JP2000506726A - 組換えａａｖベクターに基づく形質導入系およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、（ａ）外来ＤＮＡを含むｒｅｐ陰性ＡＡＶベクター、および（ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を製造するための試薬を含んでなる形質導入系に関する。本発明は、さらに、該形質導入系の使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＡＡＶベクターに基づく形質導入系およびその使用 本発明は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶベクターを含んでなる形質導入系およびその使用 に関する。 ベクターとしてのウイルスによる遺伝子の導入を、形質導入と称する。形質導 入は、しばしば細胞のゲノムに遺伝子を組み込むために使用される。例えば、ア デノ随伴ウイルス（ＡＡＶｓ）は、この目的のために、ウイルスとして用いられ る。 ＡＡＶｓは、パルボウイルス科に属する一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶ ｓは、複製のために、ヘルパーウイルス、具体的にはアデノウイルスまたはヘル ペスウイルスを必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶｓは、宿 主細胞のゲノム、具体的には、第１９染色体の特異的な部位に組み込む。 ＡＡＶｓのゲノムは直鎖状であり、約４６８０ヌクレオチドの長さを有する。 それは、構造遺伝子および非構造遺伝子をコードする２つの読み取り枠を含有す る。構造遺伝子をｃａｐ遺伝子と称する。それは、Ｐ４０プロモーターにより制 御され、３つのカプシド蛋白質をコードする。非構造遺伝子をｒｅｐ遺伝子と称 し、ｒｅｐ蛋白質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコ ードする。２つの前者蛋白質は、Ｐ５プロモーターの制御下で発現し、一方、Ｒ ｅｐ５２およびＲｅｐ４０の発現は、Ｐ１９プロモーターにより制御されている 。Ｒｅｐ蛋白質の機能は、とりわけ、ＡＡＶゲノムの複製と転写の制御により表 わされる。 現在、組換えＡＡＶｓ、すなわち外来ＤＮＡを含むＡＡＶｓが、しばしば細胞 のゲノムに組み込まず、そのため外来ＤＮＡも、そこに至らないことが判明して いる。しかしながら、後者は、とりわけ遺伝子治療に基づく細胞の操作に重要で あり、部分的に欠くことができない。 したがって、本発明の目的は、外来ＤＮＡを、よく計算された様式で細胞のゲ ノムに組み込むことが可能な物質（Ｍｉｔｔｅｌ）を提供することにある。 本発明によれば、請求項に規定された主題により、これを達成する。 したがって、本発明の主題は、 （ａ）外来ＤＮＡを含むｒｅｐ陰性ＡＡＶベクター、および （ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を提供する物質、 を含んでなる形質転換系に関する。 本発明は、そのｒｅｐ遺伝子を欠損しているＡＡＶｓが細胞のゲノムに組み込 まないという出願人の知見に基づく。 「ｒｅｐ陰性ＡＡＶベクター」という語句は、ｒｅｐ陰性である、いかなるＡ ＡＶ、すなわちウイルス粒子、およびそのＤＮＡにも関する。後者はｒｅｐ遺伝 子が存在しないかまたは欠損したｒｅｐ遺伝子だけが存在することを意味する。 ｒｅｐ陰性ＡＡＶベクターを提供するために、慣用の方法を使用することができ る。例えば、ＡＡＶ ＤＮＡが欠損するように、またはｒｅｐ遺伝子が特異的な 制限切断および連結により欠失されるようなｒｅｐ遺伝子における特異的な変異 導入によりＡＡＶ ＤＮＡを修飾しうる。ついでｒｅｐ陰性ＡＡＶ ＤＮＡをＡ ＡＶ−ｒｅｐ遺伝子を発現する細胞中にトランスフェクトすることができ、ｒｅ ｐ陰性ＡＡＶｓ、すなわち、ウイルス粒子がヘルパーウイルスによる感染後に得 られる。 「外来ＤＮＡ」という語句は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶベクターに組み込みうるいか なるＤＮＡをも含有する。該外来ＤＮＡは、コードしていなくてもよくまたコー ドしていてもよい。前者の場合、該外来ＤＮＡは、ＤＮＡ複製および／または転 写の制御エレメントでありうる。後者の場合、外来ＤＮＡは発現可能であること が好ましく、特に発現を組織特異的なプロモーターなどの誘導可能なプロモータ ーにより制御することが有利である。さらに、外来ＤＮＡは診断用および／また は治療用タンパク質をコードすることができる。治療用タンパク質としては、例 えば、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカイン、 成長因子、血漿タンパク質、レセプターなどが挙げられる。また、外来ＤＮＡは ｒｅｐ陰性ＡＡＶベクターのいかなる部位にも挿入することができる。ｒｅｐ遺 伝子中またはｒｅｐ遺伝子の代わりに外来ＤＮＡが存在することが有利であろう 。さらに、複数のＤＮＡが存在する場合が、好ましいであろう。 「ＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質を提供する物質」という語句は、ＡＡＶ Ｒｅｐ タンパク質を提供することができるいかなる物質、具体的にはＲｅｐ７８もしく はＲｅｐ６８、またはそれらの一部をも含有する。例えば、該物質はＡＡＶ Ｒ ｅｐタンパク質およびその一部のそれぞれを発現させるのに適したＤＮＡ（ｒｅ ｐ−ＤＮＡ）であってもよい。ｒｅｐ−ＤＮＡの発現が、抗生物質特異的または 組織特異的プロモーターなどの誘導可能なプロモーターにより制御されることが 好ましい。該ｒｅｐ−ＤＮＡはＡＡＶウイルス粒子のゲノムにより含まれてもよ い。該ゲノムが欠損した（欠失した）ｃａｐ遺伝子および該ｃａｐ遺伝子を誘導 可能なプロモーターのそれぞれおよび／または欠損した（欠失した）ＩＴＲ配列 を有することが好ましい。また、該ゲノムおよび対応するＡＡＶウイルス粒子は 、前記の意味の範囲内の物質であってもよい。さらに、該物質は、ＡＡＶ Ｒｅ ｐタンパク質、具体的にはＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８、それ自体またはその一 部およびそれぞれＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質またはその一部を含む融合タンパク 質であってもよい。かかるタンパク質は、慣用の方法により提供されうる。 成分（ａ）および（ｂ）は、本発明の形質導入系において、互いに結合するこ とができる。慣用の方法により、かかる結合を作製することができる。例えば、 成分（ａ）のＡＡＶベクターがウイルス粒子として存在し、成分（ｂ）の物質が 、ｒｅｐ発現ＤＮＡとして利用できる場合、下記のように行なわれることが好ま しいであろう：ＡＡＶベクターを化学的にまたは酵素的に修飾する。例えば、そ れはビオチン化、すなわちビオチンまたはＡＡＶタンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２ またはＶＰ−３に対する抗体などのビオチン化抗ＡＡＶ抗体をＡＡＶベクターに 結合する。該Ｒｅｐ発現ＤＮＡを、例えば、ポリリジンおよび／またはポリオル ニチン、ならびに数種の異なる正に荷電したアミノ酸をそれぞれ有する異種ポリ カチオンの有機ポリカチオンなどのＤＮＡ結合物質と混合する。 ポリリジンが該ＤＮＡに結合し、ストレプトアビジンがポリリジンに結合する ように、ｒｅｐ発現ＤＮＡとポリリジンおよびストレプトアビジンとを混合する ことが特に好ましい。ついで、成分（ａ）および（ｂ）の間の結合が得られるよ うに、該ビオチン化ＡＡＶベクターおよびストレプトアビジン−ポリリジン修飾 ＤＮＡを混合する。 前記形質導入系は細胞の形質導入に適する。細胞は、いかなる種および起源で あってもよい。さらに、該細胞は、別々に存在してもよく、また組織または器官 などの集合体に存在してもよい。さらに、該細胞は、生物体の内部または外部に 存在することもできる。後者の場合、該細胞を培地に保持してもよい。さらに、 該細胞は、正常細胞、ウイルス感染細胞もしくは微生物および原生生物のそれぞ れにより冒された細胞などの病気の細胞、または腫瘍細胞であってもよい。 細胞は慣用の方法により形質導入されうる。成分（ａ）および（ｂ）を互いに 連結し、該ＡＡＶベクターおよび／または該物質がウイルス粒子として存在する 形質導入系を用いる場合、該細胞を形質導入系で感染させることができる。しか しながら、該ＡＡＶベクターおよび該物質がＤＮＡとして存在する場合、例えば 、トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションなど により、該形質導入系を、細胞に導入することができる。 成分（ａ）および（ｂ）が互いに結合せず該ＡＡＶベクターおよび該物質がウ イルス粒子として存在する形質導入系を用いる場合、該細胞はウイルス粒子によ り感染することができる。しかしながら、該ＡＡＶベクターがウイルス粒子とし て存在し、該物質がＤＮＡとして存在する場合、およびそれぞれその逆の場合、 該細胞をＡＡＶベクターおよび物質のそれぞれで感染させることができ、ＤＮＡ を前記のように該細胞中に導入することができる。さらに、ＡＡＶベクターおよ び物質がそれぞれＤＮＡとして存在する場合、それらを前記のように細胞に導入 することができる。更に、物質が、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の形態でまたはそ の一部としておよびＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質またはその一部を含む融合タンパ ク質としてそれぞれ存在する場合、該物質を、例えば、リポフェクションにより 細胞に導入することができる。 本発明により、外来ＤＮＡを細胞のゲノムに組み込むことが可能になる。第１ ９染色体の特異的な部位は、しばしば組み込みの部位として得られる。なお、外 来ＤＮＡの組織特異的な発現が可能である。さらに、形質導入された細胞におけ るＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の供給は時間的に限定することができ、それは細胞 に好ましい影響を有するであろう。 また、本発明は、一定の細胞またはその環境に限定されるものではない。本発 明は、生物体内またはその外部に存在する細胞を形質導入するために用いること ができる。特に、本発明は、これらの細胞を事前に培養しておくことなしに、回 収された腫瘍試料の細胞に形質導入することに完全に適する。 したがって、本発明は、特に、ヘモグロビン異常、嚢胞性線維症、パーキンソ ン病のサブタイプ、血友病などの単一遺伝子の疾患、ＡＩＤＳ、ガン疾患におけ る遺伝子治療への使用に完全に適する。 本発明を下記の実施例により説明する。実施例：本発明の形質導入系を有する細胞の形質導入 使用される本発明の形質導入系は成分（ａ）および（ｂ）が互いに分離したも のである。 （ａ）ヒト子宮頸部腫瘍株ＨｅＬａ細胞を、ＣＭＶプロモーターの制御下にＡＡ Ｖ−ｒｅｐ遺伝子を含む発現プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン ）でトランスフェクトした。かかる発現プラスミドを用いる予備的な試験に おいて、３０〜６０％のトランスフェクション効率を達することができるこ とが示された。ＡＡＶ−ｒｅｐ遺伝子の発現をＡＡＶ−Ｒｅｐ７８に対する 抗体によるイムノブロットで決定する。 ついで、トランスフェクトした細胞を、Ｂ７タンパク質をコードするＤＮ Ａなどの発現可能な外来ＤＮＡを含むｒｅｐ陰性ＡＡＶベクター、すなわち ウイルス粒子で感染させる。外来ＤＮＡの特異的な組み込みが第１９染色体 で得られる。これは、慣用の方法により示される。さらに、Ｂ７タンパク質 の発現が得られる。これは、Ｂ７タンパク質に対する抗体により提供される 。 （ｂ）ヒト子宮頸部腫瘍株ＨｅＬａ細胞を、２つの発現プラスミドでトランスフ ェクトする。１つは、ｐＵＨＤ１５−１であり、融合タンパク質であるｔｅ ｔＲ−ＶＰ１６をコードする（ゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ），Ｍ．ら、ＰＮＡ Ｓ ＵＳＡ ８９ （１９９２）、５５４７〜５５５１を参照のこと）。ｔ ｅｔＲはテトラサイクリンリプレッサーであり、ＶＰ１６はＨＳＶのＶＰ１ ６分子のトランスアクティベーションドメインである。２番目の発現プラス ミドｐＵＨＤ１０−３は、融合タンパク質ｔｅｔＲ−ＶＰ１６により誘導さ れるプロモーターにより制御されるＡＡＶ−ｒｅｐ遺伝子を含む。この誘導 は、テトラサイクリンが培地から取り除かれた場合に得られる。トランスフ ェクトションの検出は、１番目の発現プラスミドのネオマイシン耐性遺伝子 の発現および２番目の発現プラスミドのｒｅｐ遺伝子の発現を介して決定さ れる。 ついで、トランスフェクトした細胞をＢ７タンパク質をコードする外来Ｄ ＮＡを含む（ａ）のｒｅｐ陰性ＡＡＶベクターで感染させる。培地からテト ラサイクリンを除去し、外来ＤＮＡの特異的組み込みが第１９染色体におい て、得られる。これは、慣用の方法により示される。さらに、Ｂ７タンパク 質の発現が得られる。これはＢ７タンパク質に対する抗体により示される。 前記データは、本発明の形質導入系が細胞のゲノムに特異的に外来ＤＮＡを組 み込むことができるという事実を言及する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年５月１９日（１９９８．５．１９） 【補正内容】 請求の範囲 １． （ａ）外来ＤＮＡを含むｒｅｐ陰性ＡＡＶベクター、および （ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を提供する物質であって、該ＡＡＶベクターは 、該物質と結合している、 を含んでなる形質導入系。 ２． 該ｒｅｐ陰性ＡＡＶベクターがＤＮＡとして存在する、請求項１記載の形 質導入系。 ３． 該外来ＤＮＡが発現可能である、請求項１または２記載の形質導入系。 ４． 該外来ＤＮＡが誘導可能なプロモーターにより制御されている、請求項３ 記載の形質導入系。 ５． 該物質が発現可能なｒｅｐ−ＤＮＡである、請求項１〜４いずれか記載の 形質導入系。 ６． 該ｒｅｐ−ＤＮＡが誘導可能なプロモーターにより制御されている、請求 項５記載の形質導入系。 ７． 該ｒｅｐ−ＤＮＡがＡＡＶウイルス粒子のゲノムにより含まれている、請 求項５または６記載の形質導入系。 ８． 該ゲノムが欠損したｃａｐ遺伝子および欠失したｃａｐ遺伝子をそれぞれ 含む、請求項７記載の形質導入系。 ９． 該ゲノムが欠損したＩＴＲ配列を含む、請求項７記載の形質導入系。 １０． 該物質がＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質である、請求項１〜４いずれか記載 の形質導入系。 １１． 細胞の形質導入のための請求項１〜１０いずれか記載の形質導入系の使 用。 １２． 該細胞が遺伝子治療杳として決定されたものである、請求項１１記載の 使用。 １３． 該細胞が正常細胞、病気の細胞または腫瘍細胞である、請求項１１また は１２記載の使用。 １４． 該細胞が生物体中に存在する、請求項１１〜１３いずれか記載の使用。 １５． 該細胞が生物体の外側に存在する、請求項１１〜１３いずれか記載の使 用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/16 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１Ｍ 31/18 ６３５ 35/00 ６３７Ｃ 37/04 ６４３Ｂ 43/00 49/00 Ａ Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ０７Ｋ 14/015 38/22 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 49/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/015 37/24 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 ハレック，ミヒャエル ドイツ連邦共和国 ミュンヘン デー― 80538 シュテルンシュトラーセ 20 (72)発明者 ウェントナー，クレメンス ドイツ連邦共和国 ミュンヘン デー― 81669 ローザンハイマー シュトラーセ 46 (72)発明者 ミクル，ドーリス ドイツ連邦共和国 ミュンヘン デー― 80686 フリーデンハイマー シュトラー セ 46

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）外来ＤＮＡを含むｒｅｐ陰性ＡＡＶベクター、および （ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を提供する物質（Ｍｉｔｔｅｌ）、 を含んでなる形質導入系。 ２． 該ｒｅｐ陰性ＡＡＶベクターがＤＮＡとして存在することを特徴とする、 請求項１記載の形質導入系。 ３． 該外来ＤＮＡが発現可能であることを特徴とする、請求項１または２記載 の形質導入系。 ４． 該外来ＤＮＡが誘導可能なプロモーターにより制御されていることを特徴 とする、請求項３記載の形質導入系。 ５． 該物質が発現可能なｒｅｐ−ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１〜 ４いずれか記載の形質導入系。 ６． 該ｒｅｐ−ＤＮＡが、誘導可能なプロモーターにより制御されていること を特徴とする、請求項５記載の形質導入系。 ７． 該ｒｅｐ−ＤＮＡがＡＡＶウイルス粒子のゲノムにより含まれていること を特徴とする、請求項５または６記載の形質導入系。 ８． 該ゲノムが欠損したｃａｐ遺伝子および欠失したｃａｐ遺伝子をそれぞれ 含むことを特徴とする、請求項７記載の形質導入系。 ９． 該ゲノムが欠損したＩＴＲ配列を含むことを特徴とする、請求項７記載の 形質導入系。 １０． 該物質がＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質であることを特徴とする、請求項１ 〜４いずれか記載の形質導入系。 １１． 該ＡＡＶベクターが該物質と結合していることを特徴とする、請求項１ 〜１０いずれか記載の形質導入系。 １２． 細胞の形質導入のための請求項１〜１１いずれか記載の形質導入系の使 用。 １３． 該細胞が遺伝子治療用として決定されたものである、請求項１２記載の 使用。 １４． 該細胞が正常細胞、病気の細胞または腫瘍細胞である、請求項１２また は１３記載の使用。 １５． 該細胞が生物体中に存在する、請求項１２〜１４いずれか記載の使用。 １６． 該細胞が生物体の外側に存在する、請求項１２〜１４いずれか記載の使 用。