JPH069700A - ポリエチレングリコール−ヒルジン結合体、その製造法及び血栓症の治療への使用 - Google Patents

ポリエチレングリコール−ヒルジン結合体、その製造法及び血栓症の治療への使用

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JPH069700A
JPH069700A JP5030212A JP3021293A JPH069700A JP H069700 A JPH069700 A JP H069700A JP 5030212 A JP5030212 A JP 5030212A JP 3021293 A JP3021293 A JP 3021293A JP H069700 A JPH069700 A JP H069700A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 簡単で直ぐに使用でき工業的スケールに適用
できるＰＥＧ−ペプチド結合体を製造する方法を提供す
ることを目的とする。 【構成】 適当な無水溶媒中ポリエチレングリコール又
はその誘導体（ＰＥＧ）を活性化し、活性化されたＰＥ
Ｇを回収し、該活性化されたＰＥＧとペプチドをカップ
リングさせる工程を含むポリエチレングリコール（又は
誘導体）−ペプチド（ＰＥＧ−ペプチド）結合体（conj
ugate ）の製造方法であって、ＰＥＧを、カルボニルジ
イミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び２，
３，５−トリクロロホルメート（2,3,5-trichloroforma
te）から選ばれる活性化剤によって活性化させ、活性化
されたＰＥＧの回収を疎水性有機溶媒により活性化混合
物から沈殿させることによって行うことを特徴とする製
造方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ポリエチレングリコー
ル（又は誘導体）−ペプチド結合体（conjugate ）、
（以下、「ＰＥＧ−ペプチド」と略す。）、特に、ポリ
エチレングリコール（又は誘導体）−ヒルジン（hirudi
n ）（ＰＥＧ−ヒルジン）結合体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ポリエチレングリコールの様な化合物及
びその誘導体（以下ＰＥＧと略す。）又はデキストラン
は、ヒトにおいて免疫原性がないことが知られており，
薬物学的使用を目的とする蛋白質と合わせて使用するこ
とが、インビボ（in vivo ）でこれら蛋白質の半減期を
延長するために提案されている。
【０００３】即ち、ペプチド、例えばヒルジンは、６５
〜６６アミノ酸を含有するペプチドの混合物の形態で医
用ヒルの唾液腺にその主な供給源があり、非常に特異的
且つ効果的なトロンビン阻害特性が知られているが、血
流から直ぐに除去されてしまう。その半減期は、約１時
間である。それゆえ、ヒルジンのインビボでの半減期を
延ばすことは、特に血栓症の予防に使用するために有効
である。
【０００４】インビボにおける半減期を延ばすために、
デキストラン−ヒルジン結合体が、ピー．クローズ（P.
Crause）によって作られた（EP-A-0,345,616）。ラット
において、デキストラン−ヒルジンの半減期は、遊離の
ヒルジンの半減期に比べ、インビボで増加したが、デキ
ストランとヒルジンとを結合する方法の収率が非常に低
く、結合したヒルジンの活性の７０％以上が失なわれる
のが観察される。
【０００５】ＰＥＧ−ペプチド結合も知られており、ま
た共有結合によって一般的に得られる。
【０００６】ペプチドとＰＥＧのカップリングの方法は
ＰＥＧの活性化とペプチドと活性化したＰＥＧのペプチ
ドとのカップリングという主たる２つのステップを包含
する。
【０００７】最初の活性化ステップが、一般に得られる
結合体の最終収率を限定する。
【０００８】確かに、従来の方法によって、活性化した
ＰＥＧを精製し回収するステップを必要とするＰＥＧ活
性化方法が提案されているが、これは、収率が低い。
【０００９】確かに、ベアウチャンプら（Beauchamp et
al.）（アナリティカルバイオケミストリー(Analytica
l Biochemistry) 1983, 131 ,25-33）は、水に対する広
範（extensive ）な透析と凍結乾燥によって活性化ＰＥ
Ｇを精製するステップを含む、ジオキサン中でカルボニ
ルジイミダゾールとの反応によってＰＥＧを活性化する
方法を開示している。
【００１０】広範なので、この透析は工業的スケールに
適用する場合に問題がある。更に、活性化したＰＥＧ
は、水溶液媒体中で不活性化され、それによって透析ス
テップによる活性化反応の収率を下げることになる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡単で直ぐ
に使用でき工業的スケールに適用できるＰＥＧ−ペプチ
ド結合体を製造する方法を提供することを目的とする。
本発明は、更に、ヒルジンの少なくとも８０％がＰＥＧ
と結合し、得られる結合体が出発物質のヒルジンに比べ
て１００％近く活性を保持しているようなＰＥＧ−ヒル
ジン結合体を製造する方法を提供することを目的とす
る。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成すべく鋭意研究を重ねた結果、以下のような方法を
見出して本発明を完成した。
【００１３】即ち、本発明の方法は、適当な無水溶媒中
でＰＥＧを活性化し、ＰＥＧを回収する公知のステップ
及びペプチドとの反応を含む。
【００１４】ＰＥＧ、即ち、ポリエチレングリコール及
びその誘導体は、主にポリエチレングリコール及びポリ
エチレングリコールのＣ1〜Ｃ6の低級脂肪族モノエーテ
ル、ポリエチレングリコールの芳香族モノエーテルまた
はモノエステル並びに単量体単位に関して総数のエチレ
ングリコール単位の少なくとも９０％を含有するポリグ
リコール化（polyglycolated）された誘導体を意味する
と理解されるものである。
【００１５】驚くべきことに、カルボニルジイミダゾー
ル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び２，３，５−ト
リクロロホルメート（2,3,5-trichloroformate）から選
ばれる試薬で活性化することによって活性化されたＰＥ
Ｇは、疎水性有機溶媒によって活性混合物から沈殿によ
って簡単に精製され、続くペプチドとの縮合ステップに
おいても活性を維持することが見出された。
【００１６】疎水性有機溶媒としては、例えば、脂肪族
エーテル又は炭化水素を含む、非極性または僅かに極性
のある非プロトン性の溶媒から選ばれる。
【００１７】この疎水性有機溶媒として、エチルエーテ
ル、ペンタン、ヘキサンまたはヘプタンから選択される
ものが有利であり、特にエチルエーテルが好ましい。
【００１８】活性化したＰＥＧは、濾過によって回収さ
れ凍結乾燥される。
【００１９】ＰＥＧ活性化反応は、適当な無水溶媒中、
好ましくは極性非プロトン性の溶媒中で行われるのが良
い。
【００２０】適当な無水溶媒としては、一般に、ジオキ
サン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチ
ルスルホキシドまたはテトラヒドロフランから選ばれ
る。
【００２１】好ましくは、ＰＥＧは、活性化剤としてカ
ルボニルジイミダゾールによって活性化される。
【００２２】ＰＥＧの活性化において、ＰＥＧ１モルに
対し、活性化剤は５〜５０モル、好ましくは１０〜２０
モル使用される。
【００２３】本発明の方法に使用されるＰＥＧは、分子
量が２，０００〜１００，０００、好ましくは２，００
０〜５０，０００が良く、ポリエチレングリコール及び
ポリエチレングリコールのＣ1〜Ｃ6の低級脂肪族モノエ
ステルから選ばれる。
【００２４】従って、カルボニルジイミダゾールとの反
応によって得られる活性化されたＰＥＧは、以下の一般
式Ｉ：
【００２５】
【化１】
【００２６】〔式中、Ｒは、水素原子、Ｃ1〜Ｃ6のアル
キル基又はカルボニルイミダゾール基、ｎは、約４５〜
２，４００を示す。〕で表される。ペプチドとのカップ
リングは、ペプチドの遊離のアミノ官能基によりイミダ
ゾール環を置換することによって僅かにアルカリ性で行
われる。
【００２７】このようにして得られる結合体は、以下の
一般式ＩＩ：
【００２８】
【化２】
【００２９】〔式中Ｒおよびｎは、上記に同じ。〕で表
される。
【００３０】特に有利な方法として、本発明の方法は、
ＰＥＧ−ヒルジン結合体の製造に使用される。
【００３１】ヒルジンは、医用ヒルの唾液腺から抽出さ
れる天然のヒルジン、その天然変異体（variants、その
いくつかはＨＶ１、ＨＶ２及びＨＶ３と称されてい
る）、並びに遺伝子工学によって産生され、抗トロンビ
ン活性を有する変異体及びアナログ（analogs ）を意味
すると理解される。
【００３２】遺伝子工学によるこれらペプチドの製造
は、特に、特許出願EP-A-0,158,564、EP-A-0,200,655、
EP-A-0,273,800及びEP-A-0,332,529中に記載されてい
る。
【００３３】ヒルジンは、ペプチド配列中に数個のリジ
ン基を有している。活性化されたＰＥＧは、それゆえ、
ランダムな方法でペプチドのＮ−末端官能基またはいず
れかの異なるリジン基のアミン官能基に結合し得る。
【００３４】しかし、予想外にも、活性化されたＰＥＧ
は、ヒルジンのＮ−末端アミンに結合しておらず、それ
によってペプチド単独の抗トロンビン活性に近い活性を
有する結合体を得ることができる。
【００３５】その結果、本発明は、また、ＰＥＧ−ヒル
ジン結合体の製造方法にも係り、この方法は： ａ）適当な無水溶媒中でのカルボニルジイミダゾールと
の反応によるＰＥＧの活性化、 ｂ）疎水性溶媒を用いての沈殿による活性化されたＰＥ
Ｇの回収、 ｃ）わずかにアルカリ性の媒体中、ヒルジン又はその変
異体と活性化されたＰＥＧとの縮合及び ｄ）得られた結合体の精製 の各工程を包含する。
【００３６】活性化されたＰＥＧの製造及びペプチドと
の縮合の工程ａ）、ｂ）及びｃ）は、上記に記載した条
件に従って行われる。
【００３７】ＰＥＧ−ヒルジン結合体の精製のステップ
ｄ）は、一般に以下の２ステップのクロマトグラフィー
によって行われる： ｄ１）反応していない過剰のＰＥＧを除去する陰イオン
交換クロマトグラフィー及びそれに続く ｄ２）残留する遊離ヒルジンから結合体を分離する逆相
クロマトグラフィー。
【００３８】ｄ１）で用いられる陰イオン交換樹脂は、
Ｄ−セファロース又はＱ−セファロースが有利であり、
ｄ２）で行われる逆相（reversed phase）は、ＲＰ３０
０又はＲＰ８相が有利である。
【００３９】抗トロンビン活性を有して得られる結合し
たヒルジンの収率は、６０％以上である。
【００４０】有利に、本発明の方法は、ヒルジン変異体
ＨＶ２−Ｌｙｓ４７に使用される。
【００４１】最後に、本発明は、上記に記載した方法に
よって得られるＰＥＧ−ヒルジン結合体及び血栓症の治
療における治療薬としてのそれらの使用にも係る。
【００４２】以下の実施例は、添付図面を参照して、活
性化されたＰＥＧの製造、ＰＥＧ−ヒルジン結合体の製
造及び得られた結合体の抗トロンビン活性について、本
発明を例示することを目的としている。
【００４３】
【実施例】
実施例１ 活性化されたＰＥＧモノメチルエーテル
（５，０００）（ＭＰＥＧ５，０００）の製造 ＭＰＥＧ５，０００を活性化する反応は、すべて、無水
媒体中で行う。それゆえ、まず、反応媒体の構成物中に
存在するわずかな水も除去する。ＭＰＥＧ５，０００
（メルク(Merck) ）及びＮ，Ｎ´−カルボニルジイミダ
ゾール（ＣＤＩ）（アルドリッチ(Aldrich) ）の貯蔵
は、水を捕獲するためにシリカゲルを含むデシケーター
中で行う。５Ａのモレキュラーシーブ（プロラボ(Prola
bo) ）を、４００℃に加熱したオーブン中で乾燥さ
せ、、その後温度を５０℃に下げた後、該モレキュラー
シーブを５００ｍｌのジオキサン（ＳＤＳ）に加え、溶
媒中に存在する水を捕獲する。
【００４４】２５ｇ（約４ｍｍｏｌ）のＭＰＥＧを、
８．１ｇ（約５０ｍｍｏｌ）のＣＤＩに加え、混合物を
少なくとも２時間凍結乾燥する。乾燥した粉末を、５０
ｍｌのジオキサンに加え、ＭＰＥＧ５，０００をＣＤＩ
で活性化させる反応を、攪拌しながら３７℃で２時間行
う。ＭＰＥＧ５，０００分子は、たった１つの遊離のヒ
ドロキシ基を有しているので、可能な活性化部位を１か
所のみ有していることになる。
【００４５】活性化されたＭＰＥＧ５，０００の回収
は、エーテルを用いて沈殿させることによって行う。反
応媒体中の温度が２０℃又はそれ以下になった時点で、
２容量のエーテルを攪拌しながら加えると、ＭＰＥＧ
５，０００は即座に沈殿するが、過剰のＣＤＩ及び反応
中に遊離したイミダゾールは、溶液中に存在する。該溶
液をワットマン（Whatmann）４４フィルターで濾過し、
フィルターをエーテルで洗浄した後、凍結乾燥した活性
化されたＭＰＥＧ５，０００の沈殿物を、５０ｍｌのジ
オキサン中に入れ、上述したようにエーテルで再沈殿さ
せる。濾過後、活性化されたＭＰＥＧを、終夜凍結乾燥
し、水分から防御するために、シリカゲルを含むデシケ
ーター中で保存する。
【００４６】実施例２ 活性化されたＰＥＧ５０，００
０の製造 ＰＥＧ５０，０００を活性化する反応は、すべて、無水
媒体中で行う。全ての痕跡量の水を除去するために、Ｐ
ＥＧ５０，０００、ＣＤＩ及びジオキサンを、実施例１
に記載したように処理する。
【００４７】１９．２ｇ（約３８４μｍｏｌ）のＰＥＧ
５０，０００を、１ｇ（約６ｍｍｏｌ）のＣＤＩに加
え、混合物を少なくとも２時間凍結乾燥する。乾燥した
粉末を、５０ｍｌのジオキサンに加え、ＰＥＧ５０，０
００をＣＤＩで活性化させる反応を、攪拌しながら６０
℃で１５時間行う。ＰＥＧ５０，０００の分子は、２つ
の遊離のヒドロキシ基を有している：それゆえ、ＰＥＧ
５０，０００の１分子につき２つの可能な活性化部位が
ある。
【００４８】活性化されたＰＥＧ５０，０００を、実施
例１に記載したようにエーテルで沈殿させることによっ
て回収する。１８．６ｇの活性化されたＰＥＧ５０，０
００が回収される。
【００４９】実施例３ ヒルジン−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４
７と活性化されたＭＰＥＧ（５，０００）とのカップリ
ング Ａ．ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７とＭＰＥＧ５，０００との結
合（Conjugation ） ３ｇ（約０．５ｍｍｏｌ）の実施例１の活性化されたＭ
ＰＥＧ５，０００と、１５ｍｇ（約２μｍｏｌ）のｒＨ
Ｖ２−Ｌｙｓ４７を、１００ｍＭ ホウ酸塩バッファー
（borate buffer ）（ｐＨ８．４）２５ｍｌ中で混合す
る。反応媒体を攪拌しながら４℃で１２時間放置する。
活性化されたＭＰＥＧ５，０００は、水と接触すると急
速に活性を失うので、３ｇの活性化したＭＰＥＧ５，０
００を、１２時間毎に順次反応媒体に４回加える。４度
目の活性化されたＭＰＥＧ５，０００の添加の後、反応
媒体を再度４℃で４８時間放置する。
【００５０】Ｂ．ＭＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙ
ｓ４７結合体の精製 ＭＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７結合体の精
製を以下の２段階で行なう：即ち、 i) 陰イオン交換クロマトグラフィーによって、ＭＰＥ
Ｇ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７及びｒＨＶ２−Ｌ
ｙｓ４７をカラムに吸着させ、遊離の保持されていない
過剰のＭＰＥＧを除去する。
【００５１】ii) 逆相カラムクロマトグラフィーによっ
て、残存するｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を、ＭＰＥＧ５，０
００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７から分離する。
【００５２】１．Ｑ−セファロースでの陰イオン交換ク
ロマトグラフィー 直径１４ｍｍのバイオラッドカラム（Biorad column ）
に１０ｍｌの相（phase ）を注ぎ入れ、５０ｍｌの平衡
化バッファー：１０ｍＭ ホウ酸塩（borate）で、流速
１ｍｌ／分で平衡化する。全クロマトグラフィーを流速
１ｍｌ／分で行う。Ａで得られたＭＰＥＧ５，０００−
ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を含有する反応媒体を、水で１０
倍に希釈し、１０ｍＭホウ酸塩を含有する溶液とする。
約２５０ｍｌの試料を得、これをＱ−セファロースカラ
ムにかける。カラムを５０ｍｌの平衡化バッファーで洗
浄し、溶出を１０ｍｌの１０ｍＭホウ酸塩バッファー
（ｐＨ８．５）、１Ｍ ＮａＣｌを用いて行い、カラム
を平衡化バッファーで再度平衡化する。遊離のｒＨＶ２
−Ｌｙｓ４７及びＭＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙ
ｓ４７を含む２０ｍｌの試料が回収される。これは、溶
出１０ｍｌとカラムの再平衡化の１０ｍｌとを合わせた
ものに相当する。
【００５３】２．逆相ＲＰ３００でのクロマトグラフィ
ー 全クロマトグラフィーを流速１ｍｌ／分で行う。アクア
ポアー（Aquapore）ＲＰ３００カラム（直径９５ｍｍ、
長さ２５０ｍｍ（アプライドバイオシステムズ(Applied
Biosystems)社））及びヒューレットパッカード社（He
wlett Packard）ＨＰ１０９０ＨＰＬＣを使用する。
【００５４】遊離のｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７及びＭＰＥＧ
５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を含む１で得られた
試料のｐＨを、１０ｍＭ ＴＦＡ平衡化バッファー水溶
液でｐＨ２に低下させる。これにより、最終容量が３５
ｍｌになる。５ｍｌの試料を、ＲＰ３００カラムにイン
ジェクトし、カラムを平衡化バッファーで洗浄すること
により、試料中の塩を除去する。次いで、溶出を１０ｍ
Ｍ ＴＦＡを含有する０から１００％のアセトニトリル
の４０分グラジエントで行い、その後カラムを１０〜２
０ｍｌの平衡化バッファーで洗浄する。蛋白質の溶出
は、ＯＤを２１５ｎｍで測定することによってモニタリ
ングする。操作は、７回行い、こうして３５ｍｌの試料
をクロマトグラフィーにかける。クロマトグラムを、図
１に示す。２つの画分が回収される：即ち、 −画分１は、リテンション時間が１５分であり、遊離の
ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を含有するピークに相当する。
【００５５】−画分２は、リテンション時間が１９〜２
２分であり、ＭＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４
７を含有するピークに相当する。
【００５６】ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７（画分１）及びＭＰ
ＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の溶出ピークの
比較から、９５％以上のｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７がＭＰＥ
Ｇ５，０００と結合していることが判る。
【００５７】７回のクロマトグラフィーで得られる遊離
のｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を含有する７つの画分１を混合
し、終夜凍結乾燥し、ＰＢＳバッファー中に入れる（表
参照）。この操作を、ＭＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−
Ｌｙｓ４７を含む７つの画分２についても同様に行う。
【００５８】得られた結合体のＮ末端配列は、通常の方
法で決定でき、その結果、活性化されたＭＰＥＧ５，０
００は、ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の末端のアミン官能基に
結合していないことを確認する。
【００５９】実施例４ ヒルジン ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４
７と活性化されたＰＥＧ５０，０００とのカップリング Ａ．ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７とＰＥＧ５０，０００との結
合 ２ｇ（約４０μｍｏｌ）の実施例２の活性化されたＰＥ
Ｇ５０，０００と、２ｍｇ（約２８０ｎｍｏｌ）のｒＨ
Ｖ２−Ｌｙｓ４７を、１００ｍＭ ホウ酸塩バッファー
（ｐＨ８．４）５ｍｌ中で混合する。反応媒体を攪拌し
ながら４℃で２４時間放置する。活性化されたＰＥＧ５
０，０００は、水と接触すると急速に活性を失うので、
１００ｍＭ ホウ酸塩バッファー５ｍｌ中に含まれる２
ｇの活性化したＰＥＧ５０，０００を、２４時間毎に順
次反応媒体に４回加える。３６ｍｌのＰＥＧ５０，００
０−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の溶液が回収される。
【００６０】Ｂ．ＰＥＧ５０，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙ
ｓ４７結合体の精製 ＭＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の場合と同
様に、ＰＥＧ５０，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７結合
体の精製を以下の２段階で行う：即ち、 i) 陰イオン交換クロマトグラフィー、及び ii) 逆相カラムクロマトグラフィー。
【００６１】１．Ｑ−セファロースでの陰イオン交換ク
ロマトグラフィー 直径１４ｍｍのバイオラッドカラムに１０ｍｌの相を注
ぎ入れ、５０ｍｌの平衡化バッファー：１０ｍＭ ホウ
酸塩（ｐＨ８．５）で、流速１ｍｌ／分で平衡化する。
全クロマトグラフィーを流速１ｍｌ／分で行う。Ａで得
られるＰＥＧ５０，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を含
有する反応媒体を、水で１０倍に希釈し、１０ｍＭホウ
酸塩を含有する溶液とする。約３６０ｍｌの試料を得、
これを３回にわけてＱ−セファロースカラムでのクロマ
トグラフィーにかける。１２０ｍｌの試料をＱ−セファ
ロースカラムにかけ、カラムを５０ｍｌの平衡化バッフ
ァーで洗浄し、溶出を１０ｍｌの１０ｍＭホウ酸塩バッ
ファー（ｐＨ８．５）、１Ｍ ＮａＣｌで行い、カラム
を平衡化バッファーで再度平衡化する。遊離のｒＨＶ２
−Ｌｙｓ４７及びＰＥＧ５０，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙ
ｓ４７を含む４０ｍｌの試料が回収される。これは、溶
出１０ｍｌとカラムの再平衡化の最初の３０ｍｌの和に
相当する。
【００６２】２．逆相リクロスフェアー（Lichrospher
e）ＲＰ８でのクロマトグラフィー 全クロマトグラフィーを流速１ｍｌ／分で行う。５μリ
クロスフェアーＲＰ８カラム（直径４ｍｍ、長さ１２５
ｍｍ（ヒューレットパッカード社））及びヒューレット
パッカード社ＨＰ１０９０ＨＰＬＣを使用する。
【００６３】遊離のｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７及びＰＥＧ５
０，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を含む１で得られた
試料のｐＨを、純粋なＴＦＡ２００μｌでｐＨ１．５に
低下させる。カラムを１０ｍＭ ＴＦＡ平衡化バッファ
ー水溶液で平衡化する。２０ｍｌの試料を、ＲＰ８カラ
ムにインジェクトし、カラムを平衡化バッファーで洗浄
することにより、試料中の塩を除去する。溶出は、１０
ｍＭ ＴＦＡを含有する０から１００％のアセトニトリ
ルの４０分グラジエントで行い、その後カラムを１０〜
２０ｍｌの平衡化バッファーで洗浄する。蛋白質の溶出
は、ＯＤを２１５ｎｍで測定することによってモニタリ
ングする。操作は、２回行い、こうして４０ｍｌの試料
をクロマトグラフィーにかける。クロマトグラムを、図
２に示す。２つの画分が回収される：即ち、 −画分１は、リテンション時間が１５分であり、遊離の
ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を含有するピークに相当する。
【００６４】−画分２は、リテンション時間が２０〜３
０分であり、ＰＥＧ５０，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４
７を含有するピークに相当する。
【００６５】ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７（画分１）及びＰＥ
Ｇ５０，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７（画分２）の溶
出ピークの比較から、７０％以上のｒＨＶ２−Ｌｙｓ４
７がＰＥＧ５０，０００と結合していることが判る。
【００６６】２回のクロマトグラフィーで得られる遊離
のｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を含有する７つの画分１を混合
し、終夜凍結乾燥し、ＰＢＳバッファー中に入れる。こ
の操作を、ＰＥＧ５０，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７
を含む２つの画分２についても同様に行う。
【００６７】実施例５ 得られた結合体の定量と活性 実施例３及び４で得られた結合体の定量を３種の異なる
方法： −逆相分析クロマトグラフィー（分析ＨＰＬＣ）、 −抗トロンビン活性試験及び −アミノ酸分析 によって行った。
【００６８】ａ）分析クロマトグラフィー ５μリクロスフェアーＲＰ８カラム（直径４ｍｍ、長さ
１２５ｍｍ（ヒューレットパッカード社））及びヒュー
レットパッカード社ＨＰ１０９０ＨＰＬＣを使用する。
流速は、全クロマトグラフィーの間１ｍｌ／分である。
【００６９】ＲＰ８リクロスフェアーカラムを、平衡化
バッファー：３０％アセトニトリル、１０ｍＭ ＴＦＡ
及び７０％水で平衡化する。５００μｌのＰＢＳに含有
されている約２５μｇのＰＥＧ−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７
をカラムにインジェクトし、平衡化バッファーでカラム
を洗浄後、溶出を１０ｍＭ ＴＦＡを含む３０から６５
％アセトニトリル／水の４０分グラジエントで行い、そ
の後カラムを平衡化バッファーで再度平衡化する。蛋白
質の溶出は、蛋白質に特徴的なＯＤ２１５ｎｍを測定す
ることによってモニタリングする。クロマトグラムに存
在する溶出ピークの面積は、カラムにインジェクトした
蛋白質の量に比例する。上述の様な条件下でｒＨＶ２−
Ｌｙｓ４７の既知量をクロマトグラフィーすることによ
り、溶出ピークとインジェクトされたｒＨＶ２−Ｌｙｓ
４７の量とを相関させることができる。
【００７０】ｂ）抗トロンビン活性 ヒルジンの活性を、トロンビン抑制試験によってアッセ
イする。この試験に使用する基質は、トロンビンによっ
て切断され、４１０ｎｍで吸光を示す発色基（Chromoph
ore ）を遊離するクロモザイムＰＬ（Chromozym PL）
（トシル−グリシル−プロリル−リシン−４−ニトラニ
リドアセテート）である。
【００７１】発色基の形成速度は、反応媒体中に存在す
る活性トロンビンの量に依存する。ヒルジンの存在下、
トロンビンは抑制され、発色基の形成速度は、遅くな
る。
【００７２】活性試験に使用した物質 −ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７：２．５ｍｇ／ｍｌ、氷上に保
存 −トロンビン：カイネティックスバッファー中３．３μ
ｇ／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）、氷上に保存 −クロモザイムＰＬ（ベーリンガー）：６．６６ｍｇ／
ｍｌ、室温で保存 −カイネティックスバッファー：５０ｍＭ トリス−塩
酸 ０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．１％ ＰＥＧ ６，０００ ｐＨ ７．９ ３７℃にサーモスタットで調整する。
【００７３】反応は、水浴を用いて、３７℃にサーモス
タットで調整したスペクトロフォトメーター中４１０ｎ
ｍでモニターする。０〜１００μｌのヒルジンを１ｍｌ
のプラスティックスペクトロメーターキュベット中でカ
イネティックスバッファー中５０μｌトロンビンと混合
し、最終容量９８０μｌとする。キュベットをあらかじ
め３７℃で３分間プレインキュベートし、ヒルジンをト
ロンビンに結合させる。２０μｌのクロモザイムを各キ
ュベットに加え攪拌後、ＯＤを毎分３分間４１０ｎｍで
測定する。結果はＯＤ／分で得られる。
【００７４】ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の比活性（specific
activity ）は公知であり（１５，０００ＡＴＵ／ｍ
ｇ）、結合体の活性をアッセイすることにより、結合体
の量が判る。
【００７５】Ｃ）アミノ酸の分析 アミノ酸分析を、従来公知の方法によって行う。結合体
を６Ｎ ＨＣｌ蒸気で加水分解し、アミノ酸を５％ｎ−
ヘプタン中２５４ｎｍで吸光するフェニルイソシアネー
ト（ＰＩＴＣ）と結合させる。アミノ酸結合体をＣ18逆
相カラムにインジェクトし、種々の結合体を分離できる
グラジエントを用いて溶出する。ＰＩＴＣとアミノ酸と
の結合及びクロマトグラフィーは、アプライドバイオシ
ステムズ社 １３０Ａ アミノ酸アナライザーを用い
た。逆相カラムでのリテンション時間は、各アミノ酸結
合体に特異的である。アミノ酸結合体の標準溶液によっ
て、これらのリテンション時間を決定することができ、
またｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の結合体の加水分解物中に存
在するアミノ酸の量を決定することができる。ｒＨＶ２
−Ｌｙｓ４７のアミノ酸構成は知られているので、この
ように分析したｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の正確な量を決定
することができる。
【００７６】実施例３及び４の結合体について得られた
結果を以下の表１に示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】これら２種の実施例において、活性試験
は、分析ＨＰＬＣ又はアミノ酸分析によって得られる定
量結果と同様の結果を与えるという事実により、明らか
に、得られたＰＥＧ−ヒルジン結合体のほぼ１００％が
活性を有する（実施例３では、８５から９８％、実施例
４では、６３から８８％）ことが判る。
【００７９】実施例６ ヒルジン ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４
７並びにＭＰＥＧ５０，０００及びＰＥＧ５０，０００
との結合体２種の阻害定数の測定 阻害定数の分析を、アール．エス．ストーン及びジェ
イ．ホフスティーンジ（R.S.Stone and J.Hofsteenge、
バイオケミストリー(Biochemistry)、1986,25,4628及び
バイオケミストリー(Biochemistry)、1991,4 ,295-300
）に記載の方法に従って行う。
【００８０】ヒルジンは競合型の機構に従ってトロンビ
ンを阻害する。阻害定数はそれゆえ以下のようにして計
算できる。
【００８１】Ｋi＝Ｋi´／（１＋Ｓ／ＫM） Ｋi＝阻害定数 Ｋi´＝見掛けの阻害定数 ＫM＝３．６３μＭ＝ミハエリス定数 Ｓ＝基質濃度 Ｋi´及びＳが測定できる。
【００８２】結果を以下の表２に示す。
【００８３】
【表２】
【００８４】ＭＰＥＧ５，０００又はＰＥＧ５０，００
０の結合は、ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７−トロンビン複合体
における阻害定数に影響を及ぼさない。これらの結果に
より、ＰＥＧ−ヒルジン結合体は、遊離のヒルジンと同
様の効果のあるトロンビン阻害物質であることが判る。
【００８５】実施例７ インビボにおける薬物速度論的
試験 遊離のｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７及びＰＥＧ−ｒＨＶ２−Ｌ
ｙｓ４７のラット血漿における半減期を測定するため
に、以下の２種の実験を行った： −短期間の試験：ラットに麻酔がきいている最大５〜６
時間のみ続ける。
【００８６】−長期間の試験：４８時間続け、ラットは
試験の期間中意識がある。
【００８７】実験において、３００ｇのスプラークドー
レー種（Spraque Dawley strain ）のラットを使用す
る。実験開始前５日間、ラットをそれぞれのケージに分
け、１３時間の昼−夜周期に順応させ、水と食物を自由
摂取させる。
【００８８】血液試料を、血液４容量に対して１容量と
なるように３．２％クエン酸ナトリウム溶液をあらかじ
め入れたプラスティックチューブに集める。
【００８９】血漿を、採血から１０分以内に、室温で５
分間４，０００ｇで遠心することにより調製する。血漿
試料を−８０℃で保存する。使用した結合体は、短期間
の試験においてはＭＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙ
ｓ４７、長期間の試験においてはＭＰＥＧ５，０００−
ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７及びＰＥＧ５０，０００−ｒＨＶ
２−Ｌｙｓ４７を使用する。
【００９０】ａ）短期間の試験 各試験を２匹のラットで並行して行う。実験の日にラッ
トにペントバルビタールナトリウム塩（５０ｍｇ／ｋ
ｇ）を腹腔内投与して麻酔をする。カテーテルを右の頸
静脈に入れ、遊離形態（コントロール）又は結合した形
態のｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７ ５００μｇを投与する。第
２のカテーテルを、左の頸動脈に入れ、血液試料を集め
る。
【００９１】血液試料は、ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７又はＰ
ＥＧ−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７注射前（ｔ0）並びに注射
後５分、１０分、２０分、１時間、２時間、４時間、５
時間及び６時間後に集める。
【００９２】ｂ）長期間の試験 各試験を２匹のラットで並行して行う。実験の日に、ラ
ットの尾の血管に、遊離形態（コントロール）又は結合
した形態のｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を５００μｇ投与す
る。血液試料は、ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７又はＰＥＧ−ｒ
ＨＶ２−Ｌｙｓ４７注射前（ｔ0）並びに注射後５分、
８時間及び２４時間後に尾の血管からエーテルでの緩や
かな麻酔下で集める。これら期間を除き、ラットは実験
中全て意識がある。
【００９３】ｃ）血漿試料の分析 短期間の試験において、遊離形態（コントロール）又は
結合した形態のｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の量を、ＥＬＩＳ
Ａ試験及び活性試験によって決定する。キャリブレーシ
ョン系列は、集められた試料と同じ様な条件にするため
に、ｔ0に集められた血漿で希釈したｒＨＶ２−Ｌｙｓ
４７又はＭＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の
適切に定量された溶液で調製する。血漿試料は、カイネ
ティックスバッファーで希釈され、ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４
７の濃度が、キャリブレーションの範囲に入るようにす
る。長期間の試験においては、遊離または（ＭＰＥＧ
５，０００及びＰＥＧ５０，０００と）結合したｒＨＶ
２−Ｌｙｓ４７の量を、抗トロンビン活性試験によって
決定する。これらの分析の結果は、短期間の試験につい
ては図３に、長期間の試験については図４に示す。ｒＨ
Ｖ２−Ｌｙｓ４７のＣ−末端の脱離（degradation ）
が、血漿中で起こり、それにより、ＥＬＩＳＡ試験及び
活性試験により得られる定量結果の差が説明される。事
実、ＥＬＩＳＡ試験に用いた２種の抗体の１つは、ｒＨ
Ｖ２−Ｌｙｓ４７のＣ−末端部分を認識するので、活性
が残っている脱離された分子を認識しなくなる。
【００９４】しかしながら、ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を遊
離の形態又はＭＰＥＧ５，０００と結合した形態で、同
量をラットに注射した場合、ＭＰＥＧ５，０００−ｒＨ
Ｖ２−Ｌｙｓ４７の血漿濃度は、遊離のｒＨＶ２−Ｌｙ
ｓ４７の場合に比べ、７〜８倍高い。従って同一レベル
の阻害を得るには、遊離のｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７よりも
７〜８倍少ない量のＭＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌ
ｙｓ４７を注射すればよい。
【００９５】図４に示した薬物速度論的結果により、Ｍ
ＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の半減期は、
ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７のそれと比較して増大しているこ
とが判る。一方、ＰＥＧ５０，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙ
ｓ４７の半減期は、上記２種のそれよりも、実質的に大
きい。確かに、注射３時間後、注射前の最初に測定した
活性と比較して、ＰＥＧ５０，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙ
ｓ４７結合体で処置したラットで、５０％以上の抗トロ
ンビン活性が、ＭＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ
４７結合体で処置したラットで３０％の抗トロンビン活
性が観察される。１０％未満の抗トロンビン活性が、遊
離の形態のヒルジンをラットに注射した後８時間で測定
される。
【００９６】本発明によって製造されるＭＰＥＧ５，０
００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の生産コストは、遊離のｒ
ＨＶ２−Ｌｙｓ４７の生産コストに比べ、僅かに増加す
るだけなので、薬物学的にＭＰＥＧ５，０００−ｒＨＶ
２−Ｌｙｓ４７を使用することは、ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４
７を使用するよりも、実質的にコストが減少できること
になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＰ３００カラムでのＰＥＧモノエチルエーテ
ル５，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７（ＭＰＥＧ−ｒＨ
Ｖ２−Ｌｙｓ４７）のクロマトグラフィー後に得られる
クロマトグラムを示す。蛋白質の溶出は、光学密度（Ｏ
Ｄ）を２１５ｎｍで測定することにより経時的にモニタ
ーする。
【図２】リクロスフェアー（Lichrosphere）ＲＰ８カラ
ムでのＰＥＧ５０，０００−ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７のク
ロマトグラフィー後に得られるクロマトグラムを示す。
蛋白質の溶出は、光学密度（ＯＤ）を２８０ｎｍで測定
することにより経時的にモニターする。
【図３】実施例７ｃに記載される短期間の試験の間の時
間を横軸にとり、縦軸に遊離又は結合したｒＨＶ２−Ｌ
ｙｓ４７の血漿中の濃度を示すグラフである。
【図４】実施例７ｃで記載される長期間の試験の間の時
間を横軸にとり、縦軸に遊離又は結合したｒＨＶ２−Ｌ
ｙｓ４７のパーセンテージ活性を示すグラフである。

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 適当な無水溶媒中ポリエチレングリコー
    ル又はその誘導体（ＰＥＧ）を活性化し、活性化された
    ＰＥＧを回収し、該活性化されたＰＥＧとペプチドをカ
    ップリングさせる工程を含むポリエチレングリコール
    （又は誘導体）−ペプチド（ＰＥＧ−ペプチド）結合体
    （conjugate ）の製造方法であって、ＰＥＧを、カルボ
    ニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及
    び２，３，５−トリクロロホルメート（2,3,5-trichlor
    oformate）から選ばれる活性化剤によって活性化させ、
    活性化されたＰＥＧの回収を疎水性有機溶媒により活性
    化混合物から沈殿させることによって行うことを特徴と
    する製造方法。
  2. 【請求項２】 該疎水性有機溶媒が、非極性または僅か
    に極性のある非プロトン性の溶媒から選ばれることを特
    徴とする請求項１に記載の製造方法。
  3. 【請求項３】 該疎水性有機溶媒が、脂肪族エーテル及
    び炭化水素から選ばれることを特徴とする請求項１又は
    ２に記載の製造方法。
  4. 【請求項４】 該疎水性有機溶媒が、エチルエーテル、
    ペンタン、ヘキサンまたはヘプタンから選ばれるもの、
    特にエチルエーテルであることを特徴とする請求項１か
    ら３のいずれかに記載の製造方法。
  5. 【請求項５】 該沈殿物を、次いで、濾過及び凍結乾燥
    することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載
    の製造方法。
  6. 【請求項６】 該活性化反応が、極性非プロトン性溶媒
    から選ばれる適当な無水溶媒中で行われることを特徴と
    する請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
  7. 【請求項７】 該無水溶媒が、ジオキサン、ジメチルホ
    ルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドま
    たはテトラヒドロフランから選ばれることを特徴とする
    請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
  8. 【請求項８】 ＰＥＧが、分子量が２，０００〜１０
    ０，０００、好ましくは２，０００〜５０，０００であ
    って、ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコ
    ールのＣ1〜Ｃ6の脂肪族モノエステルから選ばれること
    を特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の製造方
    法。
  9. 【請求項９】 活性化剤が、カルボニルジイミダゾール
    であることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記
    載の製造方法。
  10. 【請求項１０】 ＰＥＧ１モルに対し、活性化剤が５〜
    ５０モル、好ましくは１０〜２０モル使用されることを
    特徴とする請求項９に記載の製造方法。
  11. 【請求項１１】 該ペプチドがヒルジン又はその変異体
    の１つであることを特徴とする請求項１から１０のいず
    れかに記載の製造方法。
  12. 【請求項１２】 ポリエチレングリコール（又は誘導
    体）−ヒルジン（ＰＥＧ−ヒルジン）結合体の製造方法
    であって： ａ）適当な無水溶媒中でカルボニルジイミダゾールと反
    応させることによりポリエチレングリコール又はその誘
    導体（ＰＥＧ）を活性化させる工程、 ｂ）活性化されたＰＥＧを、疎水性溶媒を用いて沈殿さ
    せることにより、回収する工程、 ｃ）わずかにアルカリ性の媒体中、ヒルジン又はその変
    異体と活性化されたＰＥＧとを縮合させる工程、及び ｄ）得られた結合体を精製する工程 の各工程を包含する製造方法。
  13. 【請求項１３】 活性化反応が、極性非プロトン性溶媒
    から選ばれる適当な無水溶媒中で行われることを特徴と
    する請求項１２に記載の製造方法。
  14. 【請求項１４】 該適当な無水溶媒が、ジオキサン、ジ
    メチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホ
    キシドまたはテトラヒドロフランから選ばれることを特
    徴とする請求項１２又は１３に記載の製造方法。
  15. 【請求項１５】 該疎水性有機溶媒が、非極性または僅
    かに極性のある非プロトン性の溶媒から選ばれることを
    特徴とする請求項１２から１４のいずれかに記載の製造
    方法。
  16. 【請求項１６】 該疎水性有機溶媒が、脂肪族エーテル
    及び炭化水素から選ばれることを特徴とする請求項１２
    から１５のいずれかに記載の製造方法。
  17. 【請求項１７】 該疎水性溶媒が、エチルエーテル、ペ
    ンタン、ヘキサンまたはヘプタンから選ばれるもの、特
    にエチルエーテルであることを特徴とする請求項１２か
    ら１６のいずれかに記載の製造方法。
  18. 【請求項１８】 ＰＥＧ１モルに対し、カルボニルジイ
    ミダゾールが５〜５０モル、好ましくは１０〜２０モル
    使用されることを特徴とする請求項１２から１７のいず
    れかに記載の製造方法。
  19. 【請求項１９】 得られた結合体を、以下の２つの連続
    する工程：即ち、 −反応していない過剰のＰＥＧを除去する陰イオン交換
    クロマトグラフィー及び −残留する遊離ヒルジンから結合体を分離する逆相クロ
    マトグラフィー により精製することを特徴とする請求項１２から１８の
    いずれかに記載の製造方法。
  20. 【請求項２０】 ＰＥＧが、分子量が２，０００〜１０
    ０，０００、好ましくは２，０００〜５０，０００であ
    って、ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコ
    ールのＣ1〜Ｃ6の脂肪族モノエステルから選ばれること
    を特徴とする請求項１２から１９のいずれかに記載の製
    造方法。
  21. 【請求項２１】 ポリエチレングリコール又はその誘導
    体（ＰＥＧ）が、ヒルジンに対し、そのペプチドの末端
    アミン官能基とは異なる、ペプチドの少なくとも１つの
    アミン官能基に結合しているポリエチレングリコール
    （又は誘導体）−ヒルジン（ＰＥＧ−ヒルジン）結合
    体。
  22. 【請求項２２】 結合体の６０重量％以上が、抗トロン
    ビン活性を有することを特徴とする請求項２１に記載の
    結合体。
  23. 【請求項２３】 ＰＥＧが、分子量が２，０００〜１０
    ０，０００、好ましくは２，０００〜５０，０００であ
    って、ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコ
    ールのＣ1〜Ｃ6の脂肪族モノエステルから選ばれること
    を特徴とする請求項２１又は２２に記載の結合体。
  24. 【請求項２４】 請求項１２から２０のいずれかに記載
    の製造方法によって得られる請求項２１から２３のいず
    れかに記載の結合体。
  25. 【請求項２５】 血栓症の治療のための、医薬物質とし
    ての請求項２１から２３のいずれかに記載の結合体。
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