JP2000509393A

JP2000509393A - 小分子エリスロポエチン様物質

Info

Publication number: JP2000509393A
Application number: JP9539178A
Authority: JP
Inventors: イアンエイ．ウィルソン; オデットリヴナ; エンリコエイ．ストゥラ; ダナエル．ジョンソン; リンダケイ．ジョリフィー
Original assignee: ザスクリプスリサーチインスティチュート
Priority date: 1996-04-26
Filing date: 1997-04-28
Publication date: 2000-07-25
Also published as: US7272508B2; IL126566A; US20060064252A1; AU709679B2; CA2251842C; DE69738739D1; AU2818797A; US20100250600A1; KR20000065004A; KR100458755B1; CN1114876C; EP1012741B1; WO1997041526A1; NZ513454A; CN1223732A; US5835382A; ATE397251T1; CA2251842A1; EP1012741A4; EP1012741A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、EPO受容体に結合し、エリスロポエチン（EPO）様物質として作用する分子を同定するためのコンピュータ支援方法（100、102、104、106、200、202、204）を特徴とする。本発明の方法を使用して同定される好ましいEPOは、EPO活性のインビボまたはインビトロにおける一つ以上の生物検定において、EPO受容体のアゴニストとして作用する。

Description

【発明の詳細な説明】小分子エリスロポエチン様物質発明の背景 1．発明の分野本発明は、小分子エリスロポエチン様物質を同定するためのコンピュータ支援方法とこれを設計するためのコンピュータ支援方法とに関する。 2．関連技術の説明エリスロポエチン（EPO）は、未成熟赤血球細胞の増殖および分化の第1の調節因子である。EPOは、低酸素症（血液または組織中の低酸素濃度）に応答して胎児の肝臓および成人の腎臓で産生される。EPOは血流中を循環し、骨髄および他の造血組織の前駆細胞のEPO受容体（EPOR）を標的とする。組換えヒトエリスロポエチン（rHuEPO）は、慢性腎不全、癌化学療法およびAZT治療による貧血患者の治療に広範に使用される。 EPO受容体は、インターロイキン（IL）、コロニー刺激因子（CSF）および成長ホルモンプロラクチンなどの他の造血増殖因子並びに毛様体神経因子（CNTF）の受容体を含むサイトカイン受容体スーパーファミリーに属する。この受容体ファミリーの構造構成は3つの基本単位：リガンド結合細胞外ドメイン、短い膜貫通ドメインおよび大きい細胞質ドメインからなる。このスーパーファミリーの細胞外ドメインには、各々がIg定常領域のトポロジーを有する逆方向のβ鎖からなる、サンドイッチ状に折りたたまれた約100個の残基を含有する2つの別々の領域が含まれる。このファミリーのメンバーは細胞外ドメインの2つの特徴的な中心的構造：N末端領域の1対の保存されたジスルフィド架橋、およびC末端領域のWSXWS ボックス（ここで、Xは任意のアミノ酸残基である）を共有する。この受容体スーパーファミリーのほとんどのメンバーについては、1つ以上のポリペプチド鎖の重合化が高親和性受容体複合体を形成するために必須である。ホモダイマー複合体はhGHRの活性型であることが明らかにされており、同様のモデルはG-CSF、プロラクチンおよびEPO受容体についても示唆されている。エリスロポエチンは2つのEPO受容体分子の二量体化を誘導して、2つのチロシンキナーゼ（JAK2）分子と結合することによって、細胞質ドメインがリン酸化され、関連する生物学的反応に至る事象のカスケードが開始される。エリスロポエチンの重要性を考慮すると、EPO受容体と結合することができ、E POに通常誘発される応答を誘発することができる分子を同定することが非常に望ましいと考えられる。発明の概要本発明は、EPO受容体と結合し、EPO様物質として作用する分子を同定するための方法を特徴とする。本発明の方法を使用して同定される好ましいEPO様物質はE P0活性のインビトロまたはインビボにおける1つ以上の生物検定においてEPO受容体のアゴニストとして作用する。好ましいEPO様物質はペプチド結合のない分子、すなわち非ペプチド性EPO様物質である。好ましいペプチドEPO様物質は15個以下のアミノ酸を有し、より好ましくは10以下のアミノ酸を有する。本発明の方法は、特定の構造を有する分子の同定および設計を含む。本方法は、EPO様物質として作用するペプチド、EMP1（EPO様ペプチド1：以下に記載）と複合体を形成するEPO受容体の細胞外ドメイン（アミノ酸1〜225）のX線結晶構造解析研究から得られる正確な構造情報の使用に基づく。この結晶構造解析データにより、EPO受容体結合および二量体化に重要なペプチドEPO様物質の原子が同定される。さらに重要なことには、このデータにより、重要な接触原子の3次元的配列が規定される。原子がこれらの接触原子の一部または全てと同様の3次元配列を有する部分が含まれるような他の分子は、EPO様物質として作用しうる可能性がある。さらに、本明細書に記載するペプチドEPO様物質よりもはるかに大きいEPO活性を有する分子を設計または同定するためにこの構造情報を使用することができる。本発明の好ましい態様の詳細を添付の図面および以下の説明に記載する。本発明の詳細が公知になったら、当業者には数多くの別の革新および変更が明らかになると思われる。図面の簡単な説明図1は、コンピュータシステムを使用したエリスロポエチン様物質と思われる物質を同定するための第1の方法を示すフローチャートである。図2は、コンピュータシステムを使用したエリスロポエチン様物質と思われる物質を同定するための第2の方法を示すフローチャートである。種々の図面中の同一の参照番号および名称は同一の構成要素を示す。発明の詳細な説明本明細書の説明において、示される好ましい態様および実施例は本発明を制限するものではなく一例であると考えるべきである。 EPO受容体の細胞外部分に結合する小分子EPO様物質の結晶構造を以下に示す。ペプチド、EMP1（GGTYSCHFGPLTWCKPQGG；配列番号1）は、分子内ジスルフィド架橋によって特徴づけられる。いくつかの証拠により、EMP1がEPO様物質として作用できることが示唆されている。例えば、EMP1は受容体結合解析においてEPOと競合し、EPOに応答するように操作された細胞系の細胞増殖を誘導する。EPOおよびペプチドは共にEPO応答細胞において、リン酸化事象および細胞周期の進行に似たカスケードを誘導する。さらに、EMP1は、新生赤血球細胞産生の2つの異なるインビボ解析でモニターしたとき、マウスにおいて大きな赤血球形成作用を明らかにしている。このデータを組み合わせることにより、EPOと関連のない配列を有するペプチドリガンドがEPO受容体に結合し、EPO受容体のアゴニスト構成物または組立物を誘導することができるという考えが強く裏付けられる。小分子エリスロポエチン様物質の設計 EMP1二量体の構造から、天然ホルモンより実質的に小型の分子がアゴニストとして作用し、適当な生物応答を誘発することができることが明らかである。このペプチドは天然ホルモンより実質的に小さい受容体接触界面を有すると想定される。EPO受容体の結合決定要因は、受容体と相互作用する小分子リガンドを設計する際に助力となる腔および帯電残基を持たず、天然の状態で主に疎水性であるほぼ平坦な面を形成することである。本明細書に示す構造データによって明らかにされる相互作用の簡略化したフレームワークを使用して、別のEPO様物質を同定することができる。EPO受容体との結合および二量体EPO受容体の形成に重要なEMP1原子は、EMP1（ペプチド）とEBP （EPO受容体）との接触に関与する原子および二量体複合体（ペプチドーペプチド接触）の2つのEMP1分子間の接触に関与する分子を含む。表2に掲載する接触に加えて、以下のEMP1-EMP1疎水性接触が重要である：各ペプチドのTyr^P4、Cys^P6 、Phe ^P8 、Trp^P13、およびCys^P15。以下のEMP1-EBP疎水性相互作用も重要である：各ペプチドのTyr^P4、Phe^P8、およびTrp^P13。重要な接触残基中に存在する原子の全てがEPO様物質に存在する必要はないことは当業者に理解される。EPO様活性に重要であると考えられるのは、実際にはEPO受容体との重要な接触部のごく少数の原子だけである。当業者は、本明細書の構造データを使用して構築できる二量体EM P1-EPO複合体モデルに基づいて、これらの重要な原子を同定することができる。好ましいEPO様物質は、EMP1のEPO受容体接触原子と同様の位置に原子を有する。さらに好ましいEPO様物質は、以下に記載する構造中に見られるEMP1の二量体と構造的に類似している。これは、EMP1の二量体化がEPO受容体の二量体化の重要な要因であるためである。本発明の方法は所望の構造を有する化合物を同定するためのコンピュータに基づいた方法を使用する。さらに具体的には、本発明は、ペプチドがヒトEPO受容体のアミノ酸1〜225を含むエリスロポエチン受容体の一部と共結晶するとき、ペプチドGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG中の原子のサブセットの3次元座標を使用して、コンピュータ方法によりペプチドおよび非ペプチド性のEPO様候補アゴニストを決定する。これらのコンピュータに基づいた方法は大きく2つの部類：データベース法およびデノボ（新規（de novo））設計法に分けられる。データベース法では、関心のある化合物を化学構造データベースに存在する全ての化合物と比較して、関心のある化合物と何らかが類似している化合物を同定する。データベース中の構造は、NMRまたはx線結晶構造解析によって作成した実験データまたは2次元（すなわち、配列）データに基づいてモデル化した3次元構造に基づいている。デノボ設計法では、構造が関心のある化合物と何らかが類似する化合物のモデルを、例えばx線結晶構造解析で作成したデータおよび／または理論的規則のような既知の構造から得られる情報を使用したコンピュータプログラムによって作成する。このような設計法は、原子ごとの方法で、または記憶させた小分子断片を一体化することによって望ましい構造を有する化合物を構築することができる。関心のある化合物と類似の活性を有する化合物を同定する際の、データベース法およびデノボ法の成功の可否は、関心のある化合物の機能的に関連する部分を同定できるか否かに依存する。医薬品に関しては、機能的に関連する部分をファルマコフォア（pharmacophore)（薬物が結合する受容体などの穴や部位）と呼ぶ。ファルマコフォアは、生物活性例えばEPO活性に重要な構造的特徴および官能基の配列である。望ましいファルマコフォアを有する同定化合物の全てがEPO様化合物として作用するわけではない。実際の活性は最終的には、関連ある生物検定において化合物の活性を測定することによってのみ測定され得る。しかしながら、本発明の方法を使用して、実際のEPO様物質を同定するために試験しなければならない化合物の数を大幅に減らすことができるので、本発明の方法は極めて有用である。 EPO受容体の二量体化は活性に重要である。従って、好ましいEPO様物質は、EP O受容体二量体に結合するEMP1二量体の構造に基づくと考えられる。このように、好ましいEPO様物質は以下に記載する構造に存在するRWJ61233ペプチドの両方との重要な接触部を含む。このようなEPO様物質はEPO受容体の二量体を形成しやすい。 2次元データから推定される3次元構造を作成するために好適なプログラムには：コンコード（Concord）（ミズーリ州セントルイスのトリポスアソシエイテッド（Tripo Associated））、3-Dビルダー（3-D Builder）（英国オックスフォードのケミカルデザイン社（Chemical Design Ltd.））、カタリスト（Catalyst）（カリフォルニア州マウンテンビューのバイオキャド社（Bio-CAD Corp.））、およびデイライト（Daylight）（イリノイ州アボットパークのアボットラボラトリーズ（Abbott Laboratories））が挙げられる。 3次元データベースを検索して望ましいファルマコフォアを保有する分子を同定するために好適なプログラムには：MACCS-3DおよびISIS/3D（カリフォルニア州サンレアンドロのモレキュラーデザイン社（Molecular Design Ltd.）、ケムD BS-3D（ChemDBS-3D）（英国オックスフォードのケミカルデザイン社（Chemical Design Ltd.））、およびシルビル（Sylbyl）/3DB（ミズーリ州セントルイスのトリポスアソシエイテッド（Tripo Associated））、カタリスト（Catalyst）（カリフォルニア州マウンテンビューのバイオキャド社（Bio-CAD Corp.））が挙げられる。ファルマコフォアの選択および設計のために好適なプログラムには：DISCO（イリノイ州アボットパークのアボットラボラトリーズ（Abbott Laboratories））、およびケムDBS-3D（ChemDBS-3D）（英国オックスフォードのケミカルデザイン社（Chemical Design Ltd.））が挙げられる。化学構造のデータベースはケンブリッジクリスタログラフィックデータセンター（Cambridge Crystallographic DataCentre）（英国ケンブリッジ）およびケミカルアブストラクトサービス（Chemical Abstracts Service）（オハイオ州コロンブス）を使用することができる。デノボ設計プログラムには、ルディ（カリフォルニア州サンジエゴのバイオシムテクノロジーズ社（Biosym Technologies Inc.）およびアラジン（Aladdin）（カリフォルニア州アービンのデイライトケミカルインフォメーションシステムズ（Daylight Chemical Information Systems））が挙げられる。当業者は、EPO様物質の設計は、本発明の方法を使用して設計または同定した化学構造をわずかに構造の変更または調節する必要があることを認識している。一般に、本発明の方法を使用して同定または設計された化合物を化学的に合成し、次いで以下に記載する方法のうち任意のものを使用してEPO活性について試験することができる。本発明の方法を使用して、EPO活性についてスクリーニングしなければならないEPO様物質であると考えられる物質の数を大幅に減らすことができるので、本発明の方法は特に有用である。本発明はハードウェアもしくはソフトウェアまたは両者を組み合わせて実施することができる。しかしながら、好ましくは本発明は、各々がプロセッサ、データ記憶システム（揮発性および不揮発性メモリーおよび／または記憶素子を含む）、少なくとも１つの入力装置および少なくとも１つの出力装置を備えるプログラム可能なコンピュータで実行するコンピュータプログラムで実施される。プログラムコードを適用してデータを入力し、上記の機能を実施し、出力情報を作成する。出力情報を既知の様式で１つ以上の出力装置に適用する。コンピュータは、例えばパーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータまたは従来デザインのワークステーションであってもよい。各プログラムは好ましくは、コンピュータシステムと対話する高水準の手順的またはオブジェクト指向的プログラミング言語で実施される。しかしながら、望ましい場合には、プログラムをアセンブリ言語または機械語で実施してもよい。いずれの場合でも、言語はコンパイルされた、すなわち翻訳された言語であってもよい。このような各コンピュータプログラムは好ましくは、本明細書に記載する手順を実施するためにコンピュータによって記憶媒体または装置を読み込むとき、コンピュータを構成して動作するため、一般的または特殊目的のプログラム可能なコンピュータによって読み込むことができる記憶媒体または装置（例えば、ROM または磁気ディスク）に記憶される。本発明のシステムはまた、このように構成された記憶媒体によってコンピュータが特異的で予め規定された様式で動作して本明細書に記載する機能を実施する、コンピュータプログラムで構成したコンピュータ読み込み可能記憶媒体として実行されると考えてもよい。図1は、コンピュータシステムを使用した、EPO様物質と思われる物質を同定するための第1の方法を示すフローチャートである。この方法は、プロセッサ、データ記憶システム、少なくとも１つの入力装置および少なくとも１つの出力装置を備えるプログラム式コンピュータを使用し：（1）ペプチドGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGが、エリスロポエチン受容体のアミノ酸1〜 225を含む受容体の一部と共に結晶化されるとき、ペプチドの原子のサブセットの3次元座標を含むデータを入力装置を介してプログラム式コンピュータに入力することによって、基準データを作成する段階と（ステップ100）；（2）プロセッサを使用して、基準データセットとコンピュータデータの記憶システムに記憶された化学構造のコンピュータデータベースとを比較する段階と（ステップ102）；（3）3次元データベースを検索して望ましいファルマコフォアを保有する分子を同定するために好適なプログラム（上記のプログラムまたは同等なものなど）を使用して、基準データセットと構造が類似した部分を有する化学構造をデータベースから選択する段階と（ステップ104）；（4）基準データセットと類似した部分を有する、選択した化学構造を出力装置に出力する段階（ステップ106）とを含む。図2は、コンピュータシステムを使用したエリスロポエチン様物質と考えられる物質を同定するための第2の方法を示すフローチャートである。この方法は、プロセッサ、データ記憶システム、少なくとも１つの入力装置および少なくとも１つの出力装置を備えるプログラム式コンピュータを使用し：（１）ペプチドGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGが、エリスロポエチン受容体のアミノ酸1 〜225を含む受容体の一部と共に結晶化されるとき、ペプチドの原子のサブセットの3次元座標を含むデータを入力装置を介してプログラム式コンピュータに入力することによって、基準データを作成する段階と（ステップ200）；（２）化学構造モデルを作成するために好適なプログラム（上記のプログラムまたは同等のものなど）を使用して、基準データセットと構造が類似した部分を有する化学構造のモデルを構築する段階と（ステップ202）；（３）構築したモデルを出力装置に出力する段階（ステップ204）とを含む。生物活性の確認本発明の方法を使用して同定した分子がEPO様物質として作用することができるかどうかを測定するために、EPO活性のインビトロまたはインビボにおける解析を1つ以上を実施するべきである。例えば、EPO様分子はTF-1細胞（Kitamuraら、J.Cell Physiol．140:323，1985）またはB6Sut細胞（Greenbergerら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA 80:2931，1983）の増殖を刺激することができるはずであるが、好ましくはEPO受容体を保有しない細胞の増殖を刺激しない。したがって、好ましいEPO様物質はMo7e細胞（Avanziら、Br．J．Haematol．69:359，1988) の増殖を刺激しない。 EPO様物質と考えられる物質を、赤血球形成のマウスモデルで試験してもよい。この検定では、EPO様物質と考えられる物質を、内因性基底量のEPOを発現する正常なマウスに投与する。網状赤血球を好ましくはフローサイトメトリーによって計数し、EPO様候補アゴニストが網状赤血球量を増加させるかどうかを測定する。網状赤血球量の増加は、EPO様候補アゴニストが赤血球形成を刺激していることを示す。この検定に使用したマウスはすでにEPOを発現しているので、この検定は比較的感受性が低い。別法として、EPO様候補アゴニストを低酸素症発症-多血症マウス生物検定で検定してもよい。この検定では、低圧室でマウスを馴化して内因性EPO量を低下させることによって、多血症を誘発する。EPO様物質と考えられる物質を馴化したマウスに投与することができる。⁵⁹Feの血中への取り込みが赤血球形成の測定値として役立つ。この赤血球形成がEPO様候補アゴニストに起因することができる。上記の解析は好適な解析法の一例である。当業者に周知の他のEPO活性検定法も有用である。 EPO様候補アゴニストの生物活性を測定するためには、EPO様候補アゴニストの種々の濃度における生物活性を測定することが好ましい。EPO様候補アゴニストの所定の濃度での活性を、EPO自身の活性と比較することができる。構造データペプチドEMP1に結合したヒトEPO受容体のアミノ酸1〜225のアミノ酸の座標を、標準的なブルックハブン（Brookhaven）データベース形式で別添に示す。ファンデルワールス相互作用の一覧もこの別添に示す。本発明の方法によってこれらの座標をEPO様物質の設計および同定に使用することができる。 EBP-EMP1複合体の構造残基1〜225を含むヒトEPO受容体の細胞外フラグメント（EPO結合タンパク質、 EBP）を大腸菌（Escherichia coli）で発現させ、記載のように精製した（Johns onら、Protein Express.Purif.7:104，1996）。EBPとEMP1との複合体の長斜方形結晶を斜方晶空間群P2₁2₁2₁の形で得た。細胞パラメーターはa=59.2Å、b=75.5 Å、c=132.2Åで、2つのEBP分子および2つのペプチド分子は非対称単位で、V_M=2 .8Å³/ダルトンであった（Matthews，J．Mol．Biol．33:491，1968）。この結晶構造を、重原子誘導体を使用し複数同形置換（MIR）によって測定した。各ペプチドの残基1〜2および19〜20並びに受容体分子Iの残基1〜9、21〜23、164〜166 、221〜225および受容体分子IIの残基1〜9、21〜23、133〜135、221〜225は電子密度が少ないか、または全く存在しないので、構造解析から除外する。構造の解釈に影響を与える、電子密度の重大なとぎれは、アミノ末端α-ヘリックスを両受容体分子のD1の第1のβ鎖に結合する3つの残基（Arg²¹-Gly²²-Pro² ³ ）について生ずる。分子パッキングダイアグラムは、この3-残基架橋部がどのように結合されるかについて2つの可能性を与える、結晶構造解析的に関連のない第2の二量体の結晶中での近接を示す。架橋部の結合性の最新の選択は、同様の分子パッキングを共有するが、電子密度はこれら3つの残基についてあきらかになっている、高解像度（2.5Å)での別の独立したEBP-ペプチド複合体の構造に基づいている。現時点では、このN末端α-ヘリックスが溶液中に存在するか、または結晶体充填物中に存在するかどうかを解明する実験データはない。注目すべきことには、このヘリックス領域は、hGHbp（残基32から始まる；deVosら、Science 255:30 6，1992）、PRLR（残基2から始まる、第1のβ鎖、残基6までは規定されたいかなる2次構造も存在しない；Somersら、Nature 372:478，1994）、INF-yRα（残基1 7から始まる；Walterら、Nature 376:230,1995）または組織因子（残基3から始まる、第1のβ鎖、残基11までは規定されたいかなる2次構造も存在しない；Mull erら、Nature 370:662,1994）の既報の構造では観察されない。 EBPモノマーは2つの領域D1およびD2に折りたたまれ、各領域の長軸が互いに対して約90°に配列されL字型を形成する；総分子寸法は45Å×52Å×62Åである。N末端領域（D1、残基10〜114）およびC末端領域（D2、残基119〜220）は短い4 つの残基のα-ヘリックス架橋部に結合される。両領域は、全体的なトポロジーが、Ig領域よりもIII型フィブロネクチン（FBN-III）領域により密接に関連する（Borkら、J.Mol．Biol.,242,309，1994）。FBN-IIIの折り畳み部は、鎖A、B、E および鎖G、F、CおよびC'からなる、2つの逆平行のβ-プリーツシートを含み、ヒト成長ホルモン（de Vosら、Science 255:306，1992）およびプロラクチン（S omersら、Nature 372:478，1994）受容体の2つの領域、インターフェロン-γ受容体のα鎖のD1およびD2領域（INF-γRα）（Walterら、Nature 376:230,1995）、CD4のD2領域（Wangら、Nature348:411，1990;Ryuら、Nature348:419，1990）、組織因子の2つの領域（Mukkerら、Biochemistry 33:10864，1994;Harlosら、N ature 370:662，1994）、III型フィブロネクチンの強靭な繰り返し部分（Leagy ら、Science 258:987，1992）およびシャペロンタンパク質PapDのD2領域（Holmg renら、Nature 342:248，1989）に見られる。1つのβ-シート（鎖A、B、Eおよび D）の鎖Dが他（鎖G、F、C、C'）に移行することにより、FBN-IIIのトポロジーは Ig定常領域とは異なり、それはC7鎖と規定される。EBPのD1およびD2領域の等価なβ-シートコア残基の重ね合わせは77Cα対が2.3Åのr.m.s.偏差を示し、これはhGHbp（1.1Å ）およびPRLR（0.8Å)の対応する領域の重ね合わせよりかなり大きく、この2つのEBP領域の折り畳みのサブクラス間の差を反映している。 D1では、短いα-ヘリックス（残基10〜20）が、厳密なFBN-IIIポロジーではなく、FBN-III折り畳みとIg折り畳みとのハイブリッドとして十分に記載されている第1のβ-サンドイッチ（残基24〜114）の手前に位置する。このh型折り畳みでは（Wangら、Nature 348:411,1990;Ryuら、Nature348:419，1990）、C'鎖は長く、鎖Cと最初に相互作用し、次いで鎖Eと相互作用するようになり（ここで、C'は呼び名を鎖Dと変更する）、4-オン-4鎖β-サンドイッチを形成する。D1は、Cys² ⁸ (βA)とCys³⁸（βB）およびCys⁶⁷（βC'）とCys⁸³（βE）を架橋する2つの保存されたジスルフィド架橋を有する。この2つのジスルフィド架橋を形成するシステイン対間の残基数はEBPでは9および15であり、これと比較してGHRおよびPRLR 双方では9および10である。鎖C'とEの間の長い連結によって、鎖C'の第2の半分は鎖Dとなる。このh型トポロジーはこの2つのs型GHR領域のどちらにも見られない。グリコシル化の可能な部位はβBおよびβC鎖を連結するループ領域の末端方向に位置するAsn⁵²残基に存在する。この細菌が発現するタンパク質中ではAsn⁵² はグリコシル化されないが、Asn⁵²側鎖周辺の外側腔は炭水化物を容易に収容すると思われる。ヘリックス架橋部（残基115〜118）はD1とD2を連結し（Ile¹¹⁵、Asn¹¹⁶、Glu¹ ¹⁷ およびVal¹¹⁸の領域間ヘリックス架橋部のΦ、ψ捻れ角は、それぞれ-50°、- 27°、-76°、-21°、-99°、26°および-151°、38°である）、この受容体ファミリーの他のメンバ-hGHbp、PRLR、IFN-γRαおよび組織因子において観察されている。EBPでは、この領域の結合は、D1の11残基およびD2の12残基による水素結合、疎水性相互作用および1つの塩架橋（Arg³²とAsp¹²²の間）の混ざり合いによってさらに制限され、2つの領域の総埋残面積［相互作用によって埋残される分子の表面積は、1.7Åのプローブ球と標準的な原子半径を使用したプログラムMS（Connolly，J．Appl．Crystallog，16:439，1983）を使用して算出した（D aviesら、Ann．Rev．Biochem．59:439，1990）。異なるアルゴリズム（Connolly およびLeeら、J．Mol．Biol.,55:379，1971）とプローブ半径を使用したことにより、本明細書で報告する値と他の（de Vosら、Science 255:306，1992）既報値との間には弱冠の矛盾があるかもしれない。明確にするために、本明細書で報告する値は全て、受容体間の比較を良好にするために同一の方法で計算されている］は950Åである。 D2（残基119〜220）は、1つの遊離システインを使用し、ジスルフィド架橋を使用しないで標準的なFBN-III（s型）トポロジーに折りたたまれ、D1にそれぞれ 3つおよび2つのジスルフィド架橋を有するが、D2には全く有しないGHRおよびPRL Rと一致する。α-ヘリックス架橋部以降において、D2は、hGHbp、PRLR、組織因子およびIFNγ-Rαでは保存され、クラス1およびクラス2サイトカイン受容体のほとんどでは配列に基づいているPro¹²⁴を含む、不規則なコイル（残基118〜126 ）を開始する（Bazan、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:6934，1990）。この短いコイルはGly¹²⁴で終わり、hGHbp（Φ、ψ=63°、68°）およびPRLR（Φ、ψ=5 8°、38°）の等価なAla¹³⁶およびAla¹⁰¹捻れ角と一致した正のΦ(Φ、ψ=52° 、40°)を有する。Pro¹²⁴領域は、WSXWSモチーフを有する対応する膨らみに隣接して平行な、類似の伸長した膨らみ構成体を形成する。WSAWS配列は修飾された幅の広いβ-膨らみを形成し(Richardson、Adv．Prot．Chem．34:167，1981)、通常ではEPORの膜貫通ドメインに連結されると思われるβG鎖の直前の伸長鎖領域に配置される。複合体の4次構造は、2つのペプチドと2つの受容体を含んで、T型組立体を形成する。非共有ペプチド二量体は2つの受容体分子と相互作用して、ほぼ完全な2つ折りの対称な配列を形成する。この二量体の2つのEBP分子のD2を重ね合わせることにより、2つのD1領域の質量中心はわずかに0.8Å離れているだけで、完全な2 つ折りの対称体を乱すのに十分である。この二量体の角受容体の対応するD1およびD2を別々に重ね合わせることにより、r.m.s.偏差は0.53Å(105D1Cα対）および0.47Å（93D2Cα対）である。環状EMP1はCys^P6とCys^P15との間に1つのジスルフィド架橋を含み、Gly^P9-Pro^P ¹⁰ -Leu^P11-Thr^P12残基を含む、わずかに歪んだ1型β-折り返し［β-折り返しのP ro^P10（i+1）およびLeu^P11（i＋2）は、それぞれΦ、ψ=-62°、-38°および-99 °、-60°である。Leu^P11のカルボニル酸素はEBPと水素結合し、標準的なI型β- 折り返しの正常値0°±30°（i+2）からψ値を歪ませている］によって連結される2つの短いβ鎖（残基4〜7および13〜16）と架橋する。各ペプチドは他のペプチドパートナーと非常に密接に結合し、この相互作用でその分子表面1220Å²のうち320Åを埋残する（Connelly，J．Appl．Crystallog．16:439，1983;Daviesら、Ann．Rev．Bioche m.59:439，1990;Richards、J．Mol．Biol．55:379，1971）。2つのペプチドの主鎖間の4つの水素結合によって、4つの標準的な逆平行のβ-プリーツシートを形成する（表2）。2つの対称な疎水性コアはペプチド二量体化によって一体化され、ジスルフィド架橋並びにTyr^P4、Phe^P8およびTrp^P13の側鎖を含む。各疎水性コアの構成は、コーナーにPhe^P8、Trp^P13およびTyr^P4（他のペプチド由来）の芳香族環およびジスルフィド架橋（Cys^P6-Cys^P15）を置いた箱に似ている。ペプチドの両端の2つのグリシン残基は構造体を形成しない。ペプチド二量体は、2つのEBP受容体分子間の深い割れ目に埋め込まれる。各ペプチドモノマーの一部は両受容体分子と相互作用する。ペプチド二量体の結合の結果重ね合わさった2つ折りの対称な相互作用により、実際に各EBPの結合部位は同じである。EBPの4つの主要な接触領域は、D1では鎖AをＢに（L1残基33〜34）、鎖FをGに（L6残基90〜94）連結し、D2では鎖BをCに（L5残基148〜153）、鎖F をGに（L6鎖203〜205）連結する4つのループ領域（L1、L3、L5、L6）のセグメント由来である。ペプチド-EBP組立体の総埋残分子面積は、2つのペプチドおよびE BPについてそれぞれ840Åおよび880Åである。ペプチド-EBP相互作用は別個の疎水性領域（67%）と極性領域（33%）とに分離することができる。疎水性コアはペプチドと受容体との間に形成され、1つのEBP分子由来のPhe⁹³、Met¹⁵⁰およびPhe²⁰⁵ 並びに一方のペプチド由来のPhe^P8およびTrp^P13並びに他方のペプチド由来の Tyr^P4およびCys^P15からなるペプチド疎水性ボックスを含む。極性相互作用は主に、結合割れ目の底に位置し、D2では主にループL5と共存する。6つの水素結合のうち5つは、主鎖を有する1つのペプチド由来のβ-折り返し主鎖のGlyP9、ProP 10およびLeuP11残基と保存されているTyr^P4の側鎖水酸基との間で、他方のペプチドパートナーと架橋し、ループL3と相互作用する（表2）。受容体間に埋残された分子表面積が、各受容体分子由来のLeu¹⁷⁵およびArg¹⁷⁸に寄与されてわずか 75Å²である複合体の全体の安定性に対して、EBP-EBP相互作用は驚く程わずかに寄与するだけである。 EMP1は、システイン以外にいくつかの保存された残基を有する配列のファミリーの1つである。このようなコンセンサスの残基のうち最も構造上重要なものは、 Tyr^P4およびTrp^P13であると考えられ、ジスルフィド架橋とともに、ペプチド-ペプチド相互作用の疎水性コアに大きく寄与する。さらに、これら2つの芳香族残基はペプチド-受容体相互作用および受容体二量体化において重要な役割を果たす。溶液中のEBPの二量体化溶液中のEMP1とEBPとの相互作用を解明するために、本発明者らはペプチド依存性二量体構造を安定化する試みにおいて、2官能性スルフィドリル反応性架橋物質DPDPB、[1,4-ジ-（2'-ピリジルジチオプロピオンアミド）ブタン］を使用した。架橋物質の選択は、EBPを不活性化することが見出されたアミン反応性架橋物質を用いた過去の実験に基づいた。EBPは、架橋試薬とおそらく反応する可能性の高い1つの遊離スルフィドリル基（Cys¹⁸¹）を有する（DPDPB架橋物質自体は EBPのEPO結合能およびEMP1の増殖特性を不活性化しない）。二量体のEBP産物はE MP1、DPDPBおよびEBPを共インキュベーションすることによって形成される。二量体産物の量はペプチド濃度と共に増加し、ペプチドが存在しない場合には多くの二量体産物が観察されない。ジスルフィド交換反応を介して形成されるDPDPB 架橋産物は、共有結合によって架橋されたEMP1媒介二量体について観察されるように、還元によって容易に可逆的となるはずである。さらに、本発明者らは、EM P1の共有結合で架橋された二量体型を構築し、生物効力の増加を明らかにする（ Johnsonら、作成中）。EBP二量体のD2のCys¹⁸¹残基は20.7Å離れ（Sγ-Sγ距離）、DPDPB架橋物質の長さ16Å（および各端部の結合長さは約２Å）に近い。このように、EMP1は、結晶構造と一致した、溶液中の可溶性EBP二量体複合体の形成を媒介する。 WSXWSモチーフ WSXWSボックスに対応するWSAWS配列（残基209〜213）は、D2のβ鎖の直前のβ -膨らみ中に生じる（Richardson，Adv．Prot．Chem．34:167，1981;Chanら、Pro teinScience，2:1574，1993）。このモチーフはリガンドと相互作用せず、受容体-受容体相互作用に全く役割を果たさず、受容体-受容体界面および受容体-リガンド界面の対向面に位置される。WSAWSボックスは、D2の4本鎖β-シート由来のいくつかの他の保存された側鎖に関係する、相互作用の複合体配列のセグメントのみを表す。Trp²⁰⁹およびTrp²¹²のインドール環系はβ-シートの外側凹面に向いており、部分的にのみ溶媒に暴露されているだけであるが、Ala²¹¹側鎖は直接溶液中を向いている。Ser²¹⁰およびSer²¹³両者のアミドおよび水酸基は、カルボニル酸素ではなく側鎖の水酸基がβ-シート相互作用を形成する、修飾された幅の広いβ-膨らみに似た（Richardson，Adv．Prot．Chem．34:167，1981;Chanら、Protein Sc ience，2:1574，1993）疑似β-シート型相互作用の隣接鎖Fの残基198および196 の主鎖と水素結合を形成する。β-膨らみの構成は、正常なβ-シートまたは伸長鎖構造と同様に、β-シートの同じ側に2つのTrp残基を配置し、4つの残基を離して拡散させるが、対向面には配置しない。膨らみの中心残基（Richardson，Adv ．Prot．Chem．34:167，1981;Chanら、Protein Science，2:1574，1993）である鎖FのArg¹⁹⁷のグアニジニウム基が2つのTrpのインドール環の間に正確に位置づけされ、伸長されたπ-カチオン系を形成する（Kumpfら、Science261:1708，199 3）。Trp²⁰⁹のピロール環の中心、Arg¹⁹⁷のNεおよびTrp²¹²のベンゼン環の中心は直線上に位置づけされ、接合した系の3つの面が約4Åの間隔をおいて互いに対して平行に積み重ねられる。また、Arg¹⁹⁹側鎖の脂肪族部分はTrp²⁰⁹のインドール環と疎水性相互作用をし、2つの芳香族残基および2つの正に荷電したアミノ酸残基の交互の積み重ねを完成させる。Glu¹⁵⁷の側鎖はArg¹⁹⁷と水素結合を形成し、おそらくグアニジニウム基を配向しやすくし、系に弱冠の特異性と安定性を付加しやすくする。サイトカイン受容体の配列から同定された直線のWSXWSモチーフは、D2に大きな構造上の特徴を与える、より複雑な構成単位の成分のみを表すと思われる。芳香族残基は、逆平行のβ-サンドイッチ構造において安定作用を有し、折り畳み核としての役割を果たすことが過去に示唆されている（Finkelsteinら、Protein Eng．6:367，1993）。アルギニンのグアニジニウム基と芳香環のアミノ-芳香族平行積み重ねはタンパク質の構造の共通の特徴であるが（Burleyら、Adv．Prot ．Chem.，39:125，1988;Floccoら、J．Mol．Biol．235:709，1994）、π-カチオン系の平行3重積み重ねは、他のクラス-1サイトカイン受容体、hGHbpおよびPRLR では観察されるけれども、まれである（Kimら、Biochemistry 32:8465，1993）。 hGHbp（YGEFS）およびPRLR（WSAWS）のWSXWSモチーフの構造上の等価物は、π -カチオン相互作用のよりさらに入り組んで複雑な配列に関与する。π-カチオン系はhGHbpおよびPRLRで伸長されて、D2のβCとβC'を架橋するループ領域由来の別の芳香族残基（hGHbpはTrp¹⁸⁶で、PRLRはTrp¹⁵⁶）およびTrpと第2の芳香族残基との間に積み重なる正に荷電した残基（hGHbpはArg²¹¹で、PRLRはArg¹⁴⁷）を有する。別のArg残基は、hGHbpのβF鎖（Arg²¹¹）またはPRLRのβC（Arg¹⁴⁷）から与えられる；アルギニンと水素結合して、配向させるグルタミン残基も鎖を換える。配列は、このArg-Gln交換はクラス-1サイトカイン受容体ファミリーの他のメンバーに共通であるだろうということを示唆している。hGHbpおよびPRLRの伸長されたπ-カチオン系は、5つの正に荷電した残基と3つの芳香族残基が交互の順番で積み重ねられて、hGHbpではLys²¹⁵、Tyr²²²、Arg²¹³、Phe²²⁵、Arg²¹¹、Trp¹⁸ ⁶ 、Lys¹⁷⁹を含み、PRLRではLys¹⁸⁵、Trp¹⁹¹、Arg¹⁸³、Trp¹⁹⁴、Arg¹⁴⁷、Trp¹⁵⁶ 、Lys¹⁴⁹を含む。最初の芳香族-Arg-芳香族3残基はEBPのように約4Å離れているが、第2の系は、π-π相互作用に一致した約3.6Åの間隔で一体としてより密接に積み重ねられる（Burleyら、Adv．Prot．Chem.，39:125，1988;Floccoら、J． Mol．Biol.，235:709，1994）。外側のリジンもその側鎖の脂肪族部分を使用して、芳香族環と疎水性相互作用を形成する。クラス-1サイトカイン受容体スーパーファミリーの他のメンバーの配列に基づいた構造のモデル化により、このような構造が伸長されたπ-カチオン系はヒトトロンボポイエチン、IL-6および毛様体神経栄養性因子受容体、並びにヒトIL-4受容体に存在すると思われる（Gustch inaら、Protein 21:140，1995）。IFN-γRαおよび組織因子はWSXWSモチーフを有さないが、IFN-γRαの対応する配列TTEKS（残基213〜217）（Walterら、Natu re 376:230，1995）および組織因子のKSTDS（残基201〜205）（Mullerら、Bioch emistry 33:10864，1994;Harlosら、Nature 370:662，1994）は、非常に似たβ- 膨らみを維持する。これら5つのx線構造のコンセンサス配列は、位置2および5のセリンおよびトレオニンはその側鎖の水酸基と近隣鎖の主鎖との水素結合の共通セットを維持することを示す。hGHbpにだけは水酸基を含有する残基が位置2に存在しないが、Ser²²⁶は依然として等価な相互作用を維持する。Ser²²⁶からAlaへの変異はhGHHとhGHと結合を不可能にして、細胞表面での発現がかなり低下する（Baumgartnerら、J．Biol．Chem.，269:29094，1994）。GM-CSFRαおよびIL-2R βでは、セリン残基の点突然変異によって細胞表面の発現が実質的に減少するが、リガンドの結合に対してほとんどまたは全く影響を与えない（Roncoら、J．Bi ol.Chem.269:277，1994;Miyazakiら、EMBO Journal 10:3191，1991）。 EPORまたはクラス1サイトカイン受容体の他のメンバーの等価物におけるWSXWS モチーフの保存は生物活性に必須であることが提案されているので、受容体結合部位の一部であると仮定した（Yoshimuraら、J．Biol．Chem．267:11619，1992; Quelle、Mol．Cell．Biol．12:4553 1992）。EPORでは、WSAWS配列の100個の突然変異体の系統的な研究が、2つのトリプトファンとセリンの突然変異体のほとんどにより、分子は細胞表面に到達せず、小胞体内に保持された（Hiltonら、Pr oc．Natl．Sci．USA 92:190，1995;Hiltonら、J.Biol．Chem．271:4699，1996）。さらに、WSAWS配列中のAla²¹¹からGluへの変異により、ERからゴルジ体への輸送が良好になり、野生型と比較して細胞表面のEPOR分子の数が3〜5倍増加した（ Hiltonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:190，1995;Hiltonら、J Biol．Chem .271:4699，1996）。これらの結果は、WSXWS配列はEPORおよび他の関連する受容体のD2の構造および折り畳みに対して重要な役割を果たすという発明者らの結論を裏付ける。他のサイトカイン受容体複合体構造物との比較ペプチド-EBP複合体の全体的な4次構造は、hGH-hGHR複合体の等価な配列と実質的に異なる。成長ホルモンリガンドの1つの4-ヘリックス-束構造の非対称性により、EBP-ペプチド複合体のほぼ完全な2つ折り（180°）回転と比較して、受容体の非対称ホモ二量体化は受容体間の159°の回転に相当する。EBPおよびhGHbp 内のドメインの3次配列も弱冠異なる。等価なEBPおよびhGHbp D2領域を互いに重ね合わせると、その対応するD1領域は12°回転および4.3Å翻訳分だけ異なる。 hGHがその受容体に結合する機序は十分に研究されており（Wells、Curr．Opin ．Cell Biol.6:163，1994;Clacksonら、Science 267:383，1995）、逐次的である。ホルモンと1つの受容体との最初の高親和性（nM）結合により、受容体の埋残面積は1130Å²となる。第2のhGHbp2はhGHの第2の結合部位との界面が実質的に小さく（deVosら、Science 255:306，1992）、予め形成された1:1複合体とのみ相互作用して、hGHで埋残された表面積は740Å²となり、第1のhGHbp1では440Å² となる（deVosら、Science 255:306，1992;Wells，Curr．Opin．Cell Biol．6:1 63，1994;Clacksonら、Science 267:383，1995）。各hGHbpの結合決定因子は6つの認識ループ（L1〜L6）を含み、そのうち3つ（L1〜L3）はD1のβ-サンドイッチ構造の１つの端部由来で、1つは領域問架橋部由来で、2つはD2由来である。これら2つの受容体複合体、EBP-EMP1およびhGH-hGHbpは異なる二量体配列を有し、おそらくこの場合は天然リガンドおよび合成リガンドのサイズおよび形状の差を表すが、両受容体は等価なリガンド認識ループL1、L3、L5並びにEBPではL6 およびhGHbpではL1〜L6を有する。hGHのわずか1分子とだけ複合体形成した活性のないPRLRも同一の接触ループ（L1〜L6）を使用する（Somersら、Nature 372:4 78，1994）。hGHbpおよびPRLRのリガンド認識部位の類似性に基づいて、天然のE POリガンドが結合するとき、EBPの結合部位が伸長してC鎖〜C'鎖の間に残基59〜 63（L2）を含み、D1のβGのカルボキシル末端から領域間架橋部の間に残基110〜 118（L4）を含む2つの別のループ、L2およびL4を含むことが予測されるだろう。 EBP、hGHbpおよびPRLR領域のこれらの6つのループは構造上等価な位置に存在するが、各ループの相互作用部分（側面または尖端）は類似性を保っていても、サイズ、アミノ酸組成および構成が異なる；L1、L2、L3、L5は主にそれらの尖端部で相互作用し、L6は側面で相互作用する。EBPでは、L5ループはhGHbpおよびPRLR より3残基短く、L6はhGHbpおよびPRLRよりそれぞれ3残基および4残基長い。L2ループも3つの受容体間で異なる（6〜10残基）が、EBPではペプチド結合に関与せず、hGHbpではホルモンに接触するけれども、部分的に障害されている。1つの点に関しては、この状況は抗体における相補性決定領域（CDR's）に類似している。抗体の場合は、6つの結合ループの長さと配列の変更が種々の抗原に対する特異性を示すが、フレームワーク自体は一定を保つ（Wilsonら、Ciba Foudation S ymposium．Wiley，Chichester，1991，159巻，13ページ）。受容体の構造エピトープを形成する33の相互作用残基のうち9個のサブセットが機能的エピトープすなわち高親和性結合相互作用が起こるホットスポットを構成することがhGH-hGHbp複合体について示されている（Wells、Cerr．Opin．Cell Biol．6:163，1994;Clacksonら、Science 267:383，1995）。この縮小したエピトープは構造エピトープより実質的に小さく、ループL1、L3およびL5と接触して配置される残基（Arg⁴³、Glu⁴⁴、Ile¹⁰³、Trp¹⁰⁴、Ile¹⁰⁵、Pro¹⁰⁶、Asp¹⁶⁵およびTrp¹⁶⁹）を含み、最も重要な寄与（＞4.5kcal/mol）はL3およびL5の2つの芳香族残基（Trp¹⁰⁴およびTrp¹⁶⁹）に由来する(Wells、Curr．Opin．Cell Biol．6:1 63，1994;Clacks onら、Science 267:383，1995;Well、NProc．Natl．Acad．Sci．USA 93:1，1996 ）。EBPでは、過去に示唆されたように、Phe⁹³はhGHbpのTrp¹⁰⁴と等価であるが（Wells、Curr.Opin．Cell Biol．6:163，1994;Clacksonら、Science267:383，1 995:Wells、Proc．Natl Acad．Sci．USA 93:1,1996;Jolliffeら、Nephrol．Dial ．Trans．10:suppl．2，28，1995）、短いL5ループではTrp¹⁶⁹と相同の残基はない。EBP-EMP1複合体では、Phe^P8ペプチドの芳香族側鎖はhGHbpのTrp¹⁶⁹側鎖の等価な位置を占める。EPOがその受容体と結合するとき、ホルモンは結合界面の疎水性コアに芳香族残基を提供し、および／またはEBPのL6ループは、3残基長く、芳香族Phe²⁰⁵を含むので、hGHbpよりもホルモン結合の際により重要な役割を果たすと仮定することができる。これら3つのクラス-1受容体構造では、EBPではD2に存在するいくつかのループ（EBP1では残基164〜166およびEBP2では133〜135）並びにhGHbp（hGHbp1では残基55〜58、73〜78およびhGHbp2では残基54〜60、73〜75）およびPRLR（残基31〜 33、84〜86）の両者ではD2に存在するいくつかのループが障害を受けている。にもかかわらず、これら3つのクラス-1サイトカイン受容体は3次構造全体は大きく変わらない；D1およびD2は、2つの領域の長軸間の角度が約90°であるように、3 つ全ての受容体中にほぼ類似した全体配列を有する。これらの特定のL1〜L6ループが、リガンドの認識および結合に利用可能であることを可能にしているのは、このような領域の配列である。IFN-γとそのクラス-2受容体IFN-γRαとの2:2複合体では、D1およびD2は125度の角度で関連しており、受容体を細長くし、ホルモンとの相互作用に使用され得る結合決定因子を制限する；この時点でL1ループはD1-D2界面に埋残されているが、他の5つのループ（L2〜L6）は依然としてリガンド相互作用に利用可能である。この細長い領域間配列は、サイトカイン受容体スーパーファミリーとは関係が薄い、組織因子においても観察される（Mullerら、Biochemistry 33:10864，1994;Harlosら、Nature370:662，1994）。 EBP分子の突然変異の解析は、EPOを結合するために最も重大なアミノ酸残基は L3ループではPhe93であることを示す(Jolliffeら、Nephrol．Dial．Trans．10:s uppl2，28，1995)。Phe93Ala突然変異体は野生型と比較して約1000倍IC₅₀の増加を示すが、他の突然変異体（Ser91Ala、Ser92Ala、Val94Ala、Met150AlaおよびH is 153Ala）はわずか2.5〜12.5倍のIC₅₀の比較的わずかな増加を示す。Phe⁹³の側鎖は分子表面の66Å²を埋残するが、これは相互作用側鎖の中では最も大きい。hGH bpでは、対応するTrp104Alaの突然変異によってK_dが、野生型と比較して2,500より大きい倍数だけ増加し、hGH結合および機能性エピトープの疎水性コアに対する主要な寄与におけるこの残基の等価な重要性を示している（Wells、Curr．Opi n．Cell Biol．6:163，1994;Clacksonら、Science 267:383，1995;Bassら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA88:4498,1991）。シグナル伝達に対する二量体化の役割驚くべきことに、EBP-EMP1複合体構造物において、配列およびおそらく構造に関連のない、天然リガンドに対するペプチドがEPO受容体の生物的に活性な二量体化を誘発し、シグナル伝達および細胞増殖を促進することを発明者らは観察している。構造がこれまでに決定されている、3つのクラス-1サイトカイン受容体複合体の比較は、4-ヘリックス束構造を有することが提唱されている（Boissel ら、J．Biol．Chem．268:15983，1993）天然型EPOホルモンが受容体の二量体化を誘導するとき、hGH-hGHbp組み立て体に類似する可能性がより高いことを示唆している。生物学的に関連のあるシグナルを産生する事象のカスケードを開始させるためには、複数の様式の生産的細胞外二量体形成によって、細胞質ドメインと2つのJAK2分子細胞内二量体化が可能になることを示唆するだろう（Ihleら、S eminarsinlmmunology 5:375，1993;Klingmullerら、Cell 80:729，1995）。ペプチド-EBP構造は次いでシグナル伝達を促進する唯一可能性のある二量体配列を示す。 1つのArgからCysへの突然変異（ヒトではArg¹³⁰およびマウスではArg¹²⁹）を含む、突然変異体EPOR分子は、EPOの不在下にて生物学的に活性な二量体を形成することが示されており（Yoshimuraら、J.Biol.Chem．267:11619，1992;Watowi chら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:2140，1992;Watowichら、Mol.Cell．Bio l．14:3535，1994）、細胞外受容体ホモ−二量体化がシグナル伝達に対してはそれ自体で十分であることを示唆している。他の系では（Spencerら、Science 262 :1019，1993）、転写因子の特殊なセットの活性化が、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを有しない修飾された細胞膜受容体の細胞質ドメインの化学的な架橋によって誘導されうることが報告されている。これらの受容体はサイトカイン受容体スーパーファミリーとは関連がないが、受容体の活性化にはオリゴマー化が主要な役割を有すること、および細胞外リガンド結合領域の主要な機能的役割が（リガンドの存在下にて）二量体化およびオリゴマー化を可能にすることができ、細胞質ドメインの同様の結合を誘導する。突然変異実験は当初は、おそらく受容体のホモ-二量体化を促進することによって、この細胞のシグナル伝達過程におけるWSXWSモチーフの役割を示唆していた（Yoshimuraら、J．Biol．Chem．267:11619，1992;Quelleら、Mol．Cell Biol ．12:4553，1992;Chibaら、Biochem．Biophys．Res．Comm．184:485,1992）。しかしながら、EPORの切断突然変異（Miuraら、Arch．Biochem．Biophys．306:200 ，1993）はWSXWSモチーフのこの役割を確認していない。EBP-EMP1複合体構造物は、EPORのWSXWMSモチーフは、hGH-hGHbp複合体に関しては（deVosら、Science 255:306，1992）、受容体の二量体化による分子の対向面に位置することを示す。EPOR、hGHRおよびPRLRの細胞外ドメインのリガンド結合していない構造物が存在しない場合には、リガンド結合時に、WSXWSボックスに関係すると思われる何らかの構成変化が生じたかどうかを判定することができない。D2の顕著な構造的特徴および膜貫通ドメインへの明らかな接近とは別に、この領域と、シグナル伝達過程になんらかの形で関係するいくつかの他の細胞表面分子との相互作用の可能性を除外することはできない。小分子エリスロポエチン様物質の設計 EMP1二量体の構造は、天然のホルモンよりかなり小さいペプチドがアゴニストとして作用して、適当な生物応答を誘発することができることを明らかにしている。このペプチドは天然のホルモンと受容体との接触界面より実質的に小さい接触界面を形成すると想定することができる。EBPのペプチド結合部位は、通常では小分子リガンドが受容体結合部位を特異的に標的とするために必須であるいかなる腔または荷電残基がなくても、ほぼ平面を形成し、本質的には主に疎水性である。hGHbpの研究（Wellsら、Science 267:383，1995;Wells、Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 93:1，1996）は、観察された構造上の結合部位のごく小さい部分だけ、いわゆる機能的エピトープ（前記）が結合エネルギーの大部分に寄与することを示し、この部位と相互作用するように設計された「最小の」ホルモンは、受容体を活性化するほど十分な相互作用をすると思われることを強く示した。さらに、小ペプチドアゴニストとEBPとの相互作用の制限された部位は、hGHおよびhGHb pのアラニン走査から誘導されるさらに小さい機能的エピトープにほぼ正確に対応する。従って、異なる方法によって、本発明者らはわずかな数の主要な相互作用が受容体の機能的エピトープに寄与することができるという同様の結論に達した。ここで、この簡略化した相互作用面の理解と突然変異の研究を組み合わせて、機能的エピトープの最も重要な残基を同定する際の助力とすることができ、結果として薬物設計のために従来よりも実用的な標的物質を提供することができる。データ収集、MIRおよび細分統計結晶構造解析データを表1に要約する。生の結晶構造解析データを、結晶と検出器の距離を120mmにし、40kVおよび55mAで動作するエリオット（Elliott）GX-1 8発生器に取り付けたシーメンス（Siemens）マルチワイヤーエリア検出器で収集した。結晶と画像プレートの距離を150mmにし、50kVおよび80mAで動作するシーメンス（Siemens）発生器に取り付けたル徂画像プレートに2つの微分データセットを収集した。データは、生データについてはXENGEN（Howardら、J．App．Crys t．20:383，1987）を使用し、微分データについてはDENZO/SCALEPACK（Otwinows kiら、SERC Darsbury Laboratory，Warrington，1993）を使用して、集めて、拡大し、縮小した。メリットの平均数値を0.64（25.0〜3.1Å）として、プログラムパッケージPHASEA（Furey，American Crystallographic Association Fortiet h Anniversary Meeting，New Orleans，LA，1990）を使用して、最初の多同形置換異常分散（MIRAS）相を3.1Åまで計算した。相は、メリットの平均数値0.92（ 25.0〜3.1Ａ）まで、溶媒平坦化プロトコールを使用して、PHASESに細分化した。マップの質は全般に良好で、複合体構造のほとんど（94%）は、図形プログラムO（Joneら、Acta Crystallogr A47:110，1991）を使用して、適合することができた。アミノ酸残基の登録は、D1の2つのジスルフィド架橋の位置と、遊離Cys¹⁸¹ 残基に結合することが正確に想定された酢酸水銀誘導体の2つのHgの位置から立証された。ペプチドの解釈は、EBPとヨウ素かペプチド（Tyr^P4をp-ヨード-Phe と置換した）との複合体の別のデータセットから立証した。このペプチドを解像度3.3Åまで解析し、差分フーリエ（F_iodo−F_nat)α_MIRASはヨウ素原子の位置を明確に示した。X-PLOR 3.1のスロー-クーリングプロトコール（Brungerら、Acta Crystallogr A46:585，1990 ；Brunger、X-PLOR、3.1版:x線とNMRのシステム（A System for X-ray and NMR ）、エール大学出版、コネチカット州ニューヘブン、1992年）を使用して、構造を細分化し、Fo-Fc、3FO-2FcおよびSIGMAA（Read、Acta Crystallogr．A42:140 ，1986）重み付け電子密度マップを使用して再構築した。細分化の2サイクルごとの後に、モデルの偏りを少なくするための模擬アニーリング省略マップ（7〜1 0%）のセットを算出して、全構造を再構築した。数サイクルの細分化後に、個別の温度要因を算出し、10サイクルの細分化およびモデル構築後では、R-値は8.0 〜2.8Åデータでは0.21で、F＞1σ（13,984反射）であった。受容体I、受容体II およびペプチドの平均温度パラメータは、それぞれ10.5Å²、12.3Åおよび10.7 Åである。D1のループ領域に位置する、グリシンを含まない残基［EBP2のAsn¹⁶⁴ ］だけが、ラマチャンドランプロットの許容外領域に存在する。構造決定の適度な解像度（2.8Å）のために、溶媒分子はモデルには含まれなかった。結合接触結合接触を、一部表2に要約する：EBP-EMP1複合体の結合部位の水素結合相互作用。複合体の対称性のために、ペプチド-1およびペプチド-2は2つのEBP分子と等価な相互作用を形成する。距離（カットオフ3.9Å）と幾何学的な考慮とに基づいて、HBPLUS（McDonaldら、J．Mol．Biol．238:777，1994）を使用して、水素結合相互作用を解析した。本発明の多数の態様を記載してきた。にもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の修正が加えられることを理解されると思われる。従って、本発明は特に例示した態様によって制限されるのではなく、添付の請求の範囲によってのみ制限されることが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ストゥラエンリコエイ. アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴパークウエストアベニュー 5172 (72)発明者ジョンソンダナエル. アメリカ合衆国ペンシルバニア州アッパーブラックエディーロンリーコヘイジロード 1343 (72)発明者ジョリフィーリンダケイ. アメリカ合衆国ニュージャージー州ベリーミードダベンポートウェイ 16

Claims

【特許請求の範囲】 1．プロセッサ、データ記憶システム、入力装置および出力装置を備えるプログラム式コンピュータを使用してエリスロポエチン様物質と考えられるものを同定するためのコンピュータ支援方法であって：（a）ペプチドGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGが、エリスロポエチン受容体のアミノ酸1〜 225を含む該受容体の一部と共に結晶化されるとき、該ペプチドの原子のサブセットの3次元座標を含むデータを該入力装置を介してプログラム式コンピュータに入力することによって、基準データセットを作成する段階、（ｂ）該プロセッサを使用して、該基準データセットと、該コンピュータデータ記憶システムに記憶された化学構造のコンピュータデータベースとを比較する段階、（c）コンピュータ方法を使用して、該基準データセットと構造が類似した部分を有する化学構造を該データベースから選択する段階、および（d）該基準データセットと類似した部分を有する選択された化学構造を該出力装置に出力する段階を含む方法。 2．プロセッサ、データ記憶システム、入力装置および出力装置を備えるプログラム式コンピュータを使用してエリスロポエチン様物質と考えられる物質を同定するためのコンピュータ支援方法であって：（a）ペプチドGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGが、エリスロポエチン受容体のアミノ酸1〜 225を含む該受容体の一部と共に結晶化されるとき、該ペプチドの原子のサブセットの3次元座標を含むデータを該入力装置を介してプログラム式コンピュータに入力することによって、基準データセットを作成する段階、（b）コンピュータ方法を使用して、該基準データセットと構造が類似した部分を有する化学構造のモデルを構築する段階、および（c）構築したモデルを該出力装置に出力する段階を含む方法。 3．化合物がEPO様物質である、請求項1記載の方法を使用して選択される化学構造を有する化合物。 4．化合物がペプチドではない、請求項3記載の化合物。 5．化合物がペプチドである、請求項3記載の化合物。 6．ペプチドが15個以下のアミノ酸を有する、請求項5記載の化合物。