JPH0468914B2 - - Google Patents
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、酵素の水不溶性担体への固定化方法
に関する。 〔従来の技術〕 酵素反応は医薬品、食品等の製造過程で工業的
に広く用いられているが、従来酵素を基質の水溶
液に溶解させて、溶液中で反応を行わせている。
しかしこのような方法では、反応条件を一定に維
持しつつ、新鮮な酵素を補給したり、反応後に酵
素を回収する操作等が著しく複雑であるばかりで
なく、反応生成物の分離、精製も又著しく煩雑な
操作となる。このような欠点を解消する為に、近
年酵素を不溶性担体に固定化して酵素反応を連続
的に行なうことが検討されている。 酵素の固定化法としては、１担体共有結合法、
２物理的吸着法もしくはイオン結合法、３架橋
法、４包括法等が知られている。 これらの固定化法のうち、１の担体共有結合法
は担体と酵素との結合力は比較的強いが、反応条
件の設定が難しく、一般に高活性の固定化酵素を
得るのが難しい。又２の物理的吸着法もしくはイ
オン結合法は、簡単な操作で、しかも温和な条件
で固定化出来る為、比較的高活性な固定化酵素が
得られるが、担体と酵素との結合力が弱い為、担
体より酵素が脱離し易い欠点がある。 ３の架橋法は、比較的苛酷な条件で反応させる
為、活性の低い固定化酵素しか得られない難点が
あり、又４の包括法は一般に簡単かつ低廉に製造
出来る利点があるが、水溶性重合体を架橋、ゲル
化させる際に酵素活性の低下を免れないことの
他、生成したゲルより酵素が脱離し易い欠点もあ
る。 １の担体共有結合法に関連するものには、例え
ば、担体表面の官能基（−NH2，−COOH等）と
酵素分子中の−NH2，−COOH等との間で多官能
性架橋剤や縮合試薬によりシツフ塩基やペプチド
結合を形成させる方法が挙げられる。アミノ基含
有担体を架橋剤グルタルアルデヒドで活性化した
後、グルコアミラーゼを固定化する方法について
は、スターチ／スターク33（1981）エヌアール．
２，エス．52−55（Starch／Starke 33（1981）
Nr.2.S.52−55）に記載されており、さらに、グ
ルコアミラーゼの固定化をアミノ化シリカゲルに
グルタルアルデヒドで固定化して行なうことが、
エンザム マイクロバイオロジー テクノロジ
ー、1982、第４巻、３月 第89−第92頁
（Enzyme Microb.Technol.，1982，Vol.4，
March p89−92）に記載されている。しかし、
この方法により得られた酵素の活性が半減するま
で安定糖化時間は短いため、例えば、反応槽を並
列に多数設け、逐次反応槽を切り換える方式等を
とらなければ長時間に亘る連続糖化はできず、こ
れでは装置、操作が複雑になる上、頻繁な酵素の
取り換えが必要であつた。 〔発明が解決しようとする問題点〕 上記従来技術、特に、担体共有結合法において
担体表面と酵素との親和性について十分な配慮が
されておらず、共有結合反応条件の設定が複雑
で、高活性の固定化酵素を得るのが難しい等の問
題があつた。 本発明の目的は担体表面と酵素との簡単な共有
結合反応により、高活性、かつ高安定性の固定化
酵素を得ることにある。 〔問題点を解決するための手段〕 上記目的は、多官能架橋剤による担体表面と酵
素との共有結合反応において、表面官能基がアル
ノ基であるアミノ化シリカゲル担体を用い、かつ
酵素に対し特異的な吸着能を有する物質の存在下
で共有結合反応を進行させることにより、達成さ
れる。 即ち、第１の発明の特徴は、酵素含有水溶液か
ら酵素を分子中にアミノ基を含有する水不溶性担
体に固定化する方法において、上記固定化は、多
価フエノールカルボン酸の存在下で、多官能性架
橋剤による酵素とアミノ化シリカゲル担体との共
有結合反応により行なうことを特徴とする酵素の
固定化方法にある。 第２の発明の特徴は、酵素含有水溶液から酵素
を分子中にアミノ基を含有する水不溶性担体に固
定化する方法において、上記固定化は、多価フエ
ノールカルボン酸及びキトサンの存在下で、多官
能性架橋剤による酵素とアミノ化シリカゲル担体
との共有結合反応により行なうことを特徴とする
酵素の固定化方法にある。 第３の発明の特徴は、分子中にアミノ基を含有
する水不溶性担体と酵素含有水溶液に含まれる酵
素との間で多官能性架橋剤によりシツフ塩基を形
成させて酵素を固定化する方法において、上記シ
ツフ塩基形成を多価フエノールカルボン酸の存在
下で、アミノ化シリカゲル担体を用いて行なうこ
とを特徴とする酵素の固定化方法にある。 第４の発明の特徴は、分子中にアミノ基を含有
する水不溶性担体と酵素含有水溶液に含まれる酵
素との間で多官能性架橋剤によりシツフ塩基を形
成させて酵素を固定化する方法において、上記シ
ツフ塩基形成を多価フエノールカルボン酸及びキ
トサンの存在下で、アミノ化シリカゲル担体を用
いて行なうことを特徴とする酵素の固定化方法に
ある。 水不溶性アミノ基含有担体としてはシリカゲ
ル、多孔性ガラス、ゼオライト等をアミノシラン
誘導体を用いるシランカツプリング反応によりア
ミノ基を導入したアミノ化担体やキチンを脱アセ
チル化したキトサンを架橋し不溶化したアミノ多
糖担体等がある。 本発明では後述の実施例に示すようにアミノ化
シリカゲルを用いて好結果を得た。 この担体の表面官能基であるアミノ基と酵素を
共有結合させる方法は酵素中のアミノ基との間で
シツフ塩基を形成させる方法が好ましい。シツフ
塩基の形成は、例えば、多官能架橋剤としてグル
タルアルデヒドを用いれば(1)式で表わされる。多
官能架橋剤としてはグルタルアルデヒド、ジアル
デヒド澱粉、マロンアルデヒド、コハク酸アルデ
ヒド等のポリアルデヒド類があるが、特にグルタ
ルアルデヒドが好ましい。 担当 −NH2＋OHC（CH2）3CHO＋H2Ｎ− 酵素
→ 担体 −Ｎ＝CH（CH2）3CH＝Ｎ− 酵素
……(1) 一方、酵素に対し、特異的な吸着能を有する物
質としては多価フエノールカルボン酸、例えばタ
ンニン酸、ピロガロールタンニン、カテコール等
や、キチン誘導体であるキトサンが挙げられる。
多価フエノールカルボン酸では特にタンニン酸が
好ましい。 本発明に用いられる酵素は、タンニン酸やキト
サンに活性を失うことなく吸着されるものであれ
ば如何なるものでも良く、例えば、グルコアミラ
ーゼ、αーアミラーゼ、グルタミン酸脱炭酸酵素
等がある。 酵素含有水溶液にアミノ基含有担体、多官能架
橋剤と多価フエノールカルボン酸又は多価フエノ
ールカルボン酸とキトサンを共存させ、５〜40℃
で数時間反応させることにより目的とする固定化
酵素を得る。 アミノ酸含有担体の形状はグラニユー状又はビ
ーズ状であつて、その大きさは0.1〜５mm程度の
ものが好ましい。特に好ましいのは0.2mm〜0.5mm
程度のものである。あまり大きいと空隙間体積が
大きくなり体積当りの活性は小さくなる。一方、
あまり細かいと圧損が大きくなり過ぎたり、ある
いは固定化酵素と反応液の分離が難かしくなつた
りして好ましくない。 酵素固定化時のpHは酵素の失活のおこらない
範囲、温度は熱失活が起らない範囲の温度であれ
ばよいが、実際的には５〜40℃の範囲がよい。反
応時間は１〜10時間でよく、反応温度が高い場合
は短時間でよいが、振とう、あるいは攪拌を行う
のが効率的である。又、固定時酵素等を含む溶液
量は担体５〜10倍であればよい。溶液量があまり
少ないと反応時の振とう、あるいは攪拌によつて
担体の破損を生じ易くなる。一方、溶液量が多く
なると固定化反応率は減少してくる。 なお、高活性の固定化酵素を得るには、多官能
性架橋剤を反応せしめた後、適当な緩衝液により
酵素固定化担体を十分洗浄し、不十分な結合の為
に離脱しやすい酵素および余剰の多官能性架橋剤
や酵素吸着剤は除去した方がよい。 担体表面のアミノ基と酵素分子中のアミノ基と
の間で多官能架橋剤、グルタルアルデヒドにより
シツフ塩基を形成させ酵素を固定化する方法にお
いてシツフ塩基形成反応を迅速、かつ完全に進行
させるためには、多官能性架橋剤であるグルタル
アルデヒドは化学量論以上存在させる必要があ
る。ところが多量の多官能性架橋剤の共存は酵素
分子の一部が化学修飾を受け、タンパク質の高次
構造や活性中心が破壊され酵素の失活を招くた
め、この様な固定化方法で高活性の固定化酵素を
得るのは難しい。このため、やむを得ず一般に
は、アミノ基含有担体をあらかじめ過剰の多官能
性架橋剤で処理し、担体を活性化した後、未反応
の多官能性架橋剤を除去し、次に酵素を反応させ
固定化する方法がとられている。しかし、この方
法は担体のアミノ基間の架橋反応がかなり進行
し、酵素と反応する官能基が減少するため酵素の
固定化量が減少し得られる酵素固定化担体の活性
は一般に低い欠点がある。 多官能性架橋剤による担体のアミノ基と酵素の
共有結合反応において、酵素に対し特異的な吸着
能を有する物質、例えばタンニン酸等の多価フエ
ノールカルボン酸やキトサンをあらかじめ共存さ
せておくと、多官能性架橋剤が過剰に存在しても
酵素の失活が防げ、高活性で、かつ安定性の高い
固定化酵素が得られることが分つた。 〔作用〕 多価フエノールカルボン酸を用いた固定化酵素
の活性が高いのは、酵素に対して特異的な吸着能
を示す多価フエノールカルボン酸が、より多くの
酵素を吸着し、その高次構造が安定化され、多官
能性架橋剤による失活が防止されると共に多官能
性架橋剤の多官能基により担体のアミノ基と酵素
のアミノ基とが結合され担体に酵素が強固に固定
化されるためであると考えられる。 また、キトサンを併用した固定化酵素がさらに
高活性であるのは、キトサンは塩基性の多糖類で
あり酵素に対し強い吸着能を有しているためキト
サンが多価フエノールカルボン酸と共存すると酵
素は両者に共有した状態で吸着され、その高次構
造がより一層強固となるためと考えられる。 〔実施例〕 以下、主に澱粉の糖化に用いられるアスペルギ
ルスニガー起源のグルコアミラーゼの固定化方法
について実施例を挙げて本発明を具体的に示す。
次に、α−アミラーゼ、グルタミン酸脱炭酸酵素
の固定化方法について示す。 ＜グルコアミラーゼの固定化＞ シルカゲル（粒径0.3φ、細孔径500Å）をトル
エン中でγ−アミノトリエントキシシランにより
アミノ化した担体（SiO2−NH2と記す）１mlと
グルコアミラーゼ0.5ml（3000U／ml）含有水溶
液（0.05M酢酸緩衝液pH4.5）10mlを室温で４時
間接触させ固定化を行つた後、0.05M酢酸緩衝液
（pH4.5）で洗浄し、過剰のグルコアミラーゼを
除去し、固定化グルコアミラーゼを得た。なお、
固定化反応時、適宜、グルタルアルデヒド、タン
ニン酸、キトサンを加え安定な固定化を試みた。 ＜グルコアミラーゼ固定化担体の活性測定＞ 30％デキストリン水溶液（pH4.5）15mlとグル
コアミラーゼ固定化担体１mlを60℃で10分間振と
う接触させた後、生成したグルコース濃度を測定
した。なお基質として使用したデキストリン還元
糖は18％であつた。 ＜グルコアミラーゼ固定化担体の熱安定性試験＞ 30％グルコース水溶液（pH4.5）15mlとグルコ
アミラーゼ固定化担体１mlを60℃で接触させ熱処
理を行つた後、固定化担体の残存活性を測定し
た。 ＜デキストリンの連続糖化＞ グルコアミラーゼ固定化担体20mlを55℃に保温
したカラム（内径16φ）に充填し、30％デキスト
リン水溶液（pH4.5）流速１ml／minで通液し、
デキストリンの連続糖化を行つた。 第１図は多官能性架橋試薬グルタルアルデヒド
を用いてアミノ化シリカゲルにグルコアミラーゼ
を固定化した場合のグルタルアルデヒド濃度と固
定化担体の活性との関係を示したものである。本
発明の多価フエノールカルボン酸の一つであるタ
ンニン酸が共存した場合は広いグルタルアルデヒ
ド濃度範囲で高活性の固定化担体が得られる。こ
れに対し、タンニン酸が存在しない場合は、固定
化担体の活性はグルタルアルデヒド濃度の影響を
強くうけ、最適グルタル濃度範囲は非常に狭い。
そしてグルタルアルデヒド濃度の増加に伴ない固
定化担体の活性は急激に低下する。周知のように
多くの酵素は有機溶媒により変性を受け失活す
る。タンニン酸が存在しない場合の固定化担体の
低活性はグルタルアルデヒドによりグルコアミラ
ーゼが失活したことによるものである。これによ
り、最適グルタルアルデヒド濃度は(1)式で示され
る化学当量であることが分る。グルタルアルデヒ
ドによるグルコアミラーゼの失活防止には、ごく
少量のタンニン酸の共存でよく、好ましくは0.1
％以上、数％であつた。これより、グルタルアル
デヒドによるアミノ化担体と酵素グルコアミラー
ゼの共有結合反応時にタンニン酸を存在させてお
けば、酵素を失活させることなく十分量のグルタ
ルアルデヒドにより、反応は迅速、かつ完全に進
行するため、高活性で安定性に優れたグルコアミ
ラーゼ固定化担体が得られることがわかつた。 第２図はアミノ化シリカゲル（SiO2−NH2）
へのグルコアミラーゼ固定化法の比較を示したも
のである。従来法のグルタルアルデヒド（GA）
のみを用いる方法に比べ、タンニン酸、没食子酸
およびカテコール等の多価フエノールカルボン酸
を用いた方法では活性が高いことがわかる。 第３図はグルコアミラーゼ固定化担体の熱安定
性を示したものである。タンニン酸、没食子酸お
よびカテコール等の多価フエノールカルボン酸を
用いた固定化担体の活性は高いが、多価フエノー
ルカルボン酸のみでは、これら吸着したグルコア
ミラーゼが単に担体表面に沈着しているため、長
時間の熱処理によりグルコアミラーゼの脱離が容
易に起り、残存活性は急激に低下し好ましくな
い。一方、従来のグルタルアルデヒト用いた固定
化担体では、グルコアミラーゼが担体のアミノ基
と共有結合により固定化されているため、グルコ
アミラーゼの脱離はおこりにくく、失活は主に熱
変性に伴なうものであり、熱処理による残存活性
の低下はかなり軽減する。これに対し、本発明の
多価フエノールカルボン酸とグルタルアルデヒド
を用いた固定化担体では、更に残存活性の低下は
少なく、熱安定性に優れていることが分る。 第４図はグルコアミラーゼ固定化担体によるデ
キストリンの連続糖化試験結果を示したものであ
る。従来法のグルタルアルデヒドによる固定化グ
ルコアミラーゼに比べ本発明の多価フエノールカ
ルボン酸の一つであるタンニン酸とグルタルアル
デヒドを併用し固定化した固定化グルコアミラー
ゼでは安定糖化時間は約２倍延びている。更に、
キチン誘導体の一つであるキトサンを併用した固
定化グルコアミラーゼでは安定糖化時間は約３倍
になつている。 更に、タンニン酸のみの場合、酵素環境は酸性
雰囲気にあるのに対し、キトサン併用では酵素環
境は中性雰囲気となり、この状態が固定化グルコ
アミラーゼの熱安定性に好影響を及ぼしているも
のと考えられる。キトサンの添加量は固定化条件
によるが、0.01〜0.1程度で十分な効果が認めら
れる。 実施例 ２ アミノ化シリカゲン１mlにα−アミラ−ゼ0.5
ml含有水溶液（pH7.0）10mlを加え、続いてタン
ニン酸（１％）、グルタルアルデヒド（0.5％）を
加え、室温で４時間接触させα−アミラ−ゼを固
定化した。 この固定化α−アミラ−ゼの活性を以下の方法
により測定した。 ばれいしよでんぷん30％（pH7、Ca＋＋
3mM）水溶液15mlと固定化α−アミラ−ゼ１ml
を80℃で20分間接触させ生成した還元糖を測定し
た。 活性半減期は、80℃水溶液（pH7.0）中での処
理を行つたときの50％残存活性の時間である。 比較例 ２ アミノ化シリカゲン１mlにα−アミラ−ゼ0.5
ml含有水溶液（pH7.0）10mlを加え、続いてグル
タルアルデヒド（0.5％）を加え、室温で４時間
接触させα−アミラ−ゼを固定化した。 実施例 ３ アミノ化シリカゲル１mlにグルタミン酸脱炭酸
酵素20mg含有水溶液（pH5.0）を加え、続いて
タンニン酸（１％）、グルタルアルデヒド（0.5
％）を加え、室温で２時間接触させグルタミン酸
脱炭酸酵素を固定化した。 この固定化酵素の活性は以下の方法により測定
した。 グルタミン酸0.05M（pH5.0）水溶液15mlと固定
化酵素１mlを37℃で30分間接触させ生成したγ−
アミノ酪酸を測定した。 活性半減期は、45℃水溶液（pH5.0）中での処
理を行つたときの50％残存活性の時間である。 比較例 ３ アミノ化シリカゲン１mlにグルタミン酸脱炭酸
酵素20mg含有水溶液（pH5.0）を加え、続いて
グルタルアルデヒド（0.5％）を加え、室温で２
時間接触させグルタミン酸脱炭酸酵素を固定化し
た。 実施例 ４ アミノ化シリカゲン１mlにグルコースイソメラ
ーゼ50mg含有水溶液（pH7.5）10mlを加え、続
いてタンニン酸（１％）、グルタルアルデヒド
（0.5％）を加え、室温で４時間接触させグルコー
スイソメラーゼを固定化した。 この固定化グルコースイソメラーゼの活性を以
下の方法により測定した。 グルコース30％（pH7.5，Mg＋＋0.01M）水
溶液15mlと固定化グルコースイソメラーゼ１mlを
65℃で１時間接触させ生成したフラクトースを測
定した。 活性半減期は70℃水溶液（pH7.5）中での処理
を行つたときの50％残存活性の時間である。 比較例 ４ アミノ化シリカゲル１mlにグルコースイソメラ
ーゼ50mg含有水溶液（pH7.5）10mlを加え、続
いてグルタルアルデヒド（0.5％）を加え、室温
で４時間接触させグルコースイソメラーゼを固定
化した。 実施例 ５ アミノ化シリカゲル１mlにイヌラーゼ100mg含
有水溶液（pH6.0）10mlを加え、続いて、タンニ
ン酸（１％）、グルタルアルデヒド（0.5％）を加
え、室温で４時間接触させイヌラーゼを固定化し
た。 この固定化イヌラーゼの活性を以下の方法によ
り測定した。 イヌリン10％（pH6.0）水溶液15mlと固定化イ
ヌラーゼ１mlを40℃で30分間接触させ生成したフ
ラクトースを測定した。 活性半減期は45℃水溶液（pH6.0）中での処理
を行つたときの50％残存活性の時間である。 比較例 ５ アミノ化シリカゲル１mlにイヌラーゼ100mg含
有水溶液（pH6.0）10mlを加え、続いて、グルタ
ルアルデヒド（0.5％）を加え、室温で４時間接
触させイヌラーゼを固定化した。 実施例２，３，４及び５、比較例２，３，４及
び５の初期活性と活性半減期を第１表に示す。多
官能性架橋剤グルタルアルデヒドを用い、酵素を
アミノ基含有担体に共有結合により固定化する場
合、タンニン酸の共存が固定化酵素の初期活性の
向上と熱安定性の増加に有効であることがわか
る。
に関する。 〔従来の技術〕 酵素反応は医薬品、食品等の製造過程で工業的
に広く用いられているが、従来酵素を基質の水溶
液に溶解させて、溶液中で反応を行わせている。
しかしこのような方法では、反応条件を一定に維
持しつつ、新鮮な酵素を補給したり、反応後に酵
素を回収する操作等が著しく複雑であるばかりで
なく、反応生成物の分離、精製も又著しく煩雑な
操作となる。このような欠点を解消する為に、近
年酵素を不溶性担体に固定化して酵素反応を連続
的に行なうことが検討されている。 酵素の固定化法としては、１担体共有結合法、
２物理的吸着法もしくはイオン結合法、３架橋
法、４包括法等が知られている。 これらの固定化法のうち、１の担体共有結合法
は担体と酵素との結合力は比較的強いが、反応条
件の設定が難しく、一般に高活性の固定化酵素を
得るのが難しい。又２の物理的吸着法もしくはイ
オン結合法は、簡単な操作で、しかも温和な条件
で固定化出来る為、比較的高活性な固定化酵素が
得られるが、担体と酵素との結合力が弱い為、担
体より酵素が脱離し易い欠点がある。 ３の架橋法は、比較的苛酷な条件で反応させる
為、活性の低い固定化酵素しか得られない難点が
あり、又４の包括法は一般に簡単かつ低廉に製造
出来る利点があるが、水溶性重合体を架橋、ゲル
化させる際に酵素活性の低下を免れないことの
他、生成したゲルより酵素が脱離し易い欠点もあ
る。 １の担体共有結合法に関連するものには、例え
ば、担体表面の官能基（−NH2，−COOH等）と
酵素分子中の−NH2，−COOH等との間で多官能
性架橋剤や縮合試薬によりシツフ塩基やペプチド
結合を形成させる方法が挙げられる。アミノ基含
有担体を架橋剤グルタルアルデヒドで活性化した
後、グルコアミラーゼを固定化する方法について
は、スターチ／スターク33（1981）エヌアール．
２，エス．52−55（Starch／Starke 33（1981）
Nr.2.S.52−55）に記載されており、さらに、グ
ルコアミラーゼの固定化をアミノ化シリカゲルに
グルタルアルデヒドで固定化して行なうことが、
エンザム マイクロバイオロジー テクノロジ
ー、1982、第４巻、３月 第89−第92頁
（Enzyme Microb.Technol.，1982，Vol.4，
March p89−92）に記載されている。しかし、
この方法により得られた酵素の活性が半減するま
で安定糖化時間は短いため、例えば、反応槽を並
列に多数設け、逐次反応槽を切り換える方式等を
とらなければ長時間に亘る連続糖化はできず、こ
れでは装置、操作が複雑になる上、頻繁な酵素の
取り換えが必要であつた。 〔発明が解決しようとする問題点〕 上記従来技術、特に、担体共有結合法において
担体表面と酵素との親和性について十分な配慮が
されておらず、共有結合反応条件の設定が複雑
で、高活性の固定化酵素を得るのが難しい等の問
題があつた。 本発明の目的は担体表面と酵素との簡単な共有
結合反応により、高活性、かつ高安定性の固定化
酵素を得ることにある。 〔問題点を解決するための手段〕 上記目的は、多官能架橋剤による担体表面と酵
素との共有結合反応において、表面官能基がアル
ノ基であるアミノ化シリカゲル担体を用い、かつ
酵素に対し特異的な吸着能を有する物質の存在下
で共有結合反応を進行させることにより、達成さ
れる。 即ち、第１の発明の特徴は、酵素含有水溶液か
ら酵素を分子中にアミノ基を含有する水不溶性担
体に固定化する方法において、上記固定化は、多
価フエノールカルボン酸の存在下で、多官能性架
橋剤による酵素とアミノ化シリカゲル担体との共
有結合反応により行なうことを特徴とする酵素の
固定化方法にある。 第２の発明の特徴は、酵素含有水溶液から酵素
を分子中にアミノ基を含有する水不溶性担体に固
定化する方法において、上記固定化は、多価フエ
ノールカルボン酸及びキトサンの存在下で、多官
能性架橋剤による酵素とアミノ化シリカゲル担体
との共有結合反応により行なうことを特徴とする
酵素の固定化方法にある。 第３の発明の特徴は、分子中にアミノ基を含有
する水不溶性担体と酵素含有水溶液に含まれる酵
素との間で多官能性架橋剤によりシツフ塩基を形
成させて酵素を固定化する方法において、上記シ
ツフ塩基形成を多価フエノールカルボン酸の存在
下で、アミノ化シリカゲル担体を用いて行なうこ
とを特徴とする酵素の固定化方法にある。 第４の発明の特徴は、分子中にアミノ基を含有
する水不溶性担体と酵素含有水溶液に含まれる酵
素との間で多官能性架橋剤によりシツフ塩基を形
成させて酵素を固定化する方法において、上記シ
ツフ塩基形成を多価フエノールカルボン酸及びキ
トサンの存在下で、アミノ化シリカゲル担体を用
いて行なうことを特徴とする酵素の固定化方法に
ある。 水不溶性アミノ基含有担体としてはシリカゲ
ル、多孔性ガラス、ゼオライト等をアミノシラン
誘導体を用いるシランカツプリング反応によりア
ミノ基を導入したアミノ化担体やキチンを脱アセ
チル化したキトサンを架橋し不溶化したアミノ多
糖担体等がある。 本発明では後述の実施例に示すようにアミノ化
シリカゲルを用いて好結果を得た。 この担体の表面官能基であるアミノ基と酵素を
共有結合させる方法は酵素中のアミノ基との間で
シツフ塩基を形成させる方法が好ましい。シツフ
塩基の形成は、例えば、多官能架橋剤としてグル
タルアルデヒドを用いれば(1)式で表わされる。多
官能架橋剤としてはグルタルアルデヒド、ジアル
デヒド澱粉、マロンアルデヒド、コハク酸アルデ
ヒド等のポリアルデヒド類があるが、特にグルタ
ルアルデヒドが好ましい。 担当 −NH2＋OHC（CH2）3CHO＋H2Ｎ− 酵素
→ 担体 −Ｎ＝CH（CH2）3CH＝Ｎ− 酵素
……(1) 一方、酵素に対し、特異的な吸着能を有する物
質としては多価フエノールカルボン酸、例えばタ
ンニン酸、ピロガロールタンニン、カテコール等
や、キチン誘導体であるキトサンが挙げられる。
多価フエノールカルボン酸では特にタンニン酸が
好ましい。 本発明に用いられる酵素は、タンニン酸やキト
サンに活性を失うことなく吸着されるものであれ
ば如何なるものでも良く、例えば、グルコアミラ
ーゼ、αーアミラーゼ、グルタミン酸脱炭酸酵素
等がある。 酵素含有水溶液にアミノ基含有担体、多官能架
橋剤と多価フエノールカルボン酸又は多価フエノ
ールカルボン酸とキトサンを共存させ、５〜40℃
で数時間反応させることにより目的とする固定化
酵素を得る。 アミノ酸含有担体の形状はグラニユー状又はビ
ーズ状であつて、その大きさは0.1〜５mm程度の
ものが好ましい。特に好ましいのは0.2mm〜0.5mm
程度のものである。あまり大きいと空隙間体積が
大きくなり体積当りの活性は小さくなる。一方、
あまり細かいと圧損が大きくなり過ぎたり、ある
いは固定化酵素と反応液の分離が難かしくなつた
りして好ましくない。 酵素固定化時のpHは酵素の失活のおこらない
範囲、温度は熱失活が起らない範囲の温度であれ
ばよいが、実際的には５〜40℃の範囲がよい。反
応時間は１〜10時間でよく、反応温度が高い場合
は短時間でよいが、振とう、あるいは攪拌を行う
のが効率的である。又、固定時酵素等を含む溶液
量は担体５〜10倍であればよい。溶液量があまり
少ないと反応時の振とう、あるいは攪拌によつて
担体の破損を生じ易くなる。一方、溶液量が多く
なると固定化反応率は減少してくる。 なお、高活性の固定化酵素を得るには、多官能
性架橋剤を反応せしめた後、適当な緩衝液により
酵素固定化担体を十分洗浄し、不十分な結合の為
に離脱しやすい酵素および余剰の多官能性架橋剤
や酵素吸着剤は除去した方がよい。 担体表面のアミノ基と酵素分子中のアミノ基と
の間で多官能架橋剤、グルタルアルデヒドにより
シツフ塩基を形成させ酵素を固定化する方法にお
いてシツフ塩基形成反応を迅速、かつ完全に進行
させるためには、多官能性架橋剤であるグルタル
アルデヒドは化学量論以上存在させる必要があ
る。ところが多量の多官能性架橋剤の共存は酵素
分子の一部が化学修飾を受け、タンパク質の高次
構造や活性中心が破壊され酵素の失活を招くた
め、この様な固定化方法で高活性の固定化酵素を
得るのは難しい。このため、やむを得ず一般に
は、アミノ基含有担体をあらかじめ過剰の多官能
性架橋剤で処理し、担体を活性化した後、未反応
の多官能性架橋剤を除去し、次に酵素を反応させ
固定化する方法がとられている。しかし、この方
法は担体のアミノ基間の架橋反応がかなり進行
し、酵素と反応する官能基が減少するため酵素の
固定化量が減少し得られる酵素固定化担体の活性
は一般に低い欠点がある。 多官能性架橋剤による担体のアミノ基と酵素の
共有結合反応において、酵素に対し特異的な吸着
能を有する物質、例えばタンニン酸等の多価フエ
ノールカルボン酸やキトサンをあらかじめ共存さ
せておくと、多官能性架橋剤が過剰に存在しても
酵素の失活が防げ、高活性で、かつ安定性の高い
固定化酵素が得られることが分つた。 〔作用〕 多価フエノールカルボン酸を用いた固定化酵素
の活性が高いのは、酵素に対して特異的な吸着能
を示す多価フエノールカルボン酸が、より多くの
酵素を吸着し、その高次構造が安定化され、多官
能性架橋剤による失活が防止されると共に多官能
性架橋剤の多官能基により担体のアミノ基と酵素
のアミノ基とが結合され担体に酵素が強固に固定
化されるためであると考えられる。 また、キトサンを併用した固定化酵素がさらに
高活性であるのは、キトサンは塩基性の多糖類で
あり酵素に対し強い吸着能を有しているためキト
サンが多価フエノールカルボン酸と共存すると酵
素は両者に共有した状態で吸着され、その高次構
造がより一層強固となるためと考えられる。 〔実施例〕 以下、主に澱粉の糖化に用いられるアスペルギ
ルスニガー起源のグルコアミラーゼの固定化方法
について実施例を挙げて本発明を具体的に示す。
次に、α−アミラーゼ、グルタミン酸脱炭酸酵素
の固定化方法について示す。 ＜グルコアミラーゼの固定化＞ シルカゲル（粒径0.3φ、細孔径500Å）をトル
エン中でγ−アミノトリエントキシシランにより
アミノ化した担体（SiO2−NH2と記す）１mlと
グルコアミラーゼ0.5ml（3000U／ml）含有水溶
液（0.05M酢酸緩衝液pH4.5）10mlを室温で４時
間接触させ固定化を行つた後、0.05M酢酸緩衝液
（pH4.5）で洗浄し、過剰のグルコアミラーゼを
除去し、固定化グルコアミラーゼを得た。なお、
固定化反応時、適宜、グルタルアルデヒド、タン
ニン酸、キトサンを加え安定な固定化を試みた。 ＜グルコアミラーゼ固定化担体の活性測定＞ 30％デキストリン水溶液（pH4.5）15mlとグル
コアミラーゼ固定化担体１mlを60℃で10分間振と
う接触させた後、生成したグルコース濃度を測定
した。なお基質として使用したデキストリン還元
糖は18％であつた。 ＜グルコアミラーゼ固定化担体の熱安定性試験＞ 30％グルコース水溶液（pH4.5）15mlとグルコ
アミラーゼ固定化担体１mlを60℃で接触させ熱処
理を行つた後、固定化担体の残存活性を測定し
た。 ＜デキストリンの連続糖化＞ グルコアミラーゼ固定化担体20mlを55℃に保温
したカラム（内径16φ）に充填し、30％デキスト
リン水溶液（pH4.5）流速１ml／minで通液し、
デキストリンの連続糖化を行つた。 第１図は多官能性架橋試薬グルタルアルデヒド
を用いてアミノ化シリカゲルにグルコアミラーゼ
を固定化した場合のグルタルアルデヒド濃度と固
定化担体の活性との関係を示したものである。本
発明の多価フエノールカルボン酸の一つであるタ
ンニン酸が共存した場合は広いグルタルアルデヒ
ド濃度範囲で高活性の固定化担体が得られる。こ
れに対し、タンニン酸が存在しない場合は、固定
化担体の活性はグルタルアルデヒド濃度の影響を
強くうけ、最適グルタル濃度範囲は非常に狭い。
そしてグルタルアルデヒド濃度の増加に伴ない固
定化担体の活性は急激に低下する。周知のように
多くの酵素は有機溶媒により変性を受け失活す
る。タンニン酸が存在しない場合の固定化担体の
低活性はグルタルアルデヒドによりグルコアミラ
ーゼが失活したことによるものである。これによ
り、最適グルタルアルデヒド濃度は(1)式で示され
る化学当量であることが分る。グルタルアルデヒ
ドによるグルコアミラーゼの失活防止には、ごく
少量のタンニン酸の共存でよく、好ましくは0.1
％以上、数％であつた。これより、グルタルアル
デヒドによるアミノ化担体と酵素グルコアミラー
ゼの共有結合反応時にタンニン酸を存在させてお
けば、酵素を失活させることなく十分量のグルタ
ルアルデヒドにより、反応は迅速、かつ完全に進
行するため、高活性で安定性に優れたグルコアミ
ラーゼ固定化担体が得られることがわかつた。 第２図はアミノ化シリカゲル（SiO2−NH2）
へのグルコアミラーゼ固定化法の比較を示したも
のである。従来法のグルタルアルデヒド（GA）
のみを用いる方法に比べ、タンニン酸、没食子酸
およびカテコール等の多価フエノールカルボン酸
を用いた方法では活性が高いことがわかる。 第３図はグルコアミラーゼ固定化担体の熱安定
性を示したものである。タンニン酸、没食子酸お
よびカテコール等の多価フエノールカルボン酸を
用いた固定化担体の活性は高いが、多価フエノー
ルカルボン酸のみでは、これら吸着したグルコア
ミラーゼが単に担体表面に沈着しているため、長
時間の熱処理によりグルコアミラーゼの脱離が容
易に起り、残存活性は急激に低下し好ましくな
い。一方、従来のグルタルアルデヒト用いた固定
化担体では、グルコアミラーゼが担体のアミノ基
と共有結合により固定化されているため、グルコ
アミラーゼの脱離はおこりにくく、失活は主に熱
変性に伴なうものであり、熱処理による残存活性
の低下はかなり軽減する。これに対し、本発明の
多価フエノールカルボン酸とグルタルアルデヒド
を用いた固定化担体では、更に残存活性の低下は
少なく、熱安定性に優れていることが分る。 第４図はグルコアミラーゼ固定化担体によるデ
キストリンの連続糖化試験結果を示したものであ
る。従来法のグルタルアルデヒドによる固定化グ
ルコアミラーゼに比べ本発明の多価フエノールカ
ルボン酸の一つであるタンニン酸とグルタルアル
デヒドを併用し固定化した固定化グルコアミラー
ゼでは安定糖化時間は約２倍延びている。更に、
キチン誘導体の一つであるキトサンを併用した固
定化グルコアミラーゼでは安定糖化時間は約３倍
になつている。 更に、タンニン酸のみの場合、酵素環境は酸性
雰囲気にあるのに対し、キトサン併用では酵素環
境は中性雰囲気となり、この状態が固定化グルコ
アミラーゼの熱安定性に好影響を及ぼしているも
のと考えられる。キトサンの添加量は固定化条件
によるが、0.01〜0.1程度で十分な効果が認めら
れる。 実施例 ２ アミノ化シリカゲン１mlにα−アミラ−ゼ0.5
ml含有水溶液（pH7.0）10mlを加え、続いてタン
ニン酸（１％）、グルタルアルデヒド（0.5％）を
加え、室温で４時間接触させα−アミラ−ゼを固
定化した。 この固定化α−アミラ−ゼの活性を以下の方法
により測定した。 ばれいしよでんぷん30％（pH7、Ca＋＋
3mM）水溶液15mlと固定化α−アミラ−ゼ１ml
を80℃で20分間接触させ生成した還元糖を測定し
た。 活性半減期は、80℃水溶液（pH7.0）中での処
理を行つたときの50％残存活性の時間である。 比較例 ２ アミノ化シリカゲン１mlにα−アミラ−ゼ0.5
ml含有水溶液（pH7.0）10mlを加え、続いてグル
タルアルデヒド（0.5％）を加え、室温で４時間
接触させα−アミラ−ゼを固定化した。 実施例 ３ アミノ化シリカゲル１mlにグルタミン酸脱炭酸
酵素20mg含有水溶液（pH5.0）を加え、続いて
タンニン酸（１％）、グルタルアルデヒド（0.5
％）を加え、室温で２時間接触させグルタミン酸
脱炭酸酵素を固定化した。 この固定化酵素の活性は以下の方法により測定
した。 グルタミン酸0.05M（pH5.0）水溶液15mlと固定
化酵素１mlを37℃で30分間接触させ生成したγ−
アミノ酪酸を測定した。 活性半減期は、45℃水溶液（pH5.0）中での処
理を行つたときの50％残存活性の時間である。 比較例 ３ アミノ化シリカゲン１mlにグルタミン酸脱炭酸
酵素20mg含有水溶液（pH5.0）を加え、続いて
グルタルアルデヒド（0.5％）を加え、室温で２
時間接触させグルタミン酸脱炭酸酵素を固定化し
た。 実施例 ４ アミノ化シリカゲン１mlにグルコースイソメラ
ーゼ50mg含有水溶液（pH7.5）10mlを加え、続
いてタンニン酸（１％）、グルタルアルデヒド
（0.5％）を加え、室温で４時間接触させグルコー
スイソメラーゼを固定化した。 この固定化グルコースイソメラーゼの活性を以
下の方法により測定した。 グルコース30％（pH7.5，Mg＋＋0.01M）水
溶液15mlと固定化グルコースイソメラーゼ１mlを
65℃で１時間接触させ生成したフラクトースを測
定した。 活性半減期は70℃水溶液（pH7.5）中での処理
を行つたときの50％残存活性の時間である。 比較例 ４ アミノ化シリカゲル１mlにグルコースイソメラ
ーゼ50mg含有水溶液（pH7.5）10mlを加え、続
いてグルタルアルデヒド（0.5％）を加え、室温
で４時間接触させグルコースイソメラーゼを固定
化した。 実施例 ５ アミノ化シリカゲル１mlにイヌラーゼ100mg含
有水溶液（pH6.0）10mlを加え、続いて、タンニ
ン酸（１％）、グルタルアルデヒド（0.5％）を加
え、室温で４時間接触させイヌラーゼを固定化し
た。 この固定化イヌラーゼの活性を以下の方法によ
り測定した。 イヌリン10％（pH6.0）水溶液15mlと固定化イ
ヌラーゼ１mlを40℃で30分間接触させ生成したフ
ラクトースを測定した。 活性半減期は45℃水溶液（pH6.0）中での処理
を行つたときの50％残存活性の時間である。 比較例 ５ アミノ化シリカゲル１mlにイヌラーゼ100mg含
有水溶液（pH6.0）10mlを加え、続いて、グルタ
ルアルデヒド（0.5％）を加え、室温で４時間接
触させイヌラーゼを固定化した。 実施例２，３，４及び５、比較例２，３，４及
び５の初期活性と活性半減期を第１表に示す。多
官能性架橋剤グルタルアルデヒドを用い、酵素を
アミノ基含有担体に共有結合により固定化する場
合、タンニン酸の共存が固定化酵素の初期活性の
向上と熱安定性の増加に有効であることがわか
る。
本発明によれば、酵素を不溶性担体に高活性
で、かつ、安定に固定化できる、長期に亘つて連
続酵素反応が可能な固定化酵素を得ることができ
るので、生産物の純度向上、酵素使用量の低減、
反応容器のコンパクト化が図れる。
で、かつ、安定に固定化できる、長期に亘つて連
続酵素反応が可能な固定化酵素を得ることができ
るので、生産物の純度向上、酵素使用量の低減、
反応容器のコンパクト化が図れる。
第１図はグルタルアルデヒド濃度とグルコアミ
ラーゼ固定化担体の活性の関係を示した線図、第
２図はアミノ化シリカゲルへのグルコアミラーゼ
固定化法の活性比較を示した棒線図、第３図はグ
ルコアミラーゼ固定化担体の熱安定性を示した線
図、第４図はグルコアミラーゼ固定化担体による
デキストリンの連続糖化試験結果を示した線図で
ある。
ラーゼ固定化担体の活性の関係を示した線図、第
２図はアミノ化シリカゲルへのグルコアミラーゼ
固定化法の活性比較を示した棒線図、第３図はグ
ルコアミラーゼ固定化担体の熱安定性を示した線
図、第４図はグルコアミラーゼ固定化担体による
デキストリンの連続糖化試験結果を示した線図で
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 酵素含有水溶液から酵素を分子中にアミノ基
を含有する水不溶性担体に固定化する方法におい
て、上記固定化は、多価フエノールカルボン酸の
存在下で、多官能性架橋剤による酵素とアミノ化
シリカゲル担体との共有結合反応により行なうこ
とを特徴とする酵素の固定化方法。 ２ 多官能性架橋剤がグルタルアルデヒトである
特許請求の範囲第１項記載の酵素の固定化方法。 ３ 多価フエノールカルボン酸がタンニン酸であ
る特許請求の範囲第１項または第２項記載の酵素
の固定化方法。 ４ 酸素含有水溶液から酵素を分子中にアミノ基
を含有する水不溶性担体に固定化する方法におい
て、上記固定化は、多価フエノールカルボン酸及
びキトサンの存在下で、多官能性架橋剤による酵
素とアミノ化シリカゲル担体との共有結合反応に
より行なうことを特徴とする酵素の固定化方法。 ５ 多官能性架橋剤がグルタルアルデヒトである
特許請求の範囲第４項記載の酵素の固定化方法。 ６ 多価フエノールカルボン酸がタンニン酸であ
る特許請求の範囲第４項または第５項記載の酵素
の固定化方法。 ７ 分子中にアミノ基を含有する水不溶性担体と
酵素含有水溶液に含まれる酵素との間で多官能性
架橋剤によりシツフ塩基を形成させて酵素を固定
化する方法において、上記シツフ塩基形成を多価
フエノールカルボン酸の存在下で、アミノ化シリ
カゲル担体を用いて行なうことを特徴とする酵素
の固定化方法。 ８ 多官能性架橋剤がグルタルアルデヒトである
特許請求の範囲第７項記載の酵素の固定化方法。 ９ 多価フエノールカルボン酸がタンニン酸であ
る特許請求の範囲第７項または第８項記載の酵素
の固定化方法。 １０ 分子中にアミノ基を含有する水不溶性担体
と酵素含有水溶液に含まれる酵素との間で多官能
性架橋剤によりシツフ塩基を形成させて酵素を固
定化する方法において、上記シツフ塩基形成を多
価フエノールカルボン酸及びキトサンの存在下
で、アミノ化シリカゲル担体を用いて行なうこと
を特徴とする酵素の固定化方法。 １１ 多官能性架橋剤がグルタルアルデヒトであ
る特許請求の範囲第１０項記載の酵素の固定化方
法。 １２ 多価フエノールカルボン酸がタンニン酸で
ある特許請求の範囲第１０項または第１１項記載
の酵素の固定化方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61290432A JPS63146791A (ja) | 1986-12-08 | 1986-12-08 | 酵素の固定化方法 |
| KR1019870013473A KR940005581B1 (ko) | 1986-12-08 | 1987-11-28 | 효소의 고정화방법 및 고정화 효소 |
| CA000553137A CA1289091C (en) | 1986-12-08 | 1987-11-30 | Method for immobilization of enzyme and immobilized enzymes |
| EP87310656A EP0271289A3 (en) | 1986-12-08 | 1987-12-03 | Method for immobilization of enzyme and immobilized enzymes |
| US07/129,163 US4888285A (en) | 1986-12-08 | 1987-12-07 | Enzyme immobilization on a water-insoluble amino group-containing carrier |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61290432A JPS63146791A (ja) | 1986-12-08 | 1986-12-08 | 酵素の固定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63146791A JPS63146791A (ja) | 1988-06-18 |
| JPH0468914B2 true JPH0468914B2 (ja) | 1992-11-04 |
Family
ID=17755955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61290432A Granted JPS63146791A (ja) | 1986-12-08 | 1986-12-08 | 酵素の固定化方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4888285A (ja) |
| EP (1) | EP0271289A3 (ja) |
| JP (1) | JPS63146791A (ja) |
| KR (1) | KR940005581B1 (ja) |
| CA (1) | CA1289091C (ja) |
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| DE3931588A1 (de) * | 1989-09-22 | 1991-04-04 | Standard Elektrik Lorenz Ag | Interferometrischer halbleiterlaser |
| IT1241985B (it) * | 1990-06-13 | 1994-02-02 | Enea | Procedimento per l'immobilizzazione di attivita' catalitiche biologiche su argille espanse sinterizzate e prodotto cosi' ottenuto |
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| US6723121B1 (en) * | 1997-06-18 | 2004-04-20 | Scimed Life Systems, Inc. | Polycarbonate-polyurethane dispersions for thrombo-resistant coatings |
| US5998183A (en) * | 1997-07-07 | 1999-12-07 | Le Fevre; Gerard N. | Enzyme immobilization on a siliceous support with a polyaldehyde cross-linking agent |
| AU2001230258A1 (en) * | 2000-01-25 | 2001-08-07 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Support for enzymes and proteins comprising an inorganic solid and combined material comprising the support |
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| CN102120995B (zh) * | 2010-12-02 | 2012-08-22 | 中国农业大学 | 一种固定化谷氨酸脱羧酶及其制备方法 |
| CN102698322B (zh) * | 2012-05-14 | 2014-11-26 | 西南交通大学 | 一种富含氨基、羧基和醌基的多类功能团的生物医用材料制备方法 |
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| CN103881999B (zh) * | 2012-12-19 | 2016-09-28 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 低残留无机-有机杂化整体基质固定化酶反应器及其制备 |
| US20170314008A1 (en) * | 2014-08-29 | 2017-11-02 | Konkuk University Industrial Cooperation Corp. | Enzyme immobilization using iron oxide yolk-shell nanostructure |
| WO2016141026A1 (en) | 2015-03-02 | 2016-09-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Hypochlorite resistant cyanuric acid hydrolases and methods of use thereof |
| CN105734036B (zh) * | 2016-03-30 | 2018-11-09 | 江苏大学 | 一种单宁酸为模板的介孔硅固定化胰蛋白酶的制备方法 |
| CN114438072B (zh) * | 2022-04-08 | 2022-05-31 | 山东天力药业有限公司 | 一种海藻糖的生产方法 |
| CN120400121B (zh) * | 2025-07-02 | 2025-09-19 | 南昌大学 | 以接枝修饰氨基树脂为载体的固定化脂肪酶及其制备方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US4337313A (en) * | 1980-12-08 | 1982-06-29 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of biocatalysts |
| US4760024A (en) * | 1983-08-10 | 1988-07-26 | Miles Inc. | Immobilization of enzymes |
| CA1210717A (en) * | 1983-08-10 | 1986-09-02 | Oreste J. Lantero, Jr. | Immobilization of biocatalysts |
| DE3408299A1 (de) * | 1984-03-07 | 1985-09-12 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Verfahren zur immobilisierung von zellen und enzymen |
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1986
- 1986-12-08 JP JP61290432A patent/JPS63146791A/ja active Granted
-
1987
- 1987-11-28 KR KR1019870013473A patent/KR940005581B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 CA CA000553137A patent/CA1289091C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-03 EP EP87310656A patent/EP0271289A3/en not_active Ceased
- 1987-12-07 US US07/129,163 patent/US4888285A/en not_active Expired - Fee Related
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| JPS63146791A (ja) | 1988-06-18 |
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| EP0271289A3 (en) | 1990-03-07 |
| KR880007719A (ko) | 1988-08-29 |
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