JP2000510839A

JP2000510839A - 触媒イミダゾール（例えばヒスチジン）機能を有する触媒を使用した安定化変遷複合体を用いたアシル移行

Info

Publication number: JP2000510839A
Application number: JP09540797A
Authority: JP
Inventors: アールベルイ，ペール; バルツェル，ラルス
Original assignee: エイプラスサイエンスインベストアーベー
Priority date: 1996-05-14
Filing date: 1997-05-13
Publication date: 2000-08-22
Anticipated expiration: 2017-05-13
Also published as: CA2254987A1; ATE337330T1; AU715521B2; CN1329410C; JP4227193B2; DE69736561T2; AU2919497A; WO1997043302A1; EP0952980B1; US6171819B1; CN1225641A; SE9603323D0; DE69736561D1; EP0952980A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、試薬と基質との間のアシル化移行機構を含む化学反応を、該基質と変遷複合体を形成できるイミダゾール系触媒の存在下で行う方法に関する。触媒性イミダゾール機能は、該変遷複合体をアシル基との分子相互作用によって安定化することができる基で片側または両側がフランキンングされた、任意に置換されたイミダゾール基を含む化学構造要素によって与えられる。本発明はまた、かかる設計された化学構造要素、該要素を組換えＤＮＡ技術およびそのベクターによって製造する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】触媒イミダゾール（例えばヒスチジン）機能を有する触媒を使用した安定化変遷複合体を用いたアシル移行発明の分野本発明は、化学反応の触媒作用に関し、さらに詳しくはアシル移行反応の触媒作用に関する。発明の背景いわゆるアシル移行反応は、化学種内でのあるいは一つの化学種から別の化学種へのアシル基（カルボキシル基のヒドロキシ基を除いた後の有機酸の残基）の移行を包含する。その例はアミド形成、エステル交換および加水分解である。アシル移行反応は水溶液中のイミダゾールにより触媒され、強い求核剤であるイミダゾールはアシル基と共に中間の反応性複合体を形成しうることは良く知られている。ポリマー保持イミダゾールはアシル移行触媒として使用されていた（例えばSkjujins,A.外のLatv.PSR Zinat.Akad.Vestis,Kim.Ser.1988(6),720-5参照）。ヒスチジン(His)残基（イミダゾール基を含むアミノ酸）を含む小さいペプチドは加水分解活性を有しうることが更に示された。構造蛋白質およびペプチドを設計する最近の進歩で、実質的な触媒活性を有する幾つかのペプチドが製造された（W.F.DeGrado,Nature,365,488(1993)。例えば、K.Johnsson外、Nature,365,530(1993)は,短い自己会合性Leu-Lys-に富んだらせん状ペプチドであって、シッフの塩基中間体により、オキサロアセテートの基質とアミンとの間で、静電的に抑制した酸定数(Ka)で、脱カルボキル化の速度を促進する前記のペプチドを開示する。第２の構造が活性に重要であることが述べられている。本発明は、イミダゾール系触媒機能を含む設計された触媒構造における改良を提供する。発明の概要本発明によると、アシル移行反応における前記のイミダゾール誘発触媒活性は、イミダゾリル基と問題とするアシル基とで形成された変遷複合体を安定化できる性質および位置の基によって、イミダゾリル基が化学構造の片側または両側にフランキングされるならば、かなり増大されることが見いだされた。かかる安定化を達成するために、フランキング基は、例えば水素結合、静電的または疎水性相互作用またはファンデルワールス力（分子内分極）により、アシル基と分子間相互作用できるものでなければならない。増大した触媒活性は、溶液中の分子間および分子内反応と組み合わせて、立体特異性とともにまたはなしで、使用しうる。後者の場合、ペプチドまたは他の分子を部位選択的に機能化することができる。かかる部位選択的機能化は特に生体分子、例えば抗体またはその他の蛋白質またはポリペプチド、のような分子の部位選択的固定を可能にするであろう。本発明の目的の一つは、イミダゾール系触媒を使用して、改良されたアシル移行型反応を行う方法を提供することである。本発明の第一の側面においては、アシル基と変遷複合体を形成することができるイミダゾール系触媒の存在下で、アシル移行機構を含む化学反応を行う改良法が提供される。該方法は、アシル基との分子相互作用により変遷複合体を安定化することができる基によって、イミダゾリル基の片側または両側がフランキングされた化学構造要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）により、イミダゾール機能が与えられたことを特徴とする。この分子相互作用は、水素結合、静電的相互作用および疎水性相互作用から選ぶことができる。前記方法の好ましい態様において、化学構造要素は、前記の中間的複合体をへてアシル移行により部位を特定的に機能化されうるほど近くの位置に官能基を有する大きい構造体を構成するか、または該構造体の一部である。本発明の別の側面は、アシル移行反応の触媒作用能力が改良された化学構造要素を提供することである。本発明の第２の側面では、ペンダント型イミダゾール機能を有する骨格構造を含む化学構造要素であって、該要素は、イミダゾール機能が該骨格構造上の片側または両側に、変遷複合体をアシル基との分子相互作用によって安定化することができるペンダント基によってフランキングされたことを特徴とする要素が提供される。一つの態様において、構造要素は、ペプチドまたは蛋白質のような分子であり、前記の中間的複合体をへてアシル移行により部位を特定的に機能化できるほど近くの位置に官能基を有する。本発明の更に別の目的は、遺伝子工学により、変遷複合体安定化基によってイミダゾール機能が片側または両側に置かれた構造要素を構成するまたは含む、蛋白質またはペプチドを製造する方法を提供することである。第３の側面によると、本発明は、上に定義したイミダゾール機能含有構造要素を構成するまたは含む蛋白質またはペプチドの製造法を提供し、該方法は、ベクターおよび該蛋白質またはペプチドをコードしたＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ構造体を宿主生物に形質転換し、該宿主生物を培養して該蛋白質またはペプチドを発現させ、そして後者を培養物から分離することを特徴とする。前記方法の好ましい態様においては、構造要素は官能基をイミダゾール機能の近くの位置に含むので、該官能基は、該イミダゾール機能によって触媒されるアシル移行によって、部位特定的に機能化されることができる。本発明の更に別の目的は、前記の蛋白質およびペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを提供することである。第４の側面では、本発明は、前記のイミダゾール機能含有構造要素を構成するまたは含む蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列およびベクターを含む組換えＤＮＡ構造体を提供する。ベクターの好ましい態様においては、該ＤＮＡ配列は、特定の官能基を、該官能基がイミダゾール機能により触媒されるアシル移行を介して部位特定的に機能化されるほどイミダゾール機能の近くの位置にコードする。本発明の前記及び他の目的、側面、特徴、および利点は、以下の発明の詳しい記述からさらに十分に理解されるであろう。添付の図面を参照されたい。図面の簡単な説明図１Ａおよび図１Ｂは、４つの設計されたポリペプチドのらせん−ループ−らせん、即ち、設計された反応中心を指示したＳＡ−４２、ＲＡ−４２、ＰＡ−４２（図１Ａ）およびＫＯ−４２（図１Ｂ）、の概略を示す。図２は、モノ−ｐ−ニトロフェニルフマレートと本発明によるイミダゾール− 含有構造（ＲＡ−４２）とのアシル移行反応によるｐ−ニトロフェノールの放出の二次速度定数の対数を、ｐＨに対して示すグラフである。点線はｐＫａ１０．４を有するオルニチンの脱プロトン付加（ｄｅｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ）形により触媒された反応の速度定数の予想されるｐＨ依存性を示す。発明の詳細な記述前記の通り本発明は、アシル移行反応におけるイミダゾール型触媒活性を、骨格上のイミダゾール機能に、該イミダゾール機能の片側または両側上にペンダント型フランキング基を与えることにより、増大させる考えに基づく。該フランキング基は形成されたイミダゾール−アシル複合体と、変遷複合体を安定化するように相互作用することができる。更に以下に説明するように、アミド化、エステル交換、加水分解またはチオリシスのような望ましいアシル移行反応の反応速度は、それによりかなり増大するであろう。エステルは現在好ましい基質であるが、例えばアミドおよび無水物の基質もまた考慮し得る。 “イミダゾール機能または官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）”の用語は、本願では広く解釈され、望ましい触媒活性を有するあらゆるイミダゾール系構造を含むことを意味する。従ってイミダゾール基をいろいろな方法で変更してもよい。多くの目的に有利なイミダゾール機能は、アミノ酸ヒスチジン（α−アミノ−４−（または５）−イミダゾールプロピオン酸）に基づく。イミダゾール機能の使用できる炭素原子の一方または両方は、例えば独立してアルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい。イミダゾール基はまた、１−位をアルキルで置換されてもよい。該アルキルは好ましくは１ないし６個の炭素原子、特に１ないし４個の炭素原子を有し、例えばメチルまたはエチルである。該ハロゲンにはフッ素、塩素、臭素およびヨウ素が含まれる。フランキング基は、アシル変遷複合体と必要な分子相互作用をすることができる末端官能基または他の基に結合された、例えば１ないし６個の原子、好ましくは１ないし４個の原子、通常は炭素原子、のリンクまたは鎖を含み得る。触媒構造要素がペプチドであり、そしてイミダゾール機能がヒスチジン残基の一部である場合は、フランキング鎖は他のアミノ酸、例えばリシン、オルニチン、アルギニンおよび／または別のヒスチジンから選ばれたアミノ酸、のペンダント型プロトン供与部分であることができる。イミダゾール機能に関してフランキング基を、行われる望ましい変遷複合体安定化相互作用のための最適な幾何学的関係に局在化するために、触媒性イミダゾール機能を支える化学構造要素は、あるタイプの固定性または剛性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）、例えば二次構造、を有するのが好ましい。有利な態様においては、化学構造要素は、いわゆる安定化二次構造、例えばα−らせん形に巻いたコイル、を有する設計されたポリペプチドである。設計されたらせん形ペプチドは、例えばJ.W.Bryson外、Science、270、935(1995)に記載されている。しかしながら、該構造要素はペプチドに限定されない。反対に、該構造要素は、本発明に照らして、熟練者に容易に明らかな多様の組成物のいずれでもあることができ、従って、炭水化物、天然若しくは合成のポリマー等のような他のタイプの構造に含まれるか、あるいはその一部であることができる。該化学構造の大きさは制限されず、例えば５個のアミノ酸ほど小さいペプチドであってもよい。イミダゾール機能とフランキング基との間の必要な幾何学的関係については、官能基の配列は、本願の記載を読めば熟練者がそれぞれの特定の状況に対して容易に設計できるであろう。複合体安定化フランキング鎖の機能部分に依存して、変遷複合体はかかるフランキング鎖と分子内反応で反応し得る。かかる分子内反応は、ペプチド、タンパク質および他の分子を選択的に機能化するのに使用できるであろう。かかる分子内反応の例は以下の反応スキームに概略される。前記のスキームで、イミダゾール構造はヒスチジン（Ｈｉｓ）残基の一部であり、そしてアミノプロピル鎖はオルニチン（Ｏｒｎ）残基の一部であり、両方とも設計されたα−らせん形ポリペプチド内に、互いに４個の炭素原子の距離で（即ち、“ｉ”（Ｈｉｓ）および“ｉ＋４”（Ｏｒｎ）の位置で）含まれ、従って該ＨｉｓおよびＯｒｎ残基はらせん形の同じ側に位置する（各コイル内で４炭素原子）。“Ｉ”は活性エステルを表し、本願では特定的にはモノ−ｐ−ニトロフェニルフマル酸エステルである。反応はオルニチンのアミノ基が殆ど完全にプロトン付加される（ｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ）ｐＨ値で行われ、従って活性エステルとの直接反応には使用されない。かかるα−らせん形ポリペプチドの例はＲＡ− ４２であり、その超二次構造は図１Ａに図式的に示される。ＲＡ−４２は４２個のアミノ酸、並びにＨｉｓ−１５、Ｏｒｎ−１５およびＯｒｎ−３４の残基を有する。ポリペプチドＲＡ−４２を更に詳しく以下の実験の部分で記載する。反応は、Ｈｉｓのイミダゾール残基の活性エステルへの最初の攻撃で開始し、ｐ−ニトロフェノールを放出してアシル中間体を形成する。オルニチン側鎖はアシル複合体の方へ屈折し得、プロトン付加アミノ酸とアシル基の延びた酸素アニオン（ｏｘｙａｎｉｏｎ）との間の水素結合を介して該アシル複合体と相互作用して、アシル中間体は安定化される。アシル基は次にヒスチジン残基からオルニチン残基に移行し、遊離のヒスチジンが再生される。追加の安定化鎖をヒスチジン残基の反対側に有してもよい。生成した変遷複合体を以下に図式的に示す。ヒスチジン残基が２個の他のヒスチジン残基によりフランキングされた場合（ α−らせんの場合、ｉ＋４とｉ−４の位置）、特に増大した触媒活性が得られることが見いだされた。ｉの位置のヒスチジンに対して、アシル化はｉ−３の位置でも起こり得る（しかしｉ−４，ｉ−１，ｉ＋２およびｉ＋３の位置では起きない）。ｉ＋４アシル化の例示的基は、前記のオルニチンに加えて、リシンおよび１，３−ジアミノ−酪酸であり、一方ｉ−３アシル化はリシンによって例示される。更に、官能基はｉ＋４およびｉ−３の位置の両方にあってもよく、この場合の官能基は例えばリシンである。１個より多くのイミダゾリル機能をｉ，ｊ，ｋ等の位置に有する構造要素を使用することも可能であり、これらの官能基は次に、好ましくはそれぞれｉ＋４，ｊ＋４，ｋ＋４等の位置の官能基によって、片側または両側がフランキングされてもよい。従って、簡単な変遷状態結合の原理から設計した例えば機能化らせん−ループ −らせんモチーフを使用して、アシル移行反応を触媒することが可能であり、好ましい複合体安定化が、例えば、負に荷電した基質と作用する、正に荷電した水素結合ドナーの導入により、予期できる方法で得られる。前記の場合、変遷状態における主な結合相互作用は、エステル官能基の延びた酸素アニオンに対する相互作用である。これは、以下の実験部分で例証されるように、負荷電の官能基を持たないｐ−ニトロフェニルアセテートがモノ−ニトロフェニルフマレートと殆んど同じ効率で触媒されるという事実によって示される。前に述べたような本発明を具体化する設計されたポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術（遺伝子工学）によって製造できることが、容易に理解される。かかる技術は当業者によく知られるので、ここに記載しない。（例えば、ＥＰ−Ｂ１−２８２０４２を参照できる。これは、隣接するＨｉｓ−残基を含む融合タンパク質の、組換え技術による製造を開示する。）前記の反応中心の選択性は、例えば折りたたみ（ｆｏｌｄｅｄ）ポリペプチド内に、新しい機能を導入するのに使用し得る。分子内反応において、安定化用のフランキング基は勿論、アシル移行によって機能化される基である必要はないが、適当な位置の別の官能基であることができる。位置−選択性機能化の重要な側面は、タンパク質およびペプチドに炭水化物を部位選択的に導入することである。これは、問題とする炭水化物を、エステル機能を含むように修飾することにより達成される。炭水化物は免疫、炎症およびその他のプロセスの認定に重要な役割を果たす。炭水化物はまたタンパク質をタンパク質分解から保護し、そしてタンパク質の折りたたみに影響を及ぼす。従って、炭水化物の部位選択的導入を、炭水化物の役割の系統的研究に使用できるであろう。それはまた、薬を分解から保護するのにも使用できる。本発明の方法は、ワクチンの開発に、免疫系の成分を真似るのに、並びに免疫系の成分用のアンタゴニストおよびアゴニストを構成するのに、使用できる。本発明の方法はまた、側鎖に異なる反応性を与える場合、異なる機能を異なる位置に段階的に導入するのに使用できる。かかる反応は、部位選択的固定化、新規な触媒のような機能化ポリペプチドの構成、補因子の導入等に大きな潜在的可能性があることが理解される。部位選択的固定化の例を以下に図式的に例示するが、ここで前記の、らせん− ループ−らせん型の設計されたポリペプチドは、フランキングアミノアルキル鎖と安定化の関係にある触媒性ヒステジン残基を有するが、アミノ官能基を介して固体支持体のエステル官能基（Ｒ₁ＯＣＯ）に固定される。反応は、全てのアミノ官能基が殆ど完全にプロトン付加し、従ってエステル官能基との直接反応には使用できないようなｐＨ条件で実施される。固体支持体への固定は勿論、他の方法でも、即ち、ヒスチジン残基およびアミノ基を固体支持体に与え、そしてエステル官能基をペプチドに与えることにより、行うことができる。反応はペプチド合成の反応条件下では生存しない残基、または立体障害により十分に反応性ではない残基を導入するのに使用し得る。新規な枝分れ鎖ポリペプチド構造もまた、アミノ酸残基またはペプチドが導入できるのであれば、可能である。ヒスチジンは再生されるので、作製された触媒の活性部位に関与するように設計することができる。更なる可能な応用には、例えば基質またはリセプターの特定の結合のための二次または三次構造を有するペプチドライブラリー；血液循環内、アレルギー診断（および診断所）、並びに免疫学における内在物質の特定の非共有結合用のポリペプチドの構成；抗体製造のためのトポロジーを持つ分子の構成；およびワクチンの製造。本発明を、いくつかの特定の設計されたポリペプチドに対して行った実験に関連して、更に詳しく記載する。実験触媒性ポリペプチドＳＡ−４２、ＲＡ−４２、ＰＡ−４２、ＬＡ−４２およびＫＯ−４２の合成ポリペプチドＳＡ−４２、ＲＡ−４２、ＰＡ−４２およびＫＯ−４２のアミノ酸配列は、明細書に記載した配列リストに示される。ＲＡ−４２、ＰＡ−４２およびＫＯ−４２について太く下線をした残基は、触媒結合部位を構成するように設計された残基である。アミノ酸について一文字コードを使用したが、ここでＡはＡｌａ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＮはＡｓｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＶはＶａｌ、Ａｉｂはα−アミノイソ酪酸、そしてＮｌｅはノルロイシンである。配列リスト、並びに図１Ａおよび図１Ｂから分かるように、ポリペプチドはらせん−ループ−らせんモチーフである。溶液中ではペプチドは二量体化して４個のらせん束を形成するが、簡単にするために単量体のみを示す。ＬＡ−４２（図示されない）は、Ｏｒｎ−１５がＬｙｓ−１５で置き換えられた以外はＲＡ−４２と同じである。ＳＡ−４２は、Stewart,J.M.,およびYoung,J.D.,Solid Phase Peptide Synthe sis,Pierce Chem.Co.Rockford,III,1984,に記載されたようにして合成した。ポリペプチドＲＡ−４２、ＰＡ−４２、ＬＡ−４２およびＫＯ−４２は、アミノ酸誘導体を変更した（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）位置で使用した以外は同じようにして製造した。オルニチンの側鎖保護基は２−Ｃｌ−ＣＢＺ（２−クロローカルボベンゾキシカルボニル）であった。ポリペプチドは、自動ペプチド合成器（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ９６００）で、ｔ−ＢＯＣ保護基およびフェニルアセトアミドメチル−（ＰＡＭ）結合樹脂を用いて合成した。該ポリペプチドは樹脂から無水ＨＦによりテフロンバキュームライン（Ｔｅｆｌｏｎｖａｃｕｕｍｌｉｎｅ）（ペプチドインステチュート社）上で切断し、そしてサイズ−除外クロマトグラフィー、並びに逆相およびイオン交換ＨＰＬＣによって精製した。エレクトロスプレー質量分析法（ＶＧＡｎａｌｙｔｉｃａｌ、ＺａｂＳｐｅｃ）およびアミノ酸分析法を用いてペプチドの同一性を確立し、そして純度をＨＰＬＣで調べた。モノ−ｐ−ニトロフェニルフマレートの合成蒸留したばかりの塩化フマリル（０．９ｇ、５．９ミリモル）を１００ｍｌのアセトン中触媒に溶解し、溶媒の残留水と３０分間反応させた。小部分（０．２ｍｌ）を乾燥した丸底フラスコに移し、溶媒を蒸発させた。残留混合物をＣＤＣｌ₃に溶解し、ＮＭＲ管に移した。¹ＨＮＭＲスペクトルは、塩化フマリル（７．１0ｐｐｍ，ｓ）と部分的に加水分解された塩化フマリル（６．９９８および７．０７ｐｐｍ，ｄｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ）との混合物を示した。フマル酸はクロロホルム中に僅かしか溶けない。次に水をアセトン溶液に添加し、そしてＮＭＲ分析を繰り返した。合計５４μｌ（３ミリモル）を小部分に分けて注射器で添加し、各添加の後に、反応の程度をＮＭＲ分光分析法により分析した。溶液がもう塩化フマリルを含まなくなったとき、アセトンを蒸発させ、そして残った油を、エタノールを含まない５０ｍｌのクロロホルムに溶解し、遠心分離してフマル酸を除去した。上澄液を丸底フラスコに移し、新たに製造し、明るいオレンジ色に変わるまで加熱下で真空中で乾燥した１．８ｇのナトリウムｐ−ニトロフェノラートを添加した。スラリーを撹拌しながら一夜反応させ、次に遠心分離した。固体物質を３×５０ｍｌの水で抽出し、そして合わせた水性相を０．３Ｍの酢酸を用いてｐＨ６に滴定し、そして５×３０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂を用いて抽出してｐ−ニトロフェノールを除去した。水性相を０．３Ｍの酢酸を用いてｐＨ４．３に滴定し、そして５×３０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂を用いて抽出した。合わせた有機相を２５５ °Ｋで一夜放置した。結晶の小さい集まり（４０ｍｇ）を収集し、乾燥窒素流中で溶媒を部分的に蒸発させた後に、所望の生成物、モノ−ｐ−ニトロフェニルフマレート、からなる二回目の集まりを収集した（６０ｍｇ）。収率を最適化するための企てはしなかった。生成物をＮＭＲおよび質量分光分析法で同定した。モノ−ｐ−ニトロフェニルフマレートおよび他の基質のアシル移行反応についての二次速度定数の測定モノ−ｐ−ニトロフェニルフマレートのアシル移行反応についての二次速度定数を、下記の物質について決定した：ポリペプチドＳＡ−４２、ＲＡ−４２、ＰＡ−４２、ＬＡ−４２およびＫＯ−４２、並びに４−メチルイミダゾール。速度測定は、２９０．２Ｋで、１０％（ｖ／ｖ）トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、９０％の１００ミリモル（ｍＭ）ビス−トリス緩衝剤または水性緩衝溶液中で、ｐＨ４．１、５．１または５．８５で、３２０ｎｍでの吸光度の増加を、キャリー（Ｃａｒｙ）温度コントローラを備えたキャリー４分光光度計を用いて追跡することによって実施した。測定すべき物質を３００μｌの緩衝溶液に溶解し、１０％ＴＦＥ溶液中で０．１ＭのＮａＯＨにより関連するｐＨまで滴定し、そして遠心分離した。３００μｌの物質の透明な溶液を１ｍｍＵＶキュベットに移し、ＵＶ分光計の恒温室に置いた。基質を秤量しそして緩衝溶液に溶解し、２０μｌをキュベットにピペットにより移し、そして反応を開始した。ペプチドの濃度を質量アミノ酸分析により決定し、そしてそれぞれの速度定数を２回の実験の平均にした。各速度実験を少なくとも２つの半減期について追跡し、Ａ＋Ａｌ＊ｅ^-ktの形の単一の指数関数をデータに合わせた。過剰のペプチドの条件下で、各ペプチド溶液を２回の実験に使用し、そして二次反応を開始するために、２０μｌの２回目部分をキュベットに移した。過剰の速度上昇が基質との反応によって失われたＲＡ−４２の事例では、２回目の実験でのペプチドの濃度を反応性ペプチドの損失に対して調整した。基質の全濃度は０．１３ミリモル（ｍＭ）であり、二次速度定数の補正は小さく、１０％未満であった。同じ補正をＰＡ− ４２の速度定数に適用した。１０％ＴＦＥ中でｐＨ５．８５にて得られた速度定数および相対速度を以下の表１に示すが、この表にモノ−ｐ−ニトロフェニルフマレートとトリフルオロエタノールとの間の２分子反応についての対応するデータも示す。表に示されるように、ペプチドＲＡ−４２、ＰＡ−４２およびＫＯ−４２については速度定数のかなりの増加が得られる。即ち、これらのペプチドは、４−メチルイミダゾールおよびペプチドＳＡ−４２と比較して、著しく上昇した触媒活性を示す。増加した触媒活性は、前述した変遷複合体の安定化による。このように、三つのペプチドの全部は、複合体をＨｉｓ官能基とアシル基またはむしろアシル基の延びた酸素アニオンとの間で安定化することができるような幾何学的位置に、正に荷電した水素結合ドナーを有する。このように、ＲＡ−４２は触媒性Ｈｉｓを１１−位にそして安定化Ｏｒｎを１５−位に有する。ＰＡ−４２はＨｉｓを１５−位にそして安定化Ｏｒｎを１１−位に有する。ＫＯ−４２はＨｉｓ残基を１１−、１５−、１９−、２６−、３０−、および３４−位に有する。他方、ＳＡ−４２は、Ｈｉｓ−１５残基を有するが、安定化機能をもたない。以下に記載するように、ＲＡ−４２の触媒反応の反応生成物はＯｒｎ−１５の側鎖に形成されたアミドである（アミド化）。４−メチルイミダゾール触媒反応においては、反応生成物はＴＦＥエステルである（エステル交換）。前記の研究に対応する研究において、それぞれポリペプチドＫＯ−４２および４−メチルイミダゾール（４−ＭｅＩｍ）によって触媒されるモノ−ｐ−ニトロフェニルフマレートのアシル移行を、モノ−ｐ−ニトロフェニルフマレートとトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）との間の反応と比較した。反応はｐＨ４．１で１０％（ｖ／ｖ）トリフルオロエタノール、９０％の１００ミリモル（ｍＭ）酢酸ナトリウム緩衝剤中で、２９０Ｋにて実施した。反応生成物はＴＦＥエステルであった（エステル交換）。その結果（速度定数および相対速度）を以下の表２に示す。同様にして、それぞれポリペプチドＫＯ−４２および４−メチルイミダゾール（４−ＭｅＩｍ）によって触媒された水酸イオンへのアシル移行（加水分解）を、ｐＨ５．１で１００ミリモル（ｍＭ）の酢酸ナトリウム緩衝剤中で、２９０Ｋにて、下記の基質に関して研究した：モノ−ｐ−ニトロフェニルフマレート、ｐ −ニトロフェニルアセテート、シクロペンタンジカルボン酸モノ−ｐ−ニトロフェニルエステル、並びにＤ−およびＬ−トリプトファン−ｐ−ニトロフェニルエステル。その結果を以下の表３に示す。ポリペプチドＲＡ−４２およびＬＡ−４２の自己触媒された部位選択的機能化前記に製造されたポリペプチドＲＡ−４２（配列リスト参照）は、溶液中でヘアピンらせん−ループ−らせんモチーフに折りたたまれる。該ポリペプチドは、ＮＭＲおよびＣＤ分光分析による測定に基づくと、Ｈｉｓ−１１、Ｏｒｎ−１５およびＯｒｎ−３４を含む設計された反応中心を宥する。ＲＡ−４２をモノ−ｐ −ニトロフェニルフマレートと反応させた。最終反応生成物は、エレクトロスプレー質量分光分析法およびＮＭＲ分光分析法で決定されたように、Ｏｒｎ−１５の側鎖でのアミドであった。反応を、０．５−１ミリモル（ｍＭ）濃度のペプチドで研究した。Ｈｉｓ−１１がＯｒｎ−１５の側鎖のアシル化を自己機能化反応で触媒し、他のアミノ基を未機能化のままで残すことが見いだされた。更に以下に記載するように、反応機構は、Ｈｉｓ−１１とアシル中間体を形成し、次いでＨｉｓ−１１からＯｒｎ− １５へ部位選択的にアシル移行することを含む。同様にして、Ｎ−メチルニコチン酸のｐ−ニトロフェニルエステルをＲＡ−４２と前記の技術を用いて反応させて、対応するニコチンアミドを形成した。同様にして、下記式：のガラクトース誘導ｐ−ニトロフェニルエステルをポリペプチドＬＡ−４２と、前記の技術を用いて、水溶液中でｐＨ５．８５で反応させて、対応するアミドを形成した。反応生成物（テトラアセチル誘導体）の同定は、エレクトロスプレー質量分光分析法（ＥＳ−ＭＳ）により行った。アシル基は水溶液中の加水分解で除去された。反応に使用した該ｐ−ニトロフェニルエステルは、対応するカルボン酸とｐ−ニトロフェノールとの標準的ジシクロヘキシルカルボジイミドカップリングにより製造した。反応機構の研究前記の表１に示されるように、ＲＡ−４２の二次速度定数は、１０容量％ＴＦＥ．ｐＨ５．８５で、２．８＊１０^-2Ｍ^-1ｓ^-1であり、エチルアミンとｐ−ニトロフェニルアセテートとの間の対応する反応の速度定数よりも１０００倍より大きい(Knowles,J.R.,外、J.Chem.Soc.Commun.,1967,755-757)。表１に示されるように、ＲＡ−４２のＨｉｓ−１１に触媒された反応は、同じ条件で４−メチルイミダゾールにより触媒された反応よりも８．３倍速い。水溶液中では、ＲＡ−４２の二次速度定数は５．０７＊１０^-2Ｍ^-1s^-1であり、４−メチルイミダゾールについては１．０５＊１０^-2Ｍ^-1s^-1であることが見いだされた。即ち観察された約５倍の速度の上昇は、１０容量％ＴＦＥ中でも殆ど同じであった。アシル移行反応の二次速度定数のｐＨ依存性を、５０ミリモル（ｍＭ）のビス −トリス緩衝剤中で２９０．２Ｋで測定した。ｐＨに対する二次速度定数の対数のプロットを図２に示す。反応は、ペプチドの濃度に関しては一次である。図２からわかるように、二次速度定数はｐＨと共に増加し、それは反応が脱保護された形のアミノ酸残基に依存することを示す。Ｏｒｎ−１５とｐ−ニトロフェニルフマレートとの間の直接反応で生成物が形成されるなら、二次速度定数の対数はｐＨ５から８の範囲で直線状のｐＨ依存性を示すであろう。何故なら、オルニチン残基の側鎖のｐＫａは多分１０と１１の間であるからである(Tanford,C.,Adv. Protein Chem．1962、17、69-165)。しかしながら、観察されたｐＨプロフィルはその機構から外れ、ｐＫａが６．５に近づくにつれて反応はアミノ酸残基に依存性であることを示す。ＲＡ−４２のアミノ酸配列は、イオン化可能な残基Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、ＬｙｓおよびＨｉｓを含み、そしてペプチド骨格のＣ−末端カルボン酸およびＮ−末端アミノ基を含む。小さいペプチドでのイオン化可能なアミノ酸残基の典型的なｐＫａが決定され(Tanford,C.,1962,supra)、６．５に近いｐＫａ値を有するＲＡ−４２中のアミノ酸は、６．４のｐＫａをもつＨｉｓだけである。Ｈｉｓ−１１の側鎖の対応する酸のｐＫａを、¹ＨＮＭＲ分光分析法で決定し（ＶａｒｉａｎＵｎｉｔｙ５００ＮＭＲ分光分析計、２９０Ｋで、ヒスチジン芳香族プロトンの化学的シフトをｐＨの関数として測定）、水溶液中で６．５５であることが見いだされた。従って、Ｈｉｓ−１１の最初の攻撃によるｐ−ニトロフェニルフマレートの初期アシル移行反応はアシル中間体を生じさせ、反応性イミダゾールを形成すると結論され得る。観察されたｐＨ依存性は、最初の段階は律速性であることも示す。４−メチルイミダゾリウムイオンのｐＫａが決定され、そして水溶液中で３０３Ｋにて７．９５であることが見いだされた。ｐＨ非依存性（独立性）領域での二次速度定数は、ｐＨ５．８５で測定した該定数から計算でき、１．３３Ｍ^-1ｓ^-1 である。測定したｐＫａ６．５５およびｐＨ５．８５での二次速度定数から計算した、ｐＨ非依存性領域でのＲＡ−４２の二次速度定数は０．３０５である。従って、ｐＨ非依存性領域での４−メチルイミダゾールの二次速度定数は、ＲＡ −４２の二次速度定数よりも４．４倍大きい。しかしながら、ブレンステッドの式（１）に基づくと、ｌｏｇｋ₂ ＝ β＊ｐＫａ＋Ａ（１）（βは、ｐ−ニトロフェニルアセテートのイミダゾール触媒加水分解については０．８；Bruice,T.C.,外,J.Am.Chem.Soc.,1958,80,2265-2267）であり、前記のｐＫａ値、４−メチルイミダゾールの二次速度定数は、ＲＡ−４２のそれよりも１３．２倍も大きいと予想されるであろう。従って、ペプチドＲＡ−４２は、多分、Ｏｒｎ−１５の側鎖により、変遷状態の延びた酸素アニオンを安定化することにより、Ｈｉｓ−１１のアシル化を３倍に触媒作用する。以上に述べたように、４−メチルイミダゾールに対するｐＨ５．８５でのＲＡ −４２の観察された速度上昇は、５倍に近い。過剰の速度上昇は、より強く親核性の４−メチルイミダゾールはＨｉｓ−１１の側鎖よりも大きくプロトン付加されるという事実による。ｐＨ５．８５で、プロトン付加されていないＨｉｓ−１１の濃度は、合計濃度が同じであるなら、プロトン付加されていない４−メチルイミダゾールの濃度の２１倍である。従って、速度上昇が濃度作用単独によるならば、ＲＡ−４２は、ｐＨ５．８５で１．６倍（２１／１３．２）効率のよい触媒であろう。従って、観察された速度の上昇は変遷状態の安定化およびｐＫａ抑制によるものであり、二つの因子は天然の触媒において共通に見られる。最終生成物はＯｒｎ−１５の側鎖におけるアミドであるので、反応の第２段階は、Ｈｉｓ−１１から脱プロトン形のＯｒｎ−１５への、速い分子内反応でのアシル基移行である。分子内反応の速度上昇は高い。何故なら、反応条件下での¹ ＨＮＭＲスペクトル操作で痕跡量の中間体も検出されなかったからである。しかし、Ｈｉｓ−１１のアシル化は律速段階であるので、中間体は測定できない。中間体の蓄積なしの速い分子内反応は、ＲＡ−４２の観察された一次速度とも一致する。前記の通り、ＲＡ−４２のヒスチジン残基はＯｒｎ−１５の側鎖に官能基を非常に選択的な反応で導入し、その後遊離のヒスチジンが再生される。他のオルニチン、Ｏｒｎ−３４、はアミドを形成せず、隣接するヒスチジン残基を持たない。Ｌｙｓ−１０はＨｉｓ−１１の隣りにあり、従って空間的に接近しているが、反応条件下でアミドを形成しない。本発明は、勿論、前記の具体例に限定されず、請求の範囲に定義した一般的な発明の概念から逸脱しないで、多くの修正および変更をしてもよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．試薬と基質との間でアシル化移行機構を含む化学反応を、該基質と変遷複合体を形成できるイミダゾール系触媒の存在下で行う方法において、触媒性イミダゾール機能が、該変遷複合体をアシル基との分子相互作用によって安定化することができる基で片側または両側がフランキンングされた、任意に置換されたイミダゾール基を含む化学構造要素によって与えられることを特徴とする方法。２．前記分子相互作用が、水素結合、静電的相互作用および疎水的相互作用から選ばれる請求の範囲１に記載の方法。３．前記フランキンング基が、該変遷複合体と分子相互作用することができる末端基に結合された、１ないし６個の鎖原子の鎖、好ましくは炭素原子１−４のアルキル鎖、を含むことを特徴とする請求の範囲１または２に記載の方法。４．ｐＨ条件が、前記アシル移行反応で基質と反応する試薬がかなりの程度プロトン付加されるように選択される請求の範囲１、２または３に記載の方法。５．前記フランキンング基が、正に荷電した水素結合ドナーである請求の範囲１ないし４のいずれか１項に記載の方法。６．前記化学構造要素が、イミダゾール基とフランキンング基とが幾何学的に相互に固定された関係にあるように配置されている固定構造を有することを特徴とする請求の範囲１ないし５のいずれか１項に記載の方法。７．前記化学構造要素がペプチドまたはポリペプチドであることを特徴とする請求の範囲１ないし６のいずれか１項に記載の方法。８．前記イミダゾール機能が、任意に置換されたヒスチジン残基によって与えられることを特徴とする請求の範囲１ないし７のいずれか１項に記載の方法。９．前記化学構造要素が、例えば、らせん−ループ−らせん型の、設計されたタンパク質またはポリペプチドの一部であることを特徴とする請求の範囲７または８に記載の方法。１０．前記化学構造要素が、α−らせん型であり、そして前記フランキンング基が、ｉの位置のイミダゾール機能に対してｉ＋４の位置に配置されていることを特徴とする請求の範囲７、８または９に記載の方法。１１．前記化学構造要素が、α−らせん型であり、そして前記フランキンング基が、ｉの位置のイミダゾール機能に対してｉ−３の位置に配置されていることを特徴とする請求の範囲７、８または９に記載の方法。１２．前記フランキンング基が、ヒスチジン、オルニチン、ロイシンおよびアルギニンから選ばれることを特徴とする請求の範囲７ないし１１のいずれか１項に記載の方法。１３．前記化学構造要素が、官能基を有する大きい構造を構成するかまたはその一部であり、該官能基は分子内反応において前記変遷複合体を介してアシル移行によって、基質によって選択的に機能化され得る程近接した位置にあることを特徴とする請求の範囲１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。１４．前記官能基が前記フランキンング基または該フランキンング基の一部である請求の範囲１３に記載の方法。１５．前記官能基が、ｉの位置のイミダゾール機能に対してｉ＋４の位置にあり、そしてオルニチン、ロイシンまたはジアミノ酪酸残基であることを特徴とする請求の範囲１４に記載の方法。１６．前記官能基が、ｉの位置のイミダゾール機能に対してｉ−３の位置にあり、そしてロイシン残基であることを特徴とする請求の範囲１４または１５に記載の方法。１７．前記官能基が、ｉの位置のイミダゾール機能に対してｉ＋４およびｉ−３の両方の位置にあり、そして例えば、ロイシンであることを特徴とする請求の範囲１５および１６に記載の方法。１８．構造要素によって１つより多くのイミダゾール機能が与えられ、そして各イミダゾール機能が、片側または両側が官能基によりフランキンングされていることを特徴とする請求の範囲１５ないし１７のいずれか１項に記載の方法。１９．前記官能基が、ｉ，ｊ、ｋ等の位置のイミダゾール機能に対してｉ＋４、ｊ＋４、ｋ＋４等の位置にあることを特徴とする請求の範囲１８に記載の方法。２０．前記官能基が、ｉ、ｊ，ｋ等の位置のイミダゾール機能に対してｉ−３、ｊ−３、ｋ−３等の位置にあることを特徴とする請求の範囲１８に記載の方法。２１．前記官能基が、炭水化物含有残基により機能化されることを特徴とする請求の範囲１２ないし２０のいずれか１項に記載の方法。２２．前記基質が固体支持体上に設けられ、それにより前記化学構造要素が該支持体に固定されることを特徴とする請求の範囲１２ないし２１のいずれか１項に記載の方法。２３．請求の範囲１ないし２０のいずれか１項に定義された、設計された化学構造要素。２４．アシル移行機構を含む反応用の化学触媒であって、該触媒が請求の範囲１ないし２０のいずれか１項に定義された、設計された化学構造要素を含むことを特徴とする化学触媒。２５．請求の範囲７ないし２０および２２のいずれか１項に定義された、設計された化学構造要素を構成するまたは含むタンパク質またはペプチドの製造法において、宿主生物を、ベクターおよび該構造要素をコードしたＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ構造で形質転換し、該宿主生物を培養して該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現させ、該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を培養物から分離することを特徴とする製造法。２６．ベクターおよび請求の範囲７ないし２３のいずれか１項に定義された化学構造要素をコードしたＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ構造。２７．所望の化学的機能を化学的化合物の特定の部位に導入する方法において、該化学化合物に請求の範囲１ないし２３のいずれか１項に定義された構造要素を与え、そして該化合物を所望の機能を与えることができる基質と反応させることを特徴とする方法。２８．前記基質が炭水化物残基を含むことを特徴とする、請求の範囲２７に記載の方法。２９．請求の範囲２８に記載の方法を、タンパク質分解からタンパク質を保護するのに使用する方法。３０．請求の範囲２８に記載の方法を、タンパク質の折りたたみに影響を及ぼすのに使用する方法。３１．１個より多くの基を選択的に機能化することができることを特徴とする請求の範囲１７ないし２０のいずれか１項に記載の方法の使用法。３２．前記官能基が炭水化物含有残基によって選択的に機能化されることを特徴とする、請求の範囲１７ないし２０のいずれか１項に記載の方法の使用法。３３．ワクチンの開発に使用する、請求の範囲１７ないし２２、３１および３２のいずれか１項に記載の方法の使用法。３４．免疫系の天然の成分に真似るために使用する、請求の範囲１２ないし２２、３１および３２のいずれか１項に記載の方法の使用法。３５．免疫系の成分のアンタゴニストを構成するために使用する、請求の範囲１２ないし２１、３１および３２のいずれか１項に記載の方法の使用法。３６．免疫系の成分のアゴニストを構成するために使用する、請求の範囲１２ないし２１、３１および３２のいずれか１項に記載の方法の使用法。３７．免疫系アンタゴニストの設計用の構造要素の開発のために使用する、請求の範囲３４に記載の方法の使用法。