JP2000508170A - Ｓｃｆ類似体組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、幹細胞因子（ＳＣＦ）類似体ポリペプチド組成物ならびに本発明のＳＣＦ類似体の組換えＤＮＡ製造のためのベクター、宿主細胞および方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＳＣＦ類似体組成物および方法 発明の分野 本発明は、幹細胞因子（「ＳＣＦ」）類似体ポリペプチド組成物、ならびに該 ＳＣＦ類似体の組換えＤＮＡ製造のためのベクター、宿主細胞および方法に関す る。また、さらに他の側面では、薬剤組成物および使用方法を提供する。背景 幹細胞因子（「ＳＣＦ」、ＰＣＴ公開No．WO91/05795を参照；kit−リガンド （ＰＣＴ公開No．WO92/03459)、マスト細胞増殖因子（ＰＣＴ公開No．WO92/0037 6)およびSteel因子（「ＳＦ」または「ＳＬＦ」）(White，Cell 63:5-0(1990)と も言う。）は、造血前駆細胞に対して作用する造血因子である。ＳＣＦをコード する遺伝子は、クローン化され、発現されている（例えば、Hartinら、Cell 63: 203-211（1990）およびＰＣＴ公開No．WO91/05795（その全体を参照することに よって本明細書に組み入れる。））。 ＳＣＦ活性の一つの特徴は、骨髄および末梢血液での始原前 駆細胞の拡張である。臨床的には、ＳＣＦは、骨髄抑制によりかなりの罹患率お よび死亡率に至る多数の疾患の準備において有用であると考えられる。これらの 準備としては、骨髄外科化学療法後の移植で使用するための前駆細胞の可動化、 自己骨髄移植のための骨髄採取前の下準備および基準用量による化学療法または 骨髄外科化学療法／全身照射後の造血再構成の促進、におけるＳＣＦの使用が挙 げられる。 ＳＣＦは、膜結合型および可溶型などの多くの活性型を有する。ＰＣＴ公開No ．91/05795を参照。Ｃ−末端欠失類似体も活性を有する。例えば、ＳＣＦ１−１ ３７（「１」は成熟タンパク質の最初のアミノ酸を意味する。）は、生物学的活 性を示し、ＳＣＦ１−１４１は、完全な生物学的活性を多少示す（Langleyら、A rch．Bioche．Biophys．311:55-61(1994)）。ＳＣＦ１−１６５は、天然の配列 にあるアスパラギンの代わりに１０位にアスパラギン酸を有するが（Ｎ１０Ｄと 言う。）、これも研究されており、二量体生成速度にあまり影響がないことが分 かった(Luら、Biochem．J．305:563-368(1995))。ある種の共有的に結合したＳ ＣＦ二量体がＰＣＴ公開WO95/26199で報告されている。安定性は、分子間共有結 合に よって増加することが報告されている。 本明細書で提供するような、生物学的活性および安定性の増加したＳＣＦ類似 体は、より低い用量の使用で同じ生物学的結果を達成することができるので、消 費者にとって望ましい。そのような類似体は、より活性の大きい物質により、製 造バッチ当たりの販売される製品単位が多くなるので、製造者にとっても望まし い。安定性の増加、特に在庫有効期間の増加は、消費者にとっても製造者にとっ ても特に有用である。すなわち、本発明は、これらの利点を提供し、消費者およ び製造者の要求を満足するものである。発明の概要 本発明は、１０位および１１位（図１の番号に従う。メチオニンは、−１位で ある。）にアスパラギンの代わりにアスパラギン酸を含むＳＣＦ類似体に関する 。驚いたことに、そして重要なことに、これらの置換の結果、非修飾ＳＣＦと比 較して、生物学的活性がかなり高く、安定性も増大したＳＣＦ類似体が得られる ことが見いだされた。 本発明の類似体は、一部には、野生型ＳＣＦがある種の組成物緩衝液中でかな り不安定であることが見いだされたin vitroエージング研究中に行われた観察から得られた。該野生型ＳＣＦは、在庫 有効期間がより短いことが予想される。このたび、野生型ＳＣＦの主な不安定性 は、配列の１０位（図１の成熟タンパク質に関して）にあるアスパラギン（ASN 、「Ｎ」）残基での脱アミド化反応によって引き起こされることが見いだされた 。脱アミド化は、α／βペプチド結合のシフトによる脱アミド化したアスパラギ ン残基の異性化によっても生じる。異性化したＳＣＦ種は、生物学的に活性でな い。また、分子構造の敏感な変化により抗原性になる危険もある。下記に示すよ うに、本明細書に示す類似体は、野生型ＳＣＦよりも安定性が高く、生物学的活 性が増大し、脱アミド化に関連する危険性もない。 本発明の他の側面は、本発明のＳＣＦ類似体をコードする核酸、本発明のＳＣ Ｆ類似体の組換えＤＮＡ製造のためのベクター、宿主細胞および方法を含む。ま た、さらに他の側面では、薬剤組成物および使用法が提供される。図面の簡単な説明 図１は、ヒト組換えＳＣＦの膜結合型のアミノ酸１−２４８に対するアミノ酸 配列を示す図である。 図２は、加速安定性アッセイ（下記を参照）における完全なタンパク質／類似 体の相対量を示すグラフである。サンプルを１〜５日間３７℃で維持した後、分 解産物の分析を行った。試験したサンプルは次の通りである：（ａ）「ｒｈＳＣ Ｆ、野生型」、組換えヒトｍｅｔ−１ＳＣＦ１−１６５、（ｂ）「Ｎ１０Ｄ、Ｎ １１Ｄ変異体」、１０位および１１位にアスパラギン酸残基を有する組換えヒト ｍｅｔ−１ＳＣＦ１−１６５、（ｃ）「Ｎ１０Ｄ変異体」、すなわち、（ｂ）と 同じであるが、１０位のみにアスパラギン酸がある、および（ｄ）「Ｎ１０Ｅ変 異体」、Ｎ１０Ｄと同じであるが、１０位にグルタミン酸がある。発明の詳細な説明 本発明は、非修飾ＳＣＦよりも高い生物学的活性を示す特定のＳＣＦ類似体に 関する。上記で示したように、１０位および１１位（図１に従う）におけるアス パラギンの一方または両方の置換は、非修飾ＳＣＦよりもかなり高い生物学的活 性を示す分子を生じることが分かった。本発明の類似体は、本明細書では、Ｎ１ ０Ｄ（１０位のアスパラギンがアスパラギン酸で置換されている）およびＮ１０ Ｄ、Ｎ１１Ｄ（１１位にさらに置換を有するＳＣＦ類似体）と言う。好ましくは 、Ｎ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄ である。両方の位置での変異により、Ｎ１０Ｄのみの変異よりもさらに生物学的 活性（巨核球細胞増殖アッセイにおいて）が得られるからである。 便宜上、「Ｎ１０Ｄ」および「Ｎ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄ」は、全長１−２４８のＳ ＣＦタンパク質（図１）の類似体または下記に述べる他のいくつかの型の類似体 であろうとなかろうと、総称的に本発明のＳＣＦ類似体を意味する。特定の類似 体を本明細書で検討する場合は、その特定の未変換アミノ酸配列を参照する。例 えば、下記に示すのは、ＳＣＦ類似体Ｎ１０ＤＳＣＦｍｅｔ１−１６５である（ 図１の１６５個のアミノ酸を有するＳＣＦの類似体であり、Ｎ−末端はメチオニ ン残基であり、１０位のアスパラギンはアスパラギン酸で置換されている）。 ＳＣＦ類似体は、ヒトＳＣＦの全長分子（図１）と比較した類似体であり、あ るいは、図１のアミノ酸１−１６５または１−１６４を有するＳＣＦなどの修飾 ＳＣＦの類似体である（本発明の実施例は、−１位にメチオニン残基を有する修 飾ＳＣＦ１−１６５を示す。）。別の型のＳＣＦは、エキソンの欠失により２２ ０個のアミノ酸を有するものである（ＳＣＦの膜結合型）。「幹細胞因子」と題 する、1991年５月２日に公開され たＰＣＴ WO 91/05795（その全体を参照することにより本明細書に組み入れる 。）を参照。上記の幹細胞因子に関するＰＣＴ公開は、図４４にＳＣＦ１−２２ ０を例示している。修飾ＳＣＦは、Ｃ−末端の１個以上のアミノ酸が欠失して、 アミノ酸１−１３８、より好ましくは１−１４１（図１）になったもの、または Ｎ−末端の１位〜４位（図１）が欠失したものも含む。 修飾ＳＣＦは、天然のヒトＳＣＦの造血生物学的活性の少なくとも１つを有す る限り、他の付加、欠失または置換を有するものも含む。好ましい造血生物学的 活性は、初期の造血前駆細胞の増殖刺激能である。ＳＣＦ ＰＣＴ公開WO91/057 95、各所を参照。「出発」ＳＣＦ分子上の対応する部位でのアスパラギンのアス パラギン酸への置換という本発明を使用した修飾は、「出発」ＳＣＦ分子の活性 の増加が期待される。（「出発」の用語は、典型的には、タンパク質自体てはな く、これらのタンパク質をコードする核酸が本発明の類似体を製造するための出 発点であるため、引用する。） 本発明を行うための「出発」物質として使用できる具体的な修飾ＳＣＦとして は、（Ｎ１０ＤおよびＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄに対応する変化は、恐らく生物学的活 性を増加することであるた め）、以下のものが挙げられる（図１を参照）。 （ａ）ＳＣＦ１−１３８、好ましくは１−１４１（少なくともその位置で図１の Ｃ−末端システインを有する）から１−２４８までのいずれか（これらのＣ−末 端欠失は、ＵＴ−７バイオアッセイ（下記に記載）において生物学的活性にあま り影響しないので）； （ｂ）活性の低下したＳＣＦ１−１２７、１〜１３０および１−１３７；ならび に （ｃ）１、２、３または４位にＮ−末端欠失を有する（および４位にシステイン が残っている）上記ＳＣＦのいずれか。 さらに、WO 95/26199で報告された共有二量体、例えばアミノ酸リンカーを使 用して一方のモノマーのＮ−末端が他方のモノマーのＣ−末端に共有的に連結さ れた共有二量体などには、本発明の類似体である１以上のモノマーが含まれる。 「出発」ＳＣＦに対して好ましいのは、ＳＣＦ１−２４８、ＳＣＦ１−１６５ 、ＳＣＦ１−１６４であり、これらは、もっとも大きい生物学的活性を有すると 考えられ、解析されている。 本発明のＳＣＦ類似体は、−１位にメチオニン残基を有すると考えられる（典 型的には、細菌発現に起こりやすい）。 本発明のＳＣＦ類似体は、モノマーまたは二量体の製剤に含めることができ、 最も高い生物学的活性を維持するためには、ホモ二量体が好ましい。１つのＮ１ ０Ｄおよび１つのＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄ分子から成るヘテロ二量体であってもよく 、これも活性が強められる。また、Ｎ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄおよび天然のＳＣＦ（非 修飾ＳＣＦ１〜１６４または１〜１６５）を有するへテロ二量体を調製してもよ い。ＳＣＦ製剤は、へテロおよびホモ二量体の混合物であってもよく、該二量体 とモノマーの混合物であってもよい。 本発明の新規核酸配列は、本発明のＳＣＦ類似体、Ｎ１０ＤおよびＮ１０Ｄ、 Ｎ１１Ｄの原核または真核宿主細胞での発現を安全に行うために有用な配列を含 む。その核酸配列は、精製して単離することができるので、所望のコード領域は 、本発明のポリペプチドの製造に有用である。 特に、本発明のＤＮＡ配列は、以下を含む。 （ａ）配列番号３および４および６および７に記載のＤＮＡ配列； （ｂ）天然のヒトＳＣＦの造血生物学的特性の少なくとも一つを有するＳＣＦの 別の型をコードするように修飾されたサブパ ート（ａ）のＤＮＡ配列。好ましくは、生物学的特性がＳＣＦ受容体（ｃ−ｋｉ ｔ受容体）に結合する特性であるが、別の生物学的特性は、初期造血前駆細胞の 増殖刺激能である。別の生物学的特性は、メラニンを製造するためのメラノサイ トの刺激能である。他の生物学的特性は、当業者に明らかである。 特に、本発明の核酸は、下記（図１を参照）： （ａ）ＳＣＦ１−１３８、好ましくは１−１４１（少なくともその位置に図１の Ｃ−末端システインを有する）から１−２４８までのいずれか； （ｂ）ＳＣＦ１−１２７、１−１３０および１−１３７；ならびに （ｃ）１、２、３または４位にＮ−末端欠失を有する（そして、４位にシステイ ンが残っている）上記ＳＣＦのいずれか におけるＮ１０ＤまたはＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄをコードするものである。 ＤＮＡ配列は、微生物宿主におけるメッセンジャーＲＮＡの転写または翻訳を 促進するコドンを挿入することができる。製造される該配列は、Altonら、ＰＣ Ｔ公開出願WO 83/04053の方法に従って容易に構築できる。ＤＮＡは、所望によ り、Ｎ −末端メチオニン残基をコードすることができる。 本発明によって提供されるＤＮＡ配列は、新規かつ有用なウイルスおよびプラ スミドＤＮＡベクター、形質転換され、トランスフェクションされた新規かつ有 用な原核および真核宿主細胞（培地で増殖させた細菌および酵母細胞ならびに哺 乳類細胞を含む）、ならびに本発明のＳＣＦ類似体を発現し得る該宿主細胞の新 規かつ有用な培養増殖方法を生むのに有用である。本明細書で提供する生物学的 に活性なＳＣＦ類似体をコードするＤＮＡ配列（または対応するＲＮＡ）は、例 えばＳＣＦの生産不足を緩和する遺伝子治療に対して有用であると考えられる。 本発明はまた、本発明のＳＣＦ類似体の製造法も提供する。提供される、該Ｓ ＣＦ類似体をコードする核酸を含む宿主細胞からＳＣＦ類似体Ｎ１０Ｄおよび／ またはＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄを製造する方法は、 （ａ）該ＳＣＦ類似体をコードする核酸を含む該宿主細胞を、該ＤＮＡ分子の発 現を促進する条件下で培養し； （ｂ）該ＳＣＦ類似体を得る ことから成る。所望により、その方法で得られた他の成分から該ＳＣＦ類似体を 精製・単離してもよい。 宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり、細菌、哺乳類細胞（チャイニー ズハムスター卵巣細胞、サルの細胞、ベビーハムスター腎臓細胞など）、酵母細 胞および昆虫細胞を含む。工業的に製造するのに最も容易であることから、細菌 宿主細胞を使用する製造が好ましい。 また、本発明の有効な量のポリペプチド産物を、ＳＣＦ治療に有用な薬学的に 許容される希釈剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体 とともに含む薬剤組成物も本発明に包含される。該組成物は、種々の緩衝剤（例 えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）を含み、種々のｐＨおよびイオン強 度を有する希釈剤；界面活性剤および溶解剤（例えば、Tween 80、Polysorbate 80）、酸化防止剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤 (例えば、Thimersol、ベンジルアルコール)および増量物質（例えば、ラクトー ス、マンニトール）などの添加剤；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー 化合物の粒状製剤への、またはリポソームと結合した、物質の混入を含む。該組 成物は、本発明のＳＣＦ類似体の物性、安定性、in vivo放出速度およびin vivo クリアランス速度に影響を及ぼす。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Hack Publishing Co.,Easton，PA 18042)，ｐages 1 435-1712（参照することにより本明細書に組み入れる。）を参照。 本発明のＳＣＦ類似体の誘導体も本発明に包含される。該誘導体としては、１ 以上の水溶性ポリマー分子、例えばポリエチレングリコールによって、またはポ リアミノ酸の添加によって修飾した分子が挙げられる。該誘導はＮ−またはＣ− 末端で単独に生じ、または多重部位で誘導が生じる可能性もある。１以上のアミ ノ酸のリシンによる置換は、誘導のための別の部位を提供する。 本発明の類似体またはその誘導体は、注入、または経口、鼻腔、肺、局所もし くは当業者に知られている他の型の投与用に製剤化することができる。製剤は、 液体であっても、また再構成するための凍結乾燥体などの固体であってもよい。 一般に、本発明の類似体（またはその誘導体）は、現在使用されているＳＣＦ が有用であるのと同様に有用である。ただし、本発明の類似体は、より大きい効 力（下記に示すように、約２００％）を付与する。これらの用途としては、各種 の造血、神経および生殖関連疾患の治療が挙げられる。WO 91/05795（参 照することにより、本明細書に組み入れる。）を参照。また、U.S.S.N 07/982,2 55（これも、参照することにより、本明細書に組み入れる。）も参照。すなわち 、本発明組成物および薬物製造のための方法は、そのような症状の治療に有用で あると考えられる。そのような症状としては、それらに限定されないが、白血病 の治療、血小板減少症の治療、貧血の治療、移植中の骨髄移植の強化、放射線、 化学薬品または化学療法的に誘導される骨髄形成不全または骨髄抑制の治療にお ける骨髄回復の強化、後天性免疫不全症候群、および細胞の化学療法に対する感 作が挙げられる。さらに、本発明のＳＣＦ類似体組成物は、末梢血前駆細胞の可 動化に使用できる。そのような使用および組成物には、神経障害、不妊症または 脳障害に苦しむ哺乳類に治療を提供することも含まれる。さらに、本発明のＳＣ Ｆ類似体組成物は、白斑などの色素沈着障害の治療に有用であると考えられる。 本発明のＳＣＦ類似体（または誘導体）組成物はまた、in vitroで使用できる 。例えば、遺伝子治療の準備において、造血細胞に外因性ＤＮＡをトランスフェ クションし、該細胞を本発明のＳＣＦ類似体組成物を使用して培養する必要もあ ろう。すなわち、 さらに別の側面では、本発明は、in vitroで造血細胞を培養する方法を含み、該 方法は、 （ｉ）該細胞を適切な培地に置き、かかる適切な培地は本発明に係るＳＣＦ類似 体組成物を含み、 （ii）該造血細胞の増殖に適する条件を提供する ことを含む。 特に、本発明は、造血細胞に外因性ＤＮＡをトランスフェクションする方法を 提供し、該方法は、 （ｉ）該造血細胞を本発明に係るＳＣＦ類似体組成物とともに培養し、 （ii）培養した該細胞に外因性ＤＮＡをトランスフェクションする ことを含む。造血細胞は、例えば、骨髄細胞、末梢血前駆細胞である。 さらに別の側面では、本発明は、骨髄細胞または末梢血前駆細胞を培養するた めの成分を含むキットを提供し、該キットは、 （ｉ）本発明のＳＣＦ類似体組成物、および （ii）骨髄細胞または末梢血前駆細胞を培養するための培地を調製するのに適し た成分 を含む。 本明細書における使用または産物は、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＧＤＦ、ＧＭ −ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４ 、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ １、ＩＬ−１２、ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、インターフェロン（α、β、ガンマまた はコンセンサスなど）、神経栄養因子（ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＣＴＮＦまたはノ ギンなど）、他の多能性増殖因子（例えば、これらがそのような多能性増殖因子 、ｆｌｔ−３／ｆｌｋ−２リガンド、幹細胞増殖因子、および全能性幹細胞因子 であることが示される程度まで）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦなど）、および 上記の類似体、融合分子または他の誘導体から選択されるさらに少なくとも１種 の因子の投与または封入を含み得る。例えば、Ｇ−ＣＳＦと組み合わせたＳＣＦ は、末梢血前駆細胞をin vivoで可動化することが見いだされた。ex vivoの、例 えばＧ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−６と組み合わせたＳＣＦは、末梢血細胞 の拡張に有用であることが見いだされた。本発明の類似体は、同様の使用に対し て提供される。 一般に、本発明のＳＣＦ類似体（または誘導体）の効果的な量は、患者の年齢 、体重および疾患の症状または重度によって決定される。Remingtons Pharmaceu tical Sciences（前出）、第697〜773頁（参照することにより本明細書に組み入 れる。）を参照。典型的には、一日に約0.001μg/kg体重〜約1000μg/kg体重の 用量が使用できるが、それより多いまたは少ない量も、熟練した開業医の認識に 従って使用できる。投与は、一日に１回またはそれより多くてもよく、あるいは 、しばしばそれより少なく、また、本明細書に記載の他の組成物と組み合わせて もよい。なお、本発明は、本明細書に記載した用量に限られない。 下記実施例により、本発明をさらに十分説明するが、以下実施例は本発明の範 囲を限定するものではない。実施例では、本発明のＳＣＦ ｍｅｔｌ−１６５Ｎ １０ＤおよびＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄの調製ならびに１０位および／または１１位の アスパラギンでの脱アミド化の回避が組換えヒトＳＣＦの分解副生物を回避する という決定を説明する。これらのＳＣＦ類似体のin vitroでの試験も記載する。 実施例 １．１０位および／または１１位のアスパラギン残基が組換えヒトＳＣＦの生物 学的機能および化学安定性に影響を及ぼすことの決定 in vitroエージング中、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ１−１６５）の脱 アミド化を、ＨＰＬＣ分析および可溶性アンモニアの放出によって検出した。脱 アミド化速度は、低ｐＨまたは低温の緩衝剤中では遅いが、重炭酸ナトリウムな どのアルカリ性緩衝剤中、高められた温度と組み合わせると、かなり加速される 。各種脱アミド化形態のＨＰＬＣ単離の後、ペプチドマップ分析を行うと、脱ア ミド化がタンパク質の１０位のアスパラギンに関与することが示された。ペプチ ドマップ分析の後、かなりの量のアスパラギン酸およびイソアスパラギン酸ペプ チドが同定され、これは、１０位のアスパラギンがアスパラギン酸およびイソア スパラギン酸の両残基に転化されたことを示す。ｒｈＳＣＦ二量体の自然の会合 −分解の結果として(Luら、Biochem J．305:563-568(1995)を参照)、２個のホモ 二量体および３個のへテロ二量体を含む全部で５種類の脱アミド化形態が検出さ れ、単離された。細胞増殖アッセイは、イソアスパ ラギン酸ｒｈＳＣＦと他のｒｈＳＣＦモノマーとの二量化二よって誘導される２ 種類のｒｈＳＣＦヘテロ二量体が、約半分の生物学的活性を保持していることを 示した。アスパラギンの代わりにイソアスパラギン酸を有するホモ二量体は、効 力が５０倍小さいが、アスパラキン酸ホモ二量体は、脱アミド化実験中に単離し たものも、上記した部位特異的突然変異誘発によって組換え法により調製したも のも、いずれも標準の分子より活性が高かった。比較すると、合成のＮ１０Ａ（ １０位にアラニンを有する）またはＮ１０Ｅ（１０位にグルタミン酸を有する） は、脱アミド化部位がないけれども、活性はかなり小さかった。これらの類似体 は全て、アスパラギン残基を含むものよりも比較的安定であった。これらの結果 は、組換えヒトＳＣＦの化学的安定性が１０位の残基の性質の影響を受けること を示した。 ２．ＳＣＦｍｅｔ１−１６５Ｎ１０ＤおよびＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄの調製 １０位の脱アミド化がｒｈＳＣＦ製剤の活性および安定性の低下をもたらすこ とを示す上記研究を鑑みて、本発明のＮ１０ＤおよびＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄ類似体 を調製し、生物学的活性および安定性を試験した。 本発明のＳＣＦ類似体は、ＳＣＦｍｅｔ１−１６５の部位特異的突然変異誘発 によって調製した。ＳＣＦｍｅｔ１−１６５の大燗菌での発現は以前に報告され た（Langleyら、Arch．Biochem．Biophys．295:21-28（1992））。組換えヒトＳ ＣＦをコードするＤＮＡは、開始のメチオニンコドンの後ろにヒトＳＣＦ１−１ ６５のコドンを有する。精製した組換えヒトＳＣＦは、開始Ｍｅｔ（Ｍｅｔ−１ 位）を保持している。本発明のＮ１０ＤおよびＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄ類似体は、La ngleyら、Arch．Biochem．Biophys．311:55-61（1994）に記載の部位特異的突然 変異誘発によって調製した。他の「試験」類似体であるＮ１０ＡおよびＮ１０Ｅ も同様にして調製した。 ＳＣＦｍｅｔ１−１６５Ｎ１０Ｄのアミノ酸配列および核酸配列は以下の通り であった（配列番号１（ＤＮＡ）および２（アミノ酸））。 ＳＣＦｍｅｔ１−１６５Ｎ１０Ｄのアミノ酸配列および核酸配列は以下の通り であった（配列番号３および４（ＤＮＡ）ならびに５（アミノ酸））。 ＳＣＦｍｅｔ１−１６５Ｎ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄのアミノ酸配列および核酸配列は 以下の通りであった（配列番号６および７（ＤＮＡ）ならびに８（アミノ酸）） 。 解析 ＳＣＦｍｅｔ１−１６５Ｎ１０ＤおよびＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄの同一性の確認を 、元のタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列によって行った。ＳＣＦ Ｎ１０Ｄの アミノ酸配列は、Met-Glu-Gly-Ile-[Cys]-Arg-Asn-Arg-Val-Thr-Asp-Asn-Val-Ly s---であることが決定され、一方、ＳＣＦ Ｎ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄの配列は、Met- Glu-Gly-Ile-[Cys]-Arg-Asn-Arg-Val-Thr-Asp-Asp-Val-Lys---であることが明ら かにされた。従って、精製したＳＣＦ Ｎ１０ＤおよびＳＣＦ Ｎ１０Ｄ、Ｎ１ １Ｄの決定された配列は、配列番号３および４ならびに配列番号６および７に示 す各々のＤＮＡ配列から予想される配列と一致する。 ３．生物学的活性の増加 本発明の組換えヒトＳＣＦ類似体Ｎ１０ＤおよびＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄが非修飾 組換えヒトＳＣＦ１−１６５よりも生物学的活性が約５０％大きいことを示すデ ータを下記に示す。生物学的活性アッセイ in vitroＵＴ−７バイオアッセイを、巨核球細胞培養の増殖に対するＳＣＦの 刺激効果を測定することによって行った。サンプルによって刺激された培養細胞 の３Ｈ−チミジン吸収は、 ＳＣＦの生物学的効力を示す。使用した方法は、Smithら、in Current Protocol s in Immunology（Coliganら、編）pp.6.17.1〜6.17.11，John Wiley & Sons，N ew Yorkに従った。 本発明の類似体を非修飾ＳＣＦｍｅｔ１−１６５と比較した結果を下記に示す 。 ¹ これは、標準組換えヒトＳＣＦの１／２最大刺激濃度を変異体の値（３．５ または３．２）によって割り、１００を掛けることにより決定した。 これらの結果は、in vitroでの本発明の組換えヒトＳＣＦ１−１６５ Ｎ１０ ＤおよびＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄ類似体の生物活性が天然の組換えヒトＳＣＦ１−１ ６５より約５０％高いことを示す。 ４．安定性の増加 本発明の組換えヒトＳＣＦ１−１６５類似体が非修飾組換え ヒトＳＣＦ１−１６５よりも加速安定性アッセイにおいてより安定していること を示すデータを下記に示す。安定性のアッセイ ＳＣＦ、ＳＣＦ Ｎ１０ＤおよびＳＣＦ Ｎ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄ間の比較による 加速安定性を、１００ｍＭの重炭酸ナトリウム、ｐＨ８．４において、３７℃で １〜５日間、サンプルをインキュベートすることにより評価した。ＳＰ−５ＰＷ ＴＳＫゲルカラムを使用したスルホプロピル陽イオン交換ＨＰＬＣを行って、 上記した緩衝液での保存において残っている未分解形および生成した脱アミド化 物質の量を定量した。図２に示すように、ＳＣＦ Ｎ１０ＤおよびＳＣＦ Ｎ１ ０Ｄ、Ｎ１１Ｄは、インキュベート中も等しく安定であり、標準ＳＣＦよりも良 好な安定性を示す。 本発明を好ましい態様によって記載したが、理解されるように、当業者には変 形および改変が考えつくであろう。従って、添付のクレームは、そのような等価 な変形を全てカバーするものであり、それらは、クレームした本発明の範囲内で ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/22 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/475 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 5/00 Ａ 1/21 Ｂ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体における、Ｎ１０Ｄお よびＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄから成る群から選択されるＳＣＦ類似体。 ２．Ｎ１０ＤまたはＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄが、 （ａ）ＳＣＦ１−１３８〜１−２４８のいずれか、 （ｂ）ＳＣＦ１−１２７、１−１３０および１−１３７、 （ｃ）１、２、３または４位にＮ−末端欠失を有する（そして、４位のシステイ ンは残っている）サブパート（ａ）または（ｂ）のＳＣＦのいずれか、ならびに （ｄ）Ｎ−末端メチオニン残基を有するサブパート(ａ)、(ｂ)または（ｃ）のＳ ＣＦのいずれか から成る群（図１を参照）から選択される組換えヒトＳＣＦの類似体である、請 求項１に記載のＳＣＦ類似体。 ３．（ａ）配列番号３または配列番号６（および相補鎖）に記載のＤＮＡ配列； （ｂ）１０位および／または１１位においてアスパラギン酸をコードし、天然の ヒトＳＣＦの造血生物学的特性の少なくとも 一つを有するＳＣＦの別の型をコードするように修飾したサブパート（ａ）のＤ ＮＡ配列 を有するＤＮＡ分子。 ４．Ｎ１０ＤまたはＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄが、 （ａ）ＳＣＦ１−１３８〜１−２４８のいすれか、 （ｂ）ＳＣＦ１−１２７、１−１３０および１−１３７、 （ｃ）１、２、３または４位にＮ−末端欠失を有する（そして、４位のシステイ ンは残っている）サブパート（ａ）または（ｂ）のＳＣＦのいずれか、ならびに （ｄ）Ｎ−末端メチオニン残基を有するサプパート(ａ)、(ｂ)または（ｃ）のＳ ＣＦのいずれか の類似体（図１を参照）である、Ｎ１０ＤまたはＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄをコードす るＤＮＡ分子。 ５．該ＳＣＦ類似体をコードする核酸を含む宿主細胞からＳＣＦ類似体Ｎ１０Ｄ および／またはＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄを製造する方法であって、 （ａ）請求項３または４に記載のＤＮＡ分子を含む宿主細胞を、該ＤＮＡ分子の 発現を促進する条件下で培養し、 （ｂ）該ＳＣＦ類似体を得る ことを含む方法。 ６．請求項３または４に記載のＤＮＡ分子を含むＤＮＡウイルスまたはプラスミ ドベクター。 ７．請求項３または４に記載のＤＮＡを含む宿主細胞。 ８．宿主細胞が、細菌、哺乳類細胞、酵母細胞および昆虫細胞から成る群から選 択される、請求項７に記載の宿主細胞。 ９．請求項１または２に記載の組成物の有効量をそれを必要とする患者に投与す ることを含む、造血障害の治療法。 １０．該造血障害が、白血球減少症、血小板減少症、貧血、移植中の骨髄の移植 の強化、放射線、化学薬品または化学療法的に誘導される骨髄形成不全または骨 髄抑制の治療における骨髄回復の強化および後天性免疫不全症候群から選択され る、請求項９に記載の治療法。 １１．請求項１または２に記載の組成物の有効量をそれを必要とする患者に投与 することを含む化学療法に細胞を感作させる方法。 １２．請求項１または２に記載の組成物の有効量をそれを必要とする患者に投与 することを含む、神経障害、不妊症または腸障害の治療法。 １３．造血細胞をin vitroで培養する方法であって、該方法が、 （ｉ）該細胞を適切な培地に置き、かかる適切な培地はＳＣＦＮ１０ＤまたはＮ １０Ｄ、Ｎ１１Ｄ類似体を含み、該類似体は、 （ａ）ＳＣＦ１−１３８〜１−２４８のいすれか、 （ｂ）組換えヒトＳＣＦ１−１２７、１−１３０および１−１３７、 （ｃ）１、２、３または４位にＮ−末端欠失を有する（そして、４位のシステイ ンは残っている）サブパート（ａ）または（ｂ）の組換えヒトＳＣＦのいずれか 、ならびに （ｄ）Ｎ−末端メチオニン残基を有するサブパート(ａ)、(ｂ)または（ｃ）の組 換えヒトＳＣＦのいずれか から成る群（図１を参照）から選択される組換えヒトＳＣＦの修飾型であり； （ii）該造血細胞の増殖に適する条件を提供する ことを含む方法。 １４．造血細胞に外因性ＤＮＡをトランスフェクションする方法において、該方 法が、 （ｉ）該造血細胞をＳＣＦ Ｎ１０ＤまたはＮ１０Ｄ、Ｎ１１ Ｄ類似体を含む培地で培養し、該類似体が、 （ａ）ＳＣＦ１−１３８〜１−２４８のいずれか、 （ｂ）組換えヒトＳＣＦ１−１２７、１−１３０および１−１３７、 （ｃ）１、２、３または４位にＮ−末端欠失を有する（そして、４位のシステイ ンは残っている）サブパート（ａ）または（ｂ）の組換えヒトＳＣＦのいずれか 、ならびに （ｄ）Ｎ−末端メチオニン残基を有するサブパート(ａ)、(ｂ)または（ｃ）の組 換えヒトＳＣＦのいずれか から成る群（図１を参照）から選択される組換えヒトＳＣＦの修飾型であり； （ii）培養した該細胞に外因性ＤＮＡをトランスフェクションする ことを含む方法。 １５．造血細胞が、骨髄細胞または末梢血前駆細胞である、請求項１４に記載の 方法。 １６．治療または培養が、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＧＤＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ −ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、 ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ− ８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、イ ンターフェロン、神経栄養因子、ｆｌｔ−３／ｆｌｋ−２リガンドおよび繊維芽 細胞増殖因子から選択される少なくとも１種の因子をさらに含む、詰求項９ない し１５のいずれかに記載の方法。 １７．造血細胞を培養するための成分を含むキットであって、該キットが、 （ｉ）ＳＣＦ Ｎ１０ＤまたはＮ１０Ｄ、Ｎ１１Ｄ類似体であって、該類似体が 、 （ａ）組換えヒトＳＣＦ１−１３８〜１−２４８のいずれか、 （ｂ）組換えヒトＳＣＦ１−１２７、１−１３０および１−１３７、 （ｃ）１、２、３または４位にＮ−末端欠失を有する（そして、４位のシステイ ンは残っている）サブパート（ａ）または（ｂ）の組換えヒトＳＣＦのいずれか 、ならびに （ｄ）Ｎ−末端メチオニン残基を有するサブパート(ａ)、(ｂ)または（ｃ）の組 換えヒトＳＣＦのいずれか から成る群（図１を参照）から選択される組換えヒトＳＣＦの修飾型であり； （ii）骨髄細胞または末梢血前駆細胞を培養するための培地を調製するのに適し た成分；および (iii)所望により、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＧＤＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳ Ｆ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ− ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８ 、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、 ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、インターフェロン、神経栄養因子、ｆｌｔ−３／ｆｌｋ− ２リガンドおよび繊維芽細胞増殖因子から選択されるさらに少なくとも１種の因 子 を含むキット。