JP2000509266A - 細胞ｄｎａにおける数量的変化の同定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、下記工程：（ａ）正常細胞からのＤＮＡの単離およびタグプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡの増幅工程；（ｂ）検査対象の細胞と該増幅ＤＮＡとのインサイチュ・ハイブリダイゼーション工程；（ｃ）工程（ａ）のタグプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応による工程（ｂ）のインサイチュでハイブリダイズした細胞由来のＤＮＡの増幅工程、ならびに（ｄ）通常の方法で、工程（ｃ）の増幅ＤＮＡにおける数量的変化の同定工程を含む、細胞ＤＮＡにおける数量的変化の同定方法に関する。また、本発明は、当該方法を行なうのに適するキットにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞ＤＮＡにおける数量的変化の同定 本発明は、細胞ＤＮＡにおける数量的変化の同定方法および当該方法を行なう のに適するキットに関する。 分子腫瘍遺伝学の分野にとって、どの遺伝的変化および細胞遺伝学的変化がそ れぞれ、ある腫瘍に存在しているか、それらが生ずるのはどの配列か、そして、 例えば、治療の場合においてそれらが臨床の経過と関連しているかどうかを知る ことは重要である。これを見出すために、腫瘍の小さな細胞集団およびその単一 細胞それぞれのＤＮＡを調べることが必要である。この目的を達成するために多 くの試みがなされてきた。しかしながら、前記結果は満足のいくものではない。 したがって、本発明の目的は、小さな細胞集団および単一細胞それぞれのＤＮ Ａにおいて、遺伝的変化および細胞遺伝学的変化それぞれを同定することが可能 な方法を提供することにある。 本発明によれば、これは、請求の範囲に規定された主題により達成される。 したがって、本発明の主題は、下記工程： （ａ）正常細胞からのＤＮＡの単離およびタグプライマーを用いるＰＣＲ法によ るＤＮＡの増幅工程、 （ｂ）検査対象の細胞と工程（ａ）の増幅ＤＮＡとのインサイチュ・ハイブリダ イゼーション工程、 （ｃ）工程（ａ）のタグプライマーを用いるＰＣＲ法による、工程（ｂ）のイン サイチュでハイブリダイズした細胞由来のＤＮＡの増幅工程、ならびに （ｄ）通常の方法で、工程（ｃ）の増幅ＤＮＡにおける数量的変化の同定工程、 を含む細胞ＤＮＡにおける数量的変化の検出方法に関する。 「正常細胞」という用語は、それらのＤＮＡにおいて数量的変化が知られてい ないいかなる種類および起源の細胞をも含む。 かかる細胞からＤＮＡを単離および増幅する。この目的のために、常法を用い ることができる。増幅のためには、タグプライマーを用いるＰＣＲ法が供される 。「タグ」という用語は、プライマーが縮重（一般的）プライマーであってもよ い、即ち、細胞ＤＮＡの多くの異なる部位に結合できるプライマーが関係すると いう事実をいう。かかるプライマーの例は、ＤＯＰまたはＳｉＡプライマーであ る。 「検査対象の細胞」という用語は、いかなる種類および起源の細胞をも含む。 特に、これらは、腫瘍細胞または妊婦の血液由来の細胞である。小さい細胞集団 の細胞または単一の細胞が特に好ましい。間期の核を有する細胞が最も好ましい 。 検査対象の細胞は、健康な細胞由来の増幅ＤＮＡとのインサイチュ・ハイブリ ダイゼーションに供される。この目的のためには、通常の条件と材料を選択する ことができる。 インサイチュでハイブリダイズした細胞由来のＤＮＡは、増幅の鋳型として用 いられる。この目的のためには、相応じて前記タグプライマーを用いるＰＣＲ法 が供される。 増幅されたＤＮＡを用いて、数量的変化を決定する。この目的のためには、常 法が行なわれ得る。比較ゲノムハイブリダイゼーション法（ＣＧＨ）を行なうこ とが好ましい（カリオニーミ(Kallioniemi A.)ら、Science 258:818，1992、カ リオニーミ(Kallioniemi O．-P.)ら、Genes Chromosome Cancer，10:231，1994 およびリヒテル(Lichter P.)ら、Human Chromosomes中、バーマ(Verma R．S.)と バブ(Babu A.)編、ニューヨーク、1995、191頁を参照）。 本発明によれば、細胞ＤＮＡ、具体的には小さい細胞集団または単一の細胞の ＤＮＡにおける数量的変化を同定する方法を行なうためのキットも提供される。 かかるキットは、下記成分： （ａ）健康な細胞由来の増幅ＤＮＡであって、タグプライマーが隣接するＤＮＡ 、 （ｂ）タグプライマー、および通常の （ｃ）賦形剤、特にＤＮＡにおける数量的変化の同定に適するもの を含有する。 本発明により、細胞ＤＮＡ、具体的には小さい細胞集団または単一の細胞のＤ ＮＡにおける数量的変化を同定することが可能である。したがって、本発明は、 最小の組織試料および細胞凝集物の調査が重要である疾患の診断における使用に 適する。かかる疾患は、具体的には腫瘍疾患である。さらに、本発明は、妊婦の 血液中の胎児性細胞を調べるのに適する。よって、それは、出産前診断に関する 新規な可能性を表す。 図面の簡単な説明： 図１は、本発明の方法の図を示し、および 図２は、本発明の「タグ化ゲノムハイブリダイゼーション」（ＴＧＨ）法の使 用の有無での細胞株Ｃｏｌｏ ３２０ＨＳＲにおける染色体の過剰発現量を示す 。 下記実施例により本発明を説明する。実施例：本発明の方法による細胞株Ｃｏｌｏ ３２０（ＨＳＲ）の小さい細胞集 団の分析 細胞株Ｃｏｌｏ ３２０（ＨＳＲ）を用いて、本発明の方法（ＴＧＨ法、図１ を参照）を下記のように行なう。ＴＧＨ法は、いくつかの独立した工程で進行す る。 − スライド上でＣｏｌｏ ３２０（ＨＳＲ）の間期の核の調製工程。 − ＤＯＰ ＰＣＲによる正常のゲノムＤＮＡのタグ標識配列プールの調製工程 。 − タグ標識ゲノムＤＮＡの修飾。 − 細胞株Ｃｏｌｏ ３２０（ＨＳＲ）の間期の核でのタグ標識ゲノムＤＮＡの インサイチュ・ハイブリダイゼーション工程。 − ミクロマニピュレーションによる一定数のＣｏｌｏ ３２０（ＨＳＲ）細胞 集団の単離工程。ＴＧＨ処理の効率を評価するために、タグ標識ＤＮＡとハ イブリダイズする細胞核およびハイブリダイズしない細胞核の両方を単離し て、次いで、比較する。 − ＤＯＰ ＰＣＲによる単離された細胞核のＤＮＡ増幅。 − Ｃｏｌｏ ３２０（ＨＳＲ）細胞の染色体の不均衡を同定するための比較ゲ ノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）工程。 間期の核の調製に関して、血液からのゲノムＤＮＡの単離とＣＧＨプロトコー ルが関与し、公知の方法が参照される（カリオニーミ(Kallioniemi A.)ら、Scie nce 258:818，1992、カリオニーミ(Kallioniemi O．-P.)ら、Genes Chromosome Cancer，10:231，1994およびリヒテル(Lichter P.)ら、Human Chromosomes 中、 バーマ(Verma R．S.)とバブ(Babu A.)編、ニューヨーク、1995、191頁を参照） 。工程１ ＤＯＰ ＰＣＲによる正常のゲノムＤＮＡのタグ標識配列プールの調製。 試薬、緩衝液および溶液： − １０ｘ 反応緩衝液：２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂；５００ｍＭ ＫＣｌ；１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）；１ｍｇ／ｍｌ ゼラチン。 − １０ｘ ヌクレオチド混合物：２ｍＭの各ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴ Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）（ベーリンガーマンハイム製、ドイツ、カタログ 番号１２７７０４９のデオキシヌクレオシド三リン酸から調製）。 − １０ｘ ＤＯＰプライマー：２０μＭのオリゴヌクレオチド５’ＣＣＧ Ａ ＣＴ ＣＧＡ ＧＮＮ ＮＮＮ ＮＡＴ ＧＴＧ Ｇ３’（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ またはＴ）。 − ミニゲル用：アガロース；ＴＢＥ緩衝液：０．０８９Ｍ Ｔｒｉｓホウ酸塩 ：０．０８９Ｍ ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）；適当なサイズ マーカー（例えば、２ｋｂマーカー；カタログ番号１５６１５−０１６；ギ ブコ ＢＲＬ、エッゲンスタイン、ドイツ）；０．２５％ブロモフェノール ブルーと３０％グリセロールを有するゲル負荷緩衝液。 − 標識対象および増幅対象それぞれの正常細胞の開始ＤＮＡ。 詳細なコース： １． 下記成分を氷上で５００μｌの反応容器（統合された容量制限を有するＰ ＣＲ容器；ザルステット、ニュムブレッヒト、ドイツ）にピペットで入れ た。 （全体の容量５０μｌ）： １００ｎｇ 開始ゲノムＤＮＡ ５μｌ １０ｘ 反応緩衝液 ５μｌ １０ｘ ヌクレオチド混合物 ５μｌ １０ｘ ＤＯＰ プライマー Ｈ₂Ｏを５０μｌになるように添加する １．２５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（最後に添加しなければならない）。 ２． 開始ＤＮＡの無添加を除いて同じ成分を陰性対照として、ピペットで移し た。 ３． ＰＣＲ反応用に、オムニゲン／ハイバイト製の装置（タイプＡＺ １６２ ３；供給元、ＭＷＧ ビオテック、ミュンヘン近郊のエーベルスバッハ、 ドイツ）を用いた。下記の温度プログラムを用いた： − ９３℃で１０分の加熱による開始ＤＮＡの最初の変性、 − それぞれ、９４℃、１分；３０℃、３分；３０℃〜７２℃、３分；７ ２℃、３分で５サイクル（いわゆる「低いストリンジェンシー相」） − それぞれ、９４℃、１分；６２℃、１分；７２℃、３分（サイクル当 たり１秒の延長）で３５サイクル（いわゆる「高いストリンジェンシ ー相」） − ７２℃で１０分の最終伸長工程。 ４． ＰＣＲ反応後、生成物の７μｌのアリコートをアガロースゲルで分離した 。サイズマーカーとして１ｋｂマーカーを用いた。分離は、１ｘＴＢＥ緩 衝液中、１００Ｖで３０分間行なった。適用したＤＮＡを、臭化エチジウ ムを用いる染色により可視化し、写真撮影をした。通常、２００塩基対〜 ２０００塩基対間のＤＮＡ断片の「スメア」が可視化された。陰性対照で は、このサイズ範囲内にはＤＮＡが同定され得なかった。 ５． 最後に、ＰＣＲ精製キット（ディアゲン ゲーエムベーハー、ヒルデン、 ドイツ、カタログ番号２８１０６）により、残りのヌクレオチドをタグ標 識ＤＮＡから分離した。工程２ インサイチュ・ハイブリダイゼーション用のタグ標識ゲノムＤＮＡの修飾。 試薬、緩衝液および溶液 − ０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０． ５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（フラクションＶ、カタログ番号７３５０ ７８、ベーリンガーマンハイム）を有する１０ｘ 反応緩衝液。 − ０．１Ｍ β−メルカプトエタノール。 − ０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０ ．１２５ｍＭ ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガーマンハイム 、カタログ番号１５５８７０６）、０．３７５ｍＭ ｄＴＴＰを有する１０ ｘ ヌクレオチド貯蔵溶液。 − 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ニューイングランドバイオラブズ ゲーエム ベーハー、シュワルバッハ／タウヌス、ドイツ、カタログ番号２０９Ｌ）。 − ＤＮアーゼＩ貯蔵緩衝液：１ｍｌの０．１５Ｍ ＮａＣ、５０％グリセロ ール中３ｍｇ。 − カラム緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤ ＴＡ、０．１％ ＳＤＳ。 − カラム：セファデックスＧ５０（メディウム）、１ｍｌ ツベルクリンシリ ンジ（例えば、ファルマプラストＡ／Ｓ製「プリモ」、ＤＫ−４９７０ ロ ドビー）、グラスウール。 − ミニゲル用：アガロース；ＴＢＥ緩衝液；１ｋｂサイズマーカー（ギブコ ＢＲＬ、エッゲンスタイン、カタログ番号１５６１５−０１６）；ゲル負荷 緩衝液（前記参照）。 詳細なコース： １． ２μｇのタグ標識ＤＮＡ（工程１を参照）を、１０μｌの１０ｘ反応緩衝 液、１０μｌのβ−メルカプトエタノール、１０μｌのヌクレオチド貯蔵 溶液、２０ＵのＤＮＡポリメラーゼＩおよび２μｌの１：１０００希釈の ＤＮアーゼ貯蔵溶液とともにピペットで反応容器に移した（水中）。 ２． 修飾反応を１５℃で３０〜４０分間行なった。 ３． 反応混合物を氷上に置き、アリコートをインサイチュ・ハイブリダイゼー ションに適する断片サイズについて試験した。 ４． ＤＮＡの断片長は、ゲル電気泳動で決定した。１０μｌの反応バッチを、 ３μｌのゲル負荷緩衝液と混合し、沸騰水浴中で２〜３分間変性させた。 さらに氷上で３分後、アリコートを１ｋｂのサイズマーカーとともに１〜 ２％のアガロースミニゲルに適用した。ＤＮＡ断片を、１５Ｖ／ｃｍで３ ０分間分離させた。臭化エチジウムを用いる染色の後、ゲルをＵ．Ｖ．光 下で写真撮影し、ＤＮＡ断片のサイズを決定することができた。 ５． 最適の場合、ＤＮＡ断片は、５００〜１０００塩基対の間のサイズ範囲を 有しなければならない。断片の平均サイズがこの範囲を越えるとき、断片 の最適のサイズに達するまで、残りのＤＮＡをもう一度ＤＮアーゼＩとイ ンキュベートした。 ６． ＤＮアーゼを不活性化するために、２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（最終濃 度１０ｍＭ）および１μｌの１０％ＳＤＳ（最終濃度０．１％）を該バッ チに添加し、反応バッチを６８℃で１０分間加熱した。 ７． 取り込まれないヌクレオチドは、下記のように製造された分離カラムを用 いるゲル濾過によりＤＮＡ試料から分離した。 （ａ）最初に、１ｍｌのツベルクリンシリンジをグラスウールで０．２ｍ １の印まで詰め、次いで、１ｍｌの印まで緩衝化セファデックスＧ ５０を満たした。該カラムを１５ｍｌの容器内に移して、２０００ ｇ、室温で６分間遠心分離した。 （ｂ）１００μｌのカラム緩衝液をそれぞれ添加後、該カラムを再び遠心 分離した。この工程を３回繰り返した。 （ｃ）ＤＮＡをカラム上に置き、遠心分離（２０００ｇ、６分間）して、 反応容器中に回収した。このＤＮＡ試料の最終濃度は、約２０ｎｇ ／μｌである。それは、長期間（数カ月〜数年）−２０℃で保存す ることができる。工程３ Ｃｏｌｏ ３２０（ＨＳＲ）株の間期の核でのタグ標識ゲノムＤＮＡのインサイ チュ・ハイブリダイゼーション。 Ａ）Ｃｏｌｏ ３２０（ＨＳＲ）の間期の核のゲノムＤＮＡの変性。 試薬、緩衝液および溶液： − 変性溶液：７０％脱イオン化ホルムアミド（分子生物学用、カタログ番号１ １２０２７、メルク、ダルムスタット、２ｘ ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナト リウム（１Ｍ ＨＣｌでｐＨ７）。 − エタノール（氷冷）：７０％、９０％および１００％。 詳細なコース： １． 変性溶液をキュベット内に入れ、水浴中、７０℃に加熱した。 ２． 検査対象のＣｏｌｏ ３２０（ＨＳＲ）細胞の核を含むカバーグラス（７ ６ｘ２６ｍｍ）を、この溶液で正確に２分間インキュベートし、次いで、 直ちに冷却７０％アルコールに移した。 ３． 該カバーグラスを、７０％、９０％および１００％エタノール中で各５分 間脱水し、次いで、風乾した。 Ｂ）インサイチュ・ハイブリダイゼーション用のタグ標識ＤＮＡ試料の沈澱およ び変性。 試薬、緩衝液および溶液 − ３Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２。 − 脱イオン化ホルムアミド（分子生物学用、カタログ番号１１２０２７、メル ク、ダルムスタット）。脱イオン化は、ホルムアミドをイオン交換剤（例え ば、ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）樹脂、バイオラッドのカタログ番号１４２−６ ４２５、ミュンヘン、ドイツ）と攪拌させることにより行なった。 − ２ｘ ハイブリダイゼーション緩衝液：４ｘ ＳＳＣ、２０％デキストラン 硫酸。 詳細なコース： １． １μｇのタグ標識ＤＮＡと５０μｇのヒトＣｏｔｌＤＮＡ（ギブコ−ＢＲ Ｌ、エッゲンスタイン、カタログ番号５２７９ＳＡ）を１／２０倍の体積 の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍の体積の１００％エタノールの添加によ り沈澱させた。 ２． １２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清を分離し、ペ レットを５００μｌの７０％エタノールで洗浄し、再び遠心分離（１２， ０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、次いで凍結乾燥した。 ３． 沈澱したＤＮＡを６μｌの脱イオン化ホルムアミド中に挿入し、室温で３ ０分間振盪させた（ボルテックス）。 ４． ６μｌの２ｘハイブリダイゼーション緩衝液を添加後、再び３０分間振盪 を行なった。 ５． ＤＮＡを７５℃で５分間変性させ、氷上に５分間置き、次いで、３７℃で ３０分間インキュベートした（「プレアニーリング」）。 Ｃ） インサイチュ・ハイブリダイゼーション 詳細なコース： １． 変性したＤＮＡを含む１２μｌのハイブリダイゼーション混合物を、検査 対象の細胞核を含有する大きなカバーグラス上に置いた。 ２． １８ｘ１８ｍｍのサイズを有するカバーグラスをその上に置いた。 ３． １８ｘ１８ｍｍのカバーグラスを液体の接着剤で封じ、プレパラートを湿 ったチャンバー中、３７℃で４８時間インキュベートした。 Ｄ） ハイブリダイズした細胞の核の洗浄と検出 試薬、緩衝液および溶液： − 洗浄溶液Ａ：５０％ホルムアミド（ｐ．Ａ．、カタログ番号９６８４、メル ク、ダルムスタット）、２ｘＳＳＣ。 − 洗浄溶液Ｂ：０．１ｘＳＳＣ。 − 洗浄溶液Ｃ：４ｘＳＳＣ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０。 − 洗浄溶液Ｄ：２ｘＳＳＣ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０。 − ブロッキング溶液：３％ＢＳＡ、４ｘＳＳＣ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０。 − 検出緩衝液：１％ＢＳＡ、４ｘＳＳＣ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０。 − 抗ジゴキシゲニンローダミン、ＦＡＢ断片（カタログ番号１２０７７５０、 ベーリンガーマンハイム）。 − 抗退色溶液：０．２３３ｇ ＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ−２，２ ，２−オクタン）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、９０％グリ セロール。 − ４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）。 詳細なコース： １． 洗浄溶液ＡとＢを水浴でキュベット中４２℃に加熱した。 ２． 液体の接着剤の封環をカバーグラスから除去し、当該カバーグラスを次い で洗浄溶液Ａ中４２℃で３ｘ１０分間洗浄した。 ３． その後、洗浄溶液Ｂ中、３ｘ１０分間洗浄を行なった。 ４． ２００μｌのブロッキング溶液を当該カバーグラス上にピペットで置き、 カバーグラスを再びその上に置き、湿ったチャンバー中、３７℃で３０分 間インキュベートした。 ５． ブロッキング溶液を除去した；６μｇ／ｍｌのローダミン共役抗ジゴキシ ゲニン（ベーリンガーマンハイム）を有する２００μｌの検出緩衝液を代 わりに当該カバーグラス上に置き、カバーグラスの下で湿ったチャンバー 中、３７℃で３０分間インキュベートした。 ６． 次いで、細胞の核を有する大きなカバーグラスを洗浄溶液Ｃ中、４２℃で ３回各１０分間洗浄した。 ７． その後、細胞の核を有する当該大きなカバーグラスを、２００ｎｇ／ｍｌ （ＤＡＰＩ）を溶解した２ｘＳＳＣ中で２０分間インキュベートした。 ８． 洗浄溶液Ｄ中、室温で１〜２分間当該カバーグラスを洗浄する。 ９． 抗退色溶液でハイブリダイズした間期の核を覆う。工程４ ミクロマニピュレーションによるハイブリダイズした核の単離 装置： 蛍光顕微鏡用に装備した顕微鏡Ａｘｉｏｓｋｏｐ ＦＳ（カールツァイス、ジェ ナ、ドイツ）。 ド フォンブルン ミクロマニピュレーター（バコファー、ロイトリンゲン、ド イツ）。 ミクロチップの製造用のＤｅ Ｆｏｎｂｒｕｎｅ「ミクロフォルジ」（Ｍｉｋｒ ｏｓｃｈｍｉｅｄｅ）（バコファー、ロイトリンゲン）。 Ｂ２７０製のガラスプレート：サイズ７０ｘ３５ｍｍ、厚さ６ｍｍ；幅２６ｍｍ 、深さ４ｍｍの段を有する（ベルリネルグラスＫＧ製、ワルトクライヒブルゲル シュトラーセ５、１２３４７ ベルリン、ドイツ、注文番号Ｂ １００１５８ −ＰＯ／ｅｈ）。 詳細なコース： １． 単離対象のＣｏｌｏ細胞の核を有する大きなカバーグラスを、Ｂ２７０ガ ラスプレート上に置き（細胞が下方を向くように）；ベースの底とカバー グラス（と細胞の核それぞれ）の間の中間の空間を、抗退色溶液で満たし た。 ２． ミクロフォルジで製造したミクロチップをミクロマニピュレーターに挿入 した。当該ミクロチップを、約３０°の角度で上方に向くようにミクロフ ォルジにより伸ばした。 ３． 次いで、当該ミクロチップを抗退色溶液で満たした中間の空間内に、その 低い部分が単離対象の細胞の核に到達するように押し込んだ。 ４． Ｃｏｌｏ核は、顕微鏡下、適当なフィルター（ローダミン用フィルターセ ット番号４８７９１５−９９０１またはＤＡＰＩ用フィルターセット番号 ４８７９０１−９９０１、カールツァイス、イェーナ）による蛍光条件下 で可視化した。透過光を用いることにより、当該ミクロチップを同時に認 識することも可能であった。このようにして、個々に細胞の核をミクロチ ップ上で「ピックアップ」することが可能であった。（注意：細胞の核は 抗退色溶液中ではもろくはないが弾力性があるので、それらは、全体とし て単離することができる）。 ５． １つの核を１本の針でそれぞれピックアップし、後者を２０μｌのＨ₂Ｏ で満たしたＰＣＲチューブの底で破壊した。このようにして、正確に定め られた細胞数のハイブリダイズしたおよびハイブリダイズしない核を有す る集団を単離することができた。（注意：ハイブリダイズしない細胞の核 は、ハイブリダイズした核と同様に処理されたが、インサイチュ・ハイブ リダイゼーションでは、タグ標識ＤＮＡを添加しなかった）。 この工程の後、単離した核をＤＯＰ ＰＣＲに供した。このプロトコールは、 工程１（ポイント１〜５）と同一であるが、しかしながら、さらなる開始ＤＮＡ は、単離された核を除いて添加しない。ＤＯＰ ＰＣＲ産物は、通常のＣＧＨ分 析に用いた（カリオニーミ(Kallioniemi A.)ら、Science 258:818，1992、カリ オニーミ(Kallioniemi O．-P.)ら、Genes Chromosome Cancer，10:231，1994お よびリヒテル(Lichter P.)ら、Human Chromosomes中、バーマ(Verma R．S.)とバ ブ(Babu A.)編、ニューヨーク、1995、191頁を参照）。本発明の方法により、す べての染色体過剰発現量の８９％と９４％の間が３０個のＣｏｌｏ３２０（ＨＳ Ｒ）細胞と１０個のＣｏｌｏ３２０（ＨＳＲ）細胞でそれぞれ認識されるが、Ｔ ＧＨ工程なしでは３８％と４４％の間のみであることが示された。さらに、ＴＧ Ｈ処理群での偽陽性の発見の数は、非ＴＧＨ処理群よりも顕著に低かった（ ７対１８）（図２を参照）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年５月２２日（１９９８．５．２２） 【補正内容】 請求の範囲 １． 下記工程： （ａ）ＤＮＡにおける数量的変化が知られていない細胞からのＤＮＡの単離およ びタグプライマーを用いるＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅工程、 （ｂ）検査対象の細胞と工程（ａ）の増幅ＤＮＡとのインサイチュ・ハイブリダ イゼーション工程、 （ｃ）工程（ａ）のタグプライマーを用いるＰＣＲ法による、工程（ｂ）のイン サイチュでハイブリダイズした細胞由来のＤＮＡの増幅工程、ならびに （ｄ）工程（ｃ）の増幅ＤＮＡにおける数量的変化の同定工程、 を含む細胞ＤＮＡにおける数量的変化の検出方法。 ２． 検査対象の細胞が腫瘍に由来することを特徴とする、請求項１記載の方法 。 ３． 検査対象の細胞が妊婦の血液に由来することを特徴とする、請求項１記載 の方法。 ４． 検査対象の細胞が小さな細胞集団の細胞または単一の細胞であることを特 徴とする、請求項２または３記載の方法。 【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年６月２５日（１９９８．６．２５） 【補正内容】 ５． 検査対象の細胞が間期の核を有することを特徴とする、請求項１〜４いず れか記載の方法。 ６． タグプライマーが縮重プライマーであることを特徴とする、請求項１〜５ いずれか記載の方法。 ７． 工程（ｄ）の同定が「比較ゲノムハイブリダイゼーション」（ＣＧＨ）法 を含むことを特徴とする、請求項１〜６いずれか記載の方法。 ８． 下記成分： （ａ）ＤＮＡにおける数量的変化が知られていない細胞由来の増幅ＤＮＡであっ て、タグプライマーが隣接するＤＮＡ、 （ｂ）タグプライマー、および （ｃ）ＤＮＡにおける数量的変化を同定するための賦形剤、 を含有してなる、請求項１〜７いずれか記載の方法を行なうためのキット。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 下記工程： （ａ）正常細胞からのＤＮＡの単離およびタグプライマーを用いるＰＣＲ法によ るＤＮＡの増幅工程、 （ｂ）検査対象の細胞と工程（ａ）の増幅ＤＮＡとのインサイチュ・ハイブリダ イゼーション工程、 （ｃ）工程（ａ）のタグプライマーを用いるＰＣＲ法による、工程（ｂ）のイン サイチュでハイブリダイズした細胞由来のＤＮＡの増幅工程、ならびに （ｄ）通常の方法で、工程（ｃ）の増幅ＤＮＡにおける数量的変化の同定工程、 を含む細胞ＤＮＡにおける数量的変化の検出方法。 ２． 検査対象の細胞が腫瘍に由来することを特徴とする、請求項１記載の方法 。 ３． 検査対象の細胞が妊婦の血液に由来することを特徴とする、請求項１記載 の方法。 ４． 検査対象の細胞が小さな細胞集団の細胞または単一の細胞であることを特 徴とする、請求項２または３記載の方法。 ５． 検査対象の細胞が間期の核を有することを特徴とする、請求項１〜４いず れか記載の方法。 ６． タグプライマーが縮重プライマーであることを特徴とする、請求項１〜５ いずれか記載の方法。 ７． 工程（ｄ）の同定がＣＧＨ法を含むことを特徴とする、請求項１〜６いず れか記載の方法。 ８． 下記成分： （ａ）正常な細胞由来の増幅ＤＮＡであって、タグプライマーが隣接するＤＮＡ 、 （ｂ）タグプライマー、および通常の （ｃ）賦形剤、特にＤＮＡにおける数量的変化の同定に適するもの を含有してなる、請求項１〜７いずれか記載の方法を行なうためのキット。