JP2000507221A

JP2000507221A - 細胞間接着分子粉末組成物

Info

Publication number: JP2000507221A
Application number: JP9531863A
Authority: JP
Inventors: ユージーンジェイマックナリー
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムファーマシューティカルズインコーポレイテッド
Priority date: 1996-03-06
Filing date: 1997-03-04
Publication date: 2000-06-13
Also published as: WO1997032596A1; DK0885010T3; EP0885010A1; ATE242001T1; DE69722594T2; EP0885010B1; US6365343B1; DE69722594D1; CA2244894A1

Abstract

(57)【要約】本件出願は、吸入剤として投与されるのに特に適合している、乾燥微細粉末化医薬組成物であって、(a)治療上有効な量のsICAM-1；(b)sICAM-1を鼻腔内膜上に保持するのに有効な量のカルボキシメチルセルロース；及び(c)sICAM-1の保持が鼻の通路に有意な影響を及ぼすことのないバルク効果を提供するのに有効な量のバルク剤を含有することを特徴とする前記乾燥粉末化医薬組成物を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞間接着分子粉末組成物技術分野本発明は、細胞間接着分子の細胞外部分(sICAM-1)の投与方法を提供する、鼻の吸入用新規組成物を提供する。発明の背景 sICAM-1分子及びその抗ウイルス性効果は、欧州特許公開391088号公報及び199 5年６月７日に出願した米国特許出願第08/479,557号に開示されている。両文献とも本件明細書に含まれるものとする。ICAM-1は、本件明細書に含まれる米国特許第5,284,931号明細書に開示されている。この薬剤は、ライノウイルス結合の競合的拮抗剤として活性である。sICAM-1の鼻腔内投与は、出願第07/514,033号に記載されているが、鼻の投与のための吸入剤としてsICAM-1を配合する概念は開示されていない。カルボキシメチルセルロースを含むsICAM-1の放出制御医薬組成物の製造に使用する種々の希釈剤が記載されているが、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩の濃度の使用又は長期間作用する鼻の吸入剤を配合する概念の使用は全く開示されていない。鼻の通路に置かれたほとんどの薬剤の標準的な鼻の保持時間は15〜20分である。鼻膜を通って全身には吸収されないあらゆる薬剤の残分は、患者により鼻咽腔の後方に対して明瞭であり、患者により飲み込まれる。sICAM-1の分子量は比較的大きいため（82,000ダルトン）、鼻の通路から実質的な量の薬剤が全身に吸収されるのを防ぐ。吸入剤(insufflates)は、一般的に、吸入器又は粉末送風機により体腔に直接導入されて、局所的又は全身的効果が得られる、微細粉末として認識されている。吸入剤はまた、計量エアゾールバルブを使用することにより投与される投与量の正確な量をコントロールする加圧エアゾールから投与することができる。鼻咽腔で局所的な効果を有するように予定されている薬剤を吸入により投与するために、医薬的に許容でき、かつ該薬剤の分散を妨害せず、薬剤が粘液膜に付着するのを妨害せず、薬剤の有効期間に悪影響を及ぼさず、かつ、室温条件下で保存中に組成物中に巨大粒子の形成を引き起こし得るほど過剰には吸湿性ではない固体希釈剤中に薬剤を配合することが必要である。これらの理由から、鼻の通路においてタンパク質の保持を増強する安定なsICAM-1治療組成物を提供することが望まれている。発明の開示本件出願人は、sICAM-1用の固体希釈剤としてカルボキシメチルセルロースナトリウムを含有する担体系の使用に基づくsICAM-1の吸入投与用新規組成物を見いだした。従って、本発明の第一の目的は、吸入により投与するのに適当なsICAM-1の乾燥組成物を提供することである。本発明の別の目的は、薬剤の分散を妨害しないsICAM-1の乾燥組成物を提供することである。本発明の別の目的は、薬剤が粘液膜に付着するのを促進するsICAM-1の乾燥組成物を提供することである。本発明の別の目的は、薬剤の有効期間に悪影響を及ぼさないsICAM-1の乾燥組成物を提供することである。本発明の別の目的は、室温条件下で保存中に組成物中に凝集物の形成を引き起し得るほど過剰には吸湿性でないsICAM-1の乾燥組成物を提供することである。本発明の別の目的は、硬質ゼラチンカプセルと相溶性のsICAM-1の乾燥組成物を提供することである。本発明のこれら及び他の目的は、添付の明細書を参照することにより明らかとなろう。発明の実施態様本発明は、吸入剤として投与されるのに適合した、乾燥微細粉末化医薬組成物であって、 (ａ)治療上有効な量のsICAM-1； (ｂ)sICAM-1を鼻腔内膜上に保持するのに有効な量のカルボキシメチルセルロース；及び (ｃ)凍結乾燥中のカルボキシメチルセルロース及びsICAM-1の崩壊を防止するのに効果的な医薬的に優れた生成物を製造するための量のバルク剤を含有することを特徴とする前記乾燥粉末化医薬組成物を提供する。組成物は、吸入剤を１回吸入して導入することによる鼻腔通路へのsICAM-1の送達量が0.1〜1.0mg、好ましくは0.05〜0.75mgであるように調製される。 sICAM-1は、遺伝学的に処理された形態のsICAM-1レセプターの細胞外部分であり、ホスト細胞に結合するライノウイルス用競合的拮抗剤として作用する。この物質はまた、BIRR 4としても知られている、天然に発生するトランスメンブラン糖タンパク質sICAM-1から遺伝的に操作することにより誘導される可溶性糖タンパク質である一本鎖組換え体である。BIRR 4は、細胞間接着分子(ICAM-1)の細胞外ドメインを含有するアミノ酸を含有する切頭型(truncated)の分子である。ＤＮＡ配列分析に基づけば、BIRR４は鎖間(intrachain)ジスルフィド結合により安定化されている５つの免疫ブロブリン様ドメインを含有すると予想される。風邪の予防及び／又は初期の治療にsICAM-1を使用する前提は、sICAM-1化合物が、ライノウイルスが鼻の粘液膜に攻撃されるのを防ぐであろうとの事実に基づく。鼻の膜をライノウイルスから保護するために、鼻の粘液膜とsICAM-1とを実質的に完全に接触させて、あらゆるライノウイルス粒子が鼻の通路に存在し得、かつあらゆる感染の臨床的な進行を妨げるか又は弱毒化することができる粘液膜表面にsICAM-1分子が分布するようにするのが望ましい。本発明の生成物による治療のための目的のホストは、ライノウイルス感染の徴候を緩和するために治療することのできるか又はライノウイルス感染の予防のためのヒト等の霊長類を含む。本件出願人は、sICAM-1の担体としてカルボキシメチルセルロースナトリウムを使用することにより、sICAM-1の水溶液に基づく組成物又はヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースの使用に基づくsICAM-1の吸入剤である組成物と比較して、鼻の通路におけるsICAM-1の作用を延長する吸入剤を提供することを見いだした。また、本件出願人は、ソルビトール、マンニトール又はガラクチトール等の糖アルコール、又はグリシン等のアミノ酸、又はデキストラン又はシクロデキストリンであり得る炭水化物ベースポリマー等のポリマーであり得るバルク剤を、カルボキシメチルセルロースナトリウムと混合したsICA M-1に添加することにより、鼻の通路においてsICAM-の保持に有意な影響を与えることのないバルク剤を提供することを見いだした。本発明において使用した特定のカルボキシメチルセルロースナトリウムは、最低純度99.5％の医薬等級である。一般的に、好ましいカルボキシメチルセルロースナトリウムの温度25℃、濃度１重量％において測定したときの水中での粘度は 150〜250cpsである。所望により、異なる分子量を有するカルボキシメチルセルロースを一緒に混合して、所望の粘度を有する製品を得ることができる。本発明の組成物はまた、緩衝化ｐＨ約6.0を提供する無機塩を含む。一般的に、塩化ナトリウム又は塩化カリウム等のアルカリ金属の塩化物を、一塩基性リン酸ナトリウムと混合し、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物でｐＨを調整する。本発明の吸入剤は、成分を水に溶解させ、凍結乾燥により水を除去し、凍結乾燥した製品を適当な大きさの篩にかけ、微細に分割した、適当な吸入器を使用する投与に適しているフリーの流動粉末を提供することにより製造されるのが好ましい。粉末成分を混合して凍結乾燥可能な組成物を製造する方法は、粉末が次の処置により混合されない場合、sICAM-1の生物学的活性が悪影響を及ぼし得るために重要である。ポリスルホン透析濾過(diafiltration)膜を使用してリン酸緩衝溶液中にsICAM-1を製造する溶液からsICAM-1を透析することにより、sICAM-1のリン酸緩衝溶液を製造するのが好ましい。カルボキシメチルセルロースナトリウム及びバルク剤の溶液は、混合した成分を45〜55℃、好ましくは約50℃において水に分散させる前に、粉末化した成分を乾燥混合することにより別々に調製される。バルク剤及びカルボキシメチルセルロースナトリウムの乾燥混合により、カルボキシメチルセルロースナトリウムの湿潤が容易になり、水に分散させたときのポリマーの凝集が最小になる。粉末を水と混合した後、Waring blender等の高剪断混合装置を２〜10分間使用して粉末を水に分散させるのが好ましい。次に、分散させた混合物を適当なフィルター、例えば５〜50ミクロンフィルターを通して濾過し、室温まで冷却する。ポリマーを室温まで冷却した後、等量のポリマー溶液とsICAM-1溶液とを混合して、凍結乾燥バイアルに入れる。バイアルを凍結乾燥機に入れて凍結乾燥する。一般的に、凍結乾燥用に製造する組成物は以下の成分を含有する：濃度（重量％） sICAM-1 0.1〜1％バルク剤２〜10％カルボキシメチルセルロースナトリウム１〜３％アルカリ金属塩化物 0.1〜0.6％一塩基性リン酸ナトリウム 0.1〜0.6％水酸化ナトリウムｐＨ6.0の水溶液を調製するのに十分な量水水溶液を調製するのに十分な量＊＊凍結乾燥により除去される乾燥粉末化医薬組成物は以下の成分を含有する： sICAM-1 0.07〜7重量％バルク剤 70〜90重量％カルボキシメチルセルロースナトリウム 14〜45重量％好ましい乾燥粉末化医薬組成物は以下の成分を含有する： sICAM-1 １〜５重量％バルク剤 80〜90重量％カルボキシメチルセルロースナトリウム 14〜21重量％一般的に、１回の治療投与量の粉末を、使用直前に開封することができる２個の硬質ゼラチンカプセルに充填するのが好ましい。各カプセルは、sICAM-1を0.0 1〜1.0mg含有する組成物を５〜20mg含有することができる。粉末を吸入器に直接いれるか、又は、カプセルを開封してカプセルの粉末内容物を空気と混合し、患者の鼻に直接吹き込むことができる形態で放出するのに適合している無処置のカプセルに入れることができる。このタイプの吸入器を使用するために、ゼラチンカプセルは、吸入器と相互作用して粉末の適当な分散を提供する半球体末端を有するべきである。本発明を行うのに有用な装置の例は、本件明細書に含まれる米国特許第4,889,114号明細書に記載されている。この装置は、Devilbiss nasal tip,モデル40-TR等の鼻用のチップに備えることができる。以下の実施例は、本発明の好ましい態様を説明するためのものであり、本発明の記載を制限するものではない。実施例 ICAM-1の調製は、米国特許第5,284,931号明細書に記載されている。細胞質ドメインを欠くICAM-1の切頭型可溶性誘導体を製造するために、インフレームストップコドン(Dcyt〜D5の間)を、Kunkel，Proc．Natl．Acad．Sci USA 82：488-49 2(1985)の方法に基づき、Peterson et al．Cell 53:65-72(1988)により変更されているようにして、オリゴヌクレオチド変異原性を使用して生成される。両文献とも本件明細書に含まれるものとする。オリゴヌクレオチド変異原性により、発現の際、切頭、分泌型ICAM-1（sICAM-1）を形成する、Y 452 E／F TAGと称される変異体ICAM-1遺伝子を形成する。ハムスターDHFR遺伝子及びプロモーターによりコントロールされる上記変異体 ICAM-1のコード領域、SV40初期領域由来のスプライスシグナル及びポリアデニル化シグナルからなる発現べクターを作成した。ハムスターDHFR遺伝子を、BamHI/ HindIIIにより切断したpSV2gpt（Mitchell et al.，Mol．Cell．Biol．６:425-4 490(1986)）に平滑末端連結した後、FspI及びHindIIIを使用する消化によりプラスミドpBR322DHFRについて単離した(Mulligan，R．et al.，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 78:2072-20766(1981))。変異体sICAM-1(可溶性ICAM-1)cDNAは、NotIを使用する消化により単離した。次に、末端をKlenowを使用して充填し、分子をHi ndIIIで消化した。さらに、分子をpBR322DHFR発現べクターと結合させた（発現ベクターはApaIで消化し、末端をKlenowで充填し、HindIIIで消化してgpt遺伝子を除去することにより製造した）。こうして、sICAM-1遺伝子をSV40発現遺伝子中のハムスター遺伝子に物理的に結合させた。次に、完全なべクターを、リン酸カルシウム共沈殿法(Graham et al．Virolog y，52:456-467(1973)を使用して、チャイニーズハムスター巣(CHO)K1 DUX-B11細胞にトランスフェクトした。非選択培地において２日間成長させた後、該細胞を、0.05〜2μＭのメトトレキサートを含有するが、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く選択培地において継代した。クローンを単離し、サブクローン化し、Elis aによりsICAM-1産生を試験した。最大量のsICAM-1を分泌するコロニーをさらに２ラウンドの遺伝子増幅に供し、安定な細胞系、消化したCH0118Aを誘導した。s ICAM-1の源として好ましいこの細胞系は、約１μｇ／ｍＬまで培養上清にsICAM- 1を分泌した。抗ICAM-1モノクローナル抗体R6.5を使用する免疫アフィニティクロマトグラフィーによりCH0118A細胞の上清からsICAM-1を精製した。この目的のため、製造業者の指示に従って、充填した樹脂1ml当たり最終濃度５mgまで、R6.5をCNBr-活性化セファロース4B(ファルマシアLkB)に共有結合させた。全てのクロマトグラフ工程は４℃で行い、全ての緩衝液は0.2U/mlアプロチニン及び1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライドを含有した。約１mgのsICAM-1を含有する濾過した上清１リットルを、流量１ml／分でR6.5セファロースカラムに充填した。次に、カラムを、流量2.5ml／分で200mMの10mMトリス/0.15M NaClで洗浄し、結合していない物質を除去した。結合しているsICAM-1を、流量１ml／分で50mMトリエチルアミン/0.15M NaCl/pH11.0により溶出した。画分を捕集し、１Ｍトリス、pH6.0 を添加することにより最終濃度20mMまで直ぐに中和した。溶出したsICAM-1を含有する画分を、10〜15％ポリアクリルアミド勾配ゲル上でSDS-PAGE、続いて銀染色により同定した。ファルマシアファストゲルシステム（Pharmacia Phastgel system）及び銀染色キットを使用して、製造業者の指示に従って電気泳動及び染色を行った。sICAM-1を含有する画分を貯蔵し、Centric on-30ミクロコンセントレータ(Amicon，Danvers，MA)を使用して約10倍濃縮した。精製したsICAM-1の１処理単位のタンパク質含有量を、バイオ−ラドタンパク質アッセイを使用して、製造業者の指示(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA) に従って測定し、この物質を参照標準として使用するために一定分量凍結した。続いて、非重なりエピトープに結合する、サンプル中のsICAM-1の濃度を、これらの参照標準及び２つの抗ICAM-1モノクローナル抗体R6.5及びR6.1（Rothlei n et al.，Ｊ．Immunol．141;1665-1669(1998))を使用する“サンドイッチ”タイプのELISAで測定した。R6.1は、10μＬの10μｇ／ｍＬ溶液を37℃で１時間インキュベートすることにより、96ウェルプレート上のプラスチックに結合している。次に、以下の各工程を、37℃で20分間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した試薬100μＬを使用して行った:(1)参照標準sICAM-1又は未知物質の段階希釈液の結合；(2)ビオチニル化R6.5(1μｇ／ｍＬ）の結合；及び(3)製造業者の推奨濃度における西洋わさびパーオキシダーゼ複合ストレプトアビジン(Z ymed Laboratories，South San Francisco，CA)の結合。基質ABTS（Zymed）を添加し、室温で20分間インキュベーシヨン後、分光光度計で410nmにおける吸収を測定した。参照標準曲線と比較することにより濃度を決定した。ポリスルホン膜を使用してリン酸緩衝液に対してsICAM-1を透析し、溶液１ml 当たりsICAM-1 10mg;リン酸ナトリウム3.4mg及び塩化ナトリウム3.6mgの濃度のs ICAM-1の溶液を提供した。カルボキシメチルセルロース(CMC)(20g)及びマンニトール(100g)を一緒に乾燥混合した。予め50℃に加熱した水(750ml)を、低速度に設定したWaring Blender 中で攪拌し、CMCとマンニトールの乾燥混合物を、Waring Blenderの渦の周囲に添加した。粘度が増加するにつれて、粉末混合物を添加し続けながら、混合機の速度を大きくした。混合物は、約２分にわたって添加するべきである。粉末の添加が完了したとき、50℃の水を添加することにより溶液の体積を１リットルにし、５分間混合し続けた。温かい混合物を10ミクロンのフィルターを通して濾過し、室温まで冷却した。いったんポリマー溶液を室温まで冷却し、等量のカルボキシメチルセルロースナトリウム／マンニトール溶液をsICAM-1溶液と混合し、溶液１ｇを５ml凍結乾燥バイアルに入れた。バイアルを凍結乾燥機に入れ、以下のスケジュールに従って凍結乾燥した：工程１：生成物を凍結乾燥機の棚に置き、冷却器を−50℃に設定した；工程２：冷却器が−50℃に到達したとき、減圧を開始し、100ミリトールに保った；工程３：生成物の温度が−50℃に到達したとき、0.5℃／分の速度で棚の温度を −28℃に上昇させた；工程４：−28℃で15分間維持した；工程５：0.5℃／分の速度で温度を25℃に上昇させた；工程６：25℃で3.5時間維持した；工程７：0.5℃／分の速度で温度を４℃に低下させた；工程８：バイアルが減圧下で栓がされるまで４℃で維持した；及び工程９：生成物を凍結乾燥機から除いた。続いて、工程９からの生成物を米国標準篩（＃18及び＃35）を通し、微細なむらのない粉末を得た。その後、生成物15mgをNo.3の２個の硬質ゼラチンカプセルに入れた。若い農場のブタを使用する動物モデルで生成物の効率を明らかにした。生成物の鼻腔内保持を目に見えるようにするために、sICAM-1を、商業的に入手できるヨウ素化キット(Iodobeads，Pierce)を使用して¹²³Iにより放射性ラベルし、下記のCMC組成物及びコントロール組成物に含ませた。以下の処方を有するリン酸緩衝生理食塩水を使用するコントロール組成物：50mM一塩基性リン酸塩、104mM 塩化ナトリウム、pH6；１％ｗ／ｖ HPC、５％ｗ／ｖマンニトールの処方を有する組成物をベースとするヒドロキシプロピルセルロース(HPC)粉末；及び１％ｗ／ｖ HEC、５％ｗ／ｖマンニトールの処方を有する組成物をベースとするヒドロキシエチルセルロース(HEC)粉末を、CMC組成物について上述したのと類似の方法で製造した。粉末CMC及びコントロール組成物について、凍結乾燥した材料を、金属スパチュラを使用して微細粉末の大きさまで粒子を小さくし、30〜50mgの粉末を１mlの使い捨てプラスチックピペットチップに充填した。手持ち式のピペットバルブに取り付けたピペットチップを、各鼻孔に１〜1.5cm挿入し、バルブをしぼって十分な圧力をかけ、粉末を動物の鼻に運んだ。リン酸緩衝生理食塩水組成物を、0.1ml量、同様の方法で投与した。明らかにするためのこれらの研究は、¹²³I sICAM-1トレーサーを約20〜50マイクロキューリー使用した。投与後、動物を外部ガンマシンチグラフィーカメラの前に置き、90分間にわたってデータを集めた。崩壊するため生のカウントデータを集め、最初に導入した¹²³I sICAM-1 の投与量に対して標準化した％保持に変換した。結果は以下の通りである：組成物投与して90分後に保持されていた投与量％水剤組成物 30％カルボキシメチルセルロースナトリウム 80％ヒドロキシプロピルセルロース 50％ヒドロキシエチルセルロース 60％これらの試験により、鼻膜上での保持時間は、本発明の組成物については、驚くべきことであり、予想し得ないものであることが分かった。特定の態様により本発明を記載してきたが、これらの態様は変更可能であり、かつ、この出願が、一般的に以下の本発明の趣旨に従う本発明のあらゆる変形、使用又は適応をカバーし、本発明の開示からそのように発展することは、公知の範囲内であるか又は本発明の属する技術分野の範囲内での慣習的な実施を含み、添付の請求の範囲に記載した上述の本質的な構成に適用できることが理解されるであろう。

Claims

【特許請求の範囲】 1. 吸入剤として投与されるのに適合した、乾燥微細粉末化医薬組成物であって、 (a)治療上有効な量のsICAM-1； (b)sICAM-1を鼻腔内膜上に保持するのに有効な量のカルボキシメチルセルロース；及び (c)sICAM-1の保持が鼻の通路に有意な影響を及ぼすことのないバルク効果を提供するのに有効な量のバルク剤を含有することを特徴とする前記乾燥粉末化医薬組成物。 2. 前記バルク剤が、アミノ酸、糖アルコール及び炭水化物ベースポリマーからなる群から選ばれる請求項１記載の乾燥微細粉末化医薬組成物。 3. 前記バルク剤が糖アルコールである請求項２記載の乾燥微細粉末化医薬組成物。 4. 前記バルク剤が、ソルビトール、マンニトール及びガラクチトールから選ばれる請求項３記載の乾燥微細粉末化医薬組成物。 5. 組成物がまたリン酸緩衝剤を含む請求項４記載の乾燥微細粉末化医薬組成物。 6. 前記バルク剤がマンニトールである請求項５記載の乾燥微細粉末化医薬組成物。 7. sICAM-1を0.07〜7重量％、バルク剤を70〜90重量％及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを14〜45重量％含有する請求項１記載の乾燥微細粉末化医薬組成物。 8. 吸入剤として投与されるのに適合した、乾燥微細粉末化医薬組成物であって、 (a)治療上有効な量のsICAM-1； (b)sICAM-1を鼻腔内膜上に保持するのに有効な量のカルボキシメチルセルロース；及び (c)sICAM-1の保持が鼻の通路に有意な影響を及ぼすことのないバルク効果を提供するのに有効な量のバルク剤を含有することを特徴とする前記乾燥粉末化医薬組成物をホストの鼻腔内に投与することを含むライノウイルス感染症の治療又は予防方法。 9. 前記バルク剤がアミノ酸、糖アルコール及び炭水化物ベースポリマーからなる群から選ばれる、請求項８記載の乾燥微細粉末化医薬組成物をホストの鼻腔内に投与することを含むライノウイルス感染症の治療又は予防方法。 10．請求項４記載の乾燥微細粉末化医薬組成物をホストの鼻腔内に投与することを含むライノウイルス感染症の治療又は予防方法。 11．請求項５記載の乾燥微細粉末化医薬組成物をホストの鼻腔内に投与することを含むライノウイルス感染症の治療又は予防方法。 12．請求項６記載の乾燥微細粉末化医薬組成物をホストの鼻腔内に投与することを含むライノウイルス感染症の治療又は予防方法。 13．請求項７記載の乾燥微細粉末化医薬組成物をホストの鼻腔内に投与することを含むライノウイルス感染症の治療又は予防方法。