JP2000506603A

JP2000506603A - ポルホビリノーゲンの定量により鉛レベルを測定するための試薬

Info

Publication number: JP2000506603A
Application number: JP9524338A
Authority: JP
Inventors: アダムツイク，マツイーユ; フイツシユポー，ジエフリイ・アール; ヒユウザー，ケビン; ランプ，ジヨン・エム; ウオン，マーチン
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1995-12-29
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 2000-05-30
Also published as: WO1997024621A3; EP0876616A2; CA2239969A1; WO1997024621A2

Abstract

(57)【要約】式（II）および（III）［式中、ＸおよびＹは、免疫原性担体物質Ｐ(Ｐは、好ましくは、ウシ血清アルブミンである)に結合した０〜２個のヘテロ原子および０〜８個の炭素原子よりなる結合基である］で表される化合物で産生した抗体を使用する、ポルホビリノーゲンの定量により試験サンプル中の鉛のレベルを測定するためのイムノアッセイ方法および試薬。また、式(V)および（VII）［式中、ＡおよびＣは、検出団Ｑ(Ｑは、検出団、好ましくは、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である)に結合した０〜２個のヘテロ原子および０〜８個の炭素原子よりなる結合基である］の構造のフルオレセイントレーサーの合成を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】ポルホビリノーゲンの定量により鉛レベルを測定するための試薬発明の分野本発明は、アミノレブリン酸デヒドラターゼの存在下でアミノレブリン酸から生成するポルホビリノーゲンをイムノアッセイにより直接定量するための新規で独特な試薬に関する。ポルホビリノーゲンの生成量は、試験サンプル中の鉛のレベルに反比例する。比色定量でしばしば用いられるポルホビリノーゲン複合体の間接測定は行なわない。また、本発明は、免疫原、そのような免疫原から産生した抗体、およびポルホビリノーゲンの定量のための、好ましくは蛍光偏光イムノアッセイで使用するための標識試薬（すなわち標識された試薬）に関する。発明の背景生物系および環境系中の微量金属の迅速な測定は、潜在的危険性の確認および公衆衛生の維持においてますます重要になりつつある。ある金属（例えば、鉛）の毒性はよく知られている。鉛の吸収は、たとえ微量であっても、ヒトの器官に重大な障害を与えることがある。環境中の多数の広く行き渡った鉛源（例えば、食料供給源）が、影響を受けた群のスクリーニングの問題を深刻にしている。S．CumminsおよびL．Goldman，Pediatrics，1992，90，99 5-996に記載されているとおり、鉛中毒は、子供では僅か10〜15mg/dlの血中濃度で生じると一般に認識されている。水、ダスト、土壌などの環境源の鉛汚染の場合には、より一層低レベルでの同定が必要となる。これらの量を測定するためには、分析技術が、高感度で汚染物質特異的で信頼しうるものでなければならない。先行技術は、Jacobsonら，Clin ．Chem.，1991，37，515-519の論文に記載されている原子吸光分析、またはA．Berlinら，Z.Klin ．Chem．Klin．Biochem.，197 4，S．389-390に記載されている鉛に曝露される生物学的マーカーの測定に基づいている。原子吸光分析（AAS）は、その一般の利用可能性、操作に要求される高度な技術的専門知識、処理量、および必要な装置の投資および維持の費用において制限される。AAS法は、一般に、中心的な研究所で行われ、試験サンプルを採取してから該試験サンプル中の鉛レベルが得られるまでに相当な時間がかかる。生物学的マーカー法は、酵素アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ALAD）の阻害に基づくものであり、血液サンプルからのALADの活性が正常より低い活性を有する場合には、その者は鉛に曝露されていた可能性がある。また、鉛含有サンプルに曝露された後のALADの活性が、1994年10月11日付けのSlibergeldの米国特許第5,354,652号に開示されている。この特許には、鉛を定量するための比色法が記載されている。この方法においては、比色剤（エールリッヒ試薬）を使用するポルホビリノーゲンの化学的誘導体化が記載されており、これは、着色ポルホビリノーケン誘導体の生成量を定量するものである。ポルホビリノーゲンの生成量は、対応する鉛レベルに反比例する。ALADから生成するポルホビリノーゲンの比色定量の原理は、K.D. Gibsonら，Biochem.，1955，61:618-629において最初に開示された。また、Silb ergeldは前記の特許において、ALAD−鉛複合体に対する抗体の使用を開示しており、このアプローチにおいてはALDA−鉛特異的抗体をELISAアッセイで使用する。鉛を含有する疑いのあるサンプルをALADと混合し、生成したALAD−鉛複合体の量をホースラディッシュペルオキシダーゼ−抗 ALAD抗体で検出する。同様に、Jaffeの特許出願WO95/04159には、抗ALADを使用してALAD活性を定量することにより鉛曝露を測定する方法が開示されている。この方法でもまた、ALAD酵素から生成するポルホビリノーゲンをエールリッヒ試薬で比色的に測定する。1994年11月29日付けのHenkensらの米国特許第5,368,707号には、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを使用して鉛を検出するための間接酵素法が開示されている。この方法は、酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害、およびそれに続く電気化学的検出で該阻害を測定するものである。Jingの米国特許第5, 407,831号には、鉛を検出するための異なるアプローチか開示されており、それは、鉛の選択的キレート化および原子吸光分析による検出に基づくものである。鉛のレベルを測定するための前記方法には種々の欠点がある。エールリッヒ試薬を使用する比色法は、ポルホビリノーゲンを定量するための所望の発色を得るために強い無機酸および有毒な重金属を使用するという欠点を有する。バイオセンサー検出と共役させて酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼを使用する方法は、所望の特異性（第３頁28〜31行）を欠いており、これを克服するために実験室で前処理を行なう必要があった（第５頁25〜47行）。最後に、ALAD−鉛複合体を使用する方法は、種々の特異性の２つの抗体を不均一系アッセイ型で用いるサンドイッチアッセイ型を用いる。不均一系型に基づくイムノアッセイは、その製造性において複雑であることが知られている。したがって、臨床場面で費用効果的に現在利用可能な自動化装置を使用して、迅速かつ選択的な方法で鉛レベルを正確かつ厳密に測定することが依然として要求されている。これは、イムノアッセイによるポルホビリノーゲンの直接測定により達成されるであろう。発明の概要本発明は前記方法の欠点を克服するものであり、したがって、本発明は、アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ALAD）に触媒されてアミノレブリン酸（ALA）から生成したポルホビリノーゲン(PBG)の量を独特な方法で直接定量することにより鉛レベルを測定するための新規直接方法を提供し、この場合、ポルホビリノーゲンの生成量は、試験サンプル中に存在する鉛の量と反比例する。ポルホビリノーゲンのこの直接定量は、均一系型イムノアッセイ（好ましくは、蛍光偏光を用いるもの）で行なう。この方法によれば、均一系イムノアッセイの特異性、速さおよび簡便性が得られ、自動化イムノアッセイアナライザーに特によく適合した、ポルホビリノーゲンの正確で信頼しうる低コストの定量が可能となる。比色定量の過程で生成するポルホビリノーゲン複合体を介したポルホビリノーゲンの間接定量は行なわない。また、本発明は、試験サンプル中のポルホビリノーゲンの定量のための独特の抗体試薬および標識試薬（すなわち標識された試薬）を提供する。これらの試薬は、先行技術の方法において化学的誘導体化工程で使用される水銀などの有毒な重金属を含有していない。さらに、本発明は、そのような抗体試薬の製造に使用する独特の免疫原を製造するための合成方法、およびそのような独特の標識試薬を製造するための合成方法を提供する。本発明においては、それらの標識試薬および抗体試薬により、公知方法を超える技術の進歩が達成される。これらの試薬を使用することにより、化学的誘導体化工程およびポルホビリノーゲンの比色定量の手間暇のかかる方法が回避される。図面の簡単な説明図１は、本発明方法に従いポルホビリノーゲン（PBG）誘導体をウシ血清アルブミンに結合させて免疫原（７）を得るための合成経路を例示する。図２は、本発明方法に従いPBG誘導体をウシ血清アルブミンに結合させて免疫原（14）を得るための合成経路を例示する。図３は、本発明方法に従いPBG誘導体をウシ血清アルブミンに結合させて免疫原（19）を得るための合成経路を例示する。図４は、本発明方法に従い蛍光トレーサー（21）を製造するための合成経路を例示する。図５は、本発明方法に従い蛍光トレーサー（30）を製造するための合成経路を例示する。図６は、本発明方法に従い蛍光トレーサー（32）を製造するための合成経路を例示する。図７は、本発明方法に従い蛍光トレーサー（34）を製造するための合成経路を例示する。図８は、本発明方法に従い蛍光トレーサー（36）を製造するための合成経路を例示する。を定量することにより鉛のレベルを測定するための検量線を例示するグラフである。図10は、免疫原（７）、（14）および（19）を接種した動物からの抗体希釈物を例示するグラフである。発明の詳細な説明本発明では、アミノレブリン酸デヒドラターゼの存在下でアミノレブリン酸から生成したポルホビリノーゲンをイムノアッセイで直接定量することにより鉛レベルを測定する。試験サンプルに、標識試薬すなわちトレーサーと抗体試薬とを同時にまたはいずれかの順序で逐次的に接触させ、ついで該抗体試薬との結合反応に関与した又はしていない該標識試薬の量を、該試験サンプル中の鉛の量と反比例するポルホビリノーゲンの生成量の相関的要素として測定する。特に、本発明は、ポルホビリノーゲンを定量して鉛のレベルを測定するための蛍光偏光イムノアッセイで使用する免疫原、そのような免疫原から産生した抗体、および標識試薬に関する。鉛はALADによるポルホビリノーゲン（式１）の生成を阻害することか知られており、生成したポルホビリノーゲンを測定すれば、試験サンプル中に存在する鉛の量を間接的に測定することになる。鉛を含有する試験サンプルを前処理して、その鉛を赤血球内から遊離させ、タンパク質、内因性 ALAD、PBG、ALAなどの妨害化合物を除去する。サンプルの前処理には、トリクロロ酢酸（TCA）、硝酸、5 −スルホサリチル酸、過塩素酸などの酸を一般に使用する。そのようなサンプルを遠心分離し、ペレットを棄て、得られた上清を中和した後、ALADと共にインキュベートして、該試験サンプル中に存在する鉛濃度と反比例する量のポルホビリノーゲン（PBG）を得る。ついでこの混合物を、本明細書中に記載する本発明の試薬を使用する蛍光偏光イムノアッセイによりアッセイして、該混合物中に存在するポルホビリノーゲン量を検出し定量し、それにより、該試験サンプル中の鉛の量を測定する。本発明の抗体は、式II、IIIおよびIV：［式II中のＸはCO-(CH₂)_n-CO-（ｎは０〜６である）であり、式III中のＹはSO₂- (CH₂)_n-CO-（ｎは０〜６である）であり、式IV中のＺは(CO)_m-(CH₂)_n-CO-(mは０〜１であり、ｎは０〜６である）であり、式II、IIIおよびIV中のＰは免疫原性担体物質である］で表される誘導体から製造した免疫原で産生させる。本発明の標識試薬は、式V、VI、VIIおよびVIII：［式Ｖ中のＡは-CO-(CH₂)_n-CO-（ｎは０〜６である）であり、式VI中のＢは-(CH₂ )_n-CO-（ｎは０〜６である）であり、式VII中のＣはSO₂-(CH₂)_n-CO-（ｎは０〜６である）であり、式VIII中のＺは-(CO)_m-(CH₂)_n-CO-（mは０〜１であり、ｎは０〜６である）であり、式中のＱは検出団、好ましくは蛍光団である］で表されるポルホビリノーゲン化合物を用いて製造する。前記免疫原は、後記のとおり、図１、２および３に示すとおりに製造した。式 IIで表される免疫原は、アジピン酸モノエチルエステルの活性エステルでポルホビリノーゲンをN−アシル化し、ついで該遊離PBG酸を対応するtert−ブチルエステルに変換することにより製造した。該エチルエステルを遊離酸へ加水分解して、所望のハプテンを得た。図１に示すとおり、該遊離酸の活性化およびウシ血清アルブミンへの結合、およびそれに続くトリフルオロ酢酸での処理により、所望の免疫原を得た。式IIIで表される免疫原は、ポルホビリノーゲンから、まず側鎖窒素をカルバマートとして保護し、ついでその２つの遊離酸をtert−ブチルエステルに変換することにより製造した。得られた保護ポルホビリノーゲンをベンジル 4−クロロスルホニルブチラートでピロール窒素上でスルホニル化し、ついで該ベンジルエステルを水素化分解して、所望のハプテンを得た。図２に示すとおり、該遊離酸の活性化およびウシ血清アルブミンへの結合、およびそれに続くトリフルオロ酢酸での処理により、所望の免疫原を得た。式IVで表される免疫原は、PB Gジ−tert−ブチルエステルカルバマート誘導体をアシル化し、ついで加水分解して、所望のハプテンを遊離酸として得ることにより製造した。図３に示すとおり、該遊離酸の活性化およびウシ血清アルブミンへの結合、およびそれに続くトリフルオロ酢酸での処理により、所望の免疫原を得た。ポルホビリノーゲンの定量により鉛レベルを測定するための蛍光偏光イムノアッセイで使用する蛍光標識試薬は、図４、５、６および７に記載のとおりに合成した。式Ｖで表されるポルホビリノーゲン蛍光誘導体は、図４に示すとおり、6 −カルボキシフルオレセインの活性エステルをポルホビリノーゲンと結合させて、所望のトレーサーを得ることにより製造した。式VIで表される蛍光誘導体は、図５に示すとおりに合成した。この誘導体は、以下の方法で製造した：tert−ブチル4−ニトロブチラートのニトロアニオンをアルデヒドと結合させ、ついでアセタートとして保護し、ついでイソシアナートと結合させて、ピロール核を形成させた。該一級アルコールを脱保護し、ついで対応するtert−ブチルエステルに変換し、ついで該ベンジルエステル部分を水素化分解して、所望のハプテンを得た。図５に示すとおり、該遊離酸を活性化し、6−アミノメチルフルオレセインに結合させ、ついでトリフルオロ酢酸で処理して、所望のポルホビリノーゲン蛍光トレーサーを得た。式VIで表される異なる蛍光トレーサーの製造は、図５で使用するのと同じ活性エステルを使用して行なった。図６に示すとおり、この活性エステルを蛍光6−アミノカプロン酸誘導体と結合させ、ついでトリフルオロ酢酸で処理して、所望の蛍光ポルホビリノーゲン誘導体を得た。式VI Iで表される蛍光トレーサーは、図７に従い、該カルボキシプロピルスルホンアミド誘導体を5−アミノメチルフルオレセインと結合させ、ついでトリフルオロ酢酸で処理して、所望の蛍光トレーサーを得ることにより製造した。式VIIIで表される蛍光トレーサーは、図８に従い、5−アミノメチルフルオレセインを該5− カルボキシピロール誘導体と結合させ、ついでトリフルオロ酢酸で処理して、所望の蛍光トレーサーを得ることにより製造した。本発明の試薬を使用する蛍光偏光型イムノアッセイ（FPIA）に従う場合には、ポルホビリノーゲンの定量により、試験サンプル中の鉛の濃度またはレベルを正確に測定することができる。鉛レベルの測定にFPIAを行なうために、鉛レベルの測定用の検量線を作成した（図９）。本発明においては、(i)Ｐが前記のとおり免疫原性担体である式IIIで表されるポルホビリノーゲン（PBG）由来の免疫原から産生した抗体を含む抗体試薬、および（ii）Ｑが前記のとおり蛍光団である式VIIで表される蛍光標識試薬を使用する場合に、ポルホビリノーゲンの定量による鉛レベルの測定に関するより優れた蛍光偏光イムノアッセイ結果が得られることが判明している。ポルホビリノーゲンの定量には、該抗体試薬は、ポルホビリノーゲンに結合するか又はそれを認識しうる抗体を含み、該抗体は、好ましくは、Ｐがウシ血清アルブミンであり、Ｙが-SO₂-(CH₂)₃-CO-である式IIIで表されるポルホビリノーゲン誘導体から製造した免疫原で産生させ、該標識試薬は、好ましくは、Ｑが蛍光団であり、ｎが３である式VIIで表される誘導体から製造する。本発明の大きな利点は、アミノレブリン酸（ALA）および酵素アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ALAD）から生成したポルホビリノーゲン（PBG）を、本発明の独特の特異的抗体を使用するイムノアッセイにより直接定量することである。先行技術においては、酵素的に生成するポルホビリノーゲンをイムノアッセイにより直接測定することは全く行われておらず、ポルホビリノーゲンをエールリッヒ試薬と反応させてポルホビリノーゲン誘導体を得、ついでこれを比色法で測定することによる間接測定が行われているにすぎない。この後者のアプローチは多数の欠点を有しており、これらの欠点としては、例えば、濃い酸を使用すること、精度が低いこと、および各サンプルの分析に長時間を要することが挙げられる。腐食性試薬を使用すると、自動化の可能性が限定され、廃棄に関して環境問題を引き起こす。ポルホビリノーゲンの誘導体化は、測定方法において余分な工程を追加し、それにより、ポルホビリノーゲンを測定するアッセイの精度を減少させ、信頼しうる自動化を困難にする。誘導体化のための反応に長時間を要することになると、アッセイ数の処理量が減少するであろう。したがって、本発明の試薬は、以下の点で先行技術に対する大きな飛躍をもたらすものである：(i)イムノアッセイによるポルホビリノーゲンの直接測定、（ii）他のポルフィリン関連化合物の存在下で機能しうるポルホビリノーゲンに対する非常に特異的な抗体の使用、（iii）ポルホビリノーゲン特異的抗体の開発のための方法、（iv）ポルホビリノーゲン特異的抗体と標識試薬とをポルホビリノーゲン明の試薬を使用すること。本明細書中に記載するとおりにポルホビリノーゲンの定量により鉛のレベルを測定するために蛍光偏光イムノアッセイを行なう場合には、該トレーサーの検出団成分は、フルオレセイン、アミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセインなどの蛍光団であり、好ましくは、アミノメチルフルオレセイン、アミノフルオレセイン、5−フルオレセイニル、6−フルオレセイニル、6−カルボキシフルオレセイン、5−カルボキシフルオレセイン、チオ尿素−アミノフルオレセイン、メトキシトリアジノリル−アミノフルオレセインなどの蛍光誘導体である。抗体に結合するトレーサーの量は、試験サンプル中のポルホビリノーゲンの生成量と逆相関する。したがって、抗体結合部位に対するポルホビリノーゲンおよびトレーサーの相対的な、したがって特徴的な結合親和性が、該アッセイ系の重要なパラメーターである。一般に、蛍光偏光法は、蛍光トレーサーが、特徴的な波長の平面偏光により励起されると、特徴的な別の波長の光（すなわち蛍光）を発し、該蛍光が、ある与えられた媒体中でのトレーサーの回転率と逆相関する入射刺激光に対する偏光度を保有しているという原理に基づく。この特性の結果、束縛された回転を有するトレーサー物質(例えば、粘性溶液相中、あるいは比較的に低い回転率を有する別の溶液成分に結合している場合)は、自由溶液中にある場合より比較的に大きな、発光の偏光度を保有するであろう。したがって、抗体に対する結合に関してリガンドとトレーサーとが競合する時間枠内で、選択性、感度、精度などの重要な性能パラメーターが維持されたままトレーサーおよびリガンドの結合速度が遊離および結合トレーサーの適当な比率を与えるはずである。本発明においてポルホビリノーゲンの定量により鉛のレベルを測定するのに蛍光偏光イムノアッセイを行なう場合には、鉛を含有する疑いのある試験サンプルを、ALADと共にインキュベートし、ついで、本発明の免疫原で産生した抗血清の存在に対して検出可能な蛍光偏光応答を与えうる適切に選択されたそのフルオレセイン誘導体の存在下で、本発明の免疫原で産生した抗血清と接触させる。ついで該溶液に平面偏光を通過させて蛍光偏光応答を得、試験サンプル中に存在するポルホビリノーゲンの量の尺度として、該応答を検出する。本発明のポルホビリノーゲン誘導体を使用して、それを通常の担体物質に結合させることにより免疫原を製造し、ついでそれを使用して抗体を得る。また、ポルホビリノーゲン誘導体を使用して標識試薬を製造し、該標識試薬をイムノアッセイにおいて検出試薬として用いてポルホビリノーゲンを定量し、それにより試験サンプル中の鉛のレベルを測定する。式IIまたはIIIにおいてＰが免疫原性担体物質である本発明のポルホビリノーゲン誘導体は、当該技術分野で公知の種々の通常の方法により免疫原性担体物質に結合させることができる。当業者には理解されているように、免疫原性担体物質は、通常の公知の任意の免疫原性担体から選択することができ、ほとんどの場合は、タンパク質またはポリペプチドであろう。尤も、十分なサイズおよび免疫原性を有する炭水化物、多糖、リポ多糖、ポリ(アミノ)酸、核酸などの他の物質を使用することも可能である。好ましくは、免疫原担体物質は、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、チログロブリンなどのタンパク質である。本発明の免疫原を使用して、本発明によるイムノアッセイ系で使用するためのポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体を当該技術分野で公知の方法により製造する。一般には、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、ウマなどの宿主動物の種々の１以上の部位に、免疫原（通常は、アジュバントと混合して）を注射する。さらなる注射を、同じまたは異なる部位に一定の又は不規則な間隔で行ない、ついで採血して抗体力価を評価し、これを、最適な力価に達したと判定されるまで続ける。該宿主動物を出血させて多量の抗血清を得ることにより、あるいは体細胞ハイブリダイゼーション法または当該技術分野で公知の他の方法でモノクローナル抗体を得ることにより抗体を得、その抗体は、例えば、−20℃で保存することができる。蛍光偏光イムノアッセイに加えて、他の種々の型のイムノアッセイに従い、本発明におけるポルホビリノーゲンの定量を行なうことができる。そのような型のイムノアッセイ系には、競合的なサンドイッチおよびイムノメトリック（immuno metric）法が含まれるが、これらに限定されるものではない。一般に、そのようなイムノアッセイ系は、免疫グロブリン（すなわち、全抗体またはその断片）が試験サンプルからの特異的被検体に結合する能力に基づくものであり、標識または検出団に結合している本発明の抗体またはその断片を含む標識試薬を使用して結合の程度を測定する。そのような検出標識には、酵素、放射能標識、ビオチン、毒素、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リポソーム、発色団、化学発光体（chemiluminescers）、着色粒子および着色微粒子、蛍光化合物（例えば、アミノメチルフルオレセイン、5−フルオレセイニル、6−フルオレセイニル、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシフルオレセイン、アミノフルオレセイン、チオ尿素フルオレセイン、メトキシトリアジノリルーアミノフルオレセインなどの蛍光誘導体）が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書中に記載するとおり、試験サンプルは、天然に存在する又は人工的に生成させた液体またはその抽出物であることが可能であり、これらには、全血、血清、血漿、尿、便、唾液、脳脊髄液、脳組織などの生物学的試験サンプルが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、試験サンプルは、試験サンプルの抽出物またはその任意の誘導体であってもよい。典型的には、そのような型のイムノアッセイ系における結合の程度は、被検体との結合反応に関与している又はしていない標識試薬中に存在する検出団の量により測定し、この場合、検出し測定した検出団の量は、試験サンプル中に存在する被検体の量と相関しうる。例えば、競合イムノアッセイ系では、しばしばリガンドと称される測定物質が、検出団に結合した密接な構造類似性を有する物質（これは、しばしば、トレーサーと称される）と競合し、この競合は、抗体の産生に使用した免疫原と共有される構造類似性を有するリガンドおよびトレーサーの一部に特異的な抗体上の限られた数の結合部位に関して生じる。つぎに、以下の実施例により本発明を例示するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。括弧内の太字の数字は、図面中で用いている構造式を示す。略語／式：酢酸＝HOAc、アセトニトリル＝CH₃CN、クロロホルム＝CHCl₃、ジエチルエーテル＝Et₂O、ジメチルホルムアミド＝DMF、酢酸エチル＝EtOAc、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド＝EDAC、N−ヒドロキシスクシンイミド＝HOSu、メタノール＝MeOH、塩化メチレン＝CH₂Cl₂、テトラヒドロフラン＝THF。特に示さない限り、分析用HPLCは、流速２mL/分およびｌ＝ 225nmのWaters ８×100mm mBC₁₈RPカートリッジを使用して実施し、分取HPLCは、流速45mL/分およびl＝225nmのWaters 40×100mm mBC₁₈RPカートリッジを使用して実施した。実施例１ポルホビリノーゲン免疫原（７）の合成アジピン酸モノエチルエステル（22.8g，131mmol）のジメチルホルムアミド（ DMF）（100mL）溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）（28.3g，137m mol）およびN−ヒドロキシスクシンイミド（HOSu）（15.7g，137mmol）を加えた。該反応をN₂下で20時間攪拌し、濾過し、溶媒を真空中で除去した。該油状物を EtOAC（100mL）中に取り、濾過し、真空中で乾燥した。該粗製物を、フラッシュクロマトグラフィー（50％ EtoAC/50％ヘキサン）で精製して、アジピン酸活性エステル DMF（30mL）中のアジピン酸活性エステル（2.67g，9.83mmol）を、PBG（１）（800mg,3.28mmol）の0.1M NaH₂PO₄緩衝液（30mL）／１ＭNa₂CO₃（2.4mL）溶液に加えた。該反応をホイルで覆い、 N₂下で６時間攪拌し、溶媒を真空中で除去した。分取HPLC精製（25%CH₃CN/75%H₂ O+0.1%ギ酸）により、PBG−アジピン酸エチル tert−ブチルイソ尿素（4.7g,23.5mmol）を、アルゴン下DMF（６mL）中のPBG −アジピン酸エチルエステル（２）（640mg, 1.67mmol）の５℃の溶液へ加え、該反応を室温で44時間攪拌した。テトラヒドロフラン（THF）（15mL）を加えた後、該反応を濾過し、溶媒を真空中で除去した。分取HPLC精製（60% CH₃CN/40%H₂O+0.1%ギ酸）により、PBG−ジ−tert−ブチル−ア EtOH（７mL）中のPBG−ジ−tert−ブチル−アジピン酸エチルエステル（３）（300mg,0.607mmol）の５℃の溶液へ、H₂O（７mL）／KOH（102mg，1.82mmol)の溶液を加え、該反応を室温まで加温し、ホイルで覆い、アルゴン下で３時間攪拌し、溶媒を真空中で除去した。残渣をH₂O（150mL）に溶解し、1.5M H₃PO₄でpH＝ 2.8まで酸性化し、EtOAC（４×100mL）で抽出した。合わせた抽出物を食塩水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、真空中で乾燥して、PBG−ジ−tert−ブチル −アジピン酸ハプテン EDAC（183mg,0.955mmol）のDMF（６mL）溶液を、PBG−ジ−tert−ブチル−アジピン酸ハプテン（４）（110mg,0.236mmol）、HOSu（110mg，0.956mmol）のDMF （２mL）溶液へ加え、該反応をホイルで覆い、アルゴン下で20時間攪拌した。溶媒を真空中で除去した後、残渣をEt₂O／0.05M NaH₂PO₄緩衝（pH＝5.5）溶液に溶解し、Et₂O（４×50mL）で抽出した。合わせた抽出物を食塩水で洗浄し、 Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、真空中で乾燥した。 PBG−ジ−tert−ブチル−アジピン酸活性エステル（５）の収量は105mg（80％）であった。HPLC(60%CH₃CN/40%H₂O+0.1%ギ酸):5.76分，＞77%。 DMF（16mL）中のPBG−ジ−tert−ブチル−アジピン酸活性エステル（５）（37 mg,0.066mmol）を、0.1M NaH₂PO₄緩衝液（pH＝7.7，20mL）中のBSA（210mg）の５℃の溶液へ加え、該反応を室温まで加温し、ホイルで覆い、N₂下で40時間攪拌した。ゲル濾過［60g G-25 Sephadex，20％MeOH/80％H₂O（100mM 酢酸アンモニウム）］で精製し、画分を集め、凍結乾燥した。PBG−ジ−tert−ブチル−アジピン酸BSA免疫原（６）の収量は280mgであった。トリフルオロ酢酸（TFA）（10mL）を、PBG−ジ−tert−ブチル−アジピン酸BS A免疫原（６）（280mg）のCH₂Cl₂（10ｍＬ）懸濁液へ加え、該反応をN₂下で20分間攪拌し、ついで溶媒を真空中で除去した。残渣をH₂O（80mL）に溶解し、１Ｍ NH₄OHで中和し、該混合物を凍結乾燥した。H₂O（100mL）に溶解した固体を１Ｍ NH₄OHで中和し、ついで凍結乾燥した。得られた固体をH₂O（４L）中で６時間透析し、凍結乾燥して、PBG−アジピン酸−BSA免疫原（７）240mgを得た。実施例２ポルホビリノーゲン免疫原（14）の合成ジ−tert−ブチルジカルボナート（BOC₂O，2.15g，9.4mmol）のテトラヒドロフラン（THF）（15mL）溶液を、0.5M水性炭酸ナトリウム（15mmol）（30mL）およびTHF（15mL）中のポルホビリノーゲン水和物（１）（2.3g,9.4mmol）の溶液へ加えた。該反応混合物を窒素下で４時間攪拌し、別の0.5M炭酸ナトリウム（10 mL）およびBOC₂O（2.1g，9.4mmol）のTHF溶液（10mL）を該反応混合物へ加え、さらに４時間攪拌した。HPLCは、出発物質が２％未満であり所望の生成物が95％を超えることを示した。溶媒を真空中で除去した後、該粗製混合物を水（200mL ）／１ＭNaOH（５mL）中へ注ぎ、Et₂O（50mL）で抽出した。該水層を１Ｍリン酸で酸性化し、３×100mLのEtOAcで抽出し、合わせた抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空中で除去し tert−ブチルイソ尿素（19.6g,98mmol）を、窒素下ジメチルホルムアミド（DM F）（15mL）中のN-BOC PBG二酸（８）（2.8g,8.6mmol）の10℃の溶液へ加え、室温で16時間攪拌した。反応混合物を、蒸留水（45mL）およびリン酸緩衝液（500m M,pH=6.0）中へ注ぎ、３×125mLのEt₂Oで抽出し、合わせた抽出物を食塩水（70m L）で洗浄し、溶媒を真空中で除去した。分取HPLCでの精製により、ジtert−ブチルエステルN-BOC PBG（９）（1.7g, カリウムヘキサメチルジシリルアジド（0.50M，1.2mL, 0.60mmol）を、窒素下THF（５mL）中のジtert−ブチルエステル N-BOC PBG（9， 219mg,0.50mmol）の０℃の溶液へ加え、０℃で30分間攪拌した。ベンジル 4-クロロスルホニルブチラート（166mg，0.6mmol）のTHF（１mL）溶液を該反応混合物へ加え、一晩攪拌した。後処理は、水（50mL）、飽和炭酸水素ナトリウム（５mL）の混合物中へ該反応を注ぎ、３×75mLのEtOACで抽出し、溶媒を真空中で除去し、残渣を分取HPLCで精製して、所望のベンジル N₁−スルホニル化合物（10）128mg（37％）を N₁−スルホニル化合物（10）（110mg,0.16mmol）、無水エタノール（25mL）および10％パラジウム炭素（Pd/C，60mg）の混合物を、１気圧の水素下で16時間攪拌した。触媒を濾去し、溶媒を真空中で除去して、所望のN₁−スルホニル化合物 (11)92mg EDAC(115mg,0.60mmol)を、N₁−スルホニル化合物(11)(70mg, 0.12mmol）、HOSu（136mg，1.2mmol）およびDMF（３mL）の溶液へ加え、ついで窒素下で14時間攪拌した。該反応混合物をEt₂O(70mL)へ注ぎ、１×30mLのリン酸緩衝液（500mM,pH＝6.0）で洗浄し、溶媒を真空中で除去して、所望の活性エステル（12）活性エステル（12）（44mg，0.064mmol）／DMF（２mL）の溶液を、ウシ血清アルブミン（BSA,220mg）、22mLリン酸緩衝液（50mM,pH＝7.8）およびDMF（６mL）の溶液へ加え、ついで室温で15時間攪拌した。該保護免疫原をG-25カラムクロマトグラフィーで精製し、精製された免疫原を含有する画分を凍結乾燥して、所望の保護免疫原（13）278mgを得た。トリフルオロ酢酸（12mL）を、保護免疫原（13）（277mg）の塩化メチレン（1 2mL）懸濁液へ加え、室温で30分間攪拌した。該反応混合物の溶媒を真空中で除去し、40mL酢酸アンモニウム水溶液（100mM）と共に15時間攪拌して、均一な溶液を得、これを凍結乾燥した。該物質を水（50mL）に溶解し、凍結乾燥し、これを２回繰返して、所望のポルホビリノーゲン免疫原（14） 210mgを得た。実施例３ポルホビリノーゲン免疫原（19）の合成トリクロロアセチルクロリド（207mL,1.85mmol）を、ジtert−ブチルエステル N-BOC PBG（9，675mg，0.50mmol）、無水炭酸カリウム（2.24g，16mmol）および無水Et₂O（15mL）の混合物へ加え、該反応混合物を窒素下０℃で30分間攪拌した。該混合物をEt₂O（200mL）／水（100mL）、飽和炭酸水素ナトリウム（100mL ）へ注ぎ、分離し、水層を１×50mLのEt₂Oで抽出し、合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を真空中で除去して、粗製C-5置換トリクロロメチルケトン(15)805mgを得た。質量分析(M+NH₄)⁺602。水性水酸化ナトリウム（1.0M,3.5mL,3.5mmol）を、粗製C-5置換トリクロロメチルケトン（15）（805mg，1.5mmol）、アセトン（30mL）および水（６mL）の溶液へ加え、該反応混合物を25分間攪拌し、ついでアセトンを真空中で除去した。該粗製混合物を水（100mL）中へ注ぎ、Et₂O（50mL）で抽出し、水層のpHを1.0M リン酸で2.5に調整し、３×100mL EtOAcで抽出した。合わせたEtOAC抽出物を１ ×30mLの食塩水で洗浄し、溶媒を真空中で除去して、暗色の油状物を得、これを分取HPLCで精製して、所望のC-5置換カルボン酸（16）122mg（９から51％）を EDAC(289mg,1.25mmol)を、C-5置換カルボン酸(16)(122mg,0.25mmol)、HOSu（2 88mg,2.5mmol）およびDMF（3.3mL）の溶液へ加え、ついで窒素下で14時間攪拌した。該反応混合物をEt₂O（100mL）へ注ぎ、１×50mLのリン酸緩衝液（500mM，pH ＝6.0）で洗浄し、１×50mLの水で洗浄し、溶媒を真空中で除去活性エステル（17）（65.5mg，0.113mmol）／DMF（２mL）の溶液を、ウシ血清アルブミン（BSA，150mg）、50mLリン酸緩衝液（50mM，pH=8.8）およびDMF（10m L）の溶液へ加え、ついで室温で３日間攪拌した。該保護免疫原をG-25カラムクロマトグラフィーで精製し、精製された免疫原を含有する画分を凍結乾燥して、所望の保護免疫原（18）207mgを得た。トリフルオロ酢酸（10mL）を、保護免疫原（18）（206mg）の塩化メチレン（1 0mL）懸濁液へ加え、室温で30分間撹拌した。該反応溶媒を真空中で除去し、得られた残渣を40mL酢酸アンモニウム水溶液（100mM）と共に15時間攪拌して、均一な溶液を得、これを凍結乾燥した。該物質を水（50mL）に溶解し、凍結乾燥し、これを２回繰返して、所望のポルホビリノーゲン免疫原（19）153mgを得た。実施例４ポルホビリノーゲントレーサー（21）の合成 6−カルボキシフルオレセイン（34mg，0.090mmol）のジメチルホルムアミド（ 1.7mL，DMF）溶液へ、ジシクロヘキシル−カルボジイミド（18mg,0.086mmol）およびN−ヒドロキシスクシンイミド（11mg,0.087mmol）を加え、該反応をホイルで覆い、ついでN₂下で20時間撹拌した。該反応を濾過して、6−カルボキシフルオレセイン活性エステル（20）の溶液を得、これを0.10Mリン酸（pH＝7.7，４mL ）中のポルホビリノーゲン（１）（20mg,0.082mmol）溶液へ加えた。該反応をホイルで覆い、ついでN₂下で20時間攪拌し、溶媒を真空中で除去した。該粗製物をHPLC（30%CH₃CN/70%H₂O+0.1%ギ酸）で２回精製して、PBG- 実施例５ポルホビリノーゲントレーサー（27）の合成 4−ジメチルアミノピリジン（DMAP）（1.18g,9.7mmol）を、乾燥CH₂Cl₂中のt −ブチル 4−ニトロブチラート（2.74g,14.5mmol）および3−[(テトラヒドロ− 2H−ピラン−２−イル)オキシ]プロパナール（1.53g,9.7mmol）の室温の溶液へ加え、96時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、該粗製混合物をシリカケルカラムクロマトグラフィー（n-ヘキサン中の20-35％EtOAc）で精製して、a-ヒドロキシニトロ化合物（22）2.45g 無水酢酸（4.83mL，51.3mmol）を、a-ヒドロキシニトロ化合物（22）（4.45g,12.8mmol）、無水ピリジン（1.15mL,19.2mmol）および乾燥CH₂ Cl₂（50mL）の０℃の溶液へ滴下し、2.0時間後、該混合物を室温へ加温し、14時間攪拌した。後処理は、該反応混合物を10％NaHCO₃水溶液（50mL）へ注ぎ、層分離し、該水層をCH₂Cl₂（２×50mL）で抽出した。合わせた有機層を５％HCl（20m L）、水（30ｍＬ）、食塩水（15mL）で洗浄し、乾燥（MgSO₄）し、溶媒を真空中で除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（n-ヘキサン中の20％EtoAC ）での精製により、a-アセトキシニトロ化合物（23）2.63g（51％）を無色な濃厚液状物と 1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−７−エン（DBU）(0.76mL,5.08mmol)を、a-アセトキシニトロ化合物(23)(1.65g, 4.24mmol)、ベンジルイソシアノアセタート（0.890g, 5.08mmol）およびTHF（14mL）の０℃の混合物へ加え、０℃で30分間攪拌し、室温まで加温し、24時間攪拌した。得られた赤オレンジ色の溶液を水（20mL）で冷し、EtOAc（３×50mL）で抽出した。合わせた有機層を水（20mL）、食塩水（15mL）で洗浄し、乾燥（MgSO₄ ）し、溶媒を真空中で除去した。該粗製化合物をシリカケルカラムクロマトグラフィー（n-ヘキサン中の20％EtOAC）で精製して、24の1.21g(63％)を無色ガムとして得た。磁気攪拌棒、窒素入口を備えた乾燥した一口丸底フラスコ中に、メタノール（ 20mL）中の2−カルボベンジルオキシピロール（24）（1.20g，2.18mmol）を入れ、ピリジニウム p−トルエンスルホナート（PPTS,0.58g,2.29mmol）を室温で加え、48時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、該混合物を水（30mL）／EtOAc（7 5ｍＬ）で希釈した。該水層をEtOAc（２×50mL）で抽出し、合わせた有機抽出物を食塩水（20ｍＬ）で洗浄し、真空中で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（n-ヘキサン中の30-40％EtOAC）での精製により、ピロールアルコールジョーンズ試薬（2.67M，0.64mL，1.69mmol）を、アセトン（20mL）中のピロールアルコール（25）（0.400g，1.13mmol）の０℃の溶液へ１回で加え、1.5時間攪拌し、ついでイソプロパノール（3.0mL）で冷し、室温で30分間攪拌した。該混合物をアセトン（22mL）で希釈し、濾過し、アセトン（30mL）で洗浄した。該濾液を真空中で濃縮した後、得られた粗製酸をDMF（0.5mL）に溶解し、氷浴で０〜５℃に冷却し、o−t−ブチル−N,N'−ジイソプロピルーイソ尿素（0.313g， 5.0当量）のDMF（1.0mL）溶液を加えた。冷却浴を取り外し、該混合物を室温で4 3時間攪拌し、ついで溶媒を真空中で除去した。シリカゲルカラムタロマトグラフィー（n-ヘキサン中の20％EtOAc）での精製により、ピロールジt−ブチルエステル(26)0.190g(12％) パラジウム炭素（10％Pd/C）（0.029g）を、ピロールジ−ｔ−ブチルエステル（26）（0.094g,0.212mmol）の無水エタノール（４mL）溶液へ加え、水素（１気圧）下室温で2.0時間攪拌した。該混合物をエタノール（10mL）で希釈し、濾過し、溶媒を真空中で除去して、PBGの2−アシル類似体（27）0.065g EDAC（0.033g,0.175mmol）を、乾燥DMF（0.5mL）中の酸（27）（0.017g，0.05 mmol）およびHOSu（0.015g，0.125mmol）の室温の溶液へ加え、36時間攪拌した。該混合物をリン酸カリウム（pH6.0）緩衝液（３mL）で希釈し、Et₂O（３×20m L）で抽出した。合わせたエーテル性抽出物を水（５mL）で洗浄し、乾燥（MgSO₄ ）し、真空中で濃縮して、2−カルボキシピロール活性磁気攪拌棒を備えた乾燥した一口丸底フラスコへ、乾燥DMF（0.5mL）中の活性エステル（28）（0.008g，0.017mmol）を入れ、該反応混合物へ6−(アミノメチル)−フルオレセイン塩酸（6-AMF）（0.010g，0.025mmol）、ついでトリエチルアミン（Et₃N）（0.018mL，0.13mmol）を加え、室温で18時間攪拌した。該混合物を、0 .1％ギ酸(水中):MeCN/45:55(v/v)で溶出する分取逆相C₁₈HPLCで精製して、PBGトレーサージ−t−ブチルエトリフルオロ酢酸（1.0mL）を、乾燥CH₂Cl₂（1.0mL）中のジ−t-ブチルエステル（29）（0.010g,0.14mmol）の混合物へ加え、室温で1.5時間攪拌した。該混合物を、0.1％ギ酸(水中):MeCN(70:30)で溶出する分取逆相C₁₈HPLCで精製して、PBG2 実施例６ポルホビリノーゲントレーサー（32）の合成磁気攪拌棒を備えた乾燥した一口丸底フラスコ中へ、N−t−BOC−6−アミノヘキサン酸（1.15g，5.0mmol）、HOSu（0.69g, 6.0mmol）および乾燥DMF(15mL)を入れ、EDAC(1.24g,6.5mmol)を室温で加え、24 時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、水（25mL）で希釈した。該水性混合物をEt₂O（50ｍＬ，２×30ｍＬ）で抽出し、合わせたEt₂O層を水（２×20mL）、食塩水（15ｍＬ）で洗浄し、乾燥（MgSO₄）した。溶媒を真空中で除去することにより、N−t−BOC−6−アミノヘキサン酸活性エステル1.52g トリエチルアミン（0.060mL，0.45mmol）を、N−t−Boc−6−アミノヘキサン酸活性エステル(0.014g,0.045mmol)、6−(アミノメチル)フルオレセイン塩酸（6 -AMF）（0.020g,0.05mmol）および乾燥DMF（0.4mL）の室温の溶液へ加え、該混合物を室温で24時間攪拌した。0.1％ギ酸(水中):MeCN(32:68)で溶出する分取HPL Cで精製して、N−t−BOC−6−アミノヘキサノイック−(６−アミノメチル)フルオレセイン0.026g（95％）を得た。磁気攪拌棒を備えた乾燥した一口丸底フラスコへ、乾燥CH₂Cl₂(1.0mL)中の前記で製造したN−t−BOC−6−アミノヘキサノイック−(６−アミノメチル)フルオレセイン（0.024g, 0.069mmol）を入れ、トリフルオロ酢酸（0.5mL）を加え、室温で10分間攪拌した。該混合物を、0.1％ギ酸(水中):MeCN(60:40) で溶出する分取逆相C₁₈HPLCで精製して、アミノフルオレセイトリエチルアミン（0.020mL，0.15mmol）を、活性エステル（28）（６mg,0.01 3mmol）、アミノフルオレセイン化合物（７mg,0.014mmol）および乾燥DMF（0.5 ｍＬ）の溶液へ加え、該混合物を室温で20時間攪拌した。0.1％ギ酸(水中):MeCN (45:55)で溶出する分取逆相C₁₈HPLCで精製して、ジ−t−ブチルエステトリフルオロ酢酸（1.0mL）を、乾燥CH₂Cl₂（1.0mL）中のジ−t-ブチルエステル（31）（４mg，0.005mmol）の５℃の混合物へ加え、室温で1.5時間攪拌した。該混合物を、0.1％ギ酸(水中):MeCN(60:40) で溶出する分取逆相C₁₈HPLCで精製して、PBG 実施例７ポルホビリノーゲントレーサー（33）の合成 EDAC（19.2mg，0.10mmol）を、N₁−スルホニル化合物（11）（20mg,0.034mmol ）、HOSu（19.6mg,0.17mmol）およびDMF（１mL）の溶液へ加え、ついで窒素下で 14時間攪拌した。該反応混合物をEt₂O(50mL)へ注ぎ、１×30mLのリン酸緩衝液（ 500mM，pH＝6.0）で洗浄し、溶媒を真空中で除去して、所望の活性エステ分析(M＋H)⁺686。 5−アミノメチルフルオレセイン（25mg，0.048mmol）を、活性エステル（12）（22.7mg,0.033mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（44mL，0.25mmol)およびD MF（１mL）の溶液へ加え、該反応を18時間攪拌し、溶媒を真空中で除去した。分取HPLCで精製することにより、所望の保護トレーサー（33）14.3mg トリフルオロ酢酸（１mL）を、保護トレーサー（33）（14mg,0.015mmol）の塩化メチレン（１mL）懸濁液へ加え、室温で30分間攪拌し、溶媒を真空中で除去して、オレンジ色の残渣を得た。分取HPLCでの精製により、所望の保護トレーサー（34）の実施例８ポルホビリノーゲントレーサー（36）の合成 5−アミノメチルフルオレセイン（50mg，0.085mmol）を、活性エステル（17）（24.3mg,0.042mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（73mL，0.42mmol）および DMF（0.80mL）の溶液へ加え、該反応を50℃で3.5日間攪拌し、溶媒を真空中で除去した。分取HPLCで精製することにより、所望の保護トレーサー（35）トリフルオロ酢酸（3.5mL）を、保護トレーサー(35)（23mg,0.028mmol）の塩化メチレン（3.5mL）懸濁液へ加え、室温で30分間攪拌し、トルエン（５mL）を加え、溶媒を真空中で除去して、オレンジ色の残渣を得た。分取HPLCでの精製により、所望の保護トレーサー(36)の7.8mg(45％)を得た。質量分析(M)⁺613。実施例９抗血清の産生式II、IIIおよびIVで表される免疫原を使用して、抗血清を産生させた。該免疫原のそれそれを使用して、ウサギの別々の群およびヒツジの別々の群に免疫した。それらのウサギに免疫原0.5mgで初回免疫し、ついで６週間ごとに該免疫原0 .25mgで追加免疫し、一方、それらのヒツジには免疫原１mgで初回免疫し、ついで６週間ごとに該免疫原0.5mgで追加免疫した。２週間の時点で動物から採血し、該血液を力価測定して、適度の希釈で適度な結合および置換を示す抗血清コレクションを選択した。全動物から得た各血液を、合成したすべてのトレーサーを使用して、トレーサーの結合に関して試験した。試験はAbbot 該抗血清を、最終容量１mL中の該トレーサーと５〜30分間結合させた。免疫原（７）および（14）に由来する抗体のみか、選択されたトレーサーに対して有意な結合を示した。ポルホビリノーゲンの定量により鉛レベルを測定するための典型的なプールを100倍希釈し、これは、800mg/ミリリットルの鉛を含有する鉛溶液に対して約180ミリ偏光単位（ｍＰ）の結合性、および約65ｍＰの置換性を有する。図10は、偏光対選択抗体(本発明の免疫原に由来するもの)／選択トレーサーの棒グラフを示す。各棒グラフは、適合するトレーサーと組合せた場合に1/100の抗血清希釈度で得た偏光を表す。図９は、トレーサー（21）と免疫原（７）に由来する抗体とを使用した場合、およびトレーサー（34）と免疫原（14 ）に由来する抗体とを使用した場合の検量線を示す。実施例10 ポルホビリノーゲンの定量のためのサンプルの前処理９％トリクロロ酢酸、0.6N HNO₃および５mM過ヨウ素酸よりなる前処理溶液（2 00mL）を1.5mLミクロフュージ管中の試験サンプル200mLへ加え、該管に蓋をし、これを30秒間ボルテックスした。10,000rpmで２分間の遠心分離により、半透明な上清を得、これを、更に修飾することなく、実施例11に記載のアッセイで使用した。実施例11 鉛の標準曲線 GFS Chemicalsから購入したNISTに対して追跡可能な鉛（Pb）の重量測定溶液を、HNO₃でpH0.5に調整された水中で80、60、40および20m g/dlに希釈した。これを、1.25M MOPS、1.25MHEPES、30mMヒドロキシキノリン− 5−スルホン酸および0.1％硫酸ネオマイシンよりなるpH7.85の中和用緩衝液でpH 7.1に中和した。酵素アミノレブリン酸デヒドラターゼおよびウサギ抗血清溶液を、0.25M MOPS、0.9M硫酸アンモニウム、0.5％ポリエチレングリコール8Kおよび0.1％硫酸ネオマイシンよりなる緩衝液（pH7.0）中に希釈した。該基質は、50 mMアミノレブリン酸、25mMトリス(2−カルボキシエチル)−ホスフィン塩酸および250mM塩化亜鉛よりなるものであった。該蛍光トレーサー上で行なった。空のキュベットに対してブランク値を読み取った。該鉛(Pb)標準 (150ml)を、中和緩衝液90mlおよびAbbott 95mlと合わせ、ついで該キュベット中で6.25分間インキュベを該キュベットへ加え、20分問インキュベートし、ついで蛍光トレーサー（220ml）およびFPIA緩衝液375mlを加え、6.25分間の最終インキュベーションを行なった。該キュベット溶液上で、最終的な偏光値を測定した。０、 20、40、60および80mg/dlの鉛標準を、２回または４回の反復実験で使用した(図９参照)。本明細書中に記載の化合物および方法は、速さ、経費、簡便性および使い易さ並びに正確さ、精度および信頼性が重要であるあらゆる種類の自動化イムノアッセイに容易に適合すると考えられる。本発明は、その種々の実施態様のそれぞれについて記載してきたが、当業者であれば、本明細書および添付の請求の範囲に記載する本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、それらに何らかの修飾を施すことができると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヒユウザー，ケビンアメリカ合衆国、イリノイ・60076、スコキー、ハーデイング・アベニユー・8501 (72)発明者ランプ，ジヨン・エムアメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガーニー、パイン・グローブ・ストリート・ 462 (72)発明者ウオン，マーチンアメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレイズレイク、ブラツクホーク・トレイル・ 30947

Claims

【特許請求の範囲】１．ボルホビリノーゲン複合体を測定することなくボルホビリノーゲンを直接検出し定量するためのイムノアッセイ方法であって、該方法が、（a）試験サンプルを標識試薬および抗体試薬（該抗体試薬は、ボルホビリノーゲンと結合しうる抗体を含む）と接触させて、それとの反応溶液を得、（b）該抗体との結合反応に関与した又はしていない該反応溶液中の該標識試薬の量を、ボルホビリノーゲンの量の関数として測定する工程を含んでなり、前記（a）における、（i）該抗体が、式：（式中、[(Y-P)＝H]の場合、Ｘは、免疫原性担体物質Ｐに結合した結合基である。該結合基が免疫原性担体物質Ｐに結合している場合、該結合基は、互いに結合した０〜８個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子よりなる。［(X-P)＝H]の場合、Ｙは、免疫原性担体物質Ｐに結合した結合基である。該結合基が免疫原性担体物質Ｐに結合している場合、該結合基は、互いに結合した０〜８個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子よりなる。）で表されるポルホビリノーゲン誘導体から製造した免疫原で産生され、 (ii)ポルホビリノーゲンの特異的定量のための該標識試薬が、式：（式中、[(C-Q)＝H]の場合、Ａは、検出団Ｑに結合した０〜２個のヘテロ原子および０〜８個の炭素原子よりなる結合基であり、[(A-Q)＝H]の場合、Ｃは、検出団Ｑに結合した０〜２個のヘテロ原子および０〜８個の炭素原子よりなる結合基である。）で表される誘導体から製造されることを特徴とするイムノアッセイ方法。２．該試験サンプルが、血液、血漿、尿などの生物学的液体、食品、水性混合物、土壌、汚泥、堆積物、塗料およびダストから選択される、請求項１に記載の方法。３．該免疫原性担体物質が、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンおよびチログロブリンよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。４．該検出団が、酵素、蛍光分子、化学発光分子、りん光分子および発光分子よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。５．該イムノアッセイ方法が、蛍光偏光イムノアッセイであり、該標識試薬の検出団が、ポルホビリノーゲンの定量のための該抗体の存在に対する検出可能な蛍光偏光応答を与えうる蛍光分子である、請求項１に記載の方法。６． (a)偏光の面を該反応溶液中に通過させて蛍光偏光応答を得、(b)該反応溶液に対する蛍光偏光応答を、存在するポルホビリノーゲンの関数として検出することにより、該標識試薬の量を測定する、請求項５に記載の方法。７．該蛍光分子が、アミノメチルフルオレセイン、アミノフルオレセイン、5−フルオレセイニル、6−フルオレセイニル、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシフルオレセイン、チオ尿素フルオレセインおよびメトキシトリアジノリル−アミノフルオレセインよりなる群から選択される、請求項５に記載の方法。８．ポルホビリノーゲン複合体を測定することなくポルホビリノーゲンを直接検出し定量するための蛍光偏光イムノアッセイ方法であって、該方法が、（a）試験サンプルを標識試薬および抗体試薬（該抗体試薬は、ポルホビリノーゲンと結合しうる抗体を含む）と接触させて、それとの反応溶液を得、（b）該抗体との結合反応に関与した又はしていない該反応溶液中の該標識試薬の量を、ポルホビリノーゲンの量の関数として測定する工程を含んでなり、前記（a）における、（i）該抗体が、式：（式中、[(Y-P)＝H]の場合、Ｘは、免疫原性担体物質Ｐに結合した結合基である。該結合基が免疫原性担体物質Ｐに結合している場合、該結合基は、互いに結合した０〜８個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子よりなる。[(X-P)＝H]の場合、Ｙは、免疫原性担体物質Ｐに結合した結合基である。該結合基が免疫原性担体物質Ｐに結合している場合、該結合基は、互いに結合した０〜８個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子よりなる。）で表される誘導体から製造した免疫原で産生され、 (ii)ポルホビリノーゲンの特異的定量のための該標識試薬が、式：（式中、[(C-Q)＝H]の場合、Ａは、検出団Ｑに結合した０〜２個のヘテロ原子および０〜８個の炭素原子よりなる結合基であり、[(A-Q)＝H]の場合、Ｃは、検出団Ｑに結合した０〜２個のヘテロ原子および０〜８個の炭素原子よりなる結合基である。）で表される誘導体から製造されることを特徴とする蛍光偏光イムノアッセイ方法。９．該試験サンプルが、血液、血漿、尿などの生物学的液体、食品、水性混合物、土壌、汚泥、堆積物、塗料およびダストから選択される、請求項８に記載の方法。 10．該免疫原性担体物質が、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンおよびチログロブリンよりなる群から選択される、請求項８に記載の方法。 11．（a）偏光の面を該反応溶液中に通過させて蛍光偏光応答を得、（b）該反応溶液に対する蛍光偏光応答を、存在するポルホビリノーケンの関数として検出することにより、該標識試薬の量を測定する、請求項８に記載の方法。 12．該蛍光分子が、アミノメチルフルオレセイン、アミノフルオレセイン、5 −フルオレセイニル、6−フルオレセイニル、5−カルボキシフルオレセイン、6 −カルボキシフルオレセイン、チオ尿素フルオレセインおよびメトキシトリアジノリル−アミノフルオレセインよりなる群から選択される、請求項８に記載の方法。 13．該蛍光偏光イムノアッセイで使用する抗体が、[(Y-P)＝H]である免疫原に由来し、該抗体を、[(C-Q)＝H]である標識試薬と組合せる、請求項８に記載の方法。 14．該蛍光偏光イムノアッセイで使用する抗体が、[(X-P)＝H]である免疫原に由来し、該抗体を、[(A-Q)＝H]である標識試薬と組合せる、請求項８に記載の方法。 15．ポルホビリノーゲンに結合しうる抗体を含んでなる抗体試薬であって、該抗体が、式：（式中、[(Y-P)＝H]の場合、Ｘは、免疫原性担体物質Ｐに結合した結合基である。該結合基が免疫原性担体物質Ｐに結合している場合、該結合基は、互いに結合した０〜８個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子よりなる。[(X-P)＝H]の場合、Ｙは、免疫原性担体物質Ｐに結合した結合基である。該結合基か免疫原性担体物質Ｐに結合している場合、該結合基は、互いに結合した０〜８個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子よりなる。）で表されるポルホビリノーゲン誘導体から製造した免疫原で産生されることを特徴とする抗体試薬。 16．該試験サンプルが、血液、血漿、尿などの生物学的液体、食品、水性混合物、土壌、汚泥、堆積物、塗料およびダストから選択される、ポルホビリノーゲンの検出および定量のための請求項15に記載の抗体試薬。 17．該免疫原性担体物質が、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペツトヘモシアニンおよびチログロブリンよりなる群から選択される、請求項15に記載の抗体試薬。 18．ポルホビリノーゲンに結合しうる抗体に認識されうる標識試薬であって、式：（式中、[(C-Q)＝H]の場合、Ａは、検出団Ｑに結合した０〜２個のヘテロ原子および０〜８個の炭素原子よりなる結合基であり、[(A-Q)＝H]の場合、Ｃは、検出団Ｑに結合した０〜２個のヘテロ原子および０〜８個の炭素原子よりなる結合基である。）で表される誘導体から製造されることを特徴とする標識試薬。 19．該検出団が、酵素、蛍光分子、化学発光分子、りん光分子および発光分子よりなる群から選択される、請求項18に記載の標識試薬。 20．該蛍光分子が、アミノメチルフルオレセイン、アミノフルオレセイン、5 −フルオレセイニル、6−フルオレセイニル、5−カルボキシフルオレセイン、6 −カルボキシフルオレセイン、チオ尿素フルオレセインおよびメトキシトリアジノリル−アミノフルオレセインよりなる群から選択される、請求項19に記載の標識試薬。 21．式：（式中、[(Y-P)＝H]の場合、Ｘは、免疫原性担体物質Ｐに結合した結合基である。該結合基が免疫原性担体物質Ｐに結合している場合、該結合基は、互いに結合した０〜８個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子よりなる。[(X-P)＝H]の場合、Ｙは、免疫原性担体物質Ｐに結合した結合基である。該結合基が免疫原性担体物質Ｐに結合している場合、該結合基は、互いに結合した０〜８個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子よりなる。）で表される免疫原。 22．該免疫原性担体物質が、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンおよびチログロブリンよりなる群から選択される、請求項21に記載の免疫原。 23．式:（式中、[(Y-P)＝H]の場合、Ｘは、免疫原性担体物質Ｐに結合した結合基である。該結合基が免疫原性担体物質Ｐに結合している場合、該結合基は、互いに結合した０〜８個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子よりなる。[(X-P)＝H]の場合、Ｙは、免疫原性担体物質Ｐに結合した結合基である。該結合基が免疫原性担体物質Ｐに結合している場合、該結合基は、互いに結合した０〜８個の炭素原子および０〜２個のヘテロ原子よりなる。）で表される化合物。 24．該免疫原性担体物質が、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンおよびチログロブリンよりなる群から選択される、請求項23に記載の免疫原。 25． [(Y-P)＝H]の場合、Ｘが-CO-(CH₂)_n-CO-P（ｎは１〜６である）であり、Ｐがウシ血清アルブミンである、請求項23に記載の化合物。 26． [(X-P)＝H]の場合、Ｙが-SO₂-(CH₂)_n-(CO)-P（ｎは１〜６である）であり、Ｐがウシ血清アルブミンである、請求項23に記載の化合物。 27．式：（式中、[(C-Q)＝H]の場合、Ａは、検出団Ｑに結合した０〜２個のヘテロ原子および０〜８個の炭素原子よりなる結合基であり、[(A-Q)＝H]の場合、Ｃは、検出団Ｑに結合した０〜２個のヘテロ原子および０〜８個の炭素原子よりなる結合基である。）で表される化合物。 28. 該フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体が、アミノメチルフルオレセイン、アミノフルオレセイン、5−フルオレセイニル、6−フルオレセイニル、 5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシフルオレセイン、チオ尿素フルオレセインおよびメトキシトリアジノリル−アミノフルオレセインよりなる群から選択される、請求項27に記載の化合物。 29． [(C-Q)＝H]の場合、Ａが-CO-Qであり、Ｑが6−フルオレセイニルである、請求項27に記載の化合物。 30． [(A-Q)＝H]の場合、Ｃが-SO₂-(CH₂)₃-CO-NH-CH₂-Qであり、Ｑが5−フルオレセイニルである、請求項27に記載の化合物。