ES2283015T3 - Vacunacion con acidos nucleicos para infecciones parvoviricas. - Google Patents
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Abstract
EL CAMPO GENERICO DE LA INVENCION ES UN PROCEDIMIENTO PARA VACUNACION CON ACIDO NUCLEICO DE ANIMALES, A FIN DE PROTEGERLOS CONTRA INFECCIONES PARVOVIRALES. LA INVENCION SE REFIERE MAS PARTICULARMENTE A LA PREPARACION Y USO DEL ADN PARVOVIRAL Y A SU ADMINISTRACION A PERROS, GATOS Y VISONES, A FIN DE INDUCIR UNA RESPUESTA INMUNE QUE PUEDA PROTEGER A ESTOS ANIMALES CONTRA LA ENFERMEDAD PROVOCADA POR UN PARVOVIRUS VIRULENTO. LOS INMUNOGENES DEL ACIDO NUCLEICO SE DISEÑAN DE MANERA QUE SE INCLUYAN LAS PARTES ANTIGENICAS DEL GENOMA PARVOVIRAL QUE SE INCORPORA A LOS PLASMIDIOS BACTERIANOS. ESTOS PLASMIDIOS PRODUCEN EL GEN PARVOVIRAL DESEADO CUANDO SE INTRODUCEN EN CELULAS HUESPEDES POR TRANSFECCION. LAS CELULAS HUESPEDES TRANSFECTADAS CON EL INMUNOGENO PARVOVIRAL QUE EXPRESA LOS PLASMIDIOS PRODUCEN UNA CORRIENTE DE PROTEINAS ANTIGENICAS ANTE LA QUE EL SISTEMA INMUNOLOGICO DEL HUESPED LEVANTARA UNA RESPUESTA INMUNE PROTECTORA.
Description
Vacunación con ácidos nucleicos para infecciones
parvovíricas.
El campo general de la invención es un
procedimiento para la vacunación con ácidos nucleicos de animales
para protegerlos de infecciones parvovíricas. La presente invención
se refiere más particularmente a la preparación y uso de ADN
parvovírico y a su administración a perros, gatos y visones para
inducir una respuesta inmunitaria que puede proteger a estos
animales de una enfermedad causada por parvovirus virulentos. Los
inmunogenes de ácidos nucleicos están diseñados para incluir las
partes antigénicas del genoma parvovírico que están incorporadas a
los plásmidos bacterianos. Estos plásmidos producen el producto
génico parvovírico deseado cuando son introducidos en células
huésped mediante transfección. Las células huésped transfectadas con
plásmidos que expresan el inmunogén parvovírico producen una
corriente de proteínas antigénicas contra las que el sistema
inmunitario huésped pondrá en marcha una respuesta inmunitaria
protectora.
Los parvovirus son una familia de pequeños virus
de ADN estrechamente relacionados compuestos por una cápside
proteínica que contiene ADN monocatenario. Los parvovirus causan
varias enfermedades en una variedad de especies de mamíferos. El
virus de la panleucopenia felina, el virus de la enteritis del visón
y el parvovirus canino son variantes de una especificidad de
huéspedes del subgrupo del parvovirus felino y comparten más del
98% de homología en el ADN (Martyn y otros, J. Gen. Virol. 71 (1990)
2.747-2.753). El parvovirus canino es un agente
patógeno relativamente nuevo de todos los cánidos, identificado por
primera vez a finales de la década de 1970 como el agente causante
de una pandemia mundial de gastroenteritis muy mortal. Se ha
propuesto la hipótesis de que este virus es un mutante de la
especificidad de huéspedes del parvovirus felino. Cuando se
compararon las secuencias de nucleótidos de los parvovirus felino y
canino, se identificaron 31 cambios de bases que daban lugar a
cambios en tan sólo 9 aminoácidos (Martyn y otros, 1990). Seis de
estos cambios de aminoácidos se localizaban en los principales
genes de la cápside, VP1 y VP2. El epítopo antigénico
específicamente canino está determinado por la diferencia de un
sólo aminoácido con respecto al virus de la panleucopenia felina.
Un mapeo genético adicional ha confirmado recientemente cuándo se
originó el parvovirus canino, ha reforzado la teoría de su origen a
partir del parvovirus felino y ha indicado una evolución continuada
del virus en las cepas de campo actualmente en proceso de
aislamiento (Truyen y otros, J. of Virology 69 (8) (1995),
4.702-4.710).
Las dos proteínas de la nucleocápside, VP1 y
VP2, se expresan a partir del mismo ARN siendo VP2 el resultado de
un codón ATG sin cambio de pauta de lectura dentro del marco abierto
de lectura de VP1. VP2 se expresa a un nivel casi 10 veces mayor
que VP1 indicando que el codón de iniciación interno es identificado
de un modo más eficaz como tal mediante el equipo de traducción
(Turiso y otros, J. of Gen. Virol. 72 (1991),
2.445-2.456). Los experimentos de mapeo de epítopos
han demostrado que todos los epítopos antigénicos que generan
anticuerpos neutralizantes están situados dentro de VP2 (Turiso y
otros, 1991, loc. cit.). Entre éstos se incluyen los primeros 16
aminoácidos de VP2 (Langeveld y otros, J. of Virology 68 (7) (1994),
4.506-4.513; Casal y otros, J. of Virology 69 (11)
(1995), 7.274-7.277).
La inmunización sigue siendo el principal
mecanismo mediante el cual los humanos y a las especies animales se
protegen contra el azote de una enfermedad infecciosa. La tendencia
reciente en el diseño de vacunas alejadas de microbios vivos,
atenuados, por motivos de seguridad, bien por "vaccine breaks",
atenuación incompleta, reversión, o por amplificación en pacientes
inmunodeprimidos, ha ido acompañada de una disminución en la
duración y la eficacia de las vacunas. La utilización de agentes
muertos, proteínas o péptidos recombinantes clonados requiere dosis
grandes y la presencia de adyuvantes. No obstante, no se han
estudiado los efectos a largo plazo de tales adyuvantes y,
recientemente, se ha dado a entender que podrían ser los agentes
causantes de los sarcomas inducidos por vacunas en gatos (Hendrick
y otros, J. Am. Vet. Med. Assoc. 205 (1994),
1.425-1.429). Además, la localización extracelular
del antígeno inyectado plantea preguntas acerca de cómo se presentan
estos antígenos al sistema inmunitario, así como sobre su idoneidad
para generar protección contra infecciones de aparición
natural.
Las actuales prácticas de vacunación contra el
parvovirus canino son dudosas (Schultz, R.D. (1994), The Challenge
of Controlling a Newly Recognized Disease: Canine Parvovirus
Vaccines, IBC International Symposium, octubre
27-28, 108). Las vacunas que consisten en organismos
atenuados o muertos, deben administrarse repetidamente para crear
inmunidad, y habitualmente no se produce inmunización circulante
frente a títulos de anticuerpos maternos. Este problema se complica
por la capacidad del anticuerpo materno para inactivar la vacuna
cuando se ha reducido a niveles de concentración que no son
protectores y que conducen a "cierta vulnerabilidad" (Pollock
y Carmichael, J. Am. Vet. Med. Assoc. 130 (1982),
37-42). La clonación del parvovirus canino ha
llevado al desarrollo de dos estrategias de vacuna distintas. La
primera fue la introducción de toda la secuencia de VP2 en un
sistema de expresión de baculovirus. Se extrajo el producto
proteínico y se utilizó para inmunizar satisfactoriamente a perros
(Turiso y otros, J. of Virology 66 (5) (1992),
2.748-2.753). La segunda estrategia implica la
subclonación o síntesis de epítopos de péptidos que se utilizan para
inmunizar a perros. Estos péptidos han utilizado la secuencia
aminoterminal de VP2 (Casal y otros, 1995, loc. cit.) que dio lugar
a la inmunización satisfactoria de perros. Las vacunas
desarrolladas utilizando estas estrategias también han sido
probadas con el virus de la enteritis del visón, otra variante de la
serie de huéspedes estrechamente relacionada del parvovirus. La
administración de una proteína o un péptido recombinante da lugar a
una inmunidad protectora contra esta enfermedad comercialmente
relevante del visón (Langeveld y otros, Vacuna 13 (11) (1995),
1.033-1.037).
\newpage
Las vacunas contra parvovirus elaboradas a
partir de péptidos que corresponden a epítopos antigénicos de
proteínas de la cápside parvovírica se describen en
EP-A-0647655 y en Turiso y otros.
(J. General Virology 72 (1991), páginas 2.445 a 2.456). Además,
Langeveld y otros, Vaccine, Vol. 12, (1994), páginas 1.473 a 1.480,
describen como referencia la vacunación de perros utilizando virus
vivos modificados o material vírico inactivado.
Las vacunas de virus vivos modificadas contra la
panleucopenia felina son efectivas para proteger a gatos adultos,
pero pueden producir anomalías congénitas en embriones de gato in
utero, por consiguiente no están recomendadas para vacunar a
gatas intactas que podrían estar preñadas. Dadas las limitaciones
importantes de las vacunas de virus vivos modificadas, los
científicos empezaron a investigar la posibilidad de transfectar
células in vivo con genes que expresan antígenos de
organismos infecciosos (revisado en Donnelly y otros, J. Imm. Meth.
176 (1994), 145-152; Fynan y otros, Int. J.
Immunopharmac. 17 (2) (1995), 79-83; Whalen y otros
(1995), DNA Mediated Immunization to the Hepatitis B Surface
Antigen; Activation and Entrainment of the Immune Response in DNA
Vaccines, Nueva York: New York Academy of Sciences). Dicho mecanismo
de inmunización emularía el mecanismo de expresión génica vírica
sin el riesgo concomitante impuesto por los organismos atenuados,
al tiempo que se evitaría la necesidad de los adyuvantes habituales.
El descubrimiento fortuito de que la inyección intramuscular de ADN
plásmido "desnudo" portador de un promotor de mamífero haría
que el ADN fuera aceptado por células musculares y se expresara
(Wolff y otros, Science 247 (1990) 1.465-1.468) ha
causado una expansión radical del nuevo campo de la vacunación con
ácidos nucleicos. Con posterioridad al estudio original, se han
definido y ampliado las condiciones que afectan a la inyección
intramuscular de ADN plásmido (Wolff y otros, Biotechniques 11
(1991), 474-485). La eficacia de la transferencia es
relativamente baja, variando entre el 1 y el 5%, aunque esta
eficacia puede aumentarse hasta 40 veces induciendo una degeneración
muscular previa a la inyección del ADN plásmido (Vitadello y otros,
Hum. Gene. Ther. 5 (1994), 11-18; Danko y Wolff,
Vaccine 12 (16) (1994), 1.499-1.502); Davis y otros,
Hum. Gene. Ther. 4 (1993), 733-740). Dos de los
agentes mionecróticos utilizados más frecuentemente son los
anestésicos locales bupivicaína y cardiotoxina (Danko y Wolff,
1994, loc. cit.; Davis y otros, 1993, loc. cit.). Se han empleado
numerosas técnicas distintas para transferir genes al músculo tales
como los vectores retrovirales, los vectores adenovirales y los
liposomas. No obstante, la inyección directa de ADN desnudo parecer
ser el más eficaz de los mecanismos de administración a la hora de
transferir y expresar ADN exógeno (Davis y otros, 1993, loc.
cit.).
Se han investigado varias vías de administración
además de la inyección intramuscular. Todas estas vías tienen en
común que no requieren ningún agente o vector para facilitar la
introducción del ácido nucleico a las células diana. La inyección
intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, intranasal y subcutánea
de plásmidos de ADN han dado lugar a una inmunización contra la
hemoaglutinina (HA) del virus de la gripe en pollos (revisado en
Pardoll y Beckerkleg, Immunity 3 (1995), 165-169).
De forma interesante, estos estudios indicaron que la inmunización
mucosal (intranasal) con ADN no producía la respuesta IgA esperada,
sino más bien una respuesta IgG, tal como se observa con las
inyecciones intramusculares. Además, se observó que la inmunización
intradérmica por bombardeo de micropartículas de oro recubiertas de
ADN era tan eficaz como otros procedimientos de liberación de genes
a concentraciones de ADN de 100 a 1.000 veces inferiores que en los
otros procedimientos. Experimentos similares han demostrado que las
vías intradérmica e intravenosa producen una inmunización en ratones
y conejos (Raz y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994),
9.519-9.523). Destacando la simplicidad de la
estrategia, Raz y colaboradores han señalado que una manera de
evitar tener que utilizar el equipo caro y potencialmente incómodo
necesario para el bombardeo tisular y la inmunización intradérmica
es recubriendo con ADN un punzón de plástico de PPD de la
tuberculina y escarificando la piel para conseguir un resultado
similar al bombardeo biolístico. La inmunización con ADN se ha
intentado con éxito variable en varias especies de mamíferos tales
como ganado bovino, porcino y primates no humanos, predominantemente
por vía intramuscular.
En Erth y otros, Viral Immunology, vol. 9, 1996,
páginas 1 a 9, se puede observar una visión general de la
inmunización genética.
Se ha descrito que la naturaleza de la respuesta
inmunitaria frente a los antígenos presentes después de la
inyección intramuscular de construcciones de expresión de ADN
implica tanto la rama humoral como la celular del sistema
inmunitario. Cuando se inyectan construcciones de ADN informador,
éstas parecen estar dentro de miofibras maduras. Esto cuenta con el
apoyo de pruebas según las cuales la regeneración del músculo
parece aumentar la eficacia de la expresión de los plásmidos. La
presentación de los antígenos podría tener lugar por medio de la
presentación del complejo principal de histocompatibilidad ("major
histocompatibility complex", MHC) de clase I por la célula
muscular, la capatación de antígenos de los miocitos por parte de
células presentadoras de antígenos ("antigen presenting cells",
APC) procedentes de la médula ósea o mediante transfección directa
con ADN de las APC que migran a través del músculo (revisado en
Pardoll y Beckerleg, 1995, loc. cit.; Whalen y otros, 1995, loc.
cit.). No parece probable que la simple presentación de antígenos
por los miocitos sea completamente responsable de este fenómeno por
dos razones. En primer lugar hay un conjunto cada vez más
importante de datos según los cuales la presentación de antígenos en
ausencia de señales coestimuladoras, tales como B7 y
B7-2, da lugar a tolerización de antígenos (Chen y
Nabavi, Immunity 1 (1994), 147-154). En segundo
lugar, se ha descrito que el músculo tiene niveles extremadamente
bajos de expresión del MHC de clase I (Karpati y otros, Ann.
Neurol. 23 (1988), 64-72). Por lo tanto, parece
probable que la presentación de antígenos se lleve a cabo por APC
específicas que han adquirido un antígeno fagocitándolo o bien a
través de la adquisición y expresión directas del gen transferido
(Pardoll y Beckerleg, 1995, loc. cit.; Whalen y otros, 1995, loc.
cit.). Un experimento realizado con bombardeo biolístico de
partículas en el ratón parecería favorecer la última estrategia.
Los ratones se bombardearon en el pabellón de la oreja y la oreja se
extirpó quirúrgicamente cinco minutos después del bombardeo. Estos
ratones conservaban la capacidad de llevar a cabo una respuesta
inmunitaria, y aquella respuesta no difería cualitativamente de la
inducida únicamente por bombardeo. Está claro que tiene que ser una
población celular muy móvil la responsable del inicio y el
mantenimiento de la respuesta inmunitaria en estos ratones. Se ha
propuesto la célula dendrítica como esta posible célula (Fynan y
otros, 1995, loc. cit.). De manera significativa, el carácter de la
respuesta inmunitaria inducida por el bombardeo de partículas
difiere ligeramente de la respuesta resultante de la inyección
intramuscular, con predominio de IgG1 en las inyecciones
intramusculares mientras que en las inyecciones intradérmicas
predomina IgG2. La razón principal de esta diferencia puede
atribuirse a los miocitos que en la inmunización intramuscular
siguen expresando antígenos durante períodos superiores a un mes
(Pardoll y Beckerleg, 1995, loc. cit.). Esta expresión continua da
lugar a lo que se ha denominado encarrilamiento inmunitario (Whalen
y otros, 1995, loc. cit.). El resultado práctico de este fenómeno
es que la expresión muscular actúa como un estímulo continuo. Con
frecuencia, las titulaciones procedentes de una sola inyección puede
aumentar durante un período de 4 a 8 semanas, o incluso más.
También se han observado respuestas clásicas de refuerzo con
inyecciones de ADN administradas durante 6 meses después de la
primera inyección. Curiosamente, es posible que las inyecciones de
ADN de refuerzo, administradas durante el período de aumento de las
titulaciones de anticuerpos, no tengan ningún efecto o incluso que
reduzcan la respuesta al antígeno (Davis y otros, "Introduction of
systemic and mucosal immunity to HBV with plasmid DNA",
International Meeting on Nucleic Acid Vaccines, febrero
5-7, 1996, Bethesda, Maryland, EE.UU.).
La capacidad de generar una respuesta
inmunitaria cuantificable no es a priori suficiente para la
vacunación. Al contrario, la respuesta inmunitaria debe contener
los elementos apropiados para proteger al huésped de la infección,
la invasión y la enfermedad. Por lo tanto, la protección frente a la
infección en estudios de provocación sigue siendo la única
demostración más convincente de la eficacia de la vacuna. Las
vacunas basadas en ADN han sido capaces de proteger a pollos frente
a la exposición letal del virus de la gripe (Robinson y otros,
Vacuna 9 (1993), 957-960) y a ratones de la
infección por Mycoplasma pulmonis (Lai y otros, DNA and Cell
Biology 14 (7) (1995), 643-651). Además, la
inmunización con ADN podría proteger a los ratones frente al
establecimiento de infecciones persistentes del virus de la
coriomeningitis linfocítica (Martins y otros, J. of Virology 69 (4)
(1995), 2.574-2.582).
Con respecto a la vacunación con ácidos
nucleicos relacionada con la presente invención, la técnica
anterior se resume en los siguientes artículos: Donnely y otros,
1994, loc. cit., Fynan y otros, 1995, loc. cit., Whalen y otros,
1995, loc. cit. en lo que respecta a la vacunación con ácidos
nucleicos, y Turiso y otros, 1992, loc. cit. y Casal y otros, 1995,
loc. cit., en lo que respecta a la vacunación parvovírica.
La técnica anterior mencionada anteriormente
sólo examinó la respuesta inmunitaria de ratones a la vacunación
con ácidos nucleicos. Tal como es conocido en el estado de la
técnica, los resultados experimentales obtenidos con ratones no
pueden generalizarse a animales como gatos, perros y visones, debido
a la diferencia taxonómica entre estos animales. Por otro lado,
puesto que la técnica anterior no pudo proporcionar vacunas
adecuadas contra infecciones parvovíricas de cánidos, félidos y
mustélidos, el problema técnico subyacente en la presente invención
era proporcionar dicha vacuna. Dicha vacuna podría proteger de
manera eficaz en particular a perros, gatos y visones del efecto
potencialmente mortal de las infecciones por parvovirus. La solución
al problema técnico anterior se consigue mediante las realizaciones
caracterizadas en las reivindicaciones.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a una vacuna antiparvovírica tal y como se ha especificado
en las reivindicaciones anexas.
La presente memoria también describe una vacuna
antiparvovírica que comprende moléculas de ácidos nucleicos que
codifican por lo menos un epítopo específico de parvovirus y un
portador farmacéuticamente aceptable. Sorprendentemente, según la
presente invención, se ha observado que la inmunización con ADN
"desnudo" que codifica por lo menos un epítopo específico del
parvovirus produce una respuesta inmunitaria que protege a los
animales vacunados de una enfermedad inducida por parvovirus tras la
posterior infección parvovírica.
En una realización preferida de la vacuna
antiparvovírica de la invención, por lo menos uno de dichos
epítopos específicos del parvovirus es un epítopo de célula T.
El experto en la materia, al diseñar una vacuna
protectora teniendo en cuenta las enseñanzas de la presente
invención, es capaz de idear una vacuna que comprenda una secuencia
de ácidos nucleicos que codifiquen únicamente un epítopo de célula
T para utilizarlo en la vacuna de la invención.
Del mismo modo, el experto en la materia es
capaz de idear una vacuna que comprenda sólo un epítopo de célula B
que codifique un ADN para utilizarla en una vacuna de ácidos
nucleicos según la presente invención. Por lo tanto, en otra
realización preferida, la vacuna antiparvovírica comprende por lo
menos un epítopo de célula B. Alternativamente, los ácidos
nucleicos que codifican dicho epítopo o epítopos de célula B pueden
estar comprendidos en dicha vacuna junto con ácidos nucleicos que
codifican por lo menos un epítopo de célula T. Los epítopos de
células T y B pueden ser codificados por las mismas o por distintas
moléculas de ADN.
En otra realización preferida de la vacuna
antiparvovírica según la invención, dichas moléculas de ácidos
nucleicos son moléculas de ADN o moléculas de ARN. La expresión
"moléculas de ADN" se utiliza en la presente en su sentido más
amplio e incluye, por ejemplo, moléculas de ADNc, ADN genómico,
moléculas de ADN sintético y semisintético. Igualmente, la
expresión "moléculas de ARN" se utiliza en la presente en el
sentido más amplio posible.
\newpage
En otra realización preferida de la vacuna
antiparvovírica según la invención, dichas moléculas de ácidos
nucleicos codifican las proteínas parvovíricas de la nucleocápside
VP1 y/o VP2.
El genoma parvovírico tiene una longitud
aproximada de 5.000 pares de bases y contiene aproximadamente cuatro
marcos abiertos de lectura. Dos de estos marcos abiertos de lectura
codifican VP1 y VP2, las principales proteínas de la cápside de los
parvovirus. VP2 se halla dentro de VP1 y consiste en prácticamente
todo excepto una pequeña parte del extremo 5' del gen VP1 o del
extremo amino de la proteína VP1. Se sabe que la secuencia exclusiva
para VP1 codifica un epítopo que es responsable de estimular una
respuesta de célula T. La secuencia común a VP1 y VP2 codifica por
lo menos un epítopo que estimula una respuesta de los anticuerpos.
Las infecciones naturales con parvovirus generan respuestas
protectoras considerables dentro de la semana de la infección. La
expresión de todo el gen VP1 o del epítopo dentro de VP1 (y
VP2) también produce inmunidad protectora a través de las ramas
celular y humoral del sistema inmunitario.
De acuerdo con esto, el experto en la materia
puede utilizar secuencias de ácidos nucleicos que comprenden la
secuencia que codifica el epítopo VP1 como representativa de un
epítopo de célula T parvovírica o una secuencia de ácidos nucleicos
que codifica el epítopo VP2 como representativa de un epítopo de
célula B parvovírica o una combinación de ambas para la preparación
de una vacuna para vacunar a cánidos, félidos o mustélidos.
En una realización particularmente preferida de
la vacuna de la invención, dichas moléculas de ácido nucleico
comprenden el marco abierto de lectura completo de VP1, es decir, el
marco de lectura que codifica la proteína de la nucleocápside VP1.
En el caso del parvovirus canino, la longitud total del marco
abierto de lectura es de 2.169 pares de bases. Dicho marco abierto
de lectura se expresa preferiblemente bajo el control de un
promotor exógeno adecuado.
La memoria describe además que, en la vacuna de
la invención, dicho epítopo procede de un genoma de parvovirus,
siendo dicho parvovirus capaz de infectar cánidos, félidos o
mustélidos y preferiblemente perros, gatos o visones. Debido a la
gran homología general del genoma de los parvovirus que infectan a
cánidos, félidos o mustélidos, puede utilizarse una vacuna obtenida
a partir de un ácido nucleico procedente de cánidos, félidos o
mustélidos para vacunar satisfactoriamente a cualquiera de los otros
grupos de animales mencionados.
En otra realización preferida de la vacuna de la
presente invención, dichas moléculas de ácidos nucleicos que
codifican por lo menos un epítopo específico de parvovirus se hallan
comprendidas en un vector de expresión, siendo dicho vector de
expresión funcional en células de mamíferos.
Para el experto en la materia, hay disponibles
numerosos vectores de expresión adecuados para llevar a cabo la
presente invención. De acuerdo con esto, los vectores mencionados en
los ejemplos anexos como elementos fundamentales de partida para
elaborar la vacuna de la presente invención no pretenden de ninguna
manera limitar el campo de aplicación de la presente invención.
Otros vectores adecuados se hallan disponibles en empresas
comerciales como Invitrogen, Vical y Agracetus y pueden ser
fácilmente producidos por el experto en la materia.
Otra realización preferida de la invención se
refiere a una vacuna antiparvovírica, en la que dicha vacuna
comprende o dicho vector de expresión codifica por lo menos un
antígeno adicional.
Dicho antígeno adicional puede desempeñar la
función de aumentar la respuesta inmunitaria al epítopo específico
del parvovirus. En cuanto a esto, dicho antígeno adicional tiene la
función de una proteína portadora. Por otro lado, el antígeno
diferente puede inducir una respuesta inmunitaria a un organismo
patógeno distinto y de este modo desempeñar la función de crear una
vacuna multivalente. También es posible que el antígeno adicional
desempeñe ambas funciones.
Hay múltiples formas de inventar un vector que
codifique por lo menos un epítopo específico del parvovirus, así
como por lo menos un antígeno adicional. De este modo, por ejemplo,
el ácido nucleico que codifica el antígeno adicional puede ser
clonado en una secuencia de ácidos nucleicos que codifique por lo
menos un epítopo específico de parvovirus. Si no se localiza una
secuencia de restricción adecuada dentro de dicha secuencia de
ácidos nucleicos que codifica dicho epítopo específico de
parvovirus, puede crearse tal secuencia de restricción utilizando
procedimientos convencionales. A la inversa, la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica por lo menos dicho epítopo específico de
parvovirus puede ser clonada en una secuencia de ADN que codifique
por lo menos dicho antígeno adicional. El polipéptido resultante
puede ser una proteína de fusión. Por otro lado, por lo menos un
epítopo específico de parvovirus y por lo menos un antígeno
adicional pueden ser expresados como entidades proteináceas
separadas.
De las afirmaciones realizadas en el párrafo
anterior se desprende claramente que una realización particular
preferida de la invención se refiere a una vacuna, en la que dicho
antígeno adicional es un inmunogén.
Un ejemplo de tal inmunogén, que ha resultado
ser efectivo como molécula portadora, es el antígeno de superficie
de la hepatitis B, y preferiblemente la proteína
pre-S2 del antígeno de superficie de la hepatitis B
humana.
Además, la memoria describe una vacuna que
comprende el vector recombinante pGT36VP1. Dicho vector comprende
una molécula de ácidos nucleicos que representa el marco abierto de
lectura completo de VP1. La construcción detallada de dicho vector
se describe en el Ejemplo 2.
En otra realización particularmente preferida de
la vacuna de la presente invención, dicha molécula de ácidos
nucleicos que codifica por lo menos un epítopo de célula T es
seleccionada del grupo de epítopos codificados por la secuencia de
ácidos nucleicos degenerada:
CCNAARATHTTYATHAAYYTNGCNAARAARAARAARGCNGGC;
en la que N representa cualquier
base, R representa la purina, Y representa la pirimidina y H
representa A, C o
T;
y es preferiblemente el epítopo codificado por
la secuencia de ácidos nucleicos:
CCGAAAATATTCATCAACCTGGCTAAGAAGAAGAAAGCTGGC.
En otra realización particularmente preferida de
la vacuna de la presente invención, dichas moléculas de ácidos
nucleicos que codifican por lo menos un epítopo de célula B son
seleccionadas del grupo de epítopos codificados por la secuencia de
ácidos nucleicos degenerada:
TSNGAYGGNGCNGTNCARCCNGAYGGNGGNCARCCNGCNGTNMGN;
en la que N representa cualquier
base, R representa la purina, Y representa la pirimidina, S
representa G o C y M representa C o A; y es preferiblemente el
epítopo codificado por la secuencia de ácidos
nucleicos:
TCAGACGGTGCTGTACAGCCAGATGGAGGACAACCCGCGGTTCGC.
En otra realización preferida, la vacuna de la
presente invención comprende una mezcla de ácidos nucleicos que
codifica ambos epítopos de célula B y célula T.
Un ejemplo de esta realización de la invención
es el caso en el que cualquiera de las moléculas de ácidos
nucleicos mencionadas anteriormente que codifican por lo menos
dichos epítopos de células B y células T se hallen comprendidas en
vectores de expresión distintos.
En otra realización preferida de la vacuna
antiparvovírica de la invención, dicha vacuna comprende además un
adyuvante.
Los adyuvantes para vacunación son bien
conocidos en el estado de la técnica y pueden combinarse adyuvantes
adecuados con las secuencias de ácidos nucleicos descritas en las
realizaciones mencionadas anteriormente para la formulación de una
vacuna por parte de un experto en el materia.
Una realización particularmente preferida de la
presente invención se refiere a una vacuna, en la que dicho
adyuvante es una molécula de ADN que comprende motivos CpG
desmetilados.
Ya hace tiempo que se sabe que el ADN contiene
la información genética que hace único a cada individuo. Además de
esta función de la célula como plano detallado, el Dr. Arthur Krieg
ha descubierto recientemente un pequeño fragmento de ADN,
denominado motivo CpG, que produce una potente activación
inmunitaria (Nature (1995), Vol 374, 546). El ADN con motivos CpG
("ADN CpG") puede ser fácilmente sintetizado y con unos costes
reducidos, y utilizarse selectivamente para activar el sistema
inmunitario. Las aplicaciones terapéuticas de la activación
inmunitaria mediada por ADN CpG incluyen aumentar la eficacia de las
vacunas, ayudar al sistema inmunitario a destruir el cáncer y
prevenir o tratar la infección. El ADN es una parte natural del
cuerpo y es posible que sea más seguro que los fármacos que se
utilizan ahora para estimular el sistema inmunitario; véase
solicitud de patente de EE.UU. N.º de serie 08/386,063; 08/461,036;
08/462,799.
Esta invención combina por primera vez la
utilización de un ADN plásmido como vacuna junto con motivos CpG
que contienen oligonucleótidos que actúan como adyuvante de la
vacuna de ADN.
Las propiedades inmunológicas superiores de esta
vacuna se describen en los ejemplos anexos.
Es en particular preferida la vacuna
antiparvovírica, en la que dicha molécula de ADN que comprende
motivos CpG desmetilados es:
TCCATGACGTTCCTGATGCT.
En otra realización particularmente preferida de
la vacuna antiparvovírica de la invención, dicha molécula de ADN
que comprende motivos CpG desmetilados comprendía una cadena
principal de fosforotioato modificada. La modificación del
fosforotioato es particularmente ventajosa, ya que al parecer
también estimula las capacidades adyuvantes de los motivos CpG
desmetilados; véase, por ejemplo, Krieg y otros, loc. cit.
Con la vacuna según la presente invención es
posible obtener una vacunación efectiva incluso si la vacuna sólo
se aplica una vez.
Además, la presente invención se refiere a la
utilización de una vacuna antiparvovírica de la invención para la
vacunación de cánidos, félidos o mustélidos, un procedimiento para
vacunar cánidos, félidos o mustélidos mediante la administración de
una dosis adecuada de la vacuna de la invención a un animal que la
requiera, así como a la utilización de los ingredientes de la
vacuna de la invención mencionados anteriormente en la presente,
tales como los ácidos nucleicos especificados en las diversas
realizaciones o los adyuvantes, tales como los motivos CpG
desmetilados, o cualquier combinación de éstos para la preparación
de una vacuna para la vacunación de cánidos, félidos o mustélidos
contra una enfermedad parvovírica.
Preferiblemente, dichos cánidos, félidos o
mustélidos son perros, gatos o visones. El experto en la materia,
en este caso un veterinario, es perfectamente consciente de qué
dosis y vía de aplicación debería aplicarse. Además, está
familiarizado con el número de aplicaciones de la vacuna así como
con el intervalo de tiempo óptimo entre la primera vacuna y la
vacuna de recuerdo.
En una realización particularmente preferida, la
vacuna según la invención es utilizada para un protocolo de
vacunación en el que la vacuna sólo se aplica una vez y conduce a
una vacunación suficiente ("vacunación de una sola
dosis").
La vacuna de la invención se administra
preferiblemente mediante una de las siguientes vías: intramuscular
mediante aguja y jeringa, intramuscular mediante Biojector 2000®,
intradérmica mediante aguja y jeringa, intradérmica mediante
bombardeo de partículas, intradérmica mediante escarificación,
intravenosa o intraperitoneal.
Los ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo
1
Se produjeron oligonucleótidos
desoxirribonucleicos sintéticos con la secuencia:
AATTCCCCGAAAATATTCATCAACCTGGCTAAGAAGAAGAAAGCTGGC
y la cadena
complementaria:
TCGAGCCAGCTTTCTTCTTCTTAGCCAGGTTGATGAATATTTTCGGGG
que al hibridarse entre sí
contienen proyecciones que se unirán a una secuencia de restricción
Eco RI y Xho I y que, en el marco de lectura adecuado, codifican el
epítopo de célula T de VP1, PKIFINLAKKKKAG. Estos oligonucleótidos
se unieron a las secuencias Eco RI y Xho I en la región pre S2 del
antígeno de superficie de la hepatitis humana B en el plásmido
pCMV-S2S (Michel y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 92 (1995), 5307-5311) en el proceso de
eliminación de la mayor parte de la región pre S2. La construcción
resultante se denominó pCMVS-VP1e. El transcrito de
ARN producido a partir del promotor CMV de esta construcción
contiene un marco abierto de lectura con un codón de iniciación
interno (AUG). Cuando se utiliza el primer ATG, el epítopo VP1,
parte de la región pre S2 y toda la región S son producidas como
una sola proteína. El AUG interno produce sólo la proteína S. Del
mismo modo, los oligonucleótidos desoxirribonucleicos que con la
secuencia:
AATTCAGACGGTGCTGTACAGCCAGATGGAGGACAACCCGCGGTTCGC
y la cadena
complementaria:
TCGAGCGAACCGCGGGTTGTCCTCCATCTGGCTGTACAGCACCGTCTG
codifican el epítopo de péptido
SDGAVQPDGGQPAVR, a partir de VP2, fueron clonados en el
pCMV-S2S de la misma manera que el epítopo VP1. El
plásmido resultante se denominó pCMVS-VP2e. Ambas
secuencias de ADN que codifican estos epítopos son secuencias
artificiales y no representan la secuencia de ADN de parvovirus de
aparición
natural.
Ejemplo
2
Toda la región codificante del VP1 parvovírico
canino (VP1 y VP2) fue clonada mediante amplificación de la
reacción en cadena de la polimerasa (RCP) a partir de sobrenadantes
de cultivos celulares que contenían CPV de tipo 2a. Los cebadores
se localizaban justo fuera del marco abierto de lectura en el caso
de VP1, incluían las secuencias de restricción Not I (en dirección
3') y BamH I (en dirección 5'), y tenían las siguientes
secuencias:
cgg gat ccG AGA CGA CTT GGA TTA AGG
TA para el cebador en dirección 5',
y:
gtg cgg ccg CTA GTT GAT ATG TAA TAA
AC para el cebador en dirección
3'.
El producto de la RCP se restringió
secuencialmente con Not I y BamH I, y se unió al plásmido de
expresión bacteriana pGT36 digerido de un modo similar (Conry y
otros, Cancer Gene Therapy 2 (1) (1995), 33-38) en
el sentido de la orientación. La orientación y la secuencia de VP1
(y VP2) fueron confirmadas mediante secuenciación de ADN de todo el
inserto de VP1. Se hará referencia a este ADN clonado como
pGT36VP1.
Ejemplo
3
Se transfectó un fibroblasto murino (NIH 3T3)
con el clon pGT36VP1. A continuación se analizaron las células en
busca de la presencia de proteínas parvovíricas caninas
inmunorreactivas mediante análisis de inmunofluorescencia con
antisuero canino para parvovirus canino. El patrón de tinción era
indistinguible del de las células infectadas con parvovirus canino,
mientras que los controles negativos (pGT36, no ADN) mostraban
ausencia de tinción, lo que indicaba que el clon pGT36VP1 producía
un producto proteínico identificado por anticuerpos
antiparvovíricos.
Ejemplo
4
Se vacunó a tres perros de 11 semanas de vida
con 150 \mug de pCMVS-VP1e y 100 \mug de
oligonucleótido de fosforotioato sintético TCCATGACGTTCCTGATGCT
(ISO) en el músculo cuádriceps derecho, se vacunó a tres perros de
11 semanas de vida con 150 \mug de pCMVS-VP2e y
con 100 \mug de ISO, y se vacunó a tres perros de 11 semanas de
vida con 150 \mug de pCMVS-VP1e, 150 \mug de
pCMVS-VP2e y 100 \mug de ISO. Al cabo de 3
semanas, se revacunó a los perros con dosis idénticas y se les puso
bajo control para ver si aparecía titulación de anticuerpos de
proteína portadora, antígeno de superficie de la hepatitis B y
epítopos parvovíricos caninos. Se observó una respuesta
considerable de los anticuerpos contra la hepatitis y el parvovirus
canino en los animales de los grupos del pCMVS-VP1e
más pCMVS-VP2e, y del pCMVS-VP2e. No
se esperaba ninguna respuesta de los anticuerpos al parvovirus
canino en el grupo pCMVS-VP1e, ya que éste
representa un epítopo de célula T. Esto se confirmó
experimentalmente. La respuesta fue mayor en el grupo
pCMVS-VP1e más pCMVS-VP2e, lo que
indicaba que la vacuna multivalente era más efectiva.
Ejemplo
5
(a) Uno de tres ratones Balb-c
vacunados con pGT36VP1 manifestó una respuesta inmunitaria, en
particular anticuerpos contra el parvovirus canino, una semana
después del bombardeo de partículas con 1 \mug del plásmido.
(b) Tres perros Beagle jóvenes (edad aproximada
de 6 meses) sin titulación de anticuerpos contra el parvovirus
canino fueron vacunados con 150 \mug de pGT36VP1 y 100 \mug de
ISO en el músculo cuádriceps derecho. Se observó una respuesta
considerable por parte de los anticuerpos contra el parvovirus
canino que inició dentro de las 2 semanas de vacunación en un
animal, y siguió aumentando durante por lo menos 3 semanas en los
tres animales. En un Beagle de control, al que se habían inyectado
los vectores ADN e ISO no se observó aumento de la titulación de
anticuerpos.
(c) Seis perros jóvenes sin titulación de
anticuerpos contra el parvovirus canino fueron vacunados con 400
\mug de pGT36VP1 en el músculo cuádriceps derecho. Tres de estos
perros recibieron otros 400 \mug de ADN procedente de E.
coli como adyuvante inmunoestimulador, que se administró
conjuntamente con pGT36VP1. Los seis perros mostraron respuesta de
los anticuerpos contra el parvovirus dentro de las dos semanas de la
vacunación, con una titulación considerablemente superior a la
considerada protectora en de 3 a 5 semanas. En los tres perros que
recibieron ADN inmunoestimulador, se alcanzó una titulación de
anticuerpos más rápidamente que en los otros perros, lo que indica
un efecto estimulador de la inmunidad CpG positivo.
Ejemplo
6
(a) Los tres perros Beagle vacunados en el
ejemplo 5 fueron expuestos a una dosis trivalente estándar de
parvovirus canino, habitual en los ensayos con vacunas
parvovíricas, por vía intranasal. Ninguno de los perros mostró
signos de enfermedad relacionada con el parvovirus, lo que indica
protección de la enfermedad. En dos perros se observó un ligero
aumento de las respuestas de los anticuerpos contra el parvovirus
canino, que coincidía con la tendencia anterior a la exposición,
sin eliminación fecal de parvovirus, lo que indica protección
completa de la infección. El Beagle de control mostró signos de
enfermedad parvovírica después de la exposición, acompañados de un
aumento radical de la respuesta de los anticuerpos contra el
parvovirus canino.
(b) Cuatro perros jóvenes sin titulación de
anticuerpos contra el parvovirus canino fueron vacunados por vía
intramuscular con dosis de pGT36VP1 que incluían 200, 400, 600, y
800 \mug de plásmido. A la semana, todos los perros habían
fabricado anticuerpos contra el parvovirus canino, que a las 2
semanas alcanzaron una titulación protectora máxima. En un perro de
control negativo al que se inyectó solución salina no se observaron
anticuerpos contra el parvovirus canino. En el perro que recibió
600 \mug de ADN plásmido la titulación de anticuerpos se mantuvo
durante más tiempo que en los otros perros. Todos los perros fueron
revacunados con el mismo preparado y dosis 16 semanas después de la
inyección inicial. Todos los perros excepto el control negativo y el
que recibió una dosis de 200 \mug mostraron una respuesta de
anticuerpos anamnéstica. Todos los perros excepto el control
negativo, además del que recibió la dosis de 200 \mug, mostraron,
tras la reinyección, una titulación de anticuerpos neutralizantes
en suero que se sabe que es protectora. Todos los perros fueron
expuestos, durante 24 semanas después de la inyección inicial, a un
virus natural virulento que consta de tres virus aislados que se
sabe que causan enfermedad en perros vacunados. Todos los perros
vacunados con una vacuna de ácidos nucleicos pGT36VP1 fueron
protegidos de la infección y la enfermedad. El perro de control
negativo presentó una enfermedad clínica característica del
parvovirus canino y eliminó virus a través de las heces. Este
experimento demuestra que las dosis de pGT36VP1 que se hallan entre
200 y 800 \mug de plásmido, administradas como inyección
principal y de recuerdo, estimularon la producción de una titulación
de anticuerpos y protegieron de la exposición virulenta.
(c) Tres perros jóvenes sin titulación de
anticuerpos contra el parvovirus canino fueron inyectados con 150
\mug de pGT36VP1 más 150 g de ADN oligonucleótido sintetizado para
contener CpG óptimos. Todos los perros fabricaron anticuerpos
contra el parvovirus canino y fueron protegidos de la exposición al
virus virulento. Este experimento demuestra que la vacunación con
una dosis más baja de pGT36VP1 conferirá inmunidad protectora cuando
la vacunación se amplifique con oligonucleótidos
inmunoestimuladores.
(d) Seis perros jóvenes sin titulación de
anticuerpos contra el parvovirus canino fueron inyectados con una
sola dosis de 200 o 800 \mug de pGT36VP1. En todos los perros se
observó una titulación de anticuerpos contra el parvovirus canino,
que disminuyó a niveles indetectables a las 12 semanas de la
vacunación. Sin administrarles una vacunación de recuerdo, todos
los perros fueron expuestos a un virus virulento y ninguno se
infectó o se puso enfermo. Este experimento demuestra que la
inmunidad protectora se adquiere después de una única dosis de
pGT36VP1 y esta protección es independiente de la presencia
cuantificable de anticuerpos contra el parvovirus canino. Este
resultado puede interpretarse como resultado de la inmunidad celular
conferida por las células T de memoria inmunológica de vida
larga.
Estos estudios demuestran que las secuencias de
ADN seleccionadas a partir del subgrupo del parvovirus felino, una
vez insertadas en un plásmido de expresión de mamíferos, pueden
transfectar células en cultivo y en animales. Además, se demostró
que nuestros plásmidos de expresión de ADN pueden inducir una
respuesta de los anticuerpos en animales que puede conducir a la
protección frente a una exposición vírica virulenta.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Colpan, Metin
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Uhland Str. 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Essen
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 45219
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacunación con ácidos nucleicos para infecciones parvovíricas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- PRESENTACIÓN INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM o compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCNAARATHT TYATHAAYYT NGCNAARAAR AARAARGCNG GC
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAAAATAT TCATCAACCT GGCTAAGAAG AAGAAAGCTG GC
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTSNGAYGGNG CNGTNCARCC NGAYGGNGGN CARCCNGCNG TNMGN
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGACGGTG CTGTACAGCC AGATGGAGGA CAACCCGCGG TTCGC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCATGACGT TCCTGATGCT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCCCCGA AAATATTCAT CAACCTGGCT AAGAAGAAGA AAGCTGGC
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGCCAGC TTTCTTCTTC TTAGCCAGGT TGATGAATAT TTTCGGGG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Ile Phe Ile Asn Leu Ala Lys Lys Lys
Lys Ala Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCAGACG GTGCTGTACA GCCAGATGGA GGACAACCCG CGGTTCGC
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGCGAAC CGCGGGTTGT CCTCCATCTG GCTGTACAGC ACCGTCTG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln
Pro Ala Val Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGATCCGA GACGACTTGG ATTAAGGTA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGCGGCCGC TAGTTGATAT GTAATAAAC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCATGACGT TCCTGATGCT
\hfill20
Claims (21)
1. Vacuna antiparvovírica, que protege al animal
vacunado de una enfermedad inducida por parvovirus tras la
posterior infección parvovírica, que comprende moléculas de ácidos
nucleicos comprendidas en un plásmido, siendo dicho plásmido
funcional en un mamífero, que codifican por lo menos un epítopo VP1
y/o VP2 específico de parvovirus y un portador farmacéuticamente
aceptable, en el que dicho parvovirus es capaz de infectar cánidos,
félidos, mustélidos, perros, gatos o visones.
2. Vacuna antiparvovírica según la
reivindicación 1, en la que por lo menos uno de dichos epítopos
específicos de parvovirus es un epítopo de célula T.
3. Vacuna antiparvovírica según la
reivindicación 1 ó 2, en la que por lo menos uno de dichos epítopos
específicos de parvovirus es un epítopo de célula B.
4. Vacuna antiparvovírica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichas moléculas de ácidos
nucleicos son moléculas de ADN o moléculas de ARN.
5. Vacuna antiparvovírica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en la que dichas moléculas de ácidos
nucleicos codifican las proteínas de la nucleocápside del parvovirus
VP1 y/o VP2.
6. Vacuna antiparvovírica según la
reivindicación 5, en la que dichas moléculas de ácidos nucleicos
comprenden el marco de lectura abierto completo de VP1.
7. Vacuna antiparvovírica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha vacuna comprende o
dicho plásmido codifica por lo menos un antígeno adicional.
8. Vacuna antiparvovírica según la
reivindicación 7, en la que dicho antígeno adicional es un
inmunogén.
9. Vacuna antiparvovírica según cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 8, en la que dicha molécula de ácido
nucleico que codifica por lo menos un epítopo de célula T se
selecciona del grupo de epítopos codificados por la secuencia
degenerada de ácidos nucleicos:
CCNAARATHTTYATHAAYYTNGCNAARAARAARAARGCNGGC;
donde N representa cualquier base,
R representa purina, Y representa pirimidina y H representa A, C o
T.
10. Vacuna antiparvovírica según la
reivindicación 9, en la que el epítopo codificado por la secuencia
de ácidos nucleicos es:
CCGAAAATATTCATCAACCTGGCTAAGAAGAAGAAAGCTGGC.
11. Vacuna antiparvovírica según cualquiera de
las reivindicaciones 3 a 10, en la que dichas moléculas de ácidos
nucleicos que codifican por lo menos un epítopo de célula B
seleccionado del grupo de epítopos codificados por la secuencia
degenerada de ácidos nucleicos:
TSNGAYGGNGCNGTNCARCCNGAYGGNGGNCARCCNGCNGTNMGN;
donde N representa cualquier base,
R representa purina, Y representa pirimidina, S representa G o C y M
representa C o
A.
12. Vacuna antiparvovírica según la
reivindicación 11, en la que el epítopo codificado por la secuencia
de ácidos nucleicos es:
TCAGACGGTGCTGTACAGCCAGATGGAGGACAACCCGCGGTTCGC.
13. Vacuna antiparvovírica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, que comprende una mezcla de ácidos
nucleicos que codifican tanto epítopos de célula T como de célula
B.
14. Vacuna antiparvovírica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además un adyuvante.
15. Vacuna antiparvovírica según la
reivindicación 14, en la que dicho adyuvante es una molécula de ADN
que comprende motivos CpG desmetilados.
16. Vacuna antiparvovírica según la
reivindicación 15, en la que dicha molécula de ADN que comprende
motivos CpG desmetilados es:
TCCATGACGTTCCTGATGCT.
17. Vacuna antiparvovírica según las
reivindicaciones 15 ó 16, en la que dicha molécula de ADN comprende
un esqueleto con modificación fosforotioato.
18. Uso de las moléculas de ácidos nucleicos tal
y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para
la preparación de una vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17 para la vacunación de cánidos, félidos o
mustélidos.
19. Uso según la reivindicación 18, en el que
dichos cánidos, félidos o mustélidos son perros, gatos o
visones.
20. Uso según las reivindicaciones 18 ó 19, en
el que dicha vacuna se administra mediante una de las siguientes
vías: intramuscular mediante aguja y jeringa, intramuscular mediante
Biojector 2000®, intradérmica mediante aguja y jeringa,
intradérmica mediante bombardeo de partículas, intradérmica mediante
escarificación, intravenosa o intraperitoneal.
21. Uso según las reivindicaciones 18 ó 19, en
el que la inmunización se consigue mediante una sola aplicación de
la vacuna.
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|---|---|---|---|
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