JP2000510344A

JP2000510344A - 改善された標識ヌクレオチド取込み特性を有するｄｎａポリメラーゼ

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Publication number: JP2000510344A
Application number: JP10539892A
Authority: JP
Inventors: ブランディス，ジョン; ブルーム，カーチス; リチャーズ，ジャック
Original assignee: ザパーキン−エルマーコーポレーション
Priority date: 1997-03-12
Filing date: 1998-03-12
Publication date: 2000-08-15
Anticipated expiration: 2018-03-12
Also published as: US20130273526A1; CA2283789C; DE69806003T2; EP2208789B1; JP3435416B2; US20110244548A1; CA2283789A1; WO1998040496A1; US20020164591A1; DE69806003D1; EP2202312A2; DE69841023D1; US7897738B2; EP0983364B1; JP2003144143A; US20150232822A1; EP2208789A1; EP2202312A3; US20060088879A1; EP2202312B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリヌクレオチドへの標識ヌクレオチドに対して低減した差別を示す、変異体DNAポリメラーゼに関する。本発明のDNAポリメラーゼは、酵素のヌクレオチド標識相互作用領域において少なくとも１つの変異を有し、このような変異は標識ヌクレオチドに対して低減した差別をもたらす。ヌクレオチド標識相互作用領域は、Taq DNAポリメラーゼの（ｉ）O-ヘリックス、(ii)K-ヘリックス、および(iii)O-Pヘリックス間ループの部分、または他のDNAポリメラーゼにおける類似の位置に位置する。新規の変異体DNAポリメラーゼを提供することに加えて、本発明はまた、本発明の変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。提供されるポリヌクレオチドは、変異体ポリメラーゼの組換え生成のための発現ベクターを含み得る。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本発明のDNAポリメラーゼを使用する非常に多くの方法（鎖終結配列決定およびPCRのための使用を含む）を含む。本発明の別の局面は、本発明の方法に従って蛍光標識ポリヌクレオチドを合成するためのキットを提供することである。本発明のキットは、本発明の変異体DNAポリメラーゼ、およびキット中の変異体DNAポリメラーゼに関して低減した差別を示す蛍光標識ヌクレオチドを含む。

Description

【発明の詳細な説明】改善された標識ヌクレオチド取込み特性を有するDNAポリメラーゼ発明者：John Brandis，Curtis Bloom、およびJack Richards発明の分野本発明は、標識ヌクレオチドをポリヌクレオチド分子へ取り込む酵素の能力を変える変異を有するDNAポリメラーゼに関する。背景 DNAポリメラーゼは、鋳型DNA鎖および鋳型の一部とアニールされる相補合成プライマーを用いて、デオキシヌクレオチド３リン酸からのDNA分子の形成を合成する酵素である。DNAポリメラーゼおよびそれらの酵素学的特徴の詳細な説明は、Kornberg,DNA Replication第２版,W.H.Freeman(1989)に見出され得る。 DNAポリメラーゼは、研究および臨床応用の両方に適切な分子生物学技術において種々の用途を有する。これらの技術のうち、DNA配列決定および核酸増幅技術（例えば、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)）が最も重要である。多くのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列が決定されている。異なるDNAポリメラーゼ間の配列比較により、異なる酵素間での多くの相同性領域が同定された。Ｘ線回析研究により、クレノウフラグメント、T7 DNAポリメラーゼ、およびTaq DN Aポリメラーゼの３次構造が決定された。DNAポリメラーゼ３次構造およびアミノ酸配列比較の研究により、多様なDNAポリメラーゼ間の非常に多くの構造類似性が明らかになった。一般的に、DNAポリメラーゼは、２重鎖DNAの結合を提供すると考えられる大きな裂け目(cleft)を有する。この裂け目は、２組のヘリックスにより形成され、第１の組は「指(finger)」領域と呼ばれ、そしてヘリックスの第２の組は「親指(thumb)」領域と呼ばれる。裂け目の底は逆平行βシートにより形成され、そして「手のひら(palm)」領域と呼ばれる。DNAポリメラーゼ構造の概説は、JoyceおよびSteitz,Ann.Rev.Biochem.63:777-822(1994)において見出され得る。いくつかのDNAポリメラーゼの３次元構造を記載するコンピューターが判読可能なデータファイルは、公に普及している。蛍光標識ヌクレオチドは、分子生物学における多くの手順の有用性を非常に単純にし、そして改善した。合成手順においてポリヌクレオチドを標識するための蛍光標識ヌクレオチドの使用は、大部分は、放射性標識の使用に取って代わった。蛍光標識ヌクレオチドは、DNA配列決定において（Smithら、Nature 321:674-6 79(1986)を参照のこと）、PCRおよび他の形態のポリヌクレオチドフラグメント分析において広く使用されている。蛍光標識ヌクレオチドを使用することに伴う主な問題は、蛍光標識ヌクレオチドの取込みを差別するDNAポリメラーゼの能力である。例えば、本発明者らは、T ET(6-カルボキシ-4,7,2',7'-テトラクロロフルオレセイン)標識2',3'ジデオキシヌクレオチドと対応する非標識ジデオキシヌクレオチドとの間の競合アッセイにおいて、Taq DNAポリメラーゼが、非標識ジデオキシヌクレオチドを、対応する標識ヌクレオチドよりも少なくとも85倍頻繁に、DNAに取り込むことを発見した。標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドとの間のこの差別は、DNAを標識するためにDNAポリメラーゼを使用する手順に絶大な影響を有する。例えば、非常に多量の蛍光標識ヌクレオチドが配列決定反応において使用されなければならない。この多量の蛍光標識ヌクレオチドは高価であり、そして過度のバックグラウンド蛍光を生じ、それにより配列情報の収率が低減され得る。蛍光標識ヌクレオチドの取込みを差別するDNAポリメラーゼの能力から生じる問題を考慮して、本発明者らは、１つ以上の蛍光標識ヌクレオチドのDNAへの取込みに対する差別が低減した、いくつかの新規のDNAポリメラーゼを開発した。要旨天然に生じるDNAポリメラーゼは、非標識ヌクレオチドを、対応する蛍光標識ヌクレオチドよりも優先的にポリヌクレオチドに取り込む。蛍光標識ヌクレオチドを差別するDNAポリメラーゼのこの能力は、蛍光標識ヌクレオチドの酵素的付加を必要とする多くの分子生物学手順（例えば、標識ジデオキシターミネーター配列決定）に望ましくない影響を有する。本発明は、ポリヌクレオチドへの蛍光標識ヌクレオチドに対する低減した差別を示す変異体DNAポリメラーゼに関する。本発明のDNAポリメラーゼは、変異が蛍光標識ヌクレオチドに対する低減した差別をもたらすように、酵素のヌクレオチド標識相互作用領域において少なくとも１つの変異を有する。DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域は、T aq DNAポリメラーゼのO-ヘリックス、(ii)Kヘリックス、および(iii)O-Pヘリックス間ループの一部、または他のDNAポリメラーゼにおける類似の部分により形成される。TET(II)・ddCにより定義されるような、ヌクレオチド標識相互作用領域内のアミノ酸残基は、E520、A531、L522、R523、E524、A525、H526、P527、I5 28、V529、E530、K531、I532、R536、E537、R573、Q582、N583、V586、R587、P5 89、Q592、R593、R595、D610、T612、Q613、E615、R636、D637、T640、F647、V6 54、D655、P656、L657、R659、R660、T664、E681、L682、A683、I684、P685、E6 88、F692、Q754、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832である。R660、T6 64、およびE681の部位は、変異を導入するのに好ましい部位である。フルオレセイン型色素を用いた使用のための本発明の好ましい実施態様において、変異は68 1位に存在し、E（グルタミン酸）をM（メチオニン）に変換する（すなわち、E68 1M）。フルオレセイン−フルオレセインエネルギー移動色素を用いた使用のための本発明の好ましい実施態様において、変異は657位に存在し、L（ロイシン）を G（グリシン）に変換する。標識ヌクレオチドに対する差別が低減した変異体Taq DNAポリメラーゼを提供することに加えて、本発明は、広範な種々のDNAポリメラーゼ（耐熱性およびその他の両方）に由来する変異体を含む。新規の変異体DNAポリメラーゼを提供することに加えて、本発明はまた、本発明の変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。提供されるポリヌクレオチドは、変異体ポリメラーゼの組換え生成のための発現ベクターを含み得る。本発明はまた、本発明のポリメラーゼポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。本発明はまた、本発明のDNAポリメラーゼを使用する非常に多くの方法を含む。本発明の方法は、標識ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの取込みに対する差別が低減した変異体DNAポリメラーゼにより触媒されるポリヌクレオチド合成反応により、蛍光標識ポリヌクレオチドを合成する工程を含む。ポリヌクレオチド合成の本発明の方法は、プライムされるポリヌクレオチド鋳型を少なくとも１つの蛍光標識ヌクレオチドを用いて伸長する工程を含み、ここで伸長は、ポリヌクレオチドへの標識ヌクレオチドに対する差別が低減したDNAポリメラーゼにより触媒される。蛍光標識ポリヌクレオチドを合成する本発明の方法は、種々の方法（例えば、サンガー配列決定およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)）において使用され得る。本発明の別の局面は、本発明の方法に従って蛍光標識ポリヌクレオチドを合成するためのキットを提供することである。本発明のキットは、本発明の変異体DN Aポリメラーゼ、およびキット中の変異体DNAポリメラーゼに関して低減した差別を示す蛍光標識ヌクレオチドを含む。図面の簡単な説明図１は、Taq DNAポリメラーゼに結合したDNAのコンピューターモデルである。ヌクレオチド標識相互作用部位を形成するアミノ酸残基は、オレンジ色で強調される。ポリメラーゼの残部は緑色で示される。鋳型は青色で示される。標識ヌクレオチドの色素部分は赤色である。標識ヌクレオチドの残部は白色である。図２は、次ヌクレオチド効果アッセイ(next nucleotide effect assay)のプロットである。図３は、次ヌクレオチド効果アッセイのプロットである。図４は、蛍光標識ヌクレオチド「TET(II)・ddCTP」の構造の図である。本発明の特定の実施態様の詳細な説明用語 DNAポリメラーゼ内のアミノ酸残基の位置は、数字または数字／文字の組み合わせのいずれかにより示される。番号付けは、アミノ末端残基から始まる。文字は、変異体が由来する天然に生じる酵素における示された位置でのアミノ酸残基についての一文字アミノ酸コードである。特に他に示されなければ、アミノ酸残基の位置の名称は、一文字アミノ酸コードが、Taq DNAポリメラーゼにおける示された位置でのアミノ酸残基に具体的に関係しているとはいえ、全てのDNAポリメラーゼにおける類似の位置を言うと解釈されるべきである。個々の置換変異は、文字／数字／文字の組み合わせの形態により示される。文字は、アミノ酸残基の一文字コードである。数字は、変異部位のアミノ酸残基の位置を示す。数字付け系は、アミノ末端残基から始まる。Taq DNAポリメラーゼにおける残基の数字付けは、米国特許第5,079,352号(Gelfand)に記載される通りである。異なるDNAポリメラーゼ間のアミノ酸配列相同性は、対応する位置が、T aq以外のDNAポリメラーゼのアミノ酸残基に割り当てられることを可能にする。他に示されなければ、所定の数字は、Taq DNAポリメラーゼにおける位置をいう。最初の数字（すなわち、数字の左側の文字）は、非変異体酵素における示された位置でのアミノ酸残基を示す。第２の文字は、変異体酵素における同じ位置でのアミノ酸残基を示す。例えば、用語「R660D」は、660位でのアルギニンがアスパラギン酸残基により置換されたことを示す。本明細書中で使用する用語「差別」は、非標識ヌクレオチドを、対応する蛍光標識ヌクレオチドよりも優先的にDNAに取り込む、DNAポリメラーゼの特性（すなわち、DNAポリメラーゼが蛍光標識ヌクレオチドを差別すること）をいう。優先的な取り込みは、蛍光標識2',3'ジデオキシヌクレオチドおよび対応する非標識2 ',3'ジデオキシヌクレオチドがポリヌクレオチドの同じ部位への取り込みについて競合するアッセイにおいて測定され得る。このようなアッセイの例は、以下の実施例２において見出され得る。本明細書中で使用する用語「低減した差別」は、親酵素と比較した場合の、変異体DNAポリメラーゼにおける蛍光標識ヌクレオチド取り込みに対する差別の低減をいう。差別の低減は、実施例２における選択性アッセイへの参照により、またはポリメラーゼの同じ特性の測定を提供する他のアッセイへの参照により定量的に説明され得る。選択性アッセイにより測定されるような選択性数の低減は差別の低減であり、そして選択性数の比により表され得る。例えば、選択性数８を有する変異体DNAポリメラーゼは、選択性数80を有する親DNAポリメラーゼと比較した場合、差別の10倍の低減を有する。用語「親」または「親酵素」は、変異体DNAポリメラーゼと変異体酵素が由来するDNAポリメラーゼとを区別するために使用される。従って、任意の天然に生じるDNAポリメラーゼが親酵素と呼ばれ得る。天然に生じる酵素に関して変異を有する第１のDNAポリメラーゼもまた、さらなる変異を有する第２のDNAポリメラーゼに関して親酵素と呼ばれる。用語「差別を低減する変異」は、蛍光標識ヌクレオチド取り込みに対して低減した差別をもたらす、DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域における変異をいう。この用語は、蛍光標識ヌクレオチドに対する差別を低減しない、 DNAポリメラーゼにおける変異（ヌクレオチド標識相互作用領域における変異を含む）と差別を低減させる変異とを区別するために使用される。本明細書中で使用する用語「ヌクレオチド」は、特に他に言及しない限り、天然に生じるヌクレオチドおよび種々のアナログ（2',3'ジデオキシヌクレオチドを含む）の両方を広く言うために使用される。用語「フルオレセイン型色素」は、以下の縮合３環系：を含むキサンテン色素分子のクラスを言い、ここで広範な種々の置換が各デオキシ環位置で可能である。特に好ましいフルオレセイン型色素のサブセットは、4, 7-ジクロロフルオレセイン(Menchen)を含む。DNA配列決定法における蛍光標識として使用されるフルオレセイン型色素の例は、6-カルボキシフルオレセイン(6-F AM)、5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)、6-カルボキシ-4,7,2',7'-テトラクロロフルオレセイン(TET)、6-カルボキシ-4,7,2',4',5',7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、5-(および6)カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン(JOE)、ならびに5-カルボキシ-2',4',5',7'-テトラクロロフルオレセイン(ZOE)を含む。しばしば、名称-1または-2は、特定の色素の略語の後に置かれる（例えば、HEX-1）。「-1」および「-2」（または「I」および「II」）の名称は、特定の色素の異性体が使用されることを示す。１異性体および２異性体は、C-8カラムおよび15％アセトニトリル／85％0.1M酢酸トリエチルアンモニウムから35％アセトニトリル／65％0.1M酢酸トリエチルアンモニウムへの溶出勾配を利用する逆相クロマトグラフィー分離系における遊離色素の溶出順序（１異性体は、最初に溶出する異性体である）により定義される。用語「アルキニルアミノ型リンカー」は、米国特許第5,047,519号（Hobbs）、米国特許第5,151,507号(Hobbs)、および1996年８月13日に出願された米国特許出願第08/696,808号に記載されるような型のアルキニルアミノリンカーを言う。さらなるアルキニルアミノ型リンカーは、1997年４月10日に出願された、米国特許出願第08/833,855号において記載される。用語「TET(II)・ddCTP」は、図４に示される構造の蛍光標識ヌクレオチドを言う。用語「蛍光エネルギー移動色素」は、２つの色素部分間の蛍光エネルギー移動を可能にするリンカーにより結合された色素部分を言う。鎖終結配列決定における使用のために、リンカーは十分小さく、そしてDNAポリメラーゼが目的の色素で標識されたヌクレオチド３リン酸を取込むのを可能にするのに適切な形状および方向のリンカーである。エネルギー移動色素の例は、欧州特許出願番号EP 0 8 05 140、米国特許出願第08/642,330号（1996年３月３日に出願）、および米国特許出願第08/726,462号（1996年10月４日に出願）において見出され得る。本明細書中で使用する用語「変異」は、タンパク質の特定の位置でのアミノ酸残基における変化を言う。アミノ酸残基における変化は、天然に生じるタンパク質に関して定義される変化である。変異を有するタンパク質は、「変異体」タンパク質と呼ばれ得る。発明の実施態様本発明は、蛍光標識ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの取り込みを差別するポリメラーゼの能力を低減する変異を含むDNAポリメラーゼに関する。これらの変異は、本明細書中で「ヌクレオチド標識相互作用領域」と呼ばれる、DNAポリメラーゼ分子の領域にある。ヌクレオチド標識相互作用領域は、DNAポリメラーゼの３つの領域の部分により形成される。これらの３つの領域は、Taq DNAポリメラーゼの(ｉ)O-ヘリックス、(ii)Kヘリックス、および(iii)O-Pヘリックス間ループ、または他のDNAポリメラーゼにおける類似の位置に位置する。蛍光標識ヌクレオチドに対する差別を低減したDNAポリメラーゼは、2',3'ジデオキシヌクレオチドを用いる鎖終結DNA配列決定（すなわち、サンガー型配列決定）に特に有用である。 Taq DNAポリメラーゼおよび蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを用いて行われた酵素反応速度実験（実施例２および３に記載される）は、Taq DNAポリメラーゼおよび他のDNAポリメラーゼが、DNA合成間のヌクレオチド結合の際に立体配座シフトを受けるという理論を支持する。この予測された立体配座シフトは、ヌクレオチドの核酸塩基にリンカーにより結合された蛍光標識と相互作用し、それにより蛍光標識されたヌクレオチドに対する差別をもたらす、１組のアミノ酸残基を示唆する。この組のアミノ酸残基は、ヌクレオチド標識相互作用領域を形成する。出願人により提案された蛍光標識ヌクレオチドのDNAポリメラーゼへの結合についての特定の分子モデルは、所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域を形成するアミノ酸残基を予測するために使用される。DNA合成間のD NAポリメラーゼにおける立体配座シフトについての出願人のモデルは、ヌクレオチド標識相互作用領域がどのように決定されたかについての説明として提供される。このモデルは、蛍光標識ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの取り込みを差別するDNAポリメラーゼの能力を低減する、DNAポリメラーゼにおける変異を作製することに指針を提供する。図１は、どのようにDNAおよびTaq DNAポリメラーゼがこのモデルにおいて相互作用するかを示すコンピューターモデルである。DNA ポリメラーゼ-ヌクレオチド相互作用の真の機構は、ヌクレオチド標識相互作用領域のパラメーターを決定するために使用されたモデルと同じでも異なっても、本明細書中に記載の発明の実施可能性を限定しない。本発明の変異体DNAポリメラーゼは、フルオレセイン型色素で標識されたヌクレオチドに対して低減した差別を示す。言い換えれば、本発明の変異体DNAポリメラーゼは、対応する非標識ヌクレオチドと比較して、フルオレセイン型色素標識ヌクレオチドを取り込むポリメラーゼの能力を増大させる少なくとも１つの変異を含む。フルオレセイン型色素で標識されたヌクレオチドに対する低減した差別に加えて、本発明の変異体DNAポリメラーゼはまた、フルオレセイン型色素でない他の蛍光色素で標識されたヌクレオチドに対する低減した差別、ならびに他の検出可能な部分に対する低減した差別を示し得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの所定の実施態様が低減した差別を示す蛍光標識ヌクレオチドは、特定の蛍光標識、蛍光標識をヌクレオチドに付着させるために使用されるリンカー、蛍光標識上のリンカーの付着部分、選択される特定のヌクレオチド塩基、およびヌクレオチド上のリンカーの付着部位に関して変化し得る。蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の低減の正確な程度は、DNAポリメラーゼに導入される特定の変異に従って変化する。差別の低減の正確な程度はまた、アッセイされる特定の蛍光標識ヌクレオチド（例えば、塩基、色素、またはリンカーにおける変化）に従って変化する。本発明の変異体DNAポリメラーゼは、だいたい、蛍光標識ヌクレオチドに対する差別のわずかな低減から、差別の完全な排除（すなわち、変異体酵素は、標識または非標識ヌクレオチドの取り込み率に関して有意に違わない）までを示し得る。１つ以上のフルオレセイン型色素標識ヌクレオチドに対する差別の少なくとも２倍の低減を有する、本発明の変異体DNAポリメラーゼの実施態様を使用することが好ましい。所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域は、特定の蛍光標識ヌクレオチドに関して定義されることが、分子生物学の当業者により認識される。蛍光標識ヌクレオチドの構造についての以下のパラメーターの１つ以上における変化は、所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用部位を形成するアミノ酸残基の同一性を変え得る：（１）塩基の同一性、（２）ヌクレオチド塩基上の付着部位、（３）塩基を蛍光色素に結合するリンカーの同一性、および（４）蛍光色素の同一性。TET(II)・ddCTPに関して定義されるTaqのヌクレオチド標識相互作用領域は、アミノ酸残基E520、A531、 L522、R523、E524、A525、H526 、P527、I528、V529、E530、K531、1532、R536、E537、R573、Q582、N583、V586 、R587、P589、Q592、R593、R595、D610、T612、Q613、E615、R636、D637、T640 、F647、V654、D655、P656、L657、R659、R660、T664、E681、L682、A683、I684 、P685、E688、F692、Q754、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832を含む。R660、T664、およびE681の部位は、変異を導入するのに好ましい部位である。 Taq DNAポリメラーゼ（および他のDNAポリメラーゼ）の３次元構造が周知であり、そしてTET(II)・ddCTPの３次元構造が高度の確信をもって理解されるのであれば、TET(II)・ddCTPに関する標識ヌクレオチド相互作用領域を構成するアミノ酸残基の位置は、TET(II)・ddCTPと他の蛍光標識ヌクレオチドとの間の構造差違を適応させて、他のヌクレオチドに関する標識ヌクレオチド相互作用部位を定義するように、異なる組のアミノ酸残基に書き換えられ得る。例えば、塩基、塩基付着部位、および蛍光色素が同じであっても、塩基と蛍光標識と塩基との間のリンカーの長さの増加は、標識ヌクレオチド相互作用部位を形成するアミノ酸残基の同一性を予測可能に変え得る。本発明のポリメラーゼの多くの実施態様において、所定の蛍光標識ヌクレオチドに関する標識ヌクレオチド相互作用部位を形成するアミノ酸残基の組は、第２の蛍光標識ヌクレオチドに関して定義されるような標識ヌクレオチド相互作用部位を形成するアミノ酸残基の組と重複する。本発明の実施態様は、フルオレセイン型色素で標識されたヌクレオチドに対して低減した差別を示す変異体DNAポリメラーゼを含み、ここでフルオレセイン型色素は、アルキニルアミノ型リンカーによりヌクレオチド塩基に結合される。フルオレセイン型色素は、エネルギー移動色素の成分としてフルオレセイン型色素部分を含む、蛍光エネルギー移動色素であり得る。アルキニルアミノ型リンカーを含む蛍光標識ヌクレオチドに対する低減した差別に加えて、本発明の変異体DN Aポリメラーゼはまた、他の型のリンカーを含むヌクレオチドに対して低減した差別を示し得る。ポリヌクレオチドと蛍光標識との間の立体障害を最小にするために、プリンは、通常、７位に標識され、そしてピリミジンは、通常、５位に標識される。本発明の変異体DNAポリメラーゼは、所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域内のアミノ酸残基位置で差別を低減する１つ以上の変異を有する。差別を低減する変異は、通常（必ずしもそうではないが）置換変異である。いくつかの異なるアミノ酸残基は、差別を低減する変異を生じるように、親酵素の所定の位置で置換され得る。ヌクレオチド標識相互作用領域内の所定の残基位置でのアミノ酸残基は系統的に変えられて、その結果、どのアミノ酸置換が、目的のフルオレセイン型色素標識ヌクレオチド色素に対する差別の低減をもたらすのかを、およびこのような差別の低減の程度を決定し得る。特定の変異（または変異の組）が差別を低減する程度は、実施例２に記載のような選択性アッセイにより測定され得る。置換変異は、好ましくは（必ずしもそうではないが）、親DNAポリメラーゼに存在するアミノ酸残基のアミノ酸残基側鎖の大きさを低減する変異である。変異は、好ましくは（必ずしもそうではないが）、親分子の類似の位置でのアミノ酸残基の特定の極性または非極性特徴を維持するように保存的である。DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域における変異は、好ましくは、親酵素のアミノ酸残基のファージT7 DNAポリメラーゼの対応する位置でのアミノ酸残基での置換をもたらす（ただし、T7ポリメラーゼおよび親酵素におけるその位置でのアミノ酸残基間の差違は存在する）。差別を低減する変異は、DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域にある。ヌクレオチド標識相互作用領域は、DNAポリメラーゼの３つの領域の部分により形成される。これらの３つの領域は、Taq DNAポリメラーゼの(ｉ)O-ヘリックス、(ii)Kヘリックス、および(iii)O-Pヘリックス間ループ、または他のDNA ポリメラーゼにおける類似の位置に位置する。ヌクレオチド標識相互作用領域を形成するTaq DNAポリメラーゼにおける位置は、位置E520、A531、L522、R523、E 524、A525、H526、P527、I528、V529、E530、K531、1532、R536、E537、R573、Q 582、N583、V586、R587、P589、Q592、R593、R595、D610、T612、Q613、E615、R 636、D637、T640、F647、V654、D655、P656、L657、R659、R660、T664、E681、L 682、A683、I684、P685、E688、F692、Q754、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832である。Taq以外のDNAポリメラーゼにおける類似の位置もまた、ヌクレオチド標識相互作用領域に由来する。置換変異に好ましい位置は、R595、D655 、R660、およびE681である。変異に特に好ましい位置はE681であり、681位での好ましい置換はＭである。E681での他の適切な置換変異は以下の通りである（おおよそ同等であることを示す＝により示す場合を除いて、優先度が減る順番に列挙される）：Ｍ＞Ｉ＞Ｗ＞Ｌ＞Ｖ＞Ｐ＞Ｈ＝Ｋ＝Ｇ＝Ｔ＝Ｓ＞Ｄ＝Ａ＝Ｎ＞Ｙ＝Ｃ。R660位での好ましい置換変異はR660Dである。ヌクレオチド相互作用領域を形成する特定のアミノ酸残基は、差別を低減する変異の導入のために親酵素として選択される特定のDNAポリメラーゼに従って変化する。異なるDNAポリメラーゼ間の類似のアミノ酸残基位置の決定は、多数のD NAポリメラーゼのアミノ酸配列が決定されており、そして多くの相同性領域が、これらの異なるDNAポリメラーゼ間で見出されているので、当業者により容易に達成され得る。例えば、広範な生物に由来するDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の大規模な編集、およびこの配列間の相同性整列は、BraithwaiteおよびIto,Nuc l.Acids Res. 21(4):787-802(1993)において見出され得る。ファージT7ポリメラーゼおよびE.coli DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域内のアミノ酸残基の例は、表１に提供される。Taq、T7、およびE.coli DNAポリメラーゼIにおいて、フルオレセイン型色素に対する差別が低減した変異体DNAポリメラーゼを提供することに加えて、本発明は、多くの他の生物に由来する変異体DNAポリメラーゼを提供する。一般的に、本発明の教示は、Taqポリメラーゼにおける位置E520、A531、L522、R523、E524、A525、H526、P527、I528、V529、E530、K531 、I532、E537、R573、V586、R587、P589、Q592、R593、R595、D610、T612、Q613 、E615、R636、T640、F647、V654、D655、P656、L657、R659、R660、T664、E681 、L682、A683、I684、P685、E688、F692、Q754、L817、E820、L828、K831、およびE832と類似する、DNAポリメラーゼにおける１つ以上のアミノ酸残基位置を当業者が同定するのを可能にするのに十分な、Taq DNAポリメラーゼに対するアミノ酸配列相同性を共有する任意のDNAポリメラーゼに由来する、フルオレセイン型色素に対する差別が低減した変異体DNAポリメラーゼを生成するために使用され得る。ヌクレオチド標識相互作用領域において差別を低減する変異を含むように改変され得る親DNAポリメラーゼは、Thermus flavus、Pyrococcus furiosus、 Thermotoga neapolitana、Thermococcus litoralis、Sulfolobus solfataricus ，Thermatoga maritima、E.coliファージT5、およびE.coliファージTのような生物に由来するDNAポリメラーゼを含むが、それらに限定されない。DNAポリメラーゼは耐熱性でもよく、または耐熱性でなくてもよい。本発明により、当業者は、フルオレセイン型色素差別を低減する変異を、広範な種々の生物に由来するDNA ポリメラーゼ（提供される本願の出願時に単離されていなかったDNAポリメラーゼを含む）に導入し得ることが認識される。さらに、本発明の実施態様は、蛍光標識ヌクレオチドに対する所望の低い程度の差別を有する、いくつかの精製された天然に生じるDNAポリメラーゼを含む。このような天然に生じるDNAポリメラーゼは、構造的および機能的に、本明細書中に明白に記載された変異体DNAポリメラーゼと類似する。所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域を構成するアミノ酸残基は、ヌクレオチド標識相互作用領域を定義するために使用される特定の蛍光標識ヌクレオチドに従って変化する。同様に、差別を低減する変異である変異は、標識ヌクレオチド相互作用領域を定義するために使用される特定の蛍光標識ヌクレオチドに従って変化し得る。さらに、標識ヌクレオチド相互作用部位における変異により達成される差別低減の程度は、目的の特定の標識ヌクレオチドにより変化し得る。例えば、E681Mは、差別の47倍の低減および第２の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の有意に低い低減をもたらす、TET(II)・ddCTPに関してTaq において差別を低減する好ましい変異である。反対に、E681T変異は、第２の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の高レベルの低減、およびTET(II)・ddCTPに対する差別の単に低レベルの低減をもたらし得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼが、特定の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の有意な程度の低減をもたらし、そして別の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の低減の程度においてほとんどまたは全く低減をもたらさない、ヌクレオチド標識相互作用領域における差別を低減する変異を有し得るのであれば（親DNAポリメラーゼによるその蛍光標識ヌクレオチドに対する有意な差別があると仮定する）、所定の変異体DNAポリメラーゼは、１つ以上の所定の蛍光標識ヌクレオチドに関して「受容性である」と言われ得る。特定の変異体DNAポリメラーゼは、目的の特定の酵素のヌクレオチド標識相互作用部位における差別を低減する変異が、所定の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の少なくとも５倍の低減をもたらす場合、特定の蛍光標識ヌクレオチドに関して「受容性である」と言われる。本発明の変異体DNAポリメラーゼは、１を超える蛍光標識ヌクレオチドに関して受容性であり得る。反対に、特定の蛍光標識ヌクレオチドは、本発明の所定の変異体DNAポリメラーゼに関して「受容性であり」得る。ヌクレオチド標識相互作用領域において差別を低減する１を超える変異を含む、本発明の変異体DNAポリメラーゼの実施態様において、変異部位は、ヌクレオチド標識相互作用領域を形成するポリメラーゼの３つの領域の同じ領域または異なる領域にあり得る。一般的に、本発明の変異体DNAポリメラーゼは、差別を低減する、１、２、または３つの変異を有する。しかし、本発明はまた、差別を低減する３を超える変異を有する変異体DNAポリメラーゼを提供する。差別を低減する複数の変異を組み合せることにより、標識ヌクレオチド差別のより大きな低減レベルが達成され得る。しかし、本発明の多くの実施態様において、変異体DNA ポリメラーゼは、ヌクレオチド標識相互作用領域において単一の差別低減変異を有するDNAポリメラーゼのレベルと同じかまたはより少ない、低減した標識ヌクレオチド差別のレベルを有する。Taq DNAポリメラーゼ背景における好ましい変異の組み合わせは、R660D、E681G、およびF667Yである（すなわち、Taq DNAポリメラーゼ変異体(R660D、E681G、およびF667Y))。ヌクレオチド標識相互作用領域において変異を有するDNAポリメラーゼの異なる実施態様は、特定の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の低減の程度に関して異なる。これらの差違は、どの特定の実施態様が目的の特定の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の最も大きな程度の低減を有するかを決定するためのアッセイにより測定され得る。一般的に、このようなアッセイは、プライムされる鋳型上の同じ部位への取り込みについての、蛍光標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドとの間の競合を測定する。このようなアッセイの１つの例（本明細書中で「選択性アッセイ」と呼ばれる）は、以下の実施例２において詳細に記載される。本発明の変異体DNAポリメラーゼは、ヌクレオチド標識相互作用領域における差別低減変異に加えて非常に多くの変異を含み得る。これらの２次変異は、ヌクレオチド標識相互作用領域の内部または外部のいずれかであり得る。２次変異は、変異体DNAポリメラーゼに、ある有用な特性を有するかまたは与えるように選択され得る。例えば、さらなる変異は、耐熱性を増大させる、耐熱性を減少させる、進行(processivity)を増加させる、進行を減少させる、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を減少させる、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を増加させる、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少させる、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を増加させる、そしてジデオキシヌクレオチド取り込みを増加させるために導入され得る。あるいは、２次変異は、本質的に、既知の効果に何の変化ももたらさないかもしれない。 3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を低減する１つ以上の２次変異を含む、本発明の変異体DNAポリメラーゼの実施態様が特に興味深い。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性が欠損しているDNAポリメラーゼは、PCRおよび鎖終結ポリヌクレオチド配列決定に優れた特性を有する。DNAポリメラーゼにおいて3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を低減する変異は、当業者に周知である。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を低減する変異を導入する方法についての詳細な指針は、特に、米国特許第4,795,69 9号(Tabor)；米国特許第5,541,099号；米国特許第5,489,523号；およびBernadら，Cell 59:219-228(1989)において見出され得る。Taq DNAポリメラーゼにおけるこのような変異の例は、G46Dを含む。配列決定のために使用される変異体DNAポリメラーゼの実施態様について、ヌクレオチド標識相互作用領域における変異に加えて、G46D（またはTaq以外のDNAポリメラーゼにおける類似の変異）を含むことが好ましい。本発明のDNAポリメラーゼ変異体における２次変異のうち、ジデオキシヌクレオチド取り込みを増大させる（すなわち、デオキシヌクレオチドとは対照的に、ジデオキシヌクレオチドを差別するDNAポリメラーゼの能力を低減する）変異もまた興味深い。このような変異を作製することについての指針は、特に、公開されたPCT出願WO96/12042（出願番号PCT/US95/12928）に見出され得る。Taqにおける変異F667Yおよび他のDNAポリメラーゼにおける類似の変異が特に興味深い。F6 67Yは、Tet(II)・ddLTPに関するTaq DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域の一部分ではないが、一方、F667Y変異は、フルオレセイン型色素標識ヌクレオチドに対する差別を低減し得る（表１を参照のこと）。従って、特定の手順（例えば、DNA配列決定）における使用のために、デオキシヌクレオチドと2', 3'ジデオキシヌクレオチドとの間のポリメラーゼの差別を低減するように、F667 Y変異と、ヌクレオチド標識相互作用領域における差別を低減する１つ以上の変異とを組み合せることが望ましい。F667Y変異（またはその等価物）を有する本発明の変異体DNAポリメラーゼは、蛍光標識2',3'ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーターを用いるサンガー型DNA配列決定に特に有用である。 DNAポリメラーゼをコードする非常に多くの遺伝子が単離および配列決定されている。この配列情報は、公にアクセス可能なDNA配列データベース（例えば、G ENBANK）において利用可能である。広範な生物からのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の大規模な編集は、BraithwaiteおよびIto,Nucl.Acids Res.21(4):787-80 2(1993)に見出され得る。この情報は、本発明のDNAポリメラーゼおよびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチドの種々の実施態様を設計することにおいて使用され得る。公に利用可能な配列情報はまた、ハイブリダイゼーションプローブを用いた遺伝子ライブラリースクリーニングのような技術によりDNAポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニングするために使用され得る。本発明の他の実施態様は、本明細書中に提供される変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列である。本発明の変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、変異体DNAポリメラーゼの組換え生成のために使用され得る。蛍光標識ヌクレオチドに対する差別が低減した変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、種々の方法により生成され得る。蛍光標識ヌクレオチドに対する差別が低減した変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を生成する好ましい方法は、差別を低減する所望の変異を、親DNAポリメラーゼ分子をコードするポリヌクレオチドに導入するために部位特異的変異誘発を使用することによる方法である。部位特異的変異誘発技術は、米国特許第4,711,848号；米国特許第4,873,192号；米国特許第5,071,743 号；米国特許第5,284,760号；米国特許第5,354,670号；米国特許第5,556,747号; ZollerおよびSmith,Nucleic Acids Res.10:6487-6500(1982)、ならびにEdelman らDNA 2:183(1983)により例示されるように当該分野で周知である。部位特異的変異誘発についての詳細なプロトコルはまた、多くの一般的な分子生物学教科書（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning a Laboratory Manual第２版,Cold S pring Harbor Press,Cold Spring Harbor(1989)、Ausubelら、Current Protocol s inMolecular Biology(最新版)）に与えられる。さらに、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）に関する多くの教科書（例えば、DiefenbachおよびDveksler,PCR Prime r:A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(199 5)）は、指定された変異を導入するためにPCRを使用する方法を記載する。親DNA ポリメラーゼをコードする遺伝子は、公に利用可能な配列情報と共に従来のクローニング技術を使用して単離され得る。あるいは、DNAポリメラーゼをコードする、多くのクローニングされたポリヌクレオチド配列は、公に利用可能な収集サイト(site)に寄託されている（例えば、American type culture collecti on寄託物受託番号ATCC 40336は、Taq DNAポリメラーゼのファージクローンである）。親DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドへの指定された変異を導入することにより、本発明の変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを生成することに加えて、主にインビトロDNA合成技術により本発明のポリヌクレオチドを生成することが（難しいが）可能である。インビトロDNA合成技術は当業者に周知であり、そしてインビトロDNA合成の例は、米国特許第5,252,530 号；米国特許第4,973,679号；米国特許第5,153,319号；米国特許第4,668,777号；米国特許第4,500,707号；米国特許第5,132,418号；米国特許第4,415,732号；米国特許第4,458,066号；および米国特許第4,811,218号に見出され得る。インビトロDNA合成により関連ポリヌクレオチド分子を生成する場合、通常、より小さな分子が最初に生成され、その後に、ハイブリダイゼーションおよび連結により共に結合される。変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドはまた、クローニングされた遺伝子のインビトロ合成および部位特異的変異誘発の組み合わせにより生成され得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドは、変異体DNA ポリメラーゼの組換え発現のために使用され得る。一般的に、変異体DNAポリメラーゼの組換え発現は、変異体DNAポリメラーゼを、特定の型の宿主細胞における使用に適合させた発現ベクターに導入することによりもたらされる。従って、本発明の別の局面は、ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドが発現ベクターに機能的に挿入されるような、本発明の変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することである。本発明はまた、本発明の発現べクターを含む宿主細胞を提供する。組換え発現のための宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。宿主細胞の例は、細菌細胞、酵母細胞、培養された昆虫細胞株、および培養された哺乳動物細胞株を含む。好ましくは、組換え宿主細胞系は、変異体DNAポリメラーゼが由来した生物に密接に適合するように選択され得る。例えば、原核生物DNAポリメラーゼは、好ましくは、原核生物発現系において発現される。広範な発現ベクターが当該分野で周知である。種々の発現ベクターの説明およびそれらを使用する方法は、特に、米国特許第56 04118号；米国特許第5,583,023号；米国特許第5,432,082号；米国特許第5,266,4 90号；米国特許第5,063,158号；米国特許第4,966,841号；米国特許第4,806,472 号；米国特許第4,801,537号；およびGoedelら、Gene Expression Technology,Me thods of Enzymology ,第185巻,Academic Press,San Diego(1989)に見出され得る。組換え細胞系におけるDNAポリメラーゼの発現は、十分に確立された技術である。DNAポリメラーゼの組換え発現の例は、米国特許第5,602,756号；米国特許第 5,545,552号；米国特許第5,541,311号；米国法定発明登録H1,531；米国特許第5, 500,363号；米国特許第5,489,523号；米国特許第5,455,170号；米国特許第5,352 ,778号；米国特許第5,322,785号；および米国特許第4,935,361号に見出され得る。本発明の他の実施態様は、ポリヌクレオチド配列決定に特に有用な複数のDNA ポリメラーゼ組成物を含み、このような組成物は、少なくとも２つの異なる本発明の変異体DNAポリメラーゼを含み、ここで（１）第１の変異体DNAポリメラーゼは、第１の蛍光標識ヌクレオチドに関して受容性であり；（２）第２の変異体DN Aポリメラーゼは、第２の蛍光標識ヌクレオチドに関して受容性であり；そして（３）この第１および第２の蛍光標識ヌクレオチドは、それらのヌクレオチド塩基および蛍光標識に関して互いに異なる。第１および第２の蛍光標識塩基はまた、リンカー、塩基付着位置、または蛍光色素付着部位によって互いに関して異なり得る。本発明の組成物は、蛍光色素標識2',3'ジデオキシ鎖終結ヌクレオチドを用いるサンガー型DNA配列決定において配列決定反応を触媒するのに有用である。蛍光標識ターミネーターを用いる鎖終結配列決定は、好ましくは、少なくとも２つの、そしてより好ましくは４つの異なる蛍光標識チェーンターミネーターを使用し、ここで各々の異なる塩基は、特有の蛍光標識で標識される。配列決定反応に必要とされる異なる蛍光標識チェーンターミネーター間の必要な構造差違（すなわち、ヌクレオチド塩基および蛍光標識）のために、所定の配列決定反応に必要な蛍光標識ターミネーターの全てに対して受容性であるとは限らない、本発明の多くの変異体DNAポリメラーゼがある。従って、配列決定反応の組において使用される標識ターミネーターの１つ以上に対して望ましくなく高レベルの差別を有し得る本発明のDNAポリメラーゼの実施態様がある。２つ以上の変異体ポリメラーゼの本発明の組成物は、異なる鎖標識ターミネーターに対して受容性である複数の変異体DNAポリメラーゼを同時に使用することによって、この問題を改善する。それにより、変異体ポリメラーゼのうちの少なくとも１つにて、配列決定反応を触媒する他のポリメラーゼによる特定の蛍光標識ターミネーターに対する差別を「矯正させる」。組成物における異なるDNAポリメラーゼの比は、好ましくは、異なる変異体DNAポリメラーゼの各々についてほぼ等しいレベルの総活性をもたらすように選択される。異なる変異体ポリメラーゼ間の比活性における差違は、ポリメラーゼ間の総活性比を等しくする場合に考慮され得る。本発明の組成物における種々の変異体DNAポリメラーゼ間の活性レベルにおける差違はまた、本発明の組成物における異なる蛍光標識ターミネーターのレベルを調節することにより矯正され得る。本発明の複数のポリメラーゼの組成物は、２、３、４、またはそれより多くの異なる変異体DNAポリメラーゼを含み得る。変異体ポリメラーゼは、同じ種または株に由来してもよいし、由来しなくてもよい。本発明の変異体ポリメラーゼ組成物における異なる変異DNAポリメラーゼは、配列決定のための所定の組の蛍光標識ジデオキシヌクレオチドにおける１つ以上の蛍光標識ヌクレオチドに受容性でもよく、受容性でなくてもよい。本発明はまた、本発明の変異体DNAポリメラーゼ（または本発明の複数の変異体DNAポリメラーゼ組成物）を使用する種々の方法を含む。本発明の変異体DNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼを使用するほとんどの手順において対応する親D NAポリメラーゼの代わりに使用され得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの特性をより十分に利用するために、本発明の方法において使用される標識および非標識ヌクレオチドの量（または濃度）は、従来のDNAポリメラーゼを使用する対応する方法において使用される量（または濃度）に関して変更され得る。ヌクレオチド量におけるこれらの変更は、日常的な実験により最適化され得る。本発明の方法は、プライムされるポリヌクレオチド鋳型を少なくとも１つの蛍光標識ヌクレオチドを用いて伸長する工程を含み、ここで伸長は、本発明の変異体DNAポリメラーゼにより触媒される。従って、本発明の方法は、プライマー伸長により生成された１つ以上の異なる蛍光標識ポリヌクレオチドの形成をもたらす。蛍光標識ポリヌクレオチドを合成する本発明の方法は、種々の手順（サンガー配列決定（例えば、ジデオキシヌクレオチド鎖終結）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ポリヌクレオチド標識、微量配列決定を含むが、それらに限定されない）において使用され得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの蛍光標識ヌクレオチド特性に対する低減した差別は、特に、サンガーDNA配列決定反応（サイクル配列決定を含む）に有用である。サンガー配列決定のための本発明の変異体DNAポリメラーゼの使用は、配列決定反応に必要とされる蛍光標識鎖終結ヌクレオチドの量を低減し、そして多くの場合において、自動化蛍光-塩基配列決定装置（例えば、Applied Biosystems 310または377(Applied Biosystems Division of Perkin- Elmer,Foster City,CA)）で分析される単一配列決定反応において同定され得る塩基数を増加するために使用され得る。サンガー配列決定についての詳細なプロトコルは当業者に公知であり、そして例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N Y(1989)に見出され得る。本発明はまた、蛍光標識ポリヌクレオチドを合成するためのキットを提供する。キットは、特定のポリヌクレオチド合成手順（例えば、DNA配列決定またはPCR ）を行うために適合され得る。本発明のキットは、本発明の変異体DNAポリメラーゼ、およびキットにおける変異体DNAポリメラーゼに関して低減した差別を示す蛍光標識ヌクレオチドを含む。キットは、好ましくは、キットに適合した手順を行う方法についての詳細な説明書を含む。必要に応じて、本発明のキットは、キットが、行うために適合した方法を行うために必要とされる少なくとも１つの他の試薬をさらに含み得る。このようなさらなる試薬の例は、非標識ヌクレオチド、緩衝液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、配列決定プライマー、および増幅プライマーを含む。本発明のキットに含まれる試薬は、より大きな精度および正確さを提供するように予め測定された単位で供給され得る。本発明の他の実施態様には、（１）複数の変異体DNAポリメラーゼの本発明の組成物、および（２）本発明の組成物を用いる使用に適した蛍光標識鎖終結ヌクレオチド（すなわち、各標識チェーンターミネーターは、組成物における変異体 DNAポリメラーゼの少なくとも１つに関して受容性である）を含むキットが含まれる。本発明のさらなる実施態様は、本発明の複数の変異体ポリメラーゼ組成物を含むDNAを配列決定するためのキットを含み、そして少なくとも２つの異なる蛍光標識鎖終結ヌクレオチドは異なる塩基で標識され、ここで各々の蛍光標識鎖終結ヌクレオチドは、組成物における少なくとも１つの変異体DNAポリメラーゼに関して受容性である。上記で記載してきた本発明は、以下の実施例への参照によりより良く理解され得る。実施例は、多くの理由の中でも特に、本発明の特定の実施態様を例示するために提供され、そして本発明に対する制限として解釈されるべきではない。実施例実施例１Taq DNA ポリメラーゼの変異体形態の精製組換え変異体Taq DNAポリメラーゼ生成のために設計された組換え構築物を含むE.coli溶解物を、本質的に、tDesai,U.J.およびPfaffle,P.K.,Biotechniques, 19:780-784(1995)に記載のように作製した。ポリメラーゼが、溶解物に夾雑する染色体DNAおよびプラスミドDNAに結合するのを妨げるために、5M NaClを熱処理した清澄化溶解物に滴下して、最終NaCl濃度を0.25Mにした。次いで、DNAを５％ポリエチルイミン（20mM TRIS・Cl(pH8.5)中）の滴下によりこの混合物から沈殿させて、PEI最終濃度を0.3％にした。沈殿を、氷上で５分間継続させた。白色の濁った沈殿物を、４℃で15分間、15,000×ｇでの遠心分離により除去した。上清液をデカンテーションし、そして取っておいた。遠心分離後、NaCl濃度を、NaCl を含まないTETT（20mM TRIS・Cl、0.1mM EDTA、0.05％Tween-20、0.05％ Triton -X100、１％グリセロール、pH8.5）の添加の間に溶液の伝導率をモニターすることにより0.13Mに下げた。過剰なPEIを、Bio-Rex70(BI0-RAD,Richmond,CA)カラム(2.5×30cm)を用いて除去した。カラムにTETT緩衝液＋0.1M NaClを注ぎ、そして平衡化した。ポリメラーゼは、これらの条件下でBio-Rex70に結合しない。夾雑E.coliタンパク質を除去するために、Bio-Rex70カラム溶出物を、ヘパリン-アガロース(Sigma Chemical Company,St.Lou1s,MO)カラム（1.5×30cm）（これもまたTETT緩衝液＋0.1M NaClを注ぎ、そして平衡化した）に直接ロードした。ヘパリン-アガロースカラムを、２カラム容量のTETT＋0.1M NaClで洗浄し、そしてTaq DNAポリメラーゼを、TETT＋1M NaClを用いて鋭いピークとして溶出した。溶出を280nmでモニターした。ピーク吸光度に対応するヘパリン-アガロースカラム画分をプールし、そして遠心分離速度および時間について製造者の推奨に従ってUltrafree-15 Centrifug al Filter Devices(Millipore Corporation,MA)を用いて0.15mlまで濃縮した。濃縮物を、TETT緩衝液＋５％グリセロールで15mlに希釈し、そしてサンプルを0. 15mlまで再濃縮した。これをもう１回繰り返して、タンパク質サンプル中の最終 NaCl濃度を１mM未満に下げた。濃縮ポリメラーゼサンプルをTETT＋５％グリセロールを用いて２倍希釈し、そして等容量のTETT＋95％グリセロールを添加して、最終グリセロール濃度を約50 ％にした。サンプルを-20℃で保存した。タンパク質濃度を、「Bradford Protei n Assay」(BIO-RAD,Richmond,CA)を用いて決定した。活性を、放射分析アッセイ（他の所に記載）を用いて測定した。２リットルの誘導E.coli培養液（30〜50mlの熱処理した清澄化溶解物に相当する）に由来するポリメラーゼの代表的な収率は、４〜24mgの範囲であった。精製サンプルのSDS-PAGE分析は、クマシーブルー染色後に、分子量約94,000の１つの濃いバンドおよびいくつかのより微弱なバンドを示した。ゲルは、＞90％の代表的な精製レベルを示した。実施例２選択性アッセイ非標識対色素標識ターミネーターアッセイ（「ターミネーター」を伸長不可能な塩基（例えば、2',3'-ddNTP）と定義する）を使用して、変異体Taq DNAポリメラーゼサンプルを、このポリメラーゼのより良好なTet(II)・ddCTP取り込み変異体形態についてスクリーニングした。このアッセイは、ポリメラーゼ濃度のみが律速である定常状態反応の間に同時に、同じ活性部位について競合する２つの基質に基づく。従って、このアッセイは、非標識対フルオレセイン標識ターミネーターについてのポリメラーゼの「選択性」を測定する。このアッセイフォーマットにおいて使用されるDNAプライマー／鋳型を以下に示す： 5'-＞(FAM)-CCC TCG CAG CCG TCC AAC CAA CTC A GGG AGC GTC GGC AGG TTG GTT GAG TGC CTC TTG TTT＜-5' プライマーの3'末端に続く次の鋳型位置を、太文字および下線のＧにより上記に示す。反応は以下からなる： 80mM TRIS・Cl（20℃でpH9.0） 1000nM DNAプライマー／鋳型（5'-(FAM)25マー／36G_I鋳型）２mM MgCl₂ 50μＭ TET(II)・ddCTP １μＭ ddCTP 0.25単位の酵素 40μＬ反応容量 60℃反応温度サンプル（２μＬ）を、予め決定した時間（代表的に、0.25単位ポリメラーゼ活性／μＬについて20秒間隔）で反応混合物から取り出し、そして氷冷50μＬ 0 .5M EDTA（pH8.0）を添加した。定期的な(timed)アリコートを混合し、そしてさらなる処理のために氷上で保持した。各時点のサンプルを、過剰な取り込まれなかったTET(II)・ddCTPを除去するために処理した。代表的に、1.6μＬの各クエンチングしたサンプルを、250μＬの 0.8M LiCl＋0.2μｇ/ml E.coli tRNAに添加し、続いて750μＬの95％エタノールを添加した。混合後、核酸を、-20℃で20分間沈殿させた。沈殿物を、標準的な手順を用いて遠心分離により回収した。上清液を捨て、そしてペレットを、50μ Ｌの50％ホルムアミドに溶解した。ゲルサンプルを熱処理し（95℃、２分間）、そしてサンプルレーンあたり２μＬを、16％変性DNA配列決定ゲルにロードした。ゲルを、25マープライマーに相当するバンド、26マー産物（ddC取り込み事象を示４す）、および見かけの「27マー」産物のバンド（TET(II)・ddCTP取り込み事象を示す）におけるFAM蛍光量を測定するために、GeneScan Fragment Analysisソフトウェアを用いてApplied Biosystems Model 373 Sequencerにおいて泳動を行った。各バンドにおける蛍光シグナルを合計し、そしてさらなる計算のために、各バンドにおけるシグナルのパーセントを、レーン毎のローディング差を避けるための標準化として使用した。見かけの「27マー」産物分子に存在する％-FAM部分から、新たに取り込まれた3'塩基上のTET(II)部分へのエネルギー移動ha、全ての比を「野生型」またはTaq G46Dと比較したので補正しなかった。26マーおよび「見かけの」27マー産物のバンドにおける標準化された蛍光シグナルを、反応に使用された２つの分子の異なる濃度について補正し、そして補正値を時間に対してプロットした。各基質についての取り込み速度を、データに対する最小二乗適合 (fit)を用いて決定した。ddC/TET(II)・ddC取り込み速度の比は、サンプルポリメラーゼが非標識対TET(II)標識ヌクレオチドについて示す選択性の偏りと等しく、そして以下の関係を反映する：ここで： v_ddC=ddC取り込み速度 v_{Tet(II)・ddC}＝Tet(II)・ddC取り込み速度 k_cat=触媒速度定数 K_M＝ヌクレオチド平衡結合定数 [ddC]＝反応物におけるddCTP濃度 [Tet(II)・ddC]＝反応物におけるTet(II)・ddCTP濃度このアッセイフォーマットにおいて、「野生型」Taqまたは(Taq G46D)は、選択性の偏りすなわち約85：１のddC/Tet(II)・ddC数を示した。より低い選択性偏り比を示す変異体をさらなる試験に提示した。以下の表２は、いくつかの例のために試験されたいくつかの変異体についての結果を示す：表２ Taq 選択性数 WT/ 変異体 G46D 85 85/85すなわち１ G46D；R660D ８ 85/８すなわち約10 G46D；R595E 28 85/28すなわち約３ G46D；F667Y 28 85/28すなわち約３ G46D；E681G 40 85/40すなわち約２ G46D；D655L 40 85/40すなわち約２実施例３次ヌクレオチド速度効果アッセイ「基底状態」ヌクレオチド結合すなわち初期衝突と正確な塩基対形成および基転移反応との間のさらなる反応速度段階は、「次ヌクレオチド速度効果」(Patel ら、1991)と呼ばれるアッセイにおいて、3'-ジデオキシヌクレオチドを有する酵素-DNA複合体からのポリメラーゼ解離速度を遅くすると予期される。このアッセイは、次の正確なヌクレオチドの非存在下または存在下での、ddTTP取り込みの定常状態速度（すなわち、酵素が律速である）を測定する。プライマー鋳型対を以下に示す： 5'->(FAM)-CCC TCG CAG CCG TCC AAC CAA CTC A GGG AGC GTC GGC AGG TTG GTT GAG TAG GTC TTG TTT<-5' 次の鋳型位置を、太文字下線のＡにより示す。Ａを越えた次の鋳型位置はＧである。定常状態反応条件下で、本質的に全ての利用可能なポリメラーゼがプライマー／鋳型に結合する。ddTTPが溶液中に単独で存在する場合、これは、その鋳型位置Ａへの結合後に取り込まれる。さらなる取り込み事象は、ポリメラーゼが酵素-DNA複合体から解離することを必要とし、そしてまだ取り込み事象を受けていない別の利用可能なプライマー／鋳型を見出す。従って、これらの条件下の取り込み速度は、酵素-DNA複合体からのポリメラーゼの解離速度である。次の正確なヌクレオチドdGTPまたはddCTPもまた反応混合物に存在する場合、酵素・DNA・ ddCTP複合体からのポリメラーゼの解離速度は、例えば、ddTTPを取り込んだ基転移反応と、合成の進行(processive)態様におけるポリメラーゼによってddCTPを取り込む試みとの間でさらなる反応速度段階がある場合、より遅い。別の正確なヌクレオチドの存在にもかかわらず、一旦ddTTPおよびポリメラーゼが進行し得ないと、化学作用は起こり得ないので、このより遅い解離速度はより遅いddTTP の取り込み速度として検出され得る。図２に示すように、次の正確なヌクレオチドの存在は、確かに、ポリメラーゼの代謝回転または解離速度を遅くする（Taq G46D；F667Y）。図２はまた、次の正確なヌクレオチド上のフルオレセイン色素（この場合、Tet(II)・ddCTP）の存在が代謝回転速度を加速すると思われることを示す。本発明者らは、これが、ポリメラーゼが立体配座変化を常に受け、そして次の正確なヌクレオチドの非存在下でさえ変化を受けようと試み得ることを意味すると解釈する。しかし、次の正確なヌクレオチド上のフルオレセイン色素の存在は、ポリメラーゼがこのような変化を受ける能力をブロックし、それにより ddTTP取り込みのための基転移段階後の酵素の即座の解離を引き起こす。従って、フルオレセイン色素は、基転移反応後の反応速度段階を排除することによりポリメラーゼ解離速度を加速すると思われる。図３は、Taq DNAポリメラーゼの「複数の」変異体形態、Taq G46D；R660D；F6 67Y；E681Gについての次ヌクレオチド速度効果アッセイの結果を示す。この場合、次の正確なヌクレオチド上のTet(II)の存在は、変異体ポリメラーゼに対して「明白(transparent)」である。本発明者らは、これが、変異体ポリメラーゼが、確かに、このポリメラーゼの「野生型」バージョンが受ける基転移後に同じ反応速度段階を受け得ることを意味すると解釈する。本発明者らはまた、これらの結果が、F667Y変異がR660DまたはE681G変異とは異なるクラスに属することを示すと解釈する。なぜなら、Taq G46D；F667Yは、「次ヌクレオチド速度効果」アッセイにおいて「フルオレセイン効果」をなお示すが、多重変異体Taq G46D；R6 60D、F667Y；E681Gは示さないからである。次ヌクレオチド速度効果アッセイのための代表的なアッセイ条件は以下の通りであった： 1000nMプライマー／鋳型DNA 80mM TRIS・Cl（20℃でpH9.0） 2.4mM MgCl₂ 0.02単位／μＬポリメラーゼ活性 400μＭ各ヌクレオチド（存在する場合）サンプルを採取し、そして「選択性アッセイ」の下で記載されたのと同じ様式で処理した。この場合、16％ゲルにおいて得られたフラグメントの移動速度により、ddC取り込み事象とTet(II)・ddC取り込み事象とを区別することは可能である。ddCの取り込みは、上記で予期されたように、または25マープライマーより遅く移動する「正常な」26マーバンドをもたらす。Tet(II)・ddCの取り込みは、このバンドを27マーまたは28マーに等しい見かけのサイズに伴って移動させる、より遅い移動をもたらす。実施例４さらなる変異体の分析以下に提供される表１は、いくつかの異なるTaq変異体を用いて行われた選択性アッセイにより得られた結果の要旨を提供する。酵素E.coli DNAポリメラーゼ IおよびファージT7 DNAポリメラーゼにおける変異のための類似の部位もまた示される。用語「FS」は、F667Y変異を有するTaq DNAポリメラーゼを言う。参考文献 Barnes,W.M.(1992)、PCRを触媒するTaqポリメラーゼの忠実度はＮ末端欠失により改善される。Gene 112:29-35。 Brandis,J.W.,Edwards,S.G.およびJohnson,K.A.(1996)、ホスホジエステル結合形成の遅い速度は、Taq DNAポリメラーゼが2',3'-ジデオキシヌクレオチドターミネーターに対して示す強い偏りを説明する。Biochemistry 35:2189-2200。 Desal,U.J.およびPfaffle,P.K.、Escherichia coliにおいて発現された耐熱性DN Aポリメラーゼの一段階精製。Biotechniques 19:780-784。 Fersht,A.(1985)、「酵素構造および機能」W.H.FreemanおよびCompany,第２版,1 11-112頁。 Johnson,K.A.(1993)、DNAポリメラーゼ忠実度における立体配座カップリング。A nn.Rev.Biochem.62:685-713。 Patel,S.S.,Wong,I.およびJohnson,K.A.(1991)、エキソヌクレアーゼ欠損変異体の完全な特徴づけを含む、進行DNA複製の前定常状態反応速度分析。Biochemistr y 30:511-525。参考としての援用本願は、本明細書中でそれらの全体が参照される全ての刊行物、特許、および特許出願を援用する。等価物本発明は特定の実施態様に関して記載および例示されたが、一方、当業者は、改変および変化が、上文に記載され、そして以下の請求の範囲に示されるように、本発明の原理を逸脱することなくなされ得ることを認識する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (72)発明者リチャーズ，ジャックアメリカ合衆国カリフォルニア 91010, ブラッドバリー，デオダーレーン 677

Claims

【特許請求の範囲】１．ヌクレオチド標識相互作用領域において少なくとも１つの変異を有するDNA ポリメラーゼであって、ここで該DNAポリメラーゼは、フルオレセイン型色素標識ヌクレオチドに対する差別が低減した、DNAポリメラーゼ。２．前記変異が、(ｉ)O-ヘリックス、(ii)Kヘリックス、および(iii)O-Pヘリックス間ループからなる群より選択されるヌクレオチド標識相互作用領域の部分にある、請求項１に記載のDNAポリメラーゼ。３．前記変異が、E520、A531、L522、R523、E524、A525、H526、P527、I528、V5 29、E530、K531、I532、R536、E537、R573、Q582、N583、V586、R587、P589、Q5 92、R593、R595、D610、T612、Q613、E615、R636、D637、T640、F647、V654、D6 55、P656、L657、R659、R660、T664、E681、L682、A683、I684、P685、E688、F6 92、Q754、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する酵素のセグメントである、請求項２に記載のDNAポリメラーゼ。４．前記変異が、R595、D655、R660、T664、およびE681からなる群より選択される位置にある、請求項３に記載のDNAポリメラーゼ。５．前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼである、請求項４に記載のDN Aポリメラーゼ。６．前記変異が、R660D、D655L、E618G、およびR595Eからなる群より選択される、請求項５に記載のDNAポリメラーゼ。７．(G46D,R660D,F667Y)、(G46D,R595D,R660D,F667Y)、および(G46D,R660D,F667 Y,E681G)、および(G46D,F667Y,E681G)からなる群に属する変異の組を含む、請求項６に記載のDNAポリメラーゼ。８．前記DNAポリメラーゼが耐熱性DNAポリメラーゼである、請求項２に記載のDN Aポリメラーゼ。９．請求項１に記載のDNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド。１０．プロモーターを有する発現ベクターであって、ここで該ベクターが、該プロモーターと機能的に組み合せた請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。１１．請求項１０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。１２．蛍光標識ポリヌクレオチドを合成する方法であって、該方法が、請求項１に記載のDNAポリメラーゼとプライムされる鋳型とを混合する工程を包含する、方法。１３．前記プライムされる鋳型が、鎖終結配列決定反応においてプライムされる鋳型である、請求項１２に記載の方法。１４．前記プライムされる鋳型が、ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライムされる鋳型である、請求項１２に記載の方法。１５．ポリヌクレオチドを蛍光標識するためのキットであって、該キットが、請求項１に記載のDNAポリメラーゼおよび蛍光標識ヌクレオチドを含む、キット。