JP2000511160A - 多環芳香族基が結合した新規ヌクレオシドアナログ、その合成方法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はアントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テトラセンまたはペンタセンのごとき多環芳香族炭化水素を担う蛍光性ヌクレオシドを提供する。主題のヌクレオシドは、芳香族化合物のオルガノカドミウムまたはオルガノ亜鉛誘導体を使用し、１−α−クロロリボースまたはデオキシリボースシントンとカップリングさせ、Ｃ−グリコシド結合形成を用いて合成できる。カップリング反応のα−アノマーは酸−触媒平衡化によってβ−アノマーにエピマー化できる。該蛍光性ヌクレオシドはＤＮＡまたはＲＮＡ塩基アナログとして作用し、核酸に取り込むことができる。得られた蛍光タッグド核酸は組織、溶液において標的核酸についてのプローブとして有用であるか、あるいは膜に固定化される。

Description

【発明の詳細な説明】 多環芳香族基が結合した 新規ヌクレオシドアナログ、 その合成方法および使用 本発明は、軍事研究所によって授与された認証番号ＤＡＡＨ−０４−９３−Ｇ −０４３１下で米国政府と共になされた。米国政府は外発明においてある種の権 利を有し得る。 発明の分野 本発明は、アントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テトラセン またはペンタセンのごとき多環芳香族炭化水素を担う蛍光性ヌクレオシドを提供 する。主題のヌクレオシドは、オルガノカドミウムおよびオルガノ亜鉛誘導体を 使用し、１−α−クロロリボースまたはデオキシリボースシントンとカップリン グさせるＣ−グリコシド結合形成方法を用いて合成できる。カップリング反応の α−アノマーは酸触媒平衡化によってβ−アノマーにエピマー化できる。該蛍光 性ヌクレオシドはＤＮＡまたはＲＮＡ塩基アナログとして作用し、核酸に一体化 できる。得られた蛍光的にタッグを付した核酸は組織、溶液中の標的核酸用のプ ローブとして有用であり、あるいは膜に固定化される。発明の背景 ＤＮＡヌクレオシドの非常に多数の非天然アナログが近年合成されてきた。デ オキシリボースに結合した塩基部位の構造を変化させるのは、ＤＮＡにおける構 造および機能を探るための有用な戦略であった。例えば、多数の塩基アナログを 用いて、天然核酸塩基の機能に重要であり得る特異的水素結合相互作用の重要性 をテストしたきた^1-3。この戦略を用い、ＤＮＡおよびＲＮＡ構造の安定化、蛋 白質相互作用および酵素的ＤＮＡおよびＲＮＡ合成の信頼性における水素結合の 重要性が調べられてきた。 また、構造および機能の物理的および生化学的研究においてレポーターとして 供する目的で、修飾されたＤＮＡ塩基が合成されてきた。ＤＮＡ塩基に結合され てきたレポーター基の例は、ビオチン⁴およびジゴキシゲニン基⁵、スピン−標識 基⁶、およびＤＮＡ−切断部位⁷を含む。ＤＮＡで使用されるレポーターの最も傑 出したクラスの中には、生合成および生化学研究⁸でプローブとして供すること ができる蛍光タッグドＤＮＡ塩基がある。ヌクレオチドリンカーを用いてのＤＮ Ａ端部でのかかるレポーター基の置換えとは対照的に、レポーターのＤＮＡ塩基 の結合は、ＤＮＡのストレッチ内での置換えおよびプロービングを可能とする。 かかる戦略は、蛍光ベースの自動ＤＮＡ配列決定でかなり実用的用途がある⁹。 発蛍光団 を天然ＤＮＡ塩基に結合する別のアプローチは、それを蛍光性とするＤＮＡ塩基 自体のより直接的修飾である。有用な蛍光特性を持つ多数の修飾ＤＮＡ塩基が最 近報告されており；最も広く使用されているこのタイプのヌクレオシドの中には 、２−アミノプリン¹⁰およびエテノアデノシン¹¹がある。 ＤＮＡは、酵素または合成いずれかにより、蛍光的にタッグを付すことができ る。酵素の取込みは、所与の発蛍光団を担うヌクレオシド三リン酸の使用によっ て行われる。化学的方法によるＤＮＡへの取込みは特に普通のものである。蛍光 試薬をＤＮＡへ取り込む化学的方法は以下の２つの方法のうちいずれかによって なされる：ホスホルアミダイト誘導体に変換してある標識の直接的取込み、また はオリゴヌクレオチドへのアミンの取込み、続いての発蛍光団イソチオシアナー トまたはＮＨＳエステル誘導体での後の誘導体化。 ＤＮＡの後合成誘導体化は典型的には不十分であり、標準的なＤＮＡ合成を超 える工程ならびに骨の折れる精製工程を要する。標準的なＤＮＡ合成および精製 工程が使用されるゆえに、標識のＤＮＡへの直接的取込みは魅力的である。しか しながら、現在利用できる試薬は、合成のそれらのコストのため、かなり高価で ある。 現在使用されている蛍光的にタッグを付した核酸のもう１つの欠点は、多数の タッグを相互に近く位置させた場合に起こる消光現象である。かくして、多数蛍 光タッ グを持つ核酸は、しばしば、単一の蛍光タッグを持つ核酸よりも明るくなく、ま たは明るさが低くさえある。 加うるに、蛍光タッグはそれをＤＮＡに結合させる行為によって消光されるこ とが通常に観察される。例えば、ＤＮＡ鎖の端部にあるリンカーに結合されたピ レンタッグは該ＤＮＡにおいて大いに消光されたことが報告されている(ネッツ ェル（Netzel），1989ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイェティ （J．Am．Chem．Soc.）111:6966)。さらに、相補鎖を結合させると、発光はさら に１０倍消光される。この効果は必然的に検出感度の低下をもたらす。 商業的に入手可能な蛍光標識のもう１つの限界は、それらの迅速なフォトブリ ーチング特性を含む。蛍光顕微鏡またはブロットハイブリダイゼーションにおけ るごとく、標識の実用的な明るさは、発光シグナルの積分時間に依存する。フル オレセインは、例えば、（より大きな反応性を可能とする）その複雑な構造のた め、およびより反応が起こる場合に溶液に暴露されるゆえに、ＤＮＡオリゴヌク レオチドにおいてかなり迅速に光脱色する。加えて、フルオレセインのごとき標 識は典型的にはフレキシブルな連結基によってＤＮＡに結合される。時間分解蛍 光により蛋白質−ＤＮＡ結合を測定すると、等方性がしばしば問題である。とい うのは、発蛍光団はそのフレキシブルな鎖上で迅速に回転するからである。 本発明は、核酸標識に伴う欠点の多くを克服する。本 発明は、ピレン、アントラセン、フェナントレン、スチルベン、テトラセンまた はペンタセン−誘導体化ヌクリオシドがいずれかの位置でＤＮＡまたはＲＮＡ鎖 内に挿入され、ヘリックス内に堅く積まれたままとすることを可能とする。標識 の蛍光部分はあたかもそれがＤＮＡ塩基のごとく位置しているので、蛍光基はヘ リックス中で適切に積まれており、かつ相互に隣接して位置されると、相互に強 く相互反応し、強いエキシマ発光を可能とする。 本発明の蛍光ヌクリオシドアナログは迅速には光脱色せず、標識試料をかなり 長く生きた状態とし、長期間にわたる測定および実験のための機会を可能とする 。さらに、本発明の好ましい実施の形態は蛍光部位に対するα−結合を提供し、 隣接β−結合ＤＮＡ塩基による消光を最小化する。加えて、ヌクレオチド鎖にお ける糖残基に対する蛍光部位の直接的結合は、蛍光的に標識された核酸に典型的 には存在するフレキシブルなリンカーを排除する。この特徴は、時間も分解蛍光 異方性のごとき測定を簡略化する。 発明の概要 本発明は、アントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テトラセン またはペンタセンのごとき多環芳香族炭化水素を担う蛍光ヌクレオシドアナログ を提供する。多環芳香族炭化水素は、炭素−炭素結合によって、リボースまたは デオキシリボースのごとき糖部位のＣ１（１’）に結合する。該糖部位はグルコ ースのごときへ キソースまたはアラビノースのごときペントースであってよい。本発明の１の実 施の形態において、糖部位のＣ１炭素に結合した芳香族炭化水素はフェナントレ ンである。本発明のもう１つの実施の形態において、糖部位のＣ１炭素に結合し た芳香族炭化水素はピレンである。本発明のさらにもう１つの実施の形態におい て、糖部位のＣ１炭素に結合した芳香族炭化水素はアントラセンである。本発明 のもう１つの実施の形態において、糖部位のＣ１炭素に結合した芳香族炭化水素 はスチルベンである。本発明のもう１つの実施の形態において、糖部位のＣ１炭 素に結合した芳香族炭化水素はテトラセンである。本発明のもう１つの実施の形 態において、糖部位のＣ１炭素に結合した芳香族炭化水素はペンタセンである。 また、本発明は、アントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テト ラセンまたはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドのホスホルアミダイト誘導体を 提供する。ホスホルアミダイト誘導体は、フェナントレン、アントラセン、ピレ ン、スチルベン、テトラセン、またはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドを含む 核酸の化学合成で有用である。 また、本発明は、アントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テト ラセンまたはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドの、主題のヌクレオシドおよび 主題のそれらのホスホルアミダイト誘導体の合成において有用な中間体を提供す る。該中間体は、ホッファー（Hoffer） のクロロ糖のアダクトおよび対応する多環芳香族炭化水素を含む。 もう１つの態様は、アントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テ トラセンまたはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドおよびそれらのホスホルアミ ダイト誘導体を合成する方法に指向される。本発明のもう１つの態様において、 主題のヌクレオシドおよびホスホルアミダイト誘導体を用いる蛍光的に標識した ＤＮＡまたはＲＮＡを調製する方法も提供される。 内部に取り込まれた１以上の主題蛍光ヌクレオシドを有するＤＮＡおよびＲＮ Ａのごとき蛍光によりタッグを付された核酸も本発明によって提供される。 本発明は、さらに、内部に取り込まれた１以上の主題蛍光ヌクレオシドを使用 する、相補的核酸プローブの（ＦＩＳＨ）のごときハイブリダイゼーションを介 して標的核酸を検出する方法を提供する。 アントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テトラセンまたはペン タセン−誘導体化ヌクレオシドのαおよびβ両立体配置、ならびにα−アノマー をβ−アノマーへエピマー化する方法を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、化合物１−６のアルファー（左）およびベータ−アノマー（右）につ き観察された核オーバーハウザー増強の定量的差の説明図である。アルファ−ア ノマーにおいて、Ｃ−２’−βプロトンの放射はＣ−１’およ びＣ−３’双方において増強を与える一方で、Ｃ−２’−αプロトンの放射はい ずれについてもほとんどまたは全く増強を与えない。ベータ−アノマーにおいて 、Ｃ−２’−プロトンの放射はＣ−３’プロトンにおいてのみ増強を与える一方 で、Ｃ−２’−αプロトンの放射はＣ−１’プロトンにおいてのみ増強を与える 。 図２は、単一−結晶Ｘ−線構造からの１−ナフチルヌクレオシド３ａのＯＲＴ ＥＰ図である。該構造はα−アノマー立体配置およびＣ−３’−エキソＳタイプ 糖立体配置を有する。 図３は、Ｘ位において（ａ）ピレニル、（ｂ）フェナントリル、および（ｃ） ナフチルヌクレオシド１−３を含むトリヌクレオチド（配列Ｔ−Ｘ−Ｔ）につい ての４００ＭＨｚプロトンＮＭＲスペクトルを示す。 図４Ａは、５’−末端位置におけるＣ−ヌクレオシドとしてピレンを含む自己 相補性ヘプタマーオリゴヌクレオチドについての蛍光発光スペクトルである。該 ＤＮＡ配列は５’ＸＣＧＣＧＣＧであり、ここにＸは１である。励起は３４１ｎ ｍにおけるものりであり、溶液はｐＨ７．０ ＰＩＰＥＳ（１０ｍＭ）、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および０．１および０．１５μＭのＤＮ Ａ鎖濃度を含有する。 図４Ｂは、５’−末端位置におけるＣ−ヌクレオシドとしてフェナントレンを 含む自己相補性ヘプタマーオリゴヌクレオチドについての蛍光発光である。該Ｄ ＮＡ配 列は５’ＸＣＧＣＧＣＧであり、ここにＸは２である。励起は２５１ｎｍにおけ るものである。溶液およびＤＮＡ鎖組成は図４Ａについてのものと同一である。 図５は、本発明の化合物の構造式を描く。示された化合物１−６はβ形態であ る。化合物１ａないし６ａは該図に描かれた分子のα形態である。 図６は、本発明の化合物の合成調製を模式的に描く。 図７は、本発明の化合物の合成調製を模式的に描く。 図８は、商業的入手可能なホスホルアミダイトからの１、２、３および５フル オレセインを含むオリゴの発光スペクトルである。多数標識では、強い消光が起 こる。 図９は、図１３でＰ１と示したオリゴヌクレオチドの発光スペクトルである。 図１０は、図１３でＰＯと示した遊離ピレンヌクレオシドの発光スペクトルで ある。 図１１は、図１３でＰ３、Ｐ５、Ｐ３ＥＮＤおよびＰ３Ａと示したオリゴヌク レオチドの発光スペクトルである。 図１２は、図１３でＰ３およびＰ６と示したオリゴヌクレオチドの発光スペク トルである。 図１３は、相補的標的配列５’−ｄＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡを持つトリプレック ス−形成オリゴヌクレオチドの複合体の構造を描く。 図１４は、本発明のα−ピレンヌクレオシドの調製のための合成方法の模式的 説明図である。 図１５は、本発明のβ−ピレンヌクレオシドの調製のための合成方法の模式的 説明図である。 図１６Ａは、ライトボックスに保持された４つのプラスチック試験管中の蛍光 ＤＮＡを示す写真である。右から左に、試験管は１、２、３および５フルオレセ インを持つフルオレセイン−標識オリゴヌクレオチドを含有する。強度は、フル オレセイン標識の数が増大するに従って増加する。 図１６Ｂは、ライトボックスに保持された６つのプラスチック試験管中のα− ピレン−標識オリゴヌクレオチド（脱酸素のない水性緩衝液）を示す写真である 。最も左側の試験管は他の５つの試験管の１０×濃度の１つのピレン標識を有し 、ピレンの典型的な青色を示す。他の５つの試験管は１０倍希釈し、左から右に １、２、３、６および１０標識を有する。 図１７は、連続した３つのアルファピレン残基または３つの連続したベータピ レン残基いずれかを有するオリゴヌクレオチドについての蛍光発光スペクトルで ある。 図１８は、オリゴヌクレオチドＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｃ６およびＣ１０の ヌクレオチド配列を示し、ここにＰはピレン−誘導ヌクレオチドを表す。相対的 発光強度は右にリストする。 図１９Ａは、メタノール中の０．１μＭにおける単一ピレンアルファ−および ベータ−ヌクレオシドについての発光スペクトルである（励起３４８ｎｍ）。 図１９Ｂは、同一濃度におけるピレンメチルアミン・ＨＣｌと比較したＤＮＡ 中のアルファ−ピレン（水性緩衝液）についての発光スペクトルである（ピレン −ＤＮＡについての強度は１０倍にした）。 図２０は、３つのベータピレンヌクレオシドを持つ同一の配列と比較したＨＴ ３（３つのアルファピレンヌクレオシド）の蛍光発光スペクトルによって示され る蛍光強度を示す。励起は３４１ｎｍにおけるものであり；３９０ｎｍにおける バンドはラーマン散乱によるものであり、緩衝液単独で存在する。 図２１Ａは、１−３ピレンを含有する配列ＨＴ１−ＨＴ３についての発光スペ クトルを示す。 図２１Ｂは、３−７隣接ピレンを持つＨＴ３−ＨＴ７についての発光スペクト ルを示す。励起は０．１μＭの同等ＤＮＡ鎖濃度での３４１ｎｍにおけるもので ある；数値データについては表１参照。 １−７隣接アルファ−ピレン標識を含有するオリゴヌクレオチド（配列ＨＴ１ −ＨＴ７）についての吸収スペクトルを示す。測定は、同等ＤＮＡ鎖濃度よりむ しろ同等ピレン濃度（ピレンにおいて２μＭ）で行って、グルーピング効果によ るモル消光率の差を示す。 図２３は、エキシマ蛍光強度に対する偶数／奇数効果を示す。３’末端シリー ズ（□）（配列ＨＴ１−７）および５’末端シリーズ（○）（ＨＴ３Ｂ−６Ｂ） についての、ピレンの数ｖｓ相対的積分エキシマ発光強度のプ ロット。 発明の詳細な説明 本発明は、糖部位に結合したアントラセン、フェナントレン、ピレン、スチル ベン、テトラセンまたはペンタセンのごとき多環芳香族炭化水素を有する蛍光ヌ クレオシドアナログを提供する。芳香族炭化水素基はヌクレオチドまたはヌクレ オシドにおける糖部位のＣ−１（１’）炭素に結合し、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基 アナログとして作用する。糖部位上の多環芳香族炭化水素の位置のため、本発明 のヌクレオシドアナログはＲＮＡまたはＤＮＡヘリックス中に適切に積まれ、周 囲の相補的塩基の結合特性に干渉しない。 本発明によると、該アントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テ トラセンまたはペンタセンは、ヌクレオシドアナログの蛍光特性を変えることな く、１以上のアルコキシ、アルキルアミノまたはハライド基で、それらの環構造 上の種々の位置において置換することができる。例えばメトキシ、エトキシ、ジ メチルアミノ、ジエチルアミノ、ニトロ、メチル、シアノ、カルボキシ、クロロ 、ブロモ、ヨードまたはアミノ基を含むがそれらに限定されるものではない。 加えて、アントラセン、フェナントレン、ピレンまたは他の芳香族炭化水素は 、炭素−炭素結合によって、糖部位のＣ１（１’）位置に対するそれらの各環構 造上のいずれかの利用できる位置に結合させることができる。 アントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テトラセンまたはペンタ セン−誘導体化ヌクレオシドのアルファおよびベータ両アノマーが本発明によっ て提供される。 本発明の１つの実施の形態において、ピレン−誘導体化デオキシヌクレオシド は以下の構造にうち少なくつも１つを有する： 本発明のもう１つの実施の形態において、フェナントレン−誘導体化デオキシ ヌクレオシドは以下の構造にうち少なくつも１つを有する： 本発明のさらにもう１つの実施の形態において、アントラセン−誘導体化デオ キシヌクレオシドは以下の構造にうち少なくつも１つを有する： 本発明のもう１つの実施の形態において、テトラセン−誘導体化デオキシヌク レオシドは以下の構造にうち少なくつも１つを有する： 本発明のさらにもう１つの実施の形態において、ペンタセン−誘導体化デオキ シヌクレオシドは以下の構造にうち少なくつも１つを有する： 本発明のもう１つの実施の形態において、スチルベン−誘導体化デオキシヌク レオシドは以下の構造にうち少なくつも１つを有する： 本発明のさらにもう１つの実施の形態において、フェナントレン−誘導体化ヌ クレオシドは構造式： を有するα−９−フェナントレニルデオキシヌクレオシドである。 本発明のもう１つの実施の形熊において、フェナントレン−誘導体化ヌクレオ シドは構造式： を有するβ−９−フェナントレニルデオキシヌクレオシドである。 本発明のさらにもう１つの実施の形態において、ピレン−誘導体化ヌクレオシ ドは構造式：を有するα−１−ピレニルデオキシヌクレオシドである。 本発明のさらにもう１つの実施の形態において、ピレン−誘導体化ヌクレオシ ドは構造式： を有するβ−１−ピレニルデオキシヌクレオシドである。 本発明のさらにもう１つの実施の形態において、アントラセン−誘導体化ヌク レオシドは構造式： を有するα−１−アントラセニルデオキシヌクレオシドである。 本発明のさらにもう１つの実施の形態において、アン トラセン−誘導体化ヌクレオシドは構造式： を有するβ−１−アントラセニルデオキシヌクレオシドである。 本発明によって提供される有用な中間体は、例えば、アントラセン、フェナン トレン、ピレン、スチルベン、テトラセンまたはペンタセン−誘導体化ヌクレオ シド５’−３’−パラトルエイルジエステルのごとき、ホッファーのクロロ糖の アダクトおよび多環芳香族炭化水素を含む。 本発明によって提供される他の特に有用な中間体は、例えば、ピレン、アント ラセン、フェナントレン、スチルベン、テトラセンまたはペンタセン５’−ジメ トキシトリチルエーテル−３’−Ｏ−Ｈ−ホスホラートを含む。 本発明によって提供される有用な中間体は、ピレン、アントラセン、フェナン トレン、スチルベン、テトラセンまたはペンタセン誘導体化ヌクレオシドの３’ アルコールにおいて誘導体化されたＮ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−シアノエチル ホスホルアミダイトを含む。 主題のアントラセン、フェナントレン、ピレン、スチ ルベン、テトラセンまたはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドは、ＲＮＡまたは ＤＮＡのごとき核酸に取り込まれると、４８３ｎｍにピークを持つ、４５０−５ ５０ｎｍの範囲の蛍光を供する。本発明により、２以上の隣接誘導体化ヌクレオ シドは、それらの強い塩基スタッキング特性によって核酸ヘリックスを安定化し つつ、明るく長波長のエキシマを形成することが驚くべきことに判明した。かく して、他の蛍光ヌクレオシドタッグに伴う複数標識消光問題は、検出の高感度を 供しつつ、本発明によって回避される。 本発明の主題の蛍光ヌクレオシドは、シュバイツァー（Schweltzer）およびク ール（Kool）（1995）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイェテ ィ（J．Am ．Chem．Soc.）117:1863に記載されているオルガノカドミウム戦略の 修飾法を用い、多環芳香族炭化水素を糖にカップリングさせることによって合成 できる。この論文および本出願で引用された他の論文の開示は、出典明示して本 明細書の一部とみなす。 Ｃ−ヌクレオシドカップリングは、芳香族種のオルガノカドミウムまたはオル ガノ亜鉛誘導体とよく知られたホッファー¹⁹のα−クロロ糖シントンとの反応を 含む。アントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テトラセンまたは ペンタセンの糖へのグリコシドカップリングに関与する工程は図６に記載され、 ここにＡｒはアントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、 テトラセンまたはペンタセンよりなる群から選択される芳香族炭化水素である。 このカップリングの結果、アルファおよびベータアノマーの混合物が生じ、単離 収率は約５４−８１％の間である。アルファ−アノマーＣ−ヌクレオシドは第一 の反応生成物である。 トルオイル保護基はメタノール性塩基中で除去することができる。かくして、 本発明によると、未保護ヌクレオシドが２工程：芳香族カップリングおよびエス テル脱保護と少ない工程で生産することができる。 アルファ−アノマーは、第３の工程、酸−触媒平衡化によってベータ立体配置 に変換することができる。好ましい酸触媒平衡化反応は、少量の水の存在下で、 還流キシレン中のベンゼンスルホン酸を使用する。主題のヌクレオシドアナログ のアノマー−アナログはより大きい蛍光を供し、従って、蛍光標識目的では好ま しい。また、本発明は、チオール基のごとき化学ブリッグを介して一般にいずれ かの化合物に結合させることができる主題のヌクレオシドアナログのストリング の使用を提供する。分子を連結する方法は、例えば、エス・エル・ベブカジ(S.L ．Beavcage)およびアール・ピイ・アイエル（R.P.Iyer）（1993）テトラヘドロ ン（Tetrahedron）49:1925-1963に見い出すことができる。 本発明のアントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テトラセンま たはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを作成するのに 知られ た非常に多数の手法のいずれかによって、合成の間にＲＮＡまたはＤＮＡに取り 込むことができる。例えば、かかる手法は、酵素合成および化学合成を含む。化 学合成は液相または固相技術を含む。 ＲＮＡオリゴヌクレオチドの酵素方法は、サムブルック（Sambrook）ら（1989 、モレクュラー・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clo ning:A Lanoratory Manual ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、ＮＹ）に記載されているごとく、頻繁に、クレノウＴ ７、Ｔ４、Ｔａｑまたはイー・コリ（E ．coli）ＤＮＡポリメラーゼを使用する 。ＦＮＡオリゴヌクレオチドの酵素方法はサムブルックらに記載されているごと く、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを頻繁に使用する。また、逆 転写を用いてＲＮＡからＤＮＡを合成することもできる（サムブルックら）。オ リゴヌクレオチドを酵素的に合成するには、化学的に合成できる、あるいはｍＲ ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、クローン化ゲノムＤＮＡ、クローン化ｃＤＮＡまたは他の 組換えＤＮＡとして得ることができる鋳型核酸を要する。ＤＮＡオリゴヌクレオ チド合成のいくつかの酵素方法は、化学的に合成できるさらなるプライマーオリ ゴヌクレオチドを要しし得る。最後に、線状オリゴヌクレオチドは、例えば、サ カイ（Sakai）ら、1988、サイエンス（Science）239:487に記載されているＰＣ Ｒ技術によって調製できる。 線状オリゴヌクレオチドの化学合成は当該分野でよく知られ、液相または固相 技術によって達成できる。さらに、定義された配列の線状オリゴヌクレオチドは 商業的に入手できるか、あるいはホスホルアミダイト、ホスファイトトリエステ ル、Ｈ−ホスホナートおよびホスホトリエステル法を含めたいくつかの異なる合 成手法のいずれかによって、典型的には自動合成方法によって作成できる。該合 成方法は所望のオノゴヌクレオチドの長さに依存し、かかる選択は当業者の技量 内のものである。例えば、ホスホルアミダイトおよびホスファイトトリエステル 方法は１７５以上のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを生じる一方で、 Ｈ−ホスホナート方法は１００ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドでよく働 く。もし本発明のヌクレオチド塩基アナログに加えて修飾された塩基をオリゴヌ クレオチドに取り込むならば、特にもし修飾されたホスホジエステル結合を用い るならば、公知の手法に従って要求されるごとく合成方法を改変する。この点に 関し、ウルマン（Uhlman）ら、（1990、ケミカル・レビューズ（Chemical Revie ws）90:543-584）は文献を提供しており、修飾された塩基および修飾されたホス ホジエステル結合を持つオリゴヌクレオチドを作成する手法を概説する。 合成線状オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、 あるいはゲルクロマトグラフィーおよび高圧液体クロマトグラフィーを含めた多 数のク ロマトグラフィー方法のいずれかによって精製することができる。ヌクレオチド 配列を確認するには、マキサム（Maxam）およびギルバート（Gilbert）配列決定 、サンガー（Sanger）配列決定、毛細管電気泳動配列決定、ワンダリング・スポ ット配列決定法を含めた公知のいずれかの手法によって、あるいはハイボンド（ Hybond）紙に結合したオリゴヌクレオチドの選択的化学分解を用いることによっ てＤＮＡ配列決定に付すことができる。短いオリゴヌクレオチドの配列は、レー ザー脱着質量分析によって、あるいは速原子衝撃によっても分析できる（マクニ ール（McNeal）ら、1982、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイェ ティ（J ．Am．Chem．Soc.）104:976;ビアリ(Viari)ら、1987、バイオメディカル ・エンビロンメンタル・マス・スペクトロメトリー（Biomed ．Environ．Mass Sp ectrom. ）10:4671）。配列決定はＲＮＡオリゴヌクレオチドについても利用可能 である。 好ましい方法において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成器およびβ −シアノエチルホスホルアミダイト化学を用い、自動方法によって合成される。 延長されたカップリング回数（１０分）が、好ましくは、アントラセン、フェナ ントレン、ピレン、スチルベン、テトラセンまたはペンタセン−誘導体化ヌクレ オシド残基で使用される。オリゴマーは、分取用変性ポリアクリルアミドゲル電 気泳動によって精製し、クラッシュ・アンド・ソーク（crush and soak）方法の ごとき当該分野で公知 の方法によって単離することができる。 本発明の主題の蛍光ヌクレオシドは、蛍光標識を達成するために、核酸に取り 込むことができる。標準的方法を用いて、未保護ヌクレオシドを５’−ジメトキ シトリチル保護誘導体に変換することができる。例えば、未保護の主題ヌクレオ シドは乾燥ピリジンで共蒸発させ、次いで、ピリジンおよび塩化メチレンに溶解 させることができる。次いで、触媒量のＤＭＡＰ、およびジイソプロピルエチル アミンおよび４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）クロライドを次いで添加 し、混合物を室温で約８時間撹拌する。ヘキサンを添加し、混合物をフラッシュ ゲルカラムに負荷し、生成物５’−ジメトキシトリチル保護誘導体を溶出させる 。次いで、ＤＮＡまたはＲＮＡのごとき核酸配列への取込みのために、これらの 誘導体をシアノエチルホスホルアミダイト誘導体に変換することができる。 生成物５’−ジメトキシトリチル保護アントラセン、フェナントレン、ピレン 、スチルベン、テトラセンまたはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドからの３’ −Ｏ−ホスホルアミダイトの調製は、例えば、乾燥塩化メチレンに保護ヌクレオ シド誘導体を溶解させ、ジイソプロピルエチルアミンおよび２−シアノエチルＮ ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトを添加するごとき当該分野でよ く知られた方法によって達成される。反応混合物を室温で４時間撹拌し、しかる 後、ヘキサンを添加 する。次いで、混合物をフラッシュシリカゲルカラムに負荷し、生成物を油とし て溶出させる。 本発明によると、１以上の主題ヌクレオシドを、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列の種 々の位置に取り込むことができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片が分子の中 央に向かって効果的にタッグ化されるように、１以上の主題ヌクレオシドを配列 のストレッチ内に取り込むことができる。１以上の主題ヌクレオシドはＲＮＡま たはＤＮＡ配列の端部にまたはその近くに取り込むこともできる。 本発明のもう１つの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約５つ のヌクレオシドのループが２つの鎖を分離するように、ヘアピン立体配置に折り 畳むことによって、一本鎖標的核酸とでトリプリックスを形成するように設計で きる。１以上のアントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テトラセ ンまたはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドをループ内に取り込むことができる 。この立体配置は図１３に示す。 本発明のもう１つの態様において、１以上のアントラセン、フェナントレン、 ピレン、スチルベン、テトラセンまたはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドを、 線状核酸分子内に、あるいは線状核酸分子の５’および３’末端いずれかまたは 両末端に取り込むことができる。 好ましい実施の形態において、主題の蛍光ヌクレオシドをＲＮＡまたはＤＮＡ の１以上の位置に存在させる。より好ましい実施の形態において、少なくとも２ つの主 題ヌクレオシドをＲＮＡまたはＤＮＡ配列内のもう１つのものに隣接して位置さ せる。もう１つの好ましい実施の形態において、少なくとも２つの主題ヌクレオ シドを、ヘアピンオリゴヌクレオチドのループ内のもう１つのものに隣接させて 位置させる。 もう１つの好ましい実施の形態において、主題ヌクレオシドを環状オリゴヌク レオチドに取り込むことができる。２つの対向鎖を連結し、かくして環を囲むル ープドメインはその中に組み込まれた主題ヌクレオシドを有する。 より好ましい実施の形態において、少なくとも１つの主題ヌクレオシドをアデ ノシン（Ａ）塩基に隣接するＤＮＡ分子（ヘアピン、環状または線状）に取り込 む。本発明によると、Ａに隣接した３ないし５ピレンを用い、より大きい蛍光強 度が達成できる。もし５未満のかかるヌクレオシドの基が、Ａによって分離され た３ないし５のヌクレオシド、続いてもう１つのＡによって分離された３ないし ５以上の主題ヌクレオシド、続いて３ないし５以上の主題ヌクレオシドにおける ごとく分離されていれば(Ｐ３ＡＰ３ＡＰ３；Ｐ４ＡＰ４Ａｐ４；またはＰ５Ａ Ｐ５ＡＰ５）、５を超える全主題ヌクレオシドを核酸分子内で使用できる。かか る基を、核酸分子の一端または両端に付加することもできる。 もう１つの好ましい実施の形態において、奇数の主題蛍光ヌクレオシドを核酸 分子に結合させ、あるいはその 内部に取り込むことができる。かくして、３、５または７つの主題ヌクレオシド で核酸分子を標識するのは特に好ましい。 本発明のアントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テトラセンま たはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドを含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、組織 、クロマチンおよび染色体のごときゲノム物質、溶液中の、または膜に固定化さ れた標的核酸を検出するのに有用である。本発明の蛍光標識ヌクレオシド誘導体 は、制御された純粋ガラス（ｃｐｇ）のごとき固体支持体に結合される場合に特 に有用である。かくして、本発明のアントラセン、フェナントレン、ピレン、ス チルベン、テトラセンまたはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドを含むＤＮＡま たはＲＮＡ配列は、誘導体化プローブを標的に検出可能にハイブリダイズさせる のに十分な条件および時間にて、該プローブをテストすべき試料中の標的と接触 させることによって、かかる標的の検出において、十分な相補性の標的核酸にハ イブリダイズする。本発明のヌクレオシド誘導体は、検出に蛍光タッグドオリゴ ヌクレオチドを使用するいずれの技術においても有用である。蛍光検出を含む迅 速に成長する診断技術はイン・サイチュ・ハイブリダイゼーションにおける蛍光 （ＦＩＳＨ）である。該方法は、多数蛍光標識でタッグ付加した長く、酵素によ り合成したＤＮＡ鎖を使用する。これらは患者の細胞からの固定染色体にハイブ リダイズし、もし問題 の遺伝子が存在すれば、着色蛍光スポットが蛍光顕微鏡によって染色体上に見え る。該方法は、ＣＭＬ中のｂｃｒ／ａｂ１転位遺伝子のごとき全遺伝子、または ある種の遺伝病における遺伝子の余分なコピーを検出するのに使用される。 小さな合成オリゴヌクレオチドは、長い伝統的ＦＩＳＨプローブよりも高い配 列特異性を有すると期待される。ＦＩＳＨを働かせるには、プローブは顕微鏡下 で検出するのに十分な明るさで蛍光標識されていなければならない。かくして、 オリゴヌクレオチドは当量のいくつかの（おおざっぱに８−４０）蛍光タッグを 担わなければならない。本発明の蛍光ヌクレオシドは多数標識でより大きい明る さを与える。この方法は、例えば、一緒に積まれた多数ピレンからのエキシマ発 光を利用する。 核酸を標識するにおける主題蛍光ヌクレオシドの特異的適用は、自動ＤＮＡ配 列決定のための蛍光プライマー、フローサイトメトリーのための蛍光プローブ、 ＥＬＩＳＡ−様サンドイッチアッセイのための蛍光プローブ、蛋白質−ＤＮＡ結 合の測定のための発蛍光団、ＰＣＲ後の検出／同定のための蛍光プライマー、イ ン・サイチュ・ハイブリダイゼーション／顕微鏡検査（ＲＮＡおよびＤＮＡ標的 ）のための蛍光プローブ、ＤＮＡの細胞取込みの測定、核酸構造における距離、 向きおよび動力学の測定、およびサザーン／ノーザンブロットおよび関連アッセ イのための蛍光プローブを含む。 核酸間の相補性は、１つの核酸鎖における塩基が第２の核酸鎖における塩基と 水素結合、または塩基対合できる程度である。ゆえに、相補性は、時々、２つの 鎖間で塩基対を形成するヌクレオチドのパーセント、すなわち割合によって通常 は記載することができる。本明細書で用いる「十分な相補性」とは、検出可能な 結合が達成されるように、標的核酸および本発明のアントラセン、フェナントレ ン、ピレン、スチルベン、テトラセンまたはペンタセン標識核酸の間に十分数の 塩基対が存在することを意味する。 形成された塩基対のパーセントによって表しまたは測定する場合、相補性の程 度は、約３０−４０％相補性と低いものから完全な、すなわち１００％相補性ま での範囲である。一般に、標的および標識主題核酸の間の相補性の総じての程度 は好ましくは少なくとも約５０％である。 主題標識核酸および標的間の検出可能な結合を供する相補性の程度は、結合が 起こる条件に依存する。核酸鎖間の結合、すなわちハイブリダイゼーシュンが、 ２つの配列間ミスマッチの程度以外の因子にも依存することはよく知られている 。かかる因子は領域のＧＣ含量、温度、イオン強度、ホルムアミドの存在、およ び存在する反対イオンのタイプを含む。これらの条件が結合に対して有する効果 は当業者に知られている。さらに、条件はしばしば使用の環境によって決定され る。結合条件をイン・ ビトロで操作して主題の蛍光核酸の利用性を最適化することができる。所望の条 件下で当業者が使用する適当なオリゴヌクレオチドを設計できるようにする結合 条件の確立に関連する定性的および定量的考慮の徹底的処置はベルツ(Belz)ら、 1983、メッソッズ・エンザイモロジー(Methods Enzymol.)、100:266-285によっ て、およびサムブルックらによって提供されている。 かくして、本発明では、当業者は、その標的配列に検出可能に結合する十分な 相補性を呈するアントラセン、フェナントレン、ピレン、スチルベン、テトラセ ンまたはペンタセン−誘導体化ヌクレオシドよりなる群から選択される１以上の 蛍光ヌクレオシドを有する蛍光標識核酸を容易に設計できる。本明細書で用いる 「結合」または「安定な結合」は、十分量の核酸がその標的に結合してその結合 の検出を可能とすることを意味する。本発明においては、結合し、主題核酸：標 的複合体の物理的または機能的特性によって検出できる。 標的および核酸の間の結合は、機能的または物理的結合アッセイを含めた当業 者に知られたいずれの手法によっても検出できる。結合は、結合がＤＮＡ複製、 ＲＮＡ転写、蛋白質翻訳等のごとき生合成プロセスに対して観察可能な効果を有 するか否かを決定することによって機能的に検出できる。 ＤＮＡまたはＲＮＡの相補鎖の結合を検出する物理的方法は当該分野でよく知 られており、ＤＮａｓｅＩまた は化学的フットプリンティング、ゲルシフトおよびアフィニティー切断アッセイ 、ノーザンプロッティング、ドットプロッティングおよび光吸収検出手法のごと き方法を含む。蛍光方法は、分光学、蛍光分光および蛍光助力細胞ソーティング （ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡およびデジタルイメージングカメラを含む。 オリゴヌクレオチドおよびその標的核酸の間の結合は、オリゴヌクレオチドの ５０％がその標的から融解する温度によってしばしば特徴付けられる。この温度 は融解温度（Ｔ_m）である。より高いＴ_mは、より低いＴ_mを持つ複合体に対して より強いまたはより安定な複合体を意味する。 本発明によると、適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件にての３００ −９００ｎｍ範囲における蛍光の観察は、その標的配列に対する本発明の蛍光標 識核酸の結合を示す。 本発明によると、標的配列に対するアントラセン、フェナントレン、ピレン、 スチルベン、テトラセンまたはペンタセン−標識核酸の結合は、天然ゲルシフト 実験によって観察することができ、ここに結合した複合体は蛍光下で明瞭に見え る。例えば、単一ピレン−ベースのヌクレオシドを有する核酸：標的複合体は色 が深い青色で現れる一方、多数ピレン−ベースのヌクレオシドを有する核酸：標 的複合体は青色ないし黒色で現れ、より長い波長の発光を示す。 以下の実施例は本発明をさらに説明する。以下の実施例の目的では、化合物１ −６および化合物１ａ−６ａは図５に供する。化合物１−６は示した分子のβ形 態であり、化合物１ａ−６ａは図中の分子のα形態である（示さず）。明細書に おける化合物１−６および１ａ−６ａへのすべての言及は、従って、図５に構造 を描いたものをいう。 実施例１合成 Ｃ−ヌクレオシドカップリングの従前に記載された方法¹³を利用して、それら のビス−トルオイルエステル（図６）としての新しい芳香族ヌクレオシド１−４ （図５）を得た。該方法は、芳香族種のオルガノカドミウム誘導体とよく知られ たホッファー¹⁹のα−クロロ糖シントンとの反応を含む。（図６） グリコシドカップリング反応および１ａ−６ａのビス−ｐ−トルオイルエステ ルとしての主要α−エピマーの単離 コンデンサー、乾燥試験管および滴下漏斗を備えた丸底フラスコに乾燥ＴＨＦ （５ｍＬ）を入れた。マグネシウム削り粉（０．３ｇ、１．２ミリモル）および 数結晶のヨウ素を添加した。１−プロモピレン（０．３５ｇ、１．２ミリモル） を混合物に添加した。反応を完了させるのにほずかな加熱が必要であった（４０ ℃）。グリニャー ル試薬の形成が完了した後（〜１時間）、乾燥ＣｄＣｌ₂（１１０ｍｇ、０．６ ミリモル）を添加し、反応混合物を還流下で連続的に１時間加熱した。１’−α −クロロ−３’，５’−ジ−Ｏ−トルオイル−２’−デオキシリボース¹⁹（０１ ．５１ｇ、１．３ミリモル）を次いで前記混合物に一度に添加した。Ｎ₂雰囲気 下、溶液を室温で４時間撹拌した。溶液を１０％塩化アンモニウム（２×５０ｍ Ｌ）に注ぎ、塩化メチレンで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムおよび ブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を濾過し、濃縮し、 ヘキサン−酢酸エチル（９：１）で溶出するフラッシュシリカゲルクロマトグラ フィーによって精製した。主要生成物１ａビス−トルオイルエステルが淡黄色油 として得られた（α−エピマー、４８％単離収率）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、 ｐｐｍ）δ８．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、８．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８． ０）、８．０５（１Ｈ，ｓ）、７．９２−８．００（２Ｈ，ｍ）、７．７２−７ ．６０（４Ｈ，ｍ）、７．５８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．３２（２Ｈ，ｄ ，Ｊ＝８．０）、６．９６（２，ｄ，Ｊ＝８．０）、６．１６（１ｈ，ｄｄ，Ｊ ＝８．２，６．０）、５．７６（１Ｈ，ｍ）、４．９８（１Ｈ，ｍ）、４．７５ −４．６５（２Ｈ，ｍ）、３．３０−３．２２（１Ｈ，ｍ）、３．５０−３．４ ５（１Ｈ，ｍ）、３．４４（３Ｈ，ｓ）、３．３８（３Ｈ，ｓ）；¹³Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ２１．３、２１．４、３９．２、６４．５、７６．２ 、７８．０、８ ２．５、１２２．３、１２２．９、１２３．２、１２３．６、１２６．０、１２ ６．３、１２６．４、１２６．６、１２６．８、１２７．０、１２８．７、１２ ８．８、１２８．９、１２９．０、１２９．２、１２９．４、１２９．６、１２ ９．８、１３０．６、１３１．４、１３６．２、１４３．５、１４３．６、１６ ５．８、１６６．２；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₃₇Ｈ₃₁Ｏ₅ （Ｍ＋１）として 計算値５５４．２０９３、実測値５５４．２０６９ ２ａ ビス−トルオイルエステル（α−エピマー、４３％単離収率）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ８．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、８．７２ （２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、８．０５（１Ｈ，ｓ）、７．９２−８．００（２Ｈ ，ｍ）、７．７２−７．６０（４Ｈ，ｍ）、７．５８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０） 、７．３２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、６．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、６ ．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，６．０）、５．７６（１Ｈ，ｍ）、４．９８ （１Ｈ，ｍ）、４．７５−４．６５（２Ｈ，ｍ）、３．３０−３．２２（１Ｈ， ｍ）、３．５０−３．４５（１Ｈ，ｍ）、３．４４（３Ｈ，ｓ）、３．３８（３ Ｈ，ｓ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ２１．３、２１．４、３９． ２、６４．５、７６．２、７８．０、８２．５、１２２．３、１２２．９、１２ ３．２、１２３．６、１２６．０、１２６．３、１２６．４、１２６．６、１２ ６．８、１２７．０、１２８．７、１２８．８、１２８．９、１２９．０、１２ ９．２、１２９．４、１２９．６、１２９．８、１３０．６、１ ３１．４、１３６．２、１４３．５、１４３．６、１６５．８、１６６.２；Ｈ ＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₃₅Ｈ₃₁Ｏ₅（Ｍ＋１）として 計 算値５３１．２１７２、実測値５３１．２１７４ ３ａ ビス−トルオイルエステル（α−エピマー、５２％単離収率）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ８．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．９５ （２Ｈ，ｍ）、７．８３（２Ｈ，重複ｄ）、７．７１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０） 、７．５５（３Ｈ，ｍ）、７．３２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．１９（２Ｈ ，ｄ，Ｊ＝８．０）、６．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，６．０）、５．６９ （１Ｈ，ｍ）、４．９０（１Ｈ，ｍ）、４．７６−４．６５（２Ｈ，ｍ）、３． ２８−３．１８（１Ｈ，ｍ）、２．５２−２．４５（ＩＨ，ｍ）、２．４８（３ Ｈ，ｓ）、２．４２（３Ｈ，ｓ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ２ １．４、２１．５、３９．５、６４．５、７６．２、７７．８、８２．２、１２ ２．１、１２２．９、１２５．１、１２５．３、１２５．８、１２６．６、１２ ７．０、１２８．７、１２８．８、１２８．９、１２９．２、１２９．４、１２ ９．５、１２９．９、１３３．６、１３７．９、１４３．６、１６５．８、１６ ６．２；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₃₁Ｈ₂₉Ｏ５（Ｍ＋１） として 計算値４８１．２０１５、実測値４８１．２０２５ ４ａ ビス−トルオイルエステル（α−エピマー、３１％単離収率）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ） δ ８．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．９２−７．９７（４Ｈ，ｍ）、７ ．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．５２−７．６０（３Ｈ，ｍ）、７．３２ （２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、５．７２（１ Ｈ，ｍ）、５．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２、６．０）、４．８５（１Ｈ，ｍ ）、４．７６−４．６５（２Ｈ，ｍ）、３．１２−３．０２（１Ｈ，ｍ）、２． ５２−２．４５（１Ｈ，ｍ）、２．４２（３Ｈ，ｓ）、２．３８（３Ｈ，ｓ）；¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ２１．３、２１．４、４０．０、６４ ．４、７６．３、８０．２、８２．１、１２２．１、１２２．９、１２５．１、 １２５．３、１２５．８、１２６．６、１２７．０、１２８．７、１２８．８、 １２８．９、１２９．２、１２９．４、１２９．５、１２９．９、１３３．６、 １３９．９、１４３．８、１６５．８、１６６．３；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−Ｎ ＢＡマトリックス）Ｃ₃₁Ｈ₂₉Ｏ５（Ｍ＋１）として 計算値４８１．２０４３、 実測値４８１．２０１５ ５ａ ビス−トルオイルエステル（α−エピマー、１３％単離収率）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ８．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．８ ６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８-０）、７．４５（１Ｈ，ｓ）、７．２３−７．２８（５ Ｈ，ｍ）、６．９５（１Ｈ，ｓ）、５．６９（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、５．５４（１ Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０、６．０）、４．８１（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、４．６９−４ ．５６（２Ｈ，ｍ）、３．０７−２．９８（１Ｈ，ｍ）、２．４３ （６Ｈ，ｓ）、１．３５（３Ｈ，ｓ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）δ １８．３、１９．０、１９．１、２１．４、３９．１、６４．４、７６．３、 ７７．２、８１．６、１２５．９、１２６．７、１２６．８、１２８．９、１２ ９．５、１３１．１、１３１．５、１３３．７、１３５．０、１３７．３、１４ ３．５、１４３．６、１６５．９、１６６．１；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡ マトリックス）Ｃ₃₀Ｈ₃₃Ｏ₅（Ｍ＋１）として 計算値４７２．２２５０、実測 値４７２．２２３４ ６ａ ビス−トルオイルエステル（α−エピマー、１６％単離収率）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）δ ８．０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．７２ （２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．４３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５）、７．２７（２ Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．１９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、６．７６（１Ｈ， ｄ，Ｊ＝８．０）、５．６１（１Ｈ， ｂｒ ｓ）、５．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ＝８．０，６．０）、４．７４（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、４．５７（２Ｈ，ｔ Ｊ＝ ５．０）、３．０２−２．９３（１Ｈ，ｍ）、２．４３（３Ｈ，ｓ）、２．２３ （３Ｈ，ｓ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ １４．０、２０、２１ ．６、３９．４、６４．５、７４．８、７６．３、８２．５、１０３．１（ｔ） １２０．１（ｄｄ）、１２５．２（ｄｄ）、１２６．５、１２６．８、１２８ ．８、１２９．９、１２９．３、１２９．５、１４３．６、１４３．８、１５８ ．６、１５８．７；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₂₈ Ｈ₂₆Ｆ₂Ｏ₅Ｎａとして 計算値５０３．１６４６、実測値５０３．１６３６ １’，２’−ジデオキシ−１’−α−アリール−３’，５’−ジ−Ｏ−トルオ イル−Ｄ−リボフラノースのエピマー化およびβ−エピマーの単離 トルエン（５０ｍＬ）中の６ａ−ビス−トルオイルエステル（７８０ｍｇ、１ ．６２ミリモル）の溶液に、触媒量のベンゼンスルホン酸（〜１０％）、１滴の 濃硫酸および２−４滴の水を添加した。反応混合物を激しい撹拌下で４−６時間 還流した。次いで、混合物を５％水性ＮａＨＣＯ₃（５０ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯ Ａｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥し 、蒸発させた。粗製混合物のフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶液： ８：１ないし２：１ヘサン：ＥｔＯＡｃ）により、４３０ｍｇの６−ビス−トル オイルエステルを得た（β−エピマー、４６％単離収率）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ Ｃｌ₃、ｐｐｍ） δ ８．０（４Ｈ，２×ｄ，Ｊ＝８．０）、７．３５−７． ２５（５Ｈ，ｍ）、６．７６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．０）、５．６４（１Ｈ，ｄ ，Ｊ＝５．２）、５．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．２，２．３）、４．７８（ １Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．９、１１．８）、４．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．９、１ １．８）、４．５４（１Ｈ，ｍ）、２．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．６、１１． ８）、２．４３（３Ｈ，ｓ）、２．４６（３Ｈ，ｓ）、２．２３（１Ｈ，ｍ）；¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ １３．８、２２．０（ｄ）、４０．１、６４．９、７４．９、８３．０、１０ ３．０（ｔ）、１２０．１（ｄ）、１２４．５（ｄ）、１２７．３（ｄ）、１２ ８．６、１２８．８（ｄ）、１２８．９（ｄ）、１４４．０（ｄ）、１５６．５ （ｄ）、１５８．０（ｄ）、１５５．９（ｄ）、１６２．３（ｄ）、１６６．１ （ｄ）；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₂₈Ｈ₂₆Ｆ₂Ｏ₅として 計算値４８１．１８２７、実測値４８１．１８５３ １ ビス−トルオイルエステル（β−エピマー、３８％単離収率）：¹Ｈ Ｎ ＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ） δ ８．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９）、８．３ １（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９）、８．２０−８．１７（３Ｈ，ｍ）、８．１３−８ ．０５（６Ｈ，ｍ）、８．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０、７．３７（２Ｈ，ｄ， Ｊ＝８．０、７２．６（２Ｈ，ｄ，Ｊ−８．０）、６．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝ ３．６，１０．８）、５．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４）、４．８４−４．８８ （２Ｈ，ｍ）、４．７８−４．７６（１Ｈ，ｍ）、２．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝ ２．５，１３．９）、２．５０（３Ｈ，ｓ）、２．４６（１Ｈ，ｍ）、２．４０ （３Ｈ，ｓ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ２１．４、２１．５、 ４１．３、６４．５、７７．１、７７．９、８２．７、１２２．０、１２２．４ 、１２４．５、１２４．８、１２５．０、１２５．６、１２６．８、１２６．９ 、１２７．０、１２７．２、１２７．３、１２７．５、１２８．９、１２９．０ 、１２９．５、１２９．６、１３０．３、１３０．６、１ ３１．１、１３３．９、１４３．５、１４３．９、１６６．０、１６６．２；Ｈ ＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₃₇Ｈ₃₁Ｏ₅（Ｍ＋１）として 計 算値５５４．２０９３、実測値５５４．２０６９ ２ ビス−トルオイルエステル（β−エピマー、２８％単離収率）：¹Ｈ Ｎ ＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ） δ ８．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９）、８．７ ０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９）、８．１３−８．０９（４Ｈ，ｍ）、８．０３（２ Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９）、７．７７−７．６ ０（４Ｈ，ｍ）、７．３６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．１８（２Ｈ，ｄ，Ｊ ＝８．０）、６．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５，１０−５）、４．９０（１Ｈ ，ｄｄ，Ｊ＝１．９，１１．８）、４．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．９，１１． ８）、２．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．１、１３．７）、２．４９（３Ｈ，ｓ） 、２．４４−２．４１（１Ｈ，ｍ）、２．３８（３Ｈ，ｓ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（Ｃ ＤＣｌ３、ｐｐｍ）δ ２１．４、２１．５、４０．４、６４．３、７６．９、 ７７．７、８２．４、１２２．１、１２２．８、１２３．１、１２３．４、１２ ６．１、１２６．４、１２６．５、１２６．８、１２６．９、１２８．７、１２ ８．９、１２９．０、１２９．４、１２９．５、１２９．６、１２９．８、１３ ０．４、１３１．３、１３４．７、１４３．５、１４３．９、１６６．０、１６ ６．２；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₃₅Ｈ₃₁Ｏ₅（Ｍ＋１） として 計算値５３１．２１７２、実測値５３１．２ １７４ ３ ビス−トルオイルエステル（β−エピマー、３７％単離収率）：１Ｈ Ｎ ＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ） δ８．０９−８．０４（３Ｈ，ｍ）、７．９７（ １Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７.９１（１Ｈ，重複ｄ，Ｊ＝６．３，６．２）、７ ．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．５１（２Ｈ，重複ｄ，Ｊ＝６．７，６． ５）、７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９）、７．３４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０） 、７．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２，１ ０．７）、５．７１（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝５．９）、４．７８−４．７８（２Ｈ，ｍ ）、４．７０−４．７１（１Ｈ，ｍ）、２．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５，１ ３．８）、２．４８（３Ｈ，ｓ）、２．４７（３Ｈ，ｓ）、２．３９−２．３７ （１Ｈ，ｍ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ２１．４、２１．５、 ４０．６、６４．５、７７．０、７７．７、８２．４、１２２．１、１２２．８ 、１２５．３、１２５．４、１２５．７、１２５．９、１２６．８、１２６．９ 、１２７．９、１２８．６、１２８．９、１２９．０、１２９．５、１３０．２ 、１３３．４、１３６．３、１４３．５、１４３．９、１６６．０、１６６．２ ；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₃₁Ｈ₂₉Ｏ５（Ｍ＋１）として 計算値４８１．２０１５、実測値４８１．２０２５ ４ ビス−トルオイルエステル（β−エピマー、４１％単離収率）：¹Ｈ Ｎ ＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ） δ８．０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、８．０２ （２Ｈ，ｄ， Ｊ＝８．０）、７．９１−７．７７（４Ｈ，ｍ）、７．５７−７．４８（３Ｈ， ｍ）、７．３２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０） 、５．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．７）、５．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．６，１ ０．９）、４．７７−４．７５（２Ｈ，ｍ）、４．６６−４．６５（１Ｈ，ｍ） 、２．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．６，１３．８）、２．４８（３Ｈ，ｓ）、２ ．４２（３Ｈ，ｓ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ２１．３、２１ ．４、４１．６、６４．５、７７．１、８０．７、８２．９、１２３．５、１２ ４．５、１２５．６、１２５．９、１２６．８、１２６．９、１２７．４、１２ ７．７、１２８．１、１２８．９、１２９．３、１２９．４、１２９．５、１３ ２．９、１３３．０、１３７．９、１４３．５、１４３．８、１６５．９、１６ ６.２；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₃₁Ｈ₂₉Ｏ₅（Ｍ＋１）と して 計算値４８１．２０４３、実測値４８１．２０１５ ５ ビス−トルオイルエステル（β−エピマー、５４％単離収率）：¹Ｈ Ｎ ＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ） δ ８．０２（４Ｈ，２×ｄ，Ｊ＝８．０）、７ ．３５−７．２３（５Ｈ，ｍ）、６．９２（１Ｈ，ｓ）、５．６２（１Ｈ，ｄ， Ｊ＝５．６）、５．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５，１０．８）、４．７８（１ Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．９，１１．８）、４．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，１１ ．８）、４．５５（１Ｈ，ｍ）、２．５６’１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５，１４．０ ）、２．４３（３Ｈ，ｓ）、２．４６（３Ｈ，ｓ）、２． ２３（１Ｈ，ｍ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ １８．３、１９． ５、２２．１（ｄ）、４１．０、６５．０、８２．５、１２６．１、１２７．０ （ｄ）；１２８．６（ｄ）、１２８．８（ｄ）、１３２．１（ｄ）、１３５．５ 、１３６．２、１４１４．０、１４４．５、１６５．５、１６６．０；ＨＲＭＳ （ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₃₀Ｈ₃₂Ｏ₅として 計算値４７２．２２ ５０、実測値４７２．２２３４ １’，２’−ジデオキシ−１’−アリール−３’，５’−ジ−Ｏ−トルオイル −β−Ｄ−リボフラノース メタノール（５ｍＬ）中の１ ビス−トルオイルエステル（３６０ｍｇ、０． ６５ミリモル）の溶液にＮａＯＭｅ（メタノール中、２５％、０．５ｍＬ、３当 量）を添加した。反応混合物を４−６時間撹拌した。固体塩化アンモニウムをｐ Ｈが８になるまで添加した。次いで、混合物を水に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×１５ ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、蒸発させた。粗 製混合物のフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離剤；ＥｔＯＡｃ）により 、１６５ｍｇのヌクレオシド１を得た（β−エピマー、７８％）：¹Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ） δ ８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８−０）、８．３１− ８．１４（４Ｈ，ｍ）、８．０８−８．０２（３Ｈ，ｍ）、６．２５（１Ｈ，ｄ ｄ，Ｊ＝２．８，１０．４）、４．６２（１Ｈ，ｍ）、４．２８（１Ｈ，ｍ）、 ４．０２−３．９８（２Ｈ，ｍ）、２．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．０， ２．６，１３．４）、２．０２（２Ｈ，ブロードｓ，２×ＯＨ）；¹³Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ４４．５、６３．８、７４．３、７８．２、８８． ９、１２３．３、１２３．７、１２５．５、１２５．６、１２５．７、１２６． ０、１２７．９、１２８．１、１２８．２、１２８．３、１２８．４、１２８． ５、１２８．６、１３１．７、１３１．８、１３６．５；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３ −ＮＢＡマトリックス）Ｃ₂₃Ｈ₂₀Ｏ₃として 計算値３１８．１２５６、実測値 ３１８．１２５１ ヌクレオシド２ （β−エピマー、７４％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐ ｍ） δ ８．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、８．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８． ０）、８．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．９０（２Ｈ，ｍ）、７．７７− ７．６２（４Ｈ，ｍ）、５．９５（１Ｈ，ｄｄ，J＝２．８，１０．４）、４． ５９（１Ｈ，ｍ）、４．２２（１Ｈ，ｍ）、４．０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２， １３．２）、３．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１，１３．４）、２．６２（１Ｈ ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．０，１．０，５．２，１３．４）、２．２５（１Ｈ，ｍ）、 １．６（２Ｈ，ブロードｓ，２×ＯＨ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ） δ ４３．５、６３．８、７４．０、７８．０、８８．５、１２３．４、１２３ ．０、１２４．０、１２４．８、１２７．１、１２７．３、１２７．４、１２７ ．５、１２９．６、１３０．８、１３１．０、１３１．６、１３２．８、１３７ ．１；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₁₉Ｈ₁₈Ｏ₃として 計算値２９４．１２５６、実測値２９４．１２５０ ヌクレオシド３ （β−エピマー、５０％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐ ｍ） δ ８．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８． ０）、７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０） 、７．５５−７．４６（３Ｈ，ｍ）、５．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．６，１０ ．０）、４．５２（１Ｈ，ｍ）、４．１５（１Ｈ，ｍ）、３．９２−３．８６（ ２Ｈ，ｍ）、２．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８，１３．３）、２．１８（１Ｈ ，ｍ）、２.０２（２Ｈ，ブロードｓ，２×ＯＨ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、 ｐｐｍ）δ ４３．０、６３．０、７４．０、７７−０、１２３．２、１２４． ０、１２５．２、１２５．４、１２７．０、１２７．５、１３０．２、１３４． ８、１３８．０；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₁₅Ｈ₁₆Ｏ₃と して 計算値２４４．１０９９、実測値２４４．１１０５ ヌクレオシド４ （β−エピマー、６８％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐ ｍ） δ ７．８５−７．８０（４Ｈ，ｍ）、７．５０−７．４２（３Ｈ，ｍ） 、５．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８，１０．２）、４．４３（１Ｈ，ｍ，４． ０６（１Ｈ，ｍ）、３．７７（２Ｈ，ｍ）、２．６（２Ｈ，ブロードｓ，２×Ｏ Ｈ）、２．３３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．０，５．６，１３．４）、２．０２（ １Ｈ，ｍ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ４４．６、６３．９、７ ４．３、８１．５、８９．１、１２５．１、１２５．６、 １２６．６、１２８．４、１２８．６、１２８．９、１３４．３、１３４．５、 １４０．４；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₁₅Ｈ₁₆Ｏ₃として 計算値２４４．１０９９、実測値２４４．１１１０ ヌクレオシド５ （β−エピマー、９３％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐ ｍ）δ ７．２０（１Ｈ，ｓ）、６．９７（１Ｈ，ｓ）、５．３８（１Ｈ，ｄｄ ，Ｊ＝２．８，１０．４）、４．４３（１Ｈ，ｍ）、４．０１（１Ｈ，ｍ）、３ ．８２（２Ｈ，ｍ）、２．３２（３Ｈ，ｓ）、２．２６（３Ｈ，ｓ）、２．２４ （３Ｈ，ｓ）、１．９９（１Ｈ，ｍ）、１．９０（２Ｈ，ブロードｓ，２×ＯＨ ）；¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ １９．０、１９．５、１９．６、４ １．６、６３．０、７４．０、７７．０、８７．０、１２６．２、１２６．３、 １３１．２、１３１．６、１３４．１、１３５．２、１３７．０；ＨＲＭＳ（Ｆ ＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₁₄Ｈ₂₀Ｏ₃として 計算値２３７．１４９１ 、実測値２３７．１４８４ ヌクレオシド６ （β−エピマー、８９％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐ ｍ）δ ７．４６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０）、６．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０）、 ５．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８，１０．４）、４．３２（１Ｈ，ｍ）、３． ９２（１Ｈ，ｍ）、３．６８（２Ｈ，ｍ）、２．２２（３Ｈ，ｓ）、１．８９（ １Ｈ，ｍ）、１．７８（２Ｈ，ブロードｓ，２×ＯＨ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ ｌ₃、ｐｐｍ）δ １２．２、４１．９、６２．２、７２．５、 ７３．２、８７．２、１０１．５９、１０１．９、１０２．３、１１９．８、１ １９．９、１２０．１、１２４．１、１２４．３、１２８．８、１２８．９、１ ２９．０；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₁₂Ｈ₁₄Ｆ₂Ｏ₃Ｎａと して 計算値２６７．０８０９、実測値２６７−０８１２ ５’−Ｏ−トリチル化β−Ｃ−ヌクレオシドの調製 合成ヌクレオシド１（１６５ｍｇ、０．５２ミリモル）を乾燥ピリジン（４ｍ Ｌ）で２回共蒸発させ、次いで、５ｍＬのピリジンおよび４ｍＬの塩化メチレン に溶解させた。前記混合物に触媒量のＤＭＡＰ、ジイソプロピルエチルアミン（ ０．１４ｍＬ、１．５当量）および４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）ク ロライド（３２０ｍｇ、１．８当量）を添加した。混合物を室温で８時間撹拌し た。ヘキサン（５ｍＬ）を添加し、混合物をフラッシュシリカゲルカラム（ヘキ サン中の５％トリエチルアミンで予め平衡化）に負荷し、溶出した（５：１ヘキ サン：ＥｔＯＡｃないし２：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）。生成物１ ＤＭＴエー テルが黄色がかった発泡体として６４％収率で得られた（２００ｍｇ、０．３２ ミリモル）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ） δ ８．３４（２Ｈ，重複ｄ ，Ｊ＝８．０）、８.２４−８．０２（７Ｈ，ｍ）、７．５６（２Ｈ，重複ｄ， Ｊ＝８．０）、７．４５−７．２７（７Ｈ，ｍ）、６．８６（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８ ．０）、６．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２）、６．２４（１Ｈ，ｄｄ， Ｊ＝２．６，１０．４）、４．６０（１Ｈ，ｍ）、４．３０（１Ｈ，ｍ）、３． ８１（６Ｈ，ｓ）、３．５６（２Ｈ，ｍ）、２．６４（１Ｈ，ｍ）、２．３０（ １Ｈ，ｍ）；¹³Ｃ ＮＭＲ ４００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ４３．９ 、５５．２、６４．５、７４．５、７７．５、８６．４（ｄ）、１１３．２、１ ２２．８、１２３．０、１２４．８（ｄ）、１２５．０、１２５．２、１２５． ９、１２６．９、１２７．２、１２７．５、１２７．６、１２７．７、１２８． ０、１２８．４、１３０．２、１３０．３、１３０．６（ｄ）、１３１．５、１ ３５．５、１３６．１、１４ ５．０、１５８．５；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−Ｎ ＢＡマトリックス）Ｃ₄₂Ｈ₃₆Ｏ₅として 計算値６２０．２５６４、実測値６２ ０．２５６３ ２ ＤＭＴエーテル（２８０ｍｇ、５９％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐ ｍ） δ ８．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、８．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８． ０）、８．０７（２Ｈ，ｍ）、７．８(１Ｈ，ｄ，Ｊ=8.0)、７．８０−７．２４ （１２Ｈ，ｍ）、６.８４（４Ｈ，重複ｄ，Ｊ＝８．０）、５．９４（１Ｈ，ｄ ｄ，Ｊ＝２．９，１０）、４．５２（１Ｈ，ｍ）、４．２２（１Ｈ，ｍ）、３． ８（６Ｈ，ｓ）、３．５０（２Ｈ，ｍ）、２．６１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．０ ，５．２，１３．４）、２．２５（１Ｈ，ｍ）；¹³Ｃ ＮＭＲ ４００ＭＨｚ（ ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ４２．６、５５．１、６４．２、７４．１、７７.１（ 溶媒により不明瞭化）、８５．６、８６．０、１１３．１、１２ ２．３、１２２．８、１２３．２、１２４．０、１２６．２、１２６，４、１２ ６．５（ｄ）、１２６．８、１２７．８、１２８．２、１２８．８、１２９．７ 、１２９．９、１３０．１、１３１．５、１３６．０（ｄ）、１３６．２、１４ ４．９、１５５．８；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₄₀Ｈ₃₆Ｏ₅ として 計算値５９６．２５６４、実測値５９６．２５６３ ３ ＤＭＴエーテル（５０ｍｇ、５２％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ ） δ ８．１５（１Ｈ，ｄ，J＝８．０）、７．９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０） 、７．８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７． ４９−７．４５（３Ｈ，ｍ）、５．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９，１０）、４ ．５３（１Ｈ，ｍ）、４．２５（１Ｈ，ｍ）、３．８（３Ｈ，ｓ）、３．４２（ ２Ｈ，ｍ）、３．０２（３Ｈ，ｓ）、２．５８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．０，５ ．２，１３．４）、２．１８（１Ｈ，ｍ）；¹³Ｃ ＮＭＲ ４００ＭＨｚ（ＣＤ Ｃｌ₃、ｐｐｍ）δ ４２．９、５５．１、６４．３、７４．３、７７．１（溶 媒によって不明瞭化）、８５．８、８６．２、１１３．１、１２２．２、１２３ ．４、１２５．４、１２５．５、１２５．９、１２６．８、１２７．７、１２７ ．８、１２８．２、１２８．７、１３０．１、１３０．４、１３３．６、１３６ ．０、１３ ７．７、１４４．９、１５８．４；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡ マトリックス）Ｃ₃₆Ｈ₃₄Ｏ₅として 計算値５４６．２４０７、実測値５４６． ２４０６４ ＤＭＴエーテル（２００ｍｇ、６６％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐ ｍ） δ ７．８３−７．９４（４Ｈ，ｍ）、７．５６−７．２７（１１Ｈ，ｍ ）、６．８７（４Ｈ，重複ｄ，Ｊ＝８．０）、５．４１（１，ｄｄ，Ｊ＝２．９ ，１０）、４．５２（１Ｈ，ｍ）、３．８２（６Ｈ，ｓ）、３．４２（２Ｈ，ｍ ）、２．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．７，１３．４）、２．２１（１Ｈ，ｍ） ５ ＤＭＴエーテル（３１１ｍｇ、９２％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、 ｐ ｐｍ） δ ７．５２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．４３−７．２４（７Ｈ， ｍ）、６．９４−６．８４（６Ｈ，ｍ）、５．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９， ９．８）、４．４２（１Ｈ，ｍ）、４．１８（１Ｈ，ｍ）、３．８０（６Ｈ，ｓ ）、３．４０（２Ｈ，ｍ）、２．６４（１Ｈ，ｍ）、２．２９（３Ｈ，ｓ）、２ ．２３（３Ｈ，ｓ）、２．１８（３Ｈ，ｓ）、２．０（１Ｈ，ｍ）；¹³ＣＮＭＲ （ＣＤＣｌ₃。、ｐｐｍ）δ １９．６、１９．８、１９．９、４３．１、５５ ．０、６４．０、７５．０、８２．２、１１６．２、１２５．３、１２５．４、 １２５．６、１２５．７、１３０．０１、１３２．１、１３２．２、１３４．２ 、１３５．２、１３６．５、１４５．０、１５８．２；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３− ＮＢＡマトリックス）Ｃ₃₅Ｈ₃₇Ｏ₅として 計算値５３８．２７１９、実測値５ ３８．２６９０ ６ ＤＭＴエーテル（３５０ｍｇ、８８％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐ ｍ） δ ７．４６（１Ｈ，ｄ， Ｊ＝８．０）、７．３９−７．２４（５Ｈ，ｍ）、６．８３（２Ｈ，重複ｄ，Ｊ ＝８．０）、６.７４（１Ｈ，ｄｄ，ｔ＝９．８，８．６）、５．３８（１Ｈ， ｄｄ，Ｊ＝２．９，９．９）、４．４２（１Ｈ，ｍ）、４．０６（１Ｈ，ｍ）、 ３．８０（６Ｈ，ｓ）、３．３８（２Ｈ，ｍ）、２．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２ ．５，１３．４）、２１（１Ｈ，ｍ）；¹³Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ） δ ２９．４、４２．５、５４．９、６４．３、７３．３、７４．３、８５．６ ５、１０２．３、１０２．７、１０３．０、１１２．８、１１５．０、１２６． ５、１２７．５、１１２７．６、１２７．９、１２９．１、１２９．８、１２８ ．９、１３５．０、１４５．０、１５８．９；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマ トリックス）Ｃ₃₃Ｈ₃₂Ｆ₂Ｏ₅として 計算値５６９．２１１５、実測値５６９． ２１３１ ３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの調製 ５’−Ｏ−トリチル化化合物１ ＤＭＴエーテル（２００ｍｇ、０．３２ミリ モル）を４ｍＬの乾燥塩化メチレンに溶解し、これにシセイソブロピルエチルア ミン（０．２２ｍＬ、１.２ミリモル）および２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソ ブロピルクロロホスホルアミダイト（０．１１ｍＬ、０．４８ミリモル）を添加 した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、ヘキサン（４ｍＬ）を添加し、混合物 を（ヘキサン中の５％トリエチルアミンで予め平衡化した）フラッシュシリカゲ ルカラムに負荷し、溶出させた。 生成物は油状ＤＭＴホスホルアミダイト１（２１０ｍｇ、８１％）として得られ た。¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ） δ ８．４４−８．３３（２Ｈ，ｍ） 、８．２５−８．００（７Ｈ，ｍ）、７．６２−７．２２（９Ｈ，ｍ）、６．９ ２−６．７９（４Ｈ，ｍ）、６．２８−６．２０（１Ｈ，未分解ｍ）、４.６９ （１Ｈ，ｍ）、４.４５（１Ｈ，ｍ）、４．０−３．２（１２Ｈ，ｍ）、２．８ ０（１Ｈ，ｍ）、２．６９（２Ｈ，ｔ）、２．３２（１Ｈ，ｍ）、１．１５（１ ２Ｈ，ｍ）；¹³Ｃ ＮＭＲ ４００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ２０．３ （ｍ）、２４．６（ｍ）、４３．２（ｍ）、５５．２、５８．３（ｄ）、６４． １（ｄ）、７５．８（ｄ）、７６．０（ｄ）、７７．９、８５．６（ｄ）、８６ ．３、１１３．２、１１７．７（ｄ）、１２２．８（ｄ）、１２３．１（ｄ）、 １２４．８（ｄ）、１２５．１、１２５．２、１２５．９、１２６．８、１２７ ．１、１２７．５、 １２７．６（ｄ）、１２７．８（ｄ）、１２７．９、１ ２８．４、１３０．３、１３０．７（ｄ）、１３１．４、１３５．４、１３６． １（ｄ）、１４５．１、１５８．５；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリック ス）Ｃ₅₁Ｈ₅₄Ｎ₂Ｏ₆Ｐ（Ｍ＋Ｈ）として 計算値８２１．３７２２、実測値８２ １．３７２０ ２ ＤＭＴホスホルアミダイト（２８０ｍｇ、７７％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ Ｃｌ₃、ｐｐｍ） δ ８．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、８．６８（１Ｈ， ｄ，Ｊ＝８．０）、８．０７（２Ｈ，ｍ）、７．８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８． ０）、７．８０−７．２４（１２Ｈ，ｍ）、６．８４（４Ｈ，重複ｄ，Ｊ＝８． ０）、５．９４（１Ｈ，重複ｄｄ，Ｊ＝２．９，１０）、４．６２（１Ｈ，ｍ） 、４．４０（１Ｈ，ｍ）、３．９（２Ｈ，ｍ）、３．８（６Ｈ，ｓ）、３．５０ （２Ｈ，ｍ）、３．８３（３Ｈ，ｓ）、３．７７（３Ｈ，ｓ）、３．６６−３． ４５（３Ｈ，ｍ）、３．４２−３．３８（２Ｈ，ｍ）、２．８２（２Ｈ，ｔ，Ｊ ＝５．６）、２．５２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６）、２．１６（１Ｈ，ｍ）、１． ２０−１．０５（１２Ｈ，ｍ）；¹³Ｃ ＮＭＲ ４００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ₃、ｐ ｐｍ）δ ２０．０（ｍ）、２４．５（ｍ）、４２．０、４３．２（ｍ）、５５ ．１、５８．４（ｍ）、６３．９（ｄ）、７５．３（ｄ）、７５．８（ｄ）、７ ７．２（溶媒によって不明瞭化）、８５．０（ｍ）、８６．２、１１３．１、１ １７．５、１２２．４、１２３．０（ｄ）、１２３．２（ｄ）、１２４．１（ｄ ）、１２６．２、１２６．４（ｄ）、１２６．６（ｄ）、１２６．７（ｄ）、１ ２７．８、１２８．３（ｄ）、１２８．８（ｄ）、１２９．７（ｄ）、１２９． ９、１３０．１（ｄ）、１３０．６、１３１．６、１３６．１（ｍ）、１４４． ９、１５８．４；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₄₉Ｈ₅₃Ｎ₂Ｏ₆ ＰＮａとして 計算値８１９．３５３７、実測値８１９．３５３９３ ＤＭＴホスホルアミダイト（４８ｍｇ、５０％）¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ 、ｐｐｍ） δ ８．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ８．０）、 ７．８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）、７．５２−７．２４（９Ｈ，ｍ）、６．８２ （４Ｈ，重複ｄ，Ｊ＝８．０）、５．９１（１Ｈ，重複ｄｄ，２×異性体）、４ .６（１Ｈ，ｍ）、４．３８（１Ｈ，ｍ）、３．８３（３Ｈ，ｓ）、３．７７（ ３Ｈ，ｓ）、３．６６−３．４５（３Ｈ，ｍ）、３．４２−３．３８（２Ｈ，ｍ ）、２．８２（２Ｈ，ｔ，Ｊ−５．６）、２．５２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６）、 ２．１６（１Ｈ，ｍ）、１．２０−１．０５（１２Ｈ，ｍ）；¹³Ｃ ＮＭＲ ４ ００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ ２０．３（ｍ）、２４．５（ｍ）、４２ ．０、４３．１（ｍ）、５５．１、５８．４（ｍ）、６３．９（ｄ）、７５．１ （ｄ）、７６．２（ｄ）、７７．１（溶媒によって不明瞭化）、８５．０（ｍ） 、８６．１、１１３．０、１２２．３（ｄ）、１２３．４（ｄ）、１２５．４、 １２５．６（ｄ）、１２６．０（ｄ）、１２６．８（ｄ）、１２７．７、１２８ ．２（ｄ）、１２８．６（ｄ）、１３０．１（ｄ）、１３０．５（ｄ）、１３３ ．６（ｄ）、１３６．０（ｄ）、１３７．５、１４４．９、１５８．４；ＨＲＭ Ｓ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₄₅Ｈ₅₂Ｎ₂Ｏ₆Ｐ（Ｍ＋Ｈ）として 計 算値７４７．３５６５、実測値７４７．３５６３ ４ ＤＭＴホスホルアミダイト（１７０ｍｇ、６５％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ Ｃｌ₃、ｐｐｍ） δ ７．９１（１Ｈ，ｓ）、７．８３−７．７９（４Ｈ，ｍ ）、７．５６−７．２７（１１Ｈ，ｍ）、６.８７（４Ｈ，重複ｄ，Ｊ＝８．０ ）、５．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９，１０）、 ４．５８（１Ｈ，ｍ）、４．３０（１Ｈ，ｍ）、３．９０（２Ｈ，ｍ）、３．８ ３（３Ｈ，ｓ）、３．７７（３Ｈ，ｓ）、３．６６−３．４５（３Ｈ，ｍ）、３ ．４２−３．３８（２Ｈ，ｍ）、２．８２（２Ｈ，ｔ，Ｊ−５．６）、２．５２ （３Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６）、２．１６（１Ｈ，ｍ）、１．２０−１．０５（１２ Ｈ，ｍ）５ ＤＭＴホスホルアミダイト（３８０ｍｇ、８９％）¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ ｌ₃、ｐｐｍ） δ ７．５４（２Ｈ，５重複ｄ，Ｊ＝８．０）、７．４５−７ ．４０（４Ｈ，ｍ）、７．３６−７．２２（３Ｈ，ｍ）、６．９８（１Ｈ，ｓ） 、６．９０−６．８２（４Ｈ，ｍ）、５．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９，１０ ）、４．５６（１Ｈ，ｍ）、２．８２（２Ｈ、ｔＪ＝５．６）４．２２（１Ｈ， ｍ）、，３．８２（６Ｈ，ｓ）、３．６６−３．４５（３Ｈ，ｍ）、３．４２− ３．３８（２Ｈ，ｍ）２．８２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６）、２．４８（１Ｈ，ｍ ）、２．２９（３Ｈ，ｓ）、２．２４（３Ｈ，ｓ）、２．１８（４Ｈ，ｓ）、１ ．９９（１Ｈ，ｍ）、１．２８（１Ｈ，ｍ）、１．２０−１．０５（１２Ｈ，ｍ ）；¹³Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ １４８．９、１４８．４；ＨＲＭ Ｓ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₄₄Ｈ₅₅Ｎ₂Ｏ₆Ｐとして 計算値７３９ ．３８７６、実測値７３９.３８７０ ６ ＤＭＴホスホルアミダイト（４２０ｍｇ、８４％） ¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ Ｃｌ₃、ｐｐｍ） δ ７．５１（２Ｈ，ｍ）、７．４２−７．２２（９Ｈ，ｍ ）、６．８４ （４Ｈ，重複ｄ，Ｊ＝８．０）、６.７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，８−６） 、５．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９，１０）、４．５４（１Ｈ，ｍ）、４．２ ２（１Ｈ，ｍ）、３．８２（６Ｈ，ｓ）、３．６６−３．４５（３Ｈ，ｍ）、３ ．４２−３．３８（２Ｈ，ｍ）、２．８２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６）、２．５０ （２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６）、２．０５（１Ｈ，ｍ）、１．２０−１．０５（１２ Ｈ，ｍ）；¹³Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）δ １４８．９、１４８．３； ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリックス）Ｃ₄₂Ｈ₄₉Ｆ₂Ｎ₂Ｏ₆Ｐとして 計 算値７６９．３１９４、実測値７６９．３２０９ ベンゼン誘導体との反応で見られるように、より大きい多環芳香族とのカップ リング¹³は、良好な総じての収率で（５４−８１％単離収率）アルファ−および ベータ−アノマーの混合物を生じる。すべての４つの場合における主要異性体は 立体配置の保持で形成される；かくして、アルファ−アノマーＣ−ヌクレオシド （図５の１ａ、２ａ、３ａ、４ａのｐ−トルオイルエステル）は主要生成物であ る。（ＮＭＲ積分による）２つの異性体の測定された比率は、９−フェナントレ ニる誘導体についての１０：１（α：β）に対してＩ−ナフチル誘導体について の５：１の範囲である。すべての異性体のＣ−１’炭素における立体配置は、脱 保護ヌクレオシドに対する¹Ｈ−核オーバーハウザー実験によって、およびα− アノマー化合物の１つのＸ−線結晶構造での修正によって、保 護ヌクレオシドについてのカップリングＨ１’−Ｈ２’定数を解析することによ って決定された（後記参照）。 所望のベータ−アノマー（１−４のトルオイルエステル、図５）もこのカップ リング反応から単離することができるが、収率は理想よりも低かった。かくして 、実験を行って、圧倒的なアルファ−アノマーが所望のベータ−立体配置に変換 できる条件を見い出した。酸性条件は、可逆的な開環によってＣ−１位置におけ るエピマー化を可能とすることが予測された。いくつかの組の条件での実験は、 少量の水の存在下での還流キシレン中の安息香酸の結果、事実、数時間後にアル ファ−アノマーからベータ−およびアルファ−アノマーの混合物への容易な平衡 化が起こることを明らかとした。少量の水の添加は異性化に必要であることが判 明した。次いで、それらのビス−トルオイルエステルとしての全ての４つのアル ファ−異性体（図５の１ａ、２ａ、３ａ、４ａ）について平衡化を行った。また 、２つの従前に報告されている置換ベンゼンヌクレオシド（トルオイルエステル ５ａ、６ａ）についても平衡化をテストして、反応の範囲をテストした。有意に は、平衡化後の各混合物の主要成分全ての場合に所望のベータ−異性体であった （図５の１−６）。アルファ−異性体に対するベータ−異性体の比率は、トリメ チルベンゼン誘導体での４：１から１−ナフチル誘導体での２．５：１の範囲で あった。カラムクロマトグラフィー後の所望のベータ−アノマーの単離収率は２ ８− ５４％の範囲であった。アルファ−アノマーおよび混合画分は、所望ならば、再 単離し、異性化においてリサイクルできた。興味深いことには、脱保護された遊 離ヌクレオシド自体は、延長された時間においても、これらの条件下でいずれ観 察可能な異性化も受けなかった。 手中にしたベータ−アノマー立体配置へのエピマー化なついての新しい方法で は、合成反応式は、一般的に良好な収率で６つの芳香族Ｃ−ヌクレオシド（図５ の１−６）の容易な生成を可能とした（図７）。トルオイル保護基はメタノール 性塩基中で除去され、収率は５０−７８％の範囲であった。この総じての反応式 に従い、遊離の未保護ヌクレオシドが合計してただ３工程（芳香族カップリング 、異性化、エステル脱保護）にて生成された。実施例２ 構造の帰属 化合物１−６および１ａ−６ａ（図５）についてのアノマー立体配置の構造帰 属は、全ての化合物の¹Ｈ−ＮＯＥ実験によって、Ｈ１’およびＨ２’プロトン についてのカップリング定数の調査によって、およびアルファ−１−ナフチルヌ クレオシド３ａ（図２）のＸ−線結晶構造との相関付けることによってなされた 。加えて、化合物は、それらの¹Ｈおよび¹³ＣＮＭＲスペクトルによって、およ び高分解質量分析によって特徴付けられた。 ¹Ｈ、¹³Ｃおよび³¹Ｐ ＮＭＲスペクトルは、特に断りのない限り、３００Ｍ Ｈｚスペクトロメーターで記録し、 化学シフトは内部参照として溶媒を用いδ（ｐｐｍ）で与え、カップリング定数 はヘルツ（Ｈｚ）単位である。ＮＯＥ差分スペクトルも３００ＭＨｚ装置で行っ た。マススペクトルは電子衝撃または化学イオン化を用いて行った。全ての反応 は蛍光指示薬（ＳｉＯ₂−６０、Ｆ−２５４）を持っＥＭ試薬プレートを用い、 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってモニターした。フラッシュカラムク ロマトグラフィーは、ＥＭサイエンス・シリカ・ゲル(Science Silica Gel)６０ （２３０−４００メッシュ）を用いて行った。マススペクトル分析はカリフォル ニア大学、リバーサイド質量分析施設、リバーサイド（Riverside）、カリフォ ルニア州によって行った。全ての反応は、特に断りのない限り、無水条件下、乾 燥した新たに蒸留した溶媒中、窒素雰囲気下で行った。金属ナトリウム／ベンゾ フェノンから蒸留し、塩化メチレンはＮａＨから蒸留し、ピリジンは使用前にＢ ａＯから蒸留した。 プロトン核オーバーハウザー効果を用いて、化合物１−６のアノマー異性体の 幾何学を調べた（図５）。使用したアプローチは、δ１．７−２．７ｐｐｍに位 置したＨ−２’ブロトン共鳴を別々に照射し、隣接１’および３’プロトンにお ける増強を観察するというものであった（図１および表１、２参照）。その共鳴 が２’−αに対応する特異的帰属、および２’−βに対応する帰属は、先験的に はなすことができず、予測されるＮＯＥの分析 は、１’位における立体化学の帰属に対する簡単なアプローチを可能とする。ア ルファ−およびベータ−ヌクレオシドの構造（図１）の調査は、アルファ−アノ マーにつき、２’−βプロトンが１’および３’プロトンに非常に近接する一方 、Ｃ−２’−αプロトンはこれらのプロトンのいずれにも近くはないことを示す 。他方、ベータアノマーにおいて、２’−βプロトンは３’プロトンのみに近い 一方で、２’−αプロトンは１’プロトンのみに近い。かくして、アルファアノ マーにおいて、Ｃ−２’プロトンの１つの別々の放射は垂直プロトンにおける２ または０増強に導く一方で、ベータアノマーにおいては、これらの２つの放射は 各放射につき１つの有意な増強に導くであろう。 この放射をテストするために、ナフチルヌクレオシド異性体３および３ａにつ いての実験（表１および２）を行った。３ａのジエステルは、グリコシドカップ リング反応の主たる生成物である（３のジエステルは従たる生成物である）。ヌ クレオシドの２’プロトンの１つの放射は、１’および３’プロトンにおいて８ ％および７％の有意な核オーバーハウザー増強を与えた；しかしながら、他の２ ’プロトンの放射は、１’または３’位置いずれにおいても有意な増強を与えな かった。前記分析を用いると、これは、この化合物がアルファアノマーであるこ とを示す。この帰属は、該化合物について得られた単結晶Ｘ−線構造（後記）に よって確認された。２つの 異性体の分析を完結するために、本発明者らは、３ａのエピマー化の後に主要生 成物である異性体ヌクレオシド３につき同一の実験を行った。２’プロトンの１ つの放射は１’プロトンの８％増強を与え（３’プロトンでは与えなかった一方 ）、他の２’プロトンの放射は３’プロトンの５％増強を与え（１’プロトンで は与えなかった）。かくして、この化合物はベータ立体配置に帰属される。また 、１’プロトンが放射される別の実験はこの帰属に合致する；ここに、本発明者 は４’プロトンにおいて６％増強を観察した一方で（表１）、アルファアノマー はかかる増強を示さない（データは示さず）。 次いで、１、３および４−６の異性体につきＮＯＥ実験を行った（図５）。結 果を表１および２に示す。各対のうち１つの異性体は２つのＨ−２’放射につき 隣接プロトンの２およびゼロ増強を与えた一方で、他のものは２つの放射の各々 につき１つの有意な増強を明瞭に与えた点で、結果は全てモデルに合致する。２ およびゼロ増強を与えた異性体はアルファアノマーとして帰属され、１および１ 増強のものはベータアノマーに帰属された。また、アルファ異性体に存在しない ベータ異性体についてのＨ−１’プロトンの放射に対するＨ−４’位におけるＮ ＯＥ増強（表１）はこれらの帰属に合致した。 また、これらの帰属は、グリコシドカップリング反応から得られた主要異性体 が同一アノマー立体配置（アルファ）の全てである点で内部的にも合致した。同 様に、 エピマー化から単離された主要異性体は同一アノマー立体配置（ベータ）の全て であった。加えて、アルファとして帰属された全ての異性体は、６．０−８．０ Ｇｚ近くの両カップリング定数を有する、偽トリプレット（それらは、現実には ダブレットのダブレットである）として定量的に出現したＨ−１’共鳴を有した 。ベータ立体配置に帰属された異性体は、ダブレットのほとんど等しくスペース を置いたダブレット（Ｊ〜３および１０Ｈｚ）として出現したＨ−１’共鳴を有 した。これらのＨ−１’〜Ｈ−２’カップリング定数傾向は、関連β−Ｃ−ヌク レオシド¹⁸についての同様のカップリング定数の文献報告と合致する（しかし、 それらはβ−Ｎ−ヌクレオシドについての観察に対しては逆である）。 また、１−ナフチル化合物３ａで得られたＸ−線構造データはこれらの構造帰 属で有用であった（図２）。分析に適した結晶は、塩化メチレン／ヘキサン（Ｃ Ｈ₂Ｃｌ₂／ヘキサン）からの再結晶によって得られた。 実験は、グラファイト単色化Ｍｏ−Ｋα放射にてエンラフ−ノニウス(Enraf-N onius)ディフラクトメーターで行った。Ｃ₁₅Ｈ₁₆Ｏ₃の単結晶は単斜晶系、空間 群Ｐ２₁（＃４）で、α＝７．８０６（２）Å、ｂ＝６．７２０（２）Å、およ びｃ＝１１．８９８（３）Å、Ｖ＝６１５．８（３）ų、Ｚ＝２であり、計算 された密度は１．３１ｇ／ｃｍ³である。データは、５０．０°の最大２Ｔまで のｗ／２Ｔ走査技術を用い、−２０（１）℃で収集した。 データ収集に先立って行ったいくつかの強反射のオメガ走査は、２．８°のテー クオフ角度で０．２６°の半波高における平均幅を有していた。カウンター温度 は、２．０ないし２．５ｍｍの範囲の幅を持つ可変水平スリットおよび２．０ｍ ｍに設定した垂直スリットよりなるものであった。入射ビームコリメーターは０ ．７ｍｍであり、結晶から検出器までの距離は２１ｃｍであった。合計１２３４ のユニークな吸収−修正反射が収集され、構造は直接法によって解析した。非水 素原子は異方的に洗練し、水素原子は理想的な位置に含めた。全−マトリックス 最小二乗法の最終サイクルは、７８５の観察された反射に基づき、Ｒ＝０．０４ ３およびＲ_w＝０．０３９の重みをかけないおよび重みをかけた一致パラメータ ーにて集光させた（最大パラメーターシフトはそのｅｓｄの０．０１倍であった ）。単位重量の観察の標準偏差は１．５４であった。最終差分フーリエマップ上 の最大および最小ピークは、各々、０．１４および−０．１５ｅ−／ųに対応 した。全ての計算は、モレキュラー・ストラクチャー・コーポレーション（Mole cular Structure Corporation）のテキサン（teXsan）ソフトウェアパッケージ で行った。 構造はα−立体配置を示し、天然ヌクレオシドに類似して、ナフタレンはアン チ−立体配座であり、芳香族基は糖から離れる向きである。デオキシリボース環 はＣ−３’−エキソ（Ｓ−タイプ）立体配置である。 ＣＤＣｌ₃中におけるこの化合物（３ａ）のエステルに ついての実験的Ｈ’−１’ないしＨ−２’カップリング定数はＪ＝８．０および ６．０Ｈｚであった。Ｘ−線構造から得られた対応する上反角は、８．１および １２４．５゜であることが判明する。ヌクレオシドにつき経験的に調整させたカ ルプラス(Karplus)関係の適用は、各々、Ｊ＝９．２および２．８Ｈｚを予測し 、これは結晶におけるそれに対する溶液中での環立体配座の小さな変化（または このＣ−ヌクレオシドの経験的関係の非理想的マッチ）を示す。興味深いことに は、この化合物は明らかにアルファ−アノマーであるが、実験的に測定されたカ ップリング定数は天然ヌクレオシドのアルファ−アノマーよりもむしろベータ− アノマーについて通常観察されるものとより一致する。実施例３ ＤＮＡへの取込み 次いで、自動固相方法によって、β−Ｃ−デオキシヌクレオシド１、２および ３（図５）をＤＮＡオリゴヌクレオチドに取り込むことを狙ってそれらを担わせ た（図７および図１４−１５）。標準的な方法を用いて、未保護ヌクレオシドを ５’−ジメトキシトリチル−保護誘導体に変換し、収率は精製後に５９−９２％ の範囲であった。次いで、これらをシアノエチルホスホルアミダイト誘導体に変 換し、これはカラムクロマトグラフィーの後に５０−８９％収率で得られた。 正常残基についての遅延された（１０分）カップリン グサイクルによる以外は標準的なβ−シアノエチルホスホルアミダイト化学を用 い、ＤＮＡオリゴヌクレオチドをアプライド・バイオシステムズ（Applied Bios ystems）３９２合成器で合成した。非天然残基についての段階的カップリング収 率は、全て、トリチルカチオンモニタリングによって測定して９０％より大であ った。オリゴマーは、分取用２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ て精製し、クラッシュ・アンド・ソーク方法によって単離し、２６０ｎｍにおけ る吸光度によって定量した。モル吸光係数は、最近接方法によって計算した。非 天然残基を含有するオリゴヌクレオチドについての値は以下の方法で見積もった ：新しい各ヌクレオチドを２６０ｎｍでその吸光係数につき測定した。２および ３についてのモル吸光係数は、各々、８９９０および１５４であることが判明し 、これらの値をコア配列ｄＣＧＣＧＣＧについての値に加えた。 ＤＮＡにおけるヌクレオシド１の吸光度は３５０ｎｍで測定し、この値の０． ４８を２６０ｎｍにおける全吸光度から減じて、コアＤＮＡ単独の吸光度を得た 。オリゴデオキシヌクレオチドは精製後にナトリウム塩として得られた。残基１ −３の完全な取込みは配列Ｔ−Ｘ−Ｔ（ここに、Ｘ＝１−３）の短いオリゴマー の合成によって確認した。プロトンＮＭＲ（４００ＭＨｚ）（図３）は、予測さ れた完全性をもって完全な構造の存在を示した。粗製未精製オリゴヌクレオチド のスペクトルは、遊 離ヌクレオシドのそれと非常に似ており、かつアノマーＣ−１’プロトンおよび チミジンＣ−６プロトンおよびＣ−５メチル基に対して予測された芳香族完全性 を有する明瞭な共鳴を示す。これは、（非反応性の芳香族炭化水素につき予測さ れる）完全な構造の存在ならびに高いカップリング収率を共に確認する。という のは、不完全なカップリングに由来するジ−およびモノヌクレオチドは見られな いからである。実施例４ ＤＮＡにおける蛍光特性 ヌクレオシド１、２および３（図５）におけるもののごとき多環芳香族は蛍光 プローブ²²として他の状況で研究されてきたので、水性緩衝液におけるこれらの 構造を含有するオリゴヌクレオチドの蛍光特性を調べた。自己相補性であって、 ５’末端に位置した多環芳香族ヌクレオシドとでデュプレックスを形成する配列 ５’−ｄＸＣＧＣＧＣＧ（ここに、Ｘ−１、２および３）を有するヘプタマーオ リゴデオキシヌクレオチドを合成した。これらは分取用変性ゲル電気泳動によっ て精製した。 蛍光スペクトルはＳＰＥＸ−Ｆ１ｕｏｒｏｌｏｇ−２シリーズフルオロメータ ーで記録した。キセノンランプを照射源として用いた。蛍光測定値は、ｐＨ７． ０緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ−ＰＩＰＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中の０．１−０．１５μＭ ＤＮＡ溶液を用い、直角モードで採取し た。５回の走査を２ ３℃で平均した。励起スリットは６ｍｍに設定し、発光スリットは２ｍｍに設定 した。全ての発光スペクトルは、装置バラツキを補償するための参照染料（ロー ダミン−Ｂ）を用いて、かつ緩衝液単独についてのデータを減じることによって も修正した。２３３、２５１および３４１ｎｍの励起波長（吸収最大）を用いて 、各々、ナフタレン、フェナントレンおよびピレンを含有する化合物を励起した 。 発光スペクトルは、２５℃（デュプレックスを形成するような条件）にて、ｐ Ｈ７．０緩衝液（１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液、１００ｍＭ ＮａＣ１、１Ｏｍ Ｍ ＭｇＣｌ₂）中で３つの配列につき測定した。ナフタレン含有配列はバック グラウンドを超えて検出可能な発光を示さなかった。他の化合物は、多環芳香族 親構造についての公表されたスペクトル²²に合致する蛍光発光プロフィールを示 した。フェナントレン含有オリゴヌクレオチドは最も強い発光を有し（図４）、 最も強いピークは３７０ｎｍにおけるものであった。ピレン修飾配列は、３９５ ｎｍで発光最大であってフェナントレンの場合についてのものよりもかなり低い ピーク強度である以外は同様の発光プロフィールを示し、これはこれらの条件下 、この配列におけるＤＮＡによるかなりの消光を示唆する。実施例５ ＤＮＡにおけるα−ピレンヌクレオシドの特性 α−ピレンヌクレオシドホスホルアミダイトを、ＡＢ Ｉ３９２合成器にて１−μモル規模でＤＮＡに取り込んだ。カップリング収率は トリチル応答によってモニターし、高かった（〜９２％以上）。フォールディン グバック（folding back）によって一本鎖標的とでトリプレックスを形成するよ うに設計したいくつかのオリゴヌクレオチド（図１３）を調製した。該分子はチ ミジンヌクレオチドまたは種々の数（１、３、５）のピレンヌクレオチドいずれ かで構成された５−ヌクレオチドループを有する。これらは複雑なことなく合成 され、変性分取用ＰＡＧＥゲルで精製した。 熱変性実験は、０．５℃／分の加熱速度を用い、従前に記載されているごとく に行った。実験した熱変性用の溶液は、１：１のモル比のオリゴヌクレオチドプ ローブおよびその対応する相補性１８−ｎｔオリゴマー（各々１．５μＭ）を含 有した。溶液をｐＨ７．０の１０ｍＭ Ｎａ・ＰＩＰＥＳ（１，４−ピペラジン ービス（エタンスルホナート）で緩衝化した。また、１００ｍＭ ＮａＣｌおよ び１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂も変性溶液に存在させた。溶液を調製した後、それらを ９０℃に加熱し、融解実験に先立って室温までゆっくりと冷却した。Ｔ_mの不確 かさは、実験の反復に基づいて±０．５℃で見積もった。 結合実験（熱変性）の結果は、全てのオリゴマーが十分に一本鎖標的に結合す ることを示し；かくして、新しいヌクレオシドは結合特性に干渉しない。ループ を超えて伸びるより長い標的を用いて別の結合実験も行った； 結合は以前としてきつく、興味深いことには、ピレン−タッグド化合物は、ピレ ンが多く存在する程、より強い結合を示した。例えば、Ｐ１オリゴマーとの複合 体はｐＨ７．０で３５℃のＴ_mを有する一方で、ａと結合したＰ３プローブは４ ２℃または７℃高いＴ_mを有した。前記で示した配列に対する結合は天然ゲルシ フト実験によっても示され、複合体は蛍光下で明らかに見えた。単一ピレンバー ジョンは色が深い青色である一方で、多数タッグ付加バージョンは外観が淡青色 ないし白色であり、より長い波長の発光を示す。Ｐオリゴヌクレオチドの記載に ついては図１３参照。 蛍光特性 定常状態蛍光スペクトルは室温にてＳＰＥＸ−Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−２シリー ズフルオロメーターで記録した。照射源はキセノンアーク灯であった。３４１ｎ ｍの励起波長を用い、全ての励起および発光スリットは２ｍｍに設定した。蛍光 測定値は直角モードで採取した。全ての試料濃度は、ｐＨ７．０緩衝液（１０ｍ Ｍ Ｎａ・ＰＩＰＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中の標 識ＤＮＡにて０．１μＭであった。緩衝溶液は空気飽和させた。デュプレックス 測定では、等モル量のワトソン−クリック相補体を添加し、混合物を９０℃まで 加熱し、蛍光測定前にゆっくりと冷却した。特に断りのない限り、参照染料（ロ ーダミン−Ｂ）を用いて全ての発光スペクトルを測定して蛍光バラツキを補償し 、緩衝液単 独についてのデータを差し引くことによって修正した。１−ピレンメチルアミン 塩酸塩はアルドリッチ（Adrich）から入手した。 図１３の単一タッグ付加オリゴヌクレオチド（Ｐ１）をまず実験した。オリゴ ヌクレオチドＰ１のスペクトルを、同一濃度（０．１μＭ）の水中での遊離ヌク レオシド自体のそれと比較した。化合物は３４１ｎｍで励起し、ｐＨ７．０緩衝 液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ Ｎａ−ＰＩＰＥ Ｓ）中で実験した。スペクトルは図９および１０に示す。 遊離ヌクレオシドはピレンにつき公表されているものと非常に似た発光スペク トルを示し、最も強いピークは約４００ｎｍにおけるものであった。同一濃度に おけるＰ１オリゴヌクレオチドは、低い構造で、テールアウトないしより長い波 長の発光スペクトルを示す。興味深いことには、Ｐ１化合物の発光強度は３８１ ｎｍで５００，０００である一方で、水中における遊離ヌクレオシドのそれは５ ０，０００である。かくして、ヌクレオシドのＤＮＡ鎖への取込みは、約１０倍 の発光強度の増加をもたらした。 多数タッグ付加オリゴヌクレオチドは蛍光分光測定によって調べると、２つの 異常特性を有する。まず、発光スペクトルは約４５０−５５０ｎｍ（ピークは４ ８３ｎｍ）で明瞭なエキシマバンドを示す。第２に、エキシマバンドの強度は、 ３および５標識を持つ２つの化合物に ついてのＰ１の正常ピレン蛍光よりも強い。興味深いことには、３つの標識をチ ミジンを間にして置くと（Ｐ３およびＰ３Ａを比較）、エキシマバンドはかなり 弱く、エキシマは標識の隣接設置を要することが確認される。ループ中の３つの ピレンは、末端における３つのピレンよりも強いエキシマバンドを与え（Ｐ３な いしＰ３ＥＮＤを比較）、ループにおけるより大きいスタッキングを示す（図１ ３）。 次いで、全ての蛍光−タッグドオリゴマーを相補的標的ＤＮＡにハイブリダイ ズさせた。重要なことには、蛍光発光強度は結合に際して同一に留まった（２０ ％内）。これはＤＮＡに連結されたピレンブチラートと好都合に比較され、これ は相補体への結合に際して約１０倍消光される^30b。 ルビン（Rubin）ら、1995、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Aci ds Res.）23:3547-3553の手法に従って、Ｐ３オリゴヌクレオチドを環状形態に 二量体化させた。このオリゴヌクレオチドはＤＮＡ中の２０−ｎｔ認識部位にか なりきつくかつ特異的に結合する。（３つのピレンヌクレオシドを含有する）Ｐ ３オリゴマーの発光強度を、同一条件下で、（６つのピレンヌクレオシドを含有 する）環状Ｐ６オリゴマーのそれと比較した（図１３参照）。 結果は、Ｐ６化合物はＰ３オリゴヌクレオチドの２倍の発光強度を有すること を示す（図１２参照）。かくし て、６つのピレン標識がこのＤＮＡプローブに存在し、蛍光強度の消光はない。 ４８３ｎｍにおけるこのＰ６サークルの発光強度は単一標識Ｐ１化合物のそれ（ 発光最大３８１ｎｍ）の約４倍であり、同一緩衝液中の遊離ピレンヌクレオシド のそれの約４０倍である。 これらの結果は、多数標識をＤＮＡに組み込むことができ、単一標識よりもか なり明るいことが可能な発光を生じることを示す。加うるに、発光はより容易に 見えるより長波長におけるものである。実施例６ 線状オリゴヌクレオチドプローブにおける置換 実施例５におけるごときトリプレックス−形成プローブのループ領域における 置換よりもむしろ標準的ＤＮＡプローブの末端における多数アルファ−ピレン置 換を最適化するために実験を行った。最初に評価したのは、５’−末端または３ ’−末端置換が好都合であるか、隣接する塩基が重要か否かであった。実験は、 ３つの隣接アルファ−ピレンを含有するオリゴで行った；これらは未結合および ハイブリダイズした場合の双方において蛍光発光強度につき観察した。プローブ はヒト・テロメア反復に結合するように設計した。結果は、未結合オリゴマーに つき以下に示す（相対的結果はそれらが結合した場合に変化しない）。 結果は、５’末端および３’末端置換が同一の蛍光強度を与えることを示す。 しかしながら、隣接塩基の性質は差異を生じさせない。隣接塩基がＡまたはＣで ある場合の比較は、ピレンにＡが隣接する場合はかなり（５０％以上高い）発光 強度を与えたことを示す。 次に、より大きい強度のためにはさらなるピレンをどのように付加するのが最 良であるかを調べた。ＤＮＡにおいて内部的に置換されたピレンについての結果 （実施例５）は、エキシマについての発光強度は３ないし５隣接ピレンで増加す るが、もう１つ付加するのは（６隣接標識）は現実には総じての強度を減少させ ることを示した。同様の効果が、線状プローブの末端に組み込まれたピレンで観 察された。 多数ピレンを有する３つのオリゴを比較した：１つは３つの隣接標識を持ち（ Ｐ３）、１つの６つの隣接標識を持ち（Ｐ６）、および１つは３つの標識、次い でアデニン、次いでもう１つの３つの標識を持つ（Ｐ３Ａ３）。これらのうち、 Ｐ３Ａ３は他の２つよりもかなり良好な強度を与えた。かくして、Ｐ３ＡＰ３Ａ Ｐ３またはＰ５ＡＰ５のごとき立体配置を用いることによって、あるいはプロー ブの両末端にかかる基を付加することによって、 なおさらに明るい標識が可能である。 実施例７ ２つの異性体のエキシマ蛍光特性の比較 実施例５に記載した同一のＤＮＡ配列を、３つの連続したピレン残基を持つも のとして合成した；１つの配列は３つのアルファ異性体を有し、他のものは３つ のベータ異性体を有した。同一励起および同一溶液条件で、両者につき蛍光発光 を測定した。結果は、両エリゴヌクレオチドが、ピレン蛍光の喪失を持つ完全エ キシマ形成と合致して、実質的に同一の発光バンドを示す。しかしながら、アル ファの場合についてのピーク高はベータの場合よりも〜１００倍高い（図１７参 照）。 ２つの発色団単独についての固有の蛍光差は非常に少ないようである。ＤＮＡ における大きな差異についてのありそうな理由は、（天然ＤＮＡ塩基と同一の立 体配置を有する）ベータの場合は、隣接ＤＮＡとより強く重ねられ、このスタッ キングは隣接塩基によるより強い消光をもたらすということである。実施例８ さらなる実験を以下のオリゴヌクレオチドで行った。 ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、記載されたごとく^31.32、ピレン残基について の延長された（１２．５分）カップリングサイクルを除き、標準的β−シアノエ チルホスホルアミダイト化学を用い、アブライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）３９２合成器で合成した。ピ レン残基についての段階的カップリング収率は、典型的には、トリチルカチオン モニタリングによって測定して９５％より大であった。アセトニトリル中の０． ０５Ｍのピレンホスホルアミダイト濃度を用い、カップリング効率を危うくしな いことが示された。ＤＮＡオリゴマーは分取用２０％変性ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動によって精製し、クラッシュ・アンド・ソーク方法によって単離した 。未修飾オリゴヌクレオチドのモル吸光係数は、最近接方法によって計算した³³ 。ピレン残基を含有するオリゴヌクレオチドの濃度は以下の方法で測定した：Ｕ Ｖ吸光度は２６０ｎｍおよび３５０ｎｍで測定した。オリゴヌクレオチドのＤＮ Ａ部分についての計算された吸光係数を用い、２６０ｎｍ値をベア規に置き換え た。２６０ｎｍにおけるピレンの寄与についての補正因子は、３５０ｎｍにおけ る吸光度の０．５倍を採用した。これは標識オリゴマーの近似濃度を与えた。よ り正確なオリゴマー濃度に到達するために、混合実験データから構築したジョブ （Job）のプロットを、オリゴヌクレオチドに対するワトソン−クリック相補体 で行った。 熱変性実験 熱変性実験用の溶液は、１：１モル比のオリゴヌクレオチドプローブおよびそ の対応する相補性１８−ｎｔオリゴマー（各々１．５μＭ）を含有した。溶液を ｐＨ７．０の１０ｍＭ Ｎａ・ＰＩＰＥＳ（１，４−ピペラジン−ビス（エタン スネホナート）、シグマ(Sigma)）で緩衝 化した。また、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭＭｇＣｌ₂を変性溶液中に 存在させた。溶液を調製した後、それらを９０℃まで加熱し、融解実験に先立っ てゆっくりと室温まで冷却した。融解実験は、０．５℃／分の加熱速度を用い、 従前に記載されているごとくに¹⁴行った。Ｔ_mの不確かさは実験の反復に基づい て±０．５℃で見積もった。 溶液中のおよびＤＮＡ中の単一ピレンヌクレオシドの蛍光 蛍光測定は実施例５に記載されているごとくに行った。標識に選択した１８量 体ＤＮＡ配列はヒト・テロメア反復配列に相補的である³⁴。アルファ−およびベ ータ−ピレンの遊離ヌクレオシドについての蛍光発光スペクトルをまず測定した 。それらは水にほとんど溶解せず、従って、メタノール中で測定した（図１９Ａ ）。それらは同一の発光プロフィールおよび強度を有し、ピレンモノマー発光に 典型的な、３５０−４２５ｎｍ（λ_max＝３９６ｎｍ）の間に３つのバンドを示 すことが判明した。単一α−ピレン標識はオリゴヌクレオチド３’末端（配列Ｈ Ｔ１、ピレンはアデニンに隣接）に取り込み、蛍光スペクトルは水性緩衝液中で 測定した（図１９Ｂ）。発光プロフィールは、遊離ヌクレオシドのそれと、およ びピレンメチルアミン塩酸塩（ＰＭＡＨ）のそれと実質的に同一であることが判 明した。水性緩衝液中の遊離ピレンのためのモデルとしてＰＭＡＨを用い、同等 ピレン濃度に おける発光強度の比較は、α−ピレンをこのＤＮＡ配列に取り込むと、強度の〜 １７倍減少を示し、これは従前の研究^30bと合致する。 オリゴデオキシヌクレオチドにおける多数ピレン置換 ＤＮＡの同一配列においてアルファ−およびベータ−ピレン標識を比較する予 備的実験は、遊離ヌクレオシドとして両者は同一に挙動するという事実に拘わら ず、ベータ−ピレン標識はかなり低い蛍光強度を与えることを示した。この効果 の１つの例は図２０に示され、該図は３つの連続したアルファ−またはベータ− 標識を含有する配列についての発光スペクトルを比較する。発光プロフィールは ベータ立体配置にて実質的に同一であり、強度は１００倍低い。 ３’末端に１−７のα−ピレンを（配列ＨＴ１−ＨＴ７）、および５’末端に ３−６のα−ピレンを（ＨＴ３Ｂ−ＨＴＢ６）担う一連のオリゴヌクレオチドを 合成した。発光スペクトルは図２１に３’シリーズにつき示し、吸収スペクトル は図２２に示す。数値データは表３に与える。すべての場合に対し、２以上の隣 接ピレンがＤＮＡに存在する場合、エキシマ形成は４００および６００ｎｍの間 のブロードな無構造バンドとして観察された（ピーク最大〜４８９ｎｍ）（図２ １Ａ）。２つのピレンでは、非常に少量の残存するモノマー発光が観察され（エ キシマ／モノマーは＞２０：１）、３標識を超えると（図２１Ｂ）、モノマー発 光は検出できない。同様の 結果が配列の５’末端で観察され（表３参照）、これらの場合につき、低強度の より短い波長のショルダーが約４２５−４５０ｎｍのエキシマバンドで見えた。 発光強度傾向は、隣接する塩基が同一であれば、ＤＮＡの両端において一般に 同様であることが観察された（表３）。両シリーズにつき、発光強度は一般に増 加し、５標識でピークに達し、しかる後、連続標識の数をさらに増加させていく と、現実には、その結果、総じての発光強度は低下する（図２１、表３）。興味 深いことには、相対的発光強度は、各標識オリゴマーのモル吸光度のランク付に よく相関する（図２２、表３）。例えば、６つのα−ピレンをもつ配列は、現実 には、大きいピレン数にも拘わらず、５つの場合のものよりも、低いモル吸光度 （３４８ｎｍではほとんど３００倍だけ）および低い蛍光発光強度（２１倍だけ ）を共に有する。ＨＴ２−７シリーズについては、４８９ｎｍでモニタリングす ることによって励起スペクトルも測定し、得られたスペクトルは図２２における 吸収スペクトルと実質的に同一であった。 発光強度における偶数／奇数効果 全体として該シリーズを概観すると、隣接ピレンの数およびエキシマ形成の強 度で観察される（図２３）。予測されないことには、３つのピレンは２つよりも 明るい蛍光であるが、驚くべきことに、４つは３と同等には明るくない。５つの ピレンは明るい発光を生じる一方で、 ６つは強度がかなり低い。７つの標識は、次いで、強度の若干の増加を示す。一 般に、奇数ピレンはより大きい強度のエキシマ発光に好都合であるらしい一方で 、偶数は弱い発光を生じる（図２１Ｂ、表３）。同一の傾向が３’および５’両 標識オリゴマーシリーズで観察された。これは、各々が６つのピレンを保有する ２つの異なるオリゴマーにつき蛍光強度を調べることによってさらに確実となる 。６つの隣接ピレンを持つものは１つのものよりもかなり低い蛍光であり、ここ にそれらはその間にアデニンを持つ３つからなる２つの群に分けられる（ＨＴ６ ｖｓ．ＨＴ３Ａ３、表３）。吸収スペクトルの調査（図２２）は、吸光度のラン ク付けが発光強度とよく相関することを示す。かくして、偶数／奇数効果が励起 に先立つ基底状態で観察される。 プレ会合についての証拠 エキシマ蛍光が、これらの多数標識ＤＮＡにおけるピレンの励起状態または基 底状態会合から生起するかを調べるために、いくつかの種のデータを調べた。ま ずＤＮＡ（配列ＨＴ１−７）における遊離ピレン（ＰＭＡＨ）およびアルファピ レンについての吸収スペクトルの測定は、全てのＤＮＡ−会合ピレンが〜６−９ ｎｍの赤色シフトを呈することを示す。緩衝液中の遊離ＰＭＡＨは３２５および ３４２ｎｍにピーク最大を有する一方で、ＨＴ１−７のそれは〜３３１および３ ４８ｎｍにあり（表３）、スタックされた種と合致する。第２に、プレ会合 の程度を測定するのにも使用された^14.15、ピークｖｓ．谷比の測定による吸収 バンドの広がりの観察を行った。単一ピレン単独では、２．７のピーク：谷比率 が測定される一方で、多数標識ＤＮＡでは、該値は減少した：２、３、４、５お よび７標識では、該値は、各々、１．７４、１．２９、１．５４、１．３８およ び４．０である。かくして、この尺度によると、最も強いエキシマは最も高度に プレ会合している場合であり得る。 隣接する塩基の効果 シトシンｖｓ．アデノシン隣接塩基の効果をテストした（配列ＨＴ３Ｂｖｓ． ＨＴ３Ｃ）。隣接塩基がアデノシンであるオリゴマーは、ピレンがシトシンに隣 接した対応するオリゴマーの２倍の強度の蛍光であった（表３）。この見掛け消 光が吸光度のまたは量子収率によるものかはまだ知られていない。いずれの場合 においても、この見掛け消光はピレンエキシマならびにモノマー発光に適用でき るようである。 ハイブリダイゼーション効果 ピレン標識の付加がその相補体に結合するＤＮＡの能力に影響するか否かをテ ストするために、相補性１８量体ＤＮＡにて３’および５’シリーズの熱変性実 験を行った。結果を表４に示す。一般に、未標識配列（ＨＴＯ）と比較して融解 温度（Ｔｍ）に対してほとんど効果がない。ピレンの３’末端への付加は、６ま たは７標識が存在するまで幾分安定性であり、その場合、標識はわずか に脱安定化性である。ピレン標識の５’末端への付加は、恐らくは、スタッキン グがＤＮＡヘリックスの５’末端でより好都合であるため³⁵、３’末端よりも幾 分安定性である。 また、蛍光発光強度に対するハイブリダイゼーションの効果も調べた（表３） 。一般に、非常に低い効果であり、結合すると強度は少し減少または増加する。 １つの顕著な例外は３’末端に単一ピレンを含有する配列である（ＨＴ１）：ｔ ｅｌ３配列を結合させると、蛍光強度は２０倍低下する。相補鎖の調査は、チミ ジンが、プローブ鎖に標識が位置する末端に存在することを示す；相補体の結合 はピレンをアデノシンのみならずそのパートナー（チミジン）に積み上げさせ、 これはピレンの強力な消光を引き起こす。 アルファ−およびベータ−異性体ピレン遊離ヌクレオシドでの結果は、予測さ れるごとく、それらがメタノール中で実質的に同一の蛍光特性を保有することを 明瞭に示す。しかしながら、多数の異なる配列において、ベータ−ピレンはアル ファ−アノマー種よりもかなり弱い蛍光発光を示す。これは、ＤＮＡにおける単 一の置換および多重に置換されたオキシマー発光種双方に当てはまる（図２０） 。別の実験は、ベータ−置換ピレンアノマーが天然ベータ−配位ＤＮＡ鎖と強力 に迅速に積み重なる一方で、アルファ−置換の場合は積み重なりが弱いことを確 立した³⁵。同様に、単一ピレンヌクレオシドのＤＮ Ａへの取込みの結果、水性緩衝液中での遊離ピレンメチルアミン・ＨＣｌについ てのそれよりも約１７倍低い発光強度となり、これはＤＮＡへの共有結合による 消光とも一致する。また、隣接アデニンはシトシンまたはチミンよりも弱く消光 し、これは他のピレン標識でも観察されている^30b。 ２つの異なる配列状況において、エキシマ発光に対する驚くべき効果が、近接 ピレン数が増加するに従って観察された。まず、エキシマ発光強度は５標識まで 一般的に増加し、次いで、この数を超えると減少する。第２に、より驚くべきこ とに、蛍光特性に対して偶数／奇数効果があるようである。３および５標識は強 力なエキシマ強度を与える一方で、驚くべきことに、４または６標識はかなり低 い強度（約６−２０倍）を与える。強度は５標識を超えると強く降下するものの 、偶数／奇数効果は、少なくとも７標識を通じて拡大され、これは６標識よりも 幾分大きい強度である。 １ないし７近接アルファピレンを含有するシリーズについての吸収および励起 種の研究により、この効果の起源に対するいくつかの情報が生じる。（単一分子 存在としてのピレン基を鑑みると）所与のピレンタッグド分子の吸光蛍光は発光 強度で変化することが明らかである。かくして、偶数／奇数効果が基底状態で観 察され、該効果を説明するのは特別の励起状態相互作用を惹起する必要はないで あろう。むしろ、多数ピレン基の基底状態構 造または電子相互作用が該効果の主たる源であろう。 表１ ＣＤ₃ＯＤ中におけるアリールヌクレオシドのベータ異性体についてのＨ１’ −Ｈ２’カップリング定数およびプロトンＮＯＥデータ ^aカップリング定数はＣＤＣｌ₃中における１−６のビス−トルオイルエステル誘 導体についてのものである。 表２ ＣＤ₃ＯＤ中におけるアリールヌクレオシド（化合物３ａ、５ａおよび６ａ） のアルファ異性体についてのプロトンＨ１’−Ｈ２’カップリング定数およびＮ ＯＥデータ ^aカップリング定数はＣＤＣｌ₃中におけるトルオイルエステル誘導体について のものである。 表３ 水性緩衝液^a中におけるピレン−標識オリゴデオキシヌクレオチドにつ いての蛍光データ。配列は図２で与える。 ａ条件：１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ ０ｍＭ ＮａＣｌ、各鎖０.１μＭ。 ｂ積分した発光ピーク面積（４２５−６００ｎｍ）、ＨＴ１のそれ（３５０− ４２５ｎｍ）に対するもの 表４ 短い相補配列（ｔｅｌ３またはｔｅｌ３Ｂ）にハイブリダイズしたピレ ン−標識オリゴヌクレオチドについての熱変性データ（Ｔ_m、℃）^a ａ．条件：１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ ０ｍＭ ＮａＣｌ、各鎖２μＭ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．αまたはβ立体配置いずれかの炭素−炭素結合を介して糖部位のＣ−１原 子に連結したピレン、アントラセンまたはフェナントレンを含み、ここに該糖部 位がリボースまたはデオキシリボースであることを特徴とするヌクレオシド誘導 体。 ２．α−９−フェナントレニルデオキシヌクレオシド ３．α−１−ピレニルデオキシヌクレオシド ４．β−９−フェナントレニルデオキシヌクレオシド ５．β−１−ピレニルデオキシヌクレオシド ６．請求項１記載のヌクレオシドのホスホルアミダイト誘導体 ７．該ピレン、アントラセンまたはフォナントレンが、メトキシ、エトキシ、 ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ニトロ、メチル、シアノ、カルボキシ、クロ ロ、ブロモ、ヨードおよびアミノよりなる群から選択される置換基で、利用可能 な炭素位置にて誘導体化された請求項１記載のヌクレオシド誘導体。 ８．請求項１ないし６いずれか１記載の少なくとも１つのヌクレオシド誘導体 を含む核酸。 ９．ａ，ピレン、アントラセンまたはフォナントレンのオルガノカドミウムま たはオルガノ亜鉛をホッファーのα−ククロ糖のＣ１位にカップリングさせ；次 いで、 ｂ．メタノール性塩基で保護基を除去する； ことを特徴とする請求項１記載のヌクレオシド誘導体の合成方法。 １０．ａ．ピレン、アントラセンまたはフォナントレンのオルガノカドミウム またはオルガノ亜鉛をホッファーのα−ククロ糖のＣ１位にカップリングさせ； ｂ．メタノール性塩基で保護基を除去し； ｃ．塩基の存在下で、５’−ＯＨをジメトキシトリチルクロライドでトリチル 化し；次いで、 ｄ．３’−ＯＨをホスフィチル化する； ことを特徴とする請求項１記載のヌクレオシド誘導体のホスホルアミダイト誘導 体の合成方法。 １１．請求項１ないし６いずれか１記載のヌクレオシド誘導体を、該誘導体を 取り込むのに十分な条件下で、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に取り込むことを特徴と する蛍光標識核酸の調製方法。 １２．当該標識および当該プローブの間のハイブリダイゼーションを可能とす る時間および条件下で、標的核酸を、請求項１ないし６いずれか１記載の少なく とも１の核酸誘導体を含む核酸プローブと接触させ；次いで該ハイブリダイゼー ションを検出することを特徴とする、テストすべき試料中の標的核酸を検出する 方法。