JP2000506740A - 繊毛虫類由来の、カテプシンｌおよびそのプレプロ型、およびそれに対応するプロペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はカテプシンＬのプレプロ型、およびそのリーダー配列、およびカテプシンＬ、ならびに繊毛虫類、特にゾウリムシ由来のプロペプチドの単離、およびこれらのペプチドの利用、ならびに繊毛虫類からのカテプシンＬの調製法に関連するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 繊毛虫類由来の、カテプシンＬおよびそのプレプロ型、およびそれに対応するプ ロペプチド 本発明はカテプシンＬのプレプロ型（prepro form）、およびそのリーダー配列 、およびカテプシンＬ、ならびに繊毛虫類、特にゾウリムシ由来のプロペプチド の単離、およびこれらのペプチドの利用、ならびに繊毛虫類からのカテプシンＬ の調製法に関連するものである。 異なるプロテアーゼのプロペプチドがプロテアーゼであるチモーゲン（zymogens ）の活性化によって自由になると、プロテアーゼ阻害剤として機能することがで きるという発見が知られている。たとえば、切断が起こると、緑膿菌エラスター ゼのプロペプチドはエラスターゼに結合し、そのためこの酵素の不活性が起こる （ケスラー（kessler）とサフリン(Safrin)，1994，J．Biol．Chem.，269，2272 6）。パパインとパパイヤプロテイナーゼIVのプロペプチドは、成熟型パパイヤ プロテアーゼ、およびラット肝の類似のB型ならびにL型カテプシンの阻害剤とし て選択的に働く（テイラー（Taylor）ら，1995，Biochem．Soc．Trans.，23，80 ）。他のカテプシンのプロペプチドもまた、プロテアーゼの阻害剤として働く。 したがって、合成によって得られたヒトプロカテプシンＤのプロペプチドは、ウ シのカテプシンＤを阻害する（ヴァクナー(Vagner)ら、1993，Collect．Czech． Chem．Commun.，58，435）。 プロテアーゼであるカテプシンＬは、さまざまな症候群とにおいて重要な役割を 果たす。第一に、この酵素はおそらく腫瘍の侵潤および転移の形成に決定的な重 要性をもつだろう（パイク(Pike)、1991、Sissertain Abstr．Intern.，53，464 5）。このプロテアーゼはまた、宿主組織への病原性細菌または寄生性原生動物 の侵入にも関与することができる。カテプシンＬまた、骨基質の分解にも関与し ている。したがってこの酵素は、骨粗しょう症の治療と関連して価値のある対象 であることは明らかである（Pharma Japan，Sep．1995，1468，23）。 最後に、カテプシンＬはまた、関節炎などの炎症性疾患の発達にも関与すること に言及することができる。 適当なカテプシンＬ阻害剤の同定は、前記諸疾病の治療に適した製剤の開発にお いて、重要な段階を意味すると言ってよいだろう。さらに、比較的大量のカテプ シンＬを単離するための適当な原料を持つことは、非常に有利であろう。これは 、本酵素を適当なプロテアーゼ阻害剤を見つけるための、スクリーニング系に利 用できる可能性があるからである。これに加えて、たとえば壊死性組織の分解を 促進することが可能である、傷用の軟膏にも用いることが可能である。 したがって、本発明は繊毛虫類、好ましくはゾウリムシ、さらに好ましくはパラ メシウム・テトラウレリア（Paramecium tetraurelia）から得ることができるカ テプシンＬプレプロ型に関連し、またそのようなタンパク質をコードするＤＮＡ 配列に関連するものである。 本発明はさらに、繊毛虫類、好ましくはゾウリムシ、さらに好ましくはパラメシ ウム・テトラウレリア（Paramecium tetraurelia）由来のカテプシンＬ、および それに付随するＤＮＡ配列に関連し、また繊毛虫類からのその調製法、ならびに 傷の治療薬を製造するためのその使用に関連するものである。 本発明によるカテプシンＬはさらに、たとえばいわゆる分子モデリングによって 適当な阻害剤を同定するために用いることもできる。 さらに、本発明は繊毛虫類、好ましくはゾウリムシ、さらに好ましくはパラメシ ウム・テトラウレリア由来のカテプシンＬプロペプチドおよびそのＤＮＡ配列を 提供する。 繊毛虫類由来のカテプシンＬプロペプチドは、このカテプシンＬの非常に特異的 な阻害剤であり、そのため炎症性疾患、転移性腫瘍、細菌感染、寄生性原生動物 による感染、または骨粗しょう症のための治療薬を製造するために適している。 本発明はさらに、繊毛虫類、好ましくはゾウリムシ、さらに好ましくはパラメシ ウム・テトラウレリア由来のカテプシンＬのリーダー配列、またはシグナル配列 に対応した前配列（presequence）を提供し、その前配列は、組換え体ペプチド またはタンパク質が発現される際に、対応するリーダー配列、またはシグナル配 列に翻訳され、その結果、繊毛虫類細胞由来の組換え体発現ペプチドまたはタン パク質が分泌される。 本発明は次の部分と、実施例を助けとして明示されるものである。 本研究は、まず第一に繊毛虫類ゾウリムシ（原生生物）由来のカテプシンＬサブ ファミリーの、２種類のプロテアーゼの単離について述べるものである。クロー ン化されたｃＤＮＡの塩基配列決定により、すでに報告されている哺乳動物と原 生生物由来のカテプシンＬ型との類似性は高くても３０％であるが、特徴的なカ テプシンＬモチーフは、プレプロ領域と実際の酵素内両方に存在することが証明 されている。プロ領域は、典型的なＥＲＦＮＩＮモチーフを示す、８６アミノ酸 からなる部分をコードする。プロ領域は大腸菌内で発現された。単離したプロペ プチドは、ゾウリムシのカテプシンＬを効果的に（ナノモル領域で）阻害した。 それとは対照的に、他のシステインプロテアーゼ、たとえばパパインや哺乳類の ＢまたはＧまたはＨ型カテプシンは、プロペプチド濃度が１３μＭであっても阻 害されなかった。その結果から、該プロペプチドはカテプシンＬの効果的かつ特 異的な阻害剤である。このデータに基づき、上述の症候群の治療における化学的 治療法のための、強力かつ高度に特異的な阻害剤を開発することが可能なはずで ある。 実施例 カテプシンＬアッセイ³² Ｐ-ホスホリラーゼａ（約5x104cpm/min）を基質として用いた。テスト混合液 （30μｌ）には、10μＭの基質、12ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ7.0）、50μＭ ＥＤＴＡ、10ｍＭ 2−メルカプトエタノール、5ｍＭカフェイン、および6.7μ ｇのＢＳＡが含まれていた。反応は、３０℃で１０分間インキュベーションした あと、200μｌのトリクロロ酢酸（２０％ｗ／ｖ）を添加することによって停止 した。沈殿しないペプチドの放射活性は、遠心した後の上清において測定した。 １単位の酵素活性は、１分間に１μｍｏｌの³²Ｐ-リン酸化ペプチド（phosphope ptide）を遊離する酵素量に対応する。 カテプシンＬの精製 大量培養したパラメシウム・テトラウレリアを原材料として用いた。カテプシン Ｌは、細胞が酵素を分泌もするため、細胞から得られ、また培養液からも大量に 得られる。 すべての精製段階は４℃で行われた。細胞は、フレンチプレスを用いて、50ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ7.0)，5ｍＭ ＥＤＴＡ中でホモジナイズされた。細胞残 査は遠心で除いた（23,000xg、60分；100,000xg、60分）。上清を、20ｍ かけた。約半分のプロテアーゼ活性が、素通り画分に溶出された。カラムを250 ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。残ったプロテアーゼ活性は450ｍＫのＫＣｌで溶出 プロテアーゼは約27kDaに溶出された。分取しておいた活性画分は、次にモノＱ カラムにかけた。溶出は直線的勾配（100ｍＭ ＮａＣｌから350ｍＭ ＮａＣｌで 60ｍｌ）を用いて行った。２種類の活性を持つプロテアーゼ（30kDaと33kDa）は 、この段階で分離された。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて検定した。³²Ｐホ スホリラーゼを基質として用いる場合、２つのアイソザイムの至適ｐＨは6.5で あり；至適温度は56℃であった。スルフヒドリルプロテアーゼ特異的阻害剤（た とえばシスタチン、ロイペプチンおよびＴＬＣＫ）は、活性を劇的に低下させた 。一方、セリンプロテアーゼ類（アプロチニン）、メタロプロテアーゼ類（ＥＤ ＴＡ）およびＡｓｐプロテアーゼ類（ペプスタチン）に特異的な阻害剤は、まっ たく阻害効果を示さなかった。ホスホリラーゼおよびＢＳＡを用いて得られた分 解様式から、２種類のプロテアーゼがエンドプロテイナーゼ・アイソザイムであ ることが示された。 アミノ酸配列決定 タンパク質はＳＤＳゲルからポリビニリドン・ジフルオライド膜に転写され、対 応する30kDaおよび33kDaのバンドが切り出された。タンパク質断片の配列決定の ために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う前に、ＢｒＣＮ（350μｇ{10μｇのタンパク質 ）でタンパク質を切断した。配列決定は、アプライドバイオシステムズ・シーケ ンサーによって行った。30kDaバンドのアミノ末端は：GAEVDWTDNKKVKYPAVKNQで あり、一方33kDaバンドのアミノ末端は： GAEVDXTXNK（Xは不明）であった。BrCN断片の配列決定はまた、同一の酵素タン パク質が、ただ異なったプロセッシングを受けたタンパク質とともに含まれるこ とを示した。この場合、次の配列がいずれのタンパク質からも検出された： DSAFEYVADNGLAEAKDYPYYASD。ＦＡＳＴＡプログラムを用いた、 ＥＭＢＬ遺伝子バンクの比較では、アミノ末端に関しては既知のタンパク質との 対応は見られなかったが；一方で、内側にある24ｍｅｒのペプチドは１９種類の 異なるシステインプロテアーゼと明らかな対応を見せた。 カテプシンＬの増幅とサブクローニング アミノ酸配列決定の結果に基づき、また繊毛虫類のコドン使用率を考慮してオリ ゴヌクレオチドを調製した。用いたプライマーは：アミノ末端ペプチドGAEVDWDN KKVKから推定されたプライマー１（センス） 5'-GCGGGGTACCGGWGCHGAAGTHGAYTGGACWGA-TAAYAARAARG-3'および 内部にあるペプチド配列EAKDYPYYから推定されるプライマー２（アンチセンス） 5'-TARTANGGRTARTCYTTNGCYTC-3'である。PCRはパーキンエルマー・サーマルサイ クラー（30サイクル、94℃、55℃、および72℃、それぞれ１分間）を用いて行った 。これらのプライマーを用いて、ゾウリムシｃＤＮＡライブラリーから275bpの 断片が増幅された。このＤＮＡ断片の塩基配列決定により、それがカテプシンＬ に似ているという明確な証拠が提供された。したがって、ＰＣＲ断片は２つの強 く保存された領域GCNGGおよびCGCSWAを含んでいた。275bpの断片を用いて、ｃＤ ＮＡライブラリーから1.3kbの挿入断片をもつ２つのクローンが同定された。こ れらのクローンの塩基配列決定により、それらが計算上の分子質量35,031Daを持 つ、313アミノ酸のタンパク質をコードする、同一のオープンリーディングフレ ーム（open reading frames）を含むことが示された（第２図）。推定されるア ミノ酸配列は、エドマン分解によって決定されたものと一致した。 プロペプチド（EX₃RX₂(V/I)FX₂NX₃IX₃N）において保存されたERFNINモチーフは 、この酵素をH型カテプシンまたはＬ型カテプシンと特徴づけるものである。カ テプシンＨはエクソ型プロテアーゼとされるにもかかわらず、カテプシンＬは効 率的なエンド型プロテアーゼとして分類される。本明細書で述べるプロテアーゼ がエンド型プロテアーゼとして同定されたことは、それらが実際にカテプシンＬ の一つの型であることを示唆する。異なる哺乳動物型に対するゾウリムシのカテ プシンＬの相同性は、高くても３５％である（表１）。テトラヒメナ（Tetrahym ena）のシステインプロテアーゼと比較した場合も、相同性はわずか３０％であ る。 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング³² Ｐ-標識PCR断片は、対応するクローンについてｃＤＮＡライブラリーをスクリ ーリングするために用いられた。この方法で同定された２種類のクローンをサザ ンブロッティング法で分析した。どちらのクローンも同一のプレプロカテプシン Ｌプロテアーゼをコードしていた。 細菌内でのカテプシンＬプロペプチドの発現 クローン化された遺伝子は、AA-1からAA-86の潜在的プロペプチド領域を含む。 オープンリーディングフレームは５つの一般的なTAA終始コドンを含み、これは ゾウリムシではＱをコードする。発現される前に、それらは部位特異的突然変異 導入法によって、CAA（Ｑをコードする）に変更された。 プロペプチド領域を含むＤＮＡ断片はＰＣＲで増幅し、発現させるために熱誘導 性に加えてhexa-Hisタグを含むベクターpEV41Cに導入した。ＰＣＲに用いたプラ イマーは、5'- AGGTCGTCATATGAATCTTTATGCAAATTGG（センス）、および5'- ATCCTCGAGTCACTTGTATTGGAAGTTAG（アンチセンス）であった。形質転換に続き、 プロペプチドは大腸菌株２１３６で発現された。発現は、４２℃で予熱しておい たLBsmp培地を加えることによって誘導した。 集菌した後、細胞をホモジナイズし、細胞残査を遠心で除いた。上清をＮｉアフ ィニティーカラム（キアジェン(Qiagen)で精製した。タンパク質は、20ｍＭ Ｔ ｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ7.5)、8.6％グリセロール、200ｍＭ ＮａＣｌおよび500ｍ Ｍイミダゾールで溶出した。予想通り、この条件では13.6kDaのサイズをもつタ ンパク質が溶出された。 阻害実験では、このプロペプチドは、わずか60ｎＭの濃度で50％までゾウリムシ 由来の30kDaカテプシンアイソザイムを阻害した（第１図）。他のプロテアーゼ （パパイン、ヒト肝カテプシンＨ、牛腎臓カテプシンBおよび白血球カテプシン Ｇ）は、プロペプチドが13μＭの濃度でも阻害されなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/04 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５Ｂ Ａ６１Ｋ 38/46 Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ａ６１Ｋ 37/54

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 繊毛虫類から得ることのできるカテプシンＬのプレプロ型。 ２． 繊毛虫がゾウリムシである、請求の範囲第１項に記載のプレプロ型タンパ ク質。 ３． 繊毛虫がパラメシウム・テトラウレリアである、請求の範囲第１項に記載 のプレプロ型タンパク質。 ４． 請求の範囲第１項から第２項の一つに記載されたカテプシンＬのプレプロ 型をコードするＤＮＡ配列。 ５． 第２図に示されたＤＮＡ配列。 ６． 第２図に示されたＤＮＡ配列のアンチセンス鎖。 ７． 第２図に示されたアミノ酸配列。 ８． 請求の範囲第４項に記載されたＤＮＡ配列の前配列。 ９． 請求の範囲第１項から第２項の一つに記載されたカテプシンＬのプレプロ 型由来のリーダー配列。 １０． 第２図に示されたＤＮＡ配列の、第１番目から第８６番目の塩基に対応 する前配列。 １１． 請求の範囲第１０項に記載された配列のアンチセンス鎖。 １２． 第２図に示されたＤＮＡ配列の、第２１番目から第８６番目の塩基に対 応する、請求の範囲第１０項に記載された配列のコーディング前配列。 １３． すべてのＴＡＡコドンが、対応する発現系においてＱをコードするコド ンに置換された、請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ配列。 １４． すべてのＴＡＡコドンが、ＣＡＡコドンに置換された、請求の範囲第１ ３項に記載のＤＮＡ配列。 １５． 請求の範囲第１２項、または第１４項の一つに記載された配列のアンチ センス鎖。 １６． −１０８番から−８７番アミノ酸に対応するアミノ酸配列。 １７． 請求の範囲第４項に記載の、ＤＮＡ配列のプロ領域。 １８． 請求の範囲第１項から第２項の一つに記載されたカテプシンＬのプレプ ロ型に含まれるプロペプチド。 １９． 第８７番から第３４７番塩基に対応する、第２図に示されたＤＮＡ配列 のプロ領域。 ２０． すべてのＴＡＡコドンが、対応する発現系においてＱをコードするコド ンに置換された、請求の範囲第１９項に記載のプロ領域。 ２１． すべてのＴＡＡコドンが、ＣＡＡコドンに置換された、請求の範囲第２ ０項に記載のプロ領域。 ２２． 請求の範囲第１９項から第２１項の一つに記載されたアンチセンス鎖。 ２３． −８６番から−１番アミノ酸に対応する、第２図において示されたアミ ノ酸配列のプロペプチド。 ２４． 繊毛虫類から得ることのできるカテプシンＬ。 ２５． 繊毛虫がゾウリムシである、請求の範囲第２４項に記載のカテプシンＬ 。 ２６． 繊毛虫がパラメシウム・テトラウレリアである、請求の範囲第２５項に 記載のカテプシンＬ。 ２７． 第２図において、第３４８番から第１２７６番塩基に対応するＤＮＡ配 列。 ２８． 第２図において、第３４８番から第９６５番塩基に対応するＤＮＡ配列 。 ２９． すべてのＴＡＡコドンが、対応する発現系においてＱをコードするコド ンに置換された、請求の範囲第２８項に記載のＤＮＡ配列。 ３０． すべてのＴＡＡコドンが、ＣＡＡコドンに置換された、請求の範囲第２ ９項に記載のＤＮＡ配列。 ３１． 請求の範囲第２７項から第３０項の一つに記載されたアンチセンス鎖。 ３２． 第２図において示されるアミノ酸配列の１番から２０５番アミノ酸に対 応するアミノ酸配列。 ３３． 繊毛虫類を適当な培地で培養し、それに続いてカテプシンＬを単離する ことからなる、請求の範囲第２４項から第２６項、および第３２項の一つに記載 されたカテプシンＬを製造する方法。 ３４． カテプシンＬが繊毛虫類細胞から単離される、請求の範囲第３３項に記 載の方法。 ３５． カテプシンＬが培養液から単離される、請求の範囲第３３項に記載の方 法。 ３６． 繊毛虫がゾウリムシである、請求の範囲第３３項から第３５項の一つに 記載の方法。 ３７． 繊毛虫がパラメシウム・テトラウレリアである、請求の範囲第３６項に 記載の方法。 ３８． カテプシンＬが請求の範囲第３２項に記載されたアミノ酸配列を有する 、請求の範囲第３３項から第３７項の一つに記載された方法。 ３９． 薬剤として用いるための、請求の範囲第２４項から第２６項、および第 ３２項の一つに記載されたカテプシンＬ。 ４０． 傷を治療する薬剤を製造するための、請求の範囲第２４項から第２６項 、および第３２項の一つに記載されたカテプシンＬの使用。 ４１． 請求の範囲第２４項から第２６項、および第３２項の一つに記載された カテプシンＬを含む、傷用軟膏。 ４２． カテプシンＬ阻害剤を同定するための、請求の範囲第２４項から第２６ 項、および第３２項の一つに記載されたカテプシンＬの使用。 ４３． 薬剤として用いるための、請求の範囲第１８項または第２３項の一つに 記載されたカテプシンＬプロペプチド。 ４４． 炎症性疾患を治療する薬剤を製造するための、請求の範囲第１８項また は第２３項の一つに記載されたカテプシンＬプロペプチドの使用。 ４５． 転移性腫瘍を治療する薬剤を製造するための、請求の範囲第１８項また は第２３項の一つに記載されたカテプシンＬプロペプチドの使用。 ４６． 細菌感染を治療する薬剤を製造するための、請求の範囲第１８項または 第２３項の一つに記載されたカテプシンＬプロペプチドの使用。 ４７． 寄生性原生動物による感染を治療する薬剤を製造するための、請求の範 囲第１８項または第２３項の一つに記載されたカテプシンＬプロペプチドの使用 。 ４８． 骨粗しょう症を治療する薬剤を製造するための、請求の範囲第１８項ま たは第２３項の一つに記載されたカテプシンＬプロペプチドの使用。 ４９． 請求の範囲第２９項に記載のＤＮＡ配列を用い、異種発現系においてカ テプシンＬを発現することを含む、請求の範囲第２４項から第２６項の一つに記 載された、カテプシンＬを調製する方法。 ５０． 請求の範囲第２０項に記載のＤＮＡ配列を用い、異種発現系においてプ ロペプチドを発現することを含む、請求の範囲第１８項または第２３項の一つに 記載された、カテプシンＬを調製する方法。 ５１． 発現系が大腸菌である、請求の範囲第５０項に記載の方法。 ５２． 請求の範囲第２１項に記載のＤＮＡ配列が、熱誘導性ベクターを用いて 大腸菌に導入される、請求の範囲第５１項に記載の方法。 ５３． リーダー配列が、繊毛虫類の分泌される組換え発現型ペプチドまたはタ ンパク質のためのシグナルとして働く、請求の範囲第９項に記載のリーダー配列 に翻訳するための、請求の範囲第８項に記載の前配列の使用。 ５４． リーダー配列が、繊毛虫類の分泌される組換え発現型ペプチドまたはタ ンパク質のためのシグナルとして働く、請求の範囲第１５項に記載のリーダー配 列に翻訳するための、請求の範囲第１０項または第１２項に記載の前配列の使用 。 ５５． カテプシンＬ阻害剤を製造するための、請求の範囲第１８項または第２ ３項に記載のカテプシンＬプロペプチド、またはその一部またはその類似体の使 用。