CZ301598A3

CZ301598A3 - Přípravky obsahující SCF a způsoby jejich použití

Info

Publication number: CZ301598A3
Application number: CZ983015A
Authority: CZ
Inventors: Hsieng Sen Lu
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1996-04-05
Filing date: 1997-04-03
Publication date: 1999-01-13
Also published as: CN1214734A; AU726663B2; ATE363488T1; NO984491D0; WO1997038101A1; CA2249181C; US5885962A; EP0904367B1; JP2000508170A; CA2249181A1; EP0904367A1; IL126221A0; SK131098A3; DE69737766T2; KR20000004951A; NO984491L; AU2606497A; YU41798A; DE69737766D1; ES2286830T3

Description

Přípravky obsahující SCF a způsoby jejich použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká přípravků obsahuj ících polypeptidový analog faktoru kmenových buněk (SCF) a způsobů pro rekombinantní DNA produkci předkládaných analogů SCF. Také jsou, v jiných aspektech, poskytnuty farmaceutické přípravky a způsoby jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Faktor kmenových buněk (SCF, viz PCT přihláška č. WO 91/05795; také nazývaný kit-ligand, PCT přihláška č. WO 92/03459, růstový faktor žírných buněk, viz PCT přihláška č. WO 92/00376 a Steel faktor (nebo SF nebo SLF) White, Cell, 63: 5 - 6 (1990)) je hematopoetický faktor, který působí na hematopoetické progenitorové buňky. Gen kódující SCF byl klonován a exprivován, např. Martin et al., Cell 63: 203 - 211 (1990) a PCT přihláška č. WO 91/05795, což je zde uvedeno jako odkaz.

Jedním znakem aktivity SCF je expanse primitivních progenitorových buněk kostní dřeně a periferní krve. Klinicky může být SCF užitečný u mnoha chorobných stavů, při kterých může myelosuprese vést ke značné morbiditě a mortalitě. Tyto stavy zahrnují použití SCF při: mobilizaci progenitorových buněk pro použití při transplantaci po myeloablativní chemoterapii, primingu kostní dřeně před odběrem kostní dřeně pro autologní transplantaci kostní dřeně, a při akceleraci zotavení hematopoesy po standartní chemoterapii nebo po myeloablativní chemoterapii/celotělovým ozářením.

• · ·· ··

SCF má mnoho aktivních forem, včetně verze vázané na membránu a solubilní verze. Viz PCT přihláška č. WO 91/05795. Analogy s C-terminální delecí mají také aktivitu. Například, SCF 1 - 137 (s 1 označujícím první aminokyseliny zralého proteinu) vykazuje biologickou aktivitu a SCF 1 - 141 vykazuje víceméně úplnou biologickou aktivitu. (Langley et al., Arch. Biochem. Biophys. 311: 55 - 61 (1994). SCF 1 - 165, mající kyselinu aspartovou v pozici 10, místo asparaginu v nativní sekvenci (označovaný jako N10D) byl také studován a bylo zjištěno, že není významně ovlivněna tvorba dimerů (Lu et al., Biochem. J. 305: 563 - 568 (1995)) . Určité kovalentně vázané SCF dimery jsou popsány v PCT přihlášce č. WO 95/26199. Stabilita je podle údajů zvýšena intermolekulárními kovelantními vazbami.

SCF analoga se zvýšenou biologickou aktivitou a stabilitou, jako jsou analogy zde poskytnuté, budou výhodné pro uživatele, vzhledem k nižším dávkám, které mohou být použity pro dosažení stejného biologického účinku. Takové analogy budou výhodné pro producenty, protože bude získáno více aktivního produktu ve více jednotkách z jedné vsádky. Zvýšená stabilita, zejména zvýšený poločas, bude výhodná jak pro producenty, tak pro uživatele. Předkládaný vynález poskytuje tyto výhody a uspokojuje potřeby uživatelů a producentů.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká SCF analogů obsahujících kyselinu asparagovou substituovanou za asparagin v pozici 10 a v pozici 11 (podle číslování uvedeném na obrázku 1, kde methionin je v pozici -1). Překvapivě, a významně, bylo zjištěno, že tyto substituce vedou ke vzniku analogů SCF majících významně vyšší • · biologickou aktivitu a zvýšenou stabilitu ve srovnání s nemodifikovaným SCF.

Předkládané analogy vycházejí částečně z pozorování prováděných v průběhu studií in vitro stárnutí, kde bylo zjištěno, že přirozený typ SCF je vysoce nestabilní v jistých formulacích pufrů. U takového přirozeného SCF se předpokládá, že bude mít kratší poločas. Nyní bylo zjištěno, že hlavní nestabilita přirozeného SCF je způsobena deamidační reakcí na aspartylovém (asparagin, ASN, N) zbytku v pozici 10 sekvence (vzhledem ke zralému proteinu podle obrázku 1). Deamidace také vede k izomerizaci aspartylového zbytku alfa/beta posunem peptidové vazby. Izomerizované SCF nejsou biologicky aktivní. Existuje zde také riziko antigenicity vzhledem k jemné změně molekulární struktury. Jak bude dokázáno dále, analagy zde poskytnuté jsou stabilnější než přirozený SCF, mají zvýšenou biologickou aktivitu a eliminují jakékoliv riziko spojené s deamidací.

Další aspekty předkládaného vynálezu obsahují nukleové kyseliny kódujíc předkládané analogy SCF, vektory, hostitelské buňky a způsoby pro rekombinantní produkci předkládaných analogů SCF. Také jsou v dalším aspektu poskytnuty farmaceutické přípravky a způsoby pro jejich použití.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 ukazuje aminokyselinovou sekvenci pro aminokyseliny 1 - 248 membránově vázané formy lidského rekombinantního SCF.

Obrázek 2 je graf ilustrující relativní množství intaktního proteinu/analogu v akcelerovaném testu stability (viz dále). Vzorky byly uchovávány při 37 °C po dobu 1-5 dnů a potom byly analyzovány na produkty degradace. Testovanými vzorky byly (a) rhSCF, přirozený typ, rekombinantní lidský met-1 SCF 1 - 165, (b) N10D, NUD varianta, rekombinantní lidský met-1 SCF 1 - 165 mající zbytek kyseliny asparagové v pozicích 10 a 11; (c) N10D varianta, t.j., stejný jako (b), s tou výjimkou, že kyselina asparagová je pouze v pozici 10; a N10E varianta stejná jako N10D, s tou výjimkou, že v pozici 10 je kyselina glutamová.

Předkládaný vynález se týká konkrétně analogů SCF vykazujících vyšší biologickou aktivitu než nemodifikovaný SCF. Jak je uvedeno výše, bylo zjištěno, že substituce jednoho nebo obou asparaginů v pozicích 10 a 11 (podle obrázku 1) vede ke vzniku molekuly, která má významně vyšší aktivitu než nemodifikovaný SCF. Presentované analogy jsou zde označovány jako N10D (pro asparagin v pozici 10 substituovaný kyselinou asparagovou) a N10D, NUD (pro analog SCF mající další substituci v pozici 11). Preferovaným je N10D,

NUD, protože změny v obou místech vedeou k lepší biologické aktivitě (v testu proliferace megakaryocytů) než změna N10D samotná.

Termín N10D a N10D, NUD označuje genericky presentované analogy SCF, bez ohledu na to, zda je analog kompletní 1 - 248 SCf protein (obrázek 1), nebo analog některé z forem jak jsou popsány dále. Při popisování určitého analogu je popsána určitá nemodifikovaná aminokyselinová sekvence. Například, dále je ukázán analog SCF N10D SCF met 1 - 165 (analog SCF mající 165 aminokyselin podle obrázku 1 s N-terminálním methionylovým zbytkem a kyselinou asparagovou substituovanou za asparagin • ·

v pozici 10).

SCF analogy mohou být analogy kompletní molekuly lidského SCF (jak je uvedena na obrázku 1), nebo to mohou být analogy modifikovaného SCF, jako je například SCF mající aminokyseliny 1 - 165 nebo 1 - 164 podle obrázku 1. (Předkládané pracovní příklady ukazují modifikovaný SCF 1 - 165 mající methionylový zbytek v pozici -1). Jiným typem je SCF mající 220 aminokyselin, což je způsobeno delecí exonu (membránově vázaná verze SCF). Viz PCT přihláška č. WO 91/05795, nazvaná Stem Ce‘ll factor, publikovaná 2.5.1991, zde uvedena jako odkaz ve své úplnosti.

Výše uvedená PCT přihláška Stem Cell Factor popisuje na obrázku 44 SCF 1 - 220. Modifikované SCF také zahrnují ty, které mají deleci jedné nebo více aminokyselin na C-konci, za aminokyselinami 1 - 138, nebo lépe, 1 - 141 (podle obrázku 1), a ty, které mají N-terminální deleci pozic 1 až 4 (též podle obrázku 1).

Modifikovaný SCF může zahrnovat takové, které mají další adice, delece nebo substituce a které mají stále alespoň jednu z hematopoetických biologických aktivit přirozeného lidského SCF. Preferovanou biologickou aktivitou je schopnost stimulovat růst časných hematopoetických progenitorových buněk. Viz PCT přihláška č. WO 91/05795, různě. Od modifikace použité v předkládaném vynálezu, t.j. od substituce asparaginu kyselinou asparagovou v odpovídajících místech výchozí molekuly SCF se očekává, že zvýší aktivitu výchozí molekuly SCF. (Termín výchozí je v uvozovkách, protože nukleová kyselina kódující tyto proteiny, a ne protein samotný, je výchozím materiálem pro produkci předkládaných analogů).

Specifické modifikované SCF, které mohou být použity jako výchozí materiál pro provedení předkládaného vynálezu (protože změny odpovídající N10D a N10D, NUD by měly zvyšovat biologickou aktivitu) zahrnují (podle obrázku 1):

(a) jakýkoliv SCF 1 - 138, nebo lépe 1 - 141 (nejméně mající C-terminální cystein podle obrázku 1 v této pozici) až 1 - 248, protože tyto C-terminální delece neovlivňují významně biologické aktivity v UT-7 biotestu (jak je popsáno dále);

(b) SCF l - 127, 1 - 130 a 1 - 137 mající redukovanou aktivitu; a (c) jakýkoliv z výše uvedených SCF mající N-terminální delece v pozici 1, 2, 3 nebo 4 (a mající cystein zůstávající v pozici 4) .

Kromě toho, kovalentní dimery, jak jsou uvedeny v PCT přihlášce č. WO 95/26199, jako jsou ty, ve kterých jsou aminokyselinové linkery použity pro kovalentní vazbu N-konce jednoho monomeru na C-konec druhého monomeru, mohou obsahovat jeden nebo více monomerů, které jsou analogy podele předkláídaného vynálezu.

Pro výchozí SCF jsou výhodné SCF 1 - 248, SCF 1 - 165, SCF 1 -194, protože se o nich soudí, že mají nejvyšší biologickou aktivitu a protože byly charakterizovány.

Předkládané analogy SCF mohou mít methinylový zbytek v pozici -1 (typicky v důsledku bakteriální exprese).

Předkládané analogy SCF mohou být zahrnuty v přípravě monomerů a dimerů, a homodimery jsou výhodné pro udržení nejvyšší biologické aktivity. Je možné také vytvořit heterodimer skládájícíc se z jedné N10D a z jedné N10D, NUD molekuly, také ze zvýšenou aktivitou. Je také možná příprava heterodimeru obsahujícího N10D, NUD a přirozený SCF (jako je nemodifikovaný SCF 1 - 164 nebo 1 - 165). SCF přípravek může být směsí hetero- a homo-dimerů, nebo může být směsí takových dimerů a monomerů.

Nové sekvence nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu zahrnují sekvence použitelné pro zajištění exprese předkládaných analogů SCF, N10D a N10D, NUD, v prokaryotických a eukaryotických hostitelských buňkách. Nukleové kyseliny mohou být přečištěné a izolované, takže požadovaný kódující region je použitelný pro produkci předkládaných polypeptidů.

Přesněji, DNA sekvence podle předkládaného vynálezu obsahuje:

(a) DNA sekvence uvedené v SEQ ID NO: 3 a 4, a6a7;

(b) DNA sekvence bodu (a) modifikované tak, aby kódovaly jiné verze SCF mající alespoň jednu biologickou aktivitu přirozeného lidského SCF. Výhodně je biologickou vlastností vazqba na receptor pro SCF (c-kit receptor), ale dalšími biologickými vlastnostmi je schopnost stimulace proliferace časných hematopoetických progenitořových buněk. Jinou biologickou vlastností je schopnost stimulace melanocytů ke tvorbě melaninu. Další biologické vlastnosti budou odborníkům v oboru známé.

Přesněji, předkládané nukleové kyseliny jsou ty, které kódují NI OD nebo N10D, NUD v (podle obrázku 1) :

• · · · ··· · • » *

(a) jakýkoliv SCF 1 - 138, nebo lépe 1 - 141 (nejméně mající C-terminální cystein podle obrázku 1 v této pozici) až 1 - 248;

(b) SCF 1 - 127, 1 - 130 a 1 - 137;

(c) jakýkoliv z výše uvedených SCF mající N-terminální delece v pozici 1, 2, 3 nebo 4 (a mající cystein zůstávající v pozici 4) .

DNA sekvence mohou obsahovat kodony usnadňují transkripci a translaci messengerové RNA v mikrobiálním hostiteli. Takové vyrobené sekvence mohou být snadno konstruovány podle metod dle Alton et al., PCT publikovaná přihláška č. WO 83/04053. DNA může volitelně kodovat N-koncový methionylový zbytek.

DNA sekvence podle předkládaného vynálezu jsou použitelné při generování nových a použitelných virových a plasmidových DNA vektorů, nových a použitelných transformovaných a transfektovaných prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk (včetně bakteriálních buněk a kvasinek a savčích buněk kultivovaných v kultuře) a nových a použitelných metod pro kultivaci takových hostitelských buněk schopných exprese SCF analog podle předkládaného vynálezu. DNA sekvence kódující biologicky aktivní analogy SCF podle předkládaného vynálezu (nebo odpovídající RNA) mohou být užitečné pro genovou terapii v případech, ve kterých je potřeba zmírnit sníženou produkci SCF.

Předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro produkci analog SCF podle předkládaného vynálezu. Je poskytnut způsob pro produkci analog SCF N10D a/nebo N10D, N11D z hostitelské buňky

obsahující nukleovou kyselinu kódující takový analog SCF, kde uvedený způsob obsahuje:

(a) kultivaci uvedené hostitelské buňky obsahující nukleovou kyselinu kódující takový SCF analog za podmínek usnadňujících expresi takové DNA molekuly; a (b) získání takového analogu SCF.

Volitelně je možné přečistit a izolovat takový analog SCF z jiných složek získaných v tomto způsobu.

Hostitelská buňka může být prokaryotická nebo eukaryotická a zahrnuje bakterie, savčí buňky (jako jsou ovariální buňky čínského křečka, opičí buňky, baby buňky ledvin křečka, nebo jiné buňky), kvasinky, a hmyzí buňky. Pro co nej jednodušší komerční produkci je výhodné použít bakteriální hostitelské buňky.

Vynález také obsahuje farmaceutické přípravky, které obsahují účinná množství polypeptidových produktů podle předkládaného vynálezu spolu s farmaceuticky přijatelnými ředidly, konzervačními činidly, solubilizačními činidly, emulsifikačními činidly, přísadami a/nebo nosiči a které jsou použitelné v terapii SCF. Takové přípravky obsahují ředidla s různým obsahem pufrů (např. Tris-HCl, acetat, fosfát), pH a iontová síla; aditiva jako jsou detergenty nebo solubilizační činidla (například Tween 80, Polysorbate 80), antioxidanty (například kyselinu askorbovou, metabisulfit sodný), konzervační činidla (například Thimersol, benzylalkohol) a objemové substance (například laktosu, manitol); dále obsahují inkorporaci materiálu • ·

do určitých přípravků polymerických sloučenin jako je kyselina polymléčná, kyselina polyglykolová atd. nebo asociaci s liposomy. Takové přípravky budou ovlivňovat fyzikální stav, stabilitu, rychlost in vivo uvolňování a rychlost in vivo klírens analogů SCF podle předkládaného vynálezu. Viz, například, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), strany 1435 - 1712, zde uvedené jako odkaz.

Dále jsou obsaženy deriváty SCF analogů podle předkládaného vynálezu. Takové deriváty zahrnují molekuly modifikované jednou nebo více polymerickými molekulami rozpustnými ve vodě, jako je polyethylenglykol, nebo modifikované přidáním polyaminokyselin. Taková derivatizace může být provedena jednotlivě na N- nebo Ckonci, nebo může být provedena na mnoha místech. Substituce jedné nebo více aminokyselin lysinem může poskytnout další místa pro derivatizaci.

Analogy nebo jejich deriváty podle předkládaného vynálezu mohou být formulovány pro injekční, orální, nasální, plicní, lokální nebo jiné podání, jak je odborníkům v oboru známo. Přípravek může být kapalný, nebo může být v pevném stavu, jako je například lyofilizovaný přípravek, pro rekonstituci.

Obecně, analogy (nebo jejich deriváty) podle předkládaného vynálezu budou použitelné ve stejných případech jako jsou v současnosti dostupné SCF s tou výjimkou, že analogy podle předkládaného vynálezu mají vyšší účinost (přibližně 200%, jak bude ukázáno dále). Tyto případy zahrnují léčbu různých hematopoetických, neurologických a reprodukčních poruch. Viz WO 91/05795, která je zde uvedena jako odkaz, viz též U.S.S.N 07/982255, která je zde také uvedena jako odkaz. Proto, přípravky • · |· ·· ·· ·« • · · · · · • · • ·· a způsoby pro výrobu léčiv podle předkládaného vynálezu mohou být užitečné pro léčbu takových stavů. Takové stavy zahrnují, ale nejsou omezeny na, léčbu leukopenie, léčbu trombocytopenie, léčbu anemie, posílení uchycení kostní dřeně během transplantace, posílení regenerace kostní dřeně po radiační terapii, chemicky nebo chemoterapeuticky indukovanou aplasii kostní dřeně nebo myelosupresi, syndrom získané imunodeficience a sensitizaci buněk na chemoterapii. Kromě toho, přípravky analogů SCF podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro mobilizaci progenitorových buněk periferní krve. Takové použití a přípravkyt také zahrnují umožnění léčby savců trpících poškozením nervového systému, infertilitou nebo poškozením střeva. Kromě toho, přípravky analogů SCF podle předkládaného vynálezu mohou být užitečné pro léčbu poruch pigmentace, jako je vitiligo.

Přípravky analogů (nebo derivátů) SCF podle předkládaného vynálezu mohou být také použity in vitro. Například, v případě genové terapie může být žádoucí transfekce hematopoetických buněk exogenní DNA a kultivace uvedených buněk za použití přípravků analogu SCF podle předkládaného vynálezu. Tak, v ještě jiném aspektu, vynález obsahuje způsob pro kultivaci hematopoetických buněk in vitro, který obsahuje:

(i) umístění vhodných buněk ve vhodném kultivačním mediu obsahujícím přípravek analogu SCF podle předkládaného vynálezu, a (ii) poskytnutí vhodných podmínek pro kultivaci uvedených hematopoetických buněk.

Přesněji, předkládaný vynález poskytuje způsob pro transfekci hematopoetických buněk exogenní DNA, který obsahuje:

• · · « · · ·· • · • · · (i) kultivaci uvedených hematopoetických buněk s přípravkem analogu SCF podle předkládaného vynálezu, a (ii) transfekci uvedených kultivovaných buněk exogenní DNA. Hematopoetické buňky mohou být, například, buňky kostní dřeně nebo progenitorové buňky periferní krve.

V ještě jiné provedení předkládaný vynález poskytuje kit obsahujíc složky pro kultivaci buněk kostní dřeně nebo progenitorových buněk periferní krve, který se skládá z:

(i) přípravku analogu SCF podle předkládaného vynálezu; a (ii) složek vhodných pro přípravu media pro kultivaci buněk kostní dřeně nebo progenitorových buněk periferní krve.

Použití nebo produkty podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat podání nebo obsažení alespoň jednoho dalšího faktoru vybraného z EPO, G-CSF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IGF-l, LIF, interferonu (jako je a, S, gamma nebo směs), neurotrofních faktorů (jako je BDNF, NT-3, CTNF nebo noggin), jiných multipotentních růstových faktorů (jako jsou flt-3/flk-2 ligand, faktor proliferace kmenových buněk a faktor totipotentních kmenových buněk, v rozsahu, ve kterém byly demonstrovány jako multipotentní růstové faktory), fíbroblastových růstových faktorů (jako je FGF) a analogů, fúsních molekul nebo jiných derivátů výše uvedených faktorů. Například, bylo zjištěno, že SCF v kombinaci s G-CSF mobilizuje progenitorové buňky periferní krve in vivo. Bylo zjištěno, například, že ex vivo je SCF v kombinaci s G-CSF, IL-3 a IL-6 • · »· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · · • ···· ·· · · · »· ·· užitečný pro expansi buněk periferní krve. Analogy podle předkládaného vynálezu mají podobné využití.

Obecně, účinné množství analogů SCF (nebo derivátů) podle předkládaného vynálezu bude určeno v závislosti na věku, hmotnosti a stavu nebo závažnosti léčeného onemocnění pacienta. Viz, Remington's Pharmaceutical Sciences, výše, strany 697 - 773, zd uvedené jako odkaz. Typicky bude použita dávka v rozmezí od asi 0,001 /xg/kg tělesné hmotnosti/den do asi 1000 /xg/kg tělesné hmotnosti/den, ale může být použita dávka vyšší nebo nižší, jak určí odborník v oboru. Dávkování může být jedenkrát nebo vícekrát denně, nebo s menší frekvencí dávek, a může být spojeno s podáním jiných přípravků, jak jsou zde popsány. Je nutné zdůraznit, že předkládaný vynález není omezen na zde uvedené dávkování.

Následující příklady jsou zde uvedeny pro podrobnější ilustraci vynálezu, nikoliv jako jakékoliv omezení jeho rozsahu. Příklady ilustrují přípravu SCF met 1 - 165 N10D a N10D, NUD podle předkládaného vynálezu, a určení toho, že zrušení deamidace asparaginu v pozici 10 a/nebo 11 znemožňuje degradaci vedlejších produktů rekombinantního lidského SCF. Také je popsáno testování těchto analogů SCF in vitro.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Určení toho, že asparaginový zbytek v pozici 10 a/nebo 11 ovlivňuje biologickou funkci a chemickou stabilitu rekombinantního SCF.

Během in vitro stárnutí byla detekována deamidace rekombinantního lidského faktoru kmenových buněk (rhSCFl-165) ·· · ·· ·· ** **.

♦ . ·ϊ ... · ..· · • · ···· · · · · • · · · ····· ··· · · • · ·· · ···

........... «· ·· pomocí HPLC analýzy a uvolňování solubilního amoniaku. Rychlost deamidace je pomalá v pufrech s nízkým pH nebo při nízkých teplotách, ale rychlost je významně akcelerována v alkalických pufrech jako je bikarbonat sodný v kombinaci se zvýšenou teplotou. HPLC izolace různých deamidovaných forem následovaná mapovací analýzou peptidů ukázala, že deamidace probíhá na asparaginu v pozici 10 proteinu. Po mapovací analýze peptidů byla identifikována významná množství asparty a isoaspartyl peptidů, což ukazuje na konversi asparaginu v pozici 10 na aspartat nebo na isoaspartat. Jako výsledek spontání asociace-disociace rhSCF dimeru (viz Lu et al., Biochem. J. 305: 563 - 568 (1995)) bylo detekováno a izolováno celkem pět deamidovaných forem, včetně dvou homodimerů a tří heterodimerů. Testy buněčné proliferace ukázaly, že dva rhSCF heterodimerické druhy, odvozené z dimerizace mezi isoaspartyl rhSCF a jiným rhSCF monomerem, si zachovávají pouze asi polovinu biologické aktivity. Homodimer s kyselinou isoaspařagovou místo asparaginu je asi 50-krát méně účinný, zatímco aspartylový homodimer, ač izolovaný během deamidačních pokusů nebo připravený rekombinantně místně řízenou mutagenesí jak je popsáno výše, má vyšší aktivitu než standartní molekula. Při srovnání byly syntetický N10A (mající alanin v pozici 10) nebo N10E (mající kyselinu glutamovou v pozici 10) signifikantně méně aktivní, což bylo způsobeno chyběním deamidačního místa. Všechny tyto analogy byly relativně více stabilní než analogy obsahující asparagin. Tyto výsledky naznačují, že biologická funkce a chemická stabilita rekombinantního lidského SCF je ovlivněna charakterem zbytku v pozici 10.

Příklad. 2. Příprava SCF met 1 - 165 N10D, a N10D, NUD

S ohledem na výše uvedené studie ukazující, že deamidace v pozici 10 vede ke ztrátě aktivity a k nestabilitě přípravků rhSCF byly připraveny analogy N10D a N10D, NUD podle předkládaného vynálezu a byly testovány na svou biologickou aktivitu a stabilitu.

Analogy SCF podle předkládaného vynálezu byly připraveny místně řízenou mutagenesí SCF met 1-165. Exprese SCF met 1 - 165 v E. coli byla popsána dříve. Langley et al., Arch. Biochem. Biophys. 295: 21 - 28 (1992) . DNA kódující rekombinantní lidský SCF měla iniciální kodon pro methionin následovaný kodony pro lidský SCF i - 165. Přečištěný lidský rekombinantní SCF si zachovává počáteční Met (pozice Met -1). Analogy N10D a N10D,

NUD podle předkládaného vynálezu byly připraveny místně řízenou mutagenesí jak je popsána v Langley et al., Arch. Biochem. Biophys. 311: 55 - 61 (1994) . Další testované analogy, N10A a N10E, byly také připraveny tímto způsobem.

• 4 » «

4 ·

Aminokyselinová sekvence a sekvence nukleové kyseliny pro SCF met 1-165 N10D je SEQ ID NO: 1 (DNA) a SEQ ID NO: 2

aminokyselinová):
ATGGAAGGTA	TCTGCCGTAA	CCGTGTTACT	AACAACGTTA	AAGACGTTAC
Μ E G	I C R N	R V T	N N V	K D V T
TAAACTGGTT	GCTAACCTGC	CGAAAGACTA	CATGATCACC	CTGAAATACG
K L V	A N L P	KDY	Μ I T	L K Y
TTCCGGGTAT	GGACGTTCTG	CCGTCTCACT	GCTGGATCTC	TGAAATGGTT
V P G M	D V L	P S H	C W I S	E Μ V
GTTCAGCTGT	CTGACTCTCT	GACTGACCTG	CTGGACAAAT	TCTCTAACAT
V Q L	S D S L	T D L	L D K	F S N I
CTCTGAAGGT	CTGTCTAACT	ACTCTATCAT	CGACAAACTG	GTTAACATCG
S E G	L S N	Y S I I	D K L	V N I
TTGACGACCT	GGTTGAATGC	GTTAAAGAAA	ACTCTTCTAA	AGACCTGAAA
V D D L	V E C	V K E	N S S K	D L K
AAATCTTTCA	AATCTCCGGA	ACCGCGTCTG	TTCACTCCGG	AAGAATTCTT
K S F	K S P E	P R L	FTP	E E F F
CCGTATCTTC	AACCGTTCCA	TCGACGCTTT	CAAAGACTTC	GTTGTTGCTT
RIF	N R S	I D A F	K D F	V V A
CCGAAACCTC	CGACTGCGTT	GTTTCCTCCA	CCCTGTCTCC	GGAAAAAGAC
S E T S	D C V	V S S	T L S P	E K D
TCCCGTGTTT	CGGTTACCAA	ACCGTTCATG	CTGCCGCCGG	TTGCTGCTTAA
S R V	S V T K	P F M	L P P	V A A *

·· ·· • ·

#· ··

Aminokyselinová sekvence a sekvence nukleové kyseliny pro SCF met 1-165 N10D je SEQ ID NO: 3 a 4 (DNA) a SEQ ID NO: 5 (aminokyselinová):

CATATGGAAGGTATCTGCAGGAATCGTGTGACTGACAATGTAAAAGACGTCACTAAATTG

1----------i----------+---------+---------+---------+---------+ 60

GTATACCTTCCATAGACGTCCTTAGCACACTGACTGTTACATTTTCTGCAGTGATTTAAC

MEGICRNRVTDNVKDVTKL

GTGGCAAATCTTCCAAAAGACTACATGATAACCCTCAAATATGTCCCCGGGATGGATGTT

61---------Ί-----------4----------1------------1-----------μ----------4 120

CACCGTTTAGAAGGTTTTCTGATGTACTATTGGGAGTTTATACAGGGGCCCTACCTACAA

VANLPKDYMITLKYVPGMDV

TTGCCAAGTCATTGTTGGATAAGCGAGATGGTAGTACAATTGTCAGACAGCTTGACTGAT 121 —------—4—— — — — — — ——+ — — —-----—+----— — — ~ — ·4— — — — — — 4.— — _ — — — — 4· 180

AACGGTTCAGTAACAACCTATTCGCTCTACCATCATGTTAACAGTCTGTCGAACTGACTA

LPSHCWISEMVVQLSDSLTD CTTCTGGACAAGTTTTCAAATATTTCTGAAGGCTTGAGTAATTATTCCATCATAGACAAA

181---------+---------+—-------+---------+---------+---------+ 240

GAAGACCTGTTCAAAAGTTTATAAAGACTTCCGAACTCATTAATAAGGTAGTATCTGTTT

LLDKFSNISEGLSNYSIIDK

CTTGTGAATATAGTGGATGACCTTGTGGAGTGCGTGAAAGAAAACTCATCTAAGGATCTA

241---------+---------+---------ί----------+----------1----------+ 300

GAACACTTATATCACCTACTGGAACACCTCACGCACTTTCTTTTGA,GTAGATTCCTAGAT

LVNIVDDLVECVKENSSKDL

AAAAAATCATTCAAGAGCCCAGAACCCAGGCTCTTTACTCCTGAAGAATTCTTCCGTATC

301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360

TTTTTTAGTAAGTTCTCGGGTCTTGGGTCCGAGAAATGAGGACTTCTTAAGAAGGCATAG

KKSFKSPEPRLFTPEEFFRI

TTCAACCGTTCCATCGACGCTTTCAAAGACTTCGTTGTTGCTTCCGAAACCTCCGACTGC

361---------+---------h----------+-------^:--+---------+---------+ 420

AAGTTGGCAAGGTAGCTGCGAAAGTTTCTGAAGCAACAACGAAGGCTTTGGAGGCTGACG FNRSIDAFKDFVV, -ASETSDC

GTTGTTTCCTCCACCCTGTCTCCGGAAAAAGACTCCCGTGTTTCGGTTACCAAACCGTTC 421 ----------1----------h-----------4---------+---------+---------+ 480

CAACAAAGGAGGTGGGACAGAGGCCTTTTTCTGAGGGCACAAAGCCAATGGTTTGGCAAG

VVSSTLSPEKDSRVSVTKPF

ATGCTGCCGCCGGTTGCTGCTTAATAGGATCC 481---------+---------4----------+ -- 512

TACGACGGCGGCCAACGACGAATTATCCTAGG

MLPPVAA**

Aminokyselinová sekvence a sekvence nukleové kyseliny pro SCF met 1-165 N10D, NUD je SEQ ID NO: 6 a 7 (DNA) a SEQ ID NO: 8 (aminokyselinová):

CATATGGAAGGTATCTGCAGGAATCGTGTGACTGACGATGTAAAAGACGTCACTAAATTG

1----------h----------h----------1-----------μ----------μ----------(- 60

GTATACCTTCCATAGACGTCCTTAGCACACTGACTGCTACATTTTCTGCAGTGATTTAAC

MEGICRNRVTDDVKDVTKL

GTGGCAAATCTTCCAAAAGACTACATGATAACCCTCAAATATGTCCCCGGGATGGATGTT 61---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

CACCGTTTAGAAGGTTTTCTGATGTACTATTGGGAGTTTATACAGGGGCCCTACCTACAA

VANLPKDYMITLKYVPGMDV

TTGCCAAGTCATTGTTGGATAAGCGAGATGGTAGTACAATTGTCAGACAGCTTGACTGAT 121 — — — — — h — —————— 4. — — — — — — 4·— — —---— — — + — — — — — — — — — 4- — — — H ISO

AACGGTTCAGTAACAACCTATTCGCTCTACCATCATGTTAACAGTCTGTCGAACTGACTA

LPSKCWISEMVVQLSDSLTD

CTTCTGGACAAGTTTTCAAATATTTCTGAAGGCTTGAGTAATTATTCCATCATAGACAAA 181---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

GAAGACCTGTTCAAAAGTTTATAAAGACTTCCGAACTCATTAATAAGGTAGTATCTGTTT

LLDKFSNISEGLSNYSIIDK

CTTGTGAATATAGTGGATGACCTTGTGGAGTGCGTGAAAGAAAACTCATCTAAGGATCTA

241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

GAACACTTATATCACCTACTGGAACACCTCACGCACTTTCTTTTGAGTAGATTCCTAGAT LVNIVDDL VECVKENSSKDL

AAAAAATCATTCAAGAGCCCAGAACCCAGGCTCTTTACTCCTGAAGAATTCTTCCGTATC

301 ---------+---------+---------+---------+----------1----------+ 360

TTTTTTAGTAAGTTCTCGGGTCTTGGGTCCGAGAAATGAGGACTTCTTAAGAAGGCATAG

KKSFKSPEPRLFTPEEFFRI

TTCAACCGTTCCATCGACGCTTTCAAAGACTTCGTTGTTGCTTCCGAAACCTCCGACTGC

361---------+---------+---------h-----------h---------h----------+ 420

AAGTTGGCAAGGTAGCTGCGAAAGTTTCTGAAGCAACAACGAAGGCTTTGGAGGCTGACG

FNRSIDAFKDFVVASETSDC

GTTGTTTCCTCCACCCTGTCTCCGGAAAAAGACTCCCGTGŤTTCGGTTACCAAACCGTTC

421---------j----------+---------+---------+---------+---------+ 480

CAACAAAGGAGGTGGGACAGAGGCCTTTTTCTGAC-GGCACAAAGCCAATGGTTTGGCAAG

VVSSTLSPEKDSRVSVTKPF

ATGCTGCCGCCGGTTGCTGCTTAATAGGATCC 481-------------------+---------+ — 512

TACGACGGCGGCCAACC-ACGAATTATCCTAGG

MLPPVAA* * ·· » 4 • ·

Charakterizace

Potvrzení identity SCF met 1 - 165 N10D a N10D, NUD bylo provedeno podle N-koncové aminokyselinové sekvence intaktních proteinů. Aminokyselinová sekvence SCF N10D byla určena jako

Met-Glu-Gly-Ile- (Cys) -Arg-Asn-Arg-Val-Thr-Asp-Asn-Val-Lys-----, zatímco sekvence SCF N10D, NUD byla určena jako

Met-Glu-Gly-Ile- (Cys) -Arg-Asn-Arg-Val-Thr-Asp-Asp-Val-Lys-----.

Tak určené sekvence obou přečištěných SCF N10D a NIOD, NUD odpovídají sekvencím předpokládaným z odpovídajících DNA sekvencí ukázaných v SEQ ID NO: 3 a 4 a SEQ ID NO: 6 a 7.

Příklad 3. Zvýšená biologická aktivita

Dále jsou uvedena data dokazující, že rekombinantní lidské analogy SCF N10D a N10D, NUD podle předkládaného vynálezu jsou přibližně o 50% více biologicky aktivní než nemodifikovaný rekombinantní lidský SCF 1 - 165.

Test biologické aktivity

In vitro UT-7 biotest byl proveden měřením stimulačního účinku SCF na proliferaci buněčné kultury megakaryocytů. Vychytávání ³H-thymidinu kultivovanými buňkami stimulovanými vzorky je ukazatelem biologické účinnosti SCF. Použité metody byly podle Smith et al., v Current Protocols in Immunology (Coligan, et al., vyd.) str. 6.17.1 až 6.17.11, John Wiley & Sons, New York).

Výsledky srovnání analogů podle předkládaného vynálezu s nemodifikovaným SCF met 1 - 165 jsou uvedeny níže.

• ·

Λ· · ·

Vzorek koncentrace způsobující % aktivity¹ polovinu maximální stimulace (ng/ml)

SCF met	1 -	165	5,4	100
SCF met N10D	1 -	165	3,5	154
SCF met	1 -	165	3,2	160

N10D, NUD ¹ Toto je určeno za použití koncentrace způsobující polovinu maximální stimulace pro standartní lidský rekombinantní SCF (5,4) dělené hodnotou pro variantu (3,5 nebo 3,2) a násobeno 100.

Tyto výsledky ukazují, že in vitro je biologická aktivita rekombinantních analogů lidského SCF1-165 N10D a N10D, NUD podle předkládaného vynálezu přibližně o 50% vyšší než aktivita přirozeného rekombinantního lidského SCF1-165.

Příklad 4. Zvýšená stabilita

Dále jsou uvedena data dokazující, že rekombinantní lidské analogy SCF podle předkládaného vynálezu jsou stabilnější v akcelerovaných testech stability než nemodifikovaný rekombinantní lidský SCF 1-165.

Testy stability. Komparativní akcelerovaná stabilita mezi SCF, SCF N10D a SCF N10D, NUD byla hodnocena inkubací vzorků ve 100 ·· • · · · · mM bikarbonatu sodného, pH 8,4 při 37 °C po dobu 1-5 dnů.

Sulfopropylová kationtová výměnná HPLC používající SP-5PW TSK gelových kolon byla provedena pro kvantifikaci množství zbývajících nedegradovaných forem a deamidačních produktů tvořených při skladování ve výše uvedeném pufru. Jak je ukázáno na obrázku 2, SCF N10D a SCF N10D, NUD jsou stejně stabilní během inkubace a vykazují lepší stabilitu než standartní SCF.

Ačkoliv byl vynález popsán ve smyslu svých výhodných provedení, je jasné, že odborníci v oboru mohou vytvořit jeho variace a modifikace. Proto by připojené patentové nároky měly pokrýt všechny takové ekvivalentní variace, které spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

·· ··

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel: Amgen Inc.

(ii) Název vynálezu: Přípravky obsahující SCF a způsoby jejich použití (iii) Počet sekvencí: 9

Adresa pro korespondenci
(A)	Adresa	: Amgen Inc.
(B)	Ulice:	1840 DeHavilland
(C)	Město:	Thousand Oaks
(D)	Stát:	California
(E)	Země:	USA
(F)	ZIP: 91320-1789

(v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (vi) Údaje o současné přihlášce:

(A) Číslo přihlášky: US 08/628428 (B) Datum podání: 5.4.1996 (C) Klasifikace:

• 4 44 44 4«

4 4 4 4 4

4 4 4 · 44

(vili) Zástupce/agent informace (A) Jméno: Knight, Matthew W (B) Registrační číslo: 36846 (C) Reference/číslo rejstříku: A-400 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 501 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 1:

ATGGAAGGTA	TCTGCCGTAA	CCGTGTTACT	AACAACGTTA	AAGACGTTAC	TAAACTGGTT	60
GCTAACCTGC	CGAAAGACTA	CATGATCACC	CTGAAATACG	TTCCGGGTAT	GGACGTTCTG	120
CCGTCTCACT	GCTGGATCTC	TGAAATGGTT	GTTCAGCTGT	CTGACTCTCT	GACTGACCTG	180
CTGGACAAAT	TCTCTAACAT	CTCTGAAGGT	CTGTCTAACT	ACTCTATCAT	CGACAAACTG	240
GTTAACATCG	TTGACGACCT	GGTTGAATGC	GTTAAAGAAA	ACTCTTCTAA	AGACCTGAAA	300
AAATCTTTCA	AATCTCCGGA	ACCGCGTCTG	TTCACTCCGG	AAGAATTCTT	CCGTATCTTC	360
AACCGTTCCA	TCGACGCTTT	CAAAGACTTC	GTTGTTGCTT	CCGAAACCTC	CGACTGCGTT	420
GTTTCCTCCA	CCCTGTCTCC	GGAAAAAGAC	TCCCGTGTTT	CGGTTACCAA	ACCGTTCATG	480

CTGCCGCCGG TTGCTGCTTA A

501 • · • · • · • · · » ·· ··· (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 166 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (ix) Vlastnosti (A) Jméno/klíč: Protein (B) Umístění: 1...166 (D) Jiné informace: Met sekvence začíná v pozici -1 SEQ ID NO: 2 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 2:

Met 1

Glu

Gly

Ile

Cys 5

Arg

Asn

Arg

Val

Thr 10

Asn

Val

Lys

Asp 15

Val

Thr

Lys

Leu

Val 20

Ala

Asn

Leu

Pro

Lys 25

Asp

Tyr

Met

Ile

Thr 30

Leu

Lys

Tyr

Val

Pro 35

Gly

Met

Asp

Val

Leu 40

Pro

Ser

His

Cys

Trp 45

Ile

Ser

Glu

Met

Val 50

Val

Gin

Leu

Ser

Asp 55

Ser

Leu

Thr

Asp

Leu 60

Leu

Asp

Lys

Phe

Ser

Asn

Ile

Ser

Glu

Gly

Leu

Ser

Asn

Tyr

Ser

Ile

Asp

Lys

Leu

70 75 80

Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser

85

90

95

Lys

Asp

Leu

Lys 100

Lys

Ser

Phe

Lys

Ser 105

Pro

Glu

Pro

Arg

Leu 110

Phe

Thr

Pro

Glu

Glu 115

Phe

Arg

Ile

Phe 120

Asn

Arg

Ser

Ile

Asp 125

Ala

Phe

Lys

Asp

Phe 130

Val

Ala

Ser

Glu 135

Thr

Ser

Asp

Cys

Val 140

Val

Ser

Thr

Leu 145

Ser

Pro

Glu

Lys

Asp 150

Ser

Arg

Val

Ser

Val 155

Thr

Lys

Pro

Phe

Met 160

T

* T _

η

♦ ·

(2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 512 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 3:

CATATGGAAG	GTATCTGCAG	GAATCGTGTG	ACTGACAATG	TAAAAGACGT	CACTAAATTG	60
GTGGCAAATC	TTCCAAAAGA	CTACATGATA	ACCCTCAAAT	ATGTCCCCGG	GATGGATGTT	120
TTGCCAAGTC	ATTGTTGGAT	AAGCGAGATG	GTAGTACAAT	TGTCAGACAG	CTTGACTGAT	180
CTTCTGGACA	AGTTTTCAAA	TATTTCTGAA	GGCTTGAGTA	ATTATTCCAT	CATAGACAAA	240
CTTGTGAATA	TAGTGGATGA	CCTTGTGGAG	TGCGTGAAAG	AAAACTCATC	TAAGGATCTA	300
AAAAAATCAT	TCAAGAGCCC	AGAACCCAGG	CTCTTTACTC	CTGAAGAATT	CTTCCGTATC	360
TTCAACCGTT	CCATCGACGC	TTTCAAAGAC	TTCGTTGTTG	CTTCCGAAAC	CTCCGACTGC	420
GTTGTTTCCT	CCACCCTGTC	TCCGGAAAAA	GACTCCCGTG	TTTCGGTTAC	CAAACCGTTC	480

ATGCTGCCGC CGGTTGCTGC TTAATAGGAT CC

512 • ·

(2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 512 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 4:

GTATACCTTC	CATAGACGTC	CTTAGCACAC	TGACTGTTAC	ATTTTCTGCA	GTGATTTAAC	60
CACCGTTTAG	AAGGTTTTCT	GATGTACTAT	TGGGAGTTTA	TACAGGGGCC	CTACCTACAA	120
AACGGTTCAG	TAACAACCTA	TTCGCTCTAC	CATCATGTTA	ACAGTCTC-TC	GAACTGACTA	180
GAAGACCTGT	TCAAAAGTTT	ATAAAGACTT	CCGAACTCAT	TAATAAGGTA	GTATCTGTTT	240
GAACACTTAT	ATCACCTACT	GGAACACCTC	ACGCACTTTC	TTTTGAGTAG	ATTCCTAGAT	300
TTTTTTAGTA	AGTTCTCGGG	TCTTGGGTCC	GAGAAATGAG	GACTTCTTAA	GAAGGCATAG	360
AAGTTGGCAA	GGTAGCTGCG	AAAGTTTCTG	AAGCAACAAC	GAAGGCTTTG	GAGGCTGACG	420
CAACAAAGGA	GGTGGGACAG	AGGCCTTTTT	CTGAGGGCAC	AAAGCCAATG	GTTTGGCAAG	480
TACGACGGCG	GCCAACGACG	AATTATCCTA	GG			512

(2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 166 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární » « ·· • · · 4 • · 44 ·· · · 4

4 4

44 (ii) Typ molekuly: protein (ix) Vlastnosti (A) Jméno/klíč: Protein (B) Umístění: 1...166 (D) Jiné informace: Met sekvence začíná v pozici -1 SEQ ID NO: 5 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 5:

Met Glu 1

Gly Ile

Cys Arg Asn Arg Val Thr Asp Asn Val

Lys

Asp 15

Val

5

10

Thr

Lys

Leu

Val

Ala

Asn

Leu

Pro

Lys

Asp

Tyr

Met

Ile

Thr

Leu

Lys

20

25

30

Tyr

Val

Pro

Gly

Met

Asp

Val

Leu

Pro

Ser

His

Cys

Trp

Ile

Ser

Glu

35

40

45

Met

Val

Gin

Leu

Ser

Asp

Ser

Leu

Thr

Asp

Leu

Asp

Lys

Phe

50

55

60

Ser

Asn

Ile

Ser

Glu

Gly

Leu

Ser

Asn

Tyr

Ser

Ile

Asp

Lys

Leu

65

70

75

80

Val

Asn

Ile

Val

Asp

Leu

Val

Glu

Cys

Val

Lys

Glu

Asn

Ser

85

90

95

Lys

Asp

Leu

Lys

Ser

Phe

Lys

Ser

Pro

Glu

Pro

Arg

Leu

Phe

Thr

100

105

110

Pro

Glu

Phe

Arg

Ile

Phe

Asn

Arg

Ser

Ile

Asp

Ala

Phe

Lys

115

120

125

Asp

Phe

Val

Ala

Ser

Glu

Thr

Ser

Asp

Cys

Val

Ser

Thr

130

135

140

Leu

Ser

Pro

Glu

Lys

Asp

Ser

Arg

Val

Ser

Val

Thr

Lys

Pro

Phe

Met

145

150

155

160

Leu Pro Pro Val Ala Ala 165 ·· •

999 • 9 • 9

9 9 *

• · · · 9

999 · (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 512 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 6:

TTGCCAAGTC ATTGTTGGAT AAGCGAGATG GTAGTACAAT TGTCAGACAG CTTGACTGAT 180

CTTCTGGACA AGTTTTCAAA TATTTCTGAA GGCTTGAGTA ATTATTCCAT CATAGACAAA 240

CTTGTGAATA TAGTGGATGA CCTTGTGGAG TGCGTGAAAG AAAACTCATC TAAGGATCTA 300

AAAAAATCAT TCAAGAGCCC AGAACCCAGG CTCTTTACTC CTGAAGAATT CTTCCGTATC 360

TTCAACCGTT CCATCGACGC TTTCAAAGAC TTCGTTGTTG CTTCCGAAAC CTCCGACTGC 420

GTTGTTTCCT CCACCCTGTC TCCGGAAAAA GACTCCCGTG TTTCGGTTAC CAAACCGTTC 480

ATGCTGCCGC CGGTTGCTGC TTAATAGGAT CC 512 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 512 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA • · • 9

99·· • 9 99 • · 9 • 9 · • 9·· • 9 9 • 9 99

99

9 9 9

9 99

999 9 9

9 9

99 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 7:

GTATACCTTC	CATAGACGTC	CTTAGCACAC	TGACTGCTAC	attttctgca	GTGATTTAAC	60
CACCGTTTAG	AAGGTTTTCT	GATGTACTAT	TGGGAGTTTA	TACAGGGGCC	CTACCTACAA	120
AACGGTTCAG	TAACAACCTA	TTCGCTCTAC	CATCATGTTA	ACAGTCTGTC	GAACTGACTA	180
GAAGACCTGT	TCAAAAGTTT	ATAAAGACTT	CCGAACTCAT	TAATAAGGTA	GTATCTGTTT	240
GAACACTTAT	ATCACCTACT	GGAACACCTC	ACGCACTTTC	TTTTGAGTAG	ATTCCTAGAT	300
TTTTTTAGTA	AGTTCTCGGG	TCTTGGGTCC	GAGAAATGAG	GACTTCTTAA	GAAGGCATAG	360
AAGTTGGCAA	GGTAGCTGCG	AAAGTTTCTG	AAGCAACAAC	GAAGGCTTTG	GAGGCTGACG	420
CAACAAAGGA	GGTGGGACAG	AGGCCTTTTT	CTGAGGGCAC	AAAGCCAATG	GTTTGGCAAG	480
TACGACGGCG	GCCAACGACG	AATTATCCTA	GG			512

(2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 166 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (ix) Vlastnosti (A) Jméno/klíč: Protein (B) Umístění: 1...166 (D) Jiné informace: Met sekvence začíná v pozici -1 SEQ ID NO: 8 ·· ·· • · · · • · · · • · · ··· • · · ·· • · ···· ·· ·· • · · · • · ·· • ···· · • 9 · «· ·· (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 8:

Met 1

Glu Gly

Ile

Cys Arg Asn Arg Val 5

Thr 10

Asp

Val

Lys

Asp 15

Val

Thr

Lys

Leu

Val

Ala

Asn

Leu

Pro

Lys

Asp

Tyr

Met

Ile

Thr

Leu

Lys

20

25

30

Tyr

Val

Pro

Gly

Met

Asp

Val

Leu

Pro

Ser

His

Cys

Trp

Ile

Ser

Glu

35

40

45

Met

Val

Gin

Leu

Ser

Asp

Ser

Leu

Thr

Asp

Leu

Asp

Lys

Phe

50

55

60

Ser

Asn

Ile

Ser

Glu

Gly

Leu

Ser

Asn

Tyr

Ser

Ile

Asp

Lys

Leu

65

70

75

80

Val

Asn

Ile

Val

Asp

Leu

Val

Glu

Cys

Val

Lys

Glu

Asn

Ser

85

90

95

Lys

Asp

Leu

Lys

Ser

Phe

Lys

Ser

Pro

Glu

Pro

Arg

Leu

Phe

Thr

100

105

110

Pro

Glu

Phe

Arg

Ile

Phe

Asn

Arg

Ser

Ile

Asp

Ala

Phe

Lys

115

120

125

Asp

Phe

Val

Ala

Ser

Glu

Thr

Ser

Asp

Cys

Val

Ser

Thr

130

135

140

Leu

Ser

Pro

Glu

Lys

Asp

Ser

Arg

Val

Ser

Val

Thr

Lys

Pro

Phe

Met

145

150

155

160

Leu

Pro

Val

Ala

165 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 274 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární • ·

(ii) Typ molekuly: protein (ix) Vlastnosti (A) Jméno/klíč: Protein (B) Umístění: 1...273 (D) Jiné informace: Poznámka: Zralý kompletní 1 - 248 SCF protein začíná v aminokyselině 26; aminokyseliny 1 - 25 obsahují Met a leader sekvence pro membránově vázanou formu lidského rekombinantního SCF

(xi)	) Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	9 :
Met	Lys Lys	Thr Gin Thr	Trp	Ile	Leu	Thr Cys Ile Tyr Leu Gin Leu
1		5				10 15
Leu	Leu Phe	Asn Pro Leu	Val	Lys	Thr	Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg
		20			25	30
Val	Thr Asn	Asn Val Lys	Asp	Val	Thr	Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro
	35			40		45
Lys	Asp Tyr	Met Ile Thr	Leu	Lys	Tyr	Val Pro Gly Met Asp Val Leu
	50		55			60
Pro	Ser His	Cys Trp Ile	Ser	Glu	Met	Val Val Gin Leu Ser Asp Ser
65		70				75 ' 80
Leu	Thr Asp	Leu Leu Asp	Lys	Phe	Ser	Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser
		85				90 95
Asn	Tyr Ser	Ile Ile Asp	Lys	Leu	Val	Asn Ile Val Asp Asp Leu Val
		100			105	110
Glu	Cys Val	Lys Glu Asn	Ser	Ser	Lys	Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys
	115			120		125
Ser	Pro Glu	Pro Arg Leu	Phe	Thr	Pro	Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe
	130		135			140
Asn	Arg Ser	Ile Asp Ala	Phe	Lys	Asp	Phe Val Val Ala Ser Glu Thr
145		150				155 160

• · • · ♦ · · · · · · ·· · • · ···· ···· • · · · · ··· · ···· · • · · · · · · · ·«·· ··· ·· ·· ·· ·· 32

Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg 165 170 175

Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser 180 185 190

Leu Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Asn Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro 195 200 205

Gly Asp Ser Ser Leu His Trp Ala Ala Met Ala Leu Pro Ala Leu Phe 210 215 220

Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly Ala Leu Tyr Trp Lys Lys Arg

225 230 235 240

Gin Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu Asn Ile Gin Ile Asn Glu Glu

245 250 255

Asp Asn Glu Ile Ser Met Leu Gin Glu Lys Glu Arg Glu Phe Glr. Glu 260 265 270

Claims

ZPa-fcentové n. a x~ o Je y

1. Analog SCF ve farmaceuticky přijatelném ředidle, přísadě nebo nosiči, který je vybrán ze skupiny skládající se z N10D a N10D, NUD.
2. Analog SCF podle nároku 1, kde uvedený N10D nebo uvedený N10D, NUD je analog rekombinantního lidského SCF vybraného ze skupiny skládající se z (podle číslování obrázku 1):

(a) jakéhokoliv SCF 1 - 138 až 1 - 248;

(b) SCF 1 - 127, 1 - 130 a 1 - 137;

(c) jakýchkoliv SCF bodů (a) nebo (b) majících C-terminální delece v pozicích 1, 2, 3 nebo 4 (a majících cystein zůstávající v pozici 4); a (d) jakýchkoliv SCF bodů (a), (b) nebo (c) majících N-terminální methionylový zbytek.
3. DNA molekula maj ící:

(a) DNA sekvenci danou v SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 6 (a komplementárních řetězcích);

(b) DNA sekvence bodu (a) kódující kyselinu asparagovou v pozici 10 a/nebo v pozici 11, modifikované tak, aby kódovaly jinou versi SCF mající alespoň jednu z hematopoetických biologických vlastností přirozeného lidského SCF.
4. DNA molekula kódující N10D nebo N10D, NUD, kde uvedený NI OD nebo uvedený NIOD, NUD je analog (podle číslování obrázku 1) :

(a) jakéhokoliv SCF 1 - 138 až 1 - 248;

(b) SCF 1 - 127, 1 - 130 a 1 - 137;

(c) jakýchkoliv SCF bodů (a) nebo (b) majících C-terminální delece v pozicích l, 2, 3 nebo 4 (a majících cystein zůstávající v pozici 4) ; a (d) jakýchkoliv SCF bodů (a), (b) nebo (c) majících N-terminální methionylový zbytek.
5. Způsob pro produkci analogu SCF N10D a/nebo N10D, NUD z hostitelské buňky obsahující nukleovou kyselinu kódující takový analog SCF vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) kultivaci uvedené hostitelské buňky obsahující molekulu DNA podle nároku 3 nebo nároku 4 za podmínek usnadňujících expresi takové molekuly DNA; a (b) získání takového analogu SCF.
6. DNA virový nebo plasmidový vektor obsahující molekulu DNA podle nároku 3 nebo 4.
7. Hostitelská buňka obsahující DNA podle nároku 3 nebo 4.
8. Hostitelská buňka podle nároku 7, kde uvedená hostitelská • · buňka je vybrána ze skupiny skládající se z bakterií, savčích buněk, kvasinek a hmyzích buněk.
9. Způsob pro léčbu hematopoetických onemocnění vyznačující se tím, že obsahuje podání účinného množství přípravku podle nároku 1 nebo 2 pacientovi, který potřebuje takovou léčbu.
10. Způsob pro léčbu podle nároku 9vyznačuj ící se t i m, že uvedené hematopoetické onemocnění je vybráno ze skupiny skládající se z: leukopenie, trombocytopenie, anemie, zlepšeného uchycení kostní dřeně po transplantaci, zlepšené regenerace kostní dřeně při radiační, chemickou nebo chemoterapeutickou léčbou indukované aplasii kostní dřeně nebo myelosupresi, a syndromu získané imunodeficience.
11. Způsob pro sensitizaci buněk k chemoterapii vyznačující se tím, že obsahuje podání účinného množství přípravku podle nároku 1 nebo 2 pacientovi, který potřebuje takovou léčbu.
12. Způsob pro léčbu poškození nervu, infertility nebo poškození střeva vyznačující se tím, že obsahuje podání účinného množství přípravku podle nároku 1 nebo 2 pacientovi, který potřebuje takovou léčbu.
13. Způsob pro kultivaci hematopoetických buněk in vitro vyznačující se tím, že obsahuje:

(i) umístění vhodných buněk ve vhodném kultivačním mediu, kde uvedené kultivační medium obsahuje přípravek analogu SCF N10D nebo N10D, NUD, kde uvedený analog je modifikovanou formou rekombinantního lidského SCF vybraného ze skupiny skládající se z (podle číslování obrázku 1):

(a) jakéhokoliv rekombinantního lidského SCF 1 - 138 až 1

- 248;

(b) rekombinantního lidského SCF 1 - 127, l - 130 a l - 137;

(c) jakýchkoliv rekombinantních lidských SCF bodů (a) nebo (b) majících C-terminální delece v pozicích 1, 2, 3 nebo 4 (a majících cystein zůstávající v pozici 4); a (d) jakýchkoliv rekombinantních lidských SCF bodů (a) , (b) nebo (c) majících N-terminální methionylový zbytek; a (ii) poskytnutí vhodných podmínek pro kultivaci uvedených hematopoetických buněk.
14. Způsob pro transfekci hematopoetických buněk exogenní DNA, vyznačující se tím, že obsahuje:

(i) kultivaci uvedených hematopoetických buněk v mediu obsahujícím analog SCF N10D nebo N10D, NUD, kde uvedený analog je modifikovanou formou rekombinantního lidského SCF vybraného ze skupiny skládající se z (podle číslování obrázku 1):

(a) jakéhokoliv rekombinantního lidského SCF 1 - 138 až 1

- 248;

(b) rekombinantního lidského SCF 1 - 127, 1 - 130 a 1 - 137;

• · · · · ··· « · · · · · » ···· · • · · · · · « · ·« · · · · (c) jakýchkoliv rekombinantních lidských SCF bodů (a) nebo (b) majících C-terminální delece v pozicích 1, 2, 3 nebo 4 (a majících cystein zůstávající v pozici 4); a (d) jakýchkoliv rekombinantních lidských SCF bodů (a) , (b) nebo (c) majících N-terminální methionylový zbytek; a (ii) transfekci uvedených kultivovaných buněk exogenní DNA.
15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedené hematopoetické buňky jsou buňky kostní dřeně nebo progenitorové buňky periferní krve.
16. Způso podle jakéhokoliv z nároků 9 až 15 vyznačující se tím, že uvedená léčba nebo kultivace zahrnuje použití alespoň jednoho dalšího faktoru vybraného ze skupiny skládající se z EPO, G-CSF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IGF-1, LIF, interferonu, neurotrofních faktorů, flt-3/flk-2 ligandu a fibroblastového růstového faktoru.
17. Kit obsahující složky pro kultivaci hematopoetických buněk skládající se z:

(i) analog SCF N10D nebo N10D, NUD, kde uvedený analog je modifikovanou formou rekombinantního lidského SCF vybraného ze skupiny skládající se z (podle číslování obrázku 1):

(a) jakéhokoliv rekombinantního lidského SCF 1 - 138 až 1 - 248;

• · · » (b) rekombinantního lidského SCF 1 - 127, 1 - 130 a 1 - 137;

(c) jakýchkoliv rekombinantních lidských SCF bodů (a) nebo (b) majících C-terminální delece v pozicích 1, 2, 3 nebo 4 (a majících cystein zůstávající v pozici 4); a (d) jakýchkoliv rekombinantních lidských SCF bodů (a), (b) nebo (c) majících N-terminální methionylový zbytek;

(ii) složek vhodných pro přípravu media pro kultivaci buněk kostní dřeně nebo progenitorových buněk periferní krve; a (iii) volitelně alespoň jednoho dalšího faktoru vybraného ze skupiny skládající se z EPO, G-CSF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IGF-1, LIF, interferonu, neurotrofních faktorů, flt-3/flk-2 ligandu a fibroblastového růstového faktoru.

WO 97/38101

1/3