JPH0813271B2 - 線溶活性蛋白質およびその製造法 - Google Patents
線溶活性蛋白質およびその製造法Info
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- JPH0813271B2 JPH0813271B2 JP1308191A JP30819189A JPH0813271B2 JP H0813271 B2 JPH0813271 B2 JP H0813271B2 JP 1308191 A JP1308191 A JP 1308191A JP 30819189 A JP30819189 A JP 30819189A JP H0813271 B2 JPH0813271 B2 JP H0813271B2
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- protein
- chromatography
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- natto
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は経口投与しても線溶活性を持つ高純度な蛋白
質およびその製造法に関するものである。
質およびその製造法に関するものである。
（従来の技術） 血栓は末梢動静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞症、冠
動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網膜動静脈血栓症をはじめ
種々の疾患に関連した病因として大きな問題となってい
る。
動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網膜動静脈血栓症をはじめ
種々の疾患に関連した病因として大きな問題となってい
る。
須見らは、先に納豆菌の生産する線溶酵素の取得法を
出願した（特願昭61−162184）。さらに平谷らはその酵
素を含有してなる経口用血栓溶解剤についても出願し、
その有効性を明らかにした（特開平１−180834）。
出願した（特願昭61−162184）。さらに平谷らはその酵
素を含有してなる経口用血栓溶解剤についても出願し、
その有効性を明らかにした（特開平１−180834）。
それによれば、上記の線溶酵素は分子量約20,000の白
色粉末である。
色粉末である。
（発明が解決しようとする課題） しかしながら、これらの発表における線溶酵素は低純
度であるため、その作用の本質を究明できず、また作用
を現すためには１成犬あたり1gという多量の投与が必要
であった。
度であるため、その作用の本質を究明できず、また作用
を現すためには１成犬あたり1gという多量の投与が必要
であった。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは納豆もしくは納豆菌培養物から実質的に
純粋な線溶活性蛋白質を得ることに成功した。
純粋な線溶活性蛋白質を得ることに成功した。
先ず、本発明について簡単に説明する。
本発明の蛋白質は納豆、納豆菌または納豆菌培養物に
含まれているので、それらの材料を水もしくは塩類水溶
液のような水性溶媒で抽出し、この抽出液をアルコール
分画、硫安塩析、ブチル−セファローズ（Butyl−Sepha
rose 、ファルマシア社製）などの担体を用いる疎水ク
ロマトグラフィー、Mono−ＱやＳ−セファローズ（Mono
−Ｑ−,S−Sepharose 、ファルマシア社製）などの担
体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー、およびセ
ファクリルＳ−200（Sephacryl Ｓ−200、ファルマ
シア社製）などの担体を用いるゲル過クロマトグラフ
ィーなどのクロマトグラフィーを２以上組合せて精製す
ることにより得ることができる。高純度の蛋白質を得る
には疎水クロマトグラフィーが特に有効である。
含まれているので、それらの材料を水もしくは塩類水溶
液のような水性溶媒で抽出し、この抽出液をアルコール
分画、硫安塩析、ブチル−セファローズ（Butyl−Sepha
rose 、ファルマシア社製）などの担体を用いる疎水ク
ロマトグラフィー、Mono−ＱやＳ−セファローズ（Mono
−Ｑ−,S−Sepharose 、ファルマシア社製）などの担
体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー、およびセ
ファクリルＳ−200（Sephacryl Ｓ−200、ファルマ
シア社製）などの担体を用いるゲル過クロマトグラフ
ィーなどのクロマトグラフィーを２以上組合せて精製す
ることにより得ることができる。高純度の蛋白質を得る
には疎水クロマトグラフィーが特に有効である。
かくして得られた高純度の蛋白質について研究した結
果、その物理化学的な性質の全貌を究明することに成功
した。また、本物質は経口投与により１成犬あたり約20
mgの微量でも線溶活性を示すことを発見し、本発明を確
立するに至った。
果、その物理化学的な性質の全貌を究明することに成功
した。また、本物質は経口投与により１成犬あたり約20
mgの微量でも線溶活性を示すことを発見し、本発明を確
立するに至った。
本発明は次の式 で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドからな
り、かつ下記の特性： ａ）分子量 31,000（SDS−PAGE） ｂ）等電点 8.5〜8.9 ｃ）線溶活性 ｄ）合成基質（Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−MCA）に対す
る水解活性 を有する蛋白質、および納豆または納豆菌培養物の水性
抽出物をアルコール分画および（または）塩析に付し、
析出物を少くとも一工程の疎水クロマトグラフィーを含
むクロマトグラフィーで精製し請求項１記載の蛋白質を
含む分画を採取することを特徴とする線溶活性蛋白質の
製造法を指向する。
り、かつ下記の特性： ａ）分子量 31,000（SDS−PAGE） ｂ）等電点 8.5〜8.9 ｃ）線溶活性 ｄ）合成基質（Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−MCA）に対す
る水解活性 を有する蛋白質、および納豆または納豆菌培養物の水性
抽出物をアルコール分画および（または）塩析に付し、
析出物を少くとも一工程の疎水クロマトグラフィーを含
むクロマトグラフィーで精製し請求項１記載の蛋白質を
含む分画を採取することを特徴とする線溶活性蛋白質の
製造法を指向する。
本発明の蛋白質は納豆、納豆菌の培養物から抽出する
のがよい。
のがよい。
納豆または納豆菌培養物の水性抽出物はそれらの原料
を水または中性もしくは弱塩基性の塩類水溶液で抽出す
ることにより得られる。納豆菌を水性培地に培養して得
られる培養物の液状部分を水性抽出物として用いてもよ
い。
を水または中性もしくは弱塩基性の塩類水溶液で抽出す
ることにより得られる。納豆菌を水性培地に培養して得
られる培養物の液状部分を水性抽出物として用いてもよ
い。
抽出に用いる塩類水溶液としては、たとえば、0.01M
〜0.3Mの塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を含む
0.005M〜0.1Mのリン酸緩衝液（pH6〜８）あるいは0.01M
〜0.3Mの塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を含む
0.005M〜0.1Mのトリスヒドロキシアミノメタン（以下ト
リスと略称）緩衝液（pH7〜９）等が用いられる。
〜0.3Mの塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を含む
0.005M〜0.1Mのリン酸緩衝液（pH6〜８）あるいは0.01M
〜0.3Mの塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を含む
0.005M〜0.1Mのトリスヒドロキシアミノメタン（以下ト
リスと略称）緩衝液（pH7〜９）等が用いられる。
この粗抽出液に有機溶媒あるいは塩類を加えることに
より粗沈澱分画を得ることができる。例示すれば、エタ
ノールあるいはメタノールのようなアルコール類を60％
〜80％（v/v）好ましくは75％（V/v）加えることによ
り、あるいは硫酸アンモニウム（以下硫安と略称）を40
〜60％（w/v）好ましくは50％（w/v）加えることにより
粗沈澱分画を得ることができる。
より粗沈澱分画を得ることができる。例示すれば、エタ
ノールあるいはメタノールのようなアルコール類を60％
〜80％（v/v）好ましくは75％（V/v）加えることによ
り、あるいは硫酸アンモニウム（以下硫安と略称）を40
〜60％（w/v）好ましくは50％（w/v）加えることにより
粗沈澱分画を得ることができる。
その粗沈澱分画は、更に次の様なクロマトグラフィー
を行うことにより更に精製することができる。硫安を含
む中性あるいは弱アルカリ性の緩衝液で平衡化したブチ
ル−セファローズ 、アルキル−セファローズ （ファ
ルマシア社製）等の疎水性の基を持つ担体に吸着させ、
この担体から水あるいは中性あるいは弱アルカリ性の緩
衝液により抽出精製することができる。例示すれば、吸
着には1.3〜2Mの硫安を含むpH6〜８のリン酸緩衝液ある
いは同様な硫安を含むpH7〜９のトリス緩衝液が用いら
れる。また溶出には水あるいは0.005M〜1.2Mのリン酸緩
衝液（pH6〜８）のあるいは0.005M〜1.2Mのトリス緩衝
液（pH7〜９）が用いられる。また、別の精製法とし
て、中性あるいは弱アルカリ性の緩衝液で平衡化した陰
イオン交換体に供することにより共存する不純物を吸着
除去させることもできる。例示すれば、0.005M〜0.05M
のリン酸緩衝液（pH6〜８）等の緩衝液で平衡化した、
粒子分布を極めて狭くしたモノ・キュー（Mono−Ｑ）や
セファローズの架橋度を増して物理的にも化学的にも強
くしたＱ−セファローズ・ファスト・フロー（Ｑ−Seph
arose Fast Flow、ファルマシア社製）等の強塩基性陰
イオン交換体を用いることができる。さらに、中性ある
いは弱アルカリ性の緩衝液で平衡化した陽イオン交換体
に吸着させ、塩類を含む中性あるいは弱アルカリ性の緩
衝液で溶出させることにより精製することもできる。例
示すれば、吸着担体としては、0.005M〜0.05Mのリン酸
緩衝液（pH6〜８）等の緩衝液で平衡化したＳ−セファ
ローズ ファスト・フロウ（ファルマシア社製）等の陽
イオン交換体を用いることができる。担体からの本酵素
の溶出には、0.2〜1M好ましくは0.4〜0.6Mの塩化ナトリ
ウムを含む0.005M〜0.05Mのリン酸緩衝液（pH6〜８）あ
るいは0.005M〜0.05Mのトリス緩衝液（pH7〜９）等の緩
衝液を用いることができる。更にまた本酵素は、塩類を
含む中性あるいは弱アルカリ性の緩衝液で平衡化したゲ
ル濾過担体に供することにより精製することができる。
例示すれば、ゲル濾過担体としては、Sephacryl S−200
やSephadex G−75等を用いることができる。平衡化に
は、0.05〜0.5M好ましくは0.2Mの塩化ナトリウムを含む
0.005M〜0.05Mのリン酸緩衝液（pH6〜８）あるいは0.00
5M〜0.05Mのトリス緩衝液（pH7〜９）等の緩衝液を用い
ることができる。
を行うことにより更に精製することができる。硫安を含
む中性あるいは弱アルカリ性の緩衝液で平衡化したブチ
ル−セファローズ 、アルキル−セファローズ （ファ
ルマシア社製）等の疎水性の基を持つ担体に吸着させ、
この担体から水あるいは中性あるいは弱アルカリ性の緩
衝液により抽出精製することができる。例示すれば、吸
着には1.3〜2Mの硫安を含むpH6〜８のリン酸緩衝液ある
いは同様な硫安を含むpH7〜９のトリス緩衝液が用いら
れる。また溶出には水あるいは0.005M〜1.2Mのリン酸緩
衝液（pH6〜８）のあるいは0.005M〜1.2Mのトリス緩衝
液（pH7〜９）が用いられる。また、別の精製法とし
て、中性あるいは弱アルカリ性の緩衝液で平衡化した陰
イオン交換体に供することにより共存する不純物を吸着
除去させることもできる。例示すれば、0.005M〜0.05M
のリン酸緩衝液（pH6〜８）等の緩衝液で平衡化した、
粒子分布を極めて狭くしたモノ・キュー（Mono−Ｑ）や
セファローズの架橋度を増して物理的にも化学的にも強
くしたＱ−セファローズ・ファスト・フロー（Ｑ−Seph
arose Fast Flow、ファルマシア社製）等の強塩基性陰
イオン交換体を用いることができる。さらに、中性ある
いは弱アルカリ性の緩衝液で平衡化した陽イオン交換体
に吸着させ、塩類を含む中性あるいは弱アルカリ性の緩
衝液で溶出させることにより精製することもできる。例
示すれば、吸着担体としては、0.005M〜0.05Mのリン酸
緩衝液（pH6〜８）等の緩衝液で平衡化したＳ−セファ
ローズ ファスト・フロウ（ファルマシア社製）等の陽
イオン交換体を用いることができる。担体からの本酵素
の溶出には、0.2〜1M好ましくは0.4〜0.6Mの塩化ナトリ
ウムを含む0.005M〜0.05Mのリン酸緩衝液（pH6〜８）あ
るいは0.005M〜0.05Mのトリス緩衝液（pH7〜９）等の緩
衝液を用いることができる。更にまた本酵素は、塩類を
含む中性あるいは弱アルカリ性の緩衝液で平衡化したゲ
ル濾過担体に供することにより精製することができる。
例示すれば、ゲル濾過担体としては、Sephacryl S−200
やSephadex G−75等を用いることができる。平衡化に
は、0.05〜0.5M好ましくは0.2Mの塩化ナトリウムを含む
0.005M〜0.05Mのリン酸緩衝液（pH6〜８）あるいは0.00
5M〜0.05Mのトリス緩衝液（pH7〜９）等の緩衝液を用い
ることができる。
これらのクロマトグラフィーを２以上組み合わせるこ
とにより高純度な本線溶活性蛋白質を取得することがで
きる。
とにより高純度な本線溶活性蛋白質を取得することがで
きる。
かくして得られる蛋白質は、成人１日当り20〜500m
g、好ましくは50〜300mg、を１回から数回に分けて経口
的に投与することにより血栓を溶解させ、あるいは血栓
の形成を予防することができる。
g、好ましくは50〜300mg、を１回から数回に分けて経口
的に投与することにより血栓を溶解させ、あるいは血栓
の形成を予防することができる。
以下この蛋白質について詳述する。
本発明の蛋白質は、アミノ末端より で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドからな
る構造を有し、かつ下記特性を有する。
る構造を有し、かつ下記特性を有する。
ａ）分子量 31,000（SDS−PAGE） ｂ）等電点 8.5〜8.9 ｃ）フィブリン塊に対する水解活性 ｄ）合成基質に対する水解活性 上記の物性は、以下に記載する実験例ａ）〜ｄ）の各
方法によって測定したものである。
方法によって測定したものである。
実験例 ａ）分子量測定法 実施例１で記載した方法で調製した蛋白質のサンプル
にSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）とβ−メルカプトエ
タノールを加えて100℃３分間煮沸した。
にSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）とβ−メルカプトエ
タノールを加えて100℃３分間煮沸した。
かくして得られたSDS化したサンプルを12.5％のアク
リルアミドゲル（Phast Gel Homoge−neous ，ファル
マシア社製）12.5％とSDSバッファ・ストリップ（buffe
r strip）を用いて電気泳動装置ファスト・システム（P
hast System ，ファルマシア社製）によりSDS−電気泳
動（SDS−PAGE）を行った。
リルアミドゲル（Phast Gel Homoge−neous ，ファル
マシア社製）12.5％とSDSバッファ・ストリップ（buffe
r strip）を用いて電気泳動装置ファスト・システム（P
hast System ，ファルマシア社製）によりSDS−電気泳
動（SDS−PAGE）を行った。
染色は電気泳動用銀染色キット（シルバーステインカ
ントー ，関東化学社製）を用いて行った。電気泳動用
分子量測定キット（HMW Kit E（低分子用））を用いて
検量線を作製し、蛋白質の分子量を決定した。本発明の
蛋白質は分子量31,000の位置に単一染色バンドを示し
た。
ントー ，関東化学社製）を用いて行った。電気泳動用
分子量測定キット（HMW Kit E（低分子用））を用いて
検量線を作製し、蛋白質の分子量を決定した。本発明の
蛋白質は分子量31,000の位置に単一染色バンドを示し
た。
ｂ）等電点測定法 加藤製作所製の等電点電気泳動装置（110ml）を用
い、アンフォラインpH3.5〜10.0とアンフォラインpH7.0
〜9.0（ファルマシア社製）にショ糖を加えた液を重層
することによりカラムの下層程密度の濃いショ糖密度勾
配を作製した。その際、実施例１で記載した方法で調製
した蛋白質をカラムの中央に重層した。４℃に冷却しな
がら、定電圧500Vで43時間通電することによりpH勾配を
作製した。溶液を、下層から順次取り出すことによりpH
の次第に増加する80個の画分を得た。それぞれの画分の
蛋白量（280nmの吸光度）とpH及フィブリン溶解活性と
アミダーゼ活性を測定した。
い、アンフォラインpH3.5〜10.0とアンフォラインpH7.0
〜9.0（ファルマシア社製）にショ糖を加えた液を重層
することによりカラムの下層程密度の濃いショ糖密度勾
配を作製した。その際、実施例１で記載した方法で調製
した蛋白質をカラムの中央に重層した。４℃に冷却しな
がら、定電圧500Vで43時間通電することによりpH勾配を
作製した。溶液を、下層から順次取り出すことによりpH
の次第に増加する80個の画分を得た。それぞれの画分の
蛋白量（280nmの吸光度）とpH及フィブリン溶解活性と
アミダーゼ活性を測定した。
第１図にその結果を示した。本発明になる蛋白質の等
電点は8.5〜8.9であった。
電点は8.5〜8.9であった。
ｃ）フィブリン平板を用いる活性評価（フィブリン溶解
活性） フィブリン標準平板（T.Astrup and S.Mullertz,Arch
s.Bichem.Biophys.,40,346−351,1952）を作製し、実施
例１で記載した方法で調製した蛋白質を10μｌスポット
して37℃に18時間保った後、フィブリン膜の溶解面積
（mm2）を測定した。蛋白質４倍希釈液のフィブリン溶
解面積は、240.3mm2/mlであった。
活性） フィブリン標準平板（T.Astrup and S.Mullertz,Arch
s.Bichem.Biophys.,40,346−351,1952）を作製し、実施
例１で記載した方法で調製した蛋白質を10μｌスポット
して37℃に18時間保った後、フィブリン膜の溶解面積
（mm2）を測定した。蛋白質４倍希釈液のフィブリン溶
解面積は、240.3mm2/mlであった。
ｄ）Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−MCA基質を用いるアミダ
ーゼ活性評価 実施例１で記載した方法で調製したナットウキナーゼ
のアミダーゼ活性をペプチド研究所製のSuc−Ala−Ala
−Pro−Phe−MCAを用いて測定した。Suc−Ala−Ala−Pr
o−Phe−MCAをジメチルスルフォオキサイド（DMSO）を
用いて溶解した後、0.15Mの塩化ナトリウムを含む0.05M
トリス塩酸緩衝液,pH8.0に溶解して、10mMの基質溶液と
した。蛋白質を0.15Mの塩化ナトリウムを含む0.05Mトリ
ス塩酸緩衝液,pH8.0で適当に希釈してサンプル溶液とし
た。37℃に保った1mlの基質溶液に0.1mlのサンプル溶液
を加えて37℃、30分間反応させた。反応の停止は、4ml
の17％酢酸で行った。Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−MCAが
水解されて生じた、４メチルクマリン（AMC）の量を、
島津製作所製の蛍光光度計を用いて、380nmの光で励起
させ、460nmの発光した蛍光の強度を、既知量のAMCによ
るそれと比較することにより求めた。アミダーゼ活性1M
CAUは１分間当たりにSuc−Ala−Ala−Pro−Phe−MCAを
水解して１ナノモルのAMCを生成させる酵素量で表わし
た。
ーゼ活性評価 実施例１で記載した方法で調製したナットウキナーゼ
のアミダーゼ活性をペプチド研究所製のSuc−Ala−Ala
−Pro−Phe−MCAを用いて測定した。Suc−Ala−Ala−Pr
o−Phe−MCAをジメチルスルフォオキサイド（DMSO）を
用いて溶解した後、0.15Mの塩化ナトリウムを含む0.05M
トリス塩酸緩衝液,pH8.0に溶解して、10mMの基質溶液と
した。蛋白質を0.15Mの塩化ナトリウムを含む0.05Mトリ
ス塩酸緩衝液,pH8.0で適当に希釈してサンプル溶液とし
た。37℃に保った1mlの基質溶液に0.1mlのサンプル溶液
を加えて37℃、30分間反応させた。反応の停止は、4ml
の17％酢酸で行った。Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−MCAが
水解されて生じた、４メチルクマリン（AMC）の量を、
島津製作所製の蛍光光度計を用いて、380nmの光で励起
させ、460nmの発光した蛍光の強度を、既知量のAMCによ
るそれと比較することにより求めた。アミダーゼ活性1M
CAUは１分間当たりにSuc−Ala−Ala−Pro−Phe−MCAを
水解して１ナノモルのAMCを生成させる酵素量で表わし
た。
実施例１で製造して得た蛋白質のSuc−Ala−Ala−Pro
−Phe−MCA基質水解活性は107.6MCAU/mlであった。
−Phe−MCA基質水解活性は107.6MCAU/mlであった。
ｅ）アミノ酸組成 実施例１で記載した方法で調製した蛋白質各220ピコ
モルを減圧封管中で１％フェノールを含む6N塩酸により
110℃で各24,48,72時間加水分解した後ベックマン社製
モデル6300型アミノ酸分析機を用いて、ニンヒドリン発
色により各アミノ酸の組成を分析した。ただし、セリ
ン、スレオニンについては０時に外挿し、また、バリ
ン、イソロイシン及びロイシンについては72時間値を用
いた。さらに、トリプトファンについては、3Nメルカプ
トエタンスルホン酸により加水分解して求めた。また、
過ギ酸酸化を行った後アミノ酸分析を行った結果、シス
チン（＋システイン）は、含まれていないことが分かっ
た。純粋な蛋白質のアミノ酸組成及び実施例１で後述す
るアミノ酸配列は、本発明に至る過程で製造法を鋭意検
討し、純度の高い蛋白質を用いてはじめて成功すること
ができた。
モルを減圧封管中で１％フェノールを含む6N塩酸により
110℃で各24,48,72時間加水分解した後ベックマン社製
モデル6300型アミノ酸分析機を用いて、ニンヒドリン発
色により各アミノ酸の組成を分析した。ただし、セリ
ン、スレオニンについては０時に外挿し、また、バリ
ン、イソロイシン及びロイシンについては72時間値を用
いた。さらに、トリプトファンについては、3Nメルカプ
トエタンスルホン酸により加水分解して求めた。また、
過ギ酸酸化を行った後アミノ酸分析を行った結果、シス
チン（＋システイン）は、含まれていないことが分かっ
た。純粋な蛋白質のアミノ酸組成及び実施例１で後述す
るアミノ酸配列は、本発明に至る過程で製造法を鋭意検
討し、純度の高い蛋白質を用いてはじめて成功すること
ができた。
第１表はそのアミノ酸組成分析の結果を示し、スブチ
リシン族のいくつかの酵素ことにスブチリシンアミロサ
ッカリティカスと高いホモロジーを示すことが判明し
た。
リシン族のいくつかの酵素ことにスブチリシンアミロサ
ッカリティカスと高いホモロジーを示すことが判明し
た。
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に述べる。
実施例１ 市販納豆20kgを生理食塩液35Lで抽出して1.8MCAU/mg
蛋白の粗抽出液を得た。この抽出液にエタノールを加え
て50％溶液とした時の遠心上清に更にエタノールを加え
て75％エタノール沈澱分画936gを得た。この沈澱を1.5M
硫安を含む0.01M PB（リン酸塩緩衝液）,7.0に溶解し
た後同じ緩衝液で平衡化したブチル−セファローズ（Bu
tyl−Sepharose 、ファルマシア社製）に吸着させ、0.
01M PB,pH7.0で溶出した後50％w/vの硫安を加えて塩析
することにより193MCAU/mg蛋白の蛋白質1085mgを得た。
ブチル−セファローズとそれに続く硫安塩析の工程精製
効率は20.3倍であった。ここまでの工程の活性回収率は
42.5％であった。さらにこの画分を脱塩濃縮した後0.01
M トリス塩酸,pH7.0で平衡化した1mlの陰イオン交換体
Mono−Ｑカラム（ファルマシア社製）を通過させること
により204MCAU/mg蛋白の蛋白質706mgを得た。この蛋白
質画分を1.5M硫安を含む0.01M PB,7.0に溶解した後同
じ緩衝液で平衡化したアルキル−スーパーローズ（Alky
l−Superose、ファルマシア社製）1mlに吸着させ、1.2M
の硫安を含む0.01M PB,pH7.0で溶出する疎水クロマト
グラフィーにより390MCAU/mg蛋白の蛋白質277mg蛋白を
得た。全工程の活性回収率は22.0％であった。この精製
蛋白質画分の物性並びに純度については先に物性の実験
例に示した。
蛋白の粗抽出液を得た。この抽出液にエタノールを加え
て50％溶液とした時の遠心上清に更にエタノールを加え
て75％エタノール沈澱分画936gを得た。この沈澱を1.5M
硫安を含む0.01M PB（リン酸塩緩衝液）,7.0に溶解し
た後同じ緩衝液で平衡化したブチル−セファローズ（Bu
tyl−Sepharose 、ファルマシア社製）に吸着させ、0.
01M PB,pH7.0で溶出した後50％w/vの硫安を加えて塩析
することにより193MCAU/mg蛋白の蛋白質1085mgを得た。
ブチル−セファローズとそれに続く硫安塩析の工程精製
効率は20.3倍であった。ここまでの工程の活性回収率は
42.5％であった。さらにこの画分を脱塩濃縮した後0.01
M トリス塩酸,pH7.0で平衡化した1mlの陰イオン交換体
Mono−Ｑカラム（ファルマシア社製）を通過させること
により204MCAU/mg蛋白の蛋白質706mgを得た。この蛋白
質画分を1.5M硫安を含む0.01M PB,7.0に溶解した後同
じ緩衝液で平衡化したアルキル−スーパーローズ（Alky
l−Superose、ファルマシア社製）1mlに吸着させ、1.2M
の硫安を含む0.01M PB,pH7.0で溶出する疎水クロマト
グラフィーにより390MCAU/mg蛋白の蛋白質277mg蛋白を
得た。全工程の活性回収率は22.0％であった。この精製
蛋白質画分の物性並びに純度については先に物性の実験
例に示した。
精製蛋白質は、リシルエンドペプチダーゼ（Achromob
acter プロテアーゼＩ）でフラグメントに消化後逆相HP
LCで精製して９つの分画を得た。それぞれのペプチドフ
ラグメントのアミノ酸配列をアプライド・バイオシステ
ム社製Model 477A/120Aに供して決定した。なお必要に
応じてそれぞれのペプチドフラグメントを更にキモトリ
プシン消化後精製してアミノ酸配列を決定した。その結
果を第２表に示す。スブチリシンアミロサッカリティカ
スに対する蛋白質のアミノ酸配列の変異は130 S→130T,102S→102T,192A→192V,259D→259N,の４箇
所であった。
acter プロテアーゼＩ）でフラグメントに消化後逆相HP
LCで精製して９つの分画を得た。それぞれのペプチドフ
ラグメントのアミノ酸配列をアプライド・バイオシステ
ム社製Model 477A/120Aに供して決定した。なお必要に
応じてそれぞれのペプチドフラグメントを更にキモトリ
プシン消化後精製してアミノ酸配列を決定した。その結
果を第２表に示す。スブチリシンアミロサッカリティカ
スに対する蛋白質のアミノ酸配列の変異は130 S→130T,102S→102T,192A→192V,259D→259N,の４箇
所であった。
実施例２ 納豆20kgから実施例１のブチル−セファローズ溶出ま
で同様にして得られた粗製蛋白質630mgを次の方法で更
に精製した。
で同様にして得られた粗製蛋白質630mgを次の方法で更
に精製した。
この粗製蛋白質を0.05Mリン酸緩衝液（pH7.0）に平衡
化したＳ−Sepharose Fast Flow（ファルマシア社製）
に吸着し0.5Mの塩化ナトリウムを含む0.05Mリン酸緩衝
液（pH7.0）により溶出しさらに0.2M塩化ナトリウムを
含む10mMリン酸緩衝液（pH7.4）で平衡化したセファク
リルＳ−200（ファルマシア社製）により精製して、379
MCAU/mg蛋白の精製蛋白質分画257mgを蛋白を得た。全工
程の活性回収率は18.0％であった。
化したＳ−Sepharose Fast Flow（ファルマシア社製）
に吸着し0.5Mの塩化ナトリウムを含む0.05Mリン酸緩衝
液（pH7.0）により溶出しさらに0.2M塩化ナトリウムを
含む10mMリン酸緩衝液（pH7.4）で平衡化したセファク
リルＳ−200（ファルマシア社製）により精製して、379
MCAU/mg蛋白の精製蛋白質分画257mgを蛋白を得た。全工
程の活性回収率は18.0％であった。
実施例３ 予め普通寒天培地に予備培養しておいた納豆菌100ml
をヘンネベルグ液10000mlに接種し、43−45℃で45時間
振とう培養した。次にその納豆菌培養液を1,850×g 10
分間遠心しこの上清に50％（w/v）の硫安を加えて塩析
して35gの粗製品を得た。この粗製品を実施例１に従っ
て、ブチル−セファローズ、Mono−Ｑ、アルキル−スー
パーローズの順に精製して、310MCAU/mg蛋白の精製蛋白
質分画53mg蛋白を得た。全体のMCA活性回収率は、18.9
％であった。
をヘンネベルグ液10000mlに接種し、43−45℃で45時間
振とう培養した。次にその納豆菌培養液を1,850×g 10
分間遠心しこの上清に50％（w/v）の硫安を加えて塩析
して35gの粗製品を得た。この粗製品を実施例１に従っ
て、ブチル−セファローズ、Mono−Ｑ、アルキル−スー
パーローズの順に精製して、310MCAU/mg蛋白の精製蛋白
質分画53mg蛋白を得た。全体のMCA活性回収率は、18.9
％であった。
実施例４（効力） 外側伏在静脈に佐々木らの方法（K.Sasaki et al Lif
e Science 27,1659−1665,1980）で0.4mlの５％牛フィ
ブリノーゲンと0.2mlの50単位/mlの牛トロンビンを用い
て人工血栓を作製した雑種成犬（10〜16kg、雄）に実施
例１で記載した方法で調製した蛋白質の腸溶カプセル剤
（10mg/カプセル）を一度に４個経口投与し、それが十
二指腸へ移行した後経時的に採血し、前述佐々木らの方
法に従ってユーグロブリン溶解時間（ELT）を測定する
と共に鼠径部の大動脈よりアンギオグラフィン（Angiog
rafin、Schering社西独）を4ml/2秒で注入し、Ｘ線によ
る血管像影を行った。その結果、本蛋白質を含まないカ
プセルを投与した対象群（Ｎ＝３）のELTが30分〜12時
間にわたって変化がなく、また人工血栓の溶解も認めら
れなかったのに対して、水蛋白質投与群（ｎ＝３）では
ELTは30分後に33±６分（ｐ＜0.02）、１時間目には42
±10分（ｐ＜0.09）、３時間目には52±８分（ｐ＜0.
5）、そして６時間目でも53±８分（ｐ＜0.5）と投与後
に短縮（即ち線溶亢進）が認められた。また人工血栓も
本蛋白質投与群では、ELTの５時間以内に完全溶解する
ことが確認された。
e Science 27,1659−1665,1980）で0.4mlの５％牛フィ
ブリノーゲンと0.2mlの50単位/mlの牛トロンビンを用い
て人工血栓を作製した雑種成犬（10〜16kg、雄）に実施
例１で記載した方法で調製した蛋白質の腸溶カプセル剤
（10mg/カプセル）を一度に４個経口投与し、それが十
二指腸へ移行した後経時的に採血し、前述佐々木らの方
法に従ってユーグロブリン溶解時間（ELT）を測定する
と共に鼠径部の大動脈よりアンギオグラフィン（Angiog
rafin、Schering社西独）を4ml/2秒で注入し、Ｘ線によ
る血管像影を行った。その結果、本蛋白質を含まないカ
プセルを投与した対象群（Ｎ＝３）のELTが30分〜12時
間にわたって変化がなく、また人工血栓の溶解も認めら
れなかったのに対して、水蛋白質投与群（ｎ＝３）では
ELTは30分後に33±６分（ｐ＜0.02）、１時間目には42
±10分（ｐ＜0.09）、３時間目には52±８分（ｐ＜0.
5）、そして６時間目でも53±８分（ｐ＜0.5）と投与後
に短縮（即ち線溶亢進）が認められた。また人工血栓も
本蛋白質投与群では、ELTの５時間以内に完全溶解する
ことが確認された。
以上の事実から、本発明の蛋白質は既知のナットウキ
ナーゼの有効投与量1g以上に比較して飛躍的に少い投与
量で線溶効果を示すことが判る。
ナーゼの有効投与量1g以上に比較して飛躍的に少い投与
量で線溶効果を示すことが判る。
（発明の効果） 本発明によれば、少量の経口投与で線溶活性を示す無
害の高純度蛋白質が提供され、経口用血栓溶解剤として
使用できる。
害の高純度蛋白質が提供され、経口用血栓溶解剤として
使用できる。
第１図は実験例ｂ）における本発明の蛋白質の等電点分
画の結果を示すものである。
画の結果を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/32 8318−4Ｈ //(Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 加藤 和夫 兵庫県神戸市北区南五葉３丁目８番15号 (56)参考文献 特開 平１−180834（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−162184（ＪＰ，Ａ)
Claims (5)
- 【請求項１】次の式 で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドからな
り、かつ下記の特性： ａ）分子量 31,000（SDS−PAGE） ｂ）等電点 8.5〜8.9 ｃ）線溶活性 ｄ）合成基質（Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−MCA）に対す
る水解活性 を有する蛋白質。 - 【請求項２】請求項１記載の蛋白質よりなる線溶酵素。
- 【請求項３】請求項１記載の蛋白質を含んでなる経口用
血栓溶解剤。 - 【請求項４】納豆もしくは納豆菌培養物の水性抽出物を
アルコール分画および（または）塩析に付し、析出物を
少くとも一工程の疎水クロマトグラフィーを含むクロマ
トグラフィーで精製し請求項１記載の蛋白質を含む分画
を採取することを特徴とする線溶活性蛋白質の製造法。 - 【請求項５】クロマトグラフィーが疎水クロマトグラフ
ィーおよび陰イオンクロマトグラフィ、またはさらにゲ
ル過クロマトグラフィーを含む請求項２記載の製造
法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1308191A JPH0813271B2 (ja) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | 線溶活性蛋白質およびその製造法 |
| DE69012958T DE69012958T2 (de) | 1989-11-27 | 1990-11-27 | Fibrinolytisches Protein und Herstellungsweise dafür. |
| EP90312855A EP0430637B1 (en) | 1989-11-27 | 1990-11-27 | Fibrinolytic protein and production method thereof |
| ES90312855T ES2063292T3 (es) | 1989-11-27 | 1990-11-27 | Proteina fibrinolitica y su metodo de elaboracion. |
| CA002030927A CA2030927A1 (en) | 1989-11-27 | 1990-11-27 | Fibrinolytic protein and production method thereof |
| US08/067,180 US5750650A (en) | 1989-11-27 | 1993-05-24 | Fibrinolytic protein and production method thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1308191A JPH0813271B2 (ja) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | 線溶活性蛋白質およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03168082A JPH03168082A (ja) | 1991-07-19 |
| JPH0813271B2 true JPH0813271B2 (ja) | 1996-02-14 |
Family
ID=17978012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1308191A Expired - Lifetime JPH0813271B2 (ja) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | 線溶活性蛋白質およびその製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0430637B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0813271B2 (ja) |
| CA (1) | CA2030927A1 (ja) |
| DE (1) | DE69012958T2 (ja) |
| ES (1) | ES2063292T3 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0624642B1 (en) * | 1993-05-12 | 1999-01-20 | Indian Council For Medical Research | Novel thrombolytic agent, process for preparing same and its use for the preparation of a thrombi dissolving medicament |
| WO2006025276A1 (ja) * | 2004-08-31 | 2006-03-09 | Kumamoto University | ナットウキナーゼを含む眼科疾患の治療・予防剤 |
| JP2006143601A (ja) | 2004-11-16 | 2006-06-08 | Yamato Yakuhin Kk | 血液粘度低下剤 |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE81141B1 (en) * | 1983-06-24 | 2000-04-05 | Genencor Int | Procaryotic carbonyl hydrolases |
-
1989
- 1989-11-27 JP JP1308191A patent/JPH0813271B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-11-27 CA CA002030927A patent/CA2030927A1/en not_active Abandoned
- 1990-11-27 ES ES90312855T patent/ES2063292T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-27 DE DE69012958T patent/DE69012958T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-27 EP EP90312855A patent/EP0430637B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2063292T3 (es) | 1995-01-01 |
| EP0430637B1 (en) | 1994-09-28 |
| DE69012958T2 (de) | 1995-02-02 |
| DE69012958D1 (de) | 1994-11-03 |
| CA2030927A1 (en) | 1991-05-28 |
| JPH03168082A (ja) | 1991-07-19 |
| EP0430637A1 (en) | 1991-06-05 |
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Legal Events
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