JP2000509404A

JP2000509404A - 遺伝物質の導入システムとしてのカチオン性ヴィロソーム

Info

Publication number: JP2000509404A
Application number: JP9539526A
Authority: JP
Inventors: ウォルティ、アーンスト、ルドルフ; グルック、ラインハルト; クライン、ペーター
Original assignee: ニカヘルスプロダクツリミテッド
Priority date: 1996-05-08
Filing date: 1997-05-04
Publication date: 2000-07-25
Also published as: AU2776697A; SK152698A3; OA10916A; WO1997041834A1; ID17934A; BR9709224A; TNSN97080A1; BG102880A; US6210708B1; ZA973885B; AU710170B2; NO327726B1; HUP9901790A2; PA8429201A1; NZ332666A; GT199700058A; HUP9901790A3; KR100536983B1; AR007054A1; SV1997000032A

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳類の休止細胞または増殖細胞に遺伝物質の効果的な導入をするための陽荷電ヴィロソームに関する。このヴィロソーム膜は、カチオン性および／またはポリカチオン性脂質、少なくとも１個のウイルス融合ペプチド、好ましくは、少なくとの１個の細胞特異的マーカを含み、このマーカが、標的細胞の選択的探知をしてそれに結合するために、モノクローナル抗体、抗体フラグメントであるF(ab')₂、Fab'、サイトカイン、成長因子から成るグループから選択されることが都合がよい。本発明は、さらに、新規のヴィロソームの製造法およびその適用、特に、癌または白血病の治療のための薬剤成分に関する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝物質の導入システムとしてのカチオン性ヴィロソーム発明の属する技術分野本発明は、遺伝バイオテクノロジーと遺伝子治療の分野に属し、遺伝物質の標的部位への効率的な導入のために使える新規のヴィロソーム、即ち、膜内にウイルス糖タンパク質を含んだ陽荷電リポソームおよびその製造方法と応用に関する。本発明のカチオン性ヴィロソームは、遺伝子を標的細胞に、インヴィトロ(in vitro)およびインヴィヴォ(in vivo)で特異的／非特異的に、非感染状態で送達する場合に実用面で適している。発明の背景リポソームは、ドラッグデリバリー（薬物輸送・送達）の担体として、および、有効期間の短い医薬品物質の保護材または体液による（生）化学的な攻撃から医薬品物質を守るための保護材として広く使用されている。ウイルスのエンベロープ由来の再構成膜タンパク質またはその一部分を含んでいるリポソームは、通常「ヴィロソーム(virosomes)」と呼ばれている(サイザー(Sizer)ら、Bioche mi stry 26:5106-5113、1987)。このヴィロソームは、各種薬剤やＤＮＡ分子の非特異的な輸送用として現在使用されている(ヴァインスタイン(Vainstein)ら、Meth ods Enzymol、101:492-512、1983)。しかし、標的細胞の細胞膜と融合させた従来型のヴィロソームの主な欠点は、標的細胞の細胞質内に輸送された物質が、標的細胞内で制御不能な状態で遊離されてしまい、そのために、送達・導入させた物質が非保護の状態になるために細胞内の破壊的プロセスの中で容易に攻撃されてしまうことである。ＷＯ９２／１３５２５（この全内容は、本出願中に参考文献の形で記載）には、インフルエンザウイルスから得たウイルス・スパイク・タンパク質およびモノクローナル抗体のような細胞特異的マーカを使用して標的細胞に物質を向かわせる型のリン脂質二重層膜のヴィロソームが、受容体依存性エンドサイトーシスによるウイルス様透過機構により、モデル膜および動物細胞と、非常に効率よく融合することが開示されている。但し、これらのヴィロソームは、化学物質と導入を希望する薬剤を標的部位までうまく輸送はするが、負荷電の核酸のような荷電分子を、安定的に導入・送達する場合にはある種の短所がある。最近の２・３年において、リポソーム内に組み込んだ遺伝物質の標的細胞への導入、とりわけ細胞特異的な導入について、特に、抗癌、遺伝子治療への適用に関連して注目され重要性が増してきている。最近、ＤＮＡやＲＮＡを細胞に導入するための数種の方法が利用できるようになっている。例えば、ウイルス仲介法 (virus mediated method)、脂質仲介法(lipid mediated method)、マイクロインジェクション法およびエレクトロポレーションのような方法もある。最近における、そのような遺伝子導入技術の長所と短所を下記に概説する。ａ）ウイルス仲介遺伝子導入の場合レトロウイルス・ベクターを使用することにより、遺伝子を安定的に、しかも、効率的に哺乳類の細胞内に導入させることができる。しかし、レトロウイルスは分裂性細胞にだけしか感染しないために、非複製細胞への遺伝子導入の効率は非常に低い。さらに、レトロウイルス・ベクターの使用については、例えば、癌遺伝子の活性化などの点で、一般的な安全性に関連して問題がある。多数の研究者は、遺伝子導入のベクターとして、複製能を欠失させたアデノウイルスを選択するようになってきている。アデノウイルスベクターを使用して遺伝子を導入する方法には、欠失変異させたアデノウイルスに希望する遺伝子を挿入する方法や、トランスフェリン-ポリリシン架橋により、挿入するＤＮＡとアデノウイルス・コート（外殻）との間に複合体を形成させる方法とがある。このインヴィヴォ導入システムは、非常に効率のよい方法ではあるが、感染と炎症に関して不確定的なリスクが伴うという欠点がある。Ｅ１遺伝子を欠失させて、ウイルスの複製能を失わせているにも関わらず、なお残存するウイルスゲノムには、ウイルスタンパク質をコードしている多数のオープンリーディングフレームが依然として含まれているからであるからである(ヤング(Yang)ら、1994;Proc.Natl．Acad．Sci． USA 91，4407-4411)。形質導入させた細胞によるウイルスタンパク質の発現は、ヒトおよび動物体内の体液性および細胞性の両方の免疫応答を刺激するために、結果として炎症と増殖を誘発することになる。ＨＶＪ（センダイウイルス）を使用した方法では、外来ＤＮＡとリポソームとの複合体を形成させる。その後、このリポソームに不活化したセンダイウイルス（ＨＶＪ）を負荷させる。この方法は、すでに、多様な組織へのインヴィヴォ遺伝子導入に使用されている。さらに、ＨＪＶ・リポソームを使ったアンチセンス・オリゴヌクレオチドの細胞内取り込みが報告されている(モリシタ(Morishita)ら、1993;J．Cell．Biochem、17E、 239)。しかし、これらの方法の最大の短所は、ＨＪＶリポソームが赤血球細胞に非特異的に結合してしまうことである。ｂ）脂質使用遺伝子導入の場合カチオン性脂質から作製した陽荷電リポソームは、安全で、使用法が簡単であり、しかも、インヴィトロでのＤＮＡとアンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入に有効であるように見える。高い負電荷の核酸は、自然にカチオン性リポソームと相互作用する。ポリヌクレオチドを前形成状態のカチオン性リポソームと単純に混ぜるだけで、完全なＤＮＡ-リポソーム複合体が形成される。しかし、リポソーム膜には、融合ペプチドと細胞特異的マーカが含まれていないために、インヴィヴォトランスフェクションの効率は極めて低く、インキュベーション時間が長いので、望むような薬剤効果を得るためには、投与量を多くする必要がある。しかも、大量のカチオン性脂質はインヴィヴォで有毒であるとの証拠があるので、望まない副作用が発生するかもしれない。最近、小型のオリゴヌクレオチドが、癌の治療薬および抗ウイルス剤として使用できないかとの試験がされている。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成では、２つのＤＮＡ鎖のうちの一方だけが転写される。ＲＮＡに転写されたＤＮＡ鎖は、コーデイング鎖あるいはセンス鎖と呼ばれている。相補的である非コーディングまたはアンチセンス鎖は、ｍＲＮＡと同じ塩基配列を有している。非コーディング鎖が転写されると、アンチセンスＲＮＡ分子が産生され、これは標的（センス）ｍＲＮＡに結合することができる。一度アンチセンスＲＮＡがセンスＲＮＡに結合すると、その結果生成されるＲＮＡ複合分子は転写されることはなく、その結果、タンパク質合成が阻止される。通常の場合、１８^-２２塩基の短い合成アンチセンス・オリゴヌクレオチドが効率良くｍＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡの翻訳を阻止することになる。このメカニズムにより、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを使用してヒト癌細胞の増殖を停止させることが可能となる。癌に含まれる遺伝子というのは、構造タンパク質を過剰に発現することにより影響を与えていく。c-fos，c-myc，L-myc，N-myc,c-myb，abl，bcr-abl，c-raf，c-erb -2，k-rasのような遺伝子が、アンチセンス癌治療法の潜在的なターゲットである。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、抗ウイルス剤のような従来型の薬剤に対する魅力的な潜在代替物質であり、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のtat遺伝子およびgag遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドなどがその例である。文献に記載されているような再構成ウイルス・エンベロープを含んだリポソーム膜もヴィロソームと呼ぶことができる(ステッグマン(Stegmann)ら；EMBO J．6 :2651-2659、1987)。ヴィロソームとは、通常、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）から成るリン脂質二重層膜に、スパイクタンパク質のようなウイルスエンベロープが組み込まれた構造のものを言う。遺伝物質をＰＣ／ＰＥヴィロソームに導入する従来の方法には、その核酸導入の効率が低いという欠点がある。発明の概要それ故、本発明は、特別な膜組成を実現することにより、長鎖／短鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボザイム（酵素活性を有するＲＮＡ分子）、遺伝子、プラスミド、ベクターなどの導入したい希望の遺伝物質を、非常に効率良く膜に負荷させることができ、それにより、先行技術の欠点を克服した新規なカチオン性ヴイロソームに関する。さらに、本発明は、平均直径が約１２０^-１８０ｎｍであり、従来型の多くのヴィロソームに見られたような導入した物質の漏れという欠点を克服した連続脂質二重層で構成されるカチオン性ヴィロソームを形成させるために、Ａ型インフルエンザウイルス、特に、シンガポールＡ型ウイルス株の赤血球凝集素を、実質的に単膜のリポソーム内で効率良く再構成させる方法に関する。このカチオン性二重層膜（単層が望ましい）の構造は、親水性で、陽荷電の脂質頭部が液相に接しており、疎水性の脂肪酸尾部が二重層の中心部に接している。再構成されたウイルス・スパイク・タンパク質（赤血球凝集素(hemagglutinin)）が脂質二重層と一体となっており、カチオン性リポソームの表面に広がっている状態を電子顕微鏡で観察することができる（図１）。このリポソーム膜の脂質組成は、カチオン性および／またはポリカチオン性脂質から成り、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンのようなリン脂質から構成されていてもよい。大抵の場合、膜に含まれる脂質組成の割合が下記のようになっているものを選択することが好都合であることが判明している（全脂質に対しての割合）。（ｉ）カチオン性脂質および／またはポリカチオン性脂質が重量比で１００％、または、（ｉｉ）カチオン性脂質および／またはポリカチオン性脂質が重量比で９０~９５％で、ホスファチジルエタノールアミンが重量比で５~１０％、または、（ｉｉｉ）カチオン性脂質および／またはポリカチオン性脂質が重量比で４５~ ９０％、ホスファチジルエタノールアミンが重量比で５~１０％、ホスファチジルコリンが重量比で５~５０％。好適な実施例によれば、本発明は、標的細胞の選択的探知およびそれへの結合に有用である、モノクローナル抗体、F(ab')₂およびFab'フラグメントのような抗体フラグメント、サイトカイン、および／または増殖因子（これらに限定されない）を含んでいる細胞特異的マーカとカチオン性ヴィロソームとの間の不可逆共有結合に関する。これらのマーカは、リポソーム膜に結合することになるが、その場合、まずリポソーム膜の外側に広がって行き、本質的に機能的な動作、つまり、受容体の探知とそれに対する結合をすることになる。マーティン(Martin)ら(J.Biol.Chem.2 57:286-288、1982)が報告しているように、抗体フラグメントのような結合性細胞特異的マーカを前形成のリポソームに結合させると、結合収量が低いことが多く、結合産生が不能であることも頻繁に起こるということがあり、このことは、標的細胞への遺伝物質導入という目標に重大な制限を課すことになる。そのために、本発明での好適な実施例によれば、これらのマーカは、界面活性剤の存在下で、例えば、N-[4-(p-マレイミド-フェニルブチリル]ホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＢ．ＰＥ）のような前形成状態のホスファチジルエタノールアミン -架橋試薬複合分子に結合するようになっている。最善の結果を達成するためには、タンパク質分解により消化させるか、または分子内Ｓ−Ｓ結合を減らすかのいずれかの方法により不活性化現象を避け、ウイルス糖タンパク質を、再構成する前に、丹念に分離・精製することが好都合であることが判明した。従って、複合マーカ、例えば、マーカ-ＭＰＢ．ＰＥを、活性化アガロース・マトリックスを使用した（好ましくは、還元チオプロピル・セファロース６Ｂ）アフィニティ-クロマトグラフィにより、非複合ホスファチジルエタノールアミン-架橋試薬複合分子（例：ＭＰＢ．ＰＥ）から分離することが好ましい。その後、カチオン性ヴィロソームを作製する前に、精製した複合マーカ（ホスファチジルエタノールアミン-架橋試薬-マーカ分子複合体）のアリコートを、溶解膜脂質、融合タンパク質、その他の望ましい成分を含んだ界面活性剤溶液に添加する。ヴィロソームの調製の前に、二価性架橋試薬とリン脂質と細胞特異的マーカを、個別のプロセスにより、結合させるのが好都合であることが判明した。この手順を取ることで、ヴィロソーム膜の表面密度、特に、ヴィロソームと結合した細胞特異的マーカの数をより最適化させることができる。ヴィロソーム膜に組み込まれているか、または膜に結合しているタンパク質分子の濃度をよりうまく制御し、改善することは重要である。ヴィロソーム膜上での融合ペプチド（例：赤血球凝集素）および細胞特異的マーカの割合に不均衡があると、それらの選択特性が減少したり破壊されたり、極端な場合には、リポソームの凝塊形成と沈澱が起こるからである。全抗体分子の代わりに、抗体フラグメントF(ab')₂およびFab'を細胞特異的マーカとして使用することが特に好都合である。その理由は、全抗体分子を使用する場合に較べて免疫原性がはるかに少ない点にある。また、Ｆｃドメインがなければ、Ｆｃフラグメントが原因となる望ましくない生物学的、免疫学的活性、たとえば、古典経路による補体活性化、および、抗体と標的細胞上のＦｃ受容体との間の相互作用による標的細胞表面からの付着ヴィロソームの分離を引き起こす急性体液性免疫応答などの活性を減少させる。核酸輸送のための既知のリポソーム組成物と違って、本発明にかかるカチオン性ヴィロソームは、通常、標的細胞の細胞質に入る際に、形質細胞膜との融合を必要としない。このヴィロソームは、２つのステップ機構を通して宿主細胞に入ることができる。つまり、（１）付着と（２）透過である。最初の付着ステップでは、ヴィロソームは、融合ペプチド（例：赤血球凝集素）および／または細胞特異的マーカにより、細胞受容体に結合するが、特に、末端にシアル酸を有する糖タンパク膜または糖脂質に結合し、その後、受容体依存性エンドサイトーシスにより極め効率良く細胞に取り込まれることになる。細胞特異的マーカ、例えば、抗体フラグメントを含んでいるヴィロソームの場合には、これらのマーカは、追加的に標的細胞の抗原構造を認識し、その結果、２つの違った結合メカニズムにより付着することになる。このように、本発明の細胞特異的ヴィロソームは、膜上にある細胞特異的マーカにより、種々の細胞の型に対して選択性を示し、同時に、ウイルス融合ペプチド、例えば、赤血球凝集素により、エンドサイトーシス機構を通して高い細胞透過能力を発揮する。TAG72、CEA、17-1A、CA19-9のような腫瘍関連抗原またはCD10(CALLA＝急性リンパ性白血病共通抗原)やCD20のような白血病関連抗原を認識するFab'フラグメントを有するヴィロソームの場合には、細胞表面に上記の抗原を持っている腫瘍細胞または白血病細胞と選択的に結合する。第２のステップでは、ヴィロソームが受容体依存性エンドサイトーシスにより宿主細胞に入る際に、エンドソームにトラップされる。その結果、エンドソームのpHが約５~６までに低下するが、このpH値の変化により、赤血球凝集素融合ペプチドを活性化させ、ヴィロソーム膜とエンドソーム膜との融合をトリガーする。膜融合反応により、ヴィロソームの脂質エンベロープが広がり、トラップされている遺伝物質を細胞質体内に放出する。このメカニズムは、導入された遺伝物質が、消化および／またはエキソサイトーシスにより消滅させられることなく核に到達する可能性をかなり改善させる。発明の説明本発明の主要目的は、カチオン性またはポリカチオン性の脂質と、内部空間（通常、液状）とから成り、さらに、小胞膜に組み込まれているか、あるいは、この膜に共有結合している少なくとも１個のウイルス融合ペプチドから成る陽荷電リポソームを提供することである。この小胞は、膜上にある少なくとも１個の細胞特異的マーカから構成されていることが好ましい。本発明のさらに別の目的は、完全な生物学的融合活性、つまり、生きたインフルエンザ・ウイルスと本質的に同じ融合活性を有する小胞を提供することである。この融合ペプチドとして、赤血球凝集素やその誘導体のようなウイルス糖タンパク質、あるいは、エンドサイトーシスの後、上記の小胞と標的細胞のエンドソーム膜との迅速な融合を誘導できる合成融合ペプチドがある。このような新規の小胞またはヴィロソームは、望ましい遺伝物質を標的部位、特に、動物およびヒト細胞および組織にインヴィトロおよびインヴィヴォで導入する場合に特に有用である。この新規ヴィロソームは、増殖する細胞、即ち、複製する細胞だけでなく、非増殖細胞、即ち、休止細胞も透過することができるので、バイオサイエンス、薬理学、医薬分野において、薬剤としても研究または診断ツールとしても使用可能であるに注目する必要がある。薬剤として使用する場合には、本発明のヴィロソームを、通常の添加剤や薬学的に適当である担体を含んだ医薬成分の一部分としてもよい。この薬剤成分は注射液として調剤することが好ましいが、別の適用分野では、局所または全身投与用として、エマルション、クリーム剤、ゲル、軟膏剤で使用したほうが好都合の場合もあるかもしれない。それ故に、本発明のヴィロソームを、動物またはヒトの疾病予防目的および／または現在の治療目的に適した薬剤成分の製造のために使用することも本発明の目的である。さらに、本発明のもう１つの目的は、このヴィロソームをインヴィトロおよびインヴィヴォで使用可能な診断キットの製造に使用することである。本発明の１つの実施例では、この小胞は、Ａ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）の効率の良い再構成のプロセスにより得られる。従って、カチオン性ヴィロソームの調製法を教示することも本発明の目的である。好適な実施例では、この方法は、遺伝物質をカチオン性脂質小胞に導入するステップから成る。基本的には、この調製方法は、下記のステップから成る。（１）カチオン性脂質を非イオン性界面活性剤、好ましくは、オクタエチレングリコール・モノ-n-ドデシルエーテル（ＯＥＧ，Ｃ₁₂Ｅ₈）中で、好ましくは精製したウイルススパイク糖タンパク質、輸送を望む遺伝物質と一緒に溶解すること、オプションとして、ホスファチジルエタノールアミンで作製された前形成状態の複合体分子、架橋試薬、細胞特異的マーカと一緒に溶解するステップ、および２）界面活性剤吸収マイクロキャリヤー・ビーズ、好ましくはＳＭ-２バイオビーズ(Biobeads)型であり、そのメッシュサイズ（ウエット）が好ましくは２０^- ５０（０．８４~０．３０ｍｍ）のポリスチレンビーズを使用して界面活性剤除去（好ましくは反復して）することにより小胞を形成させるステップ。本発明の好ましい実施例では、適当な二価性架橋試薬を適用して、細胞特異的マーカを不可逆的に小胞膜に結合させる。ヴィロソームを細胞に選択的に結合させる役割をする細胞受容体に向かうことになる細胞特異的マーカを、生物学的に活性になるような方法で、架橋試薬に結合させる。架橋試薬がホスファチジルエタノールアミンに共有結合しているか、または、ホスファチジルエタノールアミンと細胞特異的マーカの両方と共有結合している前形成の分子複合体の形で架橋試薬を使用することが好ましい。本発明のヴィロソームに含まれる機能的に活性な融合ペプチドのために、主として、エンドソームのpHが低下すると同時に、封入された物質が標的細胞の細胞質体に放出されることになる（上記で説明した通り）。そのような制御された放出は、一方において、導入物質の標的細胞内での滞留時間を長くさせるが、他方では、ヴィロソームのエンドソーム内での望まない長期滞留を避けることができ、そのために、ヴィロソームにより輸送された貴重な物質の非特異的な劣化の危険を減少させることが可能となる。別の実施例によれば、本発明は、さらに、膜脂質がホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンから成り、しかも、独特のヴィロソームの設計可能性を改善させ、融合ペプチドおよび／または細胞特異的マーカの膜との固定を促進させる小胞に関連する。ここで「融合ペプチド」とは、ヴィロソーム膜と標的細胞の脂質膜との間の融合反応を誘発および／または促進させる能力のあるペプチドまたはタンパク質のことである。大抵の実施例で使用されている「融合ペプチド」とは、融合ペプチドを含んだウイルス・スパイク・糖タンパク質、特に、機能的な融合ペプチドを含んだウイルス表面スパイクの完全な赤血球凝集素三量体、その単量体、またはその切断サブユニットである糖ペプチドＨＡ１およびＨＡ２の１つまたは両方のことである。さらに本発明の別の実施例では、この融合ペプチドという用語は、自然界から分離されたか、あるいは、合成されたかのどちらかである純粋な融合ペプチドそのものを指している。本発明の特別に好適な実施例で使用されている、融合ペプチドを含むポリペプチドとは、インフルエンザ赤血球凝集素、特に、Ａ-Ｈ₁Ｎ₁サブタイプのことである。この合成融合ペプチドを下記の表１のアミノ酸配列（この表では、各アミノ酸は１文字表記で特定されている）から選択することが好ましい（ＷＯ９２／１３５２５の例６および図２を参照）。この「架橋試薬」という用語は、本発明により調製された小胞の表面に結合する能力があり、しかも、ポリペプチドを結合する能力のある有機ヘテロ二価性分子のことである。本発明の好適な実施例では、この分子には、スクシニミディル -4-（Ｎ−マレイミドメチル）-シクロヘキサン-１−カルボキシレート、ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシニミド・エステル、ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスルホスクシニミド・エステル、スクシニミディル4（ｐ- マレイミドフェニル）-ブチレート、スルホスクシニミディル4（ｐ-マレイミドフェニル）ブチレートのような、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に結合させるＮ-ヒドロキシスクシニミド基およびモノクローナル抗体フラグメントと結合させるためのマレイミド基、あるいは、Ｎ-ヒドロキシスクシニミディルスベレート（ＮＨＳ-ＳＡ）、Ｎ-ヒドロキシスクシニミディル-4-アジドベンゾエート（ＨＡＳＡＢ）、Ｎ-スクシニミディル-6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）、Ｎ-スルホスクシニミディル-6-(4 '-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートのような、サイトカインと結合させるための、Ｎ-ヒドロキシスクシニミド基および光化学反応性アジド基が含まれている。この架橋試薬を、架橋試薬と脂質、特に、架橋試薬とホスファチジルエタノールアミン、または脂質プラス架橋試薬プラス細胞特異的マーカの前形成の分子複合体の形で使用することが好ましい。ここで「細胞特異的」タンパク質または「細胞特異的」マーカという用語は、架橋試薬（タンパク質の場合）または架橋試薬-脂質複合体（マーカの場合）に結合することができ、さらに、標的細胞の受容体に結合することのできるタンパク質のことである。本発明の好適な実施例では、このタンパク質分子は、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、または成長因子のような細胞受容体特異的化合物のことを指している。この細胞特異的マーカは、標的細胞を選択的に探知し、それに結合すると同時にヴィロソーム膜に存在する融合ペプチドの活性を改善させる。この抗体フラグメントは、F(ab')₂およびFab'フラグメントで構成されていることが好ましく、一方、細胞特異的マーカは、インターロイキンおよび、特に下表２にリストされているようなサイトカインから構成されていてもよい。ここで使用されている「カチオン性脂質」という用語は、カチオン性成分と、塩化N-[(1,2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）(フェルグナー(Felgner)ら、；Proc Natl Acad USa 84:7413-7417 、1987)、硫酸N-[(1,2,3-ジオレオイルオキシ)-プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル（ＤＯＴＡＰ）、またはN-t-ブチル-N'-テトラデシル-3-テトラデシルアミノプロピオン-アミジン(ルイシャート(Ruysschaert)ら、；Biochem ．Biophys．Res．Commun．203:1622-162B,1994)のような、いわゆる頭- 尾両親媒性分子と呼ばれる無極性尾部を含む有機分子のことである。特に別の明記をしていない限り、この用語には下記で定義したポリカチオン性脂質が含まれる。この「ポリカチオン性脂質」という用語は、ポリカチオン性成分と、1,3-ジパルミトイル-2-ホスファチジルエタノールアミド-スペルミン（ＤＰＰＥＳ）およびジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）(ベアー(Behr)ら、Pro c．Natl．Acad．USA 86:6982-6986、1989)、トリフルオロ酢酸2,3-ジオレオイルオキシ-N-[2(スペルミンカーボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）、1,3-ジオレオキシル-2-(6-カルボキシ-スペルミル)-プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；ヨウ化N,N,N',N'-テトラメチル-N,N'-ビス（2- ヒドロキシエチル）-2,3-ジオレイルオキシ-1,4-ブタンジアンモニウム（ＴＨＤＯＢ）などのリポスペルミンのような無極性尾部を含む有機分子のことである。ここで使用されている「核酸」または「遺伝物質」には、短鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、セレン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド、チオリン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＰＴ）、アミドリン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド、メチルホスホン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、チオリン酸オリゴリボヌクレオチド、リン酸2'-OMe -オリゴリボヌクレオチド、チオリン酸2'-OMe-オリゴリボヌクレオチド、リボザイム（酵素活性を有するＲＮＡ分子）、遺伝子、プラスミド、ベクター（小胞クローニング）が含まれる。ここで使用されている「ヴィロソーム」（最も簡単な形の場合）は、カチオン性脂質と内部空間（液状が好ましい）から成る二重層膜を有し、この膜には、ウイルスタンパク質、特にウイルス糖タンパク質が含まれるリポソーム小胞である。好適な実施例では、完全な生物学的融合活性を有する、少なくとも１個の融合原性ペプチドまたはタンパク質から成り、特に、スパイク糖タンパク質である赤血球凝集素および／またはインフルエンザＡ型ウイルス（例：シンガポールＡ型）のノイラミダーゼが使用されている。ウイルスタンパク質には、ここで記載されているようなインフルエンザウイルスの融合ペプチドに匹敵するかまたは等しい合成のアミノ酸配列も含むことが理解できるであろう。膜脂質は、上記で規定されたカチオン性脂質から成るが、オプションとして、他の天然または合成の脂質でもかまわないし、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のようなリン脂質であれば好ましい。本発明のカチオン性ヴィロソームは、多くの場合、あるいは、特にインヴィトロでの細胞培養実験では、膜上に細胞特異的マーカを有していなくても使用が可能であるが、インヴィヴォで使用する場合には、すでに説明したように、これらのヴィロソームが、膜上に少なく１個の細胞特異的マーカを有しているが特に望ましい。この小胞の平均直径は、電子顕微鏡および動的光散乱法で測定した数値で、１２０~１８０ｎｍの範囲である。ここで使用されている「（生物学的に）完全な融合活性」とは、小胞膜内で再構成されたウイルスタンパク質から成る本発明のヴィロソームが、通常、再構成のための材料とする生きたウイルスが標的細胞に対して示す場合と本質的に同じ融合活性を有しているという意味である。生きたインフルエンザＡ型ウイルスの融合原性とカチオン性ヴィロソームの融合原性の比較をすることが望ましい。この融合活性については、すでに知られている手順、例えば、ヘクストラ(Hoekstra)ら(Biochemistry 23:5675-5681、1984 )、または、ルッシャー(Luscher)ら(Arch．Virol.130:317-326、1993)が報告しているような手順で測定することが可能である。アンチセンス技術が患者の治療または予防治療に使用できるようになるには、多数の問題、特に、適当な担体システムの開発の問題が解決される必要がある。例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドのような遺伝物質を標的細胞に送達させようとする場合には、それが標的細胞に届く前に、不安定となってしまい破壊されるか、またはそうでない時には、多かれ少なかれ不活性の状態になるので、従来のようなカチオン性リポソームに組み込んで使用する場合には、この物質を大量に使用する必要がある。大量に使う場合には、動物やヒトに対しての毒性がないのかとの疑問が出てくる。本発明にかかるカチオン性ヴィロソームを遺伝物質の輸送担体として使用することにより、これらの問題はうまく克服可能であり、さらに毒性による副作用を防止、少なくとも、かなり減少させることができる。このような効果が期待できるのは、本発明のカチオン性ヴィロソームは、従来知られているリポソームまたはヴィロソームよりも１，０００~２，０００倍の高い効率と高い活性で、内部に組み込れたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入できるからである。このような高い導入効率であるために、従来型のヴィロソームまたはカチオン性のリポソームの性能と本発明のカチオン性ヴィロソームの性能を比較することは実際上不可能である。図面の簡単な説明図１は、ウイルス・スパイク・タンパク質を有するＤＯＴＡＰヴィロソームの顕微鏡写真である。図２は、モデルリポソームを使用して観察した、オクタデシル・ローダミンＢ標識ＤＯＴＡＰ-ヴィロソームにおけるpH誘導による融合活性を示したものである。図３は、組み込んだアンチセンスＦＩＴＣ-ＯＰＴをヒト小細胞肺癌細胞に導入させたＤＯＴＡＰ-ヴィロソームを示している。図４と５は、アンチセンス-L-myc-ＤＯＴＡＰ-ヴィロソームのヒト小細胞肺癌細胞への抜群の取り込みとトランスフェクション効率を示したものである。図６は、別種類のヒト小細胞肺癌細胞とアンチセンス-L-myc-ヴィロソームのインキュベーションを示したものである。図７ａ、７ｂは、ｐＲＳＶｃａｔ-ＤＯＴＡＰヴィロソームのジャーカット細胞へのトランスフェクション効率を示したものである。図８は、ＤＯＴＡＰ-ヴィロソームとリン脂質-リポソームとの融合を示したもの。融合状態は、３７℃でのＲ１８分析法により測定した。図９は、ヴィロソーム処理をしたＮＣＩ-Ｈ２０９細胞へのチミジン導入。アンチセンスＦＩＴＣ-ＯＰＴ、センス・ＦＩＴＣ-ＯＰＴあるいはｍｓｃ・ＦＩＴＣ-ＯＰＴのいずれかの２００ピコモルを含んだヴィロソームの７５μ ｌと、０．５μＣｉ ¹⁴Ｃ-チミジンを含んだ新鮮培地の６２５μｌを、５ｘ５⁴cells/ml per wellに添加した場合の結果を示したものである。図１０は、アンチセンス-L-myc-ＯＰＴを含んだヴィロソームの添加直後のチミジンのＮＣＩ-Ｈ２０９細胞への導入に関する用量依存性阻止を示したものである。ＮＣＩ-Ｈ２０９細胞を、初期濃度１ｘ１０⁵wellあたりmlあたり(p er well and per ml)としてインキュベートした。数値は３回の実験の平均値±標準偏差である。図１１は、別種類のヒト小細胞肺癌細胞系と７５μｌのアンチセンス-L-myc-ヴィロソームとのインキュベーションを示す。L-myc癌遺伝子発現が細胞系ごとに減少している。つまり、Ｈ８２＜Ｈ５１０Ａ＜Ｈ２０９である。ロット１のヴィロソームには、ロット２のヴィロソームよりも少ない量のアンチセンス-L-mycが含まれていた。図１２は、違った生産法で調剤した２種類のヴィロソームによるＳｐ２細胞のトランスフェクションを示す。図１３は、違った生産法で調剤した２種類のヴィロソームによるＰ３／ＮＳ１細胞のトランスフェクションを示す。図１４は、違った生産法で調剤した２種類のヴィロソームによるＮＩＨ／３Ｔ３細胞のトランスフェクションを示す。図１５，１６，１７は、センスｃ-ｍｙｂ-ＤＯＴＡＰヴィロソーム、アンチセンスｃ-ｍｙｂ-ＤＯＴＡＰヴィロソームによる処理直後のＫＧ１の細胞増殖を示したもの。１８pmol・ＯＰＴを含むヴィロソーム溶液２５μｌ、３６ pmol・ＯＰＴを含むヴィロソーム溶液５０μｌまたは７２pmol・ＯＰＴを含むヴィロソーム溶液１００μｌを添加した。数値は３回の実験の平均値±標準偏差である。図１８は、５０μｌのセンスc-myb-ヴィロソームと５０μｌのアンチセンスc-my b-ヴィロソームを添加して、ＤＯＴＡＰ-ヴィロソームで処理した直後のＣＥＭ-Ｃ３細胞の細胞増殖を示したもの。数値は３回の実験の平均値±標準偏差である。本発明がさらに詳しく理解されるように、下記の実施例を示す。この実施例は単に例示目的であって、いかなる点においても、本発明を制限するものではない。実施例１インフルエンザウイルス由来の完全な融合活性のあるウイルス・赤血球凝集素の三量体を有し、組み込まれたアンチセンス-Ｌ-ｍｙｃ-ＦＩＴＣ（フルオロセリン標識）-オリゴデオキシヌクレオチドを含むカチオン性脂質小胞の調製。ＤＯＴＡＰヴィロソームおよびＤＯＴＡＰ-ホスファチジルコリン（ＰＣ）ヴィロソームの調製。Ａ型シンガポールウイルスの６／８６株由来の赤血球凝集素（ＨＡ）を、スケール(Skehel)及びシールド(Schild)(1971)（Proc．Natl.Acad.Sci.USA79:968-97 2）が記載した方法により分離した。簡単に言えば、ウイルスを鶏卵の尿膜腔内で増殖させ、蔗糖密度勾配超遠心分離法により２回精製した。精製したウイルスを、７．９ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ、４．４ｍｇ／ｍｌのクエン酸三ナトリウム・２Ｈ₂Ｏ、２．１ｍｇ／ｍｌのスルホン酸２-モルオホノエタン、１．２ｍｇ／ｍｌのスルホン酸N-ヒドロキシエチル-ピペラジン-N'-2-エタン（ｐＨ７．３）を含む緩衝液内で安定化させた。３４５μｇ／ｍｌのＨＡを含むウイルス懸濁液の５３ｍｌを超遠心分離（１００，０００ｘｇ、１０分）にかけて沈澱させた。１４５ｍＭ・ＮａＣｌと２．５ｍＭ・ＨＥＰＥＳを含んでいる７．７ｍｌの緩衝界面活性剤と５４ｍｇ／ｍｌの非イオン性界面活性剤オクタエチレングリコール・モノドデシルエーテル（ＯＥＧ＝Ｃ₁₂Ｅ₈）(pH7.4)を、インフルエンザ沈殿物に添加した。その沈殿物を、室温で２分間超音波処理をすることにより完全に溶解させた。その溶液を１００，０００ｘｇで１時間超遠心分離した。ここから得た上清には、溶解したＨＡの三量体（１．６３５ｍｇＨＡ／ｍｌ）と微量のノイラミダーゼが含まれていた。６ｍｇのＤＯＴＡＰを３．７ｍｌの上清（６ｍｇＨＡ）に添加して溶解した。その溶液を０．２μｍフィルタを通過させることで滅菌し、その後、１．１５ｇの滅菌マイクロキャリヤー・ビーズ（バイオビーズ[Bio beads]・ＳＭ-2が好ましい）の入ったガラス容器に移した。その容器をハイドルフ(Heidolph)社製（ケルハイム、ドイツ）の振とう器・ＲＥＡＸ２を使用して１時間振とうさせた。必要な場合には、この手順を、０．５８ｍｇのバイオビーズを使って３回まで繰り返した。この手順の後、ＤＯＴＡＰヴィロソームのかすかに透明な溶液が得られた。ＤＯＴＡＰ-ＰＣヴィロソームを調製するために、３ｍｇのＤＯＴＡＰと３ｍｇのＰＣを、６ｍｇＨＡを含む上清に添加し溶解させた。この後に続くステップは、ＤＯＴＡＰヴィロソーム調製の場合と同じであった。合成融合ペプチドを有するヴィロソームの調製膜内に合成の融合ペプチドを有するカチオン性ヴィロソームの調製ステップは下記の通りである。１．架橋試薬であるN-[γ-マレイミドブチリルオキシ］スクシニミド・エステル（ＧＭＢＳ）を使用して下記の反応により、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の活性化させるステップ。ＰＥ＋ＧＭＢＳ −＞ＭＢＳ-ＰＥ＋N-ヒドロキリスクシニミドこれは、マーティン(Martin)らが報告しているように、イミュノグロブリン・フラグメントの前形成の小胞への不可逆結合である(J.Biol.Chem.257:286-288,198 2)。２．活性化されたＰＥ（ＧＭＢ-ＰＥ）脂質小胞の調製。この調製では、２０％ホスファチジルコリン、７０％ＤＯＴＡＰ、１０％ＧＭＢ-ＰＥを、ＤＯＴＡＰヴィロソームを含むＨＡに関して記載した方法で、緩衝界面活性剤内で溶解させる。この後に続く脂質小胞を調製するためのステップは、ＤＯＴＡＰヴィロソーム調製の場合と同じである。３．合成融合ペプチドの脂質小胞への結合。このステップでは、２０個のアミノ酸から成るペプチドを使用する（このアミノ酸の配列は、G-L-F-E-A-I-A-G-F-I- E-N-G-W-E-G-M-I-D-Cである）。さらに、このアミノ酸は、そのＮ末端に遊離アミノ基、Ｃ末端にアミド基を有する。Ｃ末端のアミノ酸はシステインであるので、脂質小胞の膜でのペプチドのＧＭＰ-ＰＥへの結合に使える遊離チオール基が存在する。［ＰＥ-ＧＭＢ膜＋ＨＳ-Ｃｙｓ-ペプチドー＞ＰＥ-ＧＭＧ膜-Ｓ-Ｃｙｓ-ペプチド］の結合反応を実行するために、緩衝液（４０ｍＭ・クエン酸、３５ｍＭ・リン酸二ナトリウム、１００ｍＭ・ＮａＣｌ、２ｍＭ・ＥＤＴＡ、pH5.5）中で新しく調製された脂質小胞の溶液を同じ緩衝液内のペプチドと混合させる。この混合物を窒素存在下で静かに１夜撹拌する。脂質小胞をハイロードスーパデックス(High Load Superdex)２００カラムを使用したゲル濾過により、非結合ペプチドから分離する。代替の方法として、Fab'フラグメントの例として下記に述べる方法により、融合ペプチドを、前形成させたＰＥ-架橋試薬-ペプチド複合体を使用して、脂質小胞と結合させてもよい。チオリン酸オリゴデオキシリボヌクレオチドのＤＯＴＡＰヴィロソームへの導入 L-myc遺伝子のアンチセンス・チオリン酸オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびセンス・チオリン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＰＴ）を、カチオン性ヴィロソームにより高効率のトランスフェクションが可能であることを例として使用した。5'-ＦＩＴＣ-ＯＰＴをホスファルアミド化学により合成した(Mic rosynth GmbH，Balgach，Switzerland)。アンチセンスＯＰＴとして１５量体(5 '-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3')、センスＯＰＴとして、１５量体(5'-FITC-GCGGACA TGGACTAC-3')を使用した。アンチセンスＯＰＴとアンチＯＰＴと同じ長さのヌクレオチドで構成される混合配列コントロール（ｍｓｃ）ＯＰＴを合成した。１ｍｌのＤＯＴＡＰヴィロソームまたはＤＯＴＡＰ-ＰＣヴィロソームを下記のそれぞれに添加した。ａ）２ｍｇのアンチセンスＦＩＴＣ-ＯＰＴ（１．３μｍｏｌ）と、ｂ）３．４ｍｇのセンスＦＩＴＣ-ＯＰＴ（１．３μｍｏｌ）ｃ）３．１ｍｇのｍｓｃＦＩＴＣ-ＯＰＴ（１．３μｍｏｌ）ＦＩＴＣ-ＯＰＴを溶解させ、その後、その溶液を２６℃で２分間音波処理した。封入されていないＦＩＴＣ-ＯＰＴを、ハイロードスーパデックス(High Loa d Superdex，Pharamacia，Sweden)２００カラムを使用したゲル濾過手順により、ヴィロソームから分離した。その後、カラムを無菌ＰＢＳで平衡化させた。ＦＩＴＣ-ＯＰＴを封入しているＤＯＴＡＰヴィロソームを含んでいるボイドボリューム分画を溶出させて集めた。ヴィロソームが、０．１％（v/v）トリトン(Tr iton)Ｘ−１００を含んだ０．１Ｍ・ＮａＯＨ中で完全に溶解した後、そのヴィロソームにトラップされているＦＩＴＣ-ＯＰＴ濃度を蛍光測定した。蛍光測定のスケールの校正のために、上記の界面活性剤溶液に溶解された何も封入していない空のＤＯＴＡＰヴィロソームの蛍光度をゼロに設定した。前形成したホスファチジルエタノールアミン-二価性架橋試薬分子複合体による、Fab'-フラグメントのヴィロソームへの結合２．８ｍｌのクエン酸緩衝溶液（１００ｍＭ・ＮａＣｌ、４０ｍＭ・クエン酸、３５ｍＭ・Ｎａ₂ＨＰＯ₄.２Ｈ₂Ｏ、２ｍＭ・ＥＤＴＡ、ｐＨ５．５）に溶解させた、マウスモノクローナル抗-ＣＤ１０-（抗-CALLA）抗体から新しく還元されたFab'の３ｍｇを，０．５２４ｍｇのN-[4-（ｐ-マレイミド-フェニル）-ブチリル]ホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＢ．ＰＥ）の、０．５％のｎ-オクチル-オリゴ-オキシエチレンを含むクエン酸緩衝液溶液２１５μｌに添加した。その後、この混合物を窒素存在下で、静かに撹拌しながら、４℃で１６時間インキュベートした。インキュベーションの後、非結合ＭＰＢ．ＰＥを、４００μｌの新しく還元された湿式チオプロピル・セファロース６Ｂ(Thiopropyl Sephaose)( Phamacia，Sweden)を使用することにより除去した。この混合物を室温で４時間インキュベートした。チオプロピル・セファロース６Ｂを遠心分離により除去し、その結果生成する溶液をｐＨ７．０に中性化させた。中性化した溶液をＯＥＧ（５４ｍｇ／ｍｌ）で捕足した。上記で記載されたような方法で調製された溶液をＤＯＴＡＰヴィロソームの調製溶液に添加した。ヴィロソームの形成がなされている間に、このFab'-ＭＰＢ．ＰＥ分子は脂質二重層に挿入される。電子顕微鏡観察ＤＯＴＡＰヴィロソームの電子顕微鏡写真により、レーザ光分散法により測定される平均直径が１２０~１８０ｎｍである小胞の好ましい単膜構造が確認された。インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質スパイクがはっきりと見える（図１）。ＤＯＴＡＰヴィロソームの融合活性の測定本発明にかかるＤＯＴＡＰヴィロソームの融合活性をヘクストラ(Hoekstra)ら (1984)(Biochemistry 23:5675-5681)やルーシャー(Luscher)ら(1993)(Arch．Vir ol.130:317-326）が提唱した蛍光デクェンチング法に基づいた定量分析により測定した。蛍光プローブである塩化オクタデシルローダミンＢ(R18)（Molecular P robes，Inc.，Eugene USAより入手）を高濃度で、ＤＯＴＡＰとＨＡを含んだ緩衝ＯＥＧ(C₁₂E₈)溶液として、蛍光プローブの乾燥薄膜に添加し、このプローブを溶解させるために５~１０分間振とうさせながら、ＤＯＴＡＰヴィロソームの膜内に挿入し、その後、「カチオン性脂質小胞の調製」の項で説明した方法を連続実施した。クェンチング・ローダミンの希釈物をローダミン標識したＤＯＴＡＰヴィロソームをモデルリポソーム（ＤＯＴＡＰの割合：リポソームリン脂質＝１：２０）と一緒にインキュベーションすることにより観察した。パーキンエルマー(Perkin-Elmer)１０００蛍光分光光度計により、励起・放射波長をそれぞれ５６０ｎｍと５９０ｎｍとして蛍光測定した。図２は、ＤＯＴＡＰヴィロソームのｐＨ誘導融合反応を、蛍光デクェンチング・パーセント値（％ＦＤＱ）として示したものである。封入したアンチセンス-Ｌ-ｍｙｃ-ＦＩＴＣ-ＯＰＴの細胞内取り込みＤＯＴＡＰヴィロソームの細胞内取り込みのメカニズム研究には、ＯＰＴをフルオロセンで標識することが有用であることが判明している。L-myc遺伝子(ナウ (Nau)ら、1985;Nature318,69-73)を高レベルで発現するヒト小細胞肺癌細胞(ATC C-NCL-H209)を２ウエル組織培養チャンバースライド上で増殖させた(Nunc,Naper ville，IL 60566，USA)。５０μｌのＦＩＴＣ-ＯＰＴヴィロソームを細胞に添加した。これらを３７℃で、５，１５，３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡により観察した。図３に示されたように、アンチセンスＦＩＴＣ-ＯＰＴを封入したＤＯＴＡＰヴィロソームは急速に細胞に導入された。チミジン導入法により測定したアンチセンス-L-myc-ＦＩＴＣ-ＯＰＴ-ＤＯＴＡＰヴィロソームの生物学的効果ヒト小細胞肺癌細胞(ATCC-NC1-H209アメリカ型カルチャコレクション,rockvil le，USA)を２４ウエル型コースター(Costar)プレート内で、初期濃度を１ｘ１０⁵ /well/mlとして培養した。２４時間のインキュベーションの後、培地を除去し、０．５μＣｉの¹⁴Ｃ-チミジン（[2-¹⁴C]チミジンから調製。５２．０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ；Amersham，England）を含む６２５μ１の新鮮培地と、０．２ｎｍｏ１のアンチセンスＦＩＴＣ-ＯＰＴまたはセンスＦＩＴＣ-ＯＰＴまたはｍｓｃＦＩＴＣ-ＯＰＴのいずれかを含む７５μｌのＤＯＴＡＰヴィロソームを添加した。培養物を非常にゆっくりと撹拌し静かに３７℃で１時間振とうさせた後、インキュベータに移した。４８時間後に細胞懸濁液を除去し、遠心分離バイアルに移し、遠心分離を行った。得られた細胞沈殿物を２回洗浄した。細胞を十分に単一の細胞懸濁状態に分散させることができない場合には、細胞を短時間だけトリプシン／ＥＤＴＡ溶液に浸した。細胞沈澱物を１．５ｍｌの０．１Ｍ・ＮａＯＨ／トリトン-Ｘ-１００溶液(0.1%)に溶解させた。３ｍｌの液体シンチレーション反応混液(ReadyProtein+,Beckman，Fullerton)を１ｍｌの溶液に添加した。¹⁴C放射活性を液体シンチレーションカウンター(Beckman,Fulleton,CA,USA) で計測した。図４，５は、アンチセンス-L-myc-ＤＯＴＡＰヴィロソームの抜群の取り込みとトランスフェクション効率を示している。図６は、L-myc遺伝子を発現しない細胞は、アンチセンス-L-myc-ヴィロソームに影響されたり、阻止されたりすることもないことを示している。また、何も封入してない空のヴィロソームは、癌細胞や正常細胞に影響を示さなかった。従って、本発明にかかるヴィロソームに封入されたアンチセンスＯＰＴを使用した抗癌治療は、特に、下記で述べるような従来のカチオン性リポソームに見られた欠点がないために、非常に有効であると思われる。実施例２インフルエンザウイルス由来の完全な融合活性のあるウイルス赤血球凝集素三量体を有し、ヒトIL-6遺伝子がポリリンカー部位にクローン化されたベクターｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ3-IL-6）を封入したカチオン性脂質小胞の調製。ＤＯＴＡＰヴィロソームの調製とｐｃＤＮＡ3-IL-6の導入ｐｃＤＮＡ３(Invitrogen Corporation，San Diego，USA)は、真核細胞宿主におけて、高レベルで安定した一過性発現を起こさせるための、５．４ｋｂの大きさのベクターである。実施例１で記載された方法で、ＨＡを分離・精製した。４ｍｇのＤＯＴＡＰを、１４５ｍＭ・ＮａＣｌ、２．５ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、５４ｍｇ／ｍｌのＯＥＧ（Ｃ₁₂Ｅ₈）(pH7.4)を含んでいる０．５ｍｌの緩衝界面活性剤溶液に溶解させ、４ｍｇＨＡを含んでいる、２ｍｌの上清に添加した。その結果生じた混合物に、１００μｇのｐｃＤＮＡ3-IL-6を添加して溶解させた。この溶液を３０秒間超音波処理を行った。ＯＥＧを実施例１で説明した方法で、バイオビーズ(Biobeads)により除去した。ｐｃＤＮＡ-IL-6を負荷したＤＯＴＡＰヴィロソームのマウス骨髄腫細胞へのトランスフェクションｐｃＤＮＡ-IL-6を負荷したＤＯＴＡＰヴィロソームから成る溶液をＰＢＳで１：１０００に希釈した。１ｎｇのｐｃＤＮＡ-IL-6を含んだ、この溶液の２０ μｌと、２．５ｎｇのｐｃＤＮＡ-IL-6を含んだ、この溶液の５０μｌを、２ｘ１０⁶骨髄腫細胞(P3/NSI/1-Ag4-1,アメリカ型カルチャコレクション,Rockville ，USA)に添加した。４８時間のインキュベーションの後、細胞培養の上清について、ヒトIL-6遺伝子が存在するかどうかをＥＬＩＳＡ法により試験した。ｍｌ当たり２０^-４５ｐｇのIL-6が測定された。ｐｃＤＮＡ-IL-6を負荷したＤＯＴＡＰヴィロソームとｐｃＤＮＡ-IL-6を負荷したＤＯＴＡＰリポソームとの間のトランスフェクション効率の比較ＤＯＴＡＰと同じ量のｐｃＤＮＡ-IL-6を含ませた従来のＤＯＴＡＰリポソーム（これには、ウイルス融合ペプチドがない）でトランスフェクションした骨髄腫細胞培養物にはIL-6が認められなかった。ｐｃＤＮＡ-IL-6を負荷したＤＯＴＡＰヴィロソームと同じトランスフェクション効果を得るためには、ｐｃＤＮＡ -IL-6を負荷したＤＯＴＡＰリポソームの量を１０００倍に増加させる必要があった。実施例３完全に融合活性のあるウイルス赤血球凝集素・三量体を有し、封入したベクターｐＲＳＶｃａｔを含んでいるカチオン性小胞の調製ＤＯＴＡＰヴィロソームの調製とｐＲＳＶｃａｔの導入発現ベクターｐＲＳＶｃａｔ(ＡＴＣＣより入手、Rockville,USA)にはクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードしたＣＡＴ遺伝子を含む。酵素はアセチル基のアセチルＣｏＡからクロラムフェニコールの3'ヒドロキシ位への輸送を触媒する。ＣＡＴベクターは、トランスフェクション効率のモニターに有用である。実施例２で説明した方法により、ｐＲＳＶｃａｔをＤＯＴＡＰヴィロソームに封入する。ｐＲＳＶｃａｔを負荷したＤＯＴＡＰヴィロソームのジャーカット細胞へのトランスフェクションジャーカット細胞（１０⁶cell/ml）を、ｐＲＳＶｃａｔを負荷したＤＯＴＡＰヴィロソームの量を変化させながら（０．０００１μｌ^-２５μｌ）、一緒にインキュベートした。３７℃で４８時間インキュベーションした後、ジャーカット細胞におけるＣＡＴ活性をＣＡＴ-ＥＬＩＳＡ測定法(Boehringer Mannheim，Ger many)により測定した。図７ａ、７ｂは、０．０１μｌのＤＯＴＡＰヴィロソームを添加することで、最大のトランスフェクションが達成されることを示している。上記とは反対に、０．０１μｌのｐＲＳＶｃａｔを負荷したＤＯＴＡＰリポソームを上記と同じインキュベーション条件で、ジャーカット細胞に添加した場合には、ＣＡＴ活性が検出できなかった。実施例４細胞のヴィロソームの取り込みヴィロソームの標的細胞への移入は、２つのステップに明白に分けられる。１．付着２．透過付着ステップには、ヴィロソームのＨＡによる細胞受容体への結合が含まれる。この細胞受容体は、末端にシアル酸を有する糖タンパク質または糖脂質膜である。細胞特異性ヴィロソームの場合には、Fab'フラグメントが標的細胞表面の抗原構造を認識し、その結果、２つの違った結合メカニズムにより標的細胞にヴィロソームが付着することになる。このように、細胞特異的ヴィロソームは特定の細胞型に選択性を示す。TAG72，CEA，17-1A、CA19-9のような腫瘍関連抗原またはC D10(CALLA)およびCD20のような白血病関連抗原を認識するFabフラグメントを有するヴィロソームは、標的細胞の表面にこれらの抗原を持っている腫瘍または白血病細胞とそれぞれ選択的に結合する。赤血球凝集素である糖タンパク質を注意深く分離して精製する。タンパク質分解または分子内ジスルフィド（-Ｓ-Ｓ-）結合の減少のいずれによっても不活性化が起こることはない。透過ステップには、受容体依存性エンドサイトーシスによるヴィロソームの細胞内への移入が含まれる。ヴィロソームがエンドソームにトラップされる。エンドソーム内のｐＨ（５−６）が酸性となることで、ヴィロソーム膜とエンドソーム膜の融合がトリガーされる。ウイルスのスパイク糖タンパク質である赤血球凝集素（ＨＡ）がこの融合を仲介する。エンドソームでの膜融合反応により、ヴィロソームが脂質エンベロープから遊離し、封入された薬剤が細胞質体に届くことになる。これらのヴィロソーム調剤の融合活性を蛍光デクェンシングにより試験した。ヴィロソームを蛍光プローブであるオクタデシル・ローダミンＢ(R18)で標識し、ＨＡの融合活性を、プローブのヴィロソームからリポームの標的膜への希釈による蛍光デクェンシング値を見ることでモニターした。図８は、Ｒ１８で標識したＤＯＴＡＰヴィロソームをリン酸脂質-リポソームに添加した後すぐに観察された蛍光状態を示したものである。この蛍光は急激に増加し始め、生きたＨＡの仲介する融合がなされていることを示した。細胞による時間依存的取り込みヴィロソームの取り込み量を、細胞を、¹⁴Ｃ標識したヴィロソームと共にインキュベーションすることにより測定した。細胞濃度が１ｘ１０⁵／ｍｌであるP3/ NS1を４０μｌのヴィロソームと、３７℃で５，１０，１５，２０，３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を溶解し、¹⁴Ｃ標識したヴィロソームの量を測定した。表３から分かるように、細胞の取り込みは極めて速い。最初の５分間でヴィロソームの１０％が取り込まれた。これ以上インキュベーション時間を延ばしても取り込みが強化されるということはなかった。約１０¹¹~１０¹²のヴィロソーム、つまり、細胞当たり４，０００~４０，０００ヴィロソームを含んだ１ｍｌのヴィロソームが５分以内に取り込まれた。実施例５癌治療へのアンチセンス戦略いわゆる、「アンチセンス」オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）というのは、標的としているｍＲＮＡのヌクレオチド配列の逆補体として合成されたＤＮＡの短いヌクレオチド配列のことである。ＲＮＡ-ＤＮＡ複合体を形成させて、遺伝情報の翻訳を阻害し、ＲＮアーゼＨによる分子の破壊を促進させる。癌遺伝子を標的にしたＯＤＮをコードしているｍＲＮＡを癌細胞に送達することができれば、癌細胞の増殖を阻止できるし、一定の環境では、癌細胞を殺すこともできる。アンチセンスＯＤＮを治療薬として使用できる大きな可能性がある。多くの前臨床動物試験および臨床治験フェーズＩ~ＩＩＩにおいて、アンチセンスＯＤＮが癌遺伝子に対抗的に作用していること、ウイルス遺伝子が治療的に活性を示すことが示されている。ＤＮＡ負荷リポソームまたは従来のヴィロソームを使った機能ＤＮＡ分子の細胞への導入はあまり効率が良くない。このために、遺伝物質の導入のための陽荷電脂質二重層（カチオン性）構造のヴィロソームを開発した。陽荷電の脂質二重層は、核酸と相互反応し、核酸を小胞の中に凝縮させる。アンチセンス-L-myc-ヴィロソーム L-myc遺伝子（これは最初、小細胞肺癌[SCLC]細胞系で見つかったものである）は頻繁に増幅され、ＳＣＬＣ中で過剰発現されてしまう。5'-ＦＩＴＣ-チオリン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＰＴ）をホスファルアミド化学法により合成した(Microsynth GmbH，Balgach，Switzerland)。アンチセンスＯＰＴとして１５量体(5'-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3')、センスＯＰＴとして、１５量体(5 '-FITC-GCGGACATGGACTAC-3')を使用した。アンチセンスＯＰＴとアンチＯＰＴと同じ長さのヌクレオチドで構成される混合配列コントロール（ｍｓｃ）ＯＰＴを合成した。翻訳開始部位をカバーするアンチセンスＯＰＴは、標的ｍＲＮＡのリボソームでの翻訳を阻止する。アンチセンス-L-myc-チオリン酸オリゴデオキシリボヌクレオチドをヴィロソームに封入した。ＳＣＬＣ細胞系のＨ２０９，Ｈ５１０，Ｈ８２において、ヴィロソームに封入されたL-mycアンチセンスＤＮＡの抗増殖効果が認められた。アンチセンス-L-mycヴィロソームをヒト小細胞肺癌細胞系の細胞に添加した。センス-L-mycヴィロソームおよびmsc（混合配列コントロール）ヴィロソームを対照として使用した（図９）。アンチセンス-L-myc-ヴィロソームは、非封入アンチセンスＯＰＴに較べて２０，０００倍の活性があった。図１０で見られたと同じような効果を引き出すために、濃度がマイクロモルの範囲の非封入L-myc-アンチセンスＯＰＴを細胞培養に加える必要があった。カチオン性ヴィロソームは、ＯＤＮの送達という点で、非封入ＯＤＮの細胞内取り込みに較べてはるかに効率がよく、さらに、カチオン性リポソームよりも効率がよい。アンチセンス-L-myc-ヴィロソームの増殖阻止効果は、３つのＳＣＬＣ細胞系( H209，H510,H82)においてL-myc発現レベルと関連があった。図１１から、L-myc 遺伝子を発現しない細胞は、アンチセンス-L-myc-ヴィロソームにより影響を受けることはないと結論された。空のカチオン性ヴィロソームは正常細胞と癌細胞に対してはなんら影響を示さなかった。L-myc遺伝子は、ＳＣＬＣにおいて頻繁に増幅され過剰発現されヒト成人組織では増幅は非常に制限され発現のレベルも低いので、L-mycがアンチセンス・ヴィロソーム治療の良い標的になりうるであろう。実施例６遺伝子治療のためのプラスミドベクターの非感染性導入。哺乳類での発現のためのベクターのカチオン性ヴィロソームによるトランスフェクション。癌遺伝子治療の現在のアプローチでは、適切な治療用遺伝子をヒト癌細胞に生体外(ex vivo)またはインヴィヴォで発現させるために、プラスミド・ベースのベクターを使用して導入しようとする。現在、治療に使える遺伝子として下記のものが評価されている。単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子のような感受性遺伝子(Moolten FL,Cancer Res.46:5276-5281,1986)；サイトカイン遺伝子のような癌細胞を減少させるために免疫系を標的にする遺伝子(Tep per RI等；Cell 57:503-512，1989)；補助的刺激分子をコードしている遺伝子(T ownsend SE等；Science 259:368-370,1993）；外来性の組織適合遺伝子(Plauts GE等；Proc Natl Acad Sci USA90:4645-4649，1993)；p53のような野生型腫瘍抑制遺伝子の代替遺伝子(Chen Pl等；Science 250:1576-1580,1990)。遺伝子治療のための最近使用されているウイルス・ベースのベクターにはある種の制限があり、例えば、遺伝子導入のために標的腫瘍細胞に到達させるための特異性の欠如、さらに、二次悪性疾患の誘発に関する安全性の問題や複製コンピタント・ウイルス形成の組み換えの起こる可能性などの問題があるので、プラスミド・ベースの発現ベクターをインヴィヴォで遺伝子導入できるための非感染性遺伝子導入技術の開発が必須である。ここで開示したカチオン性ヴィロソーム技術を使用すれば、非感染性の受容体仲介遺伝子導入が可能となる。市販されている脂質の通常のトランスフェクション効率は、５~５０％である。本発明のヴィロソームを使用すれば、市販されているリポソームよりも高い効率でのトランスフェクションが可能となるだけでなく、ＤＮＡをヴィロソームに封入することにより、細胞の安定した形質転換を実現できる。ヒト・インターロイキン６(IL-6)遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３（これは、真核細胞宿主において、高レベルの安定した一過性発現をするように設計した５．４ｋｂのベクターである）のポリリンカー部位にクローン化した。このベクターは、ネオマイシン耐性マーカーを含んでおり、これは、Ｇ４１８存在下で安定形質転換細胞を選択するために使用されるもので、ＳＶ４０初期プロモータ領域から発現される。３つの方法により、ベクターの封入を行った。１．透析：ヴィロソームの作製中にプラスミドを封入した。透析により、界面活性剤であるオクチル-ＰＯＥ(Octyl-POE)(Alexis Corp.，Laeufelfingen，Switze rland)を除去した。２．バイオビーズ(Biobeads):ヴィロソームの作製作製中にプラスミドを封入した。界面活性剤ＯＥＧをバイオビーズで除去した。３．超音波処理：プラスミドをＤＯＴＡＰで封入して、得られたＤＯＴＡＰ-リポソームを、超音波処理により、ＤＯＴＡＰ-ヴィロソームと融合させた。¹⁴ Ｃチミジンで標識したｐｃＤＮＡ-cIL-6-ＤＮＡを作製して封入されたプラスミドの量を測定した。 Sp2/0-Ag14細胞（ハイブリッド、非分泌性、マウス；ＩＤ番号：ＡＴＣＣＣＲＬ-１５８１、ここではＳｐと呼ぶ）、P3/NSI/1-Ag4-1細胞（非分泌性骨髄腫、マウス、ＩＤ番号：ＡＴＣＣＴＩＢ-１８，ここではＰ３／ＮＳ１と呼ぶ）、NIH/3T3細胞（胚、接触阻止、ＮＩＨスイスマウス；ＩＤ番号：ＡＴＣＣＣＲＬ-１６５８）を１ｍｌ培地中１ｘ１０⁵の濃度で、ヴィロソーム調製物（１)^- （３）を使用して、トランスフェクションした。トランスフェクションを行ってから１０日後、ＥＬＩＳＡにより、発現したIL-6の量を測定した（図１２，図１３，図１４）。これらの細胞系すべてについて、ＡＴＣＣ（アメリカ型カルチャ・コレクション）(12301，Parklawn Drive,Rockville，Maryland，USA)から入手できる。トランスフェクションされたＳｐ２およびＰ３／ＮＳ１細胞をＧ４１８により２回選択した。２カ月の培養の後、IL-6の産生量を再度測定した。表４はその数値を示したものである。細胞沈殿物に添加された溶解緩衝液を調製して、およそ２ｘ１０⁶/mlの細胞数となるようにした。実施例７白血病治療におけるアンチセンス戦略ヒト白血病における最もよく見られる遺伝子異常は、フィラデルフィア染色体 (Ph¹)転座である。癌原遺伝子ablの第９染色体から第２２染色体上のbcr領域への転座が、結果としてbcr-ablハイブリッド遺伝子の生成となる。abl癌原遺伝子は、通常、トリプシンキナーゼ活性を有するタンパク質をコードし、これはbcr- ablハイブリッド遺伝子を有する細胞内で増える。bcr-abl転写物は、ヒト慢性骨髄性白血病(CML)患者およびPh¹急性リンパ芽球性白血病患者の多くに見られる。 CMLにおけるbcr-abl遺伝子を標的にして治療することは最も合理的方法であることは明らかである。bcr遺伝子の第２または第３のエクソンからc-ab１遺伝子の第２エクソンまでのスプライシングにより産生されたbcr-abl転写物の接続部分に相補的である合成ＯＤＮは、フィラデルフィア１白血病細胞の増殖をインヴィトロで抑制し、正常骨髄前駆細胞を保存することが判明している（スズチリック (Szczylik)C等;Science 253:562-565，1991）。しかし、bcr-ablアンチセンス治療はCML患者に限定されている。アンチセンス治療のもう１つの分子標的はmyb遺伝子である。myb（癌原遺伝子 c-mybがコードされた産物）は、ＤＮＡ結合特異的転写因子として機能する。このmybは、造血細胞に優先的に発現され、造血細胞増殖に必要である。 c-mybのコドン２−７を標的として送達された１８-mer・アンチセンスＯＤＮは、試験した一次急性骨髄性白血病症例の７８％において、さらに、一次慢性骨髄性白血病(CML)の頻発症例５例のうちの４例において、Ｔ細胞白血病細胞(CCRF -CEM)のクローン原性増殖を阻止するかまたは完全に廃止させた（カラブレッタ( Calabretta)Bら；Proc Natl Acd Sci USA 88:2351-2355,1991）。急性および慢性の白血病などの数種の新生物治療の一部として、骨髄のパージングが採用されている。現在は、骨髄について免疫製剤および化学療法薬などの多様な薬剤で白血病性細胞の洗浄を行っている。白血病細胞の増殖をさせる癌遺伝子を標的として送達されるＯＤＮを封入したヴィロソームは、治療的に有用かつ重要であり、白血病細胞を減少させる効果の点で、従来の化学療法剤よりも選択性が高い、他方、正常な前駆細胞を保存する。アンチセンス-c-myb-ヴィロソーム c-mybコドン２−９に対応するセンスＯＰＴおよびアンチセンスＯＰＴを調製した。センスc-myb配列は、5'-GCCCGAAGACCCCGGCAC-3'であり、およびアンチセンス-c-myb-配列は5'-TGTGCCGGGGTCTTCGGGC-3'であった。ＯＰＴのＤＯＴＡＰヴィロソームへの封入は、L-myc-ＤＯＴＡＰヴィロソームで使用したと同じ方法で行った。ヒト骨髄白血病細胞系ＫＧ−１およびヒト急性リンパ芽球性白血病細胞系ＣＥＭ−Ｃ３をセンスc-mybヴィロソームおよびアンチセンスc-mybヴィロソームに曝露させた。ＫＧ−１細胞の増殖は、癌原遺伝子myb遺伝子産物に依存しているが、ＣＥＭ−Ｃ３はc-myb遺伝子の産物に依存していない。ＫＧ−１遺伝子を、２５，５０，１００μｌのセンスc-mybヴィロソームおよびアンチセンスc-m ybヴィロソーム（これらのそれぞれに、１８，３６，７２ｐｍｏ１のセンスＯＰＴとアンチセンスＯＰＴを含む）と一緒にインキュベートさせた。インキュベーションして２日目、３日目、４日目に細胞数を測定した。２５μｌのセンスc-mybヴィロソームとアンチセンスc-mybヴィロソームを添加した場合には、細胞増殖に対してはほんのわずかの影響しかなかった（図１５）。しかし、これらの５０μｌ（図１６）および１００μｌ（図１７）を添加した場合には、細胞増殖を強く阻止した。センスc-mybヴィロソームの用量を多くすることによっても、阻止効果を示した。ＣＥＭ−Ｃ３細胞は、同じヴィロソーム調剤には影響を受けなかったので（図１８）、これらの効果はヴィロソーム膜により誘起されなかったことが推定される。説明において使用された略字 2'-OMe:2'-Oメチル CALLA:急性リンパ性白血病共通抗原 CAT:クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ DOTAP:硫酸N-[(1,2,3-ジオレオイルオキシ)-プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル DOTMA:塩化N-[(1,2,3-ジオレオイルオキシ]-N,N,N-トリメチルアンモニウム FITC-OPT:チオリン酸フルオレセン・イソチオネート標識オリゴデオキシリボヌクレオチド G418:ジェネティシン・ディサルファート(Geneticin disulfat（抗生物質Ｇ４１８） HA:赤血球凝集素 IL-6:インタロイキン６ MPB.PE:N-[4-(p-マレイミド)-フェニル[ブチリル]-ホスファチジルエタノールアミン（＝架橋試薬−リン脂質複合体） msc:混合配列コノトロール NA:ノイラミダーゼ Octyl-POE:n-オクチル-オリゴ-オキシエチレン ODN:オリゴデオキシヌクレオチド OEG:オクタエチルグリコール・モノドデシルエーテル(C₁₂E₈) OPT:チオリン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド PC:ホスファチジルコリン PE:ホスファチジルエタノールアミン PNA:ペプチド・核酸 SCLC:小細胞肺癌 SV40:シミアンウイルス４０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者クライン、ペータースイス国ツェーハー―4438 ランゲンブルック、ノイホッフ（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．カチオン性および／またはポリカチオン性脂質を含んでいる陽荷電脂質二重層膜を有し、機能的に活性であるウイルスの少なくとも１個の融合ペプチドと、膜に結合した少なくとも１個の細胞特異的マーカと、好ましくは、標的細胞への送達のための望ましい材料から成る脂質小胞。２．膜の構成が、全脂質に対する割合で、 ‐カチオン性脂質および／またはポリカチオン性脂質が重量比で９０~９５％で、ホスファチジルエタノールアミンが重量比で５~１０％、または、 ‐カチオン性脂質および／またはポリカチオン性脂質が重量比で４５~９０％、ホスファチジルエタノールアミンが重量比で５~１０％、ホスファチジルコリンが重量比で５~５０％である請求項１に記載の小胞。３．（ｉ）カチオン性脂質が、塩化N-[(1,2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N ,N,N-トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；硫酸N-[(1,2,3-ジオレオイルオキシ)-プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル（ＤＯＴＡＰ）；N-t-ブチル-N'-テトラデシル-3-テトラデシルアミノプロピオンアミドのグループから選択された少なくとも１つから成り、（ｉｉ）プロカチオン脂質が、1,3-ジパルミトイル-2-ホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、2,3-ジオレオイルオキシ-N -[2(スペルミン-カーボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；1,3-ジオレオイルオキシ-2-（6-カルボキシ-スペルミル）-プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；ヨウ化N,N,N',N'-テトラメチル-N,N'-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2,3-ジオレオイルオキシ-1,4-ブタンジアンモニウム（ＴＨＤＯＢ）から選択された少なくとも１つから成る請求項１または２に記載の小胞。４．融合ペプチドが、赤血球凝集素三量体または単量体、これらの切断サブユニットの１つまたは両方、糖ペプチドであるＨＡ１およびＨＡ２、自然界から分離された融合ペプチド、および合成融合ペプチドのグループから選択される、前記クレームの１つまたはそれ以上に記載の小胞。５．膜が、少なくとも１つの二価性架橋試薬から成り、少なくとも１つの融合ペプチドおよび／または少なくとも１つの細胞特異的マーカが、上記架橋試薬によりその膜と結合している前記クレームの１つまたはそれ以上に記載の小胞。６．膜がホスファチジルエタノールアミンから成り、架橋試薬がホスファチジルエタノールアミンへの共有結合により、その膜に結合しており、架橋試薬が融合ペプチドまたは細胞特異的マーカの遊離チオール基にそれぞれ結合している請求項５に記載の小胞。７．上記の細胞特異的マーカが、モノクローナル抗体、F(ab')₂フラグメント、F ab'フラグメント、サイトカイン、成長因子のグループから選択される前記クレームの１つまたはそれ以上に記載の小胞。８．上記小胞にトラップされた望ましい遺伝物質、好ましくは、短鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、セレン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド、チオリン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド・ホスホルアミド、メチルホスホン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド、ペプチド核酸、リボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、チオリン酸オリゴリボヌクレオチド、リン酸2'-OMe-オリゴリボヌクレオチド、ホスホリン酸2'-OMe-オリゴリボヌクレオチド、リボザイム、遺伝子、プラスミド、ベクターから成るグループから選択された遺伝物質から成る前記クレームの１つまたはそれ以上に記載の小胞。９．直径が１２０~１８０ｎｍの範囲にある前記クレームの１つまたはそれ以上に記載の小胞。１０．（ａ）少なくとも１個の天然または合成のウイルス融合ペプチドを、非イオン性界面活性剤を含んでいる適当な緩衝液に溶解させるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）により生成した溶液に添加し、その中でカチオン性および／またはポリカチオン性脂質を溶解させるステップと、（ｃ）ホスホチジルエタノールアミン（ＰＥ）、架橋試薬、および、その架橋試薬に結合することができる少なくとも１個の細胞特異的マーカ、好ましくは、架橋試薬活性のホスホチジルエタノールアミン（ＰＥ／架橋試薬）およびＰＥ／架橋試薬／マーカ複合体から成るグループから選択された前成形の分子複合体から成るマーカを添加するステップと、（ｄ）オプションとして、ホスホチジルコリンを添加するステップと、（ｅ）この溶液をマイクロキャリヤー・ビーズ、好ましくは、ポリスチレン・バイオビーズＳＭ−２で処理することで界面活性剤を除去して、その結果として、陽荷電脂質二重層小胞を形成させるステップと、（ｆ）好ましくは、ステップ（ｅ）から作製される小胞に、標的細胞に導入させる望ましい物質のある量を添加し、その物質を小胞に取り込ませるために、その混合物を音波処理し、取り込まれなかった物質を、好ましくは、ゲル濾過により除去するステップから成る請求項１に記載の小胞の製造プロセス。１１．（ａ）カチオン性および／またはポリカチオン性脂質を非イオン性界面活性剤を含んでいる適当な緩衝液に溶解させるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で生成した溶液に、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）および、好ましくは、前形成のＰＥ／架橋試薬複合体から成る二価性架橋試薬、または代替的に、（ｂ’）ステップ（ａ）で生成した溶液に、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、二価性架橋試薬、少なくとも１個の融合ペプチド、および好ましくは、ＰＥ／架橋試薬、ＰＥ／架橋試薬／融合ペプチド、およびＰＥ／架橋試薬／マーカから成るグループから選択された前形成分子複合体である少なくとも１個の細胞特異的マーカを添加し、この後に続くステップ（ｅ）を省略するステップと、（ｃ）オプションとして、ホスホチジルコリンを添加するステップと、（ｄ）この溶液をマイクロキャリヤー・ビーズ、好ましくは、ポリスチレン・バイオビーズＳＭ−２で処理することで界面活性剤を除去して、その結果として、陽荷電脂質二重層小胞を形成させるステップと、（ｅ）その小胞に、少なくとも１個のウイルス融合ペプチドおよび架橋試薬に結合することのできる、少なくとも１個の細胞特異的マーカを添加するステップと、（ｆ）好ましくは、ステップ（ｅ）から作製される小胞に、標的細胞に導入させる望ましい物質のある量を添加し、その物質を小胞に取り込ませるために、その混合物を音波処理し、取り込まれなかった物質を好ましくはゲル濾過により除去するステップから成る請求項１に記載の小胞の製造プロセス。１２．（ｉ）カチオン性脂質が、塩化N-[(1,2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル] -N,N,N-トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；硫酸N-[(1,2,3-ジオレオイルオキシ)-プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル（ＤＯＴＡＰ）；N-t- ブチル-N'-テトラデシル-3-テトラデシルアミノプロピオンアミドから成るグループから選択された少なくとも１つの物質から成り、さらに、（ｉｉ）ポリカチオン性脂質が、1,3-ジパルミトイル-2-ホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、 2,3-ジオレオイルオキシ-N-[2(スペルミン-カーボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；1,3-ジオレオイルオキシ-2-（6-カルボキシ-スペルミル）-プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；ヨウ化N,N,N',N'-テトラメチル-N,N'-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2,3-ジオレオイルオキシ-1,4-ブタンジアンモニウム（ＴＨＤＯＢ）から成るグループから選択された少なくとも１つの物質から成る請求項１０または１１に記載のプロセス。１３．上記緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液であり、好ましくは、オクタエチレングリコール・モノドデシルエーテルおよびn-オクチル-オリゴ-オキシエチレンから成るグループより選択された２５０μmol/mlの非イオン界面活性剤から成る請求項１０~１２の１つまたはそれ以上に記載のプロセス。１４．上記ウイルス融合ペプチドが、赤血球凝集素の三量体または単量体、それらの切断サブユニットの１つまたは両方、糖ペプチドＨＡ１およびＨＡ２、自然界から分離された融合ペプチド、合成融合ペプチドから成るグループから選択される請求項１０~１３の１つまたはそれ以上に記載のプロセス。１５．脂質の構成が、全脂質に対する割合で、 ‐カチオン性脂質および／またはポリカチオン性脂質が重量比で９０~９５％で、ホスファチジルエタノールアミンが重量比で５~１０％、または、 ‐カチオン性脂質および／またはポリカチオン性脂質が重量比で４５~９０％、ホスファチジルエタノールアミンが重量比で５~１０％、ホスファチジルコリンが重量比で５~５０％である請求項１０~１４の１つまたはそれ以上に記載のプロセス。１６．上記のマイクロキャリヤー・ビーズのメッシュ・サイズ（ウエット）が２０~５０（０．８４~０．３０mm）であり、その溶液がこのビーズで４回まで処理される請求項１０~１５の１つまたはそれ以上に記載のプロセス。１７．上記細胞特異的マーカが、モノクローナル抗体、F(ab')₂フラグメント、F ab'フラグメント、サイトカイン、成長因子から成るグループにより選択される請求項１０~１６の１つまたはそれ以上に記載のプロセス。１８．上記架橋試薬が、好ましくは、ビス-N-スクシニミディル誘導体および光活性スクシニミディル誘導体から成るグループより選択されたヘテロ二価性スクシニミディル誘導体である請求項１０~１７の１つまたはそれ以上に記載のプロセス。１９．前形成の分子複合体であるＰＥ／架橋試薬／融合ペプチドまたはＰＥ／架橋試薬／細胞特異的マーカが、融合ペプチドまたは細胞特異的マーカがチオール基を通して、好ましくは、N-[4-(p-マレイミドフェニル)-ブチリル]-ホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＢ．ＰＥ）および4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート-ホスファチジルエタノールアミン（ＭＣＣ．ＰＥ）のグループから選択される共有結合の架橋試薬／ＰＥ-分子複合体の架橋試薬部分に結合する反応により得られる請求項１０~１８の１つまたはそれ以上に記載のプロセス。２０．未反応架橋試薬-ホスファチジルエタノールアミン分子、特に、未反応ＭＰＢ．ＰＥまたはＭＣＣ．ＰＥが、ゲルクロマトグラフィ、好ましくは、アガロースマトリックスを使用したアフィニティクラマトグラフィ、最も好ましくは、還元チオプロピルセファロース６Ｂにより、反応生成物から分離される請求項１９に記載のプロセス。２１．導入のための上記の望ましい物質は、短鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、セレン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド、チオリン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド・ホスホルアミド、メチルホスホン酸オリゴデオキシリボヌクレオチド、ペプチド核酸、リボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、チオリン酸オリゴリボヌクレオチド、リン酸2'-OMe-オリゴリボヌクレオチド、ホスホリン酸2'-OMe-オリゴリボヌクレオチド、リボザイム、遺伝子、プラスミド、ベクターから成るグループから選択された遺伝物質である請求項１０~２０の１つまたはそれ以上に記載のプロセス。２２．より好ましくは、望みの遺伝物質を標的細胞、特に、哺乳類の休止細胞または増殖性細胞に特異的かつ非感染で送達することのできるドラッグデリバリーの輸送システムとして使用される請求項１~１０のうちの１つまたはそれ以上に記載の、および／または請求項１０~２１のうちの１つまたはそれ以上に記載のプロセスにより達成できる陽荷電脂質小胞。２３．診断用または医療用、好ましくは、ヒトまたは動物における予防／治療に使用可能である請求項２２に記載の陽荷電脂質小胞。２４．癌、白血病、ウイルス感染から成るグループより選択された疾病の治療用として、好ましくは、アンチセンス治療に適した、少なくとも１個のアンチセンスオリゴヌクレオチドで構成される請求項２２または２３に記載の陽荷電脂質小胞。２５．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、癌原遺伝子または癌遺伝子をコードしたｍＲＮＡを標的とする請求項２４に記載の陽荷電脂質小胞。