JP2000509976A - パルボウイルス感染のための核酸予防接種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の一般的な技術分野は、パルボウイルス感染から動物を保護するための動物の核酸予防接種の方法である。本発明は、特に、パルボウイルスDNAの調製及び使用、及び毒性パルボウイルスにより発病する疾病から動物を保護する免疫反応を誘導するためのイヌ、ネコ及びミンクへのパルボウイルスDNAの投与に関する。核酸免疫原は、細菌プラズミドに含有されたパルボウイルスゲノムの抗原性部分を含有するようにデザインされている。これらのプラズミドは、トランスフェクションにより宿主細胞に導入された時に、所望のパルボウイルス遺伝子生成物を生成する。パルボウイルス免疫原発現プラズミドを導入した宿主細胞は、宿主免疫系に保護的免疫反応を有する抗原性タンパク質の流れを生成する。

Description

【発明の詳細な説明】 パルボウイルス感染のための核酸予防接種 本発明の一般的な技術分野は、パルボウイルス感染から動物を保護するための動 物への核酸予防接種の方法である。本発明は、特に、パルボウイルスDNAの調製 及び使用並びに毒性パルボウイルスにより発病する疾病から動物を保護する免疫 反応を誘導するためのイヌ、ネコ及びミンクへのパルボウイルスDNAの投与に関 する。核酸免疫原は、細菌プラズミドに含有されたパルボウイルスゲノムの抗原 性部分を含有するようにデザインされている。これらのプラズミドは、トランス フェクションにより宿主細胞に導入された時に、所望のパルボウイルス遺伝子生 成物を生成する。パルボウイルス免疫原発現プラズミドを導入した宿主細胞は、 宿主の免疫系が保護的免疫反応を生じる抗原性タンパク質の流れを生成する。パ ルボウイルスは、単鎖DNAを含有するタンパク質キャプシドからなる小さいDNAウ イルスに非常に類似した一族である。パルボウイルスは様々な哺乳類種に多様な 疾病を引き起こす。ネコ科パンルコペニア ウイルス(feline panleukopenia vi rus)、ミンク エンターリチス ウイルス(mink enteritis virus)及びイヌ科パ ルボウイルスは、ネコ科パルボウイルス サブグループの宿主に関する変異体で あり、98％以上のDNA類似性を有している(マルティン（Martyn）ら、J.Gen.Viro l.71(1990)2747-2753)。イヌ科パルボウイルスは、全てのイヌ科動物において比 較的新しい病原体であり、高致死率胃腸炎の世界的な流行の原因となる作因とし て始めて1970年代後半に発見された。このウイルスは、ネコ科パルボウイルスの 宿主に関する変種であると推測された。ネコ科及びイヌ科のパルボウイルスの核 酸配列を比較すると、31塩基の変化が確認され、たった９つのアミノ酸が変化し ただけであると分かった(マルティンら、1990)。これらのアミノ酸の６つの変化 は、主要キャプシド遺伝子であるVP1及びVP2にあった。イヌ科特異的抗原性エピ トープは、ネコ科パンルコペニア ウイルスと１つ異なると決定された。さらに 遺伝子マッピングにより、近年イヌ科パルボウイルスの発生時 が確認され、ネコ科パルボウイルスから発生したという推測を確かなものとし、 現在単離されている系におけるウイルスの継続的な進化を示している(トルイェ ン(Truyen)ら、J．of Virology 69(8)(1995)、4702-4710)。 ２つの核酸キャプシドタンパク質、VP1及びVP2は同じRNAから発現し、VP2はVP1 のオープンリーディングフレームのイン-フレームATGコドンから得られる。VP2 はVP1より約10倍高いレベルで発現されており、内部の出発コドンはより効率的 に翻訳装置により認識されることを示している(トゥリソら、J．of Gen．Virol ．72(1991)、2445-2456)。エピトープマッピング実験は、全ての抗原性エピトー プは、VP2内で中和抗体を生成していることを立証した(トゥリソら、1991、前記 参照.)。これらはVP2の最初の16のアミノ酸を含んでいる(ランゲヴェルドら、J ．of Virology 68(7)(1994)4506-4513;カサル(Casal)ら、J．of Virology 69(11 )(1995)、7274-7277)。 免疫化は、ヒト及び動物を感染性疾病の発生源から保護する一次的機構を与える 。安全性を考慮して、生きた、弱毒化した試薬から離れた最近のワクチンのデザ インの流行、「ワクチン破壊」による不完全に弱毒化したもの、復帰したもの、ま たは免疫抑制患者において増幅するものは、ワクチンの持続及び効力における減 少を伴っているようにも見える。溶解試薬、クローンされたタンパク質またはペ プチドの組み換え体の使用は、多量の投与量及びアジュバントの存在を必要とす る。しかし、そのようなアジュバントの長期に渡る影響は広く調査されておらず 、最近になって、それらはネコの肉腫を誘導するワクチン中の原因となる作因と して包含されるようになった(ヘンドリック(hendrick)ら、J．Am．Vet．Med.Ass oc．205(1994)、1425-1429)。更に、投与された抗原の細胞外での位置は、免疫 系にこれらの抗原をいれる方法及びそれらの自然発生する感染に対する保護を発 生させるための適性についての疑問を投げかける。 最近のイヌ科パルボウイルスのための免疫試験は限界にきている(シャルツ（Sch ultz）、R.D.(1994)、新規発見疾病の制御への挑戦：イヌ科パルボウイルス ワクチン、IBC国際シンポジュウム、10月27-28、108)。弱ったまたは殺された生 物によるワクチンは、免疫を発生させるために繰り返し与える必要があり、循環 している母親から受けた抗体力価に対抗できる免疫化は通常起こらない。この問 題は、保護不可能なレベルまで減少させて、「無防備な窓(window of vulnerabi lity)」にまで導びく間に、ワクチンを不活性化する母親から受けた抗体によっ て倍加される(ポロック(Pollock)及びカルミカエル(Carmichael)、J．Am．Vet． Med．Assoc．130(1982)、37-42)。イヌ科パルボウイルスのクローニングは、２ つの明確なワクチン法の開発に導いた。１つ目は、哺乳類のウイルス(baculovir us)の発現系に完全なVP2配列を導入することである。生成されたタンパク質は収 集され、有効にイヌを免疫化するのに用いられる(トゥリソ(Turiso)ら、J．of V irology 66(5)(1992)、2748-2753)。第二の方法は、イヌを免疫化するのに用い られるペプチドエピトープのサブクローニングまたは合成を含んでいる。これら のペプチドは、VP2のアミノ末端配列を使用し(カサル(Casal)ら、1995、前記参 照.)、有効なイヌの免疫化を行っている。これらの方法を用いて開発されたワク チンはミンク エンテリティス ウイルスや他の非常に類似したパルボウイルス の宿主に関する変異体でも試された。組み換えタンパク質またはペプチドの投与 により、商業的に問題であるミンクの疾病に対する保護免疫が得られた(ランゲ ヴェル(Langeveld)ら、Vaccine 31(11)(1995)、1033-1037)。 ネコ科パンレウコペニアのための修飾された生きたウイルスのワクチンは、成ネ コを保護するには効果的であるが、子宮内の子ネコの胎児に生まれつきの障害を 与えてしまうため、妊娠可能な成体のメスネコの予防接種には適当ではない。修 飾された生きたウイルスのワクチンでは大きな制限があるため、研究者らは、感 染生物からの遺伝子発現抗原をin vivoで細胞に導入する可能性を広げることを 試みた(ドネリー(Donnelly)ら、J．Imm．Meth．176(1994)、145-152;ファイナン (Fynan)ら、Int．J．Immunopharmac．17(2)(1995)、79-83;ウェレン(Whalen)ら( 1995)、ヘパチチスＢ表面抗原のDNAを介した免疫化;DNAワクチンにおける免疫反 応の活性化及び同調化、ニューヨーク:ニューヨーク科学アカデミーを参照)。上 記の免疫化の機構は、典型的なアジュバントの必要性を迂回しつつ、弱った生 物から与えられる付随の危険性なしにウイルス性遺伝子発現の経路を模倣する。 哺乳類プロモーターを持つ「裸の」プラズミドDNAの筋内投与が、筋肉細胞に吸収 され発現されるDNAを発生させる(ウォルフ(Wolff)ら、Science 247(1990)1465-1 468)という思いがけない発見は、核酸予防接種の新規分野の画期的な発展に導い た。最初の研究に続いて、プラズミドDNAの筋内投与に影響を与える条件が更に 特定され広げられた(ウォルフ(Wolff)ら、Biotechniques 11(1991)、474-485)。 転移の効率は比較的低く、1-5％の範囲内にあり、その効率は、プラズミドDNAの 投与後に筋肉変性を誘導することによって40倍にまで増加させることができる( ヴィタデロ(Vitadello)ら、Hum.Gene.Ther.5(1994)、11-18;ダンコ(Danko)及び ウォルフ、Vaccine 12(16)(1994)、1499-1502)；ディビス(Davis)ら、Hum.Gene. Ther.4(1993)、733-740)。最も一般的に使用されている２つの筋肉性(myonecrot ic)作因は、局所的な麻酔性ブピビカイン(bupivicaine)、及びカルティオ毒(car diotoxin)(ダンコ(Danko)及びウォルフ、1994、前記参照.;デイヴィス(Davis)ら 、1993、前記参照)である。例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベ クター及びリボゾームを含む多くの他の技術は、遺伝子を筋肉に転移するために 使用されている。しかし、外来DNAの転移及び発現における輸送機構において、 裸のDNAの直接投与が一番効率的であるようである(ディビス(Davis)ら、1993、 前記参照)。 筋内注射に加えて、幾つかの投与経路が探求されている。これらの経路の共通点 は、標的細胞に核酸を挿入するために作因またはベクターを必要としない点であ る。静脈内、腹腔内、皮内、鼻腔内及び半継続的なDNAプラズミドの注射の全て が、インフルエンザ ウイルス ヘマグルチニン(HA)に対してニワトリを免疫化 した(パルドール(Pardoll)及びベッカークレッグ(Beckerkleg)、Immunity 3(199 5)、165-169参照)。興味深いことに、これらの研究は、DNAによる粘膜（鼻腔内 ）免疫は、IgA反応を起こさず、むしろ筋内注射に見られるように、IgG反応を起 こすことを示している。更に、金の微粒子に覆われたDNAの打ち込みによる皮内 免疫は、他の方法よりも100から1000倍低いDNA濃度でも、他の遺伝子転移方法と 同様の効果があることが示された。同じような実験が、皮内及び静脈 内経路によりネズミ及びウサギを免疫化することを示した(ラズ(Raz)ら、Proc． Natl．Acad．Sci．USA 91(1994)、9519-9523)。方法の単純さを強調することで 、ラズ及びその同僚は、プラスチックのツベルクリンPPDトィンのDNA被覆及び皮 膚の乱切によりバイオリスチックな打ち込み(biolistic bombardment)と同様な 結果が得られる、組織打ち込み及び皮内免疫のために必要な、高価で場合によっ ては扱いにくい器具の使用を迂回できる可能性があることを示唆している。DNA 免疫は、ウシ、ブタ、及びヒト以外の霊長類を含む数種の哺乳類において、主に 筋内経路を介して試みられ、多くの成功を収めている。 DNA発現構築物の筋内注射の後に起こる免疫反応の性質は、免疫系の体液性及び 細胞性の防護の両方に関連していると報告されている。レポーターDNA構築物が 注射されると、それらは成熟した筋原繊維内に含有されると思われる。これは、 筋肉再生成がプラズミド発現の効果を増加するように思われる証拠により支持さ れている。抗原の導入は、筋細胞によるMHCクラスＩの発生、骨髄由来抗原提供 細胞(APCs)による筋細胞からの抗原吸収、または筋肉を介して移動するAPCsの直 接DNAトランスフェクションにより起こるのであろうと考えられている(パルドー ル(Pardol)及びベッカーレッグ(Beckerleg)、1995、前記参照;ウァレン(Whalen) ら、1995、前記参照.参照)。２つの理由から、筋細胞の単純な抗原提供は、これ らの現象の全てを担っているとは思われない。一つ目は、副-増幅(co-stimulato ry)信号B7及びB7-2が欠けたときの抗原提供は抗原に対する耐性を起こすという 成長体の証拠である(チェン(chen)及びナバビ(Nabavi)、Immunity1(1994)、147- 154)。二つ目は、筋肉ではMHCクラスＩ発現が非常に低いレベルにあると報告さ れていることである(カルパチ(Karpati)ら、Ann.Neurol.23(1988)、64-72)。従 って、抗原提供は、抗原を取り除くかまたは転移された遺伝子の直接的な取得及 び発現を介して抗原を得るプロフェッショナルAPCsにより行われる可能性が高い と考えられる(パラドール及びベッカーレッグ、1995、前記参照.;ウァレンら、1 995、前記参照.)。ネズミにおけるバイオリスチックな(biolistic)粒子打ち込み による実験は、後者のアプローチを好ましいものとすると考えられる。ネズミは 耳介に打ち込みを受け、打ち込みを受けた５分後にその耳が手術的 に摘出された。これらのネズミは、免疫反応を形成する能力を保持しており、そ の反応は、打ち込みのみによって誘導されたものと定量的に相違しなかった。明 らかに、高率で動き回る細胞集団がこれらのネズミの免疫反応の出発及び移動に 関与しているようである。この細胞として、樹状突起細胞が挙げられた(フィナ ンら、1995、前記参照.)。明らかに、粒子打ち込みにより誘導された免疫反応の 特徴は、筋内注射により得られる反応からは微妙に異なっており、筋内注射では IgG1が大部分であるが、皮内注射においてはIgG2が主成分であった。この違いの 第一の理由は、１ヶ月を超える期間抗原を発現し続ける筋内免疫の筋細胞(パラ ドール及びベッカーレッグ、1995、前記参照.)にあると思われる。この継続的な 発現は、免疫昏睡と呼ばれるものを引き起こす(ウェイレンら、1995、前記参照. )。この症状に見られる実験的な現象は、筋肉発現の継続的な上昇(boost)である 。しばしば、単一の注射により得られる力価は４から８週間、またはそれ以上の 週を超える期間上昇することがある。古典的な上昇反応は、第一回目の注射の後 に、６ヶ月以上DNA注射が続けられた時にも観察された。奇妙なことに、上昇抗 体力価の期間中に起こるDNA上昇注射は、何の影響も及ぼさないか、または抗原 に対する反応を減少させる(デイヴィスら、「プラズミドDNAを有するHBVに対する 組織的及び粘膜の免疫の導入」、核酸ワクチン国際会議、２月5-7、1996、ベセス ダ、メリーランド、アメリカ)。 測定可能な免疫反応を生成する能力は、予防接種のために優先される(priori)能 力ではない。むしろ免疫反応は、感染、進入，及び疾病から宿主を保護する適当 な成分を含有していなければならない。従って、攻撃の研究での感染に対する保 護が、唯一の最もの確信の持てるワクチン効率の証拠であることは事実である。 DNAを基にしたワクチンは、致死的なインフルエンザウイルスの攻撃からニワト リを（ロビンソン(Robinson)ら、Vaccine 9(1993)、957-960）かつミクロプラズ マ(Mycoplasma pulmonis)感染からネズミを(ライ(Lai)ら、DNA and Cell Biolog y 14(7)(1995)、643-651)保護することができる。更に、DNA免疫により、リンパ 性脈絡髄膜炎ウイルスの継続的な感染の構築に対してネズミを保護することがで きる(マーティン(Martins)ら、J．of Virology 69(4)(1995)、2574-2582)。 核酸予防接種に関して、本発明に関連する従来技術は、以下の記事にまとめられ ている。核酸予防接種に関して、ドンネリーら、1994、前記参照.、フィナンら 、1995、前記参照.、ウァレンら、1995、前記参照.、及びパルボウイルス予防接 種に関して、トゥリソら、前記参照,及びカサルら、1995、前記参照.。 例示された上記従来技術は、核酸予防接種に対するネズミの免疫反応のみを試験 している。従来技術で知られているように、ネコ、イヌ及びミンク等の動物間の (taxonomic)相違により、ネズミから得られた実験結果をこれらの動物に適用す ることはできない。一方、イヌ科、ネコ科及びイタチ科の動物のパルボウイルス 感染に対する適当なワクチンが従来技術に無いため、本発明の根底にある技術的 な課題はそれらのワクチンを提供することにある。前記ワクチンは、パルボウイ ルス感染の潜在的な命を脅かす効果から、特に、イヌ、ネコ及びミンクを効果的 に保護しなければならない。上記の技術的問題は、請求項で特徴付けられる態様 の提供により解決することができる。 従って、本発明は、少なくとも１つのパルボウイルス特異的エピトープをコード する核酸分子及び製薬学的に適した担体を含む抗パルボウイルスワクチンに関す る。 驚くべきことに、本発明により、少なくとも１つのパルボウイルス特異的エピト ープをコードする「裸」のDNAを用いた免疫化は、続くパルボウイルス感染におい てパルボウイルスにより誘導される疾病から予防接種された動物を保護する免疫 反応を生じることが分かった。 本発明の抗パルボウイルスワクチンの好ましい態様においては、少なくとも１つ の前記パルボウイルス特異的エピトープが、Ｔ細胞エピトープである。 当業者は、本発明の技術知識を用いて保護的ワクチンをデザインする場合、本発 明のワクチンに使用されるＴ細胞エピトープのみをコードする核酸配列を含むワ クチンを考案することが可能である。 同様に、当業者は、本発明による核酸ワクチンのために使用するＢ細胞エピトー プのみをコードするDNAを含むワクチンを考案することが可能である。従って、 更なる好ましい態様においては、抗パルボウイルスワクチンは少なくとも１つの Ｂ細胞エピトープを含有する。代わりに、少なくとも１つの前記Ｂ細胞エピトー プをコードする核酸は、少なくとも１つのＴ細胞をコードする核酸と共に前記ワ クチンに含有されることが可能である。Ｔ細胞及びＢ細胞エピトープは、同じま たは異なるDNA分子にコードされることができる。 本発明による抗パルボウイルスワクチンの更に好ましい態様においては、前記核 酸分子がDNA分子またはRNA分子である。「DNA分子」という用語はここでは最も 広い意味で用いられ、例えばcDNA分子、遺伝子DNA、合成及び半合成DNA分子を含 む。同様に、「RNA分子」という用語は、ここでは最も広い範囲の意味で使用され る。 本発明の抗パルボウイルスワクチンの更に好ましい態様においては、前記核酸分 子はパルボウイルスVP1及び／またはVP2核酸キャプシドタンパク質をコードする 。 パルボウイルス遺伝子は、長さ約5000塩基対であり、約４つのオープンリーディ ングフレームを含有する。これらのオープンリーディングフレームの２つは、パ ルボウイルスの主要キャプシドタンパク質VP1及びVP2をコードする。VP2は、VP1 内に含有され、全てのしかし小さいVP1遺伝子の5'末端またはVP1タンパク質のア ミノ末端を含有している。VP1のみが有する配列は、Ｔ細胞反応の増幅に関与し ているエピトープをコードしていることが知られている。VP1及びVP2で共通する 配列は、抗体反応を増幅する少なくとも１つのエピトープをコードする。パルボ ウイルスの自然感染は、感染から１週間以内に顕著な保護反応を生じる。全VP1 遺伝子またはVP1（及びVP2）内のエピトープの発現は、細胞性及び体液性防護の 両方または免疫系を介する保護免疫を生じる。 従って、当業者は、パルボウイルスＴ細胞エピトープの代表としてVP1エピトー プをコードする配列、またはパルボウイルスＢ細胞エピトープの代表としてVP2 エピトープをコードする核酸配列またはその両方の組み合わせを含む、ネコ科、 イヌ科及びイタチ科の動物を免疫化するためのワクチン調製のために含有する核 酸配列を使用することができる。 本発明のワクチンの特に好ましい態様としては、前記核酸分子が完全なVP1オー プンリーディングフレーム、例えば、VP1核酸キャプシドタンパク質をコードす るリーディングフレームを含有する。ネコ科パルボウイルスの場合、オープンリ ーディングフレームの完全な長さは2169塩基対である。好ましくは、前記orfは 適切な外来プロモーターの制御下で発現される。 本発明のワクチンの更に好ましい態様は、前記エピトープがパルボウイルス遺伝 子から誘導されたものであり、前記パルボウイルスはイヌ科、ネコ科またはイタ チ科の動物、及び、好ましくは、イヌ、ネコまたはミンクに感染できる。イヌ科 、ネコ科またはイタチ科の動物に感染するパルボウイルス遺伝子が全体的に非常 に類似していることから、イヌ科、ネコ科またはイタチ科の動物から誘導された 核酸により誘導されるワクチンは、前記以外の動物群の免疫化を行うのに使用す ることができる。 本発明のワクチンの更に好ましい態様においては、少なくとも１つのパルボウイ ルス特異的エピトープをコードする前記核酸分子は、発現ベクターに含有されて おり、前記発現ベクターが哺乳類細胞で機能する。 当業者にとっては、本発明を行うために適当な様々な発現ベクターを得ることが 可能である。従って、本発明のワクチンの開発を始める基盤となる下記の実施例 において列挙されたベクターは、いずれの場合においても本発明を限定するもの ではない。更に適するベクターは、インヴィトロゲン(Invitrogen)、ヴィカル(V ical)、及びアグラセタス(Agracetus)を含む商社から入手可能であり、当業者に よって簡単に製造することができる。 本発明の更なる好ましい態様は、少なくとも１つの付加的な抗原を、前記ワクチ ンが含有するかまたは前記発現ベクターがコードする、抗パルボウイルスワクチ ンに関連している。 前記付加的抗原は、パルボウイルス特異的エピトープ免疫反応を増強する機能を 果たすことができる。この事において、前記付加的抗原は担体タンパク質の機能 を有する。代わりに、異なる病原体に対して異なる抗原は免疫反応を誘導し、よ って、多価ワクチンを生ずる機能を果たすこともできる。更に、付加的抗原は両 方の機能を果たすことも可能である。 少なくとも１つの付加的な抗原と同様に、少なくとも１つのパルボウイルス特異 的エピトープをコードするベクターを作る多くの方法がある。従って、例えば、 付加的な抗原をコードする核酸は、少なくとも１つのパルボウイルス特異的エピ トープをコードする核酸配列にクローンすることができる。もし、前記パルボウ イルス特異的エピトープをコードする前記核酸配列内に適する制限酵素部位がな いならば、制限酵素部位を従来法により形成することができる。逆に、前記少な くとも１つのパルボウイルス特異的エピトープをコードする核酸配列を前記少な くとも１つの付加的な抗原をコードするDNA配列にクローンすることもできる。 得られたポリペプチドは、融合タンパク質でもよい。代わりに、少なくとも１つ のパルボウイルス特異的エピトープ及び少なくとも１つの付加的な抗原が、別々 のタンパク質系(proteinuceous)物体として発現されてもよい。 前段の記載から明らかなように、本発明の特に好ましい態様は、前記付加的抗原 が免疫原であるワクチンに関連している。 担体分子として効果的であるとされた上記のような免疫原の例は、肝炎B-表面抗 原、及び好ましくはヒト肝炎B-表面抗原プレS2タンパク質である。 本発明の更に特に好ましい態様は、組み換え体pGT36VP1を含むワクチンに関する 。前記ベクターは完全なVP1オープンリーディングフレームを表す核酸分子を含 む。前記ベクター構成の詳細は実施例２に記載されている。 本発明のワクチンの更に特に好ましい態様においては、少なくとも１つのＴ細胞 エピトープをコードする前記核酸分子が、以下の一般化した核酸配列にコードさ れるエピトープ群から選択される。 配列中、Nはいずれの塩基でもよく、Rはプリンを示し、Yはピリミジンを示 し、及びHはA、CまたはTを示し、 好ましくは、エピトープが下記の核酸配列によりコードされる。 本発明のワクチンの更に特に態様においては、少なくとも１つのＢ細胞エピトー プをコードする前記核酸分子が、以下の一般化した核酸配列によりコードされた エピトープ群から選択される。 配列中、Nはいずれの塩基でもよく、Rはプリンを示し、Yはピリミジンを示 し、SはGまたはCを及びMはCまたはAを示し、 好ましくは、エピトープが核酸配列によりコードされる。 更に好ましい態様においては、本発明のワクチンはＴ細胞及びＢ細胞エピトープ の両方をコードする核酸の混合物を含む。 本発明のこの態様の例は、前記少なくとも１つのＢ細胞及びＴ細胞エピトープを コードする核酸分子が、前述のいずれかの異なる発現ベクターに含有される場合 である。 本発明の抗パルボウイルスワクチンの更なる好ましい態様は、前記ワクチンにア ジュバントを更に含有する。 免疫化のためのアジュバントは従来技術においてよく知られており、当業者によ って、ワクチンの製剤のための前記態様で説明された核酸配列と組み合わせるこ とができる。 本発明の特に好ましい態様は、前記アジュバントがメチル化されていないCpGモ チーフを含むDNA分子を含有するワクチンに関する。 DNAはそれぞれ個々の特徴を形成する遺伝情報を含むことが知られてきた。細胞 の青写真(blueprint)であるこの役割に加えて、アーサー クリエグ博士(Dr.Ath ur Krieg)は、最近、潜在的免疫活性化を起こすCpGモチーフと呼ばれる短鎖DNA を発見した(Nature(1995)、Vol 374、546)。CpGモチーフを有するDNA(「CpG DNA 」)は簡単に安価で合成することができ、免疫系を選択的に活性化するために使 用することができる。ワクチン効果の増加を含むCpG DNAを介した免疫活性化の ための治療的な応用は、ガン細胞の破壊、及び感染の保護または治療のための免 疫系を助ける。DNAは自然組織体の一部であり、免疫系を増強するために現在使 用されている薬より安全である(米国特許出願番号08/386,063;08/461,036;08/46 2,799参照)。 本発明は、DNAに基づくワクチン用のアジュバントとして作用するCpGを含有する オリゴヌクレオチドとワクチン用のプラズミドDNAの使用を、初めて組み合わせ た。 このワクチンの優れた免疫性質は、下記の実施例において説明されている。特に 好ましいのは、メチル化されていないCpGモチーフを含む前記DNA分子が、 である抗パルボウイルスワクチンである。 本発明の抗パルボウイルスワクチンの更に特に好ましい態様においては、前記DN A分子がホスホロチオエート(phosphorothioate)変性バックボーンを含むメチル 化されていないCpGモチーフを含有する。 ホスホロチオエート変性は、メチル化されていないCpGモチーフのアジュバント 容量を更に強化することが明らかなため、特に有利である(クリエグら、前記参 照.)。 本発明のワクチンにより、ワクチンが１度しか与えられない場合にも、効果的な 免疫を得ることが可能である。 更に、本発明は、例えば、パルボウイルス疾患に対するイヌ科、ネコ科またはイ タチ科の動物の免疫化のためのワクチンを調製するための、種々の態様で特定さ れた核酸またはメチル化されていないCpGモチーフのようなアジュバントまたは それらの組み合わせのいずれかのような本発明のワクチンの成分の使用と同様に 、イヌ科、ネコ科及びイタチ科の動物の予防接種ための本発明の抗パルボウイル スワクチンの使用、必要のある動物に本発明のワクチンを適した分量で投与する ことによりイヌ科、ネコ科及びイタチ科の動物に予防接種する方法に関する。 好ましくは、前記イヌ科、ネコ科またはイタチ科の動物が、イヌ、ネコまたはミ ンクである。当業者（ここでは獣医）は適用するべき分量及び投与経路について 熟知している。更に、最初及びそれに続く予防接種の好適な時間間隔と同様に、 ワクチンの適用回数も公知である。 特に好ましい態様においては、本発明のワクチンは、ワクチンが１回与えられる だけで十分な免疫を誘導する予防接種方法のために使用される(単一投与量免疫( single dose immunization))。 本発明のワクチンは、好ましくは、以下の経路の１つにより投与される；針及び による鼻腔内投与、粒子打ち込みによる鼻腔内投与、乱切による鼻腔内投与、静 脈内または腹腔内投与。 実施例で本発明を例示する。 実施例１：イヌ科パルボウイルスサブグループの抗原的エピトープの合成 合成デオキシリボ核酸オリゴヌクレオチドが、以下の配列 及び相補的鎖の により生成された。 上記配列は、アニーリングした時に、EcoRＩ及びXhoＩ制限酵素部位に結合す リーディングフレームを含有している。プレS2領域の大部分を削除する工程にお いて、これらのオリゴヌクレオチドは、pCMV-S2S中のヒト肝炎Ｂ表面抗原のプレ S2領域にあるEco R1及びXho Ｉサイトにライゲートする(ミッチェル(Michel)ら 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)、5307-5311)。得られた構築物はpCMVS-VP1 eと名づけられた。この構築物のCMVプロモーターから生成されたRNA転写物は、 内部出発コドン(AUG)を持つオープンリーディングフレームを含んでいる。第一 のAUGが使用された時、VP1エピトープ、S2領域の一部分及び全てのＳ領域は単一 のタンパク質として生成される。内部AUGはＳタンパク質のみを生成する。同様 にして、下記の配列を持つデオキシリボ核酸オリゴヌクレオチド がVP1エピトープと同じ方法により、pCMV-S2Sにクローンされた。得られたプラ ズミドはpCMVS-VP2eと名づけられた。これらのエピトープをコードする両方のDN A配列は合成配列であり、自然発生パルボウイルスからのDNA配列を表してはいな い。 実施例２：イヌ科パルボウイルスVP1-VP2遺伝子のクローニング及びパルボウイ ルス遺伝子発現プラズミドの構築 イヌ科パルボウイルスVP1(VP1及びVP2)をコードする領域の全てが、ポリメラー ゼ鎖反応増幅により、CPVタイプ2aを含有する組織培養上清からクローンされた 。プライマーは、VP1のオープンリーディングフレームのすぐ外側に配置され、N otＩ(下流)及びBamHＩ(上流)制限酵素部位を含みかつ以下の配列を有する。 PCR生成物はNotＩ及びBamHＩにより順番に切断され、同様に切断された細菌発現 pGT36とセンス方向でライゲートされた(コンリー(Conry)ら、Cancer Gene Thera py 2(1)（1995）33-38)。VP1(及びVP2)の方向及び配列は、全VP1挿入部をDNA配 列分析することにより確認された。このクローンされたDNAはpGT36VP1と呼ばれ る。 実施例３：培養細胞におけるクローンパルボウイルスVP1-VP2の発現 ネズミ繊維芽細胞(NIH 3T3)にpGT36VP1クローンが導入された。イヌ科パルボウ イルスに対するイヌ科抗血清を用いる免疫蛍光アッセイにより、免疫活性イヌ科 パルボウイルスタンパク質の存在について細胞を試験した。染色のパターンはイ ヌ科パルボウイルスで感染された細胞では確認することができず、陰性(pGT36DN A無し)コントロールは染色されていなかった。これによって、pGT36VP1クローン は抗パルボウイルス抗体により確認されるタンパク質生成物を生成していること が示された。 実施例４：パルボウイルス(エピトープ)核酸ワクチンによるイヌの免疫化 ３匹の11週目の高齢子犬が150μｇpCMVS-VP1e及び100μｇの合成ホスホロチオ 四頭筋筋肉から免疫化され、３匹の11週目の高齢子犬は150μｇのpCMVS-VP2e及 び100μｇISOで免疫化され、３匹の11週目の高齢子犬は150μｇのpCMVS-VP1e、1 50μgのpCMVS-VP2e及び100μｇのISOで免疫化された。子犬は３週間後に同じ投 与量で免疫強化され、担体タンパク質、肝炎Ｂ表面抗原、及びイヌ科パルボウイ ルスエピトープに対する抗体力価の変化が観察された。pCMVS-VP1e及びpCMVS-VP 2eを投与された動物及びpCMVS-VP2e群においては、顕著な抗体反応が肝炎および イヌ科パルボウイルスの両方において見られた。pCMVS-VP1eはＴ細胞エピトープ を示すため、イヌ科パルボウイルスに対する抗体反応は予測されなかった。この 予測は実験的に確認された。反応は、pCMVS-VP1eプラスpCMVS-VP2eにおいて最大 であり、これは多価ワクチンがより効果的であることを示している。 実施例５：パルボウイルスVP1及びVP2遺伝子を発現する核酸による動物の免疫化 (a) pGT36VP1により免疫化された３匹のBa1b-cネズミの１匹は、プラズミド 1μｇによる粒子打ち込みの１週間の後に、免疫化されており、特に、イヌ 科パルボウイルスに対する抗体反応を示した。 (b) 抗イヌ科パルボウイルス抗体力価の無い３匹の幼いビークル犬(約６ヶ月) を、150μgのpGT36VP1及び100μｇISOにより、右の大腿四頭筋筋肉から免疫 化した。顕著な抗イヌ科パルボウイルス抗体反応が、１匹では２週間で構築 され始め、３匹の動物において少なくとも３週間増加を続けた。対照ビーグ ルとしてベクターDNA及びISOを投与したものは、抗体力価に変化はなかった 。 (c) 抗イヌ科パルボウイルス抗体力価を有さない６匹の幼犬を400μｇのpGT36V P1で、右の大腿四頭筋筋肉から免疫化した。これらのイヌのうち、３匹には 、更に免疫増強アジュバントとして400μｇの大腸菌由来DNAをpGT36VP1と共 に投与した。６匹全てが抗パルボウイルス抗体反応を免疫化の２週間以内に 示し、３から５週間目で保護可能な力価を明らかに超えた力価に達した。免 疫増強DNAを受けた３匹は、CpG免疫増幅強化を示す高い抗体力価に、他のイ ヌよりもより早くより達した。 実施例６：核酸ワクチン発現パルボウイルスVP1及びVP2による免疫化されたイヌ のイヌ科パルボウイルス感染の攻撃からの保護 (a) 実施例５において免疫化された３匹のビーグル犬は、パルボウイルスワク チン投与において鼻腔内経路を介して使用された標準３価の量のイヌ科パル ボウイルスで試験された。いずれのイヌもパルボウイルスに関連した病状は 見られず、これは疾病からの保護を示している。２匹のイヌはわずかな抗イ ヌ科パルボウイルス抗体反応の増加を示し、便からのパルボウイルスの流出 は無く、予備投与の傾向と一致しており、これは感染からの完全な保護を示 している。対照ビーグルは投与後、抗イヌ科パルボウイルス抗体反応の顕著 な増加を伴うパルボウイルス疾患の症状を示した。 (b) 抗イヌ科パルボウイルス抗体力価を有さない４匹の幼犬を、筋内投与を介 して200、400、600及び800μｇのプラズミドpGT36VP1で免疫化した。全 てのイヌが抗イヌパルボウイルス抗体を１週間以内に生じ、２週間以内に保 護力価のピークに達した。陰性コントロールとして生理食塩水を投与したイ ヌは、抗イヌ科パルボウイルス抗体を発生しなかった。600μｇのプラズミ ドDNAを注射されたイヌは、他のイヌに比べて長く抗体力価を保持した。全 てのイヌに、最初の投与から16週後、同じ分量の同じ調製物を再度投与した 。陰性コントロール及び200μｇ以外の全てのイヌは、既往症抗体反応を示 した。陰性コントロール以外の200μｇ投与を含めた全てのイヌは、保護を 発生することが知られている再注射の後、血清中和抗体力価を示した。全て のイヌは、最初の注射の24週間後に、免疫化していない犬において発病の原 因になると知られている３種の単離ウイルスを含む毒性街上ウイルスを注射 された。pGT36VP1核酸ワクチンで免疫化された全てのイヌは、感染及び疾病 から保護された。陰性対照犬はイヌ科パルボウイルスの典型的な臨床的疾病 を発病し、ウイルスを便に排出した。この実験は、最初の及び効果を高める 次の注射で与えた200μｇから800μｇプラズミドの範囲にあるpGT36VP1の投 与量が、抗体力価の生成を刺激し、毒性の攻撃に対する保護を形成すること を示した。 (c) 抗イヌ科パルボウイルス抗体力価を持たない３匹の幼犬に150μｇのpGT36V P1プラスCpGsを含有するように合成されたオリゴヌクレオチドDNA150μｇを 注射した。全てのイヌが抗イヌ科パルボウイルス抗体を形成し、毒性ウイル スの攻撃から保護された。この実験により、免疫化が免疫刺激性オリゴヌク レオチドにより増幅された時、低い分量のpGT36VP1による免疫化が保護免疫 を与えることが示された。 (d) 抗イヌ科パルボウイルス抗体力価を有さない６匹の幼犬に、単一分量200か ら800μｇのpGT36VP1を注射した。全てのイヌが始めに抗イヌ科パルボウイ ルス抗体力価を形成し、免疫化の12週間後、それは検出不可能なレベルまで 減少した。効果を高める次の免疫化を投与しないで、全てのイヌは毒性ウイ ルスによる攻撃を受けたが、いずれのイヌも感染または病気に はならなかった。この実験は、保護免疫がpGT36VP1の単一投与後に達成され 、この保護は測定可能な抗イヌ科パルボウイルス抗体の存在には依存してい ないことが示された。この結果から、細胞免疫が長期生存免疫記憶Ｔ細胞に 授与されたと解釈することができる。 これらの研究は、ネコ科パルボウイルスサブグループから選択されたDNA配列が 動物発現プラズミドに挿入された時に、培養細胞及び動物内で細胞に導入するこ とが可能であることを示した。更に、我々のDNA発現プラズミドは動物内で抗体 反応を呼び出し、毒性ウイルス攻撃に対する保護に導くことが示された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくとも１つのパルボウイルス特異的エピトープをコードする核酸分 子及び製薬学的に適した担体を含む抗パルボウイルスワクチン。 ２． 少なくとも１つの前記パルボウイルス特異的エピトープが、Ｔ細胞エピト ープである請求項１に記載の抗パルボウイルスワクチン。 ３． 少なくとも１つの前記パルボウイルス特異的エピトープが、Ｂ細胞エピト ープである請求項１または２に記載の抗パルボウイルスワクチン。 ４． 前記核酸分子がDNA分子またはRNA分子である請求項１から３のいずれ か１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。 ５． 前記核酸分子がパルボウイルスVP１及び／またはVP２核酸キャプシドタ ンパク質をコードする請求項１から４のいずれか１項に記載の抗パルボ ウイルスワクチン。 ６． 前記核酸分子が完全なVP１オープンリーディングフレームを含有する請 求項５に記載の抗パルボウイルスワクチン。 ７． 前記エピトープがパルボウイルス遺伝子から誘導されるものであり、前 記パルボウイルスがイヌ科、ネコ科またはイタチ科の動物、及び、好ま しくは、イヌ、ネコまたはミンクに感染できる請求項１から６のいずれ か１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。 ８． 少なくとも１つのパルボウイルス特異的エピトープをコードする前記核 酸分子が発現ベクターに含有されており、前記発現ベクターが哺乳類細 胞で機能する請求項１から７のいずれか１項に記載の抗パルボウイルス ワクチン。 ９． 前記ワクチンが少なくとも１つの付加的な抗原を含有するかまたは発現 ベクターが少なくとも１つの付加的な抗原をコードする請求項１から８ のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。 １０．前記付加的な抗原が免疫原である請求項９に記載の抗パルボウイルスワ クチン。 １１．少なくとも１つのパルボウイルス特異的エピトープをコードする前記核 酸分子を含有する前記発現ベクターが、pGT36VP1であり、その構築が実 施例２に記載されている請求項８から１０のいずれか１項に記載の抗パ ルボウイルスワクチン。 １２．少なくとも１つのＴ細胞エピトープをコードする前記核酸分子が、以下 の一般化した核酸配列にコードされるエピトープ群から選択される請求 項２から１１のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。 配列中、Nはいずれの塩基でもよく、Rはプリンを示し、Yはピリミジン を示し、及びHはA、C、またはTを示し、 好ましくは、エピトープが下記の核酸配列にコードされる。 １３．少なくとも１つのＢ細胞エピトープをコードする前記核酸分子が、以下 の一般化した核酸配列によりコードされたエピトープ群から選択される 請求項３から１２のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。 配列中、Nはいずれの塩基でもよく、Rはプリンを示し、Yはピリミジン を示し、SはGまたはCを示し、かつMはCまたはAを示し、 好ましくは、エピトープが下記の核酸配列によりコードされる。 １４．Ｔ細胞及びＢ細胞エピトープの両方をコードする核酸混合物を含む請求 項１から１３のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。 １５．アジュバントを更に含有する請求項１から１４のいずれか１項に記載の 抗パルボウイルスワクチン。 １６．前記アジュバントがメチル化されていないCpGモチーフを含むDNA分子 である請求項１５に記載の抗パルボウイルスワクチン。 １７．メチル化されていないCpGモチーフを含む前記DNA分子が である請求項１６に記載の抗パルボウイルスワクチン。 １８．前記DNA分子がホスホロチオエート変性バックボーンを含有する請求項 １６または１７に記載の抗パルボウイルスワクチン。 １９．イヌ科、ネコ科、またはイタチ科の動物における予防接種のための請求 項１から１８のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチンの使用。 ２０．前記イヌ科、ネコ科またはイタチ科の動物が、イヌ、ネコまたはミンク である請求項１９に記載の使用。 ２１．前記ワクチンが下記の経路の１つにより投与される請求項１９または２ による筋内投与、針及び注射器による鼻腔内投与、粒子打ち込みによる 鼻腔内投与、乱切による鼻腔内投与、静脈内または腹腔内投与。 ２２．ワクチンの単一投与により免疫化が達成される請求項１９または２０に 記載の使用。