JP2000508902A

JP2000508902A - タキソール生合成のための組成物および製造方法

Info

Publication number: JP2000508902A
Application number: JP9537339A
Authority: JP
Inventors: マークアールウィルダン; ロドニービークロトー
Original assignee: ワシントンステイトユニヴァーシティリサーチファウンデーション
Priority date: 1996-04-15
Filing date: 1997-04-15
Publication date: 2000-07-18
Also published as: EP0907312A1; US6610527B1; EP0907312B1; ATE319297T1; WO1997038571A1; AU710405B2; US6114160A; ES2259190T3; CA2250693A1; US5994114A; EP0907312A4; DE69735419D1; AU2922597A; CA2250693C; DE69735419T2

Abstract

(57)【要約】イチイのタキサジエン合成酵素の遺伝子をクローン化して、その核酸およびポリペプチ配列を提示した。トランジットペプチドの先端除去または除去は、大腸菌細胞中における、クローン化したタキサジエン合成酵素遺伝子の発現を増加させる。

Description

【発明の詳細な説明】タキソール生合成のための組成物および製造方法関連事例の近接した参考文献本出願は、本明細書に参考文献として挿入されている、１９９６年４月１５日に出願された、米国暫定出願No.60/015,993の優先権を請求する。技術分野本発明は、ジテルペノイド生合成の検出の分野、特に、たとえばタキソールのような、タキソイド化合物の生合成に関連している。政府支援への謝辞本発明は、National Institutes of Health（国立保健研究所）の補助金No.CA -55254のもとに、政府支援によりなされた。政府は、本発明において確実な権利を有する。背景技術高度に機能化したジテルペノイドであるタキソール（Wani et al.,「J.Am.Che m.Soc.」93:2325-2327,1971）は、強力な化学療法薬剤として良く確立されている(Holmes et al.,in「Taxane Anticancer Agents:Basic Science and Current Status（タキサン抗癌剤、基礎化学および現在の状況）」,Georg et al.,eds.,P P.31-57,American Chmical Society，Washington,DC.,1995;Arbuck and Blayloc k,in「Taxol:Science and Applications,（タキソール：科学と応用）」Suffnes s,ed.,pp.379-415,CRC Press,Boca Raton,FL,1995）。（パクリタキセルは、ブリストルマイヤーズスクイブの登録商標である、タキソールの一般名である。）元来の起源である、Pacific yew（イチイ）（Taxus brevifolia Nutt.;Taxace ae）の樹皮よりのタキソールの供給は限られている。結果として、代りの製造方法を開発しようという激しい努力がなされ、それには農場で生育したTaxus種の葉および他の再生可能な組織からの単離、組織培養システム中における生合成、および、より容易に入手可能な、進化したタキサンジテルペノイド（タキソイド）代謝物からの、タキソールおよびその類似物の半合成が含まれる（Cragg et al.，「J.Nat.Prod．」56:1657-1668,1993）。タキソールの全合成は、現在においては、商業的な生産はできず（Borman，「Chem.Eng.News」72(7):32-34,199 4）、予見できる未来において、タキソールの供給、および合成において有用である前駆体は、タキサス種の植物またはそれより得た細胞培養における、生物学的な製造方法に依存せざるを得ないことは、明らかである（Saffness,in「Taxan e Anticancer Agents:Basic Science and Current Status（タキサン抗癌剤、基礎科学および現在の状況）」,Georg et al.,eds.,American Chemical Society,W ashington,DC.,1995,pp.1-17）。タキソールの生合成は、ジテルペノイド類の共通の前駆体（West,in「Biosynt hesis of Isoprenoid Compounds（イソプレノイド化合物類の生合成）」,Porter and Spurgeon,eds.,vol.1,pp.375-411,Wiley & Sons,New York,NY,1981）である、ゲラニルゲラニルジフォスフェイトの、taxa-4(5),11(12)-dieneへの最初の環状化を含んでおり（Koepp et al.，「J.Biol.Chem.」270:8686-8690,1995）、引き続いてこのオレフィンの大規模な酸化的修飾（Koepp et al.,J.Biol.Chem.2 70:8686-8690,1995;Croteau et al.,in「Taxane Anticancer Agents:Basic Scie nce and Current Status（タキサン抗癌剤、基礎科学および現在の状況）」,Geo rg et al.,eds.,pp.72-80,American Chemical Society,Washington,DC,1995）、および側鎖の合成（図１）が起こる（Floss and Mocek,in「Taxol:Science and Applications（タキソール：科学と応用）」,Suffness,ed.,pp.191-208,CRC Pre ss,Boca Raton,FL,1995）。 taxa-4(5),11(12)-diene合成酵素（「タキサジエン合成酵素」）は、ゲラニルゲラニルジフォスフェイトの初期環状化を行い、タキサン骨格の作成を担う酵素であり、T.brevifoliaの葉柄組織より単離され、部分精製され、そして特性解析された（Hezari et al.,「Arch.Biochem.Biophys．」322:437-444,1995）。タキサジエン合成酵素は、一般的な酵素学的性質において、他の植物テルペノイドシクラーゼと似通っているが（Hezari et al.,「Arch.Biochem.Biophys．」 322:437-444,1995）、抗体作成またはミクロシークエンスを行うために十分な量を精製することは非常に難しいことが証明されており、このアプローチよりｃＤＮＡクローニングを行うことが妨げられている。発明の要旨我々は、イチイのタキサジエン合成酵素をクローン化し、配列決定を行った。本発明の、実施形態は、少なくとも１５の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも２５、最も好ましくは３０の、天然のタキサジエン合成酵素の遺伝子、例えばイチイのタキサジエン合成酵素遺伝子、の連続したヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを含む。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、イチイのタキサジエン合成酵素の相同物を得るプローブおよびプライマーとして有用であり、例えば、タキソイドを生成する生物の核酸を、適切なハイブリダイゼーション条件下においてそのようなプローブまたはプライマーと接触させて、生体のタキサジエン合成酵素の遺伝子をそのプローブまたはプライマーとハイブリダイズできるようにして、そしてプローブまたはプライマーがハイブリダイズした、生体のタキサジエン合成酵素遺伝子を単離する。本発明の他の実施形態は、タキサジエン合成の生物学的活性を有するポリペプチドをコード化する配列を含む、単離したポリヌクレオチドを含有している。好ましくは、そのポリペプチドをコード化している配列は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の、天然イチイのタキサジエン合成ポリヌクレオチド遺伝子とのヌクレオチド配列の類似性を有している。そのようなポリヌクレオチドの好適形態においては、ポリペプチドをコード化している配列は、天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチドの、保存されたアミノ酸置換のみを持つポリペプチドをコード化しており、例外的に、いくつかの実施例では、：３２９、６５０、７１９および７７７のシステイン残基；３７０、４１５、５７９および７９３のヒスチジン残基、；DDXXDモチーフ；DXXDD モチーフ；保存されたアルギニン；そしてＲＷＷＫ因子：において一つまたはそれ以上のアミノ酸置換を持つ。好ましくは、コード化されたポリペプチドは、天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチドに対して、保存されたアミノ酸置換のみを持つか、あるいは完全に相同である。加えて、コード化されたポリペプチドは、好ましくはトランジットペプチドの少なくとも一部分を欠損している。そのようなポリヌクレオチドおよびそれをコード化したポリペプチドを含有している細胞、特に植物細胞、およびトランスジェニック植物、もまた含まれる。本発明の他の実施形態には、タキサジエン合成酵素活性を持つ単離されたポリペプチドが含まれ、天然のタキサジエン合成酵素ポリペプチドと、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチドの、最も好ましくは成熟したイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチド（すなわち、トランジットペプチドのみ欠損している）の少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも３０の連続したアミノ酸の、単離されたポリペプチドもまた含まれる。本発明の他の実施形態には、天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチドに対する、特異的な抗体もまた含まれる。本発明の他の実施形態には、例えば、タキソイド生産細胞のような、タキサジエン合成酵素ポリペプチドを細胞内において発現させる方法が含まれ、タキサジエン合成酵素ポリペプチドを発現可能であるポリヌクレオチドをコード化している細胞を、そのポリペプチドを発現させるのに適している条件下において培養することにより、その発現可能なポリヌクレオチドを欠損している、他の類似細胞より期待されるであろう程度より、好ましくは、より高い程度のタキソイドが生成する結果となる。本発明の、前述および他の目的および利点は、下記の詳細な記述および添付した図により、より明らかになるであろう。図の簡単な記述図１は、ゲラニルゲラニルジフォスフェイトのタキサ-4(5),11(12)-ジエンへの最初の環状化、引き続いての大規模な酸化的修飾および側鎖の合成を含む、タキソールの生合成の段階を示す。図２は、イチイタキサジエン合成酵素クローンpTb42.1の、ヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列を示す。開始および停止コドンに下線を引いた。プライマー合成に用いた領域の部位には、二重下線を引いた。DDMADおよびDSYDD モチーフは、太い活字である。保存されたヒスチジン（Ｈ）およびシステイン（Ｃ）およびRWWK因子は、箱型で示した。トランジットペプチドを、一部または全体除去する、先端除去部位は、三角形で示した（▼）。好適形態の詳細な説明ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた、相同性に基づいたクローニング戦略を用いて、タキサジエン合成酵素を暗号化するｃＤＮＡを単離した。関連したモノテルペン、セスキテルペン、およびジテルペンシクラーゼの共通配列に基づいて、一連の縮重プライマーを構成した。それらのプライマーのうち、二つが８３塩基対（ｂｐ）の断片を増幅し、その断片は配列がシクラーゼ様であって、それはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして用い、そのｃＤＮＡライブラリーは、イチイの茎より抽出された poly(A)⁺RNAより構築した。２キロベースペア（ｋｂ）過剰の挿入サイズを有する、１２個の独立したクローンが単離され、部分的に配列を決定した。それらのｃＤＮＡ単離物の中の一つを、大腸菌の中で機能的に発現させて、ゲラニルゲラニルジフォスフェイトをジテルペンオレフィンに変換させる触媒活性を有するタンパク質を得て、そのジテルペンオレフィンはタキサ-4(5),11(12)- ジエンであると、キャピラリーガスクロマトグラフィーとマススペクトロメトリーを組み合わせることにより同定された（Satterwhite and Croteau，「J.Chrom atography」452:61-73，1988）。タキサ-4(5),11(12)-ジエン合成酵素のｃＤＮＡ配列は、2586ヌクレオチドの転写解読枠を特定する。その推定されるポリペプチド配列は、862アミノ酸残基を含み、成熟した天然の酵素において先に決定された約79,000と比較して、98,3 03の分子量を持つ。それゆえに、それは全長であり、長い推定上の色素体を標的としたペプチドを含んでいるようである。植物由来のモノテルペン、セスキテルペン、およびジテルペンシクラーゼの配列を比較すると、これらの酵素間において、明確な程度の類似性を示しており；タキサジエン合成酵素は、grand fir由来のジテルペンシクラーゼであるアビエタジエン合成酵素に最も近接して似ている（４６％同一性、６７％類似性）。タキサジエン合成酵素遺伝子の利用形質転換細胞中におけるタキソール生合成の増加タキソール（パクリタキセル）生合成に関わるステップは、ゲラニルゲラニルジフォスフェートの最初の環状化であり、ゲラニルゲラニルジフォスフェートは普遍的なイソプレノイド中間体であり、ジテルペンシクラーゼであるタキサジエン合成酵素により触媒される。この反応の生成物は、タキサン骨格を有する親オレフィンである、タキサ-4(5 ),11(12)-ジエンである。タキソイド類およびタキソイド生化学の総説としては、例えば、Kingston et al.,"「The Taxane Diterpenoids,"Progress in the Ch emistry of Organic Natural Products，（タキサンジテルペノイド類、有機天然生成物の化学における進歩）」vol.61,Springer Verlag,New York,1933,pp.1- 206"を見よ。標的経路において環状化に関わるステップは、タキソールおよび関連したタキソイド類をもたらす、生合成的に伸長された配列中における、遅いステップである（Koepp et al.，「J.Biol.Chem.」270:8686-8690,1995;Hezari et al.，「Ar ch.Biochem.Biophys．」322:437-444,1995）。タキソイド生合成が可能な生物の細胞中における、タキソールおよび関連したタキソイド類（例えば、特にセファロマンニン、バッカチン類、タキシニン類）の収量は、組み換えタキサジエン合成遺伝子の細胞中における発現により、増加する。タキソイド生合成を増加させるための、このアプローチは、タキソイドを生合成可能な、どのような生物にも使用できる。タキソール合成は、特定の微生物中のみならず、例えば、Taxaceae中において、起こっていることが知られており、それは世界中に由来するタキサス種を含んでいる（これらに限定されるものではないが、T.brevifolia，T.baccata，T.x media，T.cuspidata，T.canadensis,およびT.chinensis を含む）。タキソールは菌類、Taxomyces andreanaeによってもまた生成される可能性がある（Stierle et al.，「Science」260:214,1993）。 Agrobacterium tumefaciensにより仲介されたタキサス種の形質転換について述べられてきており、そして得られるカルス培養物はタキソールを生成することが示されている（Han et al.，「Plant Sci.」95:187-196,1994）。タキソールは、常法により、タキサジエン合成酵素遺伝子により形質転換した細胞より単離することができる。タキサスのカルスおよび懸濁培養物の生成と、およびそのような培養物からのタキソールと関連化合物の単離については、すでに述べられている（例えば、Fett-Netto et al.,「Bio/Technology」10:1572-15 75,1992中において）。微生物中におけるタキソイド類の生合成下記で論じた様に、タキサジエン合成活性は、組み換えタキサジエン合成酵素を発現している、形質転換したE.coli （大腸菌）宿主細胞において観察された。タキサジエン合成酵素は大規模な翻訳後修飾は必要とせず、例えば、大規模な翻訳後修飾は、哺乳動物細胞中においては、酵素機能のために備えられている。結果として、広範囲の宿主細胞中において、機能できるタキサジエン合成酵素を発現させることができる。ゲラニルゲラニルジフォスフェートは、タキサジエン合成酵素の基質であるが、カルテノイド色素（例えば、Serratia sppおよびRhodotorula spp）を生成する細菌や酵母を含む、広範囲の生物中において生成される。そのような微生物中に、タキサジエン合成酵素を発現できるベクターを導入することにより、タキサ -4(5),11(12)-ジエンおよびタキサン骨格を有する関連化合物を大量に生成させることができる。そのように生成したタキサン骨格は、化学的原料として有用である。単純なタキソイド類は、例えば、香料定着液として有用であるかもしれない。タキサジエン合成酵素相同物および関連遺伝子のクローニングイチイ由来のタキサジエン合成酵素遺伝子が得られることから、タキソイド生合成が可能である他の生物、特にタキサスspp.よりタキサジエン合成酵素の相同物をクローニングする事が可能となる。共通するタキソイド類の比率は、試したイチイの種類または品種により変化するが、明らかにすべてのタキサス種は、タキソールを含むタキソイド類を、ある程度まで合成する（例えば、Mattina and Palva,「J.Envi ron.Hort」．10:187-191,1992;Miller，「J.Natural Products」43:425-437,198 0を見よ）。タキソールは、菌類であるTaxomyces andreanaeによってもまた、生成されるかもしれない（Stierle et al.，「Science」260:214,1993）。タキサジエン合成酵素遺伝子は、タキソールまたは関連したタキソイド類を生成することができる、どのような生物からも単離することが可能であり、そのためにイチイタキサジエン合成酵素遺伝子配列に基づいたプライマーまたはプローブ、またはタキサジエン合成酵素に特異的な抗体を、常法により用いる。タキサジエン合成酵素遺伝子とポリペプチドの修飾された形態下記においてさらに充分述べるように、タキサジエン合成酵素の配列が知られているためにその配列を修飾することができ、遺伝子および遺伝子生成物ポリペプチドの変異体を生成することができる。例えば、色素体トランジットペプチドは、他のトランジットペプチドにより除去および／または置換することが可能であり、それにより遺伝子産物を種々の細胞内器官に向かわせたり、宿主細胞より排出させたりできる。定義および実験方法以下の定義および実験方法は、本発明をより良く定義し、本分野において通常の技術を有する者が本発明を実施できるように案内するために提供した。分子生物学における一般的な用語の定義は、Rieger et al.，「Glossary of Genetics; Classical and Molecular（遺伝学辞典；古典および分子）」,5th edition,Spri nger-Verlag,New York,1991；およびLewin，「Genes Ｖ（遺伝子Ｖ）」Oxford U niversity Press,New York,1994の中でもまた、見出すことができる。「植物」という単語は、全ての植物とその子孫を含んでいる。その単語はまた、種子、切片、球根、果実、花などを含む、植物の部品もまた含んでいる。植物の「生殖単位」は、植物のすべての未分化の部品または組織であり、それより植物の子孫、例えば、種子、切片、芽、球根、体細胞胚、培養細胞（例えば、カルスまたは懸濁培養）を含む植物の子孫を得る事ができる。核酸核酸（本明細書では、「ポリヌクレオチド」という単語で置き換え可能に使っている）は、本発明を実施するために有用であり、単離されたタキサジエン合成酵素遺伝子と、他の植物種におけるその相同物およびその切片と変異体を含む。「タキサジエン合成酵素遺伝子」という単語は、タキサ-4(5),11(12)-ジエン合成酵素配列を含む核酸のことを意味しており、好ましくは、タキサジエン合成酵素活性を有するポリペプチドをコード化のことを意味している。この単語は、上述で議論して図２で示した、イチイ由来の、単離された全長タキサジエン合成酵素ｃＤＮＡおよびそれに相当するゲノム配列（その配列と実施可能に結合した側面または内部配列を含み、制御因子および／またはイントロン配列を含む）と、基本的に関連している。この単語はまた、イチイ由来のタキサジエン合成酵素遺伝子の対立遺伝子もまた含んでいる。「天然の」「天然の」という単語は、天然由来の（「野生型の」）核酸またはポリペプチドを意味する。「相同物」タキサジエン合成酵素遺伝子の「相同物」とは、イチイ以外の生物より単離されたタキサジエン合成酵素をコード化している遺伝子配列である。「単離された」「単離された」核酸とは、生物の細胞中における他の核酸配列より、実質的に分離するか、精製した核酸であり、その核酸は生体中において天然由来であり、つまり、通常の核酸精製方法による、他の染色体性および過剰色体性のＤＮＡおよびＲＮＡである。この単語は、組み換えた核酸および化学的に合成した核酸を含む。断片、プローブ、プライマータキサジエン合成酵素核酸の断片は、本発明において核酸の一部分であり、その核酸は全長より短く、かつ、適切なハイブリダイゼーション条件下において、図２のタキサジエン合成酵素核酸と特異的にハイブリダイズ可能な、少なくとも最短の長さを含んでいる。そのような断片の長さは、好ましくは１５−１７ヌクレオチド、またはそれ以上である。核酸プローブおよびプライマーは、図２に提出したタキサジエン合成酵素遺伝子の配列に基づいて調製が可能である。「プローブ」は、検出可能なラベルまたはレポーター分子と付着させた単離ＤＮＡまたはＲＮＡであり、そのようなラベルまたはレポーター分子には、例えば放射性同位元素、リガンド、化学発光試薬、または酵素がある。「プライマー」は単離された核酸であり、一般的には１５ヌクレオチドまたはそれ以上の長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、核酸ハイブリダイゼーションにより相補的な標的ＤＮＡ鎖へアニールして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖の間にハイブリッドを形成して、そして、ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ、により標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長した。プライマー対は、核酸配列の増幅に、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の一般的な核酸増幅方法に、使用可能である。プローブおよびプライマーを、調製および使用する方法は、例えばSambrook e t al.,「Molecular Cloning:A Laboratory Manual（分子クローニング：実験室マニュアル）」,2nd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab oratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989;「Current Protocols in Molecula r Biology（分子生物学における現在のプロトコール）」,ed.Ausubel et al.,Gr eene Publishning and Wiley-Interscience,New York,1987（定期的に改定）；およびInnis et al.，「PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications （PCRプロトコール：実験方法および応用への案内）」,Academic Press:San Die go,1990に述べられている。ＰＣＲプライマー対は、既知の配列より推定可能であり、例えば、プライマーのような目的のために意図されたコンピュータープログラムを用いることにより推定可能である（Version 0.5,1991,Whitehead Insti tute for Biochemical Reserch,Cambridge,MA）。核酸配列の類似性核酸配列の「類似性」は、２つのポリヌクレオチド配列が、それらの配列中の相当する位置において、同一のヌクレオチド塩基を有している程度の大きさであり、その時最適にアラインされているものとする（適切な核酸挿入または欠損を有する）。配列類似性は、Madison,WI、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、遺伝子コンピューターグループの配列解析ソフトウェアーパッケージ、のような配列解析ソフトを用いて決定することができる。好ましくは、タキサジエン合成酵素ポリヌクレオチドの変異体は少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％のヌクレオチド配列類似性を、天然のタキサジエン合成酵素遺伝子、特に図２に提示したイチイのタキサジエン合成酵素に対して有している。影響下に結合した最初の核酸配列が第二の核酸配列と、機能的に関連した状態に置かれた時、最初の核酸配列は、第二の核酸配列と「影響下に」結合している。例えば、もしそのプロモーターがそのコード配列の転写または発現に影響するならば、プロモーターはコード配列と影響下に結びついている。一般的に、影響下に結合したＤＮＡ配列は相接しており、相接している部位が、二つのタンパク質コード部位を結合させるために必要である解読枠の中にある。「組み換え」「組み換え」核酸は、２つの異なる分離した配列部位の、人工的な組み合わせにより作成した、単離したポリペプチドであり、例えば化学的な合成または遺伝工学技術による単離した核酸部位の操作により作成する。核酸操作の技術は、例えばSambrook et al（1989）とAusubel et al（1987、定期的に改定）において、一般的に述べられている。核酸の化学合成の方法は、例えば、Beaucage and Carruthers，「Tetra.Letts.」22:1859-1862.1981,およびMatteucci et al.，「J.Am.Chem.Soc.」103:3185,1981において議論されている。核酸の化学合成を、例えば市販されている自動化されたオリゴヌクレチド合成機で行う事ができる。組み換えまたは化学的に合成した核酸、ベクター、形質転換体、宿主細胞の調製本発明により、自然のまたは合成した核酸は、ＤＮＡ構築物を典型とする、組み換え核酸構築物中に挿入することができ、宿主細胞中に導入して複製する事ができる。そのような構築物は、好ましくはベクターであり、そのベクターは複製機構および配列を含み、その複製機構と配列は、与えられた宿主細胞内で、ポリペプチドをコード化する配列を翻訳、転写することができる。本発明を実施するために、Sambrook et al.,1989、またはAusubel et al.,1987の中で議論されたような、ベクターと宿主細胞を調製して使用するための、一般的な組成物と製造方法が用いられる。「形質転換した」または「トランスジェニックな」細胞、組織、器官、生物は、外来の核酸が、その中に導入されたものである。「トランスジェニックな」または「形質転換した」細胞または生物には（１）細胞または生体の子孫および（２）繁殖計画より作成した子孫であり、その計画において「トランスジェニック」植物を掛け合わせにおける親として用い、”トランス遺伝子”、すなわち組み換えタキサジエン合成酵素の核酸、が存在することに由来する結果として、変化した表現型を示す。核酸ハイブリダイゼーション；「適切な条件」；「特異性」本発明における核酸プローブとプライマーは、適切な条件下で標的ＤＮＡ配列、例えば、タキサジエン合成酵素遺伝子とハイブリダイズする。「適切な条件」という単語は、核酸プローブの標的核酸（すなわち、興味が持たれる、特定の核酸配列へ）へのハイブリダイズという点を考えて、機能的に限定している。そこで用いられているハイブリダイゼーション方法は、Sambrook e t al.,1989,at 9.52-9.55において議論されている。また、Sambrook et al.,198 9 at 9.47-9.52,9.56-9.58;Kanehisa，「Nucl.Acids Res」．12:203-213,1984; およびWetmur and Davidson，「J.Mol.Biol．」31:349-370,1968も見よ。特定の増幅プライマー対を用いた、標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）を考慮すると、適切な条件とは、プライマー対が、標的核酸配列のみにハイブリダイズできる条件であり、その標的核酸配列へ、相当する野生型配列（またはその相補物）を有するプライマーは結合し、そして好ましくは独特の増幅生成物を生成する。「（標的配列に）特異的な」という単語は、プローブまたはプライマーが適切な条件下において、標的配列を含むサンプル中で標的配列にのみハイブリダイズする事を示している。核酸増幅本明細書で用いられたように、「増幅されたＤＮＡ」は、標的核酸配列の核酸増幅した生成物のことである。核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、この分野で知られている種々の核酸増幅方法のいずれによっても行うことが可能である。本分野において種々の増幅方法が知られており、米国特許No4,683,195および4,683,202および，「PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications（PCRプロトコール：実験方法および応用への案内）」,Innis et al.,eds.,Academic Press:San Diego,1990の中で述べられている。タキサジエン合成酵素またはその相同物をコード化しているｃＤＮＡの製造方法ここで開示された、タキサジエン合成酵素ｃＤＮＡの有用性に基づき、他のタキサジエン合成酵素遺伝子（例えば、タキサジエン合成酵素の対応物または相同物）が、本分野で知られているクローニング方法により、広範囲の植物よりたやすく得られる。タキサジエン合成酵素配列に基づいた、一つまたはそれ以上のプライマー対が、そのようなタキサジエン合成酵素遺伝子またはその相同物を、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）または他の一般的な増幅方法により増幅する目的で使用される。代わりに、開示されたタキサジエン合成酵素ｃＤＮＡまたはその断片は、与えられた植物種より作成したｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、常法によりプローブする目的で、使用可能である。タキサジエン合成酵素のゲノム配列およびその相同物のクローニングタキサジエン合成酵素ｃＤＮＡ配列は入手可能であるため、本分野の技術を有する者は、タキサジエン合成酵素ｃＤＮＡ（プロモーターおよび他の調節領域およびイントロン配列））に相当するゲノミッククローンを得て、常法によりそのヌクレオチド配列を決定する事が可能である。事実上すべてのタキサス種は、タキソイド類を、タキソールを含めて、ある程度は合成する事が可能である（例えば、Mattina and Palva，「J.Environ.Hort. 」10:187-191,1992;Miller，「J.Natural Products」43:425-437,1980を見よ）。タキソイド類を生成するすべての生物は、タキサジエン合成酵素の相同物を発現することが期待される。タキサジエン合成酵素遺伝子は、イチイタキサジエン合成酵素プローブの、標的種のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーに対するハイブリダイゼーションにより、得ることができる。そのような相同物は、図２に示したタキサジエン合成酵素配列に基づいたプライマーを用いた、標的種のゲノムＤＮＡまたはＲＮＡより、ＰＣＲまたは他の増幅方法によってもまた得る事ができる。イチイまたは他の植物種由来のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーは、常法により調製することができる。図２の中で示した配列に基づいたプライマーおよびプローブは、タキサジエン合成酵素配列を常法により確定するために（および、もし必要ならば、訂正するために）使用することができる。タキサジエン合成酵素ｃＤＮＡの核酸配列変異体およびタキサジエン合成酵素タンパク質のアミノ酸配列変異体ここで開示されたタキサジエン合成酵素タンパク質の核酸およびアミノ酸配列を用いて、本分野の技術を有する者は、そのヌクレオチドまたはアミノ酸配列中に、わずかな変異を有するＤＮＡ分子およびポリペプチドを作成することができる。「変異体」ＤＮＡ分子というものは、天然のタキサジエン合成酵素配列中に、わずかな変異を含むＤＮＡ分子であり、例えば天然のタキサジエン合成酵素配列の一つまたはそれ以上のヌクレオチドが欠損し、添加し、および／または置換しているような、配列中における変異を含むＤＮＡ分子であり、その間好ましくは実質的なタキサジエン合成酵素活性を維持する。変異体ＤＮＡ分子は、例えば、標準的なＤＮＡ変異体誘起技術、または変異体ＤＮＡ分子またはその一部分の化学的な合成により作成することができる。そのような変異体は、好ましくは核酸のタンパク質コード領域の解読枠を変えることなく、そして好ましくはタキサジエン合成酵素の生物機能において変化しないか、ほんのわずか減少させるか、または増加させる、タンパク質をコード化する。アミノ酸置換は、好ましくは単一のアミノ酸残基の置換である。ＤＮＡ挿入は好ましくは約１から１０の近接したヌクレオチドであり、欠損は好ましくは約１から３０の近接したヌクレオチドである。挿入および欠損は、好ましくはタンパク質をコードした、またはコードしていない配列の末端よりの挿入および欠損であり、そして好ましくは近接した塩基対中で作成される。置換、欠損、挿入またはそれらの組み合わせは、最終的な構築物に到達するために組み合わせることが可能である。好ましくは、本発明における変異体核酸は、「静止した」または「保存された」変異体である。「静止した」変異体は、天然のタキサジエン合成酵素の配列またはその相同物の変異体であり、その中において一つまたはそれ以上の塩基対の置換があるが、その配列によりコード化されるポリペプチドのアミノ酸配列に変化はない。「保存された」変異体は、天然のタキサジエン合成酵素配列またはその相同物の変異体であり、その中において遺伝子のタンパク質コード領域中の少なくとも一つのコドンが変化しており、例えばアミノ酸置換のような、核酸配列によりコード化されるポリペプチドの一つまたはそれ以上のアミノ酸残基に保存された変化を引き起こす。多数の保存されたアミノ酸置換を、下記にリストする。加えて、一つまたはそれ以上の、システイン残基をコード化するコドンを置換することがあり、結果としてシステイン残基を失い、タキサジエン合成酵素ポリペプチドのジスルフィド結合に影響を与える。上記にリストしたものより保存性が低い置換を選択する事より、機能の実質的な変化がなされ、例えば、（ａ）置換部位におけるポリペプチド骨格の構造；（ｂ）標的部位におけるポリペプチドの電荷または疎水性；または（ｃ）アミノ酸側鎖の体積における変化を引き起こす。通常、タンパク質の性質に最も大きな変化を引き起こすと予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルへと（またはこれらによって）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンが、他のいずれかの残基へと（または残基によって）置換される；（ｃ）正電荷を持つ側鎖、例えば、リジル、アルギニル、またはヒスタジルが負電荷の残基、例えば、グルタミル、またはアスパルチルへと（またはこれらによって）置換される；または（ｄ）かさ高い側鎖を持つ残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を持たないもの、例えばグリシンへと（またはグリシンによって）置換される。タキサジエン合成酵素遺伝子配列は、以下のように修飾される。（１）発現効率を改善し、発現したポリペプチドの標的を変換するために：植物以外の宿主中において発現させるために、（または発現したポリペプチドを宿主植物中の異なった細胞内器官へ向けるために）天然の遺伝子配列を５’末端より先端切除が可能であり、色素体トランジットペプチドをコード化する配列を、約１３７アミノ酸除去し（すなわち、最大１３８Ｓまで）、成熟したタキサジエン合成酵素の、約７２５アミノ酸のポリペプチドをコード化する配列を残す。加えて、例えば、発現を改善するために、宿主細胞において遺伝子がコドンを使用する傾向を確認するために、一つまたはそれ以上のコドンを変換することができる。一つまたはそれ以上のシステイン残基を除去または添加して、それにより一つまたはそれ以上のジスルフィド結合を除去または添加することにより、酵素的な安定性を変化させることができる。（２）触媒効率を変えるために：下記で議論されたように、基質結合において役割を果たしているアスパラギン酸豊富部位は、タキサジエン合成酵素中においてもまた存在しており、ＤＸＸＤＤモチーフと関連している（図２）。ヒスチジンおよびシステイン残基は、植物由来のいくつかのテルペノイドシクラーゼの活性部位に包含されてきた。タキサジエン合成酵素における、３７０、４１５、および７９３におけるヒスチジン残基と、３２９、６５０、および７７７におけるシステイン残基は、植物テルペノイドシクラーゼの遺伝子の間で保存されている。一つまたはそれ以上の保存されたヒスチジンおよびシステイン残基（下記で議論されるように）、または半保存された残基であるシステイン残基（例えば、残基３２９、６５０、７１９、および７７７）やヒスチジン残基（例えば、残基３７０、４１５、５７９、および７９３）は、変異させることにより酵素反応速度を変えることができる。加えて、これらの保存されたヒスチジンとシステイン残基に近接した残基もまた変えることができ、それによりシステインまたはヒスチジン含量を増加させて電荷安定性が改善される。ＤＤＸＸＤおよびＤＸＸＤＤモチーフ（ここでＤはアスパラギン酸、Ｘは任意のアミノ酸）のアスパラギン酸含量を増加させることにより、それらのモチーフは基質／中間体結合に関与しているようであるが、酵素反応速度（すなわち、酵素反応の律速イオン化段階）もまた増加させる事ができる。アルギニンは結合または触媒に関与しており、そして保存されたアルギニン残基は突然変異生成の良い標的でもある。保存されたＤＤＸＸＤおよび／またはＤＸＸＤＤモチーフ（例えば、そのアスパラギン酸残基）を、他の既知の酵素のそれらのモチーフと合わせるために通常の部位特異的突然変異作成法により変化させることは、タキサジエン合成酵素の酵素反応速度または基質特異性において変化を引き起こす事もまた可能である。加えて、ＲＷＷＫ因子（５６４から５６７残基）の突然変異生成により生成物の生成もまた変える事が可能であり、ＲＷＷＫ因子はカルボカチオン反応中間体を安定化する役割を果たすかもしれない、芳香族残基を含んでいる。（３）基質利用性を変えるために：酵素の、特に活性部位を、変化させることにより、その酵素がゲラニルゲラニルジフォスフェイトより短い（例えば、Ｃ₁₀ ）または長い環（例えば、Ｃ₂₅）と結合できるようにすることが可能である。疎水性パッチの大きさを増加または減少させて、酵素の疎水性ポケットの大きさを変えることにより、利用する基質の大きさを変えることができる。ドメインの交換により、類似した効果を得る事ができる。（４）生成する生成物を変えるために：保存されたアスパラギン酸およびアルギニン残基に向けた突然変異生成法により、酵素が異なったジテルペン骨格、例えば、一、二、または三環、を生成できるようにさせることができる。例えば、Cane et al.,「Biochemistry」34:2480-2488,1995;Joly and Edwards,「J.Bio l.Chem.」268:26983-26989,1993;Marrero et al.,「J.Biol.Chem.」267:533-536 ,1992;and Song and Poulter，「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」91:3044-3048,1994 を見よ。宿主細胞中におけるタキサジエン合成酵素核酸の発現本発明により、タキサジエン合成酵素遺伝子またはその断片を導入したＤＮＡ構築物は、好ましくはタキサジエン合成酵素タンパク質をコードする配列を、宿主細胞中で発現可能な、影響下に結合したプロモーターの制御下に置く。植物細胞中において異種の遺伝子を発現させるのに適した種々のプロモーターが、本分野において知られており、それには構成的プロモーター、例えば多くの植物組織、器官、または組織特異的なプロモーター中に発現しているカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35S プロモーター、および、例えばメチルジャスミネート、サリチル酸、または緩和剤のような化学物により誘導可能なプロモータが含まれる。種々の他のプロモーター、または発現ベクターを構築するために有用な他の配列は、細菌、酵母、哺乳類、昆虫、両生類、鳥類、または他の宿主細胞中で発現させるのに有用である。固体の支持体に付着した核酸本発明における核酸は、溶液中に遊離していることも、固体の支持体に通常の方法で付着させることも可能であり、そのような支持体には、例えばハイブリダイゼーション膜（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン）、ビーズ、または本分野で知られている他の固体支持体がある。ポリペプチド「タキサジエン合成酵素タンパク質」（またはポリペプチド）という単語は、タキサジエン合成酵素遺伝子によりコード化されるタンパク質のことであり、例えば、対応遺伝子、相同物、およびその変異体を含む。タキサジエン合成酵素ポリペプチドは、組み換えタキサジエン合成酵素核酸の発現により生成する事ができ、または化学的に合成される。ポリペプチドの化学合成の技術は、例えば、Me rrifield,J，「Amer.Chem.Soc.」85:2149-2156,1963の中で述べられている。ポリペプチド配列の同一性および類似性通常、本発明に包含されるタキサジエン合成酵素ポリペプチドは、天然のタキサジエン合成酵素ポリペプチドと比較して、少なくとも約７０％のアミノ酸配列「同一性」（または相同性）を有しており、好ましくは少なくとも約８０％の同一性、そしてさらに好ましくは、天然のタキサジエン合成酵素ポリペプチドと、少なくとも約９０％の同一性を有している。好ましくは、そのようなポリペプチドは、天然のタキサジエン合成酵素ポリペプチドの特徴的な構造特性および生物学的活性も、また有する。アミノ酸配列の「類似性」とは、整列したアミノ酸配列が、相当する位置において同一のアミノ酸または保存されたアミノ酸置換物を有している、その程度の大きさである。タキサジエン合成酵素「生物学的活性」は、常法のプロトコール（例えば、He zari et al.,「Arch.Biochem.Biophys．」322:437-444,1995の中で述べられたプロトコールを、参照としてここに加える）により測定されたタキサジエン合成酵素の酵素活性を含む。タキサジエン合成酵素の他の生物学的活性には、基質結合には限定されないが、免疫学的活性（タキサジエン合成酵素に特異的な抗体の生成を引き出す能力を含む）などが含まれる。ポリペプチドの同一性（相同性）または類似性は、典型的には配列解析ソフトウェアーを用いて解析され、そのようなソフトウェアーにはWI、マジソン、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、ジェネティックコンピューターグループの配列解析ソフトウェアーパッケージのような物がある。ポリペプチド配列解析ソフトウェアーは、種々の置換、欠損、置換および他の修飾に帰する同一性の大きさを用いて、ポリペプチド配列を組み合わせる。「単離した」「精製した」「均質の」ポリペプチドポリペプチドが、自然にそれに付随している細胞内器官（核酸、脂質、炭水化物、および他のポリペプチド）より分離されている場合、ポリペプチドを「単離した」という。そのようなポリペプチドはまた、「純粋に」または「均一に」または「実質的に」純粋または均一であるとみなすことができる。そこで、化学的に合成した、または組み換えた（つまり、組み換え核酸の発現産物、たとえ同一の型の細胞中に発現していても）ポリペプチドは、単離したとみなされる。サンプルの重量において少なくとも６０−９０％、好ましくは９５％またはそれ以上、そしてより好ましくは９９％以上がポリペプチドで構成されている時、単量体ポリペプチドは単離される。タンパク質の純度または均一性は、例えば、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲルの電気泳動、引き続いてのポリアクリルアミドゲルの染色による一本鎖ポリペプチドバンドの可視化；高速液体クロマトグラフィー；または他の常法により、示される。タンパク質精製本発明におけるポリペプチドは、この分野で知られている、いかなる手段によっても精製することができる。タンパク質精製の種々の方法は、例えば、「Guide to Protein Purification（タンパク質精製への案内）」,ed .Deutscher,Meth.Enzymol.185,Academic Press,San Diego,1990;そして領域では「Protein Purification:Principles and Practice（タンパク質精製：原理と実施）」,Springer Verlag,New York,1982の中で述べられている。タキサジエン合成酵素ポリペプチドの変異体；標識本発明の具体例において、タキサジエン合成酵素ポリペプチドに包含されるものとして、変異ポリペプチドがあり、その変異ポリペプチド中に、天然のタキサジエン合成酵素ポリペプチドの置換、欠損、挿入または他の修飾がある。その変異体は、構造的および／または生物学的特徴を実質的に維持し、そして好ましくは一つまたは少数の近接したアミノ酸残基の、静止または保存的な置換である。好ましくは、そのような変異ポリペプチドは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは９０％、天然のタキサジエン合成酵素ポリペプチドに対して相同である。天然のタキサジエン合成酵素ポリペプチド配列は常法により修飾することができ、そのような常法には、例えば、アセチル化、カルボキシ化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、そして標識があり、それに引き続いてタキサジエン合成酵素ポリペプチドの、インビボまたはインビトロの酵素処理、または修飾したアミノ酸を用いてタキサジエン合成酵素ポリペプチドの合成のいずれかを行う。ポリペプチドまたはその断片を標識するための、種々の一般的な方法および試薬がある。典型的な標識には、放射性同位元素、リガンドまたはリガンド受容体、蛍光、化学発光試薬、そして酵素が含まれる。標識化する方法と、種々の目的のために適切な標識の選択の案内は、例えば、Sambrook et al.(1989)とAusubel et al(1987 定期的な改定を伴う)において議論されている。ポリペプチド断片本発明はまた、タキサジエン合成酵素ポリペプチドの断片もまた包含し、そのポリペプチドは天然の全長タキサジエン合成酵素ポリペプチドの、少なくとも１残基を欠損し、なおタキサジエン合成酵素の生物学的活性特性の少なくとも一つ、例えば合成酵素の酵素活性または免疫学的な限定特性の保持、を維持している。付加する例として、タキサジエン合成酵素ポリペプチドの免疫学的に活性な断片は、標的免疫システム（例えば、ネズミまたはウサギ）中において、タキサジエン合成酵素特異的抗体を引き起こす事が可能であり、またはタキサジエン合成酵素特異的な抗体への結合において、タキサジエン合成酵素と競合することが可能であり、そしてそれゆえに、生物学的サンプル中において、タキサジエン合成酵素ポリペプチドの存在のためのイムノアッセイに有用である。そのような免疫学的活性断片は、典型的には７から１７アミノ酸が最小サイズである。断片は、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、そして最も好ましくは少なくとも３０の連続した、天然のタキサジエン合成酵素ポリペプチドのアミノ酸を含む。融合ポリペプチド本発明はまた融合ポリペプチドを与え、それは、例えば、異種の融合ポリペプチド、すなわち、タキサジエン合成酵素ポリペプチド配列またはその断片、および異種のペプチド配列、例えば、異なったポリペプチドよりの配列を含む。そのような異種の融合ポリペプチドは、それゆえ融合した配列のそれぞれより与えられる生物学的な性質を示す（例えば、リガンド結合、触媒、分泌シグナル、抗原的限定、など）。融合相手には、例えば、イムノグロブリン、ベータガラクトシダーゼ、trpE、プロテインA、ベータラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母アルファ交配因子、および種々のシグナルおよび先導配列が含まれ、例えば、先導配列はポリペプチドの分泌を指示することができる。融合ポリペプチドは典型的には、組み換え核酸の発現または化学合成により作られる。ポリペプチド配列の決定本発明におけるポリペプチドの配列は、本分野で知られている、種々の方法により決定できる。ポリペプチドの配列を決定するために、典型的にはそのポリペプチドを断片化し、それらの断片を分離し、それぞれの断片の配列を決定する。タキサジエン合成酵素ポリペプチドの断片を得るために、ポリペプチドをトリプシン、クロストリパイン、スタフィロコッカスプロテアーゼのような酵素、またはシアノーゲンブロマイド、o-イオドソベンゾエート、ヒドロキシルアミンまたは2-ニトロ-5-チオシアノベンゾエートのような化学試薬で消化することができる。ペプチド断片は、例えば逆層高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、により分離して、そして気相シークエンシングにより解析することができる。抗体本発明はまた、タキサジエン合成酵素に特異的なポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を包含し、すなわち、そのような抗体はタキサジエン合成酵素に結合し、そして標準的な条件下においてタキサジエン合成酵素ポリペプチドを、他のポリペプチドより区別することができる。そのような抗体を作成し、常法によりアッセイした。種々のイムノアッセイ技術および応用を含め、本発明における抗体を調製および使用するために、例えば、Goding，「Monoclonal Antibodies:Principles and Practice（モノクローナル抗体：原理と実施）」,2d ed,Academic Press,New Y ork,1986;およびHarlow and Lane,「Antibodies:A Laboratory Manual（抗体：実験室マニュアル）」,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY ,1988を見よ。タキサジエン合成酵素特異的抗体は、例えば、：タキサジエン合成酵素ポリペプチドの精製；発現ライブラリーより、イチイまたは他の植物由来のタキサジエン合成酵素相同物のクローニング；タンパク質ブロットやイムノアッセイのための抗体プローブ；などに有用である。タキサジエン合成酵素のポリペプチドおよび抗体は、常法により標識が可能である。適切な標識として、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光試薬、化学発光試薬、磁気粒子、などが含まれる。植物の形質転換および再生植物細胞の形質転換、培養、および再生のために、良く知られた方法のいずれを用いることも可能であり、本発明の実施に当たって用いることが可能である。外来ＤＮＡを植物細胞中に導入する方法には、それに限定されるものではないが、Agrobacterium tumefaciensおよび二成分ベクターを含む、適切なTiベクターの使用を伴うトランスファー、化学的に誘導されたトランスファー（例えば、ポリエチレングリコール）、バイオリスティクスおよびマイクロインジェクションが含まれる。例えば、「Plant Molecular Biology Manual（植物分子生物学マニュアル）」A3:1-19,1988を見よ。本発明は下記の実施例を参照する事により、より良く理解されると考えられるが、それらの実施例は単に本発明を実施するために現在知られている最適形態として描くという意図である。しかしながら、本発明の範囲は、それに限定されるとは考えるべきではない。実施例１：タキサ-4(5),11(12)-ジエン合成酵素をコード化するｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定実験材料および実験方法植物、基質、および標準品活発に成長している４歳のT.brevifoliaの若木を温室中で維持する。[1-³H]ゲラニルゲラニルジフォスフェイト（120 Ci/mol）を、前に述べた（LaFever et al.，「Arch.Biochem.Biophys．」313:139-149,19 94）ように調製し、全合成により標準となる（±）タキサ-4(5),11(12)-ジエンを調製した（Rubenstein，「J.Org.Chem．」60:7215-7223,1995）。ライブラリーの構築木の裸子植物組織のために開発された、Lewinsohnと補助者の方法（Lewinsohn et al.，「Plant Mol.Biol.Rep．」12:20-25,1991）を用いて、T.brevifoliaの茎より総ＲＮＡを抽出した。Poly(A)⁺ＲＮＡは、oligo( dT)-セルロース（ファルマシア）上におけるクロマトグラフィーにより精製し、得られた５μｇのｍＲＮＡを、λＺＡＰIIｃＤＮＡを構築するために、製造者の指示書に従って用いた（Stratagene）。ＰＣＲに基づいたプローブの生成およびライブラリーのスクリーニング高等植物由来のモノテルペン、セスキテルペン、ジテルペンシクラーゼの、６つの入手可能な配列の比較より（Facchini and Chappell,「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」 89:11088-11092,1992;Colby et al.,「J.Biol.Chem.」268:23016-23024,1993;Ma u and West,「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」91:8497-8501,1994;Back and Chappe11 ，「J.Biol.Chem.」270:7375-7381,1995;Sun and Karmiya,Plant Cell 6:1509-1 518,1994;and Bensen et al.,「Plant Cell」7:75-84,1995）、共通した変性プライマーを合成するための、１１の相同領域が定義された。１２のプライマー（最もカルボキシ末端のプライマー、最もアミノ末端のプライマー、および両方向における９つの内部プライマー）すべては、CsClで精製したT.brevifolia葉柄ライブラリーのファージＤＮＡを鋳型として用いた広範囲の増幅条件において、すべての可能な組み合わせを配備した（Innis and Gelfand,in「PCR protocols（P CRプロトコール）」(Innis et al.,eds),pp.3-12,253-258,Academic Press,San Diego,CA,1990;Sambrook et al.,1989）。ゲル電気泳動により（Sambrook et al.,1989）ＰＣＲ生成物を分析すると、CC 7.2FおよびCC3R（図２を見よ）プライマーの組み合わせのみが、特異的なＤＮＡ断片を作成した（〜８０ｂｐ）。このＤＮＡ断片は、pT7Blue（Novagen）へとクローン化されて配列決定（DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing,Applied Bio systems）され、長さが８３ｂｐであると示された。ＰＣＲは、[α-³²P]dATPによるランダムな６量体ラベル（Tabor et al.,in「Current Protocols in Molecu lar Biology（分子生物学における現在のプロトコール）」,Ausubel et al.,Sec tions 3.5.9-3.5.10,1987）のために、この材料を最大１μｇ得るために使用し、標準プロトコール（Britten and Davidson,in「Nucleic acid Hybridisation （核酸ハイブリダイゼーション）」,Hames and Higgins,eds.,pp.3-14,IRL Pres s,Oxford,1988）を用いて大腸菌LE392の中において生育した、３×１０⁵プラークのフィルター除去物をスクリーニングするための、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。陽性シグナルを与えるプラーク（合計１０２）のうち、更なる２サイクルのハイブリダイゼーションによって、５０を精製した。３８の純粋なクローンは、Bl uescriptファージミドとして、インビボ排除された。挿入サイズは、T3およびT7 プロモーターを用いてＰＣＲにより決定し、１２の最大のクローンにつき（挿入＞２kb）部分配列を決定した。大腸菌中におけるｃＤＮＡの発現部分配列を決定した、全長挿入物はすべて、フレーム外であるか、または推定されるメチオニン開始コドンのすぐ上流に未熟な停止部位を持っていた。後者の複雑さは、ヘアピン状の形をした第２本目のｃＤＮＡ鎖を生成するという結果となりやすい（Old and Primrose，「Principl es of Gene Manipulation（遺伝子操作の原理）」,4th ed.,pp.3435,Blackwell Scientific,London,1989）。温度に安定であり、高精度である、鈍化ポリメラーゼであるPful（Stratagene）およびFRM42プライマー（偽停止コドンの下流）およびT7プロモータープライマーを用いて、pTb42由来の2.7kbの挿入は、ＰＣＲによりフレームへとクローン化された。得られた鈍麻な断片を、EcoRVにより消化したpBluescript SK(-)（Stratagene）中へ結合し、pTb42.1を得て、大腸菌XL1- Blue（Stratagene）へと形質転換した。テルペンシクラーゼ活性の、機能している発現を評価するために、pTb42.1をつないでいる大腸菌XL1-Blue細胞を、100μg/mlのアンピシリンと12.5μg/mlのテトラサイクリンを添加した5mlのＬＢ培地中において、200μＭのIPTGにより誘導するまで生育させて（A₆₀₀＝0.4まで）、25℃で4時間さらに生育させた。細菌を遠心分離により回収し（1800g、10分）、タキサジエン合成酵素のアッセイバッファー中に再懸濁し（Hezari et al.,「Arch.Biochem.Biophys．」322:437-44 4,1995）、０−4℃において簡単に高周波分解することにより破砕し、そして得られた懸濁液を遠心分離して、ペレットの砕片とした（18,000g、10分）。確立されたプロトコール（Hezari et al.,「Arch.Biochem.Biophys．」322:437-444, 1995）により、15μMの[1-³H]ゲラニルゲラニルジフォスフェイトおよび1mMのMg Cl₂の存在下で、31℃で4時間インキュベーションすることにより、上清のタキサジエン合成酵素活性をアッセイした。その反応生成物をペンタンにより抽出し、その抽出物をシリカゲル上においてカラムクロマトグラフィーにより、前述したように精製し（Hezari et al.,「Arch.Biochem.Biophys．」322:437-444,1995）、オレフィン画分を供給し、それぞれ画分の同量を液体シンチレーションスペクトロメトリーにより測定し、³Hの取り込みを定量した。フレーム外挿入のプラスミドを持つ、形質転換大腸菌におけるコントロール実験もまた、実行した。組み換え酵素のオレフィン生成物の同定は、キャピラリーガスクロマトグラフィーマススペクトラム／スペクトロメトリー（キャピラリーGC-MS）のみならず、キャピラリー放射ガスクロマトグラフィー（「キャピラリー放射ＧＣ）」により、前に述べた方法（Koepp et al.，「J.Biol.Chem.」270:8686-8690,1995）、および標準タキサ-4(5),11(12)-ジエン（Rubenstein，「J.Org.Chem．」60:72 15-7223,1995）を用いて証明した。GC-MS分析のために（Hewlett-Packard 6890 GC-MSD）、選択した特徴的イオンをモニターした：m/z272[P⁺];257[P⁺-15(CH₃]; 229[P⁺-43(C₃H₇];121,122,123[Ｃ環断片群];および107[m/z122ベースピーク-15( CH₃)］。非常に特徴的なＣ環の二重開裂断片イオンの由来が述べられている（Ko epp et al.，「J.Biol.Chem.」270:8686-8690,1995）。結果と考察ｃＤＮＡ単離と特性解析一般的な特性において（分子量、二価イオン要求性、反応速度定数、など）、タキサジエン合成酵素は、高等植物由来の他のテルペノイドシクラーゼと類似している；しかしながら、その酵素の組織タイターが低く、また広範囲の分取条件下において不安定であるため、そのタンパク質を均一に精製することが妨げられた（Hezari et al.,「Arch.Biochem.Biophys．」322: 437-444,1995）。電気泳動により精製したシクラーゼの１０μgサンプルを、標準的な分析方法により調製したが（Schagger and von Jagow，「Anal.Biochem. 」166:368-379,1987;Towbin et al.，「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」76:350-4354, 1979）、エドマン分解によりアミノ末端配列を提供する事はできなかった。匹敵するタンパク質サンプルの、トリプシン処理とＣＮＢｒ開裂を繰り返し行ったが、それもまた配列決定できるペプチドを提供する事はできなかった。その大部分は回収率が低いためである。タンパク質に基づいたオリゴヌクレオチドプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする、替わりの方法として、ＰＣＲに基づいた戦略が開発され、それはＰＣＲ増幅のための一組の変性したプライマーに基づいており、そのプライマーは、６つの高等植物テルペンシクラーゼにおいて、高度に保存され、その配列が知られている、その部位を認識するためにデザインされたものである。それらのシクラーゼの中の３つは、(-)-リモネン合成酵素（オランダ薄荷）由来のモノテルペンシクラーゼ）（Colby et al.，「J.Biol.Chem.」268:23016- 23024,1993）、エピ−アリストロケン合成酵素（タバコ由来のセスキテルペンシクラーゼ）（Facchini and Chappell,「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」89:11088-110 92,1992;Back and Chappell，「J.Biol.Chem.」270:7375-7381,1995）、およびカスベン合成酵素（トウゴマ由来のジテルペンシクラーゼ）（Mau and West，「 Proc.Natl.Acad.Sci.USA」91:8497-8501,1994）であり、各々のゲラニル（Ｃ₁₀ ）、ファルネシル（Ｃ₁₅）、およびゲラニルゲラニル（Ｃ₂₀）ジフォスフェイト基質の環状化において、タキサジエン合成酵素と類似した反応機構を利用する（ Lin et al.，「Biochemistry」,in press）。Arabidopsis thaliana（Sun and K armiya,「Plant Cell」6:1509-1518,1994）とトウモロコシ（Bensen et al.,「P lant Cell」7:75-84,1995）由来のカウレン合成酵素Ａおよびgrand fir由来（Ab ies grandis;Stofer Vogel,Wildung,Vogel,and Croteau，論文準備中）の(-)-アビエタジエン合成酵素は、かなり異なった機構を利用し、ゲラニルゲラニルジフォスフェイトの末端二重結合のプロトン化をともない、中間体コパリルジフォスフェイトの環状化を開始する。アビエタジエン合成酵素の場合には、それに引き続いてジフォスフェイトエステルのより典型的なイオン化が起こり、第二の環状化を開始するのに機能して、引き続いてオレフィンを生成する（LaFever et al. ，「Arch.Biochem.Biophys．」313:139-149,1994）。後者は、裸子植物のテルペンシクラーゼの配列のみが、現在利用可能であることを示している。すべてのシクラーゼ間の、推定されるアミノ酸配列の比較より、ＰＣＲのプライマー構築のための１１個の領域が標的とされた。広範囲の増幅条件の下で、１２個すべてのプライマーをすべての組み合わせで試し、引き続いてゲル電気泳動により生成物の解析を行うと、プライマーのひとつの組み合わせ［CC7.2（順方）CC3（逆方）位置は図２を見よ］のみが、T.brevifoliaのライブラリーファージ鋳型として用いると、特異的なＤＮＡ断片（８３塩基対）を得た。CC3プライマーは、(-)-リモネン合成酵素（Colby et al.，「J.Biol.Chem.」268:23016-23 024,1993）、エピ−アリストロケン合成酵素（Facchini and Chappell,「Proc.N atl.Acad.Sci.USA」89:11088-11092,1992）、カスベン合成酵素（Mau and West ，「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」91:8497-8501,1994）との間の強い相同性の領域を現している。CC7.２プライマーは、被子植物ジテルペンシクラーゼの配列の（ Mau and West，「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」91:8497-8501,1994 Sun and Karmiy a，「Plant Cell」6:1509-1518,1994;Bensen et al.,「Plant Cell」7:75-84,19 95）、最近得られた裸子植物のジテルペンシクラーゼである、grand fir由来の( -)-アビエタジエン合成酵素（Stofer Vogel,Wildung,Vogel,and Croteau,論文準備中）をコード化する、ｃＤＮＡクローンとの比較に基づいて選択された。８３塩基対の断片をクローン化して配列決定し、そしてシクラーゼ様である事が示された。このＰＣＲ産物を、ハイブリダイゼーションプローブとして用いるために³²Ｐでラベルされ、そして３×１０⁵個のプラークの、高度に厳密なスクリーニングに使用して、１０２個の陽性シグナルを得た。これらのクローンの中で、５０個を二つの更なるスクリーニング、インビボの切除および挿入の測定、の繰り返しを通じて精製した。最大の挿入物（＞2.0kb）を持つ１２個のクローンを部分的に配列決定し、それらはすべて同一遺伝子の現している事が示された。これら挿入物の中の４つは全長であることが判明した。大腸菌中におけるｃＤＮＡの発現精製した４つの全長クローンのすべては、フレーム外であり、またはヘアピン状の形をした第２本目のｃＤＮＡ鎖を生成するから、開始メチオニンコドンのすぐ上流に停止部位を有する。pTbよりの挿入は、ＰＣＲ法によりフレーム中へクローン化されて、その鈍麻な断片をpBluescr ipt SK(-)のEcoRV部位へ結合し、pTb42.1を得て、大腸菌XL1-Blueへと形質転換した。形質転換した大腸菌を、抗生物質を添加したＬＢ培地中で生育させて、IPTGにより誘導した。細胞を回収して均一化し、そしてその抽出物のタキサジエン合成酵素活性を、[1-³H]ゲラニルゲラニルジフォスフェイトを基質とした標準プロトコール（Hezari et al.,「Arch.Biochem.Biophys．」322:437-444,1995）を用いて、アッセイした。反応混合液より単離したオレフィン画分は、放射活性の生成物を含み（〜1nmol)、それは標準タキサ-4(5),11(12)-ジエンと、キャピラリー放射ＧＣにおいて一致していた（Rt=19.40±0.13分）。このジテルペンオレフィンの同定は、キャピラリーGC-MS分析により確定した。保持時間（12.73分対 12.72分）および、ジテルペンオレフィン生成物の選択したイオンマススペクトル（表１）は、標準タキサ-4(5),11(12)-ジエンと同一であった（Rubenstein，「J.Org.Chem．」60:7215-7223,1995）。表１に示した、選択した特徴的イオンの由来は、全体のスペクトラム存在量の大部分を説明するが、本明細書および他においても述べられている（Koepp et al.，「J.Biol .Chem.」270:8686-8690,1995）。サンプルの大きさが異なるので、標準品の全存在量（2.96E⁵)は、生合成したオレフィンの全存在量（1.42E⁵）の、最大２倍であった。これ、およびバックグラウンドとサンプル運転の間の差は、たぶん高質量断片の相対存在量におけるわずかな差異を説明するものである。表１；組み換えタキサジエン合成酵素により生成したジテルペンオレフィン（生成物）を、標準タキサ-4(5),11(12)-ジエン（「標準品」）と比較してのG C-MS分析同様に調製し、pBluescriptにより形質転換してフレーム外挿入を持つ大腸菌のコントロール培養物の抽出物は、ゲラニルゲラニルジフォスフェイトを検出可能なレベルのジテルペンオレフィンへ転換する事ができないため、これらの結果によりpTb42.1クローンは、イチイ由来のタキサジエン合成酵素をコード化している事が確認される。配列解析 pTb42およびpTb42.1由来の挿入物の両鎖の配列を決定した。Pfuポリメラーゼにより、誤りは導入されなかった。pTb42.1タキサジエン合成酵素ｃＤＮＡは２７００ヌクレオチドの長さであり、２５８６ヌクレオチドの完全な転写解読枠を含んでいる（図２）。その推定されたアミノ酸配列は、約１３７アミノ酸の推定上の色素体トランジットペプチドおよび約７２５残基（〜８２．５ｋＤａ）の成熟したタンパク質の存在、そのようなアミノ末端を標的とする配列の特質的なアミノ酸含量および構造的な特徴、およびそれらの開裂部位（Keegstra et al.,「Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.」40:471-501,1989;von He ijne et al.,「Eur.J.Biochem」180:535-545,1989）、およびジテルペンの生合成の位置は色素体中に限定されているという事実（West et al.,「Rec.Adv.Phyt ochem.」13:163-198,1979;Kleinig,「Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 」40:39-59,1989）を示している。成熟タンパク質の分子量は、天然の（成熟した）酵素の大きさ（〜７９ｋＤａ）に基づいてゲルロカクロマトグラフィーとドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）により評価された（West et al.,「Rec.Adv.Phytochem.」13:163-198,1979;Kleinig,「Annu.Rev .Plant Physiol.Plant Mol.Biol.」40:39-59,1989）。トランジットペプチド／成熟タンパク質の接合点および両者の半分の正確な長さは知られておらず、それは成熟タンパク質のアミノ末端が明らかにブロックされており、そしてまだ同定されていないからである。高等植物由来の他のテルペンシクラーゼとの、一対方式の配列比較により（Fe ng and Doolittle，「Methods Enzymol.」183:375-387,1990;Genetic Computer Group,Program Manual for the Wisconsin Packet,Version 8,Genetic Computer Group,Madison,WI,1994）、アミノ酸レベルにおいて明らかな程度の配列類似性を示した。yew（イチイ）由来のタキサジエン合成酵素は、オランダ薄荷由来の( -)-リモネン合成酵素（Colbyet al.，「J.Biol.Chem.」268:23016-23024,1993）に対して３２％の同一性および５５％の類似性を示し、タバコ由来のエピ−アリストロケン合成酵素（Facchini and Chappell,「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」89:1 1088-11092,1992）に対して３０％の同一性および５４％の類似性を示し、トウゴマ由来のカスベン合成酵素（Mau and West，「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」9 1:8497-8501,1994）に対して３１％の同一性および５６％の類似性を示し、Arab idopsis thalianaとトウモロコシ由来のカウレン合成酵素Ａ（Sun and Karmiya, 「Plant Cell」6:1509-1518,1994;Bensen et al.,「Plant Cell」7:75-84,1995 ）に対して３３％の同一性および５６％の類似性を示し、grand fir由来の(-)- アビエタジエン合成酵素（Stofer Vogel,Wildung,Vogel,and Croteau，論文準備中）に対して４５％の同一性および６７％の類似性を示した。この群中における他のメンバーとの、一対方式比較を行うと、大まかに比較できるレベルの同一性（３０−４０％）および類似性（５０−６０％）を示した。これらのテルペノイド合成酵素は、異なった植物種由来の、広範囲のシクラーゼの型を現しており、このクラスの酵素が共通の祖先であるという示唆を支持している（Colby et al. ，「J.Biol.Chem.」268:23016-23024,1993;Mau and West,「Proc.Natl.Acad.Sci .USA」91:8497-8501,1994;Back and Chappell，「J.Biol.Chem.」270:7375-7381 ,1995;McGarvey and Crteau，「Plant Cell」7:1015-1026,1995;Chappell,Annu. Rev.「Plant Physiol.Plant Mol.Biol．」46:521-547,1995）。タキサジエン合成酵素のアミノ末端配列は、近年決定されてきた微生物セスキテルペンシクラーゼ（Hohn and Beremand,「Gene(Amst.)」79:131-136,1989;Pro ctor and Hohn，「J.Biol.Chem.」268:4543-4548,1993;Cane et al.，「Biochem istry」33:5846-5857,1994）のいずれとも、近接して類似しておらず（同一性〜２０％；類似性〜４０％）、またタキサジエン合成酵素配列はプレニルトランスフェラーゼの公表された配列のいずれとも類似していなかった（Chen et al.,「 Protein Sci.」3:600-607,1994;Scolnik and Bartley，「Plant Physiol.」104: 1469-1470,1994;Attucci et al．「Arch.Biochem.Biophys．」321:493-500,1995 ）。それらはテルペノイドシクラーゼと同様に、アリリックジフォスフェイトを基質として用いて、同様の求電子的反応機構を利用している酵素群である（Poul ter and Rilling,in「Biosynthesis of Isoprenoid Compuonds（イソプレノイド化合物の生合成）」,Porter and Spurgeon,eds.,vol.1,pp.161-224,Wiley & Son s,New York,NY,1981）。アスパラギン酸リッチ（I,L,V）XDDXX(XX)Dモチーフは、大部分のプレニルトランスフェラーゼおよびテルペノイドシクラーゼ中において見出されており（Facchini and Chappell,「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」8 9:11088-11092,1992;Colby et al.,「J.Biol.Chem.」268:23016-23024,1993;Mau and West,「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」91:8497-8501,1994;Back and Chappell ，「J.Biol.Chem.」270:7375-7381,1995;Hohn and Beremand，「Gene(Amst.)」7 9:131-136,1989;Proctor and Hohn，「J.Biol.Chem.」268:4543-4548,1993;Cane et al.，「Biochemistry」33:5746-5857,1994;Chen et al.，「Protein Sci.」 3:600-607,1994;Scolnic and Bartley，「Plant Physiol.」104:1469-1470,1994 ;Attucci et al．「Arch.Biochem.Biophys．」321:493-500;Abe and Prestwich, 「J.Biol.Chem.」269:802-804,1994）、そして基質結合において役割を果たしていると思われ（Chen et al.,「Protein Sci.」3:600-607,1994;Abe and Prestwi ch，「J.Biol.Chem.」269:802-804,1994;Marrero et al.,「J.Biol.Chem.」267: 21873-21878,1992;Joly and Edwards,「J.Biol.Chem.」268:26983-26989,1993;T arshis et al.,「Biochemistry」33:10871-10877,1994）、タキサジエン合成酵素中においてもまた存在しており、DXXDDモチーフ（図２）と関連している。ヒスチジンおよびシステイン残基は、いくつかの植物由来のテルペノイドシクラーゼの活性部位に包含されている（Rajaonarivony et al.，「Arch.Biochem.Bioph ys．」299:77-82,1992;Savage et al.，「Arch.Biochem.Biophys．」320:257-26 5,1995）。整列した配列の探索により、タキサジエン合成酵素の、３つのヒスチジン（３７０、４１５および７９３の部位において）および３つのシステイン（３２９、６５０および７７７の部位において）が、植物テルペノイドシクラーゼ遺伝子の間において保存されていた。イチイ由来のタキサジエン合成酵素は、トウゴマ由来のカスベン合成酵素（Mau and West，「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」91 :8497-8501,1994）よりは、grand fir由来のアビエタジエン合成酵素と最も近接して類似しており、トウゴマ由来のカスベン合成酵素は同様の型の環状化反応を触媒するが、系統発生学的には非常に遠いものである。grand fir由来のアビエタジエン合成酵素は、裸子植物由来の現在入手可能な、唯一の他のテルペノイドシクラーゼであり（Stofer Vogel,Wildung,Vogel and Croteau、論文準備中）、針葉樹由来のこれら二つのジテルペンシクラーゼは、明らかに配列の相同性があるいくつかの領域を共有しており、それらの一つは偶然にプライマー構築のために選択されており、タキサジエン合成酵素のクローニングへと導いたＰＣＲにより入手したプローブの獲得のための道具であることが証明された。実施例３：トランジットペプチド配列を除去するために先端切除した、タキサジエン合成酵素遺伝子の発現天然のタキサジエン合成酵素遺伝子配列において、５’末端より除去部位まで、または最大１３７アミノ酸の色素体のトランジットペプチドをコード化する配列すべて（成熟したタキサジエン合成酵素ポリペプチドは、約７２５アミノ酸である）、先端除去を行なった。アミノ末端より残基３１（Glu）、３９（Ser）、４９（Ser）、５４（Gly）、７９（Val）、または８２（Ile）までアミノ酸残基を除去した、欠損変異体を作成した。これらの変異体を大腸菌カルス中において発現させて、細胞抽出液のタキサジエン合成酵素活性を上述した方法によりアッセイした。予備実験において、先端除去した変異体の発現は、野生型タキサジエン合成酵素以上に増加して約５０％までなり、また残基８３−８４を超えてさらに先端除去を行うとタキサジエン合成酵素活性は明らかに減少した。色素体のトランジットペプチドを少なくとも部分的に先端除去すると、タキサジエン合成酵素の発現は改善された。さらに、この配列を除去することによりタキサジエン合成酵素の精製が改善され、なぜならそのトランジットペプチドは大腸菌のチャペロンにより認識されるからであり、そのチャペロンは酵素と共に精製され、また精製に巻き込まれ、また、なぜならばタキサジエン合成酵素のプレタンパク質は、大腸菌中で発現した時には包含体を生成する傾向があるからである。トランジットペプチドを除去するための実際の開裂部位は、残基１３６（Ser ）と残基１３７（Pro）の間の、予想された開裂部位においてではないかもしれない。１３６残基のトランジットペプチドは非常に長いようであり、そして他の（モノテルペン）合成酵素は、だいだい残基６０（Met）においてアルギニンの直列対（Arg-Arg）を持っている。アルギニンの直列対の、アミノ末端すぐ近くにおける先端切除は、大腸菌中においてすばらしく発現するという結果をもたらした。タキサジエン合成酵素はArg-Arg要素を欠如している。また、残基８３-８４以降における先端除去は、活性を低下させる。実施例および直接的記述の両者により、本発明を詳述してきた。関連技術において通常の技術を有する者は、下記の請求項の中で述べられている本発明の同等物を推測できるであろうが、それは前述の記述の精神の範囲内である。それらの同等物は、本発明の範囲内に含まれるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/00 9/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クロトーロドニービーアメリカ合衆国ワシントン州 99163 プルマンエヌイーヴァレックスロード1835

Claims

【特許請求の範囲】１．天然タキサジエン合成酵素遺伝子の、少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチド。２．天然タキサジエン合成酵素遺伝子の、少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチド。３．タキサジエン合成酵素の生物学的活性を持つポリペプチドをコード化する配列を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。４．請求項１記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。５．請求項１記載のポリヌクレオチドを含む、植物細胞。６．請求項１記載のポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック植物。７．単離したポリヌクレオチドはポリペプチドをコード化する配列を含み、その配列はタキサジエン合成酵素の生物学的活性を有するポリペプチドをコード化し、そのヌクレオチドをコード化する配列が、天然のイチイタキサジエン合成酵素遺伝子と、少なくとも７０％のヌクレオチド配列類似性を有する、単離したポリヌクレオチド。８．ポリペプチドをコード化する配列が、天然のイチイタキサジエン合成酵素遺伝子と、少なくとも８０％の配列類似性を有する、請求項７記載のポリヌクレオチド。９．ポリペプチドをコード化する配列が、天然のイチイタキサジエン合成酵素遺伝子と、少なくとも９０％の配列類似性を有する、請求項８記載のポリヌクレオチド。 10．ポリペプチドコード化配列はポリペプチドをコード化し、そのポリペプチドは図２のタキサジエン合成酵素ポリペプチド配列に対して保存的アミノ酸置換のみを有するが、システイン残基３２９、６５０、７１９、および７７７；ヒスチジン残基３７０、４１５、５７９、および７９３；DDXXDモチーフ；DXXD Dモチーフ；保存されたアルギニン；およびRWWK因子、より成る群より選択された少なくとも一カ所におけるアミノ酸置換を例外とする、請求項７記載のポリヌクレオチド。 11．ポリペプチドをコード化する配列はポリペプチドをコード化し、そのポリペプチドは天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチド配列に対して、保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項７記載のポリヌクレオチド。 12．ポリペプチドをコード化する配列はポリペプチドをコード化し、その配列は天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチドの、トランジットペプチド配列の少なくとも一部分が欠損している、請求項７記載のポリヌクレオチド。 13．ポリペプチドをコード化する配列はポリペプチドをコード化し、そのポリペプチドは天然のタキサジエン合成酵素ポリペプチドと、完全に相同である、請求項７記載のポリヌクレオチド。 14．請求項７記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。 15．請求項７記載のポリヌクレオチドを含む、植物細胞。 16．請求項７記載のポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック植物。 17．タキサジエン合成酵素活性を有する、単離されたポリペプチド。 18．天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチドと、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１７記載のポリペプチド。 19．タキサジエン合成酵素ポリペプチドと、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１８記載のポリペプチド。 20．タキサジエン合成酵素ポリペプチドと、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１９記載のポリペプチド。 21．天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチド配列に対して保存的置換のみを有するが、例外として、天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチド配列の一つまたはそれ以上の位置におけるアミノ酸置換を有し、その位置は：システイン残基３２９、６５０、７１９、および７７７；ヒスチジン残基３７０、４１５、５７９、および７９３；DDXXDモチーフ；DXXDDモチーフ；保存されたアルギニン；およびRWWK因子、より成る群より選択された、請求項１７記載のポリペプチド。 22．天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチド配列に対して、保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項１７記載のポリペプチド。 23．天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチド配列に対して、完全に相同である、請求項１７記載のポリペプチド。 24．トランジットペプチドの一部分または全部を欠損している、請求項１７記載のポリペプチド。 25．天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチドの、少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む、単離したポリペプチド。 26．単離した、成熟した天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチド。 27．天然のイチイタキサジエン合成酵素ポリペプチドに対して、特異的な抗体。 28．細胞内においてタキサジエン合成酵素ポリペプチドを発現させる方法であり、：請求項１７による、タキサジエン合成酵素ポリペプチドをコード化する、発現可能なポリヌクレオチドを含む細胞を準備して；その細胞を、ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する、各段階を含む方法。 29．細胞が、タキソイド産生細胞である、請求項２８記載の方法。 30．ポリヌクレオチドが発現することにより、発現可能なポリヌクレオチドを欠損している他の類似した細胞と比較して、細胞がより高レベルのタキソイドの産生するようになる、請求項２９記載の方法。 31．タキサジエン合成酵素遺伝子を得る方法であり、：タキソイド産生生物の核酸を、適切なハイブリダイゼーション条件下において、請求項１記載のポリヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーと接触させて、それによりプローブまたはプライマーが、生物のタキサジエン合成酵素遺伝子とハイブリダイズするようにして；生物のタキサジエン合成酵素遺伝子を単離する、という各段階を含む、方法。