JP2000511408A

JP2000511408A - 新規治療

Info

Publication number: JP2000511408A
Application number: JP09538552A
Authority: JP
Inventors: カラン，エリック・エイチ; グレイ，キャロル; デイビス，ジョン・ビー; ウォード，ロビン・ブイ
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1996-04-26
Filing date: 1997-04-22
Publication date: 2000-09-05
Also published as: WO1997041443A3; WO1997041443A2; EP0900384A2; GB9608657D0

Abstract

(57)【要約】プレセニリン−１（ＰＳ−１）の切断を阻害するかさもなければ変調する化合物を同定するための化合物をスクリーニングする方法であって、ＰＳ−１の１８ｋＤａおよび２８ｋＤａ種への切断の程度を試験化合物が存在しない場合の切断の程度と比較して測定する方法、それにより同定された化合物および治療におけるその化合物の使用。

Description

【発明の詳細な説明】新規治療本発明は治療において有用である可能性のある化合物を同定するために用いるアッセイに関する。本発明はまた、治療におけるポリペプチド切断のモデュレーターの使用、および、アルツハイマー病の診断におけるポリペプチド切断産物の使用にも関する。アルツハイマー病（ＡＤ）は臨床的には痴呆、および神経病理学的には多数の老人性斑および神経細繊維癒着の存在を特徴とする中枢神経系の進行性変性疾患である。典型的には、ＡＤは老人の遅発性疾患である。しかしながら、早発性の該疾患を、年齢依存性浸透度を伴う常染色体の優性形質として遺伝する少数の家系が報告されている。最も一般的には、該疾病の発症の年齢は６０歳以下である。早発性および後発性ＡＤ発症の両方への遺伝的因子の関与が示されている。少なくとも４種の異なる遺伝子座の変異がＡＤへの遺伝的感受性と関連する。染色体１９上のアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子のｅ４対立遺伝子は遅発性ＡＤと関連している（Strittmatterら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1993, 90:1997-1981;Saundersら、Neurology 1993,43:1467-1472);Corderら、Science 1993,261:921-923)。染色体２１上のβ−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）遺伝子の変異が、早発性ＡＤのいくつかの家系において見られている（Goat eら、Nature 1991,349:704-706;Chartier-Harlinら、Nature 1991,353:844-846; Murrellら、Science 1991,254:97-99;Karlinskyら、Neurology 1992,42:1445-14 53)。最近、ＳＴＭ２と呼ばれる遺伝子中の新規なＡＤ遺伝子座が「ボルガ・ゲルマン」一族(「Volga German」kindred)の遺伝子連鎖分析から、染色体１(lq31 -41)上に同定された（Ephrat Levy-Lahadら、Science 1995,269:970-973;ibid.9 73-977)。ＳＴＭ２遺伝子は、ＡＤ−関連遺伝子、Ｓ１８２と注目すべき類似性を有している。染色体１４ｑ２４．３に対する遺伝子連鎖研究により第４の遺伝子座（ＡＤ３）がマッピングされ、早発性常染色体優性形質ＡＤの７０％異常の原因である可能性がある。(Sche11enbergら、Science 1992，258:668-670;George-Hyslopら、Na ture Genet.1992,2:330-334;Van Boreckhovenら、Nature Genet.1992,2:335-339 )。ＡＤ３遺伝子座はこの疾患の最も進行的な形態に関連しており(３０歳から６０歳の間で発症)、この遺伝子座での突然変異はＡＤに至る生物学的に基本的な過程であることが示唆されている。最近、ＡＤ３遺伝子座において早発性常染色体優性形質ＡＤを分離する７つの家系において５個のミスセンス突然変異を有する新規遺伝子、Ｓ１８２がクローニングされ、Sherrigtonら、Nature 1995，375:754-760に記載された。Ｓ１８２転写物のヌクレオチド配列分析により、６つの大きな家系の罹患者由来の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応生成物において異型接合体ヌクレオチド置換体が示された。Ｓ１８２の推定オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）は７−膜貫通タンパク質であると予想されるタンパク質をコードし、家系に関係するヌクレオチド置換により、膜貫通（ＴＭ）ヘリックスＩＩ（Ｌ１４６Ｍ)、ＶＩ(Ｅ２４６Ａ )、およびＶＩＩ（Ｙ４１０Ｃ）において、ならびにＴＭＩＩ−ＴＭＩＩＩ（Ｒ１６３Ｈ）およびＴＭＶＩ−ＴＭＶＩＩ（Ｖ２８６Ｌ）の間のループにおいてコードされるアミノ酸が変化する。加えて、Ｓ１８２遺伝子（以後プレセニリンー１(presenilin-1)遺伝子と称する）のコーディング領域に影響しない遺伝子のイントロン９における多型性は、後発性散発性アルツハイマー病の危険因子であることが示された(M．Wraggら、The Lancet，347:509-512(1996))。本発明は、プレセニリン−１が細胞内で酵素により大部分がメチオニン２９８およびアラニン２９９間で切断され：プレセニリン−１のＮ末端領域に対して上昇した抗体により免疫的に検出できるが、Ｃ末端に対して上昇した抗体によっては検出できない２８ｋＤａのＮ末端フラグメント；およびプレセニリン−１のＣ末端領域に対して上昇した抗体により免疫的に検出できるが、Ｎ末端に対して上昇した抗体によっては検出できない１８ｋＤａのＣ末端フラグメント；を生じるという知見に基づいている(D．Selkoe，Neurobiology of Aging Supple ment Volume 17，number 4S Abstract 146，pS37 1996)。プレセニリン−１における突然変異が早発性ＡＤ惹起し、イントロン性多型性が遅発性散発性アルツハイマー病の発症の危険性の増加を伴うので、プレセニリン−１の切断はアルツハイマー病の病理学におけるその役割において、重要な事象である。したがって、本発明はＰＳ−１の切断を阻害またはさもなければ調節する化合物を同定するための化合物をスクリーニングする方法であって、プレセニリン− １（ＰＳ−１）の１８ｋＤａおよび２８ｋＤａ種への切断の程度を試験化合物がない場合の切断の程度と比較して測定することを含む方法を提供する。本発明はまた、それにより同定される化合物にも関する。好ましい態様において、この方法ではＰＳ−１をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターでトランスフェクトしたヒト宿主細胞を用いる。切断産物の存在は、切断産物のごときＰＳ−１のフラグメントに対して作成され、２８ｋＤａ種よりも１８ｋＤａ種に対して特異的、およびその逆のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて宿主細胞のタンパク質含量をアッセイすることにより検出できる。イムノアッセイの任意の適当な構成、例えばウェスタン・ブロット・アッセイまたはＥＬＩＳＡを用いてもよい。ＰＳ−１のフラグメントに対して作成され、２８ｋＤａ種よりも１８ｋＤａ種に特異的、およびその逆のモノクローナルおよびポリクローナル抗体はそれ自体新規であり、本発明のさらなる態様を形成する。特に、本発明はポリペプチドＣＲＳＬＧＨＰＥＰＬＳＮＧＲＰＱＧＮＳＲおよびＣＲＤＳＨＬＧＰＨＲＳＴＰＥＳＲに対して作成した抗体を提供する。本発明はまた、単離形態の新規１８ｋＤａおよび２８ｋＤａの切断産物、それに対する特異的抗体およびポリペプチド切断産物をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をも提供する。Ｃ末端１８ｋＤａ種を通常のＮ末端配列決定することにより切断部位を決定でき、メチオニン２９８およびアラニン２９９間に大部分が存在することが見出された(D．Selkoe，Neurobiology of Aging Supplement Volume 17，number 4S Abstract 146，pS37，1996)。切断部位に関する知見により、本発明の方法において全長のＰＳ−１に代えて用いることができ、ＰＳ−１の切断に関与する酵素活性を解析し、測定できる、切断部位にわたる短いポリペプチド（例えばアミノ酸３から１０個の長さ）を設計できる。また、切断部位に関する知見により、ポリペプチドを本発明にしたがって特異的抗体を作成するのに用いることができ、本発明の方法において有用な、ＰＳ−１の２８ｋＤａ種のＣ末端および１８ｋＤａ種のＮ末端に対応する短いポリペプチド（例えばアミノ酸３から２０個の長さ）をも設計できる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは好ましくは単離形態で提供され、好ましくは均質にまで精製される。「単離された」なる用語はその物質が元来の環境（例えばそれが天然物である場合、天然の環境）から除去されていることを意味する。例えば、生存動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系において共存する物質の一部または全てから分離されている場合、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であることができ、および／またはかかるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部であることができ、かかるベクターもしくは組成物が自然環境の一部ではないので単離されている。好ましくは、ポリペプチドは精製された形態である。精製形態はその他のタンパク質狭雑物に対して少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９９％の純度であることを意味する。本発明はまた本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、本発明のベクターで遺伝子操作した宿主細胞および組み換え技術による本発明のポリペプチドの製造にも関する。従って本発明のさらなる態様によれば、宿主において該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、発現した産生物を回収する組み換え技術により本発明のポリペプチドを製造する方法が提供される。別法として本発明のポリペプチドをペプチド合成の常法により合成的に製造できる。宿主細胞を例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであってもよいベクターで遺伝子操作する(トランスダクトまたはトランスフォームまたはトランスフェクトする)。ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージ等の形態であってもよい。操作した宿主細胞をプロモーターを活性化し、形質転換体を選別し、または遺伝子を増幅するのに適するように修飾した慣用の栄養培地中で培養できる。温度、ｐＨ等の培養条件は発現用に選択した宿主細胞で以前に用いられた条件であり、これは当業者には明らかであろう。適当な発現ベクターには染色体性、非染色体性および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡ、ワクシナ、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病のごときウイルス性ＤＮＡの組み合わせ由来のベクターが包含される。しかしながら宿主細胞中で複製可能であり生存可能な限り、その他のいかなるベクターを用いてもよい。適当なＤＮＡ配列を種々の方法によりベクターに挿入してもよい。概して、ＤＮＡ配列は当該分野で知られる方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。かかる方法およびその他の方法は当業者の範囲内であると考えられる。発現ベクター内のＤＮＡ配列を適当な発現調節配列（プロモーター）に作動的に連結させ、ｍＲＮＡの合成を調整する。かかるプロモーターの代表例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、イー・コリ（E.coli）ｒａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰ_Lプロモーターおよび原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を調節することが知られているその他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターはまた、翻訳開始および転写終止のためのリボソーム結合部位をも含有する。ベクターはまた発現を増幅するための適当な配列をも含有してもよい。加えて発現ベクターは、１個またはそれ以上の選別マーカー遺伝子を含有し、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸リダクターゼもしくはネオマイシン耐性またはイー・コリのテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性のごとき形質転換した宿主細胞を選別するための表現型の特性を提供するのが好ましい。遺伝子をプロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現用）および所望によりオペレーター（本明細書では総括して「調節」エレメントと称する）の調節下におくことができ、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、この発現構築物を含有するベクターにより形質転換された宿主細胞中でＲＮＡに転写されるようにできる。コーディング配列はシグナルペプチドまたはリーダ配列を含有してもしなくてもよい。例えばイー・コリｔａｃプロモーターまたはプロテインＡ遺伝子（ｓｐａ）プロモーターおよびシグナル配列を用いて本発明のタンパク質配列を発現できる。リーダー配列は翻訳後プロセッシングにおいて細菌宿主により除去できる。ＣＡＴ（クロラムフェニコール・トランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有するその他のベクターを用いてプロモーター領域を所望の遺伝子から選別できる。２種の適当なベクターはＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特別に命名された細菌性プロモーターにはｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびｔｒｐが包含される。真核生物プロモーターにはＣＭＶ極初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウス・メタロチオネイン−Ｉが包含される。適当なベクターおよびプロモーターの選択は当業者の範囲内である。調節配列に加えて宿主細胞の成長に応じてタンパク質配列の発現を制御できる制御配列を加えるのが望ましい。制御配列は当業者に既知であり、例としては制御化合物の存在を含め化学的または物理的刺激に応答して遺伝子発現をオンまたはオフするものが包含される。例えばエンハンサー配列などの別の型の制御エレメントもまたベクターに存在してもよい特定のコーディング配列を適当な制御配列を有するベクター中に置き、コーディング配列の位置および配向を、調節配列に関して、コーディング配列が調節配列の「調節」下で転写される（すなわち調節配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列を転写する）ように発現ベクターを構築する。コーディング配列の修飾は、この目的を達成するために望ましい。例えば、適当な配向で調節配列に結合できるように、すなわち解読枠を維持するように配列を修飾することが必要な場合もある。調節配列および他の制御配列を、前記のクローニングベクターなどのベクターに挿入する前にコーディング配列にライゲートしてもよい。別法としてコーディング配列をすでに調節配列および適当な制限部位を含有している発現ベクターに直接クローニングできる。コーディング配列の修飾を行い、発現を増強するために、選択した宿主細胞に適合するようコドンの使用を変化させてもよい。一般に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカー、例えばイー・コリのアンピシリン耐性遺伝子およびエス・セレビシアエ（S.cerebisiae）ＴＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を指示する高−発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。異種構造配列を翻訳開始および終止配列、好ましくは翻訳されたタンパク質の周辺腔または細胞外培地への分泌を指示できるリーダー配列を用いて適当な状態に組み立てる。所望により、異種配列は望ましい特性、例えば発現組み換え産物の安定化または精製の容易化を付与するＮ−末端同定ペプチドを含有する融合タンパク質をコードできる。本明細書で前記したような適当なＤＮＡ配列、ならびに適当なプロモーターまたは調節配列を含有するベクターを用いて適当な宿主細胞を形質転換し、宿主にタンパク質を発現させることができる。クローニング用の組換えＤＮＡベクターおよびそれらが形質転換できる宿主細胞の例としては、バクテリオファージλ(イー・コリ)、ｐＢＲ３２２(イー・コリ)、ｐＡＣＹＣ１７７(イー・コリ)、ｐＫＴ２３０(グラム陰性細菌)、ｐＧＶ１１０６(グラム陰性細菌)、ｐＬＡＦＲ１(グラム陰性細菌)、ｐＭＥ２９０(イー・コリ以外のグラム陰性細菌)、ｐＨＶ１４(イー・コリおよびバシラス・サブチリス(Bacillus subtilis))、ｐＢＤ９(バシラス)、ｐＩＪ６１(ストレプトミセス(Streptomyces))、ｐＵＣ６(ストレプトミセス)、ＹＩｐ５(サッカロミセス (Saccharomyces))、バキュロウイルス（baculovirus）昆虫細胞系、ＹＣｐ１９（サッカロミセス）等が挙げられる。概要は「DNA Cloning」：Vols I&II,Glove rら、ed．IRL Press Oxford（1985）(1987)および;T．Maniatisら、「Molecular Cloning」Cold Spring Harbor Laboratory（1982）を参照のこと。宿主生物からポリペプチドの分泌を惹起する配列を加え、続いて分泌シグナルを切断することが望ましい場合もある。酵母発現ベクターもまた当業界で知られている。例えば、米国特許第４４４６２３５号；第４４４３５３９号；第４４３０４２８号を参照のこと；また欧州特許出願第１０３４０９号；第１００５６１号；第９６４９１号をも参照のこと。ＳＶ４０後期プロモーターを用いて哺乳動物細胞における発現を誘導するｐＳＶ２ｎｅｏ（J．Mol．Appl．Genet．1:327-341に記載される）またはＣＭＶプロモーターを用いて発現を誘導するｐＣＤＮＡ１（Mol．Cell Biol．7:4125-4129）に由来するベクターｐＣＤＮＡ１ｎｅｏ。これらの後者の２種のベクターは共に哺乳動物細胞中で一過性または安定した（Ｇ４１８耐性を用いる）発現用に用いることができる。昆虫細胞発現系、例えばドロソフィラ（Drosophila）もまた有用であり、例えばＰＣＴ出願ＷＯ９０／０６３５８およびＷＯ９２／０６２１２ならびにＥＰ２９０２６１−Ｂ１を参照のこと。高等な真核生物によるＤＮＡの転写はエンハンサー配列をベクターに挿入することにより増強される。エンハンサーはＤＮＡのシス作動性エレメントであり、通常約１０から３００塩基対であり、プロモーターに作用してその転写を増強する。例には複製起点の後方の１００から２７０塩基対のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモターエンハンサー、複製起点の後方のポリオーマ・エンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが包含される。前記のベクターを含有する宿主細胞は、哺乳動物細胞のごとき高等な真核細胞もしくは酵母細胞のごとき下等な真核細胞であることができ、または細菌細胞のごとき原核細胞であることもできる。適当な宿主の代表例としては:原核生物、例えばイー・コリ、ストレプトミセス、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonel la thyphimurium）のごとき細菌細胞、および真核生物、例えば酵母のごとき真菌細胞、ドロソフィラ（Drosophila）およびスポドプテラ・フルギペルダ（Spod optera frugiperda）のごとき昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはボウズ（Bowes）黒色腫のごとき哺乳動物細胞、植物細胞等が挙げられる。適当な宿主の選択は本明細書の教示より当業者の範囲内であると考える。構築物をリン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより宿主細胞へ導入できる。(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。適当な宿主株を形質転換し、宿主株を適当な細胞密度にまで成長させた後、選択したプロモーターを適当な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）により誘導し、さらなる期間細胞を培養する。典型的には、遠心により細胞を回収し、物理的または化学的手段により粉砕し、得られた粗抽出物をさらに精製するために保持する。凍結−融解サイクル、ソニケーション、機械的粉砕または細胞溶解剤の使用を含む常法によりタンパク質の発現に用いた微生物細胞を粉砕でき、かかる方法は当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞系を用いて組み換えタンパク質を発現することもできる。哺乳動物発現系の例には、サル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７ライン（Gluzman，C ell，23:175(1981)に記載される）および適合するベクターを発現できるその他のセルライン、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫセルライン等が包含される。哺乳動物発現ベクターは複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の所望のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス・ドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列ならびに５’ フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０プライスに由来するＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位を用いて所望の非転写遺伝的エレメントを提供してもよい。また、ヒト以外のトランスジェニック動物を宿主として用いてもよい。発現したポリペプチドの回収方法は、選択した発現系および宿主に依存する。発現系がポリペプチドを成長培地に分泌する場合、ポリペプチドを培地から直接精製できる。ポリペプチドが分泌されない場合は、細胞溶解物から単離するかまたは細胞膜分画から回収する。ポリペプチドが細胞表面に局在する場合、細胞全体または単離した膜を所望の遺伝子産物の検定源として用いることができる。イー・コリのごとき細菌宿主に発現されポリペプチドは封入体から単離し、再生する必要がある。適当な成長条件および回収方法の選択は当業者の範囲内である。硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む方法により組み換え細胞培養物からポリペプチドを回収および精製できる。必要ならばタンパク質の再生工程を用いて成熟タンパク質の立体配置を完全にすることができる。最後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に用いることができる。組み換え製造法で用いる宿主に応じて、ポリペプチドをグリコシル化してもグリコシル化しなくてもよい。ポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含有してもよい。「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により産生した、すなわち所望のポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生したポリペプチドを意味する。「合成」ポリペプチドは化学的合成により製造したポリペプチドである。「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自立的ユニットとして機能する；すなわちそれ自体の調節下で複製可能な遺伝的エレメント（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）である。「ベクター」は、付着したセグメントが複製できるように、別のＤＮＡセグメントがするプラスミド、ファージ、またはコスミド等のレプリコンである。「二本鎖ＤＮＡ分子」は弛緩および超らせんの両方の二本鎖らせんのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン塩基）のポリマーの形態を意味する。この用語は分子の１次および２次構造のみを意味し、特定の３次形態を限定するものではない。従って、この用語はとりわけ直鎖ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを包含する。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造に関して論じる場合、ＤＮＡのセンス鎖に沿って５’から３’の方向の配列のみを示す慣用法に従って本明細書に配列を記載できる。特定のタンパク質のＤＮＡ「コーディング配列」、または特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」は、適当な制御配列の調節下においた場合、ポリペプチドに転写および翻訳されるＤＮＡ配列である。「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’ 方向）のコーディング配列の転写を開始する能力のあるＤＮＡ制御領域である。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１のマッピングにより簡便に示される）およびＲＮＡポリメラーゼの結合に寄与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。真核生物プロモーターは、いつもではないが、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。ＤＮＡ「調節配列」とはプロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流制御ドメイン、エンハンサー等を総称し、総じて宿主細胞におけるコーディング配列の発現（すなわち転写および翻訳）を提供する。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コーディング配列をｍＲＮＡに転写し、次いでコーディング配列によりコードされるポリペプチドに翻訳する場合、調節配列は細胞においてコーディング配列の「発現を指示する」。「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列によりトランスフォームもしくはトランスフェクトされた、またはトランスフォームもしくはトランスフェクト可能な細胞である。外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合、細胞はかかる外因性ＤＮＡにより「形質転換されている」。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合して）も組み込まれなくてもよい。原核生物および酵母では、例えば外因性ＤＮＡはプラスミド等のエピソームエレメント上に保持され得る。真核細胞に関しては、安定して形質転換またはトランスフェクトされた細胞は、外因性ＤＮＡが染色体内に組み込まれ、染色体複製を介して娘細胞により遺伝される細胞である。この安定性は真核細胞が外因性ＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなるセルラインまたはクローンを確立する能力により示される。「クローン」は、単一の細胞または有糸分裂による共通の先祖に由来する細胞の集団である。「セルライン」は、多世代にわたってインビトロで安定した成長が可能な１次細胞のクローンである。２個のＤＮＡまたはポリペプチド配列が「実質的に相同」または「実質的に同一」とは、分子の所定の長さにわたりヌクレオチドまたはアミノ酸が少なくとも約８５％（好ましくはすくなくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％）対合する場合であり、対立遺伝子変異を包含する。また、本明細書で用いるように実質的に相同とは、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列と同一性を示す配列を意味する。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば特定の系で規定されるようなストリンジェント条件下でサザンハイブリダイゼーション実験で同定できる。適当なハイブリダイゼーション条件の規定は当業者の範囲内である。例えば「Current Protocols in Mol．Biol．」Vol.I&II，Wiley Interscience，Ausbel ら(編)（1992）を参照のこと。実質的に同一のタンパク質配列はタンパク質溶解性消化、ゲル電気泳動およびマイクロシークエンシングにより同定できる。「機能的に等価」なる用語は、対象のタンパク質のアミノ酸配列が元来のタンパク質の活性と同種の活性を示す配列であることを意味する。ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然で他の分子と結合して見出されない、他のＤＮＡ分子内またはその分子に付着した同定可能なＤＮＡのセグメントである。ポリペプチドまたはそれを発現する細胞を免疫原として用いてそれに対する抗体を製造できる。これらの抗体は例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることができる。本発明はまたキメラ、一本鎖およびヒト化抗体ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリーの産物をも包含する。当該分野で知られる種々の方法を用いて、かかる抗体およびフラグメントを製造することができる。ポリペプチドを動物に直接注射して、またはポリペプチドを好ましくはヒト以外の動物に投与してポリペプチドに対して生成された抗体を得ることができる。このようにして得た抗体を次いでポリペプチド自体に結合する。このようにしてポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列を用いて完全な天然のポリペプチドに結合する抗体を生成することさえもできる。連続セルライン培養により産生される抗体を提供する任意の技術を用いてモノクローナル抗体を製造することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Kohler and Milstein，1975，Nature，256:495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢセルハイブリドーマ技術(Kozborら、1983，Immunology Today，4:72)、およびヒト・モノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶハイブリドーマ技術(Coleら、1985,Mono clonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc．77-96)が包含される。一本鎖抗体の製造に関して記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）を適用して、免疫原性ポリペプチドに対する一本鎖抗体を製造できる。本発明はまた、ＰＳ−１の１８ｋＤａおよび２８ｋＤａ種への切断のモデュレーターである化合物およびＰＳ−１の機能を変調するためのそれらの使用も提供する。本発明はさらにＰＳ−１の機能を変調するための医薬の製造における本発明による化合物の使用を提供する。本発明はさらにアルツハイマー病の治療または予防の方法であって、本発明の化合物、とりわけＰＳ−１の１８ｋＤａおよび２８ｋＤａ種への切断のモデュレーターである化合物の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。治療に用いる場合、本発明の化合物を標準的な製剤方法にしたがって処方する。したがって、本発明はまた、本発明の化合物および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。経口投与した場合に活性である化合物は、液剤、例えばシロップ、懸濁剤または乳剤、錠剤、カプゼルおよびロゼンジに処方できる。一般に、液体製剤は、懸濁化剤、保存剤、着香剤または着色剤と共に、適当な液体担体、例えばエタノール、グリセリン、非水性溶媒、例えばポリエチレングリコール、油または水中の化合物または医薬上許容される塩の懸濁液または溶液からなる。錠剤の形態の組成物は、固体製剤を製造するために慣用される適当な医薬担体を用いて製造できる。かかる担体の例には、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、ラクトース、シュークロースおよびセルロースが包含される。カプセルの形態の組成物は、慣用のカプセル方法を用いて製造できる。例えば、活性成分を含有するペレットを標準的な担体を用いて製造し、次いで硬質ゼラチンカプセルに充填できる；別法として、適当な医薬担体、例えば水性ガム、セルロース、珪酸塩または油を用いて分散物または懸濁液を製造し、次いで分散物または懸濁液を軟質ゼラチンカプセルに充填できる。典型的な非経口用組成物は、滅菌水性担体または非経口用に許容される油、例えばポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、落花生油、ゴマ油中の化合物または医薬上許容される塩の溶液または懸濁液からなる。別法として溶液を凍結乾燥し、次いで投与直前に適当な溶媒で復元できる。典型的な坐剤処方は、坐剤で投与した場合に活性である式（Ｉ）で示される化合物または医薬上許容されるその塩を、グリコール・ポリマー、ゼラチンもしくはココアバターまたはその他の低融点植物性もしくは合成ワックスもしくは脂肪のごとき結合剤および／または滑沢剤と共に含む。好ましくは組成物を、錠剤もしくはカプセルのごとき単位投与形態にする。経口投与用の各投与量単位は、好ましくは、本発明の阻害剤を１から２５０ｍｇ含有する（非経口投与用には好ましくは０．１ｍｇから２５ｍｇ含有する）。成人の患者の１日の投与計画は例えば式（Ｉ）の化合物もしくは医薬上許容されるその塩を遊離塩基として計算して、経口投与用量は１ｍｇから５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇから２５０ｍｇ、または静脈内、皮下もしくは筋肉内投与用量は０．１ｍｇから１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇから２５ｍｇにでき、化合物を１日１から４回投与する。適当には化合物を治療期間中連続して投与する。さらなる態様において、本発明は患者におけるアルツハイマー病を予測する診断方法であって、患者から組織サンプルを単離し、該サンプルをＰＳ−１の１８ｋＤａおよび２８ｋＤａ種への切断に関してアッセイすることを含む方法を提供する。化合物のスクリーニング方法に関して前記したように、切断産物に対して製造したポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いてサンプルのタンパク質含量をアッセイことにより切断産物の存在を検出できる。本発明はさらに以下の実施例に関して記載する；しかしながら本発明をかかる実施例に制限するものではないことを理解すべきである。特記しなければ全ての部分または量は重量で示す。実施例実施例１細胞中のプレセニリン−１の切断の証明ＰＳ−１のＮ末端領域のアミノ酸４２−６０を含有するペプチドＣＲＳＬＧＨＰＥＰＬＳＮＧＲＰＱＧＮＳＲ、およびＰＳ−１のＣ末端領域のアミノ酸３４４ −３５８を含有するペプチドＣＲＤＳＨＬＧＰＨＲＳＴＰＥＳＲに対するウサギポリクローナル抗体を作成した(Ｒ．Sherringtonら、Nature，375:754-760,1995 )。これらの抗体は：ＰＳ−１のｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞の細胞溶解物をウェスタン・イムノブロット分析により、ベクター対照細胞に比較してトランスフェクトした細胞におけるタンパク質のバンドの免疫反応性が強いことが示される；タンパク質バンドに対する免疫反応性が抗体を作成するのに用いたペプチドに対して競合することが示される；ペプチドを接種する前にウサギから採取した血清では、ペプチドを接種した後の血清を用いて検出されるタンパク質バンドを検出することができないことが示される；ことにより特徴付けられている。神経芽腫セルラインＳＨＳＹ５ＹをＰＳ−１遺伝子のｃＤＮＡを含有する発現ベクターでトランスフェクトし、安定してトランスフェクトされたセルラインを確立した。トランスフェクトされた細胞において、およびベクター対照細胞においても、ＰＳ−１タンパク質はタンパク質のＮ末端およびＣ末端の領域の両方に対して作成した抗体で検出できる４３−４６ｋＤａのタンパク質として現れる。全長ＰＳ−１タンパク質は、ベクター対照細胞よりもＰＳ−１でトランスフェクトされた細胞においてより容易に検出できる。トランスフェクトした細胞およびトランスフェクトしていない両方の細胞内でＰＳ−１がタンパク質溶解的に切断され：プレセニリン−１のＮ末端領域に対して作成した抗体により免疫的に検出できるが、Ｃ末端に対して作成した抗体では検出されない２８ｋＤａのＮ末端フラグメント：およびプレセニリン−１のＣ末端領域に対して作成した抗体により免疫的に検出できるが、Ｎ末端に対して作成した抗体では検出されない１８ｋＤａのＣ末端フラグメントを生成する。実施例２プレセニリン−１の切断のモデュレーターに関するアッセイ前記した抗体を用いて細胞におけるＰＳ−１の切断、およびＰＳ−１の切断の程度に影響しうる外来性物質の効果が測定できる。これはＰＳ−１タンパク質を切断する酵素の活性を阻害またはさもなければ変調する物質を包含し、かかる物質はアルツハイマー病の治療に有用である。プレセニリン−１（ＰＳ−１）遺伝子のｃＤＮＡを含有する発現ベクターでトランスフェクトしたヒト神経芽腫細胞におけるプレセニリン−１の切断の阻害剤の能力を、以下の方法を用いて試験した：ｐｃＤＮＡ３またはｐＣＥＰ４発現ベクターのどちらかのＰＳ−１ｃＤＮＡでトランスフェクトした付着ＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞をマイクロタイタープレート中で成長させる。８８％（ｖ／ｖ）ＤＭＥＭ／ＮＵＴＭＩＸＦ−１２、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、５０μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、Ｇ−４１８ゲネチシン４００μｇ／ｍｌ、および２ｍＭグルタミンからなる成長培地（ｐＨ７．４）において８０％集密にまで細胞を成長させる。試験化合物をジメチルスルホキシド中、保存濃度２ｍＭで溶解し、次いで成長培地中１：２００に希釈する。成長培地を除去した後、希釈した化合物２００μｌを３つのウェル内の付着細胞に加える。希釈した溶媒を含有する適当な対照培養物を３検体用意する。プレートを加湿インキュベーター中９５％空気／５％ＣＯ₂で３７℃にて、２４時間インキュベートする。細胞をリン酸緩衝塩水（ｐＨ７．４）で２回洗浄する。５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）中１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ｖ／ｖＮＰ４０、０．５％ｖ／ｖデオキシコール酸ナトリウム、０．１％ｖ／ｖドデシル硫酸ナトリウムからなるＲＩＰＡ緩衝液中で細胞を溶解し、サンドウィッチアッセイにおいて特異的抗体を用いる９６ウェル・イムノアッセイ・フォーマットでアッセイする。第１の抗プレセニリン−１抗体を細胞内のＣ末端フラグメントに対する捕獲物質として供し、第２の抗プレセニリン−１特異的抗体（これは切断により生成されるＮ末端ネオエピトープを認識する）を検出に用いる複合体の成分として供する。デキストランに結合し、ビオチニル化した第３のウサギＩｇＧ特異的抗体を経時分解する蛍光で検出し、次いでストレプトアビジン− ユーロピウム複合体（Delfia；ＥＧ＆ＧBerthold and Wallac）と、続いてエンハンサー溶液とさらにインキュベートする。陽性の結果は対照群に相対して蛍光が変化するものであり、これは試験化合物の効果の結果切断が変調されたことを示唆する。結果を溶媒のみを含有する培地で条件づけしたウェルで得られたシグナルの阻害％として表す。実施例３診断方法アルツハイマー病を予測するための手段として、またアルツハイマー病の治療としてプレセニリンの切断を変調するために投与されている物質の効果を評価する手段として、前記した抗体を診断用に用いて、患者組織、例えば血液におけるＰＳ−１の１８ｋＤａおよび２８ｋＤａ種への切断の程度をアッセイできる。化合物のスクリーニング方法について前記したように、切断産物に対して産生したポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いてサンプルの免疫活性をアッセイすることにより切断産物の存在を検出してもよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者グレイ，キャロルイギリス、シーエム19・５エイダブリュー、エセックス、ハーロウ、ニュー・フロンティアーズ・サイエンス・パーク・サウス、スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ (72)発明者デイビス，ジョン・ビーイギリス、シーエム19・５エイダブリュー、エセックス、ハーロウ、ニュー・フロンティアーズ・サイエンス・パーク・サウス、スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ (72)発明者ウォード，ロビン・ブイイギリス、シーエム19・５エイダブリュー、エセックス、ハーロウ、ニュー・フロンティアーズ・サイエンス・パーク・サウス、スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ

Claims

【特許請求の範囲】１．プレセニリン−１（ＰＳ−１）の切断を阻害するかさもなければ変調する化合物を同定するための化合物をスクリーニングする方法であって、ＰＳ−１の１８ｋＤａおよび２８ｋＤａ種への切断の程度を試験化合物が存在しない場合の切断の程度と比較して測定することを含む方法。２．ＰＳ−１をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターでトランスフェクトされたヒト宿主細胞を用いる請求項１に記載の方法。３．ＰＳ−１のフラグメントに対して作成し、２８ｋＤａ種よりも１８ｋＤａ種に対して特異的またはその逆であるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて宿主細胞のタンパク質含量をアッセイすることにより切断産物の存在を検出する請求項１または２に記載の方法。４．ウェスタン・ブロット・アッセイまたはＥＬＩＳＡである請求項３に記載の方法。５．単離形態のＰＳ−１１８ｋＤａまたは２８ｋＤａ切断産物。６．ＰＳ−１の２８ｋＤａ種のＣ末端または１８ｋＤａ種のＮ末端に対応する３ないし２０個のアミノ酸長のポリペプチド。７．ＰＳ−１フラグメントに対して作成され、２８ｋＤａ種よりも１８ｋＤａ種に特異的またはその逆である抗体。８．請求項５または６に記載のポリペプチドに対して作成された請求項７に記載の抗体。９．ポリペプチドＣＲＳＬＧＨＰＥＰＬＳＮＧＲＰＱＧＮＳＲまたはＣＲＤＳＨＬＧＰＨＲＳＴＰＥＳＲに対して作成された請求項７に記載の抗体。１０．抗体が請求項７ないし９で定義されるものである請求項３または４に記載の方法。１１.ＰＳ−１の切断部位にわたる３ないし１０個のアミノ酸のポリペプチド。１２．請求項１１に記載のポリペプチドを用いる請求項１に記載の方法。１３．請求項５、６または１１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）。１４．請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。１５．請求項１４に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。１６．宿主においてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、発現した産物を回収する組み換え技術による請求項５、６または１１に記載のポリペプチドの製造方法。１７.ｐｃＤＮＡ３またはｐＣＥＰ４発現ベクターのＰＳ−１ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞。１８．請求項１ないし４のいずれかに記載の方法により同定される化合物。１９．ＰＳ−１の１８ｋＤａおよび２８ｋＤａ種への切断のモデュレーターである化合物。２０．請求項１８または１９に記載の化合物および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。２１．ＰＳ−１の機能を変調する医薬品の製造における請求項１８または１９に記載の化合物の使用。２２．アルツハイマー病の治療または予防方法であって、請求項１８または１９に記載の化合物の有効量を患者に投与することを含む方法。２３．患者におけるアルツハイマー病を予測するための診断方法であって、患者から組織サンプルを単離し、ＰＳ−１の１８ｋＤａおよび２８ｋＤａ種への切断に関して該サンプルをアッセイすることを含む方法。