【発明の詳細な説明】
レプチンアッセイ
本発明は、レプチンレセプターと結合する化合物の存在の測定用アッセイに関
する。本発明は、サンプル中に存在するレプチンレセプター結合物質の量の定量
用アッセイにも関する。発明の背景
レプチンはＯｂ遺伝子産物である（Zhangら，1995 Nature 372:425-432）。そ
れがないと、マウスは、ヒトの病的肥満と類似した強度の肥満となる。マウスは
、ヒト II型糖尿病と類似した糖尿病に罹り（Zhangら，1995 Nature 372:425-4
32）、生殖力がなくなる（Chehabら，1996 Nature Genetics 12:318-320）。レ
プチンを十分量与えると、これらの症状は消える。
現在、組換えレプチンの調製物をアッセイできる唯一の方法は、ｏｂ／ｏｂマ
ウスに多量のレプチンを注射することによる（Campfield 1995 Science269:546-
549；Rentsch 1995 Biochem Biophys Res Comm 214:131-136）。レプチン活性は
餌摂取の抑制に基づき評価されるが、レプチン活性は個体間で大きく変動
する。レプチン活性の統一された基準は存在しない。それ故、少量のレプチンを
用いるレプチン生物活性の迅速で正確なアッセイが望ましい。発明の詳細な説明
本発明は、レプチンレセプター結合化合物がサンプル中に存在するかどうかの
測定方法であって、ａ）プロモーターと少なくとも１個のレプチン応答要素（re
sponse element）を含み、レポーター遺伝子と機能可能なように結合しているプ
ロモーター領域を含む核酸；及びｂ）レプチンレセプターをコードする核酸；を
含む細胞と、サンプルを接触させ、レポーター遺伝子の転写が起るかを測定する
ことを特徴とする該方法に関する。図面の簡単な説明
図１は、ＧＴ１−７細胞を用いるレプチンの機能的アッセイを示すグラフであ
る。細胞を、ｏｂ−ｒについて偽トランスフェクトするか、痩身ラットＯｂ−ｒ
ｃＤＮＡでトランスフェクトするか、又はヒトＯｂ−ｒ ｃＤＮＡでトランス
フェクトした。細胞は、レプチンで処理されたＯｂ−ｒ発現細胞でのルシフェラ
ーゼ活性の誘導を示した。
図２は、ルシフェラーゼ活性の増加を測定したとき、レプチ
ンの量に対し、細胞が直線性の用量反応性を示すグラフである。ＧＴ１−７細胞
を、ヒトＯｂ−ｒで一過性にトランスフェクトし、種々の量のヒトレプチンで処
理した。
図３は、痩身ラットＯｂ−ｒのＤＮＡ配列である。
図４は、ｐＣＭＶ４ベクターに挿入したヒトＯｂ−ｒのＤＮＡ配列である。ヒ
トｏｂ−ｒのGen Bank受託番号は、Ｕ４３１６８である。ヌクレオチド１４１〜
３７７０を、ｐＣＭＶ４−Ｏｂ−４で用いる。
図５は脂肪質ラットＯｂ−ｒのＤＮＡ配列である。
本明細書と請求の範囲で、以下の定義を適用する。
“レプチンレセプター結合化合物”とは、レプチンレセプターに結合する化合
物を意味する。
“レプチン擬似物質”とは、レプチンレセプターに結合し、細胞内反応のカス
ケードを開始させ、結局レプチン応答要素の制御下に、ＤＮＡ転写が起ることに
なるレプチン以外の化合物を意味する。
“レプチン応答要素”とは、レプチンレセプター結合事象に応答性で、このよ
うな事象が起ると、プロモーターの制御下でＤＮＡの転写を可能とするプロモー
ター領域内に位置するＤＮＡ
配列を意味する。
“プロモーター領域”とは、タンパク質又はペプチドコード配列の上流に位置
するＤＮＡを意味し、それは、少なくとも１個の応答要素を含有する。
“プロモーター”は、完全長プロモーター、最小プロモーター、及び完全長よ
り短いが最小プロモーターより多数の核酸を含むプロモーターを包含する。
“Ｏｂ−ｒ”とは、Ｏｂ−レセプターを意味する。
本発明の一面は、特定の化合物がレプチンレセプターと結合できるかを測定で
きる細胞“トランス”活性化アッセイである。一般的に、リガンドのその膜結合
レセプターへの結合は、シグナルの細胞内カスケードを開始させる。最後に特定
の転写制御要素が活性化され、ＤＮＡの転写が起る。本発明により、天然レプチ
ンのその天然レプチンレセプターとの結合は、レプチン応答要素を活性化するカ
スケードを開始させ、ＤＮＡ転写に至ることが知見された。本発明で同定された
一つのこのようなレプチン応答要素は、ＩＲＦ−１由来γ−インターフェロン活
性化配列である。ＩＲＦ−１由来活性化配列は当業界で報告されたが（Pineら，
1994 EMBO J．13:158-167）、レプチン−レプ
チン受容体結合事象への応答性は今まで不明であった。
レプチン応答要素のこの発見により、本発明の基礎となる種々のアッセイの設
計が可能となった。選択されたプロモーターと１個以上のレプチン応答要素を含
有するプロモーター領域を構築する。プロモーター領域は、ハイブリッドプロモ
ーター領域を含みうる、即ち天然では一緒に存在しないプロモーターと応答要素
を含みうるか、又はプロモーター領域は、天然のプロモーター領域でありうる。
好適実施態様では、プロモーターは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプ
ロモーターのような十分に特性が明らかにされたプロモーターであるが、選択さ
れる宿主細胞で機能することが知られている任意のプロモーターを使用できる。
レプチン応答要素の活性に影響しうる転写制御配列が存在しないように、プロモ
ーターが最小プロモーターであることも好ましい。
好ましくは、レプチン応答要素はプロモーター領域に近接させる。介在配列が
レプチン応答要素の機能を妨害しなければ、介在配列は、レプチン応答要素とプ
ロモーター間に存在しうる。
本発明によれば、適切なレプチン応答要素は、ＩＲＦ−１由来γ−インターフ
ェロン活性化配列 ５’−ＣＴＧＡＴＴＴＣ
ＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＣＧ−３’である。好適実施態様では、プロモーター領域
は、複数のＩＲＦ由来γ−インターフェロン活性化配列を含有し、より好ましく
は最低３個のこのような配列を含有する。複数のレプチン応答要素が存在する場
合、好ましくはそれらを縦列に結合させる。しかし、介在配列がレプチン応答要
素の機能を妨害しなければ、介在配列も存在しうる。
レプチン−レプチンレセプター結合の結果として起る転写を検出するために、
レポーター遺伝子を、少なくとも１個のレプチン応答要素と機能可能なように結
合させるのが好ましい。レポーター遺伝子は、容易に検出されるペプチドをコー
ドするか、又は転写もしくは翻訳の簡単な検出を可能なものとする任意の遺伝子
でありうる。一般的には、レポーター遺伝子は、宿主細胞で天然に存在するか、
又は宿主細胞で少量だけ産生されるタンパク質をコードする。周知のレポーター
遺伝子の例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）
、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ（細菌又は蛍由来）、及びβ−
ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素に基づく他の検出系な
どがある。特に好適な実施態様では、ルシフェラーゼがレポーター遺伝子である
。別の実施
態様では、翻訳産物よりも、レポーター遺伝子ＤＮＡから転写されるｍＲＮＡを
測定してもよい。
ａ）プロモーターと少なくとも１個のレプチン応答要素を含むプロモーター領
域；及びｂ）そのプロモーター領域と機能可能なように結合したレポーター遺伝
子；を含むレポーター遺伝子構築体は、本発明の更なる別の一面をなす。好まし
くは、レポーター遺伝子構築体を適切なベクターに入れ、それを用いて、宿主細
胞をトランスフェクトする。ベクターは、選択された宿主細胞で機能できる、プ
ラスミド、コスミド及びウイルスベクターを含む任意の公知のベクターでありう
る。
宿主細胞は、培養するのが容易な任意の細胞又は細胞株でありうる。一般的に
、好適な宿主細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞であり、特に好適な実
施態様では、マウス視床下部細胞（ＧＴ１−７のような）、哺乳動物神経芽腫細
胞株、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）もしくはＬ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １）のようなマウス線維芽細胞株、チャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ
−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、又はヒト胎児腎由来２９３細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ １５７３）である。
宿主細胞はその表面に豊富なレプチンレセプターを有するか、又はその表面に
豊富なレプチンレセプターを発現するように形質転換されることができるが、後
者の状況が好ましい。任意のレプチンレセプターを使用できるが、ヒト及び齧歯
類のものが好ましい。ヒトレプチンレセプターをコードする核酸は報告されてお
り（Tartagliaら，1995 Cell 83:1263-1271；引用により本明細書に含まれるも
のとする）、図４に示す。マウス遺伝子も使用でき、特にGen Bankに寄託された
配列に基づくと位置２６〜２７７５も使用できる。野生型ラット、脂肪質ラット
（ｆａ／ｆａ遺伝子型）（図３に示す）、及びｏｂレセプター遺伝子のヘテロ接
合体ラット（図５に示す）からのレプチンレセプターをコードする核酸は、同時
係属中の米国特許出願第 号及び第６１／０１３，９６９号（Attorney Doc
ket No.19462PV，1996年２月22日出願；19462PV1,1996年３月22日出願；両方と
も引用により本明細書に含まれるものとする）に記載されている。種々のレプチ
ンレセプターで細胞をトランスフェクトすることにより、由来が異なるレセプタ
ーの生物応答を研究、比較できる。また、特定の所望の突然変異を含むレプチン
レセプターも、公知の分子生物学的技術により構築でき、
突然変異体の構造と機能は、本発明のアッセイを用いて研究できる。
本発明の別の一面は、本発明のアッセイで宿主細胞が使用できるように、宿主
細胞をトランスフェクトするのに適した一セットのベクターである。ベクターの
セットは、レプチンレセプター構築体を含有する第１のベクターを包含する。レ
プチンレセプター構築体は、所望のレプチンレセプター又は該レセプターの突然
変異型をコードする核酸を含有する。レプチンレセプター構築体は、その天然の
プロモーター又は任意の他の所望の異種プロモーターの制御下にありうる。それ
は、場合によっては、エンハンサー及び膜上でレセプターを発現するのに助けと
なる配列のような他の発現制御要素も含みうる。
ベクターのセットは、上記レセプター遺伝子構築体を含有する第２のベクター
も包含する。
本発明の一好適アッセイでは、レプチンレセプターリガンドの可能性のある化
合物をアッセイできる。この実施態様では、レプチンレセプター（天然又は組換
え）を発現する細胞を、上記レポーター遺伝子構築体でトランスフェクトし、細
胞が天然では豊富なレプチンレセプターを発現しない場合、レプチンレ
セプター構築体でトランスフェクトする。レプチンレセプターリガンドの可能性
のあるものを、トランスフェクトされた細胞と接触させ、レポーター遺伝子転写
産物又は翻訳産物の存在を検出する。これを、同じくトランスフェクトされた細
胞をレプチンと接触させる対照アッセイで測定した転写量又は翻訳量と比較でき
る。本発明のアッセイの更なる利点は、それが用量反応性であるということ、即
ちレプチンリガンド−レプチンレセプター結合は起るほど、レポーター遺伝子の
転写及び／又は翻訳が増加し、それ故レプチンレセプター結合活性の定量的測定
が可能となるということである。
逆スクリーニングも、本アッセイの一部として使用できる。逆スクリーニング
では、同一細胞型の第２の細胞を、上記レポーター遺伝子構築体でトランスフェ
クトするが、レプチンレセプター遺伝子構築体ではトランスフェクトしない。レ
プチンレセプターリガンドの可能性のあるものを、トランスフェクトされた細胞
と接触させ、レポーター遺伝子転写又は翻訳の存在を検出する。レプチンレセプ
ターの存在下でのみレポーター遺伝子構築体を活性化するこれらのレプチンレセ
プターリガンドの可能性のあるものは、特異的レプチンアゴニストであると決定
される。
この実施態様のアッセイを用いて、レプチンアゴニストとアンタゴニストを同
定できる。レプチンアゴニストとは、レプチン擬似物質のように、レプチンレセ
プターと結合し、レプチンの細胞応答と少なくともほぼ等しく、それより大きい
こともありうる細胞応答を引起す。このような化合物は、レプチンが不十分なた
めに、肥満、糖尿病又は無生殖力が起る状況下で有用であろう。
アッセイのこの実施態様を用いて、レプチンアンタゴニストも同定できる。レ
プチンアンタゴニストとは、レプチンレセプターと結合できるが、天然のレプチ
ンの応答よりも小さい応答しか引起さない化合物である。このような化合物は、
食欲不振や悪液質の治療に有用であろう。
本発明のもう一つの面で、種々のレプチン応答要素の可能性のあるものを、レ
ポーター遺伝子の転写を制御するプロモーター近傍に挿入することによって、新
規レプチン応答要素を同定できる。この構築体でトランスフェクトされ、天然又
は組換えレプチンレセプターを発現する細胞をレプチンと接触させる。結果とし
て起るレポーター遺伝子の転写を、レプチン応答要素
がＩＲＦ−１由来γ−インターフェロン活性化配列である場合に起る転写と比較
する。このアッセイを用いて同定される新規レプチン応答要素は、本発明の更に
もう一つの面をなす。
本発明の別の実施態様では、レプチン調製物の力価を測定、定量できる。この
実施態様では、レプチン含有調製物を、レポーター遺伝子構築体を含有し、レプ
チンレセプター（組換え又は天然）を発現している細胞と接触させる。レポータ
ー遺伝子の転写量及び／又は翻訳量を測定し、既知の力価の調製物を用いて得ら
れたものと比較する。
本発明の更に別の面では、種々のレプチンレセプターの生物活性を研究、比較
できる。この実施態様では、第１の細胞を、レポーター遺伝子構築体と第１のレ
プチンレセプターでトランスフェクトする。第１のレプチンレセプターは、その
活性が測定できる任意のレプチンレセプター、変異体、又は突然変異体でありう
る。第１の細胞を、レプチンと接触させ、レポーター遺伝子転写又は翻訳を測定
する。この量を、その活性が既知であるか、又は参照として使用できる第２のレ
プチンレセプターを用いて、同一条件下得られた量と比較する。
以下の非限定実施例を、本発明をより良く説明するために提
供する。
実施例１ ベクター構築
レプチンでトランス活性化される発現ベクターＡＨ３２を以下のように構築し
た。ＩＲＦ−１遺伝子からのＳｔａｔ結合要素（ＳＢＥ）（Simsら，1993 Mol C
ell Biol．13:690-702;Pineら，1994 EMBO J．13:158-167；両方とも引用により
本明細書に含まれるものとする）を含む２種の相補的オリゴヌクレオチドを合成
し、標準的分子生物学技術を用いて、キナーゼを作用させ、アニーリングさせた
（Sambrookら，1989 Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold
Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）。用いたオリゴ
ヌクレオチドの配列は、５’−ＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＴＧＡＣＧ−３’
及び５’−ＣＧＴＣＡＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴ−３’である。二本鎖オ
リゴヌクレオチドを、ｐＴＫＬｕｃのＳｍａＩ部位にクローニングした。プラス
ミドｐＴＫＬｕｃは、ｐＺＬｕｃに見出されたホタルルシフェラーゼ遺伝子（Sc
hdlowら，1992 Mol.Biol Cell 3:941-951）の上流に単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ遺伝子の−３５〜＋１
０のプロモーター配列（McKnightら，1982 Science 217:316-324）を含む。連結
されたＤＮＡを用い、ＤＨ５αコンピテント細胞（Gibco/BRL，Gaithersburg，M
D）を使用してE.coliを形質転換した。形質転換されたコロニーから得られたＤ
ＮＡを、制限消化分析で分析し、形質転換体の各々で見出されたＳＢＥオリゴヌ
クレオチドの方向性とコピー数を、配列決定キット（US Biochemical，Clevelan
d，OH）を用いて挿入体の配列決定により確認した。クローンＡＨ３２は同一方
向で挿入されたＳＢＥを３コピー含むことが知見され、クローンＡＨ３２を用い
てヒト線維芽細胞株（WI-38 VA13亜系2RA；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ７５．１）
による更なる研究を行った。ＡＨ３２でトランスフェクトされた細胞は、ＩＦＮ
−α又はＩＦＮ−γによる処理の６時間後、ルシフェラーゼ活性が６〜１０倍増
加することが示された。
プライマーＲＯＢＲ３５（５’−ＴＴＧＧＡＧＧＡＣＴＡＴＧＧＧＴＧＴＣ−
３’）及びＲＯＢＲ３７（５’−ＣＴＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧ−３
’）を用い、鋳型としてラット視床下部ｃＤＮＡを用いるＰＣＲによって、ラッ
トＯＢ−Ｒの完全長コード配列（サイズ約３．７ｋｂ）を得た。Barnes
（Barnes，1994，Proc.Natl.Acad.Sci．91:2216-2220,引用により本明細書に含
まれるものとする）の改変法により、ロングＰＣＲは完全長フラグメントを産生
した。ロングＰＣＲ反応のために、Taq Extender（Stratagene，La Jolla，CA）
とExpand Long Template PCR System(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)
を組合せて使用した。最終容量２０μＬの標準ＰＣＲ反応混合液は、鋳型（ラッ
トｃＤＮＡ）４０ｎｇ、プライマー２００ｎｇ、５００ｍＭ ｄＮＴＰ、Expand
キットからの１×緩衝液３、及びExpand kit enzyme mix ０．２ｍＬからなって
いた。反応物質を薄壁反応チューブに集めた。増幅プロトコルは、Perkin Elmer
480 Thermal Cyclerを用い、９２℃、３０秒が１サイクル、続いて９２℃、３
０秒、５４℃１分、及び６８℃、５分が３５サイクルであった。
完全長産物のＤＮＡ配列を、AmpliTaq DNAポリメラーゼ，ＦＳによるABI PRIS
M Dye terminator cycle sequencing(Perkin Elmer，Foster City)を用いて決定
し、幾つかのＰＣＲ誘起エラーを検出した。これらのＰＣＲ誘起突然変異を除外
するために、正しいＤＮＡ配列を含むクローンからの制限フラグメントを組立て
た。３種の異なる制限フラグメントを用いて、ｆａ／
ｆａ視床下部ｃＤＮＡ由来の、ヌクレオチド８８０にＣを有する完全長クローン
を構築した。ＨｉｎｄIIIポリリンカー部位〜ヌクレオチド５０２のＮＤｅＩ部
位のフラグメント、５０２のＮｄｅＩ部位〜１５２２のＳａｃＩ部位のフラグメ
ント、及び１５２２のＳａｃＩ〜ＸｂａＩポリリンカー部位のフラグメントを、
ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen，San Diego，CA）のＨｉｎｄIII部位とＸｂａＩ部位
に連結させることによって、発現構築体を得た。ヌクレオチド８８０にＡを有す
る野生型（痩身）クローンは、５０２〜１５２２のＮｄｅＩ〜ＳａｃＩフラグメ
ントを痩身ラットの視床下部ｃＤＮＡ由来のフラグメントで置き換えて構築した
。
ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターｐＣ
Ｈ１１０（Hallら，1983，J Hol Appl Gen 2:101-109）を、Pharmacia Biotech
，Inc.（Piscataway，NJ）から得た。
完全コード領域を含むヌクレオチド１４１〜３７７０のヒトＯｂレセプターｃ
ＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲを用いて得、それを、D.W.Russellから贈られた
ｐＣＭＶ４（Andersson,S．1989 J Biol．Chem．264:8222-8229）にサブクロー
ニングした。実施例２ 細胞培養
P.L.Mellonから贈られたマウス視床下部細胞株、ＧＴ１−７細胞（Lipositsら
，1991 Endocrinology 129:1575-1583）を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ）（Gibco/BRL，Gaithersburg，MD）、１０％子ウシ血清、５０μｇ／ｍＬ
ストレプトマイシン、及び５０Ｕ／ｍＬペニシリン（増殖培地）中で、９５％空
気、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で維持した。細胞を約４×１０4／ｃｍ2で接種
し、集密になる前に継代した。
実施例３ ＧＴ１−７細胞のトランスフェクション
トランスフェクションの１８時間前に、３５ｍｍ組織培養皿当り３．５×１０5
細胞で細胞を播いた。プラスミドＡＨ３２、適切なＯｂ−ｒプラスミド、及び
ｐＣＨ１１０を、リポソーム媒介トランスフェクションを用いて細胞に導入した
。詳細には、各プラスミド３００ｎｇをOptimenTM(Gibco/BRL，Gaithersburg，M
D)２００μＬに添加した。LipofectamineTM（Gibco/BRL，Gaithersburg，MD）１
０μｇを、OptimemTMの第２の２００μＬ容量に加えた。２つの溶液を混合し、
室温で３０分間インキュ
ベートし、OptimenTMで６００μＬに調整した。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩
水で２度洗浄した。ＤＮＡ−リポソーム複合体を細胞に施用した。細胞を６時間
インキュベートし、そのときに増殖培地２ｍＬを細胞に加えた。１６時間後、ト
ランスフェクション混合液を除去し、２ｍＬの新しい増殖培地を加えた。
実施例４ ルシフェラーゼアッセイ
トランスフェクションの約２４時間後、種々の量の組換えヒトレプチンを細胞
に加えた。次いで細胞を２４時間インキュベートした。細胞培養培地を除去し、
氷冷したカルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水２ｍＬで
細胞を迅速に洗浄した。次いで、製造業者のプロトコルに従い、Promega report
er lysis reagent（Promega，Madison，WI）１５０μＬを用いて、アッセイのた
めに細胞を調製した。Promegaルシフェラーゼアッセイ試薬１００μｌを用いて
反応を開始させた後、サイクルモードでDynatech ML 3000ルミノメーター(Dynat
ech，Chantilly，VA)を用いて、ルシフェラーゼ活性について、細胞溶解液２０
μＬをアッセイした。各細胞溶解液５０μＬのβ−ガラクトシダーゼ活性を、β
−ガラクトシダーゼアッセイ
（Promega，Madison，WI）を用いて測定した。各サンプルで得られた相対的光単
位をβ−ガラクトシダーゼ活性で割って、結果を標準化した。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Leptin Assay The present invention relates to assays for determining the presence of compounds that bind to the leptin receptor. The present invention also relates to assays for quantifying the amount of leptin receptor binding substance present in a sample. BACKGROUND leptin invention are Ob gene product (Zhang et al., 1995 Nature 372: 425-432). Without it, mice become obese with a strength similar to morbid obesity in humans. Mice suffer from diabetes similar to human type II diabetes (Zhang et al., 1995 Nature 372: 425-432) and become fertile (Chehab et al., 1996 Nature Genetics 12: 318-320). With enough leptin, these symptoms go away. Currently, the only way that recombinant leptin preparations can be assayed is by injecting large amounts of leptin into ob / ob mice (Campfield 1995 Science 269: 546-549; Rentsch 1995 Biochem Biophys Res Comm 214: 131-136). . Leptin activity is evaluated based on suppression of food intake, but leptin activity varies widely between individuals. There is no uniform standard for leptin activity. Therefore, a rapid and accurate assay for leptin bioactivity using small amounts of leptin is desirable. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides a method for determining whether a leptin receptor binding compound is present in a sample, comprising: a) a promoter and at least one leptin responsive element, Contacting a sample with a cell containing a nucleic acid comprising a promoter region operably linked thereto; and b) a nucleic acid encoding a leptin receptor, and determining whether transcription of the reporter gene occurs. To the method. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing a functional assay for leptin using GT1-7 cells. Cells were mock-transfected for ob-r, transfected with lean rat Ob-r cDNA, or transfected with human Ob-r cDNA. Cells showed induction of luciferase activity in leptin-treated Ob-r expressing cells. FIG. 2 is a graph showing that cells show a linear dose response to the amount of leptin when the increase in luciferase activity is measured. GT1-7 cells were transiently transfected with human Ob-r and treated with various amounts of human leptin. FIG. 3 shows the DNA sequence of lean rat Ob-r. FIG. 4 shows the DNA sequence of human Ob-r inserted into the pCMV4 vector. The Gen Bank accession number for human ob-r is U43168. Nucleotides 141 to 3770 are used in pCMV4-Ob-4. FIG. 5 shows the DNA sequence of the fatty rat Ob-r. In this specification and in the claims, the following definitions apply. "Leptin receptor binding compound" means a compound that binds to the leptin receptor. By "leptin mimetic" is meant a compound other than leptin that binds to the leptin receptor, initiates a cascade of intracellular reactions, and ultimately results in DNA transcription under the control of a leptin response element. By "leptin response element" is meant a DNA sequence located within the promoter region that is responsive to leptin receptor binding events and, when such an event occurs, allows transcription of the DNA under the control of the promoter. By "promoter region" is meant DNA located upstream of a protein or peptide coding sequence, which contains at least one response element. "Promoter" includes full-length promoters, minimal promoters, and promoters that are less than full-length but contain more nucleic acids than minimal promoters. "Ob-r" means Ob-receptor. One aspect of the invention is a cellular "trans" activation assay that can determine whether a particular compound can bind to the leptin receptor. In general, binding of a ligand to its membrane-bound receptor initiates an intracellular cascade of signals. Finally, specific transcription control elements are activated, and transcription of DNA occurs. According to the present invention, it has been found that binding of native leptin to its native leptin receptor initiates a cascade that activates leptin response elements, leading to DNA transcription. One such leptin response element identified in the present invention is an IRF-1-derived γ-interferon activating sequence. Although IRF-1 derived activation sequences have been reported in the art (Pine et al., 1994 EMBO J. 13: 158-167), the responsiveness to leptin-leptin receptor binding events has not been previously known. This discovery of a leptin response element has allowed the design of various assays underlying the present invention. A promoter region containing the selected promoter and one or more leptin response elements is constructed. The promoter region can include a hybrid promoter region, ie, can include a promoter and a response element that are not naturally present together, or the promoter region can be a native promoter region. In a preferred embodiment, the promoter is a well-characterized promoter, such as the herpes simplex virus thymidine kinase promoter, but any promoter known to function in the selected host cell can be used. . It is also preferred that the promoter be a minimal promoter so that there are no transcriptional regulatory sequences that can affect the activity of the leptin response element. Preferably, the leptin response element is close to the promoter region. If the intervening sequence does not interfere with the function of the leptin response element, the intervening sequence may be between the leptin response element and the promoter. According to the present invention, a suitable leptin response element is the IRF-1 derived γ-interferon activating sequence 5′-CTGAATTTC CCCGAAATGACG-3 ′. In a preferred embodiment, the promoter region contains a plurality of IRF-derived γ-interferon activating sequences, more preferably at least three such sequences. If multiple leptin response elements are present, they are preferably linked in tandem. However, if the intervening sequence does not interfere with the function of the leptin response element, intervening sequences may also be present. Preferably, to detect transcription resulting from leptin-leptin receptor binding, the reporter gene is operably linked to at least one leptin response element. The reporter gene can be any gene that encodes a peptide that is easily detected or that allows for easy detection of transcription or translation. Generally, the reporter gene encodes a protein that occurs naturally in the host cell or is produced in small amounts in the host cell. Examples of well-known reporter genes include chloramphenicol acetyltransferase (CAT), green fluorescent protein (GFP), luciferase (from bacteria or fireflies), and other detection systems based on enzymes such as β-galactosidase, alkaline phosphatase. and so on. In a particularly preferred embodiment, luciferase is a reporter gene. In another embodiment, the mRNA transcribed from the reporter gene DNA may be measured rather than the translation product. A reporter gene construct, comprising: a) a promoter region comprising a promoter and at least one leptin response element; and b) a reporter gene operably linked to the promoter region, constitutes yet another aspect of the present invention. Eggplant Preferably, the reporter gene construct is placed in a suitable vector and used to transfect host cells. The vector can be any known vector, including plasmid, cosmid, and viral vectors, that can function in a selected host cell. A host cell can be any cell or cell line that is easy to culture. Generally, suitable host cells are eukaryotic cells, preferably mammalian cells, and in particularly preferred embodiments, mouse hypothalamic cells (such as GT1-7), mammalian neuroblastoma cell lines, Mouse fibroblast cell lines such as NIH / 3T3 (ATCC CRL 1658) or L (ATCC CCL 1), Chinese hamster ovary CHO-K1 cells (ATCC CCL 61), or 293 cells derived from human fetal kidney (AT CC CRL 1573). It is. The host cell has abundant leptin receptors on its surface or can be transformed to express abundant leptin receptors on its surface, although the latter situation is preferred. Although any leptin receptor can be used, human and rodent are preferred. Nucleic acids encoding the human leptin receptor have been reported (Tartaglia et al., 1995 Cell 83: 1263-1271; incorporated herein by reference) and are shown in FIG. Mouse genes can also be used, especially positions 26-2775, based on the sequences deposited with Gen Bank. Nucleic acids encoding leptin receptors from wild-type rats, fatty rats (fa / fa genotype) (shown in FIG. 3), and heterozygous rats for the ob receptor gene (shown in FIG. 5) are co-pending. U.S. Patent Application No. No. 61 / 013,969 (Attorney Docket No. 19462PV, filed on February 22, 1996; 19462PV1, filed on March 22, 1996; both are incorporated herein by reference). Has been described. By transfecting cells with various leptin receptors, the biological response of receptors of different origins can be studied and compared. Also, leptin receptors containing specific desired mutations can be constructed by known molecular biology techniques, and the structure and function of the mutant can be studied using the assays of the present invention. Another aspect of the invention is a set of vectors suitable for transfecting a host cell so that the host cell can be used in an assay of the invention. The set of vectors includes a first vector containing a leptin receptor construct. Leptin receptor constructs contain nucleic acid encoding the desired leptin receptor or a mutant form of the receptor. The leptin receptor construct may be under the control of its native promoter or any other desired heterologous promoter. It may also optionally include other expression control elements such as enhancers and sequences that assist in expressing the receptor on the membrane. The set of vectors also includes a second vector containing the receptor gene construct. In one preferred assay of the invention, potential leptin receptor ligand compounds can be assayed. In this embodiment, cells expressing the leptin receptor (natural or recombinant) are transfected with the reporter gene construct described above, and if the cells do not naturally express the abundant leptin receptor, transfected with the leptin receptor construct. . A potential leptin receptor ligand is contacted with the transfected cells and the presence of a reporter gene transcript or translation product is detected. This can be compared to the amount of transcription or translation measured in a control assay that also contacts the transfected cells with leptin. A further advantage of the assay of the present invention is that it is dose responsive, ie, the more leptin ligand-leptin receptor binding occurs, the greater the transcription and / or translation of the reporter gene, and thus the leptin receptor binding activity This means that the quantitative measurement of is possible. Reverse screening can also be used as part of this assay. In the reverse screening, a second cell of the same cell type is transfected with the reporter gene construct but not with the leptin receptor gene construct. A potential leptin receptor ligand is contacted with the transfected cells to detect the presence of reporter gene transcription or translation. Those potential leptin receptor ligands that activate the reporter gene construct only in the presence of the leptin receptor are determined to be specific leptin agonists. Leptin agonists and antagonists can be identified using the assays of this embodiment. Leptin agonists, like leptin mimetics, bind to leptin receptors and elicit a cellular response that is at least approximately equal to, and possibly greater than, the cellular response of leptin. Such compounds may be useful in situations where insufficient leptin results in obesity, diabetes or fertility. Using this embodiment of the assay, leptin antagonists can also be identified. Leptin antagonists are compounds that can bind to the leptin receptor but elicit a response that is less than that of native leptin. Such compounds may be useful in treating anorexia and cachexia. In another aspect of the invention, novel leptin responsive elements can be identified by inserting various potential leptin responsive elements near the promoter that controls transcription of the reporter gene. Cells transfected with this construct and expressing the native or recombinant leptin receptor are contacted with leptin. The resulting transcription of the reporter gene is compared to the transcription that occurs when the leptin response element is an IRF-1-derived γ-interferon activating sequence. The novel leptin response element identified using this assay forms yet another aspect of the present invention. In another embodiment of the present invention, the titer of a leptin preparation can be measured and quantified. In this embodiment, a leptin-containing preparation is contacted with cells containing a reporter gene construct and expressing a leptin receptor (recombinant or native). The amount of transcription and / or translation of the reporter gene is measured and compared to that obtained using a preparation of known titer. In yet another aspect of the invention, the biological activity of various leptin receptors can be studied and compared. In this embodiment, a first cell is transfected with a reporter gene construct and a first leptin receptor. The first leptin receptor can be any leptin receptor, variant, or mutant whose activity can be measured. The first cell is contacted with leptin and the reporter gene transcription or translation is measured. This amount is compared with that obtained under the same conditions using a second leptin receptor whose activity is known or can be used as a reference. The following non-limiting examples are provided to better illustrate the present invention. Example 1 Vector Construction An expression vector AH32 transactivated with leptin was constructed as follows. Stat-binding element (SBE) from the IRF-1 gene (Sims et al., 1993 Mol Cell Biol. 13: 690-702; Pine et al., 1994 EMBO J. 13: 158-167; both incorporated herein by reference. Complementary oligonucleotides were synthesized, kinased, and annealed using standard molecular biology techniques (Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed). ., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). The sequences of the oligonucleotides used were 5'-CTGAATTTCCCGAATGACG-3 'and 5'-CGTTCATTTCGGGGAAATCAT-3'. The double stranded oligonucleotide was cloned into the Smal site of pTKLuc. Plasmid pTKLuc contains a promoter sequence of -35 to +10 of the herpes simplex virus thymidine kinase gene upstream of the firefly luciferase gene (Sc hdlow et al., 1992 Mol. Biol Cell 3: 941-951) found in pZLuc. , 1982 Science 217: 316-324). The ligated DNA was used to transform E. coli using DH5α competent cells (Gibco / BRL, Gaithersburg, MD). The DNA obtained from the transformed colonies was analyzed by restriction digestion analysis, and the orientation and copy number of the SBE oligonucleotide found in each of the transformants was determined using a sequencing kit (US Biochemical, Cleveland). , OH) by sequencing of the insert. Clone AH32 was found to contain 3 copies of SBE inserted in the same orientation, and further studies with human fibroblast cell line (WI-38 VA13 subline 2RA; ATCC No. CCL75.1) were performed using clone AH32. went. Cells transfected with AH32 showed a 6- to 10-fold increase in luciferase activity after 6 hours of treatment with IFN-α or IFN-γ. The full-length coding sequence of rat OB-R (size about 3.10) was obtained by PCR using primers ROBR35 (5'-TTGGAGACTACTGGGTGCTC-3 ') and ROBR37 (5'-CTACTGGAATGGAACCTGG-3') as a template and rat hypothalamus cDNA. 7 kb). With the modification of Barnes (Barnes, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 2216-2220, incorporated herein by reference), long PCR produced full-length fragments. For long PCR reactions, Taq Extender (Stratagene, La Jolla, CA) and Expand Long Template PCR System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) were used in combination. The standard PCR reaction mixture in a final volume of 20 μL consisted of 40 ng of template (rat cDNA), 200 ng of primers, 500 mM dNTPs, 1 × buffer 3 from the Expand kit, and 0.2 mL of Expand kit enzyme mix. The reactants were collected in a thin-walled reaction tube. The amplification protocol used a Perkin Elmer 480 Thermal Cycler, one cycle at 92 ° C, 30 seconds, followed by 35 cycles at 92 ° C, 30 seconds, 54 ° C for 1 minute, and 68 ° C, 5 minutes. The DNA sequence of the full-length product was determined using ABI PRIS MDye terminator cycle sequencing with AmpliTaq DNA polymerase, FS (Perkin Elmer, Foster City) and detected some PCR-induced errors. To rule out these PCR-induced mutations, restriction fragments from clones containing the correct DNA sequence were assembled. The three different restriction fragments were used to construct a full-length clone with a C at nucleotide 880 from the fa / fa hypothalamus cDNA. A fragment of the HindIII polylinker site to the NDeI site at nucleotide 502, a fragment of the NdeI site to 5022 at the SacI site, and a fragment of 1522 at the SacI to XbaI polylinker site were added to the HindIII site of pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.). And an XbaI site to obtain an expression construct. A wild-type (slimming) clone having an A at nucleotide 880 was constructed by replacing the 502-1522 NdeI-SacI fragment with a fragment from the hypothalamic cDNA of a lean rat. The β-galactosidase expression vector pCH110 (Hall et al., 1983, J Hol Appl Gen 2: 101-109) under the control of the SV40 early promoter was obtained from Pharmacia Biotech, Inc. (Piscataway, NJ). A human Ob receptor cDNA fragment of nucleotides 141 to 3770 containing the complete coding region was obtained using PCR, which was provided by pWRVs from DWRussell (Andersson, S. 1989 J Biol. Chem. 264: 8222-8229). Was subcloned. Example 2 Cell Culture A mouse hypothalamic cell line, GT1-7 cells (Liposits et al., 1991 Endocrinology 129: 1575-1583), a gift from PLMellon, was transformed into Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco / BRL, Gaithersburg, MD). ) In 10% calf serum, 50 μg / mL streptomycin, and 50 U / mL penicillin (growth medium) at 37 ° C. in a 95% air, 5% CO 2 atmosphere. Cells were seeded at approximately 4 × 10 4 / cm 2 and passaged before confluence. Example 3 Transfection of GT1-7 Cells Eighteen hours before transfection, cells were seeded at 3.5 × 10 5 cells per 35 mm tissue culture dish. Plasmid AH32, the appropriate Ob-r plasmid, and pCH110 were introduced into cells using liposome-mediated transfection. Specifically, 300 ng of each plasmid was added to 200 μL of Optimen ™ (Gibco / BRL, Gaithersburg, MD). 10 μg of Lipofectamine ™ (Gibco / BRL, Gaithersburg, MD) was added to a second 200 μL volume of Optimem ™ . The two solutions were mixed, incubated at room temperature for 30 minutes, and adjusted to 600 μL with Optimen ™ . Cells were washed twice with phosphate buffered saline. The DNA-liposome complex was applied to the cells. The cells were incubated for 6 hours, at which time 2 mL of growth medium was added to the cells. After 16 hours, the transfection mixture was removed and 2 mL of fresh growth medium was added. Example 4 Luciferase Assay Approximately 24 hours after transfection, various amounts of recombinant human leptin were added to the cells. The cells were then incubated for 24 hours. The cell culture medium was removed, and the cells were washed quickly with 2 mL of ice-cold phosphate buffered saline without calcium and magnesium. Cells were then prepared for the assay using 150 μL Promega reporter lysis reagent (Promega, Madison, WI) according to the manufacturer's protocol. After initiating the reaction with 100 μl of Promega luciferase assay reagent, 20 μl of cell lysate was assayed for luciferase activity using a Dynatech ML 3000 luminometer (Dynatech, Chantilly, VA) in cycle mode. Β-galactosidase activity in 50 μL of each cell lysate was measured using a β-galactosidase assay (Promega, Madison, WI). The relative light units obtained for each sample were divided by the β-galactosidase activity to normalize the results.
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566
33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
(31)優先権主張番号 ６０／０３１，００２
(32)優先日 平成８年11月15日(1996．11．15)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ
(72)発明者 フアン・デル・プルウフ，レオナルドウス
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126
(72)発明者 クレシ，サジヤド・エイ
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126
(72)発明者 カリ，ドリス・エフ
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126
(72)発明者 ヘス，ジヨン・ダブリユ
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126
(72)発明者 トタ，マイケル・アール
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126
(72)発明者 チエン，フアン
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 5/10 C12Q 1/68 Z C12Q 1/68 G01N 33/15 Z G01N 33/15 33/566 33 / 566 C12N 5/00 A (31) Priority claim number 60 / 031,002 (32) Priority date November 15, 1996 (November 15, 1996) (33) Country claiming priority United States (US) (81 ) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), CA, JP, US (72) Invention Juan del Plouhu, Leonardus United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Clesi, Saziad United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Kari, Doris F. United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Invention Hess, Jyon Dubrillo United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Tota, Michael Earl United States, New Jersey 07065, Rowway, East Lincoln Avenue・ 126 (72) Inventor Chiang, Juan United States, New Jersey ・ 07065, Lowway, East Lincoln Avenue ・ 126