JP2000509495A - 均質相中のハプテンを検出及び／又は定量するための方法、及びその実行のための手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は均質相中のハプテンの検出及び／又は定量のための方法であって以下の操作を含む方法に関する：− 既知量の阻害剤−ハプテン複合体を検出されるべき及び／又は定量されるべきハプテンを含む溶液に加え；− 阻害剤−ハプテン複合体の量に相当する量の抗体を溶液に加え；ー 一つの活性化部位で競合に入る二つの基質のための一つの活性化部位を持つタイプＣのβ−ラクタマーゼを溶液に加え（第一の基質は好ましくは可視紫外線測定によって検出可能及び／又は定量可能な化合物に変換され得るレポーター基質であり、第二の基質はレポーター基質の加水分解の速度に作用する阻害剤−ハプテン複合体である）；− レポーター基質の変換で生ずる化合物の濃度を検出及び／又は定量する（レポーター基質のＫ_m定数は阻害剤−ハプテン複合体のＫ_m定数より少なくとも１００倍高く、レポーター基質のｋ_cat定数は阻害剤−ハプテン複合体のｋ_cat定数より少なくとも１０倍高い）。

Description

【発明の詳細な説明】 均質相中のハプテンを検出及び／又は定量するための方法、 及びその実行のための手段発明の主題 本発明は均質相中のハプテンを検出及び／又は定量するための方法、及び検出 及び／又は定量のための手段(device)、特に均質相中のハプテンのスクリーニン グ及び／又はアッセイを可能にするキットに関する。従来技術 過去数年の間、生化学の分野における主要な進展は均質相中のハプテンのアッ セイを可能にするイムノアッセイの開発を可能にした。ハプテンは天然起原又は 合成ルートによって得られる小さなサイズの分子であり、特に動物又はヒトを治 療するのに用いられる。 かかる分子は例えば医薬活性成分、ホルモン、アナボリックステロイドなどで あり得る。 これらのハプテンのスクリーニング及び／又はアッセイについての試験の適用 を容易にするため、均質相中で用いることのできるイムノアッセイを開発する試 みがなされてきた。 酵素学的イムノアッセイが提案されている。それらはVoller及びBidwell(Voll er A.，Bidwell D.W.，in Alternative Immunoassays，Collins WP Ed．John Wi ley，Chichester，pp.78-79(1986))によって記載されている「基質標識蛍光イム ノアッセイ(substrate labelled fluorescent immunoassay)」、「アポ酵素再活 性化イムノアッセイ系(apoenzyme reactivation immunoassay system)」、「酵 素増幅イムノアッセイテスト(enzyme multiplied immunoassay test)」、及び「 酵素チャネリングイムノアッセイ(enzyme channeling immunoassay)」、及びク ローン化された酵素ドナーイムノアッセイ(cloned enzyme donor immunoassay)( Henderson et al.，Cli．Chem.，32,9,pp.1637-1641(1986))である。 特許出願ＥＰ−０１１７６４８は乳の凝固阻害に基づいた相中のステロイドの イムノアッセイを記載している。このアッセイは乳を生産する家畜の繁殖力につ いての情報を与える。 しかし、臨床生物学における、及び様々な媒体（血液、尿など）中の多数のハ プテンのアッセイ及び／又は検出における広範囲の使用を可能にするほど十分感 度が高く、特異的かつ再現可能な均質相中で作用するイムノアッセイの開発にお いては現在まで何の成功も達成されていない。 現在まで用いられているヨウ素ベースの系は実際的にはすべてのヨウ化物が空 気中で酸化され、昇華により失われるヨウ素を生成するという不都合を有する。 従ってこれは不安定性の第一の源を構成する。更に、デンプンペーストはバクテ リア及び菌によって容易に分解され、そのことは不安定性の別の源を構成する。 特許出願ＦＲ−２３３９１７２は尿酸又はヨウ素によって酸化することのでき る他の材料がアルカリ性媒体中の予め決められた量よりも大きい割合で液体中に 存在するかどうかを測定するための反応系を記載している。前記試薬はヨウ素の 存在を検出する指示薬と共に遊離ヨウ素の好適な量をその場で放出することがで きる水活性化可能なヨウ素生成剤を含む。ヨウ素生成剤及び指示薬は試験ストリ ップに適用される。結果としてかかる手段は乾燥状態でのみ作用し、従って固体 系での分析における適用に留まっている。発明の目的 本発明の目的は十分感度が高く特異的かつ再現可能な、いかなるタイプの均質 相（血液、血清、尿、乳など）中のハプテンをもスクリーニング及び／又はアッ セイするための方法及び手段を得ることである。 特に、１００ｐＭ以上のオーダーの濃度、又は１０ｐＭ以上のオーダーの濃度 でヒト又は動物の生理液中に存在するハプテンを検出することを可能にする方法 及び手段を得ることが求められている。 本発明の特別な目的は従来技術の手段及び方法において観察される「バックグ ラウンドノイズ(background noise)」を減少させることによって前記方法及び手 段の感度を最適化することである。 本発明の最後の目的は汚染又は分解なしに長期間貯蔵することができる手段を 得ることである。発明の主要な特徴 本発明は以下の方法に関する。 すなわち、均質相中のハプテンの検出及び／又は定量のための方法であって、 以下の操作を含む方法： − 既知量の阻害剤−ハプテン複合体を検出されるべき及び／又は定量されるべ きハプテンを含む溶液に加え； − 阻害剤−ハプテン複合体の量に相当する量の抗体を溶液に加え； − 一つの活性化部位で競合に入る二つの基質のための一つの活性化部位を持つ タイプＣのβ−ラクタマーゼを溶液に加え（第一の基質は好ましくは可視紫外線 測定によって検出可能及び／又は定量可能な化合物に変換され得るレポーター基 質であり、第二の基質はレポーター基質の加水分解の速度に作用する阻害剤−ハ プテン複合体である）； − レポーター基質の変換で生ずる化合物の濃度を検出及び／又は定量する（レ ポーター基質のＫ_m定数は阻害剤−ハプテン複合体のＫ_m定数より少なくとも１０ ０倍、好ましくは１００００倍高く、レポーター基質のｋ_cat定数は阻害剤−ハ プテン複合体のｋ_cat定数より少なくとも１０倍、好ましくは１００００倍高い ）。 上述の操作に先立って、あり得る妨害を除去するため、酵素を保護する薬剤、 レポーター基質を保護する薬剤、ハプテン−阻害剤複合体を保護する薬剤、又は 汚染除去剤の如き物質をアッセイされるべきハプテンを含む溶液に任意的に加え てもよい。 上述したある量の抗体の溶液への添加はレポーター基質の溶液への添加の操作 と組合せてもよい。上述の操作のいくつか又はすべては組合せることができる。 つまり、上述の操作は同時に行われることもでき、及び／又は操作の示された順 序は改変することができる。 従って、記載の明確さのためだけに、溶液への酵素の添加に先立つ様々な操作 は個別の手順として連続的に示されている。 結果として、遊離ハプテンの不在下ですべての阻害剤−ハプテン複合体分子は 抗体と結合し、不活性となる。従って酵素活性は最大となる。他方、アッセイさ れるべきハプテンの量が高ければ高いほど、阻害剤−ハプテン−抗体の量はいっ そう低くなる。このことは阻害剤−ハプテン複合体分子の実質的な有効性を意味 する。 これは低い酵素活性に通じ、それはレポーター基質の低い変換を生じ、それは 可視紫外線の低い吸光度によって検出及び／又は定量される（図１参照）。 又、本発明は均質相中のハプテンをスクリーニング及び／又は定量するための 手段に関し、その手段は一つの活性化部位で競合に入る二つの基質のための一つ の活性化部位を持つ酵素及び二つの基質を含む（第一の基質は好ましくは可視紫 外線測定によって検出可能及び／又は定量可能な化合物に変換され得るレポータ ー基質であり、第二の基質はレポーター基質の加水分解の速度を調節する阻害剤 −ハプテン複合体である）。前記手段は前記阻害剤−ハプテン複合体に結合可能 な抗体をも含む。 レポーター基質のｋ_cat定数は高く０．１ｓ^-1、好ましくは１０ｓ^-1より大き い。阻害剤−ハプテン複合体のＫ_i定数は低く、５０００μｍ、好ましくは１０ ０μｍ未満である。阻害剤−ハプテン複合体のｋ_cat定数は低く、０．１ｓ^-1未 満である。 本発明による方法及び手段において、酵素はβ−ラクタマーゼ、好ましくはタ イプＣのβ−ラクタマーゼである。有利にはβ−ラクタマーゼはEnterobacter c loacae Ｑ９０８Ｒ及びＰ９９から得られるβ−ラクタマーゼ、及びCitrobacter freundii及びEscherichia coliから得られるβ−ラクタマーゼからなる群から 選択される。 本発明によれば阻害剤及びレポーター基質はペニシリン、セファロスポリン、 及びβ−ラクタム系抗生物質からなる群から選択される。 レポーター基質はセファロリジン、ニトロセフィン、セファロチン、セファレ キシン、セファロスポリンＣ、セファセトリル及びセファゾリンからなる群から 選択されることが好ましい。 本発明によれば阻害剤−ハプテン複合体の阻害剤はカーベニシリン、オキサシ リン、セフロキシン、セフォタキシム、及びメチシリンからなる群から選択され ることが好ましい。 本発明はヨウ化カドミウムの添加によって安定化されたヨウ素／デンプンペー スト系を用いた表色系(color system)による検出方法にも関する。 好ましくはレポーター基質の反応の証拠は加水分解産物に特異的な色の測定に よって検出されるか、又は、これらの産物が着色していない場合は指示薬系によ って、特にヨウ素／デンプンを用いた着色によって検出される。 出願人はヨウ化カドミウムが空気中での酸化に対して安定であること、及びカ ドミウムイオンの毒性がデンプンペーストを微生物による汚染に対して安定化す ることに気付いた。 ヨウ化カドミウムの添加によって安定化されたテンプンペースト溶液中でのヨ ウ素の生成に基づく上述のタイプの系が上述の手法において特に好ましいことが 明らかになった。 ヨウ化カドミウムはＤＴＰＡ及びヨウ素酸塩の存在下でｐＨ２の媒体と反応し て試薬を生成し、それは続いて作用ｐＨにされることができる。 以下の実施例で述べられるとおりこのタイプの反応はヨウ素を用いたセファレ キシンのアッセイの如き他のアッセイにも好適であることは注意されるべきであ る。 上述のレポーター基質の変換から生ずる化合物の濃度を検出及び／又は定量（ アッセイ）する特別な事例では、このデンプン／ヨウ素色はハプテンの検出及び ／又はアッセイを低濃度で、及び均質相の一般的な色に関して識別する色の範囲 で可能にする。 本発明による方法及び手段において阻害剤はカーベニシリン、オキサシリン、 セフロキシン、セフォタキシム、及びメチシリンからなる群から選択されること が好ましい。同様に、β−ラクタム環又はβ−ラクタム環に関連した環を持つい かなる他の物質、又はβ−ラクタム環もしくはβ−ラクタム環に関連した環を必 ずしも持たないが上述の酵素群に対して測定可能な速度パラメータ(kineticpara meters)（Ｋ_m、Ｋ_i及びｋ_cat）を示し、レポーター基質の加水分解速度の低下 を保証するいかなる物質さえからも阻害剤は選択することができる。 有利にはアッセイされるべきハプテンは医薬活性成分、ホルモン、アナボリッ クステロイド、又は以下のものからなる群から選択されることが好ましい薬物で ある：テストステロン、エストラジオール(estridiol)、プロゲステロン、アル ドステロン、コルチゾール、メチルアンフェタミン、メタドン、テトラヒドロカ ンナビノール、Δ⁴−アンドロステンジオン、モルフィン、ＤＨＥＡスルフェー ト、ナンドロロン、テオフィリン、コカイン、及び／又はそれらの加水分解誘導 体。本発明の好ましい実施例の記述 １．酵素の選択 β−ラクタマーゼはＡ，Ｂ，Ｃ及びＤという四つのファミリーに分類すること ができる。Ａ，Ｃ及びＤタイプのβ−ラクタマーゼはセリンを含む活性化部位を 介したアシル−酵素複合体の生成に関与するそれらの作用様式によって特徴付け られる。Ｃタイプの酵素は以下のことに基づいて有利に選択された： − 文献から知られている速度パラメータ、 − 阻害剤の存在下でのそれらの反応機構、 − それらの商業的利用可能性、 − それらの化学的及び熱的安定性。 実際にはタイプＣのβ−ラクタマーゼによるペニシリンの加水分解反応では明 快な阻害剤は存在しない。結果として「良好かつ貧弱な基質(good and poor sub strate)」という語はβ−ラクタマーゼとのペニシリンの相互作用においてペニ シリンを特徴付けるために用いられる。しかし、簡単のため「基質(substrate) 」及び「阻害剤(inhibitor)」という語が明細書の残りの部分及び請求の範囲で は用いられる。 良好な基質又はレポーター基質は貧弱な基質、すなわちハプテン−阻害剤複合 体と共同で用いられる。後者による不活性化のモデルはアシル酵素の生成による 比較的安定な酵素−阻害剤複合体の生成を仮定する。 利用可能なβ−ラクタマーゼの中にEnterobacter cloacae Ｑ９０８Ｒ及びＰ ９９，Citrobacter freundii,又はEscherichia coliからのβ−ラクタマーゼを 挙げることができる。２．阻害剤の選択 阻害剤の選択は速度パラメータ及びアッセイされるべきハプテンとの結合の可 能性（阻害活性にとっては必須でない官能基の存在）に依存している。酵素レベ ルでは理想的な阻害剤は可能な限り低いｋ_cat（極めて低い分解速度）及び同時 に可能な限り低いＫ_m（酵素に対する高い親和性）を持つべきである。考えられ ている阻害反応の場合、Ｋ_m値は定数Ｋ_iに近い。従ってＫ_mはＫ_iの計算から推定 可能である。これは既知の特性を持つレポーター基質の存在下でかつ様々な量の 阻害剤の存在下で行われれる速度測定から得られる。又、理想的な阻害剤は（阻 害剤の酵素に対する結合段階に相当する）可能な限り高い速度定数ｋ₊₁を持つべ きである。この原則に基づいて以下の五つの阻害剤を選択することが可能であっ た： − カーベニシリン（Ｋ_m＝０．５−２０ｎＭ；ｋ_cat＝０．００２−０．００４ ｓ^-1）， − オキサシリン（Ｋ_m＝０．５ｎＭ；ｋ_cat＝０．００５Ｓ^-1）， − セフロキシン（Ｋ_m＝２０ｎＭ；ｋ_cat＝０．０４−０．１５ｓ^-1）， − セフォタキシム（Ｋ_m＝２０−１７０ｎＭ；Ｋ_cat＝０．０１−０．１７ｓ^-1 ）， − メチシリン（Ｋ_m＝２−１５０ｎＭ；ｋ_cat＝０．０７−０．０８ｓ^-1）。 阻害剤は遊離しておりかつその阻害活性には必須でなく、しかもアッセイされ るべきハプテンに対する結合を可能にする少なくとも一つの化学的官能基を持つ べきである。 更に、用いられる阻害剤はナンドロロンの如きステロイド、テオフィリンの如 き医薬、又はコカインの如き薬物に対して結合可能であるべきである。３．レポーター基質の選択 様々なβ−ラクタマーゼと接触させられる一連のレポーター基質のＫ_m及びｋ_{c at} 値は表１及び２に集められている。データは実験によって測定されたか又は文 献で利用可能なデータから引き出された。 Citro.F.はCitrobacter freundiiからのβ−ラクタマーゼを表し、P99及び Q908RはEnterobacter cloacaeから得られるβ−ラクタマーゼを表す。 表１及び２からセファロリジン、ニトロセフィン、セファロチン、セファロス ポリンＣ、セファセトリル、セファゾリン（及びセファレキシンも）がレポータ ー基質として使用可能であることがわかる。４．ナンドロロンカーベニシリネート（結合物(conjugate)１）の合成 フェニルマロン酸を３５℃で乾燥ジオキサン−エーテル混合物中で１．２当量 の塩化チオニルと３時間インキュベートすることによって酸一塩化物に変換する 。溶媒を蒸発させ、ジオキサン−エーテル混合物中に溶解された残余（高温の油 ）をジオキサン中のナンドロロンの氷冷溶液と混合する。ステロイドが不足して いる混合物を室温で１２時間インキュベートする。生成物を水性炭酸水素ナトリ ウム溶液で抽出し、次に溶液をｐＨ２に酸性化した後、クロロホルムで再抽出す る。クロロホルムの蒸発によってステロイドフェニルマロネートを得る（図２参 照）。 ナンドロロンフェニルマロネートの６−ＡＰＡへの結合を従来どおりカルボニ ルジイミダゾール（ＣＤＩ）での活性化後に行う。結合物の精製をトルエン−白 ペトロラタム混合物からの最終再結晶化前にｐＨ２及び８．５のエーテル中での 抽出によって行う（表９参照）。５．コカインカーペニシリネートの合成（結合物２） 水性−アルコール媒体中で１当量のＫＯＨの作用によってジエチルフェニルマ ロネートを加水分解してモノエステルとする。次にモノエステルをカルボキシル ジイミダゾールを活性化剤として用いる従来の手法によってｐ−アミノメチル安 息香酸と結合させる。残余のエチルエステルを５％ＫＯＨでの加水分解及びそれ に続いて１当量のトリエチルアミンの存在下でクロロギ酸イソブチルとアンヒド ライドを混合させる方法を用いてベンジルアルコールでエステル化することによ って、対応するベンジルエステルで置換する。残余のカルボキシル官能基を従来 通りクロロギ酸イソブチルで活性化し、次にエクゴニンに結合させる。結合物の ベンゾイルエクゴニン部分のカルボン酸をメタノールの存在下で適用される同様 の手法によってメチルエステルによって変換する。ベンジル官能基を２バールの 水素圧で炭素上のパラジウムの存在下で加水分解によって除去する。生成した酸 はBrown et al.，Chem．Soc．Perkins Trans No.1,p.881(1991)の方法に従って メタンスルホニルクロライドを用いた前もっての活性化を用いて６−ＡＰＡに最 終的に結合させるために用いられる（図３参照）。この化合物の精製はトルエン −白ペトロラクタム混合物からの最終再結晶化の前にｐＨ２及び８．５のエーテ ルでの抽出によって行われる（表９参照）。６．様々なナンドロロンオキサシリネート及び他のステロイドの合成 ナンドロロン及び他のステロイドの検出限界を低下させるため、それらは（特 に低いＫ_iを持つ）より効果的な阻害剤に結合され、異なるレベルの阻害力を必 要とする様々な用途に適した様々な阻害特性を持つ阻害剤の範囲を生み出す。こ れらの化合物の合成を以下に述べる。目標の分子を得るためにとられた手順はス テロイドへの結合を可能にするため及びＫ_iにおける有意な差異を生み出すため に好適に改変されたペニシリンに結合された側鎖及びステロイド部分を含む前駆 体の合成にある。次にアミドが前駆体の６−ＡＰＡへの結合によって形成され、 最終的な分子が得られる。以下に示される合成の一般方法は図４−１３にまとめ られている。６．１． 前駆体の合成（フェニルイソオキサゾール） 第三ブチル３−（４−カルボキシフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４ −カルボキシレート（前駆体１）の合成 １当量の４−カルボキシベンズアルデヒド（Ｉ）をＮａＯＨでｐＨ４．５に調 節された水／メタノール混合物中で２当量のヒドロキシルアミンヒドロクロライ ドと反応させる。２時間の反応後、溶液を化合物(II)の沈殿が得られるまで減圧 下で濃縮する。沈殿を濾過し、氷冷水で洗浄し、ｐＨ８のＮａＨＣＯ₃緩衝液に 再溶解する。化合物溶液を木炭を用いて精製し、濾過し、ＨＣｌで再酸性化する 。沈殿した化合物(II)を単離し、Ｈ₂Ｏで洗浄し、減圧下で乾燥する。 化合物IIをジオキサン／ＣＨＣｌ₃混合物中に溶解する。溶液をアセトン／ド ライアイス混合物で冷却し、次に塩素で飽和させる。塩素化された溶液を次に室 温まで徐々に加熱する。反応の完了後、溶液を減圧下で蒸発させる。得られた化 合物(III)をエタノールに溶解させ、白ペトロラクタムの添加によって沈殿させ る。 １当量の化合物IIIをメタノール／アセトニトリル混合物に溶解させる。０℃ に冷却した後、２当量のＮａ第三ブチルアセトアセテート（IV）を化合物IIIの 溶液にゆっくりと加える。反応の終わりに溶液を酢酸で酸性化した水で置換する 。化合物をクロロホルムを用いて溶液から抽出する。クロロホルム相を水で洗浄 し、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。それを次に化合物（Ｖ）が濃縮されるまで 蒸発させる。 第三ブチル３−［４−（２−ブロモメトキシ）−３−クロロフェニル］−５−メ チルイソオキサゾール−４−カルボキシレート、及び第三ブチル３−［４−（２ −ヨードエトキシ）−３−クロロフェニル］−５−メチル−イソオキサゾール− ４−カルボキシレート（前駆体２ａ及び２ｂ）の合成 合成は先行する化合物の製造に基づいており、開始材料はブロモメトキシベン ズアルデヒドである。ブロモメトキシベンズアルデヒドをＮａＯＨの制御された 添加によってｐＨを５に保たれた水性−アルコール媒体中でヒドロキシルアミン ヒドロクロライドの作用によってオキシムに変換する。２時間にわたるクロロホ ルム中の飽和での塩素の作用はオキシムをクロロオキシムに変換し、続いてフェ ニル環をエーテルのオルト位において塩素原子で置換する。生成物は反応中に生 成する不安定な化合物を除去するため、シリカカラムでのクロマトグラフィーに よって２回精製される（移動相はトルエン、エチルアセテート、及び酢酸（６； １；０．１）からなる）。得られた安定な化合物（表９）を次に第三ブチルアセ トアセテートのカリウム塩１当量と反応させる。添加化合物は反応の間に環化し 、第三ブチル３−［４−（２−ブロモエトキシ）−３−クロロフェニル］−５− メチルイソオキサゾール−４−カルボキシレートを得る。それはアセトン媒体中 でＮａＩとの反応によって対応するヨウ化された誘導体に変換させることができ る。 第三ブチル３−［Ｎ−（３−クロロプロピル）ベンズアミド−４−イル］−５− メチルイソオキサゾール−４−カルボキシレート、及び第三ブチル３−［Ｎ−（ ３−ヨードプロピル）ベンズアミド−４−イル］−５−メチルイソオキサゾール −４−カルボキシレート（前駆体３ａ及び３ｂ）の合成 第三ブチル３−（４−カルボキシフェニル）−５−メチルイソオキサゾール− ４−カルボキシレートをイミダゾールの存在下で第三ブチルジメチルシリルクロ ライドとの反応によってカルボキシル官能基上に第三ブチルジメチルシリル誘導 体を生成することによって保護する。保護された誘導体をジメチルホルムアミド （ＤＭＦ）及びジクロロメタンの混合物中でオキサリルクロライドの作用によっ て酸塩化物に変換する。次に酸塩化物は過剰のトリエチルアミンを添加した酸塩 化物を含む媒体中へ塩酸塩の形で導入されたクロロプロピルアミンと反応させる ことによってアミドによって生成される。かくして得られた塩素化された誘導体 はアセトン中のＮａＩと反応させることによって対応するヨウ素化された誘導体 へ変換することもできる。 第三ブチル３−（４−アミノフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カ ルボキシレート（前駆体４）の合成 ４−ニトロベンズアルデヒドをｐＨ５（ｐＨの維持はＫＯＨの添加によってな される）の水性−アルコール媒体中でヒドロキシルアミンと反応させることによ ってオキシムに変換する。次にクロロホルム中の気体状塩素の助けによって塩素 化によってクロロオキシムを生成させる。得られた誘導体と第三ブチルアセトア セテートのカリウム塩との反応は第三ブチル３−（４−ニトロフェニル）−５− メチルイソオキサゾール−４−カルボキシレートを与え、それは炭素上のパラジ ウムによって触媒作用を及ぼされる水素（２バール）の助けによって還元される 。アミン含有誘導体はエチルアセテート中に塩酸塩の形で単離される。 第三ブチルジメチルシリルエステルによって保護された第三ブチル３−［４−（ ２−カルボキシエトキシ）フェニル］−５−メチルイソオキサゾール−４−カル ボキシレート（前駆体５）の合成 パラヒドロキシベンズアルデヒドをジメチルホルムアミドとアセトニトリルと の混合物中でカリウム第三ブトキシドの存在下でプロピオラクトンと反応させる 。生成した誘導体を関連化合物について上述したようにオキシムに変換し、イミ ダゾールを添加されたテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で２時間１当量の第三ブ チルジメチルシリルクロライドと反応させることによって保護する。生成物に対 する塩素の作用はクロロオキシムを与え、それは既述の方法に従って第三ブチル アセトアセテートのカリウム塩によってイソオキサゾールに変換される。６−２． フェニルイソオキサゾールへの結合のためのステロイドの製造 ナンドロロン及びテストステロンが改変なしで又は５−アミノバレリアン鎖も しくは３−ヒドロキシプロピオン鎖の添加後に使用された。 ナンドロロンのアミノバレリアン酸誘導体（前駆体６）又はテストステロンのア ミノバレリアン酸誘導体（前駆体７） ５−アミノバレリアン酸をＮａＯＨの存在下で水−テトラヒドロフラン混合物 中でのジ−第三ブチルジカルボネートの反応によってＢｏｃ基で保護する。得ら れた誘導体をしかし、わずかに過剰のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ ）及びジメチルアミノピリジンの存在下で不足量のテストステロン又はナンドロ ロンと反応させる。反応は０℃の温度でジオキサンとテトラヒドロフランとの混 合物中で行われる。アミン基の保護はジクロロメタンとエチルアセテートの混合 物中での４当量のフェノール及び１当量のテトラメチルシリルの反応によって除 去される。生成した化合物をエーテルから単離する。 テストステロン及びナンドロロンのヘミスクシネート（前駆体８及び９） ステロイドをオートクレーブで１２０℃の温度に加熱されたピリジン溶液中の １当量の無水琥珀酸と反応させる。６．３． テストステロン、ナンドロロン、及びプロゲステトンへのプロピオン 鎖の添加（前駆体１０，１１及び１２） ステロイド（ナンドロロン、テストステロン、及び１１−α−ヒドロキシプロ ゲステロン）のカリウム塩をテトラヒドロフラン媒体中での１当量のカリウム第 三ブトキシドとの１当量のステロイドの反応によって生成させる。１５分後、媒 体を３容量のジメチルホルムアミドで希釈し、１当量のβ−プロピオラクトンを 加える。６．４． エストラジオールへのプロピオン鎖の添加（前駆体１３） エストラジオールを第三ブチルジメチルシリル基の添加によってフェノールの レベルで保護する；エストラジオール及びタリウムエトキシド（等量ずつ）を共 沸蒸留によって遊離するアルコールを連続的に除去しつつベンゼン中で加熱する 。反応完了後、１．１当量の第三ブチルジメチルシリルクロライドを添加し、フ ェノールの置換が完了するまで反応を続ける（前駆体１４）。保護されたステロ イドのカリウム塩を生成させ、それを前駆体１０−１２について上述したように プロピオン鎖で置換する。６．５． 前駆体１−５の前駆体６−１４との反応によるオキサシリン側鎖の形 成 前駆体１を５ｍｇ％のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及び１当量の前駆 体１４，ナンドロロン、テストステロン、又は１１−α−ヒドロキシプロゲステ ロン、及び０℃に冷却された溶液に徐々に添加されたわずかに過剰のジシクロヘ キシルカルボジイミドの存在下で、微小量のジメチルホルムアミドを加えたジク ロロメタンの溶液中で活性化する。ジシクロヘキシルウレアの除去後、生成物を 石油エーテルから単離する。４−イソオキサゾールカルボン酸の保護を４０分間 還流下で加熱されたニトロメタン溶液中のトリフルオロ酢酸の作用によって除去 する。生成物をトルエン、エチルアセテート、及び酢酸２；１；０．１の移動相 で溶離されたシリカカラムでのクロマトグラフィーによって精製する。鎖３，４ ，５，及び６がこの製造から生ずる。 前駆体１をわずかに過剰のトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で０℃の温度 で微小量のジメチルホルムアミドを含むジオキサン中でクロロギ酸イソブチル（ １．１当量）で活性化する。前駆体６又は７のうちの一つのジメチルホルムアミ ド溶液をこの溶液に加える。上述の脱保護(deprotection)後に鎖７及び８を得る ために反応は過剰のトリエチルアミンの存在下で行わせる。 前駆体１４、ナンドロロン、テストステロン、又は１１−α−ヒドロキシプロ ゲステロンのいずれか一つ、及びベンゼン中に等量で添加されたタリウムエポキ シドを加熱しつつ、ベンゼンの蒸留によって遊離するアルコールを連続的に除去 する。反応が完了したとき、反応性に依存して前駆体２ａ又は２ｂのどちらか一 方の一当量、又は反応性に依存して前駆体３ａ又は３ｂの１当量を加え、完全な 置換が得られるまで反応を続ける。鎖９−１６はこのルートによって、生成物の 親油性に適した組成を持つトルエンと白ペトロラタムの混合物を移動相として有 するシリカカラムでの精製後に得られ、脱保護が上述のとおり行われる。 前駆体８−１３のいずれか一つをテトラヒドロフランからなる媒体中でイミダ ゾールの存在下で１当量の第三ブチルジメチルシリルクロライドとの反応によっ て第三ブチルジメチルシリルエステルに変換する。このエステルをオキサリルク ロライド及び触媒量のジメチルホルムアミドの存在下でジクロロメタン中で反応 させ、等量で反応媒体へ導入される前駆体４へ結合される対応する酸塩化物を生 成させる。鎖１７−２２はこのようにして、上述の方法による脱保護の後、生成 される。前駆体５を触媒量のジメチルホルムアミドの存在下で１当量のオキサリ ルクロライドによってジクロロメタン媒体中で酸塩化物に変換し、前駆体６，７ ，又は１４のいずれか一つ、又は以下の化合物のいずれか一つと反応させる：反 応媒体中へ等量で導入されたナンドロロン、テストステロン、及び１１−α−ヒ ドロキシプロゲステロン。鎖２３−３８は既述の方法による脱保護後に得られる 。６．６． 鎖１−２６の６−ＡＰＡへの結合 鎖のイソオキサゾール環の４位のカルボキシルを−５０℃され、かつ１当量の ジイソブロピルエチルアミンを含むテトラヒドロフラン媒体中でメタンスルホニ ルクロライド（１当量）で活性化する。反応後、室温に戻した後、重炭酸塩の水 性溶液に２％で溶解されかつ等容量のアセトンで希釈された１当量の６−ミノペ ニシラン酸を媒体中へ導入する。溶媒の除去及びｐＨ２及びｐＨ８．５のエーテ ルで開始されるエーテルでの抽出による精製後、結合物１−２６を白ペトロラタ ムから単離する。しかし、生成物３，９，１３，２２，及び２８はテトラヒドロ フラン媒体でｐＨ５でのＨＦ／ＫＦ混合物を用いたフェノールの脱保護を経なけ ればならない。 これらの結合物（図１０−１３）の特性は表９に示されている。結果 １． 酵素活性の測定及びアッセイ 測定は様々なバクテリア株からのβ−ラクタマーゼを用いて行われた:Entero bacter cloacae Ｐ９９，Escherichia coli及びCitrobacter freundii（Ｐ９９ ，E．Coli,及びC．Freundiiと記号で表す）。 測定は四つの部分に分けられる。第一部分は様々な量のレポーター基質（ニト ロセフィン）及び酵素（阻害剤の不存在下で）の存在下での酵素活性の測定を含 む。第二部分は阻害剤の阻害活性の計算である（表９）。第三部分はアッセイで 用いられる抗体の量を測定するため酵素活性の測定と共に行われる。第四部分は ハプテンのアッセイを含む。２． 酵素活性の測定 測定はニトロセフィンの存在下で行われた。目的は酵素の触媒定数の計算であ り、それは測定時間と適合する酵素速度を得るために用いられる基質及び酵素の 量を測定するのに役立つ。図１４は酵素濃度（［Ｅ］）の関数としての、及びＰ ９９及びE．Coliからの酵素については６０μＭ，C．Freundiiからの酵素につい ては１５０μＭの濃度でのニトロセフィン（Ｓ）の存在下での、Ｐ９９，E．Col i，及びC．Freundiiからのβ−ラクタマーゼの最大速度（Ｖ₀）の変化を示す。 図１４はＰ９９及びC．Freundii酵素の酵素活性が類似していることを示す。グ ラフに基づいて計算されたこれら二つの酵素の触媒定数（ｋ_cat）は文献での値 に匹敵する。他方、E．Coliの酵素活性は子測値に関して相対的に低いようにみ える。３． ナンドロロンカーベニシリネート（Ｉ）の阻害活性の測定（表３） 実施例として、この化合物について行われた選択的研究の結果が与えられてい る。表９に示されている結果は同様の方法によって得られた値を与える。ニトロ セフィン及びナンドロロンカーベニシリネートの存在下で酵素について行われた 最大酵素速度（Ｖ₁）の測定は阻害剤の阻害定数（Ｋ_i）を測定するのに役立つ。 これらの測定はアッセイ中用いられる阻害剤の濃度（Ｉ）を決定する。表 ３ ４． 抗体の存存下でのナンドロロンカーベニシリネートの阻害活性の測定（表 ４） 実施例としてのこれらの測定の目的は正確な量の阻害剤の存在下での酵素活性 の有力部分の回復の評価である。表４はβ−ラクタマーゼ、ニトロセフィン、ナ ンドロロンカーベニシリネート、及び抗ナンドロロン抗体の存在下で記録された 酵素反応の速度（Ｖ_ab）を与える。又、表４は測定媒体中で用いられた抗体を含 む血清の希釈度（血清希釈度）を示す。表 ４ 表４は０．２−０．２４μＭの阻害剤濃度、６２５倍の抗体の血清希釈度がＶ₀ に近い速度を回復するために十分であるようにみえることを示す。又、表４は 阻害剤濃度の５倍の増大は同じ割合での血清濃度の増大を意味することを示す。５． ナンドロロンのアッセイ（表５） 結合物１を阻害剤として用いるナンドロロンのアッセイが以下のように行われ た：ナンドロロンのサンプルをナンドロロンカーベニシネートの溶液に加える。 かくして得られた混合物に希釈した抗体血清を加え、次に３０秒間ボルテックス する。次にそれにレポーター基質、緩衝液、及び酵素の溶液を加える。手早く攪 拌した後、４８２ｎｍでの媒体の吸光度を５分間連続的に読み取る。 ナンドロロンアッセイの例が図１５に与えられている。図１５は時間の関数と しての４８２ｎｍ（加水分解されたニトロセフィンについての特徴的な波長）で の吸光度の変化を示す。各々の直線の傾きは酵素反応の速度を与える。グラフの 直線は遊離の阻害剤の濃度に対する速度変化を示す。測定はＰ９９からのβ−ラ クタマーゼの存在下で行われた。 （表５に示されている）ナンドロロンアッセイの二つの実施例はそれぞれＰ９ ９及びE．coliからのβ−ラクタマーゼを用いて行われた。それらは同一の阻害 剤濃度を用いて行われたアッセイの正確さはＰ９９からのβ−ラクタマーゼを用 いたものの方が高いということを示す。Ｐ９９からのβ−ラクタマーゼを用いた とき、測定媒体中の検出可能なナンドロロンの最小濃度は０．０２μＭのオーダ ーであり、それは基質の１０ピコモル（測定容量＝５００μｌ）に相当する。E. coliからのβ−ラクタマーゼを用いた検出可能な最小濃度は測定が困難である。 これは０．０５μＭ（すなわち２５ピコモルの量）未満の濃度で行われる測定の 不正確さのためである。 表 ５ ナンドロロンの量の関数としての［（Ｖ₀／Ｖ₁）−１］の変化を記述する図１ ６は二つのパラメータ間の直線関係を示す。E．Coliからのβ−ラクタマーゼを 用いた、１μＭの阻害剤濃度及び適当な量の抗体を用いて行われるアッセイはこ の酵素を用いたアッセイの「範囲(range)」が増大され得ること、及び感度の減 少に伴われることを示す。従って最良の妥協を得るために阻害剤の量を最適化す ることは重要である。６． アッセイに必要な気質及び酵表の量の計算 アッセイの測定時間はわかっているので、ｋ_catからアッセイ中に用いられた 酵素及び基質の量を計算することができる。例えば、上に示されたアッセイにつ いては５分間の測定時間が設定された。この５分間（ｄｔ）で、４８２ｎｍでの 吸光度（加水分解されたニトロセフィンの最大吸光度）は酵素阻害剤の不在下、 １ユニット（ｄＡ＝１）理想的には増加するべきである。Ｐ９９からの酵素（ｋ_cat ＝７８0ｓ^-1）については、ｄＡ／ｄｔ＝１／３００（ｓ^-1）を観察すること が望ましく、その結果、加水分解されるニトロセフィンの吸光係数（ε＝１５０ ００Ｍ^-1ｃｍ^-1）を考慮に入れると、加水分解速度においては： Ｖ₀＝ｄＡ／ｄｔ＝１／（３００×１５０００）＝２．２×１０^-7Ｍｓ^-1と なる。 他方、β−ラクタマーゼについては： Ｖ₀＝ｋ_cat［Ｅ］ であると解され、これは以下のことを意味する： ｋ_cat［Ｅ］＝２．２×１０^-7Ｍｓ^-1 ［Ｅ］＝２．２×１０−７／７８０＝２．８×１０^-10Ｍ この濃度は実験的に測定された理想的な濃度（２．５×１０^-10Ｍ）に近い。 アッセイの必要性をカバーするための基質の最小濃度も計算可能である。アッ セイ時間（３００ｓ）中にＶ０ｄｔに対応する化合物濃度（すなわち３００×２ る。この値はアッセイ中に用いられる６０μＭの基質にほぼ相当する。わずかに 高い基質濃度が基質の飽和による最大速度を保証するために用いられるべきであ る。他方、１に近いＫ_m／（Ｋ_m＋［Ｓ］）比を維持するためにこの濃度を制限す ることは重要である。７． 用いられる阻害剤の量及びアッセイの感度の計算 用いられる阻害剤の量及びアッセイの感度に関するすべての理論的計算は以下 の方程式を用いて行うことができる： アッセイで用いられる阻害剤の量は阻害定数Ｋ_iに依存する。後者が小さけれ ば小さいほど、検出可能な酵素速度における変化を観察するのに必要な阻害剤の 量はますます低くなる。 酵素活性において５０％減少を導く阻害濃度はアッセイを行うのに好適な基礎 であるようにみえる。Ｐ９９からの酵素を用いたナンドロロンカーベニシリネー ト（Ｋ_i＝７０ｎＭ）の存在下で、上で計算された基質濃度（６５μＭ）を用い たアッセイの場合の計算は以下のとおりである： この値はＰ９９からのβ−ラクタマーゼを用いたナンドロロンのアッセイ中に 用いられる濃度に相当する。 酵素速度における１０％変化を容易に検出することができると仮定するならば 、以下のものに等しい阻害剤の量を検出することができる： 計算量の抗体の存在下である量の阻害剤を用いたナンドロロンのアッセイの場 合、その免疫学的複合体から阻害剤を置換するため及び２４ｎＭの遊離阻害剤濃 度を得るために必要なナンドロロンの濃度を計算することが可能である。ナンド ロロンが阻害剤として同様の大きさのオーダーの抗体に対する親和性を持つ場合 、スキャッチャード理論(Scatchard theory)は２４ｎＭのナンドロロン濃度が実 質的に等量の遊離阻害剤濃度が得られるまで阻害剤を置換することを示す。５０ ０μｌの容量についての検出限界は結果として ２０×１０^-9×５００×１０^-6＝１０×１０-¹²モル である。 この値はナンドロロン量の関数として（Ｖ₀／Ｖ_i）−１を表すナンドロロンア ッセイのグラフによって実験的に確認される。 行われたアッセイはインキュベーションを行わずにハプテンをアッセイするこ とができることを示す。測定の総継続時間は７−８分を越えない。Ｐ９９からの β−ラクタマーゼ／ナンドロロンカーベニシリネート／ニトロセフィン／抗体系 のナンドロロンの検出限界は１０ピコモルである。 感度はナンドロロンオキサシリネートの使用によって大いに改良される。何故 ならオキサシリン（０．５ｎＭ）のＫ_i値はカーベニシリン（１０ｎＭ）のそれ よりもずっと有利であるかである。 同様のオーダーの結果がテオフィリンカーベニシリネートで得られた。これら の速度特性(kinetic characteristics)（Ｋ_i）はアッセイで商業的に利用される のには十分である。８． 保護剤の例 表６は基質の加水分解の速度が血清の存在によって影響されるということを示 す。酵素の不在下では測定媒体中に存在する血清の割合と共に変化する基質（ニ トロセフィン）の加水分解の速度が観察される。表６はアジ化ナトリウム（Ｎａ Ｎ₃）又はフェニルブタゾン０．０７ｍｇ／ｍｌの添加はこの速度を大いに減少 させることを示す。更に、フェニルブタゾン０．０７ｍｇ／ｍｌの添加は基質の 効力を増加させることによってアッセイの質を改良する。これらの二つの保護剤 の存在下でのナンドロロンのアッセイの例はこの表に与えられている。表６ 解説 Ｖｏｌ．Ｍｅｓ． ：酵素速度が監視される最終容量Ｖ ： 基質（ニトロセフィン）の分解速度Ｑｅｎｚ ： 最終容量中のＰ９９ β−ラクタマーゼの濃度Ｑｓｕｂ ： 最終容量中のニトロセフィンの濃度Ｑｉｎｈ ： 最終容量中の阻害剤の濃度Ｑａｎａｌ ： 最終容量中の分析対象物(analyte)の濃度ＤＳＡ ： 抗ナンドロロン抗体を含む血清の稀釈度％ｓｅｒｕｍ ： 最終容量中の血清の割合Ｔｐ ： 試験された保護剤（ＰＢＳ＝0.1Ｍリン酸緩衝液＋0.15Ｍ ＮａＣｌ）Ｂｕｆｆｅｒ ： 測定中に用いられた緩衝液(hepes/phos＝ＰＢＳ緩衝液及び ヘペス緩衝液(Hepes buffer)2.5ｍＭの９／１混合物）ｐＨ ： 測定中に用いられた緩衝液のｐＨ ヨウ化カドミウムによって安定化されたデンプンペースト溶液中のヨウ素の生 成に基づく上述のヨウ素−デンプンアッセイ方法は他の抗生物質のアッセイにお いて適用を見出す。９． セファレキシンのアッセイ（表７） ０．００３Ｎヨウ化カドミウム及び０．００２７５Ｎヨウ化カリウムの混合溶 液１００ｍｌをそれぞれ５４．９２ｍｇのヨウ化カドミウム及び９．７７ｍｇの ヨウ化カリウムを１％スターチペーストを含むヘペス緩衝液溶液ｐＨ８．２（１ ０ｍＭ）に溶解させることによって調製する。ヘペス緩衝液中の０．２Ｍ ＤＴ ＰＡ溶液１００ｍｌも調製する。最後にセファレキシンの１ｍＭストック溶液を 上述のへぺス緩衝液１００ｍｌに３４ｍｇのセファレキシンを溶解させることに よって調製する。測定尺度の調製 − セファレキシンのストック溶液を加水分解し、１ｍｌを取って希釈し、それ を０．００１Ｍの水酸化ナトリウム４ｍｌで１５分間処理し、次にヘペス緩衝液 を用いて１００ｍｌに調節する； − デンプンヨウ素溶液を２０ｍｌの混合溶液、２５ｍｌのＤＴＰＡ、及び３ｍ ｌの氷酢酸を混合することによって調製し、次に容量をヘペス緩衝液を用いて調 節する（デンプンヨウ素溶液）； − １−６μＭまでの濃度の加水分解されたセファレキシンを１００〜６００： １の容量を取ることによって調製し、そこに１００μｌのデンプンヨウ素溶液を 加える。容量をヘペス緩衝液を用いて１ｍｌに調節する； − 溶液の最終吸光度を５分後に６２０ｎｍで測定する。表 ７ ０．９９６１の相関係数及び直線方程式 Ｙ＝−０．１３４５Ｘ＋０．９６ が得られる。アッセイ − セファレキシンを希釈して０．５−２ｍＭの濃度を得； − 前記溶液を測定尺度の調製に用いた手法に従って加水分解し、希釈し； − セファレキシンの加水分解溶液２５０μｌを集め、１００μｌのデンプンヨ ウ素溶液を加え、容量をヘペス緩衝液を用いて１ｍｌに調節し； −５分後、吸光度を６２０ｎｍで読み取り、濃度を既に確立された測定尺度に関 して計算する。１０． Ｐ９９からのβ−ラクタマーゼを用いてレポーター基質としてナンドロ ロンカーベニシレート（結合物１）及びセファレキシン−ヨウ素−デンプン混合 物を用いたナンドロロンのアッセイ（表８） 表 ８ 色の変化は６２０ｎｍで観察され、それは測定過程で分解されたセファレキシ ンのヨウ素消費量に相当する。ヨウ素は以下のようにして生成された：デンプン ヨウ化カドミウム及びヨウ化カリウム（０．００２Ｎ ＣｄＩ²−０．００２ ４Ｎ ＫＩＯ₃−１．５％デンプン）の混合溶液１００μｌを取る。ＤＴＰＡの ナトリウム塩の０．１Ｎ溶液１００μｌをこの溶液に添加し、ｐＨを１Ｍ ＨＣ ｌの添加によって２にする。反応後、媒体を十分な量の０．０２Ｍヘペス緩衝液 の添加によってｐＨ７にし、次に均質なイムノアッセイ試薬の導入後に９００μ ｌの最終容量にする。表９の解説 カラム２ カラム８ ＊：ＦＡＢ Ｘ：Ｐ９９を用いて計算 ＋：Ｍ＋Ｈ −：Ｍ−Ｈ表 ９: カーベニシリン及びオキサシリン結合物の特性 １１． 阻害剤としてナンドロロン及びプロゲステロンのオキサシリネート（結 合物４及び６）を用いたナンドロロン及びプロゲステロンのアッセイ このアッセイは例５で述べたように行われ、表１０及び図１７に表されている 。表 10

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＥＥ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 サルレ，ギー ベルギー，ベ―4100 セラン，リュ デュ フォル 69 (72)発明者 ルジュヌ，ロベール ベルギー，ベ―4802 ウズィ，アヴニュ ジャン タステ 129

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 均質相中のハプテンの検出及び／又は定量のための方法であって以下の操 作を含む方法： − 既知量の阻害剤−ハプテン複合体を検出されるべき及び／又は定量されるべ きハプテンを含む溶液に加え； − 阻害剤−ハプテン複合体の量に相当する量の抗体を溶液に加え； − 一つの活性化部位で競合に入る二つの基質のための一つの活性化部位を持つ タイプＣのβ−ラクタマーゼを溶液に加え（第一の基質は好ましくは可視紫外線 測定によって検出可能及び／又は定量可能な化合物に変換され得るレポーター基 質であり、第二の基質はレポーター基質の加水分解の速度に作用する阻害剤−ハ プテン複合体である）； − レポーター基質の変換で生ずる化合物の濃度を検出及び／又は定量する（レ ポーター基質のＫ_m定数は阻害剤−ハプテン複合体のＫ_m定数より少なくとも１０ ０倍高く、レポーター基質のｋ_cat定数は阻害剤−ハプテン複合体のｋ_cat定数よ り少なくとも１０倍高い）。 2. 前記の操作に先立って、あり得る妨害を除去するために、アッセイされる べきハプテンを含む溶液にβ−ラクタマーゼを保護する薬剤、レポーター基質を 保護する薬剤、ハプテン−阻害剤複合体を保護する薬剤、又は汚染除去剤の如き 物質を加える請求の範囲１記載の方法。 3. レポーター基質のｋ_cat定数が０．１ｓ^-1，好ましくは１０ｓ^-1より大き いことを特徴とする請求の範囲１又は２記載の方法。 4. 阻害剤−ハプテン複合体のＫ_i及びk_catがそれぞれ５０００μＭ未満（好 ましくは１００μＭ未満）及び０．１ｓ^-1未満であることを特徴とする請求の範 囲１−３のいずれか記載の方法。 5. β−ラクタマーゼがEnterobacter cloacae Ｑ９０８ＲおよびＰ９９，Cit robacter freundii，及びEscherichia coliから得られるβ−ラクタマーゼから なる群から選択されることを特徴とする請求の範囲１−４のいずれか記載の方法 。 6. 阻害剤及びレポーター基質がペニシリン、セファロスポリン、及びβ−ラ クタム系抗生物質からなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲１−５ のいずれか記載の方法。 7. レポーター基質がセファロリジン、ニトロセフィン、セファロチン、セフ ァレキシン、セファロスポリンＣ、セファセトリル、及びセファゾリンからなる 群から選択されることを特徴とする請求の範囲６記載の方法。 8. レポーター基質の変換がデンプン−ヨウ素表色系によって検出されること を特徴とする請求の範囲１−７のいずれか記載の方法。 9. 阻害剤がカーベニシリン、オキサシリン、セフロキシン、セフォタキシム 、及びメチシリンからなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲６記載 の方法。 10. ハプテンが医薬活性成分、ホルモン、アナボリックステロイド、及び／又 は薬物からなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲１−９のいずれか 記載の方法。 11. ハプテンがテストステロン、エストラジオール、プロゲステロン、アルド ステロン、コルチゾール、メチルアンフェタミン、メタドン、テトラヒドロカン ナビノール、Δ⁴−アンドロステンジオン、モルフィン、ＤＨＥＡスルフェート 、ナンドロロン、テオフィリン、コカイン、及び／又はそれらの加水分解誘導体 からなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲１０記載の方法。 12. 均質相中のハプテンを検出及び／又は定量する手段において、手段が一つ の活性化部位で競合に入る二つの基質のための一つの活性化部位を持つタイプＣ のβ−ラクタマーゼ、二つの基質（第一の基質は好ましくは可視紫外線測定によ って検出可能及び／又は定量可能な化合物に変換され得るレポーター基質であり 、第二の基質は阻害剤−ハプテン複合体の加水分解の速度を調節する阻害剤−ハ プテン複合体である）、及び前記阻害剤−ハプテン複合体を結合できる抗体を含 むこと、レポータ基質のＫ_m定数が阻害剤−ハプテン複合体のＫ_m定数より少なく とも１００倍高いこと、及びレポーター基質のｋ_cat定数が阻害剤−ハプテン複 合体のｋ_cat定数より少なくとも１０倍高いことを特徴とする手段。 13. レポーター基質のｋ_cat定数が０．１ｓ^-1、好ましくは１０ｓ^-1より大きい ことを特徴とする請求の範囲１２記載の手段。 14. 阻害剤−ハプテン複合体のＫ_i及びｋ_cat定数がそれぞれ５０００μＭ未満 （好ましくは１００μＭ未満）、及び０．１ｓ^-1未満であることを特徴とする請 求の範囲１２又は１３記載の手段。 15. β−ラクタマーゼがEnterobacter cloacae Ｑ９０８ＲおよびＰ９９，Citr obacter freundii，及びEscherichia coliから得られるβ−ラクタマーゼからな る群から選択されることを特徴とする請求の範囲１２−１４のいずれか記載の手 段。 16. 阻害剤及びレポーター基質がペニシリン、セファロスポリン、及びβ−ラク タム系抗生物質からなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲１２−１ ５のいずれか記載の手段。 17. レポーター基質がセファロリジン、ニトロセフィン、セファロチン、セフ ァレキシン、セファロスポリンＣ、セファセトリル、及びセファゾリンからなる 群から選択されることを特徴とする請求の範囲１６記載の手段。 18. レポーター基質の変換がデンプン−ヨウ素表色系によって検出されること を特徴とする請求の範囲１２−１７のいずれか記載の手段。 19. 阻害剤がカーベニシリン、オキサシリン、セフロキシン、セフォタキシム 、及びメチシリンからなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲１６− １８のいずれか記載の手段。 20. ハプテンが医薬活性成分、ホルモン、アナボリックステロイド、及び／又 は薬物からなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲１２−１９のいず れか記載の手段。 21. ハプテンがテストステロン、エストラジオール、プロゲステロン、アルド ステロン、コルチゾール、メチルアンフェタミン、メタドン、テトラヒドロカン ナビノール、Δ⁴−アンドロステンジオン、モルフィン、ＤＨＥＡスルフェート 、ナンドロロン、テオフィリン、コカイン、及び／又はそれらの加水分解誘導体 からなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲２０記載の手段。 22. 表示のためのデンプン−ヨウ素表色系において、ヨウ素がヨウ化カドミウ ムの添加によって安定化されたデンプンペースト溶液中で生成されることを特徴 とするデンプン−ヨウ素表色系。 23. ヨウ素が適切なｐＨの媒体中で錯生成剤及び酸化剤の存在下でヨウ化カド ミウムから生成され、次に表示試薬が作用ｐＨにされることを特徴とする請求の 範囲２２記載の表色系。 24. 用いられる錯生成剤がＤＴＰＡであることを特徴とする請求の範囲２２又 は２３記載の表色系。 25. 酸化剤がヨウ素酸塩又は過ヨウ素酸塩であることを特徴とする請求の範囲 ２２−２４のいずれか記載の表色系。