JP2000507105A - 触媒抗体の前駆体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｂ細胞マイトジェネシスを誘導することができる、Ｂ細飽表面分子結合部分を含む触媒抗体の成長因子または前駆体に関する。好ましいＢ細胞表面分子結合部分は、ペプトストレプトコッカス・マグヌスからのプロテインＬ、プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＨの免疫グロブリン結合分子である。Ｂ細胞マイトジェネシスを誘導する能力を有する成長因子はまた、それに対する触媒抗体を得ようとする抗原にさらに結合させることができる。ついで、Ｂ細胞マイトジェネシスは、Ｂ細胞表面上での触媒抗体による成長因子の抗原部分の触媒開裂に依存する。本発明の方法は、治療または診断目的のために触媒抗体を生成させるのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 触媒抗体の前駆体 本発明は一般に触媒抗体に関し、より詳しくは該触媒抗体の新規製造法に関す る。本発明の方法は、その一部を、Ｂ細胞マイトジェネシス（mitogenesis）を 誘導する触媒産物の利用に基づいている。好ましい態様において、Ｂ細胞マイト ジェネシスを誘導する能力を有する成長因子を、その触媒抗体を得ようとする標 的抗原に結合させる。ついで、Ｂ細胞マイトジェネシスは、Ｂ細胞表面上での触 媒抗体による該成長因子の抗原部分の触媒開裂に依存することになる。本発明の 方法は、治療および診断の両目的のために触媒抗体を産生するのに有用である。 本明細書中で言及するヌクレオチドおよびアミノ酸についての配列同定番号（ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）は実施例に従って定義される。 急速に精巧の度を増している組換えＤＮＡ技術は、医学および同類の健康分野 における研究および開発を著しく容易にしている。特に重要な研究領域は、免疫 応答機構を刺激する組換え抗原の使用およびその結果である。しかしながら、現 在までのところ、組換え技術は触媒抗体の生成において特に有効というわけでは ない。 触媒抗体は、たとえば、タンパク質分解によりタンパク質を活性化あるいは不 活化するのに用いる、極めて基質特異的な触媒である。触媒抗体は、なかでも慢 性関節リウマチ、ＡＩＤＳおよびアルツハイマー病などのヒト疾患の治療剤とし ての大きな可能性を有する。 抗体療法は、すでに患者において日常的に用いられている。抗体はヒトの循環 系において約２３日の半減期を有し、この点は他の薬剤に比べて明らかな利点で ある。しかしながら、触媒抗体は、さらに一層効果的であると考えられている。 触媒抗体は、それが抗原と出会った後に再利用され、「古典的な」抗体でのよう に抗原に結合することはない。それゆえ、触媒抗体は古典的な抗体よりもはるか に低投与量で機能することができ、免疫原投与量以下で用いることができるに違 いない。触媒抗体はとりわけ長期の治療において有用である。 触媒抗体は伝統的にマウスを遷移状態の類似体で免疫することにより産生され てきた。かかる抗体は、いくつかの化学反応を触媒することが示されている。し かしながら、このアプローチは、特定のタンパク質のタンパク質加水分解に影響 を及ぼす遷移状態類似体の構造を予測することが困難であるという点で重大な限 界を有する。マウスを遷移状態類似体で免疫することは、役に立たない定義によ るものである。なぜなら、それはＢ細胞の選択を表面免疫グロブリンが該類似体 に結合する能力に基づいて行うのであって、表面免疫グロブリンの触媒活性に基 づいて行うものではないからである。このことは、触媒抗体が比較的低い代謝回 転速度を有し天然の酵素対応物と競合しえない理由の一つである。その結果、触 媒酵素はこれまでは治療または診断手段として傑出したものとはならなかった。 それゆえ、所望の触媒特異性を有する触媒抗体を産生するための一層効果的な アプローチを開発することに対する必要性が存在する。本発明に従い、本発明者 らは、Ｂ細胞マイトジェネシスを誘導する能力を有する組換えまたは合成成長因 子に基づいてかかるアプローチを開発した。該成長因子の前駆体形態は、「触媒 性の」Ｂ細胞を選択する。それゆえ、本発明は、Ｂ細胞活性化のための触媒産物 の利用（抗原結合部位に依存しない）を提供する。 従って、本発明の一つの側面は、Ｂ細胞表面分子結合部分を含む組換えまたは 合成成長因子またはその前駆体に関し、その際、該成長因子または該前駆体の触 媒産物はＢ細胞マイトジェネシスを誘導することができる。 さらに詳しくは、本発明は、Ｂ細胞表面分子結合部分を含む組換えまたは合成 成長因子を提供するものであり、その際、該成長因子はＢ細胞マイトジェネシス を誘導する。 本発明の一つの側面において、組換えまたは合成成長因子は、Ｂ細胞表面分子 結合部分および該成長因子がＢ細胞マイトジェネシスを誘導するようにＢ細胞に Ｔ細胞依存性のヘルプ（加勢）（help）を提供する部分を含む。 他の側面において、Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分は該成長因 子に独立して提供される。Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する外部より提 供される部分の一例は、抗ＣＤ４０抗体またはその機能的等価物である。 特に好ましい態様において、Ｂ細胞表面分子結合部分はＢ細胞表面免疫グロブ リン結合部分を含むが、本発明は、その結合、相互作用および／または架橋がＢ 細胞マイトジェネシスに導くかまたは有糸分裂生起を容易にする所定範囲のＢ細 胞表面分子をも包含する。本明細書において、以下、「Ｂ細胞表面分子」への言 及はＢ細胞表面免疫グロブリンへの言及を含む。Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプ を提供する部分はＴ細胞エピトープが好ましいが、これに限られるわけではない 。本明細書において、以下、「Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分」 への言及はＴ細胞エピトープを含む。 本発明は、さらにＢ細胞マイトジェネシスを誘導しうる組成物をも包含し、該 組成物は下記より選ばれる成分を含む： （i）Ｂ細胞表面分子結合部分を含む組換えまたは合成分子； （ii）Ｂ細胞表面分子結合部分を含む多量体の形態の組換えまたは合成分子； （iii）Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分をさらに含む、（i）また は（ii）の組換えまたは合成分子；および （iv）使用前に混合するかまたは順番にまたは同時に使用する別々の組成物であ って、Ｂ細胞表面分子結合部分を有する成分を第一の組成物中に含み、およびＢ 細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供しうる分子を第二の組成物中に含む組成物。 好ましくは、Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供しうる分子は、Ｔ細胞エピ トープまたは抗ＣＤ４０抗体またはその機能的な等価物である。 好ましくは、Ｂ細胞表面分子を架橋して芽体発生（blastogenesis）を確実に するため、成長因子は少なくとも２つのＢ細胞表面分子結合部分を含む。別の態 様において、成長因子が多量体の形態にて存在する場合には、該分子は単一のＢ 細胞表面分子結合部分を含んでいてよい。 さらに一層好ましくは、成長因子は、少なくとも２つのＢ細胞表面分子結合部 分によりフランキングされた、隣接したまたは近位にあるＴ細胞エピトープ部分 を含む。Ｂ細胞表面でのＴ細胞エピトープの提示はＢ細胞マイトジェネシスを可 能とする。本明細書において「Ｂ細胞マイトジェネシス」なる術語はその最も広 義にて用い、Ｂ細胞の活性化、クローン拡張、親和性成熟（affinitymaturation ）および／または抗体分泌並びに増殖および分化を含む。本明細書において「マ イトジェン性（mitogenic）」なる術語はマイトジェネシスを意味する。 他の態様において、組換えまたは合成成長因子は、該成長因子の多量体形成を 可能とする別の部分をも含む。多量体は２つまたはそれ以上の成長因子分子また はその前駆体を含む。多量体形成を誘導する部分の例としては、抗体、架橋分子 の形成を容易にする領域またはシグナルペプチドが挙げられるが、これらに限ら れるものではない。ここで架橋とは、多量体形成へと導くのに適当な結合を提供 するあらゆる相互作用をいい、共有結合、イオン結合、格子会合、イオン架橋、 塩架橋および非特異的な分子会合を含むが、これらに限られるものではない。本 発明の特に好ましい態様は、外膜部分Ａ（Outer Membrane Portion A）（ｏｍｐ Ａ）のシグナルペプチド［スケラ（Skerra）、Gene、１５１：１３１−１３５， １９９４］などのシグナルペプチドおよびその機能的誘導体の使用である。ここ で「機能的誘導体」とは、成長因子の多量体形成を依然として可能とするｏｍｐ Ａシグナルペプチドの変異体または誘導体（またはその機能的等価物）である。 好ましい態様において、Ｂ細胞表面分子が免疫グロブリンである場合、成長因 子のＢ細胞表面結合部分は一般に免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変部分な どの免疫グロブリンの一部に結合する。 免疫グロブリン結合分子の一例は、ペプトストレプトコッカス・マグヌス （Peptostreptococcus magnus）からのプロテインＬである。プロテインＬは５ つの免疫グロブリン結合ドメインを有する。他の免疫グロブリン結合分子として はプロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＨが挙げられる。しかしながら 、本発明は、たとえばＢ細胞受容体のリガンドを含む、Ｂ細胞表面成分に結合し うるあらゆる分子を包含する。 Ｔ細胞エピトープを定める組換えまたは合成分子の部分は、好ましくはすでに 抗原刺激を受けたＴ細胞に提示されて、胚中心でのＢ細胞増殖および抗体の親和 性成熟を誘導させる。このことは一般に免疫グロブリンクラススイッチおよび血 清中への抗体分泌により達成される。一般にＴ細胞エピトープはＢ細胞内に嵌入 し、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスII上に提示される。 特に好ましい態様において、Ｔ細胞エピトープはニワトリ卵リゾチーム（ＨＥ Ｌ）からのものであるか［アルツビア（Altuvia）ら、Molecular Immunology、 ３１：１−９、１９９４］またはＨＥＬからのアミノ酸４２〜６２を含むペプチ ドなどのその誘導体またはそのホモログまたは類似体である。このＴ細胞エピト ープは、マウスにおいてＭＨＣクラスII分子Ｈ−２Ａ^k上またはヒトなどの他の 哺乳動物では他のＭＨＣクラスII分子またはその等価物上で抗原提示細胞（ＡＰ Ｃ）により提示されたときにＨＥＬ特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によ り認識される。他のＴ細胞エピトープの例としては、破傷風トキソイド、卵アル ブミン、マラリア抗原並びにＨＥＬの他の領域が挙げられるが、これらに限られ るものではない。当業者であれば容易に適当なＴ細胞エピトープを選択すること ができるであろう。 別の態様において、Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分は古典的な 意味においてＴ細胞エピトープではないが、それにもかかわらず同様の仕方で機 能することができる。かかる部分の一例は抗ＣＤ４０抗体である。 本発明の他の側面は、構造： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は同じかまたは異なり、それぞれＢ細胞表面分子結合部分 であり、Ｘ₂はＢ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分である）を有する 組換えまたは合成分子を包含し、該組換えまたは合成分子はＸ₁およびＸ₃が結合 したＢ細胞のＴ細胞依存性のＢ細胞マイトジェネシスを誘導することができる。 Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃の表示は配列順序の制限を課するものではなく、本発明は、Ｘ₁Ｘ₃ Ｘ₂、Ｘ₃Ｘ₂Ｘ₁、Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₁、Ｘ₂Ｘ₁Ｘ₃およびＸ₃Ｘ₁Ｘ₂などの要素Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃を 含むあらゆる配列を包含する。 本発明はさらに、構造： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は同じかまたは異なり、それぞれＢ細胞表面免疫グロブリ ン結合部分であり、Ｘ₂はＴ細胞エピトープである）を有する組換えまたは合成 分子を包含し、該組換えまたは合成分子はＸ₁およびＸ₃が結合したＢ細胞のＴ細 胞依存性のＢ細胞マイトジェネシスを誘導することができる 本発明はさらに、構造： ＭＸ₁［Ｘ₂］_b （式中、Ｘ₁はＢ細胞表面免疫グロブリン結合部分などのＢ細胞表面分子結合部 分であり、Ｘ₂はＢ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分であり、Ｍは該 組換えまたは合成分子の多量体形成を可能または容易にする部分であり、ｂはＸ₂ 分子の数を表し、０、１または＞１であってよい）を有する組換えまたは合成 分子を提供する。 Ｍの一例は、ｏｍｐ Ａからのシグナルペプチドなどのシグナルペプチドであ る。Ｍの多量体効果は、分子［ＭＸ₁［Ｘ₂］_b］_k （式中、Ｍ、Ｘ₁、Ｘ₂およびｂは前記と同じ、ｋは１または＞１である）を提供 することである。ｋの例は約２〜約１０００であり、好ましくは約＞１〜約５０ −２００である。 Ｘ₂の任意的な特性は、別の態様でＸ₁と関連するかもしれない。ＭＸ₁［Ｘ₂］_b を構成する分子成分はいかなる順序であってもよい。 Ｘ₁はペプトストレプトコッカス・マグヌスからのＬプロテインに由来するも のであってよいが、これに限られるものではない。 好ましくは、Ｘ₂はＨＥＬからのアミノ酸４２〜６２などの（これに限られる ものではない）ＨＥＬからのＴ細胞エピトープである。他の態様において、ｂ＝ ０である場合、Ｘ₂はＴ細胞エピトープではなく、外部より提供されてＢ細胞に Ｔ細胞依存性のヘルプを提供する。この場合、Ｘ₂はたとえば抗ＣＤ４０抗体で あってよい。 特に好ましい態様において、上記で定義したＸ₁Ｘ₂Ｘ₃は本明細書において 「ＬＨＬ」（式中、Ｌはペプトストレプトコッカス・マグヌスからのＬプロテイ ンからの免疫グロブリン結合部分であり、ＨはＨＥＬからのアミノ酸４２〜６２ またはその等価物に対応する）と称する。ＬＨＬのヌクレオチド配列およびアミ ノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に 示してある。 本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列もしくは該配列と少な くとも６０％の類似性を有するアミノ酸配列またはSＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示 すヌクレオチド配列もしくは低ストリンジェンシー条件下でSＥＱ ＩＤ ＮＯ ：１にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列 を有する成長因子またはその前駆体を包含する。 本明細書において言及する４２℃における低ストリンジェンシーとは、ハイブ リダイゼーションのために少なくとも約１％ｖ／ｖから少なくとも約１５％ｖ／ ｖのホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍの塩、および洗 浄条件のために少なくとも約１Ｍから少なくとも約2Ｍの塩を含む。別のストリ ンジェンシー条件もまた必要に応じて適用することができ、たとえば、ハイブリ ダイゼーションのために少なくとも約１６％ｖ／ｖから少なくとも約３０％ｖ／ ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍの塩、 および洗浄条件のために少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍの塩を 含む中くらいのストリンジェンシー、またはハイブリダイゼーションのために少 なくとも約３１％ｖ／ｖから少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少 なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩、および洗浄条件のため に少なくとも約０．００Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩を含む高ストリンジ ェンシーが適用できる。 ＨＥＬからの「Ｈ」ドメインにより連結されたプロテインＬからの２つの 「Ｌ」ドメインは成長因子ＬＨＬを構築し、この成長因子はＢ細胞上の表面免疫 グロブリンを架橋する。この架橋は、Ｂ細胞の活性化および芽球形成を含む。Ｌ ＨＬの嵌入およびプロセシングはＭＨＣII上でのＨの提示へと導く。Ｈペプチド でのＭＨＣIIのＴ細胞認識は、活性化Ｂ細胞に増殖並びに抗体クラススイッチお よび分泌の指令を与える。 本発明のマイトジェン性成長因子は、「触媒」Ｂ細胞を選択する前駆体の形態 である場合に、所望の触媒特異性を有する抗体を産生するうえで極めて有用であ る。前駆体成長因子は、それに対する触媒抗体を得ようとする標的抗原であって Ｂ細胞の抗原依存性クローン拡張をマスキングする標的抗原を含む。選択された Ｂ細胞表面免疫グロブリンにより該抗原が開裂されると、成長因子はＢ細胞のマ イトジェネシスを誘導することができる。 実質的に、Ｂ細胞は遷移状態の類似体への結合に基づくよりも、むしろ表面免 疫グロブリンの触媒活性に基づいて選択される。このことは、胚中心での親和性 成熟を可能にし、「触媒成熟（catalytic-maturation）」を確実にしてインビボ で可能な最高の酵素代謝回転率を得ることができる。本発明のこの側面は、Ｂ細 胞表面上の触媒抗体による開裂によって放出されるまでは遮蔽され実質的に不活 性なＬＨＬなどの上記Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃を含むＢ細胞成長因子前駆体を設計することに より達成される。ここで「開裂」なる術語は、結合の切断に限られるものではな く、Ｂ細胞成長因子の遮蔽を除去ないし低減するのに適した相互作用を含む。 放出されたＸ₁Ｘ₂Ｘ₃は、Ｘ₁Ｘ₃ドメインを介してＢ細胞表面免疫グロブリン などのＢ細胞表面分子を架橋することにより触媒Ｂ細胞を活性化する。ついでＸ₁ Ｘ₂Ｘ₃は通常の抗原と同様に嵌入されプロセシングされる。細胞内プロセシン グはＸ₁Ｘ₂Ｘ₃中に導入されたＴ細胞エピトープＸ₂を生成する。Ｂ細胞表面上で のＸ₂の提示は、Ｂ細胞のＴ細胞依存性クローン拡張並びに触媒成熟および触媒 抗体の分泌へと導く。ついで触媒抗体を血清中で検出することができ、触媒Ｂ細 胞を標準法により回収することができる。 本発明のこの側面によれば、Ｂ細胞マイトジェネシスを誘導しうる成長因子に 結合または他の仕方で会合した抗原を含む組換えまたは合成成長因子前駆体が提 供され、その際、該成長因子前駆体の触媒産物はＢ細胞マイトジェネシスを可能 とするものであり、これは抗原結合部位に独立であってよい。 本発明の他の側面によれば、Ｂ細胞表面結合分子部分およびＢ細胞にＴ細胞依 存性のヘルプを提供する部分により連結または他の仕方で会合した抗原を含む組 換えまたは合成成長因子前駆体が提供され、その際、該抗原または該抗原に近接 する領域が開裂すると、該Ｂ細胞表面分子部分および該Ｔ細胞依存性のヘルプの 部分はＢ細胞マイトジェネシスを誘導する成長因子を形成する。 好ましくは、本発明は、Ｂ細胞表面免疫グロブリン結合部分およびＴ細胞エピ トープ部分により連結または他の仕方で会合した抗原を含む組換えまたは合成成 長因子前駆体に関するものであり、その際、該抗原または該抗原に近接する領域 が開裂すると、該Ｂ細胞表面免疫グロブリンおよび該Ｔ細胞エピトープはＢ細胞 マイトジェン特性を有する成長因子を形成する。 他の態様において、本発明は、Ｂ細胞表面分子結合部分および成長因子前駆体 に多量体形態を付与する部分により連結または他の仕方で会合した抗原を含む組 換えまたは合成成長因子前駆体を提供するものであり、その際、該抗原または該 抗原に近接する領域が開裂すると、Ｂ細胞マイトジェネシスを誘導する能力を有 するＢ細胞表面分子結合部分を含む成長因子が提供される。 本発明のこの側面による抗原は、触媒抗体を得ようとするあらゆる抗原である 。例としては、サイトカイン、たとえば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−１〜Ｉ Ｌ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）、ＩＦＮα、ＩＦＮβまたはＩＦＮγ などのインターフェロン（１ＦＮ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激 因子（ＣＳＦ）、第VIII因子、エリスロポエチンおよびヘモポエチンなどの血液 因子、癌抗原、ＨＩＶ、インフルエンザウイルスまたは肝炎ウイルスなどの病原 ウイルスからのドッキングレセプター（たとえば、ＨＥＰ Ａ）ＨＥＰ Ｂ、Ｈ ＥＰＣ、ＨＥＰ Ｅ）およびアルツハイマー病患者や骨髄腫患者などにおけるア ミロイド斑が挙げられるが、こえらに限られるものではない。さらに詳しくは、 ＴＮＦの場合、ＴＮＦのタンパク質分解不活化は慢性関節リウマチや毒素ショッ ク症候群の治療に有用である。ドッキングレセプターを介してターゲティングす ることにより、ＨＩＶ、肝炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスなどの病原 ウイルスは有効に不活化される。触媒抗体はまた、アルツハイマー病患者や骨髄 腫患者などにおいてアミロイドプラークのクリアランスに有用である。ターゲテ ィングＩｇＥは、たとえば、喘息などの炎症性状態を治療するメカニズムを提供 する。 本発明の触媒抗体はまた、たとえば個体によって消費された薬物などの薬物を 解毒するうえでも有用である。たとえば、大麻やヘロインその他の薬物の作用は 、これら薬物の活性成分に向けられた触媒抗体の投与により個体において処置す ることができる。さらに、触媒抗体はまた、たとえば自己免疫抗体をターゲティ ングすることにより自己免疫および炎症性疾患状態を治療するのに有用である。 触媒抗体はまた、環境場面でも用途を有し、石油製品やプラスチックなどの環境 汚染物質に対処することができる。これらすべての場面において、適当な抗原を 選択し、本発明の成長因子前駆体中に導入することができる。 本発明の関連する側面において、成長因子前駆体の「抗原」部分はプロテアー ゼ開裂部位を含むアミノ酸リンカー配列などの標的部位により模倣することがで きる。例としては、タバコモザイクウイルス（tabacco etch virus）（ＴＥＶ） プロテアーゼ開裂部位を含むアミノ酸リンカー配列が挙げられる。さらに詳しく は、ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位の場合、ＴＥＶプロテアーゼによるアミノ酸リ ンカー配列の開裂は触媒抗体の特性と類似の特性をもたらすのに有用である。こ れは、成長因子分子を開発するための有用なモデルシステムを提供する。 本発明の他の側面は、構造： ＡＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ａ （式中、Ａは触媒抗体を得ようとする標的抗原であり、Ｘ₁およびＸ₃は同じかま たは異なり、それぞれＢ細胞表面分子結合部分であり、Ｘ₂はＢ細胞にＴ細胞依 存性のヘルプを提供する部分である）を有する組換えまたは合成分子を提供する ものであり、該Ｂ細胞の表面上の触媒抗体は、該組換えまたは合成分子のＡのす べてまたは一部を開裂して分子［Ａ’］Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃［Ａ’］（式中、Ａ’は任意 に存在し、触媒抗体による開裂後のＡの一部である）を生成し、この生成した分 子は、Ｘ₁およびＸ₃が結合したＢ細胞のＴ細胞依存性のクローン拡張を誘導する ことができる。 ＡＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ａ分子はいかなる配列であってもよい。 本発明の他の側面は、構造： ［Ｍ］_cＡＸ₁［Ｘ₂］_d［Ｘ₃］_eＡ［Ｍ］_f （式中、Ａは触媒抗体を得ようとする標的抗原であり、Ｘ₁およびＸ₃は同じか または異なり、それぞれＢ細胞表面分子結合部分であり、Ｘ₂はＢ細胞にＴ細胞 依存性のヘルプを提供する部分であり、Ｍは組換えまたは合成分子の多量体形成 を可能または容易にする部分であり、ｃおよびｆは同じかまたは異なり、それぞ れ、０、１または＞１であり、ｅは０または１であり、ただし、ｃおよびｆの両 者が０である場合はｅは０ではない、ｄは０、１または＞１である）を有する組 換えまたは合成分子に関し、該Ｂ細胞の表面上の触媒抗体は、該組換えまたは合 成分子のＡのすべてまたは一部を開裂することができ、生成した触媒産物はＢ細 胞マイトジェネシスを誘導することができる。 成長因子前駆体は、Ｂ細胞マイトジェネシスを誘導しうる成長因子を介して抗 原がＢ細胞により認識されることを可能にする。該抗原は先行する触媒活性化が ないとＢ細胞活性化を有効にマスキングする。それゆえ、成長因子は該抗原のす べてまたは一部が開裂を受けるまでは「前駆体」の形態である。他のマスキング はまた、Ｂ細胞表面分子結合部分のＢ細胞表面分子結合ドメインに結合または他 の仕方で会合しうる分子によっても提供される。適当なマスキング分子の例とし ては、これらに限られるものではないが、免疫グロブリンのカッパまたはラムダ 軽鎖の可変部分が挙げられる。 別の態様として、可変重鎖および軽鎖を含むフラグメント（Ｆｖ）を用いるこ とができ、このものは一本鎖（ｓｃ）でおよび／またはジスルフィド安定化（ｄ ｓ）されているのが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよい。カッパ軽鎖の可 変部分のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：１１に示してある。 上記免疫グロブリン部分はＢ細胞表面の免疫グロブリン結合ドメインをブロッ キングするのに有用な分子であるが、他の分子を用いることもできる。たとえば 、天然物スクリーニングは、Ｌプロテインの免疫グロブリン結合ドメインや他の Ｂ細胞表面結合分子に結合する分子を、珊瑚、土類、植物、海床、海洋無脊椎動 物または他の都合のよい採取源などの天然採取源から非常に容易に同定すること ができる。 特に好ましい態様において、組換えまたは合成成長因子前駆体は、実質的に Ｘ₁およびＸ₃のそのコグネイトＢ細胞表面抗原分子への結合を防ぎ、それによっ て免疫グロブリンペプチドまたはその化学的等価物または他のＢ細胞表面分子ブ ロッキング試薬を成長因子に結合、融合または他の仕方で会合させることによっ て成長因子のＢ細胞活性化作用のマスキングを容易にする。特に好ましい態様に おいて、該前駆体は、触媒抗体を得ようとする抗原およびＢ細胞表面結合部分ま たは成長因子のＢ細胞表面分子結合ドメインをマスキングしうる部分を含む。該 前駆体はまた、可変カッパまたはラムダ軽鎖ドメインまたはｓｃ−ｄｓ−Ｆｖ分 子または天然物スクリーニングの後に検出されたマスキング分子を含んでいてよ い。 一般に、成長因子としてＢ細胞表面免疫グロブリン結合部分に結合する免疫グ ロブリン分子は、成長因子にフランキングしている抗原のそれぞれＮ末端および Ｃ末端部分に連結している。たとえば、本発明の一つの特に好ましい態様は、構 造： Ｉ’ＡＸ₁Ｘ₂Ｘ₃ＡＩ” （式中、Ｉ'およびＩ"は任意に存在し、同じかまたは異なっていてよく、それぞ れカッパまたはラムダ軽鎖またはｓｃ−ｄｓ−Ｆｖ分子などのＸ₁およびＸ₃のブ ロッキング試薬であり、Ａは触媒抗体を得ようとする標的抗原であり、Ｘ₁およ びＸ₃はＢ細胞表面分子結合部分であり、Ｘ₂はＢ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを 提供する部分である）を含む成長因子前駆体を提供するものであり、該Ｂ細胞の 表面上の触媒抗体は該組換えまたは合成分子のＡのすべてまたは一部を開裂して 分子［Ａ'］Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃［Ａ'］（式中、Ａ'は任意に存在し、触媒抗体による開裂 後のＡの一部である）を生成することができ、該生成した分子はＸ₁およびＸ₃が 結合するＢ細胞のＴ細胞依存性Ｂ細胞マイトジェネシスを誘導することができる 。 Ｉ'ＡＸ₁Ｘ₂Ｘ₃ＡＩ"の分子成分は、いかなる配列であってもよい。 本発明は、Ｘ₁およびＸ₃があらゆるＢ細胞表面分子結合分子であり、Ｉ'およ びＩ"がかかる分子のＢ細胞表面分子への結合を阻止またはマスキングするもの を包含する。 他の態様において、Ｉ'ＡＸ₁Ｘ₂Ｘ₃ＡI"分子またはその一部は多量体の形態で あってよい。このことは、該分子のすべてまたは一部がｏｍｐＡのシグナルペプ チドなど（これに限られない）の多量体形成成分（Ｍ）含む場合に特に当てはま る。単量体単位は、多くの他の結合の中でも共有結合、塩橋、ジスルフィド架橋 および疎水性相互作用を含む上記で記載したものなどのいずれの結合手段によっ ても結合または他の仕方で会合させることができる。単量体形成の程度に依存し て、このことは成長因子のＢ細胞表面分子結合ドメインのマスキング作用を損な うかもしれず、若干の抗原依存性のクローン拡張が起こるかもしれない。このこ とは、少なくとも若干の触媒抗体依存性Ｂ細胞マイトジェネシスがある場合には それほど不利ではない。 この態様によれば、構造： ［Ｉ’ＡＸ₁［Ｘ₂'］_o［Ｘ₂Ｘ₃ＡＩ"］_n］_m （式中、Ｉ'およびＩ"は同じかまたは異なり、それぞれカッパまたはラムダ軽鎖 またはｓｃ−ｄｓ−Ｆｖ分子などのＸ₁およびＸ₃のブロッキング試薬であり、Ａ は触媒抗体を得ようとする標的抗原であり、Ｘ₁およびＸ₃はＢ細胞表面分子結合 部分であり、Ｘ₂およびＸ₂'は同じかまたは異なり、それぞれＢ細胞にＴ細胞依 存性のヘルプを提供する部分であり、ｏは０または１であり、ｎは括弧内の成分 の多量体特性を示し、０、１または＞１であり、ｍは括弧内の成分の多量体特性 を示し、０、１または＞１である）を含む成長因子前駆体が提供される。 好ましくは、ｎおよびｍはそれぞれ約１〜約１０，０００であり、さらに好ま しくは約１〜約１，０００であり、さらに一層好ましくは約１〜約２００である 。 好ましくは、ｎが０である場合はｏは１である。 別の態様において、成長因子前駆体は構造： ［［Ｉ'ＡＸ₂Ｘ₃］_n［Ｘ₂'］_o［Ｘ₁ＡＩ"］_mまたは［［Ｉ'ＡＸ₁［Ｘ₂'］_o］_n［ Ｘ₂Ｘ₃ＡＩ"］_m］ を含む。 ｎおよびｍの正確な数は確かめることはできないが、多量体特性は機能的にま たはサイズにより物理的に同定することができる（たとえば、ＨＰＬＣまたはＰ ＡＧＥを用いて決定できる）。 Ａの例は上記で例示したものが挙げられるが、これらに限られるものではない 。 本発明は、プロテアーゼ感受性ペプチドなどの非抗原開裂部位の置換を包含し 、このことは成長因子分子を設計するえでの有用なモデルを提供する。 本発明の例示した成長因子前駆体は本明細書において「ＣＡＴＡＢ」として言 及され、ＴＮＦによりフランキングされたＬＨＬを含み、カッパおよび／または ラムダ軽鎖からの可変領域は該Ｌ分子のＢ細胞免疫グロブリン結合ドメインをさ らにマスキングする。 他の態様において、成長因子前駆体は、触媒抗体以外の手段または触媒抗体に 加えて他の手段により活性化されうるＣＡＴＡＢを模倣する。たとえば、酵素感 受性分子は「抗原」であってよい。一つの態様において、ＣＡＴＡＢ模倣物は本 明細書において「ＴＬＨＬ」として言及され、ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位を含 むアミノ酸リンカー配列のＮ末端に連結した可変カッパ軽鎖を含み、該配列はＬ ＨＬに連結している。ＴＬＨＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それ ぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示してある。他の 態様において、ＴＬＨＬはＴＥＶプロテアーゼ開裂部位を含む他のアミノ酸リン カー配列をさらに含み、可変カッパ軽鎖が該アミノ酸リンカー配列のＣ末端に連 結しており、本明細書においてＣＡＴＡＢ−ＴＥＶと称する。ＣＡＴＡＢのヌク レオチド配列および対応アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およ びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示してある。 本発明は、 （i）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列に対し て少なくとも６０％の類似性を有するアミノ酸配列（抗原のアミノ酸配列を含ま ない）； （ii）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すヌクレオチド配列またはＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：３に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％の類似性を有するヌク レオチド配列によりコードされるアミノ酸配列； （iii）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイ ズ しうるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列であって、該成長因子 前駆体の触媒特性がＢ細胞マイトジェネシスを誘導しうるもの から選ばれるアミノ酸の配列を含む成長因子前駆体を包含する。 可変カッパ軽鎖部分は、ベンスジョーンズタンパク質、ＬＥＮから都合よく得 ることができ、これはＬなどのある種の免疫グロブリン結合タンパク質に結合す ることが示されている。別の態様において、ｓｃ−ｄｓ−ＦｖなどのＦｖを用い ることができる。 抗原（たとえば、ＴＮＦペプチド部分）を認識する触媒抗体により成長因子前 駆体ＣＡＴＡＢが開裂されると、Ｌドメインと可変カッパ軽鎖との間の共有結合 が切断される。ブロッキング可変カッパ軽鎖は、個々のドメインの互いの親和性 が比較的低い（〜１０^-7Ｍ）ためにＬドメインから解離するであろう。このこと により、表面免疫グロブリンに１０^-9Ｍの親和性で結合および架橋しうる成熟成 長因子ＬＨＬが放出されるであろう。同様のメカニズムは、可変カッパ軽鎖、Ｔ ＮＦ、ＬおよびＨ以外の分子を用いる場合にも機能する。 このＢ細胞表面免疫グロブリン架橋はＢ細胞を活性化し、下流事象を誘導して 触媒抗体の触媒的成熟および分泌を導く。血清中の触媒抗体はＥＬＩＳＡベース のアッセイなどの多くの手順により検出することができ、触媒性Ｂ細胞は標準ハ イブリドーマ法により回収することができる。触媒抗体が非ヒト動物由来のもの である場合には、これらを組換えＤＮＡ法によりヒト化し、ヒトでの治療目的の ために産生させることができる。別法として、ヒトＩｇ遺伝子座についてトラン スジェニックであるヒト化マウスなどの「ヒト化」動物で抗体を生成することも できる。 本発明は成長因子および／またはその前駆体の誘導体をも包含する。誘導体に は、成長因子および／または前駆体の変異体、一部（part）、フラグメント、部 分（portion）、ホモログまたは類似体またはそれらの成分が含まれる。アミノ 酸の誘導体には、単一または複数のアミノ酸の置換、欠失および／または付加が 含まれる。たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の 誘導体には、これらに対して少なくとも６０％の類似性を有する配列またはＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に低ストリンジェンシー条件下で ハイブリダイズしうるヌクレオチド配列によりコードされる配列が含まれる。 特に有用な誘導体には、成長因子および／またはその前駆体の化学的類似体ま たはその成分が含まれる。そのような化学的類似体は治療または診断に使用する ために分子を安定化するのに有用であろう。 本明細書において成長因子前駆体の類似体には、側鎖の修飾、ペプチド、ポリ ペプチドまたはタンパク質合成の間の非天然アミノ酸および／またはその誘導体 の導入、およびタンパク質性分子またはその類似体に立体配置上の制限を負荷す る架橋試薬および他の方法の使用が含まれるが、これらに限られるものではない 。 本発明において側鎖修飾の例としては、アルデヒドと反応させた後にＮａＢＨ₄ で還元することによる還元的アルキル化；メチルアセトイミデート（methylace timidate）を用いたアミド化；無水酢酸を用いたアセチル化；シアネートを用い たアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（Ｔ ＮＢＳ）を用いたアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸または無水テ トラヒドロフタル酸を用いたアミノ基のアシル化；ピリドキサール−５−リン酸 を用い、ついでＮａＢＨ₄で還元するリシンのピリドキシル化などのアミノ基の 修飾が挙げられる。 アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキ サールおよびグリオキサールなどの試薬を用いてヘテロ環縮合生成物を生成する ことにより修飾することができる。 カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素の生成を経てカルボジイミド活性化し た後、引き続き誘導体化してたとえば対応のアミドとすることにより修飾するこ とができる。 スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いたカルボキ シメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物を用いた混合ジ スルフィドの生成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの 反応；４−クロロメルクリベンゾエート、４−クロロメルクリフェニルスルホン 酸、塩化フェニル水銀、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールその他の水 銀化合物を用いたメルクリ誘導体の生成；アルカリ性ｐＨでのシアネートを用い たカルバモイル化などの方法により修飾することができる。 トリプトファン残基は、たとえば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化、ま たは２−ヒドロキシー５−ニトロベンジルブロマイドまたはハロゲン化スルフェ ニルを用いたインドール環のアルキル化により修飾することができる。一方、チ ロシン残基は、テトラニトロメタンを用いたニトロ化により３−ニトロチロシン 誘導体を生成させることにより変えることができる。 ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を用いたアルキ ル化またはジエチルピロカーボネートを用いたＮ−カルボエトキシ化により行う ことができる。 ペプチド合成の間の非天然アミノ酸および誘導体の導入の例としては、これら に限られるものではないが、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３− ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリ シン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ− ３−ヒドロキシ-６−メチルヘプタン酸、２-チエニルアラニンおよび／またはア ミノ酸のＤ−異性体の使用が挙げられる。本明細書において使用してよい非天然 アミノ酸の例を表１に示す。 たとえば、３Ｄ立体配置を安定化するため、架橋試薬を用いることができ、ホ モ２官能性架橋試薬、たとえば、（ＣＨ₂）_nスペーサー基（ｎ＝１〜６）を有す る２官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ドエステル、および通常、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性の 残基およびマレイミドまたはジチオ残基（ＳＨ）またはカルボジミド（ＣＯＯＨ ）などの他の基に特異的に反応性の残基を含むヘテロ２官能性架橋試薬を用いる ことができる。加えて、たとえば、Ｃ_αおよびＮ_α−メチルアミノ酸の導入、ア ミノ酸のＣ_α原子とＣ_β原子との間への二重結合の導入、およびＮ末端とＣ末端 との間、側鎖間もしくは側鎖とＣ末端もしくはＮ末端との間にアミド結合を生成 するなどの共有結合を導入することによる環状ペプチドまたは類似体の生成によ り立体配置を制限することができる。 本発明はさらに、成長因子のアンタゴニストまたはアゴニストとして機能しう る成長因子および／またはその前駆体の化学的類似体をも包含する。これらは免 疫応答を制御するうえで有用である。化学的類似体は必ずしも成長因子前駆体に 由来しなくともよく、ある種の立体配置的な類似性を有しておればよい。別の態 様として、成長因子前駆体のある種の物理化学特性を模倣すべく化学的類似性を 特別に設計することができる。化学的類似体は化学的に合成することができ、ま たはたとえば珊瑚、土類、植物、微生物、海洋無脊椎動物または海床の天然物ス クリーニングの後に検出することができる。 表１ 非通常アミノ酸 コード 非通常アミノ酸 コード α-アミノ酪酸 Abu Ｌ−Ｎ−メチルアラニン Nmala α-アミノα-メチル酪酸 Mgabu Ｌ−Ｎ−メチルアルギニン Nmarg アミノシクロプロパン- Cpro Ｌ−Ｎ−メチルアスパラギン Nmasn カルボキシレート Ｌ−Ｎ−メチルアスパラギン酸 Nmasp アミノイソ酪酸 Aib Ｌ−Ｎ−メチルシステイン Nmcys アミノノルボルニル Norb Ｌ−Ｎ−メチルグルタミン Nmgln カルボキシレート Ｌ−Ｎ−メチルグルタミン酸 Nmglu シクロヘキシルアラニン Chexa Ｌ−Ｎ−メチルヒスチジン Nmhis シクロペンチルアラニン Cpen Ｌ−Ｎ−メチルイソロイシン Nmile D-アラニン Dal Ｌ−Ｎ−メチルロイシン Nmleu D-アルギニン Darg Ｌ−Ｎ−メチルリジン Nmlys D-アスパラギン酸 Dasp Ｌ−Ｎ−メチルメチオニン Nmmet D-システイン Dcys Ｌ−Ｎ−メチルノルロイシン Nmnle D-グルタミン Dgln Ｌ−Ｎ−メチルノルバリン Nmnva D-グルタミン酸 Dglu Ｌ−Ｎ−メチルオルニチン Nmorn D-ヒスチジン Dhis Ｌ−Ｎ−メチルフェニルアラニン Nmphe D-イソロイシン Dile Ｌ−Ｎ−メチルプロリン Nmpro D-ロイシン Dleu Ｌ−Ｎ−メチルセリン Nmser D-リジン Dlys Ｌ−Ｎ−メチルトレオニン Nmthr D-メチオニン Dmet Ｌ−Ｎ−メチルトリプトファン Nmtrp D-オルニチン Dorn Ｌ−Ｎ−メチルチロシン Nmtyr D-フェニルアラニン Dphe Ｌ−Ｎ−メチルバリン Nmval D-プロリン Dpro Ｌ−Ｎ−メチルエチルグリシン Nmetg D-セリン Dser L-N-メチル-t-ブチルグリシン Nmtbug D-トレオニン Dthr Ｌ−ノルロイシン Nle D-トリプトファン Dtrp L-ノルバリン Nva D-チロシン Dtyr α-メチル-アミノ-イソブチレート Maib D-バリン Dval α-メチル−γ-アミノブチレート Mgabu D-γ-メチルアラニン Dmala α-メチルシクロヘキシルアラニン Mchexa D-α-メチルアルギニン Dmarg α-メチルシクロペンチルアラニン Mcpen D-α-メチルアスパラギン Dmasn α-メチル-γ-ナフチルアラニン Manap D-α-メチルアスパルテート Dmasp α-メチルペニシラミン Mpen D-α-メチルシステイン Dmcys N-(4-アミノブチル)グリシン Nglu D-α-メチルグルタミン Dmgln N-(2-アミノエチル)グリシン Naeg D-α-メチルヒスチジン Dmhis N-(3-アミノプロピル)グリシン Norn D-α-メチルイソロイシン Dmile N-アミノ-γ-メチルブチレート Nmaabu D-α-メチルロイシン Dmleu α-ナフチルアラニン Anap D-α-メチルリジン Dmlys N-ベンジルグリシン Nphe D-α-メチルメチオニン Dmmet N-(2-カルバミルエチル)グリシン Ngln D-α-メチルオルニチン Dmorn N-(カルバミルメチル)グリシン Nasn D-α-メチルフェニルアラニン Dmphe N-(2-カルボキシエチル)グリシン Nglu D-α-メチルプロリン Dmpro N-(カルボキシメチル)グリシン Nasp D-α-メチルセリン Dmser N-シクロブチルグリシン Ncbut D-α-メチルスレオニン Dmthr N-シクロヘプチルグリシン Nchep D-α-メチルトリプトファンDmtrp N-シクロヘキシルグリシン Nchex D-α-メチルチロシン Dmty N-シクロデシルグリシン Ncdec D-α-メチルバリン Dmval N-シクロドデシルグリシン Nedod D-N-メチルアラニン Dnmala N-シクロオクチルグリシン Ncoct D-N-メチルアルギニン Dnmarg N-シクロプロピルグリシン Ncpro D-N-メチルアスパラギン Dnmasn N-シクロウンデシルグリシン Ncund D-N-メチルアスパルテート Dnmasp N-(2,2-ジフェニルエチル)グリシン Nbhm D-N-メチルシステイン Dnmcys N-(3,3-ジフェニルプロピル)グリシン Nbhe D-N-メチルグルタミン Dnmgln N-(3-グアニジノプロピル)グリシン Narg D-N-メチルグルタメート Dnmglu N-(1-ヒドロキシエチル)グリシン Nthr D-N-メチルヒスチジン Dnmhis N-(ヒドロキシエチル)グリシン Nser D-N-メチルイソロイシン Dnmile N-(イミダゾリルエチル)グリシン Nhis D-N-メチルロイシン Dnmleu N-(3-インドリルエチル)グリシン Notrp D-N-メチルリジン Dnmlys N-メチル-γ-アミノブチレート Nmgabu N-メチルシクロヘキシルアラニン Nmchexa D-N-メチルメチオニン Dnmmet D-N-メチルオルニチン Dnmorn N-メチルシクロペンチルアラニン Nmcpen N-メチルグリシン Nala D-N-メチルフェニルアラニン Dnmphe N-メチルアミノイソブチレート Nmaib D-N-メチルプロリン Dnmpro N-(1-メチルプロピル)グリシン Nile D-N-メチルセリン Dnmser N-(2-メチルプロピル)グリシン Nleu D-N-メチルスレオニン Dnmthr D-N-メチルトリプトファン Dnmtrp N-(1-メチルエチル)グリシン Nval D-N-メチルチロシン Dnmtyr N-メチラ-ナフチルアラニン Nmanap D-N-メチルバリン Dnmval N-メチルペニシラミン Nmpen γ-アミノブタン酸 Gabu N-(p-ヒドロキシフェニル)グリシン Nhtyr L-t-ブチルグリシン Tbug N-(チオメチル)グリシン Ncys L-エチルグリシン Etg ペニシラミン Pen L-ホモフェニルアラニン Hphe L-α-メチルアラニン Mala L-α-メチルアルギニン Marg L-α-メチルアスパラギン Masn L-α-メチルアスパルテートMasp L-α-メチル-t-ブチルグリシン Mtbug L-α-メチルシステイン Mcys L-メチルエチルグリシン Metg L-α-メチルグルタミン Mgln L-α-メチルグルタメート Mglu L-α-メチルヒスチジン Mhis L-α-メチルホモフェニルアラニン Mhphe L-α-メチルイソロイシン Mile N-(2-メチルチオエチル)グリシン Nmet L-α-メチルロイシン Mleu L-α-メチルリジン Mlys L-α-メチルメチオニン Mmet L-α-メチルノルロイシン Mnle L-α-メチルノルバリン Mnva L-α-メチルオルニチン Morn L-α-メチルフェニルアラニン Mphe L-α-メチルプロリン Mpro L-α-メチルセリン Mser L-α-メチルスレオニン Mthr L-α-メチルトリプトファンMtrp L-α-メチルチロシン Mtyr L-α-メチルバリン Mval L-N-メチルホモフェニルアラニン Nmhphe N-(N-(2,2-ジフェニルエチル) Nnbhm N-(N-(3,3-ジフェニルプロピル） Nnbhe カルバミルメチル)グリシン カルバミルメチル)グリシン 1-カルボキシ-1-(2,2-ジフェニル Nmbc エチルアミノ)シクロプロパン 本発明により包含される他の誘導体には、完全にグリコシル化されていない分 子から修飾グリコシル化分子までの一定の範囲のグリコシル化変異体が含まれる 。変化したグリコシル化パターンは、異なる宿主細胞での組換え分子の発現の結 果、生成する。 本発明の成長因子および成長因子前駆体は、組換えＤＮＡ手段により、または 化学的合成法により生成することができる。前者に関しては、本発明のこの側面 はＢ細胞免疫グロブリン結合ペプチドまたはポリペプチドおよびＴ細胞エピトー プをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子を提供する。 一般に、この核酸分子は、Ｂ細胞免疫グロブリン結合ペプチドまたはポリペプ チドおよびＴ細胞エピトープを含む融合分子をコードする。この観点から、この 核酸分子は、一般にプロモーター領域と、それに作動性に連結したＢ細胞免疫グ ロブリン結合ペプチドまたはポリペプチドコード部分、および該部分の３'末端 に作動性に連結したＴ細胞エピトープ部分を含む。本発明の核酸分子の発現は融 合分子の合成となる。好ましい態様において、この核酸はさらに、抗原性部分、 および任意に可変カッパ軽鎖などの免疫グロブリン部分をもコードしている。幾 つかの状況においては、１またはそれ以上の組換え成分の精製は、ｏｍｐＡにつ いてはシグナルペプチドのすべてまたは一部または該組換え分子が生成された微 生物宿主については他の担体分子となる。このことは多量体形成を容易にする。 本発明の特に好ましい態様において、核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すヌクレオチド配列またはこれら配列に低ストリン ジェンシー条件下でハイブリダイズしうる配列（該ヌクレオチド配列は上記成長 因子前駆体をコードする）を含む。 本発明のさらに他の側面は、特定の抗原に対する触媒抗体の製造方法を包含し 、該方法は、Ｂ細胞結合触媒抗体と相互反応しうる抗原を含む成長因子前駆体の 有効量を動物に投与することを含み、該抗原はＢ細胞表面分子結合部分およびＢ 細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分に結合しているかまたは他の仕方で 会合している。成長因子前駆体はまた、該抗原に結合した可変カッパ軽鎖などの Ｂ細胞表面分子結合部分マスキング残基をも含む。 別の態様において、成長因子前駆体は、標的抗体を得ようとする抗原に結合し た多量体の形態のＢ細胞表面分子結合部分を含む。Ｔ細胞依存性のヘルプを提供 する部分は好ましくはＴ細胞エピトープであり、好ましくは該前駆体の一部であ る。しかしながら、該部分は同時にまたは連続的に動物に投与される別個のもの であってもよい。 本発明はまた、上記方法により産生された触媒抗体をも提供する。触媒抗体は 、上記式におけるＡに有効に特異的であるかまたは向けられている。それゆえ、 かかる触媒抗体はあらゆる抗原、たとえば、これらに限られるものではないが、 サイトカイン、たとえば、これらに限られるものではないが、腫瘍壊死因子（Ｔ ＮＦ）、ＩＬ−１〜ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）、ＩＦＮα、Ｉ ＦＮβまたはＩＦＮγなどのインターフェロン（ＩＦＮ）、顆粒球コロニー刺激 因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、第VIII因子、エリスロポエチンおよびヘ モポエチンなどの血液因子、癌抗原、ＨＩＶ、インフルエンザウイルスまたは肝 炎ウ イルス（たとえば、ＨＥＰ Ａ）ＨＥＰ Ｂ、ＨＥＰ ＣまたはＨＥＰ Ｅ）な どの病原性ウイルスからのドッキングレセプター、およびアルツハイマー病患者 や骨髄腫患者におけるようなアミロイド斑に向けられてよい。 本発明の触媒抗体は、とりわけ哺乳動物、一層詳しくはヒトの疾患状態に関連 して特定の治療および診断用の用途を有する。従って、本発明は、成長因子前駆 体またはその誘導体および任意に成長因子前駆体活性の調節剤および１またはそ れ以上の薬理学的に許容しうる担体および／または希釈剤を含む医薬組成物を包 含する。さらに詳しくは、医薬組成物は本発明の成長因子前駆体により生成した 触媒抗体を含む。これら成分を以後、「活性成分」と称する。 注射に使用するのに適した剤型としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または 分散液および滅菌注射溶液または分散液をその場で調製するための滅菌粉末が含 まれ、クリーム剤または局所適用に適した他の形態であってもよい。それは製造 および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの微生物の作用に 抗して保存されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオ ール（たとえば、グリセロール、ポリエチレングリコールおよび液状のポリエチ レングリコール）、それらの適当な混合物、および植物油を含む溶媒または分散 媒体であってよい。適当な流動性の保持は、たとえば、リシチン（licithin）な どのコーティングの使用、分散剤の場合に必要な粒径の保持により、および界面 活性剤の使用により達成できる。微生物の作用からの防護は、種々の抗菌剤およ び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸 、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、たとえ ば糖や塩化ナトリウムを含めるのが好ましいであろう。注射用組成物の遷延吸収 は、組成物中に吸収遅延剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラ チンを使用することによりもたらすことができる。 滅菌注射液は、適当な溶媒中に所要量の活性化合物を必要に応じて上記種々の 他の成分とともに導入し、ついで濾過滅菌することにより調製される。一般に、 分散液は、基礎分散媒体および必要とされる上記他の成分を含む滅菌ビヒクル中 に種々の滅菌活性成分を導入することにより調製される。滅菌注射液の調製のた めの滅菌粉末の場合は、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥法であり、こ れにより活性成分と前以て滅菌濾過した溶液からの別の所望の成分の粉末が得ら れる。 活性成分が適切に保護されている場合、これら成分は、たとえば不活性な希釈 剤または他の資化可能な可食担体とともに経口投与してよく、またはハードまた はソフトシェルゼラチンカプセル中に封入してよく、または錠剤に圧錠してよく 、または食事の食品中に直接導入してよい。経口の治療投与のためには、活性成 分を賦形剤とともに配合し、摂取可能な錠剤、舌下錠、トローチ剤、カプセル剤 、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの剤型で用いることがで きる。かかる組成物または製剤は、少なくとも１重量％の活性化合物を含んでい なければならない。組成物および製剤のパーセントは、もちろん変わりうるもの であり、約５〜約８０重量％の間であるのが都合よい。かかる治療に有用な組成 物中の活性化合物の量は、適切な投与量が得られるものであればよい。本発明に よる好ましい組成物または製剤は、経口投与剤型単位が約０．１ｎｇ〜２０００ ｍｇの範囲の活性化合物、好ましくは約０．１μｇ〜１５００ｍｇの範囲、さら に好ましくは約１μｇ〜１００ｍｇの範囲の活性化合物を含むように調製する。 錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下に掲げる成分を含んで いてよい：アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸 二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸など の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；ショ糖、乳糖またはサッカ リンなどの甘味剤；ペパーミント、冬緑油、サクランボの風味などの香味剤。投 与剤型単位がカプセル剤である場合は、上記物質に加えて液状担体を含んでいて よい。他の種々の物質がコーティングとしてまたは投与単位の物理形態を他の仕 方で変えるために配合されてよい。たとえば、錠剤、丸剤またはカプセル剤はセ ラック、糖またはその両者でコーティングできる。シロップ剤またはエリキシル 剤は、活性成分、甘味剤としてのショ糖、保存剤としてのメチルパラベンおよび プロピルパラベン、着色料およびサクランボ、オレンジまたはマンゴなどの香味 剤を含んでいてよい。もちろん、投与単位剤型を調製するのに用いた物質は、薬 理学的に純粋かつ使用した量において実質的に非毒性でなければならない。さら に、活性化合物を除放製剤中に配合することもできる。 本発明はまた、クリーム剤、ローション剤およびゲル剤などの局所投与に適し た剤型をも包含する。 薬理学的に許容しうる担体および／または希釈剤としては、いずれかまたはす べての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅 延剤などを含む。薬理学的活性物質のためのかかる媒体および剤の使用は当該技 術分野でよく知られている。通常の媒体または剤が活性成分と適合しない場合を 除いて、治療組成物中での使用を考慮することができる。補助活性成分を組成物 中に配合することもできる。これら成分には、免疫増強分子、多量体形成を容易 にする分子、および処置しようとする疾患状態に基づいて選択した薬理学的に活 性な分子が含まれる。 投与を簡単にし、投与量を均一にするために、投与単位剤型の非経口組成物を 製剤することは特に有利である。本明細書において使用する投与単位剤型とは、 処置しようとする哺乳動物に対する単一投与に適した物理的に個々の単位をいい 、各単位は所要の薬理学的担体とともに所望の治療効果を生じるように計算して 前以て決定された量の活性物質を含んでいる。本発明の新規な投与剤型単位の明 細書は、（ａ）活性物質の独特の特性および達成すべき特定の治療効果、および （ｂ）本明細書中に詳細に記載するように肉体の健康を損ねた疾患状態を有する 生体において疾患を治療するためのかかる活性物質を調合する技術に内在する限 界によって記載され、直接依存している。 主要な活性成分は、本明細書に記載した投与単位剤型にて適当な薬理学的に許 容しうる担体とともに有効量で都合よくかつ有効に投与されるように調合される 。単位投与剤型は、たとえば、０．１ｎｇ〜約２０００ｍｇの範囲の量、さらに 好ましくは０．１μｇ〜１５００ｍｇの範囲の量、さらに一層好ましくは１μｇ 〜１０００ｍｇの範囲の量の主要な活性化合物を含んでいてよい。比率で表現す ると、活性化合物は一般に約０．５μｇ〜約２０００ｍｇ／ｍｌ担体で存在する 。補助活性成分を含む組成物の場合は、投与量は通常の投与量および該成分の投 与 経路を参照して決定する。 本発明のさらに他の側面は、成長因子前駆体およびその誘導体に対する抗体に 関する。かかる抗体はモノクローナルかまたはポリクローナルであってよく、該 前駆体によって選択される触媒抗体とは独立である。本発明の組換えまたは合成 成長因子前駆体またはその誘導体に対する（非触媒）抗体は治療剤として有用で あるが、診断剤として特に有用である。抗体はまた、成長因子前駆体により産生 された触媒抗体に対して産生させることもできる。これらの抗体はすべて、成長 因子またはその触媒抗体誘導剤のための診断アッセイにおいて特別の適用を有す る。 たとえば、特定の抗体を触媒抗体をスクリーニングするために用いることがで きる。後者は、たとえば、生物学的流体中のこれら抗体のレベルをスクリーニン グするためまたは触媒抗体を精製するための手段として重要である。本明細書に おいて考慮する技術は当該技術分野で知られたものであり、たとえば、サンドイ ッチアッセイおよびＥＬＩＳＡを含む。 上記抗体に対して向けられた第二抗体（モノクローナル、ポリクローナルまた は抗体のフラグメントまたは合成抗体）は本発明の範囲に含まれる。第一抗体お よび第二抗体の両者を検出アッセイに用いることができるし、または第一抗体を 市販の抗免疫グロブリン抗体とともに用いることができる。 ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両者とも酵素またはタンパク 質で免疫することにより得ることができ、両タイプともイムノアッセイに利用で きる。両タイプの血清を得る方法は当該技術分野でよく知られている。ポリクロ ーナル血清の方がより好ましくないが、有効量の抗原またはその抗原性部分を適 当な実験室動物に注射し、該動物から血清を回収し、ついで公知の免疫吸着法の いずれかにより特定の血清を単離することにより比較的容易に調製できる。この 方法によって産生された抗体は実質的にあらゆるタイプのイムノアッセイに利用 可能であるけれども、生成物の潜在的な不均一性のために一般にあまり好ましく はない。 モノクローナル抗体のイムノアッセイでの使用は、大量に産生しうる能力およ び生成物の均一性のために特に好ましい。不死化細胞株と免疫原性調製物に対し て感作したリンパ球とを融合することにより誘導されるモノクローナル抗体産生 のためのハイブリドーマ細胞株の調製は、当業者によく知られた技術により行う ことができる。 本発明の他の側面は、被験者からの生物学的試料中の抗原の検出方法を包含し 、該方法は、該生物学的試料を該抗原またはその誘導体またはホモログに特異的 な抗体に抗体−抗原複合体を生成するのに充分な時間および条件下で接触させ、 ついで該複合体を検出することを含む。この文脈において、「抗原」は成長因子 、その前駆体、その成分またはそれによって誘導された触媒抗体であってよい。 抗原の存在は、ウエスタンブロッティング法およびＥＬＩＳＡ法などの幾つか の方法で達成することができる。米国特許第４,０１６，４１３号、同第４,４２ ４,２７９号および同第４，０１８，６５３号などを参照することによって明ら かなように、広範囲のイムノアッセイ法が利用できる。これらには、もちろん、 非競合タイプの単一部位（single-site）および２部位（two-site）すなわち「 サンドイッチ」アッセイ並びに伝統的な競合結合アッセイが含まれる。これらア ッセイはまた、標的に対する標識抗体の直接結合を含む。 サンドイッチアッセイが最も有用で一般的に用いられているアッセイであり、 本発明に使用するのが好ましい。サンドイッチアッセイ法の多くの変法が存在す るが、すべて本発明により包含される。簡単に説明すると、典型的なフォアウォ ード（forward）アッセイでは非標識抗体を固相基体に固定化し、試験しようと する試料を該結合分子と接触させる。適当な期間、たとえば抗体−抗原複合体を 生成するのに充分な時間のインキュベーションの後、ついで検出可能なシグナル を生成しうるリポーター分子で標識した該抗原に特異的な抗体を加え、抗体−抗 原−標識抗体の他の複合体を生成するのに充分な時間、インキュベートする。未 反応物質をすべて洗浄して除き、リポーター分子によって産生されたシグナルを 観察することによって該抗原の存在を決定する。その結果は、視覚シグナルの単 純な観察により定性的であるか、または既知の量のハプテンを含む対照試料と比 較することにより定量化することができる。フォアウォードアッセイの変法とし ては、試料と標識抗体とを結合抗体に同時に加える同時アッセイが挙げられる。 これら技術は、より一般的でない変法も含めて当業者にはよく知られている。本 発明によれば、試料は、抗原を含むものであり、細胞抽出液、上澄み液、組織生 検あるいは血清、唾液、粘液性分泌物、リンパ液、組織液および呼吸液を含む。 それゆえ、試料は一般に生物学的流体を含む生物学的試料を含むが、発酵液およ び細胞培養液からなどの上澄み液をも包含する。 典型的なフォアウォードサンドイッチアッセイにおいて、抗原またはその抗原 性部分に対する特異性を有する第一抗体を共有結合かまたは受動的な結合により 固相表面に結合させる。固相表面は一般にガラスまたはポリマーであり、最も一 般的に用いられるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリ スチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固相支持体は、チュー ブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、またはイムノアッセイを行うのに適 した他のあらゆる表面の形態であってよい。結合プロセスは当該技術分野でよく 知られており、一般に、架橋、共有結合または物理的吸着が含まれ、ポリマー− 抗体複合体を被験試料のための調製において洗浄する。ついで被験試料のアリコ ートを固相複合体に加え、抗体中に存在するサブユニットの結合を可能にするの に充分な時間（たとえば、２〜４０分）および適当な条件下（たとえば、２５℃ ）でインキュベートする。インキュベーション期間の後、抗体サブユニット固相 を洗浄し、乾燥し、該ハプテンの一部に特異的な第二抗体とともにインキュベー トする。第二抗体は、該第二抗体の該ハプテンへの結合を示すのに用いるリポー ター分子に結合されている。 別法では、生物学的試料中の標的分子を固定化し、ついで該固定化標的をリポ ーター分子で標識されたまたは標識されていない特異的抗体に接触させることを 含む。標的の量およびリポーター分子シグナルの強度に依存して、抗体での直接 標識により結合標的を検出することができる。別のやり方として、第一抗体に特 異的な第二の標識抗体を標的一第一抗体複合体に暴露して標的−第一抗体−、第 二抗体三次元複合体を生成することができる。この複合体は、リポーター分子に よって放出されるシグナルにより検出される。 本明細書において使用する「リポーター分子」とは、その化学的特性において 、抗原−結合抗体の検出を可能とする分析的に同定可能なシグナルを提供する分 子を意味する。検出は定性的かまたは定量的のいずれかであってよい。このタイ プのアッセイにおいて最も一般的に用いられるリポーター分子は、酵素、蛍光団 または放射性ヌクレオチド含有分子（すなわち、放射性同位元素）および化学発 光分子のいずれかである。エンザイムイムノアッセイの場合、一般にグルタルア ルデヒドまたは過ヨウ素酸により酵素を第二抗体に結合させる。しかしながら、 容易に認識されるであろうように、広範囲の様々な結合法が存在し、これらは当 業者に容易に利用できる。一般的に用いられる酵素としては、とりわけ西洋ワサ ビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼおよ びアルカリホスファターゼが挙げられる。特定の酵素に用いる基質は、一般に、 対応酵素による加水分解後に検出可能な色変化を生成するために選択される。適 当な酵素の例としては、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼが挙げ られる。また、上記発色性基質ではなく蛍光生成物を生成する蛍光原性基質を用 いることも可能である。いずれの場合においても、酵素−標識抗体を第一抗体ハ プテン複合体に加え、結合させ、ついで過剰の試薬を洗浄して除去する。ついで 、適当な基質を含む溶液を抗体−抗原−抗体複合体に加える。基質は第二抗体に 結合した酵素と反応して定性的な視覚シグナルを生成し、これをさらに通常、分 光光度的に定量化して試料中に存在したハプテンの量を示すようにする。「リポ ーター分子」はまた、ラテックスビーズ上での赤血球などの細胞の凝集または凝 集の抑制の使用をも包含する。 別法として、フルオレセインやローダミンなどの蛍光化合物を抗体の結合能を 変えることなく抗体に化学的に結合させることができる。特定波長の光の照明に より活性化されたときに、蛍光色素−標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子を 励起状態に誘導し、ついで光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色の光が放 出される。ＥＩＡの場合と同様、蛍光標識抗体は第一抗−ハプテン複合体に結合 される。未結合の試薬を洗浄して除去した後、残留する三次元複合体を適当な波 長の光に暴露すると、観察される蛍光は目的ハプテンの存在を示す。免疫蛍光 法およびＥＩＡ法はともに当該技術分野で非常によく確立されており、本発明の 方法において特に好ましい。しかしながら、他のリポーター分子、たとえば、放 射性同位元素、化学発光分子または生物発光分子なども用いることができる。 本発明は、触媒抗体をコードする遺伝子配列をクローニングするためにいかな る手段も用いることができる。たとえば、定められた抗原の触媒をスクリーニン グするために、ファージ表面上に触媒抗体を発現しうるファージ展示ライブラリ ーを用いることができる。 本発明はさらに、特定の抗原に対する触媒抗体を産生するためにＢ細胞マイト ジェネシスを誘導するための成長因子前駆体の触媒の産物の使用をも包含する。 さらに詳しくは、本発明は、抗原のすべてはまたは一部の触媒開裂の後のＢ細 胞マイトジェネシスの誘導における、Ｂ細胞表面分子結合部分に結合、融合また は他の仕方で会合した、その触媒抗体を得ようとする抗原を含む成長因子前駆体 の使用を包含する。 本発明のさらに他の態様は、抗原のすべてまたは一部の触媒開裂の後にＢ細胞 マイトジェネシスを誘導するための成長因子前駆体の製造における、Ｂ細胞表面 分子結合部分に結合、融合または他の仕方で会合した抗原の使用を包含する。 本発明をさらに以下の限定されない図面および／または実施例により記載する 。 図面において： 図１は、ＬＨＬをコードする遺伝子構築物を生成するのに用いる３つの重複す る合成オリゴヌクレオチドの模式図である。 図２は、ヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）アフィニティーカラム上で精製した後の細 菌溶解液中のＬＨLの写真表示である。第一のレーンは非還元LＨL試料、第二の レーンは還元ＬＨＬ試料、右のレーンはサイズが約１８ｋＤａの精製ＬＨＬであ る。 図３は、２つの親和性標識を有するＬＨＬ.seqの模式図である。 図４は、２０％ｗ／ｖポリアクリルアミドＳＤＳ銀染色ＰＨＡＳＴ−ゲル上で 分析したＬＨＬ.seq発現および精製を示す写真表示である。Ｌ＝ＬＨＬ.seq発現 のｏ／ｎ誘導後の組換えＤＨ１０Ｂ溶解液；Ｓ−ストレプトアビジン精製Ｌ ＨＬ.seqタンパク質；Ｈ−ｈｕＩｇＧ精製ＬＨＬ.seqタンパク質；ｅ−１ｍｇ／ ｍｌジアミノビオチン、ＰＢＳ（Ｓ）または１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．０） （Ｈ）による溶出；ｂ−負荷緩衝液中での沸騰によるＬＨＬ.seqの溶出。精製は １．５ｍｌ容エッペンドルフ管中、室温にて行った。５０μｌの溶解液を２５μ ｌのカラムマトリックスとともに１５分間インキュベートした。ついで、記載の ように５０μｌの溶液で溶出または沸騰する前にカラム物質を５００μｌのＰＢ Ｓ、０．５％ｖ／ｖトリトンＸ−１００で２回洗浄した。ｈｕＩｇＧマトリック スからのＬＨＬ.seqの溶出は、大スケールのアフィニティーカラム上で洗浄する 場合には最も有効で好ましい方法ではあったが、この特定の条件下では非常に非 効率的であった。 図５は、Ｂ細胞に対するＬＨＬのマイトジェネシス活性を示すグラフ表示であ る。Ｍ、培地；ＬＰＳ、リポ多糖；Ａｂ、抗ＩｇＭ抗体；Ｃ、誘導された「空の 」発現ベクターおよびＬＨＬ_bＹ軸（０〜１００％）：Ｘ軸上に示す物質ととも に腸間膜のリンパ節細胞を一夜インキュベートした後にＢ７．２を発現する細胞 のパーセント。 図６は、図５のグラフ表示であり、けばを付した棒は５００μｇ／ｍｌのヒト ＩｇＧの存在下での実験を示す。 図７は、以下に示す同時培養の上澄み液とともにインキュベートしたＩＬ−２ 依存性ＣＴＬＬのＤＮＡ合成（ＣＰＭ）の間の³Ｈ−チミジン導入を示すグラフ 表示である。脾臓細胞または腸間膜のリンパ細胞をＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９ とともにＭ、培地；ＨＥＬ、ニワトリ卵リゾチーム；およびＬＨＬの存在下で同 時培養した。各ＨＥＬおよびＬＨＬについてのけばを付した棒は、ヒトＩｇＧ （ＨｕＩｇＧ）の存在下での同じ実験である。 図８は、カッパ可変軽鎖およびその２つの親和性標識の模式図である。 図９は、２０％ｗ／ｖポリアクリルアミドＳＤＳ ＰＨＡＳＴ−ゲル上で分析 した銀染色後のカッパ発現を示す写真表示である。Ｌ＝カッパを発現すべく誘導 した２つの異なる組換えＤＨ１０Ｂクローンの全溶解液；Ｔ＝ペリプラスム分画 後のペレット；Ｐ＝カッパタンパク質を有するペリプラスム画分。 図１０は、２０％ｗ／ｖポリアクリルアミドＳＤＳ ＰＨＡＳＴ−ゲル上で分 析した銀染色後のカッパ発現を示す写真表示である。ｗ＝カラム物質とともにイ ンキュベートした後のペリプラスム画分；ｅ＝（Ｆ）Ｃａ⁺⁺依存性の抗Ｆｌａｇ 親和性カラムの場合の５００ｍＭ ＥＤＴＡまたは（Ｓ）ストレプトアビジンカ ラムの場合の５０ｍＭジアミノビオチンを用いた溶出液；ｂ＝負荷緩衝液中で沸 騰することにより得られた（Ｆ）および（Ｓ）からの溶出液。 図１１は、銀染色した２０％ｗ／ｖポリアクリルアミドＳＤＳ ＰＨＡＳＴ− ゲル上で示されるカッパー負荷ストレプトアビジンカラムにより精製されたＬＨ Ｌの写真表示である。ＬＨＬ＝ＬＨＬ単独プラスストレプトアビジンマトリック ス；ＬＨＬ−カッパ＝カッパ負荷ストレプトアビジンマトリックス上で精製した ＬＨＬ；カッパ＝ストレプトアビジンマトリックスに結合したカッパ単独。 図１２は、ＣＡＴＡＢ前駆体ＴＬＨＬの模式図である。 図１３は、２つの異なるＤＨ１０Ｂクローンからの精製ＴＬＨＬの銀染色した ２０％ｗ／ｖポリアクリルアミドＳＤＳ ＰＨＡＳＴ−ゲル分析の写真表示であ る。Ｌ＝全溶解液；Ｐ＝ペリプラスム画分；ｅ＝５０ｍＭジアミノビオチンで溶 出；ｂ＝負荷緩衝液中での沸騰により溶出。 図１４は、ＴＥＶ開裂したＴＬＨＬの銀染色した２０％ｗ／ｖポリアクリルア ミドＳＤＳ ＰＨＡＳＴ−ゲルの写真表示である。レーン１＝開裂していないＴ ＬＨＬ；レーン２＝１０単位のＴＥＶで開裂したＴＬＨＬ；レーン３および４＝ レーン１および２での１０μｌの代わりに２０μｌで開裂を行った。ＴＥＶプロ テアーゼバンドの同定は後の実験で確認された。 図１５は、ＬＨＬ.seq誘導されたＢ細胞活性化を示す表示である：ＦＡＣＳに よるｆｓｃ、ｂ７−１、ｂ７−２分析。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪからの腸間膜リンパ節細 胞を３×１０⁵／ウエルにて３つの培養で刺激した。Ｂ細胞上の活性化マーカー のアップレギュレーション（upregulation）を、Ｂ２２０⁺Ｔｈｙ^-細胞上でゲー ティングしてＢ細胞を同定することによりモニターした。結果をＦＡＣＳ−ヒス トグラムで表してあり、ＦＳＣおよびＢ７−１およびＢ７−２染色レベルを示す 。灰色の線は培地単独でインキュベートした細胞からのバックグラウンド染 色を示し、黒の線は個々の結果を示す。抗ＩｇＭおよび抗カッパを正の対照とし て、ＬＰＳを負の対照として含めた。 図１６は、ＬＨＬ.seq誘導されたＢ細胞活性化を示す表示である：ＦＡＣＳに よるＦＳＣ、ＭＨＣクラスII分析。ＦＡＣＳ分析は上記と同様にして行った。灰 色の線は培地単独でインキュベートした細胞からのバックグラウンド染色を示し 、黒の線は個々の結果を示す。抗ＩｇＭを正の対照として、ＬＨＬ.seqプラスｈ ｕＩｇＧを対照として含めた。 図１７は、ＬＨＬ.seq誘導されたＢ細胞活性化を示す表示である：増殖アッセ イにおける用量−応答分析。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪからの腸間膜リンパ節細胞（上のパ ネル）およびＣＢＡ／Ｊマウスからの脾臓細胞（下のパネル）を上記と同様にし て調製した。リンパ球を完全ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ培地中、３７℃で２日間、 平底９６−ウエルプレート中で１×１０⁵／ウエルにて３つの培養で刺激した。 最後の６時間に細胞に³Ｈ−チミジンを適用する。ＤＮＡをガラス繊維フィルタ ー上に回収し、³Ｈ−チミジンの取り込みをβ−カウンターで測定した。結果を 、標準偏差を含めて３つの培養の平均として表す。 図１８は、ＴＬＨＬ誘導されたＢ細胞活性化を示す表示である：ＦＡＣＳによ る分析。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスからの腸間膜リンパ節細胞をナイコデンツ（Nyco denz）（１.０９１ｇ／ｃｍ³）中で遠心分離し、ついでプラスチック上、３７℃ で１時間吸着させた。リンパ球を３×１０⁵細胞／ウエルにてＬＰＳ、抗ＩｇＭ 抗体、ＬＨＬ.seq、ＴＬＨＬおよびＴＥＶ−開裂ＴＬＨＬで刺激した。培養１日 目に細胞をＢ７−１およびＢ７−２について染色した。Ｂリンパ球をＢ２２０の 発現およびＴｈｙ１．２発現の欠如により同定した。Ｂ細胞の活性化の状態をそ のＦＳＣの増大およびＢ７−２およびＢ７−１の発現により確認した。 図１９は、ＴＬＨＬ誘導されたＢ細胞活性化を示す表示である：増殖アッセイ による分析。ＣＢＡ／Ｊマウスからの脾臓細胞２×１０⁵を上記と同様にして培 養および刺激した。培養２日目に細胞を³Ｈチミジンを６時間適用した。³Ｈチミ ジンの取り込みをカウント／分（ｃｐｍ）にて示す。ＭＥＤ＝培地単独；ＴＥＶ ＝ＴＥＶプロテアーゼ；ＴＬＨＬ＝ＴＬＨＬ；ＴＬＨＬ＋ＴＥＶ＝ＴＥＶ−開 裂ＴＬＨＬ；ＬＨＬ＝ＬＨＬ.seq。 図２０は、全ＤＨ１０Ｂ細胞溶解液からｈｕＩｇＧアフィニティーカラム精製 したＬＨＬ−ｏｍｐの銀染色した２０％ｗ／ｖポリアクリルアミドＳＤＳ ＰＨ ＡＳＴ−ゲル分析上のＬＨＬ−ＯＭＰの精製を示す表示である。ＬＨＬ−ｏｍ ｐを分子量サイズマーカーのつぎに行ったところ、約１９.５ｋＤの正確な分子 量を示す。 図２１は、ＬＨＬ−ＯＭＰ誘導されたＢ細胞活性化を示す表示である。Ｃ３Ｈ ／ＨｅＪマウスからの脾臓細胞をナイコデンツ（１．０９１ｇ／ｃｍ³）中で遠 心分離し、ついでプラスチック上、３７℃で１時間吸着させた。細胞を３×１０⁵ 細胞／ウエルにてＬＰＳ、抗ＩｇＭ抗体、ＬＨＬ.seq（１μｇ／ｍｌ）、ＬＨ Ｌ−ｏｍｐ（２μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ４０ｍＡｂ（クローンＦＧＫ４５．５）（ ０．５μｇ／ｍｌ）、ＬＨＬ−ｏｍｐ（１２５ｎｇ／ｍｌ）および両濃度のＬＨ Ｌ−ｏｍｐと抗ＣＤ４０との組褪せで刺激した。刺激後１日目に細胞をＢ７−１ およびＢ７−２について染色した。Ｂリンパ球をＢ２２０の発現およびＴｈｙ１ ．２発現の欠如により同定した。Ｂ細胞の活性化の状態をそのＦＳＣの増大およ びＢ７−２およびＢ７−１の発現により確認した。ＬＨＬ.seqのデータは代表的 な実験（たとえば、図１８）からとった。 図２２は、ＬＨＬ−ＯＭＰ誘導されたＢ細胞増殖を示す表示である。Ｃ３Ｈ／ ＨｅＪマウスからの脾臓細胞をナイコデンツ（１．０９１ｇ／ｃｍ³）中で遠心 分離し、ついでプラスチック上、３７℃で１時間吸着させた。細胞を３×１０⁵ 細胞／ウエルにて、ＬＨＬ.seq（１μｇ／ｍｌ）、抗ＩｇＭ抗体（２０μｇ／ｍ ｌ）およびＬＨＬ−ｏｍｐ（２μｇ／ｍｌ）で刺激した。培養２日および３日後 に細胞に³Ｈ−チミジンを適用した。ＤＮＡ中への³Ｈ−チミジンの取り込みをβ −カウンターで評価した。 図２３は、ｏｍｐＬの模式図である。 図２４は、Ｆｖ−ｃａｔＡｂの模式図である。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯの概要 分子 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ヌクレオチド アミノ酸 ＬＨＬ １ ２ ＣＡＴＡＢ−ＴＥＶ ３ ４ ＴＬＨＬ ５ ６ ＬＨＬ.seq ７ ８ ＦＬＡＧエピトープ − ９ カッパ １０ １１ ＬＨＬ−ｏｍｐ １２ １３ Strep-tag − １４ 実施例１ 合成オリゴヌクレオチドからのＬＨＬの生成 ３つの重複した合成オリゴヌクレオチド、１１５ｍｅｒ、１１６ｍｅｒおよび １０５ｍｅｒから、２つの２０サイクルＰＣＲ反応においてプルーフリーディン グＤＮＡポリメラーゼＰｆｕを用いてＬＨＬを生成した（図１参照）。２つのＰ ＣＲ産物（２９０ｂｐおよび２００ｂｐ）を精製し、発現ベクターｐＡＳＫ７５ 中に平滑末端クローニングした。その配列を自動シークエンシングにより確定し た。以後のすべてのＰＣＲは、文献の記載に従って上記と同様にして行った。Ｌ ＨＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示してある。 実施例２ 大腸菌中でのＬＨＬの発現およびヒトＩｇＧ（ｈｕｌｇＧ）アフィニティーカラ ムによる精製 発現ベクターｐＡＳＫ７５は、ｏｍｐＡシグナルペプチドを介して大腸菌のペ リプラスム中へのタンパク質の発現を指令する。タンパク質発現をミドログ （midlog）大腸菌ＤＨ１０Ｂ培養液中、２００ｎｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサ イクリンで１６時間誘導した。細胞を溶解し、可溶性のＬＨＬをｈｕＩｇＧアフ ィニティーカラムで精製した（＞９５％）（図２）。調製物から内毒素を除去す るため、０．５％ｖ／ｖトリトンＸ−１００を用いた充分な洗浄をアフィニティ ーカラム上で行った。発現レベルは培養液１リットル当たり２０ｍｇと評価され た。 実施例３ Ｎ末端にＦＬＡＧエピトープおよびＣ末端にStrep-tagを有するＬＨＬタンパク 質の生成 Ｎ末端にＦＬＡＧエピトープおよびＣ末端にいわゆるstrep-tagを含む形態の ＬＨＬ（以下、「ＬＨＬ.seq」と称する）をＰＣＲにより生成した（図３）。Ｌ ＨＬ.seqのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す。ＦＬＡＧエピトープはアミノ酸ＤＹ ＫＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を含み、strep-tagはアミノ酸配列Ａ ＷＲＨＰＱＦＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を含む。ＦＬＡＧエピトープは 幾つかの抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体により認識され、strep-tagはストレプ トアビジンにより認識される。strep-tagはストレプトアビジンカラム上でのＬ ＨＬ.seqの精製に用いた。ＬＨＬ.seqをカラムに結合させたまま内毒素を最小に するため、ＬＨＬ.seqを０．５％ｖ／ｖトリトンＸ−１００、トゥイーン２０お よびＰＢＳで洗浄した。ＬＨＬ.seqの溶出は、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．０ ）かまたはＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌジアミノビオチンを用いて行った。この方法 ではＬＨＬ.seqを免疫グロブリンへの結合に基づいた精製を行わなかったので、 免疫グロブリンに結合する他の未知の細菌タンパク質の混入の可能性を排除でき た。しかしながら、ＬＨＬ.seqの生物学的活性はＬＨＬと同一のままであった。 ＦＬＡＧ−エピトープをN末端に付加したのは、ＬＨＬ.seqのペリプラスム間隙 への分泌を容易にするためであった。これまでの発現研究と同様、このことは首 尾よくいかず、全細菌溶解液からＬＨＬ.seqを精製する必要があった（図４）。 このことの結果、ｏｍｐＡシグナルペプチドは除去されず、このことが今度はＬ ＨＬ.seqの多量体の形成を導いた。 実施例４ Ｂ細胞に対するＬＨＬのマイトジェン活性 Ｂ細胞に対するＬＨＬのマイトジェン活性を、脾臓細胞および腸間膜リンパ球 の一夜培養液で試験し、精製Ｂ細胞に対しても行った。Ｂ細胞の活性化状態の分 析は、ＦＡＣＳ、Ｂ細胞のサイズの検討およびＢ７−２表面発現の誘導により行 った。ＬＨＬの活性化能は、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）、細菌のマイトジェンリ ポ多糖および抗ＩｇＭ抗体（２５μｇ／ｍｌ）（表面ＩｇＭを架橋する）と同様 である。その結果を、幾つかの異なるマウス株、たとえばＢＩ０．Ａ（４Ｒ）、 ＣＢＡ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪおよびＢＡＬＢ／ｃで独立に得た。Ｂ細胞は、活性化ア ッセイにおいて５倍希釈（２５μｇ／ｍｌ〜１.６ｎｇ／ｍｌ）で滴定したとき にＬＨＬに対して明らかな用量応答を示した。その結果を図５に示す。同じ培養 条件でＴ細胞活性化状態を分析する平行実験は、ＬＨＬがＴ細胞に対して作用を 有しないことを示した。Ｔ細胞は芽球形成を示さなかったし、活性化マーカー、 たとえばＩＬ−２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５）をアップレギュレートすること もなかった。 実施例５ ｈｕＩｇＧによるＬＨＬマイトジェン活性のブロッキング 同じ実験において、Ｌドメインに結合するｈｕＩｇＧ（５００μｇ／ｍｌ）を 用いてＬＨＬの活性を特異的にブロックした。これらの結果は、Ｂ細胞の活性化 が細菌により産生された内毒素を有するＬＨＬの混入によるものであることを排 除した。その結果を図６に示す。 実施例６ Ｂ細胞によるＬＨＬのプロセシングおよびＨＥＬ特異的ハイブリドーマ３Ａ９へ のＨエピトープの提示 脾臓細胞および腸間膜リンパ球をＬＨＬの存在下、Ｔ細胞ハイブリドーマ３Ａ ９とともに同時培養した。３Ａ９は、ＭＨＣIIＨ−２Ａ^k上に提示されたＨＥＬ ペプチド５２−６１アミノ酸に特異的である。このペプチドを認識すると３Ａ９ はＩＬ−２を分泌する。ＩＬ−２産生の測定は、ＤＮＡ合成の間の³Ｈ−チミジ ンの取り込みに基づいてＩＬ−２依存性細胞株（ＣＴＬＬ）の増殖を評価するバ イオアッセイにおいて行った（図７）。Ｂ細胞によるＨの３Ａ９への提示はＣＴ ＬＬの増殖によって明らかに示され、ｈｕＩｇＧによって特異的にブロックする ことができた。 実施例７ ヒトＬＥＮタンパク質配列による可変（ｖ）−カッパ軽鎖の生成 ヒト骨髄腫タンパク質ＬＥＮをコードする遺伝子のアミノ酸配列を用いて可変 カッパ軽鎖を生成した。このヒトカッパ軽鎖タンパク質（以下、「カッパ」と称 する）は比較的高濃度で可溶であり、タンパク質Ｌに結合することが示された。 カッパをＰＣＲにより合成オリゴヌクレオチドから生成した。タンパク質の精製 を容易にするため、Ｎ末端にＦＬＡＧエピトープを、Ｃ末端にstrep-tagを付加 した（図８）。カッパのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示す。 実施例８ 大腸菌ＤＨ１０Ｂ中でのカッパの発現 カッパをｐＡＳＫ７５中にクローニングして大腸菌のペリプラスム空隙へカッ パを誘導発現させた。発現の誘導は、対数増殖している大腸菌株ＤＨ１０Ｂ細胞 の培養液において４００ｎｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリンを用いて＞４ 時間行った（図９）。 実施例９ ＤＨ１０Ｂのペリプラスムからのカッパタンパク質の精製 培養液を回転沈殿させ（spun down）、４００ｍＭショ糖を含む緩衝液中、氷 上で再懸濁した。ついで、カッパを抗ＦＬＡＧおよび／またはストレプトアビジ ンカラムによりペリプラスム画分から精製した（図１０）。 実施例１０ 精製後のカッパの正しい折り畳みの確認 カッパの正しい折り畳みをＬＨＬへの結合能により示した。カッパをそのstre p-tagによりストレプトアビジンカラムに結合させた。ついで、このカッパ負荷 カラムがＬＨＬを結合することを示した（図１１）。strep-tagを有しないＬＨ Ｌは、ストレプトアビジンカラム単独には結合しなかった。 実施例１１ ＴＬＨＬの生成 ＴＬＨＬを、ＬＨＬ、カッパおよびカッパとＬＨＬとを連結するリンカーをコ ードする合成オリゴヌクレオチドからＰＣＲにより生成した。リンカー配列には 、タバコモザイクウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識および／または開裂部位 に対応するアミノ酸配列を含んでいた。すべての成分をｐＡＳＫ７５中にクロー ニングして下記タンパク質配列とした：ＦＬＡＧ−カッパーリンカーＴＥＶ−Ｌ ＨＬ−strep-tag（図１２）。可能性として、ＴＬＨＬはＣＡＴＡＢと同様の特 性を示すかもしれない。なぜなら、一つのカッパ結合部位がブロックされており 、表面免疫グロブリン架橋には２つの部位が必要とされるからである。ＴＬＨＬ のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およ びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示してある。 実施例１２ ＤＨ１０Ｂ中でのＴＬＨＬの発現 ＴＬＨＬ発現の誘導を、対数増殖している培養液に４００ｎｇ／ｍｌのアンヒ ドロテトラサイクリンを＞４時間加えることにより行った。ＴＬＨＬはペリプラ スム空隙には分泌されず、誘導後に若干の菌体溶解を引き起こした。 実施例１３ 全細菌溶解液からのＴＬＨＬの精製 ＴＬＨＬをそのstrep-tagを介してストレプトアビジンカラムにより全細菌溶 解液から精製した（図１３）。すでに記載したように、内毒素レベルは洗浄プロ トコールを用いて低減させた。 実施例１４ ＴＥＶを用いたＴＬＨＬの「Ｔ」および「ＬＨＬ」への開裂 ＴＬＨＬはＴＥＶプロテアーゼによりカッパ部分が開裂除去されるように設計 してあった。ＴＥＶ開裂は、それぞれ１７２アミノ酸の２つのポリペプチドを生 成する。これらタンパク質フラグメントのサイズが同一であるのは、ＴＬＨＬが 大腸菌のペリプラスム空隙に分泌されないからであり、それゆえｏｍｐＡシグナ ルペプチドを保持している。それゆえ、ＴＬＨＬをＴＥＶプロテアーゼとともに ＰＢＳ中で室温または４℃にてインキュベートするとＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で １９ｋＤのバンドが得られた（図１４）。 実施例１５ ＴＬＨＬおよびカッパからのＰＣＲによるＣＡＴＡＢ−ＴＥＶの組み立て ＣＡＴＡＢ−ＴＥＶをＴＬＨＬおよびカッパからＰＣＲにより組み立てる。Ｔ ＬＨＬとカッパとは種々のペプチド、たとえばタンパク質加水分解抗体の潜在的 な標的部位であるＴＮＦアミノ酸１−３１により連結することができる。この場 合、リンカーにはタバコモザイクウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼの認識配列が 含まれ、ＣＡＴＡＢ−ＴＥＶからのＬＨＬのインビトロ生成が可能となる。ＣＡ ＴＡＢ−ＴＥＶのヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す。 実施例１６ ＤＨ１０Ｂ中でのＣＡＴＡＢの発現およびstrep-tagによるストレプトアビジン アフィニティーカラム上での精製 ＣＡＴＡＢ−ＴＥＶをＴＬＨＬと同様にして（上記参照）発現および精製する 。 実施例１７ Ｂ細胞上でのＣＡＴＡＢ−ＴＥＶの非マイトジェン活性の証明 ＣＡＴＡＢ−ＴＥＶを、ＬＨＬおよびＬＨＬ.seqのマイトジェン活性を分析す るのに使用するすでに確立されたＢ細胞アッセイにおいて試験する。 実施例１８ ＴＥＶプロテアーゼによるタンパク質加水分解開裂によるＣＡＴＡＢのマイトジ ェン活性の現出 ＣＡＴＡＢ−ＴＥＶをＴＥＶからの部位特異的なプロテアーゼで消化するとＬ ＨＬとカッパドメインとの間の共有結合が開裂される。この開裂によってマイト ジェン化合物であるＬＨＬが生成し、これを標準的なＢ細胞活性化アッセイにお いて試験する。 実施例１９ Ｋ−ハプロタイプの幾つかのマウス株でのＣＡＴＡＢの使用 触媒抗体応答をインビボで引き起こすため、幾つかのマウス株を種々の投与経 路、たとえば脾臓内投与により免疫する。ｇｌｄおよびｌｐｒ変異体株には、比 較的高頻度で触媒自己抗体（たとえば、ＤＮＡアーゼ活性を有する抗体）が天然 に存在するのでこれを用いる。 実施例２０ ＣＡＴＡＢ特異的な触媒抗体の血清からの検出 免疫マウスから血清抗体をたとえばＬＨＬアフィニティーカラム上で精製する 。精製抗体を¹²⁵Ｉ−標識ＣＡＴＡＢとともにインキュベートし、タンパク質加 水分解開裂をＰＡＧＥゲル上で評価する。さらに、ストレプトアビジンを９６ウ エルＥＬＩＳＡプレート上で用いてＣＡＴＡＢをそのＣ末端strep-tagを介して 固定化することができる。固定化したＣＡＴＡＢを精製触媒血清抗体とともにイ ンキュベートすることによりタンパク質加水分解開裂され、Ｎ末端のアフィニテ ィー標識、たとえばｆｌａｇエピトープは失われる。この欠如は、西洋ワサビペ ルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）結合抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ において検出する。触媒抗体を産生するＢ細胞は標準ハイブリドーマ法により回 収することができ、触媒抗体は組換えＤＮＡ法によりヒト化することができる。 たとえば、「ヒト」抗体をヒト化マウスから得ることができる。 実施例２１ ＬＨＬ.seqにより誘導されたＢ７−１発現 ＬＨＬ.seqがＢ細胞を活性化する能力を、抗ＩｇＭおよび抗カッパによる刺激 と比較して試験した。活性化状態の測定は、細胞表面での活性化マーカーＢ７− １およびＢ７−２の発現により、およびＢ細胞の細胞周期の開始により行った。 Ｂ７−１およびＢ７−２の発現レベルの決定は蛍光標識モノクローナル抗体を用 いたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により行い、一方、細胞周期の開始は細 胞サイズの増大をフォアウォード光分散（Forward Light Scatter）（ＦＳＣ） によりモニターした。 使用した方法は以下の通りであった。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスからの腸間膜リン パ節細胞をナイコデンツ中で遠心分離して（１.０９１ｇ／ｃｍ³）死細胞およ び赤血球（ｒｂｃ）を除去した。この後、プラスチック上、３７℃で１時間吸着 させてマクロファージなどの吸着細胞を除去した。リンパ節細胞を平底９６−ウ エルプレート中、完全ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ培地にて３７℃、１〜３日間、３ つの培養３×１０⁵／ウエルにて刺激した。Ｂ細胞上の活性化マーカーのアップ レギュレーションのモニターを、Ｂ２２０⁺Ｔｈｙ^-細胞上にゲーティングしてＢ 細胞を同定することにより行った。ＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）、ポリクローナル Ｆ(ａｂ)₂抗ＩｇＭ抗体（２０μｇ／ｍｌ）および抗カッパ抗体（１０μｇ／ｍ ｌ）を対照として含めた。ＬＨＬ．ｓｅｑは１μｇ／ｍｌで用いた。Ｃ３Ｈ／Ｈ ｅＪマウスをリンパ球の採取源として用いたのは、この特定のマウス株がＬＰＳ に非応答性であるからであった。この株をＬＰＳ対照と組み合わせて用いること により、ＬＨＬ.seqにより誘導されるＢ細胞刺激が細菌により発現されたタンパ ク質のＬＰＳ（内毒素）混入による可能性が有効に排除される。 ＦＡＣＳ分析は、このＣ３Ｈ／ＨｅＪリンパ節細胞のＬＰＳによる２日間の刺 激の結果、Ｂ細胞の活性化とはならなかったが、一方、抗ＩｇＭ抗体、抗カッパ 抗体またはＬＨＬ.seqによる刺激ではＦＳＣの増大およびＢ７−２のアップレギ ュレーションにより測定されるようにＢ細胞の活性化となった。ＬＨＬ.seqの特 徴的な能力は、インキュベーション後のＢ７−１の強力な誘導により示される（ 図１５を参照）。抗ＩｇＭ抗体は刺激の２〜３日目にＢ７−１を誘導する。 実施例２２ ＬＨＬ.seqはＭＨＣクラIIを誘導する ＬＨＬ.seqを、刺激Ｂ細胞上のＭＨＣクラスIIの適切なアップレギュレーショ ンを保証する能力について比較した。抗ＩｇＭ抗体（２０μｇ／ｍｌ）並びにｈ ｕＩｇＧ（５００μｇ／ｍｌ）でブロッキングしたＬＨＬ.seq（１μｇ／ｍｌ） を対照として含めた。使用した方法は実施例２１に記載したものと同様であった 。 Ｂ細胞上でのＭＨＣクラスII分子のアップレギュレーションは、Ｔ細胞のヘル プをインビボで受けるための必要条件である。 Ｃ３Ｈ／ＨｅＪリンパ節細胞を抗ＩｇＭ抗体並びにＬＨＬ.seqで一夜刺激す るとＦＳＣの増大およびＭＨＣクラスIIのアップレギュレーションという結果と なる。ＬＨＬ.seqの活性は５００μｇ／ｍｌのｈｕｌｇＧを培養液に加えること により完全にブロックされた（図１６参照）。 実施例２３ ＬＨＬ.seqは用量依存的な仕方で増殖を誘導した 系列希釈したＬＨＬ.seqを用いてＢ細胞増殖を刺激した。この実験は、ＬＨＬ .seqの生物学的特性が抗ＩｇＭ抗体のような通常のＢ細胞マイトジェンと同様で あることを示した。それゆえ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪからの腸間膜リンパ節細胞および ＣＢＡ／Ｊからの脾臓細胞の刺激について用量−応答曲線を得た（図１７参照） 。 実施例２４ ＴＬＨＬはＢ細胞活性化を誘導した ＬＨＬ.seqＴＬＨＬおよびＴＥＶ−開裂ＴＬＨＬがＢ細胞を活性化する能力に ついて、活性化マーカーＢ７−１（ＣＤ８６）およびＢ７−２（ＣＤ８０）の表 面発現の誘導によりおよびＢ細胞の細胞周期の開始により測定して試験した。Ｂ ７−１およびＢ７−２の発現レベルは蛍光標識モノクローナル抗体を用いたフロ ーサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により決定し、一方、増殖はフォアウォード光散 乱（ＦＳＣ）による細胞サイズの増大および³Ｈ−チミジン取り込みアッセイに よりモニターした。 使用した方法は実施例２１に記載したものと同様であった。 Ｃ３Ｈ／ＨｅＪリンパ節細胞をＬＰＳで一夜刺激するとＢ細胞の活性化とはな らなかったが、一方、抗ＩｇＭ抗体またはＬＨＬ.seqによる刺激ではＦＳＣの増 大およびＢ７−２のアップレギュレーションにより測定されるようにＢ細胞の活 性化となった。ＬＨＬ.seqの特徴的な能力は、一夜インキュベーション後のＢ７ −１の強力な誘導により示される（図１８を参照）。抗ＩｇＭは刺激の２〜３日 目にＢ７−１を誘導する。 しかしながら、ＴＬＨＬはＬＨＬ.seqと同じ程度にＢ細胞を活性化した。この ことは予期しないことであった。というのは、一つのＬドメインを共有結合カ ッパでブロックするとＢ細胞表面上の免疫グロブリンの架橋が妨げられると思わ れるからである。架橋の妨害は、等量のＬＨＬ.seqで達成される活性化に比べて Ｂ細胞の活性化がないかまたは有意に低い活性化となるはずである。ＴＥＶ−開 裂ＴＬＨＬはｏｍｐ−カッパ（下記参照）とＬＨＬ.seq部分とになるが、より低 いＢ７−１およびＢ７−２アップレギュレーションおよびより低いＦＳＣ増大に より示されるように（図１８）非開裂ＴＬＨＬに比べてＢ細胞活性化がはるかに 低くなった。 ＣＢＡ／Ｊマウスからの脾臓細胞をナイコデンツ（１．０９１ｇ／ｃｍ³）中 で遠心分離して死細胞およびｒｂｃを除去した。この後、プラスチック上、３７ ℃で１時間吸着させて吸着細胞を除去した。ついで、脾臓細胞を平底９６−ウエ ルプレート中、完全ＲＰＭＩ＋１０％ｖ／ｖ ＦＣＳ培地にて３７℃、２日間、 ３つの培養２×１０⁵／ウエルにて刺激した。細胞に最後の６時間、³Ｈ−チミジ ンを適用した。ついで、ＤＮＡをガラス繊維フィルター上に回収し、³Ｈ−チミ ジンの取り込みをβ−カウンターで測定した。 ＦＡＣＳ分析により得られた結果は、増殖データにより確認された；ＴＬＨＬ およびＬＨＬ.seqは同等のＢ細胞増殖を誘導したが、ＴＥＶ−開裂ＴＬＨＬは約 ７０％強度が低かった（図１９）。 実施例２５ ＴＥＶ−開裂ＴＬＨＬ刺激データはｏｍｐ誘導多量体形成を確認する Ｂ細胞活性化データは本発明者らをしてＬＨＬ、ＬＨＬ.seqおよびＴＬＨＬが 多量体分子として溶液中に存在するという結論に導かしめる。二量体またはオリ ゴマーの免疫グロブリン結合分子、たとえば抗ＩｇＭ抗体はＢ細胞活性化を誘導 するが、抗ＩｇＤ−デキストランなどの多量体は有意により高程度のＢ細胞活性 化という結果となる。このことは、ＬＨＬ、ＬＨＬ.seqおよびＴＬＨＬの場合も 、上記実験において一夜培養後のＢ７−１の高度のアップレギュレーションによ り示されるように当てはまる。多量体形成はｏｍｐＡシグナルペプチド（ｏｍｐ ）によって容易になる。他の研究者によってｏｍｐＡシグナルペプチドが水溶液 中で多量体を形成することが公開されている。ＬＨＬ、ＬＨＬ.seqおよび ＴＬＨＬの凝集の証拠はまた、ＨＰＬＣ研究によっても得られている。ｏｍｐＡ シグナルペプチドが欠如した新たな組換えＬＨＬ.seqタンパク質（ＬＨＬ−ｏｍ ｐと称する）を設計したが、このタンパク質からもまたこれら結論が確認された （下記参照）。 実施例２６ ＴＬＨＬ多量体形成は「カッパ−ブロッキング」を克服する ＴＬＨＬにおいて一つの「Ｌ」ドメインはカッパによってブロックされるにち がいないが、ｏｍｐによって媒体される多量体形成は幾つかの遊離の「Ｌ」ドメ インが多量体分子［ＴＬＨＬ］_n中に存在することを可能にする。このことは、 示されるように、広範なｓＩｇ架橋となり、完全なＢ細胞活性化となる。 実施例２７ ＬＨＬ−ｏｍｐの生成および分析 ＬＨＬ.seqからＰＣＲによりｏｍｐＡシグナル配列を除去するプルーフリーデ ィングポリメラーゼＰｆｕを用いてＬＨＬ−ｏｍｐを生成した。 実施例２８ ＬＨＬ−ｏｍｐのアフィニティーカラム精製 ＬＨＬ−ｏｍｐはstrep-tagを含むが、標準プロトコールを用いてストレプト アビジンカラムにより精製することはできず、該カラムマトリックスに対してＬ ＨＬ.seqに比べて結合活性が低いことを示していた。この低い結合活性はｏｍｐ によるＬＨＬ.seqの多量体形成を確認するものであり、このことがＬＨＬ.seqと ＬＨＬ−ｏｍｐとの唯一の差異である。このことと一致して、ＬＨＬ−ｏｍｐは ｈｕＩｇＧアフィニティーカラムから容易に精製された（図２０）。 実施例２９ ＬＨＬ−ｏｍｐはＢ細胞活性化を誘導した ＬＨＬ−ｏｍｐがＢ細胞活性化を誘導する能力を、上記で概要を示したように Ｂ細胞上でのＢ７−１およびＢ７−２発現レベルを分析する前にＣ３Ｈ／ＨｅＪ マウスからの脾臓細胞を種々の時間インキュベートすることにより評価した。Ｂ 細胞の細胞周期への進行はＦＡＣＳおよび増殖アッセイによりモニターした。 細胞を上記と同様にして調製および培養した。ＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）およ び抗ＩｇＭ（２０μｇ／ｍｌ）を対照として用いた。 ＬＰＳによるＣ３Ｈ／ＨｅＪの刺激は検出可能なＢ細胞活性化とはならなかっ たが、抗ＩｇＭ抗体かまたはＬＨＬ.seqのいずれかによる処理は一夜培養の間に Ｂ細胞活性化を誘導した；抗ＩｇＭ抗体については増大したＦＳＣおよびＢ７− ２のアップレギュレーション、ＬＨＬ.seqについては増大したＦＳＣおよびＢ７ −１およびＢ７−２発現。ＬＨＬ−ｏｍｐは２μｇ／ｍｌで用いたときに、ＦＳ Ｃプロフィルにより示されるように、Ｂ７−１、Ｂ７−２のアップレギュレーシ ョン、およびＢ細胞のブラスティング（blasting）の誘導においてＬＨＬ.seqよ りも効力が低かった。未変化のＦＳＣプロフィルは、ＬＨＬ−ｏｍｐがＢ細胞増 殖を誘導しないことを示していた（図２１）。このことは増殖アッセイにおいて 確認された（図２２）。 Ｂ細胞をＬＨＬ−ｏｍｐおよび抗ＣＤ４０抗体（０．５μｇ／ｍｌの濃度のｍ Ａｂ ＦＧＫ４５．５）の両者で同時に刺激した。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞の ヘルプの部分的な代替として働いた。ｓｌｇとヘルパーＴ細胞様シグナル伝達と の組み合わせは、好レベルのＢ細胞活性化および増殖を達成した。このことは特 に、ＬＨＬ−ｏｍｐを１２５ｎｇ／ｍｌの濃度で用いたときに示すことができた 。１２５ｎｇ／ｍｌはそれ自体ではＢ細胞活性化を誘導しなかったが、それ自体 では低い効力しか有しない抗ＣＤ４０抗体と組み合わせたときにＢ７−１、Ｂ７ −２およびＦＳＣアップレギュレーションが達成された。ＬＨＬ−ｏｍｐと抗Ｃ Ｄ４０抗体とが協同的に作用することが示唆される（図２１参照）。 実施例３０ 新規な多量体マイトジェンを設計するためのｏｍｐの利用 得られた実験データは、大腸菌の外膜プロテインＡ（ｏｍｐＡ）からのシグナ ルペプチドが組換えタンパク質ＬＨＬ.seqおよびＴＬＨＬの凝集を誘導すること を示している。ｏｍｐＡシグナルペプチド（ｏｍｐ）は、通常、その目的部位で ある細菌のペリプラスム空隙に達すると開裂して除去される。しかしながら、Ｌ ＨＬ、ＬＨＬ.seqおよびＴＬＨＬの場合は、ペリプラスム中への分泌は損な われる。これら３つのタンパク質はすべて細胞質に留まり、ｏｍｐペプチドはそ のＮ末端部分を形成する。Ｎ末端ｏｍｐペプチドは、組換えタンパク質ＬＨＬ− ｏｍｐおよびＴＥＶ−開裂ＴＬＨＬと比較して生物学的活性が強大であることに よって示されるように、多量体形成を導く。 ｏｍｐが多量体形成を誘導するという観察は、ＬＨＬ、ＴＬＨＬおよびＣＡＴ ＡＢと同じ所望の生物学的機能を有する一層簡単な分子の設計を可能にする。こ の目的のため、本発明者らは以下のタンパク質設計を提案する。上記結果は、記 載のタンパク質がペリプラスム空隙に分泌されないことを示している。それゆえ 、Ｎ末端部分にｏｍｐペプチドおよびＣ末端部分にＬまたはＨＬを有するタンパ ク質を産生することが可能であるに違いない。ｏｍｐは多量体の形成を可能とす るので、これにより［ｏｍＰＬ］_n（以下、ｏｍｐＬと称する）または［ｏｍｐ ＨＬ］_n（式中、ｎは２に等しいかそれ以上である）が生成されるに違いない（ 図２３参照）。 実施例３１ ｏｍｐＬの多量体形成およびＦｖ−ｃａｔＡｂの設計 ｏｍｐＬの多量体形成は、ＬＨＬまたはＬＨＬ.seqと同様の仕方で表面免疫グ ロブリンの架橋を可能にするに違いないタンパク質複合体を生成する。ｏｍｐＬ それ自体は、しかしながら、単一のブロッキング残基しか必要としない比較的簡 単な単量体タンパク質である。このブロッキングドメインは以下に記載するｓｃ ｄｓＦｖであり、融合タンパク質ｏｍｐＬ−リンカーＴＥＶ−ｓｃｄｓＦｖ（Ｆ ｖ−ｃａｔＡｂ）となるであろう。この逆の立体配置であるｓｃｄｓＦｖ−ＴＥ Ｖ−リンカー−Ｌｏｍｐ（ｐＦｖ−ｃａｔＡｂ）もまた生成され、これがｐＦｖ −ｃａｔＡｂのペリプラスム分泌を可能にするであろう。後者のｐＦｖ−ｃａｔ Ａｂは、ｏｍｐＬと逆の融合タンパク質でありＣ末端側にｏｍｐペプチドを有す るＬｏｍｐの機能的な多量体形成および生物学的活性を必要とする（図２４参照 ）。すべての記載した組換えタンパク質を上記実験系で試験する。 実施例３２ Ｌドメインブロッキング残基の再設計 ＬＥＮカッパ軽鎖をＬのブロッキングドメインとして使用するに際しては２つ の潜在的な問題がある。第一に、大腸菌での発現の間にタンパク質（すなわち、 ＬＨＬ、ＬＨＬ.seqおよびＴＬＨＬ）がペリプラスム空隙に分泌されないため、 このことがカッパ部分において折り畳みの問題を起こすことが考えられる。第二 に、カッパに対する抗体がＬＨＬ.seqによって結合されるので、記載の系におい て潜在的に正しく折り畳まれたカッパを有するタンパク質を精製する直接的な手 段がない。 正しく折り畳まれた成長因子前駆体の精製を可能とするため、ブロッキング残 基を再設計した。カッパが、内部ジスルフィド架橋（安定化されたジスルフィド 架橋、ｄｓ）により安定化された一本鎖（ｓｃ）抗体により置換されるであろう 。このｓｃｄｓＦｖは、広く記載されている形質細胞腫ＭｃＰｃ６０３から抗ホ スホリルコリン特異性を用いて得られるであろう。ホスホリルコリン−結合能は 、正しく折り畳まれた組換えタンパク質をホスホリルコリンアフィニティーカラ ムにより精製することを容易にするであろう（図２４）。 実施例３３ ＬＨＬ／ＣＡＴＡＢ誘導体のヒトにおける潜在的な使用 ヒトでの触媒抗体の産生を可能とするには、構築物にわずかに改変を加えるこ とが必要である。「Ｈ」Ｔ細胞エピトープを、より多様なＭＨＣクラスII分子と 関連してヒトの大部分においてＴ細胞により認識されるであろう「ユニバーサル Ｔ細胞エピトープ」と交換しなければならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 38/46 Ｎ 39/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 39/395 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/24 19/00 37/54 37/66 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ターリントン，デイビッド・マシュー オーストラリア3130ビクトリア州ブラック バーン、カー・ストリート28番 (72)発明者 トロイトライン，ヘルベルト・ルドルフ オーストラリア3039ビクトリア州ムーニ ー・ポンズ、ジョージ・ストリート11番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｂ細胞表面分子結合部分を含む組換えまたは合成成長因子またはその前駆 体であって、該成長因子または該前駆体の触媒産物がＢ細胞マイトジェネシスを 誘導しうる成長因子またはその前駆体。 ２．Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供しうる部分をさらに含む請求項１に 記載の組換えまたは合成成長因子またはその前駆体。 ３．Ｂ細胞表面分子結合部分がＢ細胞表面免疫グロブリン結合ドメインを含み 、Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分がＴ細胞エピトープである、請 求項２に記載の組換えまたは合成成長因子またはその前駆体。 ４．該成長因子が少なくとも２つのＢ細胞表面結合部分を含み、Ｂ細胞表面結 合分子の架橋を容易にする、請求項２に記載の組換えまたは合成成長因子または その前駆体。 ５．該前駆体の多量体形成を容易にする部分をさらに含む、請求項１から４の いずれか一つに記載の組換えまたは合成成長因子またはその前駆体。 ６．該多量体形成を容易にする部分がシグナルペプチドである、請求項５に記 載の組換えまたは合成成長因子。 ７．該シグナルペプチドがｏｍｐＡ由来のものであるかまたはその機能的等価 物である、請求項６に記載の組換えまたは合成成長因子またはその前駆体。 ８．該Ｂ細胞表面免疫グロブリン結合ドメインがペプトストレプトコッカス・ マグヌスからのプロテインＬまたはその誘導体またはその機能的等価物である、 請求項３に記載の組換えまたは合成成長因子またはその前駆体。 ９．該Ｔ細胞エピトープがニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）またはその誘導体 またはその機能的等価物である、請求項３に記載の組換えまたは合成成長因子ま たはその前駆体。 １０．該Ｂ表面免疫グロブリン結合部分に結合した抗原をさらに含み、該抗原 または該抗原に近接した領域の開裂により該組換えまたは合成成長因子がＢ細胞 マイトジェネシスを誘導する、請求項１から９のいずれか一つに記載の組換えま たは合成成長因子またはその前駆体。 １１．配列番号２に実質的に示されたアミノ酸配列または該配列に対して少な くとも６０％の類似性を有する配列を含む、請求項１０に記載の組換えまたは合 成成長因子またはその前駆体。 １２．配列番号4に実質的に示されたアミノ酸配列または該配列に対して少な くとも６０％の類似性を有する配列を含む、請求項１０に記載の組換えまたは合 成成長因子またはその前駆体。 １３．Ｂ細胞マイトジェネシスを誘導しうる組成物であって、 （i）Ｂ細胞表面免疫グロブリン結合部分を含む組換えまたは合成分子； （ii）Ｂ細胞表面免疫グロブリン結合部分を含む多量体の形態の組換えまたは合 成分子； （iii）Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分を含む（i）または（ii） の組換えまたは合成分子；および （iv）使用前に混合するかまたは順番にまたは同時に使用する別々の組成物であ って、Ｂ細胞表面分子結合部分を有する成分を第一の組成物中に含み、およびＢ 細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供しうる分子を第二の組成物中に含む組成物よ り選ばれる成分を含む、組成物。 １４．Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分がＴ細胞エピトープまた は抗ＣＤ４０抗体またはその機能的等価物である、請求項１１に記載の組成物。 １５．構造： ＭＸ₁［Ｘ₂］_b （式中、Ｘ₁はＢ細胞表面免疫グロブリン結合残基などのＢ細胞表面分子結合残 基； Ｘ₂はＢ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分； Ｍは該組換えまたは合成分子の多量体形成を可能または容易にする部分； ｂはＸ₂分子の数を示し、０、１または＞１であってよい） を有する組換えまたは合成分子。 １６．構造： ［Ｍ］_cＡＸ₁［Ｘ₂］_d［Ｘ₃］_eＡ［Ｍ］_f （式中、Ａは触媒抗体を得ようとする標的抗原； Ｘ₁およびＸ₃は同じかまたは異なり、それぞれＢ細胞表面分子結合残基； Ｘ₂は触媒抗体にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分； Ｍは該組換えまたは合成分子の多量体形成を可能または容易にする部分； ｃおよびｆは同じかまたは異なり、それぞれ０、１または＞１である； ｅは０または１、ただし、ｃおよびｆの両者が０である場合はｅは０ではない； ｄは０または＞１である） を有し、該Ｂ細胞上の触媒抗体は該組換えまたは合成分子からＡのすべてまたは 一部を開裂することができ、得られた触媒産物がＢ細胞マイトジェネシスを誘導 しうる、組換えまたは合成分子。 １７．構造： Ｉ’ＡＸ₁Ｘ₂Ｘ₃ＡＩ” （式中、Ａは触媒抗体を得ようとする標的抗原； Ｘ₁およびＸ₃は同じかまたは異なり、それぞれＢ細胞表面分子結合残基； Ｉ'およびＩ”は任意に存在し、同じかまたは異なり、それぞれＸ₁およびＸ₃の ブロッキング試薬； Ｘ₂はＢ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供する部分である） を含み、該Ｂ細胞上の触媒抗体は該組換えまたは合成分子からＡのすべてまたは 一部を開裂して分子：［Ａ'］Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃［Ａ'］ （式中、Ａ'は任意に存在し、触媒抗体による開裂後のＡの一部である） を生成することができ、該得られた分子はＸ₁およびＸ₃が結合するＢ細胞のＴ細 胞依存性Ｂ細胞マイトジェネシスを誘導しうる、組換えまたは合成成長因子また はその前駆体。 １８．請求項１に記載の組換え成長因子をコードするヌクレオチドの配列を含 む、単離核酸分子。 １９．請求項１３に記載の組換え成長因子をコードするヌクレオチドの配列を 含む、単離核酸分子。 ２０．請求項１５に記載の組換え成長因子をコードするヌクレオチドの配列を 含む、単離核酸分子。 ２１．請求項１６に記載の組換え成長因子をコードするヌクレオチドの配列を 含む、単離核酸分子。 ２２．請求項１７に記載の組換え成長因子をコードするヌクレオチドの配列を 含む、単離核酸分子。 ２３．配列番号：１または配列番号：３または配列番号：７に示すヌクレオチ ドの配列またはこれら配列に対して少なくとも６０％の類似性を有する配列また はこれら配列に低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうる配列を含む 単離核酸分子。 ２４．特定の抗原に対する触媒抗体の製造方法であって、Ｂ細胞に結合した触 媒抗体と相互反応することができる抗原であってＢ細胞表面分子結合部分に融合 した抗原を含む成長因子の有効量を、該抗原が開裂され、該分子の残りの部分が Ｂ細胞マイトジェネシスを誘導しうる時間および条件下で動物に投与することを 含む方法。 ２５．該成長因子がＢ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供しうる部分を含む、 請求項２４に記載の方法。 ２６．Ｂ細胞にＴ細胞依存性のヘルプを提供しうる分子を順番にまたは同時に 投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。 ２７．請求項１から１７のいずれか一つに記載の組換えまたは合成成長因子ま たはその前駆体および１またはそれ以上の薬理学的担体および／または希釈剤を 含む医薬組成物。 ２８．請求項１から１７のいずれか一つに記載の組換えまたは合成成長因子ま たはその前駆体に対して生成した触媒抗体を含む医薬組成物。 ２９．構造： ［Ｉ'ＡＸ₁［Ｘ₂'］_o［Ｘ₂Ｘ₃ＡＩ"］_n］_m （式中、Ｉ'およびＩ"は同じかまたは異なり、それぞれカッパまたはラムダ軽鎖 またはｓｃ−ｄｓ−Ｆｖ分子などのＸ₁およびＸ₃のブロッキング試薬； Ａは触媒抗体を得ようとする標的抗原； Ｘ₁およびＸ₃はＢ細胞表面分子結合残基； Ｘ₂およびＸ₂'は同じかまたは異なり、それぞれＢ細胞にＴ細胞依存性のヘルプ を提供する部分； ｏは０または１； ｎは括弧内の成分の多量体特性を示し、０、１または＞１； ｍは括弧内の成分の多量体特性を示し、０、１または＞１である） を含む組換えまたは合成成長因子またはその前駆体。 ３０．構造： ［［Ｉ'ＡＸ₂Ｘ₃］_n［Ｘ₂'］_o［Ｘ₁ＡＩ"］_m （式中、Ｉ'およびＩ"は同じかまたは異なり、それぞれカッパまたはラムダ軽鎖 またはｓｃ−ｄｓ−Ｆｖ分子などのＸ₁およびＸ₃のブロッキング試薬； Ａは触媒抗体を得ようとする標的抗原； Ｘ₁およびＸ₃はＢ細胞表面分子結合残基； Ｘ₂およびＸ₂'は同じかまたは異なり、それぞれＢ細胞にＴ細胞依存性のヘルプ を提供する部分； ｏは０または１； ｎは括弧内の成分の多量体特性を示し、０、１または＞１； ｍは括弧内の成分の多量体特性を示し、０、１または＞１である） を含む組換えまたは合成成長因子またはその前駆体。 ３１．Ｂ細胞マイトジェネシスを誘導して特定の抗原に対する触媒抗体を生成 するための成長因子前駆体の触媒産物の使用。 ３２．Ｂ細胞表面分子結合部分に結合、融合または他の仕方で会合した、それ に対する触媒抗体を得ようとする抗原を含む成長因子前駆体の、該抗原のすべて または一部の触媒開裂後にＢ細胞マイトジェネシスを誘導するうえでの使用。 ３３．Ｂ細胞表面分子結合部分に結合、融合または他の仕方で会合した抗原の 、該抗原のすべてまたは一部の触媒開裂後にＢ細胞マイトジェネシスを誘導する ための成長因子前駆体を製造するうえでの使用。 ３４．請求項１から１７のいずれか一つに記載の成長因子またはその前駆体を 用いて生成した触媒抗体。