JP2000511410A - ナンセンス介在ｒｎａ崩壊の哺乳動物の調節因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 これまでに研究されているすべての真核生物は、翻訳の決定のための未熟シグナルを含む転写産物を検出し分解する能力を有する。このナンセンス介在ＲＮＡ崩壊（ＮＭＲＤ）のプロセスは、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）で最も広範に研究されており、酵母では少なくとも３tuのトランス作用性因子（Ｕｐｆ１ｐからＵｐｆ３ｐまで）が必要である。本発明は、ヒトおよびマウスＲＥＮＴ１（regulator of nonsense transcripts：ナンセンス転写産物の調節因子）をコードするｃＤＮＡを提供する。ＲＥＮＴ１は、亜鉛フィンガー様のモチーフおよびＮＴＰａｓｅドメイン並びにヘリカーゼスーパーファミリーＩのメンバーに共通の全モチーフを含めてＵｐｆ１ｐ中の推定上の機能性エレメントのすべてを含有する、最初に同定された哺乳動物タンパク質である。さらに、Ｕｐｆ１ｐの最も外側のＮ末端およびＣ末端により挟まれたＲＥＮＴ１の中心領域を含有するキメラタンパク質の発現は、酵母においてＵｐｆ１ｐ欠損表現型を補足する。

Description

【発明の詳細な説明】 ナンセンス介在ＲＮＡ崩壊の哺乳動物の調節因子 本発明は、アメリカ合衆国政府に支援され国立保健研究所（ＮＩＨ）助成金Ａ Ｒ４１１３５とＨＧ００９７１によりなされた。アメリカ合衆国政府は、本発明 に関連する一定の権利を有する。 発明の分野 本発明は、一般的に細胞中のナンセンス介在ＲＮＡ崩壊（nonsense-mediated RNA decay）を阻害するための組成物および方法に関する。 発明の背景 関連技術の説明 以下は、本発明に関連する技術の一般的説明である。いずれも本発明の先行技 術とは認められない。 すべての生物は、未成熟翻訳停止コドンを含有するＲＮＡ転写産物を検出し分 解する能力を有する。このようなＲＮＡ転写産物は「ナンセンス」転写産物と呼 ばれ、これらの転写産物を分解する細胞プロセスは、ナンセンス介在ＲＮＡ崩壊 （nonsense-mediated RNA decay：ＮＭＲＤ）と呼ばれる。ＮＭＲＤは酵母にお いて広範に研究されているが、ＮＭＲＤに参加する哺乳動物因子はこれまでは記 載されていない。酵母では、ＵＰＦＩ遺伝子によりコードされるタンパク質Ｕｐ ｆ１が、ＮＭＲＤに関与していると考えられている（Leeds et al.，1992，Csap linski et al.，1995）。Ｕｐｆ１は、サッカロミセス・セレビッシェ（S．cere visiae）のＳｅｎ１（これは、ｔＲＮＡスプライシングを媒介する）およびＭｏ ｖ−１０（これは、機能が未知なマウスのタンパク質である）と、高度の配列相 同性を有する。酵母のさらに２つの因子であるＵｐｆ２とＵｐｆ３もまた、ＮＭ ＲＤに必須である。 酵母と哺乳動物ではＮＭＲＤが実質的に異なることを、いくつかの要因が示唆 する。例えば、酵母ではＮＭＲＤに翻訳が関与していると考えられているが、い くつかの観察結果からは、哺乳動物細胞では翻訳が同様の役割を果たしていない ことが示唆される（Peltz et al.，1994）。第１に、多くの遺伝子や突然変異体 にとって、細胞質中のナンセンス転写産物のレベルの低下は、細胞の核内のナン センス転写産物のレベルの同様の低下と結びついている。転写速度が正常である にもかかわらず細胞質や核の両方でレベルが低下している転写産物の例には、β −グロビン、ＤＨＦＲ、ＴＰＩ、ＭＵＰ、およびトリ肉腫ウイルスｓｒｃ、をコ ードする転写産物がある。哺乳動物のＮＭＲＤが酵母のＮＭＲＤと異なることを 示す第２のしるしは、ＮＭＲＤが哺乳動物細胞の細胞質ではなく核内で起こると いう示唆である（Maquat，1995）。ＮＭＲＤが哺乳動物細胞の核内で起こること を示唆する要因は、（ｉ）ＮＭＲＤはイントロン配列に依存する；（ii）イント ロンのないミニ遺伝子由来の多くの転写産物は、ＮＭＲＤに対して免疫がある； （iii）いったんナンセンス転写産物が細胞質に達しポリソームにより結合され ると、それらは正常な安定度を示す；そして（iv）ナンセンスコドンはプレｍＲ ＮＡプロセシングに影響を与える、という観察結果である。特に説得力のある観 察結果は、ナンセンス突然変異は、細胞のＲＮＡスプライシング機構がエキソン を認識する能力を変化させ得ることである；このプロセスは核内で起き、リボソ ームに依存しない（Dietz et al.，1993a;DietaandKendzior，1994）。 ＮＭＲＤは、細胞内プロセシングにおいて顕著な生理学的役割、すなわち細胞 内の異常タンパク質の存在を減少させるという役割を有する。ＮＭＲＤの非存在 下では、ナンセンス突然変異に起因する未成熟停止コドン（ＰＴＣ）が、野生型 タンパク質の末端切断型であるタンパク質の産生につながる。フレームシフト、 遺伝子再編成、またはイントロンの保持に由来するＰＴＣは、正常に機能するＮ ＭＲＤの非存在下では、野生型タンパク質とは配列が異なる異常タンパク質を産 生することがある。このような異常タンパク質は、疾病状態に関与すると考えら れている。ＲＥＮＴ１内に突然変異を有する哺乳動物は、マルファン症候群のよ うなこれらの異常タンパク質の過剰な蓄積が関与する症候群、老化の加速、また は種々の癌に罹りやすいと考えられている。すなわち、ＲＥＮＴ１は、ＮＭＲＤ の制御において重要な役割を果たし、従って突然変異タンパク質の発現による疾 病状態の防止に対して重要な役割を果たす。発明の要約 本発明者は、ナンセンス突然変異を含有する転写産物の安定性を制御する、ｒ ｅｎｔ１と呼ぶタンパク質をコードするヒト相補的ＤＮＡを単離し性状解析した 。本発明者は、ｒｅｎｔ１のドミナントネガティブ（dominant negative）型（ すなわち、正常なタンパク質の機能を妨害する突然変異タンパク質）の発現は、 ナンセンス転写産物の安定化と蓄積を引き起こすことを証明した。本発明者はま た、ｒｅｎｔ１の発現を阻害するアンチセンス調節分子の発現は、ナンセンス転 写産物を安定化させることを証明した。本発明者は、遍在するＮＭＲＤ経路の必 須成分について予測されるように、ｒｅｎｔ１は試験したすべてのヒト組織中で 発現されることを証明した。 ヒトＲＥＮＴ１ ｃＤＮＡをクローン化し配列決定する以外に、本発明者はま た、マウスのＲｅｎｔ１ ｃＤＮＡおよびゲノム配列を完全な状態でクローン化 し配列決定した。本発明者は、ｒｅｎｔ１は酵母のＵｐｆ１ｐ（ナンセンス転写 産物分解の公知のエフェクター）に対して相同性が高いことを証明した。本発明 者は、主にヒトのタンパク質配列から構成されるタンパク質の発現は、ＮＭＲＤ 機能が欠損した酵母でＮＭＲＤを復帰させることを証明した。本発明者は、ｒｅ ｎｔ１をコードするマウス遺伝子をクローン化し、ヒトとマウスのタンパク質は ほとんど同一であることを証明した。本発明者は、ｒｅｎｔ１は、ナンセンス転 写産物安定性の、最初に同定された哺乳動物の調節因子であると結論した。 本発明者は、ＮＭＲＤ経路は、他の遺伝子中の未成熟停止コドンにより引き起 こされる疾患の重症度に影響を与え得ることを証明した。ｒｅｎｔ１または機能 の関連したタンパク質の操作によるＮＭＲＤの効率の修飾は、新規な治療戦略と して提唱される。ｒｅｎｔ１発現またはその機能の阻害は、意図する機能の一部 を保持するタンパク質をコードするナンセンス転写産物を安定化するのに使用さ れる。あるいはまた、ｒｅｎｔ１の発現またはその機能のレベルの増強およびＮ ＭＲＤの効率の上昇は、有害なタンパク質（例えば、有害なドミナントネガティ ブまたはゲイン・オブ・ファンクション（gain-of-function：機能の獲得）作用 を有するもの）をコードするナンセンス転写産物を、より効率的かつ完全に分解 するのに使用される。 ＮＭＲＤの効率の修飾はまた、新しい疾病遺伝子を同定するための手段として も提唱される。もしＮＭＲＤが、未知の疾病遺伝子内の未成熟停止コドンを有す る細胞株中で実験的に傷害されると、この疾病遺伝子に由来するナンセンス転写 産物は、安定化され細胞内に蓄積する。ＮＭＲＤの阻害時に濃縮される転写産物 を同定することにより、疾病遺伝子の同定が大幅に促進されるであろう。 本発明は、実質的に純粋なｒｅｎｔ１ポリペプチド、その断片、ｒｅｎｔ１ま たはその断片をコードする核酸配列、ｒｅｎｔ１またはＮＭＲＤのモジュレータ ーの検出方法、ＲＥＮＴ１核酸の遺伝子送達と遺伝子発現が可能な製剤の投与方 法、ＲＥＮＴ１核酸のためのハイブリダイゼーション方法、およびＲＥＮＴ１核 酸配列を使用して作出されたトランスジェニック動物、を提供する。 本発明の好適な実施態様の詳細を、添付の図面と以下の説明により示す。本発 明の詳細がいったん明らかになれば、当業者には多くの追加の改良および変更が 可能であろう。図面の簡単な説明 図１は、ｒｅｎｔ１のアミノ酸配列と相同タンパク質とのアライメントを示す 。Ａ、酵母（ｙ）の熱ショックタンパク質Ｓｉｓ１とＢ．ナプス（B．napus）（ ｂ）のＲＮＡ結合タンパク質ＧＲＰ１０の特定領域とをアライメントさせたアミ ノ末端。Ｂ、サッカロミセス・セレビシエ（S．cerevisiae）Ｕｐｆ１ｐの特定 領域とアライメントさせた本体。Ｃ、ヒトまたはマウス（ｈ／ｍ）ＲＮＡ結合タ ンパク質Ｅｗｓの特定領域とアライメントさせたカルボキシ末端。同一の残基と 保存された残基は、それぞれ縦線（│）と点（・）で示す。下線の領域は、推定 上のヌクレオチド結合機能（セグメント１と２）およびＮＴＰ加水分解機能（セ グメント３〜５）を果たす。太字かつ下線を引いた領域は、ヘリカーゼスーパー ファミリーＩのメンバー中で高度に保存されている。Ｕｐｆ１ｐ中の証明された ドミナントネガティブ突然変異の部位の上に、十字（†）を示す。ヒト配列の上 のイタリック体の記号は、ヒトタンパク質中のアミノ酸７８〜１１１８に対応し 図中の≧と≦で挟まれたマウス配列の性状決定された領域中の差異を示す。 図２は、ヒト組織中のｒｅｎｔ１発現のノーザンブロット分析を示す。ポリ（ Ａ）ＲＮＡは、記載したすべての成人組織中で、約５．４kbの主要な転写産物の サイズを示す。あまり強くないシグナルは、すべてのレーンで約３．７kbでみら れ、膵臓に特異的な追加のかつ有意に小さいハイブリダイズする転写産物が存 在する。試験した追加の組織（脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、 および末梢血白血球）はすべて、主要な約５．４kbのバンドとあまり強くない３ ．７kbのバンドを示したが、精巣では同様に強いシグナルが観察された。 図３は、アンチセンスターゲティング構築物を示す。天然のＵ１ｓｎＲＮＡの Ｓｍタンパク質結合部位（ボックス）の代わりに使用した（破線で挟まれた）配 列を示す。この配列は、ＲＥＮＴ１ ｃＤＮＡのコードヌクレオチド５２３〜５ ５５に相補的である。ハンマーヘッド型リボザイムループを標的中のＧＵＣトリ プレットにアライメントし、これはリボザイム切断のコンセンサス部位として機 能する（矢印）。この構築物は、公知のナンセンス転写産物を有する細胞系をト ランスフェクションし安定に選択するプロセスにより、この方策を使用してＮＭ ＲＤ阻害の効率を試験することを可能にする。 図４は、マウスＲＥＮＴ１の完全なゲノムおよびアミノ酸配列を示す。 図５は、酵母組換え発現ベクター構築物ＭＥＴ２５−ＲＥＮＴ１中のヒトＲＥ ＮＴ１を示す。 図６は、酵母組換え発現ベクター構築物ｐＡＤ５４ＵＲＡ−ＲＥＮＴ１中のヒ トＲＥＮＴ１を示す。 図７は、哺乳動物組換え発現ベクター構築物ＣＭＶ−ＲＥＮＴ１中のヒトＲＥ ＮＴ１を示す。 図８は、哺乳動物組換え発現ベクター構築物ＢＲＥＮＴ１−ｎｅｏ中のヒトＲ ＥＮＴ１を示す。 図９は、哺乳動物組換え発現ベクター構築物ＲＳＶ−ｌａｃ−ＲＥＮＴ１中の ヒトＲＥＮＴ１を示す。 図１０は、ｐＢＳｍＲＥＮＴ１．ＴＫ．ｇｅｎｏｍｉｃ．Ｂａｍ＃３６と呼ぶ 、マウスＲＥＮＴ１のターゲッティングベクターを示す。 図１１は、ｐＢＳｍＲＥＮＴ１．ｇｅｎｏｍｉｃ．Ｂａｍと呼ぶ、マウスＲＥ ＮＴ１のゲノムクローンを示す。発明の詳細な説明 本発明の核酸配列およびアミノ酸配列、組成物、製剤および方法、これらの使 用を説明する前に、本発明は本明細書に記載の特定の組成物、製剤、配列および 方法に限定されず、そのような組成物、製剤、配列および方法は変化することも あることを理解されたい。また、本明細書に記載の用語は具体例を説明するため のものであり、本明細書に記載の用語は決して本発明の範囲を限定するものでは なく、本発明は請求の範囲によってのみ限定されることを理解されたい。好適な実施態様の説明 本発明は、ｒｅｎｔ１タンパク質をコードする実質的に純粋なポリヌクレオチ ドまたはその断片を提供する。これらのポリヌクレオチドは、ｒｅｎｔ１をコー ドするＤＮＡ,ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む。ｒｅｎｔ１の全部または一部 をコードするポリヌクレオチドはすべて、それらが本明細書に記載のｒｅｎｔ１ 活性を有するポリペプチドまたはｒｅｎｔ１分子の機能性断片をコードする限り 、本発明に包含される。そのようなポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌ クレオチド、合成ポリヌクレオチド、および故意に操作したポリヌクレオチドを 含む。例えば、ｒｅｎｔ１ポリヌクレオチドは部位特異的突然変異誘発を受けて もよい。ｒｅｎｔ１のポリヌクレオチド配列はまた、アンチセンス、ナンセンス 、またはミスセンス配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子コードの 結果としての縮重配列を含む。２０種の天然アミノ酸があり、そのほとんどは２ つ以上のコドンにより規定される。従って、すべての縮重ヌクレオチド配列は、 このヌクレオチド配列によりコードされるｒｅｎｔ１ポリペプチドのアミノ酸配 列またはその一部が機能的に変化しない限り、本発明に含まれる。 本発明はまた、前述のｒｅｎｔ１ポリペプチドをコードする単離された核酸分 子、ならびにその断片を提供する。これらの核酸は、ｒｅｎｔ１をコードする天 然のヌクレオチド配列、または天然の核酸配列とは異なるが遺伝子コードの縮重 のために同じアミノ酸をコードする配列を含むことができる。本発明の核酸は、 ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチド、またはこれらの組合せ物もしくは修飾物を 含有することができる。 本明細書において「単離された核酸」という用語は、それが得られる生物の天 然ゲノム中に存在するとき、通常は直接隣接している５’および３’フランキン グ配列に直接隣接していない核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を意味する 。すなわちこの用語は、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベ ク ター中に組み込まれる核酸、異種細胞のゲノム（または、同種細胞のゲノムであ るが、天然部位とは異なる部位に存在するゲノム）中に組み込まれる核酸；およ び別個の分子として存在する核酸、例えばＰＣＲ増幅または制限酵素消化により 産生されるＤＮＡ断片、またはin vitro転写により産生されるＲＮＡ分子、を示 す。この用語はまた、例えば融合タンパク質の産生に使用できる追加のポリペプ チド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成する、組換え核酸を示す 。 本発明の核酸分子は、ＲＥＮＴ１遺伝子産物（例えば、ＲＥＮＴ１ ＲＮＡお よびｒｅｎｔ１ポリペプチド；後述）の産生のための標準的方法において鋳型と して使用することができる。さらに、ｒｅｎｔ１ポリペプチド（およびその断片 ）をコードする核酸分子および関連する核酸、例えば（１）ｒｅｎｔ１ポリペプ チドをコードする核酸に相補的であるかまたはこれとハイブリダイズする配列を 含有する核酸、またはその断片（例えば、少なくとも９、１２、１５、２０、ま たは２５ヌクレオチドを含有する断片）；および（２）ｒｅｎｔ１ポリペプチド をコードする核酸に相補的な配列とハイブリダイズする配列を含有する核酸、ま たはその断片（例えば、少なくとも９、１２、１５、２０、または２５ヌクレオ チドを含有する断片）は、ハイブリダイゼーションの性質に焦点を当てた方法で 使用することができる。例えば、後に詳述されるように、このような核酸分子は 以下の方法で使用することができる。すなわち、ＲＥＮＴ１核酸を合成するため のＰＣＲ法、サンプル中のＲＥＮＴ１核酸の存在を検出する方法、新しいＲＥＮ ＴＩファミリーメンバーをコードする核酸を同定するためのスクリーニング法、 および治療法。本明細書において試料という用語は、体液、血液、血清、血漿、 細胞、組織、スワブもしくは分泌物、または臨床技術分野の当業者に通常知られ ている他の臨床サンプルを含む。 本明細書において「実質的に純粋な」という用語は、他のタンパク質、脂質、 炭水化物、核酸、および天然に会合している他の生物学的物質を、実質的に含ま ないポリペプチド（例えば、ｒｅｎｔ１ポリペプチド、またはその断片）のよう な分子を説明するために用いられる。例えば、実質的に純粋な分子（例えば、ポ リペプチド）は、少なくとも６０％（乾燥重量）の目的の分子であってよい。当 業者であれば、標準的なタンパク質精製法を使用してｒｅｎｔ１ポリペプチドを 精製することができ、ポリペプチドの純度は、例えばポリアクリルアミドゲル電 気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、カラムクロマトグラフィー（例えば、高 速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、およびアミノ末端アミノ酸配列解析 を含む標準的方法を使用して決定することができる。 また本発明は、ｒｅｎｔ１ポリペプチドの配列の「保存的変異体」である配列 を有するポリペプチドも含む。「保存的変異体」アミノ酸配列とは、保存的アミ ノ酸置換、例えば、１つのアミノ酸を同じクラスの別のアミノ酸で置換（例えば 、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンのような１つの疎水性ア ミノ酸を別のアミノ酸で置換、または、１つの極性アミノ酸を別のアミノ酸で置 換、例えばアルギニンをリジンで、グルタミン酸をアスパラギン酸で、またはグ ルタミンをアスパラギンで置換）するような保存的アミノ酸置換、または１つま たはそれ以上の非保存的置換、欠失、もしくは挿入によってのみ、基準配列とは 異なる配列である（ただし、そのポリペプチドは、少なくとも１つのｒｅｎｔ１ 特異的活性、またはｒｅｎｔ１特異的エピトープを保持する）。例えば、生物活 性を大きく変更することなく、１つまたはそれ以上のアミノ酸をｒｅｎｔ１ポリ ペプチドから欠失して、ポリペプチドの構造を修飾することができる。例えば、 ｒｅｎｔ１の生物活性のために必須ではないアミノ末端またはカルボキシ末端ア ミノ酸を除去することができる。そのような修飾により、小さくて活性のあるｒ ｅｎｔ１ポリペプチドが出現する。 「ｒｅｎｔ１」という用語は、以下の定義に従って使用される。すなわち、ｒ ｅｎｔ１およびＲＥＮＴ１（regulator of nonsense transcripts（ナンセンス 転写産物の調節因子））という用語は、それぞれ、図１のマウスまたはヒトから の遺伝子およびタンパク質を意味する（配列番号１、２、３または４）。 本明細書において「試験組成物」という用語は、遺伝子、核酸配列、ポリペプ チド、ペプチド断片のような組成物、またはコンビナトリアルライブラリーもし くは他のコンビナトリアルプロセスを使用して作成され、特定のキャパシティー で機能する能力（例えば、ｒｅｎｔ１補助因子、またはｒｅｎｔ１相互作用物質 （interactor）、またはｒｅｎｔ１経路を使用するナンセンス介在ＲＮＡ崩壊（ ＮＭＲＤ）のｒｅｎｔ１モジュレーターとしての能力）についてアッセイされ る組成物、またはｒｅｎｔ１ポリペプチドの活性を模倣する化合物（例えば、ペ プチドミメティック）である。このような試験組成物、核酸配列またはポリペプ チドは、しばしばその配列または構造のために、特定のキャパシティーで機能し うると思われる。それにもかかわらず、ランダムに選択された「試験」核酸配列 、ポリペプチドまたはその断片、および組成物もまた使用することができ、この 目的のために当該分野で公知の技術、例えば核酸ライブラリーからのポリペプチ ドの発現、またはＰＣＲコンビナトリアル作成ポリペプチドを使用することがで きる。「補助因子」は、ｒｅｎｔ１を調節しＮＭＲＤに影響を与えることができ る任意の組成物（例えば、ポリペプチド、ポリペプチド誘導体、またはペプチド ミメティクス）である。本発明には、ｒｅｎｔ１を介してＮＭＲＤを自然界で誘 導する組成物；また自然界ではＮＭＲＤを誘導しない組成物（例えば、人工組成 物および、および他の目的を果たす天然の組成物）が包含される。本明細書で使 用される「アゴニスト」という用語は、ＲＥＮＴ１介在ＮＭＲＤを上昇させるこ とができる任意の組成物を意味する。このようなアゴニストは、ｒｅｎｔ１を介 して、ＮＭＲＤを増加させたりＮＭＲＤを調節するのに、ｒｅｎｔ１に結合する 必要はない。本明細書において「アンタゴニスト」という用語は、ｒｅｎｔ１の 能力を低下させるか、またはｒｅｎｔ１経路を介してＮＭＲＤを誘導することが できる任意の組成物を意味する。アンタゴニストは、ｒｅｎｔ１経路を介してＮ ＭＲＤを調節するのに、ｒｅｎｔ１に直接結合したり、またはｒｅｎｔ１と競合 する必要はない。 「製剤」とは、遺伝子送達と遺伝子発現が可能な組成物、すなわち標的細胞へ 、または標的細胞内に直接、ヌクレオチド配列を送達することができる組成物を 意味し、ここで、ヌクレオチド配列を含有する製剤は、標的細胞の最も外側の膜 の細胞質側に取り込まれ、かつ送達されたヌクレオチド配列の遺伝子発現の検出 可能なレベルが標的細胞中で発現されるように、遺伝子発現を達成することがで きる。より好ましくは、細胞膜の細胞質側に送達された後に、組成物はエンドソ ームまたは溶解性分解を受けることなく、送達されたヌクレオチド配列の遺伝子 発現の検出可能なレベルが標的細胞中で発現されるように、遺伝子発現を行うこ とができる機能的状態で、標的細胞の核の中に輸送される。標的細胞中の遺伝子 ま たはヌクレオチド配列の発現レベルは、その中のヌクレオチド配列が生物学的に 有効な量の遺伝子産物を供給できるような量で、または標的細胞に対して機能的 に有効な生物学的作用を及ぼすような量で、一定の時間にわたり遺伝子発現を提 供することが可能である。本明細書において製剤という用語は、以下の例を意味 するが、決して（明示的にも暗示的にも）これらに限定されるものではない。す なわち、（１）正味の性質および実効電荷が陽イオン性、陰イオン性または中性 のリポソーム、またはリポソーム製剤またはリポソーム組成物；（２）リガンド を介して［ＤＮＡ＋ポリ陽イオン＋リガンド］組成物が標的細胞の細胞表面受容 体へ結合した後、［ＤＮＡ＋ポリ陽イオン＋リガンド］組成物が標的細胞中にエ ンドサイトーシスされることができ、次にＤＮＡがリガンドとポリ陽イオンから 切り離され、以後の発現のために機能的状態で細胞核に送達されるように、ポリ 陽イオンおよびリガンドとイオン的に複合体化されたＤＮＡ、核酸、または核酸 発現ベクター。当業者であれば、（ａ）組成物をリソソーム小胞から退去させる ことにより、組成物が標的細胞に入った後のエンドソーム溶解から組成物を保護 するペプチド配列、または（ｂ）核エンベロープの孔から細胞の核の中に核酸を 運搬する核ターゲッティング物質として作用するペプチド配列、を含むような、 組成物の種々の変更を想到することができる。既に記載されている同様の製剤は 、アシアログリコプロテイン−ポリリジン結合体（Wu and Wu，J．Biol．Chem．263 :14621，1988;Wu et al.、J．Biol．Chem.264:16985，1989)；（３）裸の核 酸；（４）圧縮(compacted)核酸または圧縮製剤；または（５）微量注入され得 るプラスミドまたは裸のＤＮＡ（Wolff et al.，Science 247:1465，1990）；（ ６）ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター組成物中の核酸；および（ ７）コロイド分散物（Feigner et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413， 1987;Ono et al.，Neuroscience Lett 117:259，1990;Brigham et al.，Am．J． Med．Sci.298:278，1989;Staubinger and Papahadjopoulos，Meth．Enz.101 :51 2，1983）。当業者は、標的細胞へのヌクレオチド配列の送達のための他の組成 物も認識できるであろう。 「遺伝子送達」とは、組成物または製剤を標的細胞内にまたはこれと接触する ように運搬または輸送することを意味し、その結果組成物または製剤は、サイト ティック(cytotic)プロセス（すなわち、ピノサイトーシス、エンドサイトーシ ス、ＮＭＲＤ、マクロサイトーシスなど）により、標的細胞の最も外側の細胞膜 の内側つまり細胞質側に取り込まれ、次に機能的状態（検出可能な有効な生物学 的作用を及ぼすような時間および量で、検出可能な遺伝子発現を達成することが 可能）で細胞の核に運搬される。 「遺伝子発現」とは、標的細胞への送達後、ヌクレオチド配列がうまく転写お よび翻訳されて、送達されたヌクレオチド配列の検出可能なレベルが、機能的な 生物学的作用が達成されるような量と時間で発現されることを意味する。本明細 書における遺伝子発現としては、以下の例を例示できるが、決して（明示的にも 暗示的にも）これらに限定されるものではない。ＲＥＮＴ１核酸配列は、標的細 胞に送達され発現され、その結果、標的細胞はｒｅｎｔ１タンパク質またはＲＥ ＮＴ１ＲＮＡの産生を増加、減少または阻害し、従って、ＮＭＲＤを増強、ＮＭ ＲＤを阻害、またはＮＭＲＤを調節し、こうして有効な検出可能な生物学的作用 または結果を示す。「発現可能な遺伝子構築物」とは、発現するような位置にＲ ＥＮＴ１遺伝子を有する構築物を意味する。「機能的に結合」とは、適切な分子 （例えば、転写活性タンパク質）が制御配列に結合した時、遺伝子と制御配列が 、ＲＥＮＴ１遺伝子の発現を可能にするように結合していることを意味する。「 形質転換された」とは、組換え核酸技術により、異種核酸分子が導入された細胞 （または、その祖先）を意味する。「異種」とは、別の種に由来するか、または 本来の型もしくは細胞内で本来発現されている型が修飾されている核酸配列を意 味する。 「トランス遺伝子」とは、工夫して細胞に挿入され、細胞から発現する、生物 のゲノムの一部（すなわち、安定に組み込まれるかまたは安定な染色体外成分と して）になる任意のＤＮＡ断片である。このようなトランス遺伝子は、トランス ジェニック生物に対して部分的にまたは完全に異種（すなわち、外来）である遺 伝子、または生物の内在遺伝子に対して相同的な遺伝子を含有してもよい。この 定義には、ＤＮＡに転写された後にゲノム内に取り込まれるＲＮＡ配列を用いて 作製されるトランス遺伝子が含まれる。本明細書において「トランスジェニック 」という用語は、早期胚または受精卵のｉｎ ｖｉｔｒｏ操作により、または 特異的遺伝子ノックアウトを誘導する任意のトランスジェニック技術により、ゲ ノムが改変された任意の生物をさらに含む。本明細書において「遺伝子ノックア ウト」という用語は、当業者に公知の任意のトランスジェニック技術により達成 される、機能を完全に失ったｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子の標的破壊を意味する。ある 実施態様において、遺伝子ノックアウトされたトランスジェニック動物は、相同 的組換えにより非機能的になるように標的遺伝子を標的として挿入することによ り、標的遺伝子が非機能的にされているものである。本明細書において「トラン スジェニック」という用語は、導入されたトランス遺伝子を有するか、または内 在遺伝子が非機能的にもしくはノックアウトされている、生物を産生することが できる、当業者に公知の任意のトランスジェニック技術を含む。 「プロモーター」とは、転写を指令するのに充分な最小のヌクレオチド配列を 意味する。本発明はまた、外部シグナルまたは作用物質（ａｇｅｎｔ）により、 プロモーター依存性遺伝子発現を細胞型特異的、組織特異的、または誘導性につ いて制御可能にするのに充分なプロモーター成分も包含し、このような成分は、 本来の遺伝子の５’または３’領域に位置してもよい。「検出可能に標識される 」とは、分子の存在をマークし同定するための任意の手段（例えば、オリゴヌク レオチドプローブ、またはプライマー、抗体またはその断片、タンパク質または その断片、遺伝子またはその断片、あるいはｃＤＮＡ分子）を意味する。検出可 能に標識する方法は、当該分野で公知であり、放射能標識（例えば、³²Ｐまたは³⁵ Ｓのようなアイソトープによる）、および非放射能標識（例えば、化学発光標 識、例えば蛍光標識）があるが、これらに限定されない。 「精製された抗体」とは、少なくとも６０重量％であり、天然には会合してい るタンパク質や天然に存在する有機分子を含まない抗体を意味する。好ましくは 調製物は、少なくとも７５％、より好ましくは９０％、および最も好ましくは少 なくとも９９重量％の純度である抗体（例えば、ｒｅｎｔ１特異的抗体）である 。精製された抗体は、例えば組換え的に産生したタンパク質または保存されたモ チーフペプチド、および標準的方法を使用して、例えばアフィニティクロマトグ ラフィーにより得られる。本発明は、完全なモノクローナル抗体またはポリクロ ーナル抗体のみでなく、免疫学的に活性な抗体断片、例えばＦab’または（Ｆab ’） ２断片、または遺伝子操作したＦv断片（Ladnerら、米国特許第４，９４６，７ ８８号）を使用することもできる。「特異的に結合する」とは、特定のタンパク 質を認識し結合するが、試料（例えば生物学的試料、これは当然タンパク質を含 有する）中の他の分子を実質的に認識し結合しない抗体を意味する。 本明細書において「治療上有効」とは、治療される患者の症状を改善するのに 充分な製剤の量を意味する。「改善する」とは、治療を受ける患者の病状または 障害の悪影響を小さくすることを意味する。本発明の対象は好ましくはヒトであ るが、いかなる動物も本発明の方法により治療することができると想到される。 「調節する」という用語は、ＲＥＮＴ１ｍＲＮＡ、核酸、ポリペプチドまたはタ ンパク質の発現を増強、阻害、改変、または修飾することを意味する。 本発明はまた、試験物質または組成物が細胞内でＮＭＲＤを調節するかどうか を測定する方法を提供する。この方法は、（ｉ）ＲＥＮＴ１を有する細胞を準備 し；（ii）その細胞を、それが不存在の場合には細胞中のＲＥＮＴ１を活性化す る試験物質または組成物と接触させて；そして（iii）細胞のＮＭＲＤの変化を 検出する、ことにより行われる。本発明の実施にあたって、細胞は、同時または 逐次的に試験物質または組成物と接触させることができる。ＮＭＲＤの増加は、 試験物質または組成物がＲＥＮＴ１のアゴニストであることを意味し、ＮＭＲＤ の減少は試験物質または組成物がｒｅｎｔ１のアンタゴニストであることを意味 する。必要であれば、ＮＭＲＤの調節物質を同定するための上記方法は、本発明 のこの態様で使用される、ＲＥＮＴ１を含むＮＭＲＤ経路内の組成物、補助因子 または他の組成物を同定するのに使用することができる。本発明の実施において 、試験物質または組成物として任意の物質または組成物が使用でき、好適な試験 物質または組成物は、ポリペプチドおよび小さい有機物質または組成物である。 構造的相同性のある配列は、試験物質または組成物が細胞中でＲＥＮＴ１を介し てＮＭＲＤを調節するか否かに関する根拠を提供するが、ランダムに選択された 試験物質または組成物もまた、本発明の使用に適している。物質または組成物を ランダムに作製するための当該分野で公知の方法（例えば、核酸ライブラリーか らのポリペプチドの発現）は、適切な試験物質または組成物を産生するのに使用 することができる。当業者は、本明細書に記載の特定の方法の代わりに別の方法 が 使用できることを認識できるであろう。 本発明はまた、ＲＥＮＴ１を含む試料を試験組成物と接触させて、試験組成物 の添加後にＮＭＲＤの変化を測定することを含む、ＲＥＮＴ１に結合する新規補 助因子またはインヒビターの検出方法を提供する。本発明のｒｅｎｔ１タンパク 質は、ｒｅｎｔ１を介してＮＭＲＤに影響を与える新規化合物または新規試験組 成物を同定するためのスクリーニング方法に有用である。すなわち別の実施態様 において本発明は、試験組成物を含む成分とｒｅｎｔ１とを、これらの成分が相 互作用するのに充分な条件下でインキュベートし、次に試験細胞中でＮＭＲＤに 及ぼす試験組成物の作用を測定することを含む、試験組成物のスクリーニング方 法を提供する。ｒｅｎｔ１と組成物との間で観察されたＮＭＲＤに及ぼす作用は 、アゴニスト作用でもアンタゴニスト作用でもよい。好ましくはｒｅｎｔ１をコ ードするポリペプチドは、配列番号２または４のポリペプチドまたはその機能的 断片、あるいはｒｅｎｔ１タンパク質の生物活性を有する合成ペプチドである。 本発明はまた、少なくとも１つのｒｅｎｔ１特異的活性またはエピトープを保 持するｒｅｎｔ１ポリペプチドの断片を含有する。例えば少なくとも８〜１０ア ミノ酸を含有するｒｅｎｔ１ポリペプチド断片は、例えば、ｒｅｎｔ１特異的抗 体の産生において、免疫原として使用することができる。このような断片は、Ｒ ＥＮＴ１の配列を図１と比較して容易に同定することができる。ペプチド免疫原 としての使用以外に、試料中のｒｅｎｔ１特異的抗体の存在を検出するための免 疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ）に、ｒｅｎｔ１断片を使用することができる。 本発明のｒｅｎｔ１ポリペプチドは、いくつかの標準的方法の任意のものを使 用して得ることができる。例えば、ｒｅｎｔ１ポリペプチドは、標準的組換え発 現系（後述）、化学合成（このアプローチは、小さいｒｅｎｔ１ペプチド断片に 限定される）で産生することができ、また天然に発現されている組織から精製（ 例えば、Ausubel，et al.,前述）することもできる。 本発明はまた、前述したｒｅｎｔ１ポリペブチドをコードする単離された核酸 分子、並びにその断片を提供する。これらの核酸は、天然に存在するヌクレオチ ド配列、またはｒｅｎｔ１をコードする天然に存在する核酸の配列とは異なる配 列を含有するが、保存的変異体である遺伝コードまたはアミノ酸の縮重のために 同じアミノ酸をコードする。本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド 、またはこれらの組合せまたは修飾を含有してもよい。 これまでに研究されたあらゆる生物は転写終結の関する未熟シグナルを含むＲ ＮＡ転写物を検出および分解する能力を保持していた。 酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)で、ナンセンス 介在ＲＮＡ崩壊(ＮＭＲＤ)のプロセスが包括的に研究された。酵母経路の必須成 分には、少なくとも３つのトランス作用因子(ＵＯＦ1-3)が含まれている。酵母 ＵＰＦ1のヒト相同体はＲＮＴ1である(ナンセンス転写物のレギュレーター)。本 発明は哺乳類rent1相同体のメンバーをコードする核酸分子を同定する方法を含 む。これらの方法では、rent1ポリペプチドをコードする核酸を含むサンプル、 例えば、ｃＤＮＡライブラリーのごとき核酸ライブラリーをＲＥＮＴ1特異的プ ローブ、例えばＲＥＮＴ1特異的核酸プローブでスクリーニングする。ＲＥＮＴ1 特異的核酸プローブはrent1ポリペプチドをコードする核酸と、またはその相補 的配列と特異的にハイブリダイズする核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡヌ クレオチド、あるいはその組み合わせまたは修飾物）である。 ＲＥＮＴ1は酵母におけるＵＰＦファミリーと密接に関係しているので、本発 明の文脈におおいて「ＲＥＮＴ1特異的プローブ」とは、ＵＰＦ配列をコードす る核酸、またはその相補的配列に対するよりもより高度に検出できる限度で、re nt1ポリペプチドをコードする核酸に、またはその相補的配列に結合するプロー ブをいう。かくして「ＲＥＮＴ1特異的プローブ」には、測定できる限度で、ren t1ポリペプチドをコードする核酸に（またはその相補的配列に）結合できるプロ ーブが含まれるが、ＵＰＦ配列をコードする核酸に（または相補的配列に）に結 合できるプローブは含まれない。 本発明はＲＥＮＴ1特異的核酸プローブの生産を促進する。かかるプローブを 得る方法は、図１に示されるアミノ酸配列のアラインメントに基づいて設計する ことができる。該プローブは少なくとも９個、例えば少なくとも12、15、25、35 、50、100または150個のヌクレオチドを含み、いくつかの標準法の何れを用いて も作製できる(Ausubelら,前掲参照)。例えば、好ましくは、該プローブは下記の もののごときＰＣＲ増幅 法を用いて作製される。これらの方法では、プライマーはrent1-特異的アミノ酸 を含むＲＥＮＴ1配列に相当するよう設計され、得られたｔれＰＣＲ産物をプロ ーブとして用いて、ｃＤＮＡライブラリーのごとき核酸ライブラリーをスクリー ニングする。 当該技術分野で公知のごとくに、ＰＣＲプライマーは典型的には、少なくとも 15個のヌクレオチド、例えば15-30個のヌクレオチドを含むように設計される。 ７個のアミノ酸を含有するrent1ペプチドをコードする、21個のヌクレオチドを 含有するＲＥＮＴ1−特異的プライマーの設計は以下に記載される。好ましくは 、かかるプローブの該ヌクレオチドのほとんど、あるいは全てはrent1−特異的 アミノ酸を含むrent1−保存アミノ酸をコードする。例えば、少なくとも40％のr ent1−保存アミノ酸を含有するペプチドをコードする配列を含むプライマーを使 用することができる。21個のヌクレオチドを含有するかかるプライマーは、少な くとも3/7、4/7、5/7、6/7または7/7のrent1−保存アミノ酸をコードする配列を 含有できる。図１の解析によって決定できるように、７個のアミノ酸を含む21個 のヌクレオチドプライマー場合では、５個までのアミノ酸がrent1−特異的であ る。かくして、該プライマーは少なくとも１つのrent1−特異的アミノ酸、例え ば５個までのrent1−特異的アミノ酸をコードする配列を含有できる。一旦、ren t1−特異的アミノ酸配列を、それに対してプライマー配列が設計される鋳型とし て選択すれば、そのプライマーを例えば標準的な化学法を用いて合成することが できる。前記のごとくに、遺伝子コードの縮重により、かかるプライマーは適当 な縮重配列を含むよう設計すべきであり、当業者ならば容易にそれを決定するこ とができる。 上に提示された指針に基けば、ＲＥＮＴ1−特異的プライマーの設計のための 鋳型として用い得るrent1−保存アミノ酸ペプチドの例は以下の通りである。さ らなる例は、rent1ポリペプチドの配列のアラインメトの解析によって発見する ことができる。プライマーは例えば、rent1のペプチドの5-10個のアミノ酸領域 に基づき、所望のプライマー長に応じて 設計できる。例えば、プライマーは下記に示されるセグメントの何れかの連続し た７個のアミノ酸に相当するようにも設計することができる。 1．ＱＶＤＦＶＱＫＳＴＳＦＤＲＭＱＳＡＬＫＴＦＡＶ（配列番号５） （ヒトrent1のアミノ酸411-434に相当） 2．ＬＳＬＩＯＧＰＰＧＴＧＫＴＶＴＳＡＴＩＶＹＨＬＡＲＱＤＮ（配列番号 ６） （ヒトrent1のアミノ酸487-515に相当） 3．ＨＩＶＮＨＬＶＲＡＫＣＫＥＶＴＬＨＫＤＧＰ（配列番号７） （ヒトrent1のアミノ酸488-511に相当） 4．ＡＧＱＬＤＡＱＶＧＰＥＧＩＬＱＮＧＡＶＤＤＳＶＡＫＴ（配列番号８） （ヒトrent1のアミノ末端のアミノ酸72-97に相当） 5．ＩＬＩＤＥＳＴＱＡＴＥＰＥＣＭＶＰＶＶＬＧＡＫＱＬＩＬＶＧＤＨ（配 列番号９） （ヒトrent1のアミノ酸634-663に相当） 6．ＳＭＳＱＰＳＱＭＳＱＰＧＬＳＱＰＥＬＳＱ（配列番号１０） （ヒトrent1−カルボキシ末端のアミノ酸1061-1075に相当） 前記のごとくに、ＲＥＮＴ1−特異的プライマー、例えば上に示されるrent1− 特異的ペプチドまたはその一部に基づくプライマーをＰＣＲ反応に用いてＲＥＮ Ｔ1−特異的プローブを作出し、これをrent1ファミリーメンバーをコードする核 酸を同定するための標準的スクリーニング法に用いることができる(Ausubelら， 前掲参照)。 ＲＥＮＴ1−特異的核酸プローブに加えて、rent1−特異的抗体のごときrent1 −特異的ポリペプチドプローブを用い、新規なrent1ポリペプチドまたはその一 部をコードする核酸に関してサンプル、例えば、発現ライブラリーをスクリーニ ングすることができる。例えば、rent1−特異的ペプチドと特異的に結合する抗 体を本法を用いることができる。かかるスクリーニングを実施するための方法は 、当該技術分野で十分に公知である(例えば、Ausubelら,前掲参照)。 塩基対合相互作用そのペアのメンバーの１つの各ヌクレオチドとその ペアの他のメンバーの各ヌクレオチドとの間で起こるならば、１対の核酸分子配 列（または単一の核酸分子内の２領域）は互いに「相補的である」といえる。１ 対の核酸分子（または単一の核酸分子内の２領域）がそれらの間で塩基対合相互 作用により二重らせんを形成すれば、それらは互いに「ハイブリダイズする」と いえる。当該技術分野で公知のごとくに、核酸ペア間のハイブリダイゼーション はハイブリダイズする領域の間で完全な相補性を必要とはせず、用いられるハイ ブリダイゼーション条件の下で二重らせんを維持するのに十分な塩基対合が存在 しさえすればよい。 典型的には、ハイブリダイゼーションは低および中度ストリンジェント条件の 下で行われ、そこでは特異的相互作用および幾分の非特異的相互作用が起こり得 る。ハイブリダイゼーション後、中度または高ストリンジェント条件の下で洗浄 を行い、非特異的結合を除去する。当該技術分野で公知のごとくに、最適洗浄条 件は経験的に、例えば、段階的にストリンジェントの程度を増すことにより決定 することができる。ストリンジェントの程度に影響を与えるために変化させ得る 条件パラメーターとしては、例えば、温度および塩濃度が挙げられる。一般に、 塩濃度が低くなるほど、また温度が高くなるほど、ストリンジェントの程度は高 くなる。例えば、洗浄はハイブリダイゼーション溶液と同等もしくはより低い塩 濃度の溶液を用いて、低温（例えば、室温）で開始することができる。それに続 く洗浄は、同様の塩を含む段階的により温かい溶液を用いて行うことができる。 また、塩濃度を低くして温度を洗浄工程中一定にすることもできるし、塩濃度を 低くして温度を上昇させることもできる。例えば、ホルムアミドなどの不安定化 剤の使用を始めとするその他のパラメータを変更してストリンジェント程度に影 響を与えることができる。 核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定レベルのストリンジェント程 度を達成するために用いられる条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質によっ て様々である。例えば、長さ、相補性の程度、ヌクレ オチド配列の組成（例えば、ＧＣ含量対ＡＴ含量）、および核酸のハイブリダイ ズ領域の核酸のタイプ（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）が、選択的ハイブリダイゼー ション条件において考慮され得る。さらに考慮される点は、その核酸の一方が、 例えばフィルター上に固定化されているかどうかということである。 段階的にストリンジェントの程度を高める条件は以下の通りである：ほぼ室温 にて2xＳＳＣ10.1％ＳＤＳ(ハイブリダイゼーション条件)；ほぼ室温にて0.2xＳ ＳＣ/0.1％ＳＤＳ(低ストリンジェント条件)；次いで、約68℃にて0.1xＳＳＣ( 高ストリンジェント条件)。洗浄はこれらの条件一つのみ、例えば、高ストリン ジェント条件を用いて行うこともできるし、各条件（例えば、挙げられた工程の 全てまたは何れかを繰り返して挙げられた順で各10-15分ずつ）を用いることも できる。しかしながら前記のごとくに、至適条件は特定の関連するハイブリダイ ゼーション反応によって様々であり、経験的に決定することができる。 本発明の核酸分子はいくつかの標準法の何れによっても得ることができる。例 えば、該分子は標準的な組換え法、酵素法（例えば、ＰＣＲまたは逆転写(ＲＴ) /ＰＣＲ法）および化学法（ホスホアミダイト−基合成）を用いて作製すること ができる。さらに、それらは核酸ライブラリーおよび組織サンプルなどのサンプ ルから、標準的ハイブリダイゼーション法を用いて単離することもできる。例え ば、前記したごとくに標準法を用いて、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライ ブラリーをＲＥＮＴ1核酸配列に相当する核酸プローブとハイブリダイズさせて 、そのライブラリー中での相同なヌクレオチド配列の存在を検出することができ る(例えば、Ausubelら，前掲)。これらの方法は上により詳細に記載されている 。また前記のごとくに、rent1特異的エピトープのごとき少なくとも１つのrent1 エピトープを含有するポリペプチドをコードする核酸も、rent1−特異的抗体を プローブとして、ラムダgt11に含まれるライブラリーのごときｃＤＮＡ発現ライ ブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。かかる抗体 はポリクローナルもしくはモノクロ ーナルの何れであってもよく、標準法を用いて作製される(例えば、Harlowおよ びLane，Antibodies:A Laboratory Manual．Cold Spring Harbor Laboratory Pr ess，Cold Spring Harbor，New York，1988参照)。 rent1−特異的抗体および核酸は、サンプルまたは特異的細胞種におけるrent1 ポリペプチド(抗体を用いる)、または核酸（核酸プローブを用いる）の存在を検 出するための方法でプローブとして用いることができる。これらの方法では、re nt1−特異的抗体または核酸プローブをrent1−関連障害を持つことが疑われる患 者由来のサンプルと接触させ、次いで、該サンプルへの抗体または核酸プローブ の特異的結合を検出する。疑わしいサンプルにおけるrent1ポリペプチドまたは 核酸の存在レベルを対照サンプル、例えば罹患していない個体由来の同等のサン プルと比較して、該ペプチドがrent1−関連障害を有しているかどうかを決定す ることができる。また、rent1ポリペプチドまたはその断片をプローブとして診 断法に用いて、例えば、サンプル中のrent1−特異的抗体の存在を検出すること もできる。さらには、rent1−特異的抗体を用いて、rent1またはその断片と複合 体を形成した新規なコファクターを検出することもできた。 ＲＥＮＴ1−特異的核酸プローブはサンプル中のＲＥＮＴ1核酸との結合の検出 を容易にする化合物で標識することができる。例えば、該プローブはビオチニル 化核酸を含んでよく、それにはアビジン複合体（例えば、ハツカダイコンペルオ キシダーゼ結合アビジン）が結合できる。放射性標識した核酸プローブも使用で きる。これらのプローブを核酸ハイブリダイゼーションアッセイに用いて、サン プル中のＲＥＴ1の変化レベルを検出できる。例えば、in situハイブリダイゼー ション、ＲＮＡアーゼプロテクションおよびノーザンブロット法を使用できる。 本発明で使用可能な他の標準的な核酸検出法は当業者に公知である（例えば、Au subelら,前掲載参照)。さらに、診断用分子が核酸である場合には、ＲＥＮＴ1特 異的プローブとの結合に先立ちそれを増幅させることができる。好ま しくはＰＣＲが用いられるが、リガーゼ連鎖反応(ligase chain reaction，LCR) 、連結活性化転写(ligated activated transcription，LAT)および核酸配列に基 づく増幅(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)法などの他の核 酸増幅法も使用可能である。 さらに、ＲＥＮＴ1−特異的核酸プローブを用いて、ＲＥＮＴ1核酸配列または ＲＥＮＴ1核酸配列の相同体の断片に関して、発現ライブラリーのごとき核酸ラ イブラリーから特異的な発現ポリペプチドクローンを検出することもできた。Ｒ ＥＮＴ1−特異的核酸プローブを用いて、適切な本発明の試験化合物を作製する のに用い得る化合物をランダムに形成させるのに用いられる発現クローン（例え ば、核酸ライブラリー由来のポリペプチドの発現）を検出することもできた。本 明細書に記載したごときrent1に特異的な抗体を用い、ｃＤＮＡ発現ライブラリ ーを、少なくとも１つのエピトープを有するrent1ペプチドに関して間接的にス クリーニングすることができる。かかる抗体はポリクローナルまたはモノクロー ナルの何れに由来するものであってもよく、ＲＥＮＴ1ｃＤＮＡの存在の指標と なる発現産物を検出するのに用いることができる。 本明細書で特に開示するのは、ヒトＲＥＮＴ1コーディング配列を含む全ｃＤ ＮＡおよびマウスＲＥＮＴ1を含む全ｃＤＮＡ配列である。相違がＮ最末端およ びＣ最末端で見られるが、Upf1pおよびＲＥＮＴ1の大きな中央領域（各々残基60 -853および121-917）は58％に一致と80％の保存を示す。さらに、rent1はヌクレ オチド結合にあずかり得るシステイン豊富ジンクフィンガー様ドメインを含むUp f1pに見出される推定される機能的エレメント、推定されるＮＴＰアーゼ活性を 有するドメインおよびヘリカーゼスーパーファミリ−Ｉのメンバーに共通な一般 的なモチーフの全てを含む最初に同定された哺乳類タンパク質である。 ＲＥＮＴ1のＮ末端はUpf1pでは見られないプロリン、グリシンおよびアラニン (ＰＧＡ)残基の全てから成る領域を含む。この領域の機能まだ知られていないが 、ＰＧＡ豊富なストレッチは直接的な転写レプレッサーとして働くことが判明し ている。また、高ＰＧ含量により強いられるらせ ん不安定化特性は、その分子の好適なコンホメーション与え得る。あるＰＧＡ豊 富領域を排除すれば、ＲＥＮＴ1とUpf1pの間で特定の一致が明らかになる。双方 とも比較的セリンとトレオニン（各々19対24％）および酸性残基（ＤまたはＥ； 各々22対18％）が豊富で、この特徴はトランス活性化または転写調節特性を持つ 核酸結合タンパク質によく見られるものである。両Ｃ末端はセリンおよびグルタ ミンが豊富（各々21対18％）であるが、ＳＱジペプチド(n=14)としてのこれら大 部分の残基の生産はＲＥＴ1に独特である。多くのＲＮＡ認識モチーフ(ＲＲＭ) 含有タンパク質は、ＲＮＡプロセッシングの複数の局面を調節することを前提と するグルタミン豊富領域を有している。ＲＥＮＴ1の分岐ＮおよびＣ末端配列の ＢＬＡＳＴ解析からは、ＲＮＡと相互作用し、そのプロセッシングを調節する複 数のタンパク質との相同性が明らかになる。これらには酵母のSis1熱ショックタ ンパク質(Ｐ=5.6e-07)、ビィ・ナプス(B．Napus)のGr10ＲＮＡ結合タンパク質( Ｐ=1.2e-04)、およびヒトまたはマウスＥＷＳＲＮＡ結合タンパク質(Ｐ=8.9e-03 )が含まれる(18-20)。 ＲＥＮＴ1をコードするポリペプチドには、図１のヌクレオチド配列(配列番号 １)、並びにその配列に相補的な核酸配列が含まれる。相補的配列にはアンチセ ンスヌクレオチドが含まれてもよい。該配列がＲＮＡである場合、図１のデオキ シヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＴは各々リボヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＵ に置き換えられる。また、少なくとも９個の塩基長である前記核酸配列の断片も 本発明に含まれ、それはその断片に図１のタンパク質をコードするＤＮＡ（配列 番号２）と生理学的条件下で選択的にハイブリダイズさせるに十分な長さである 。 本発明のＤＮＡ配列はいくつかの方法によって得ることができる。例えば、該 ＤＮＡは当該技術分野で十分に公知のハイブリダイゼーション法を用いて単離す ることができる。これらには、限定されるものではないが、1)相同な核酸配列を 検出するためのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのプローブとのハイブリダイ ゼーション、2)注目するＤＮＡ配列にアニーリング可能なプライマーを用いるゲ ノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ におけるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、および3)構造特性を分け持つクローン 化ＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングが含まれ る。従って、注目する遺伝子の部分ＤＮＡ配列が与えられると、当業者ならば過 度の実験を行うことなく全長ｃＤＮＡクローンの単離のためのプローブを調製す ることができよう(例えば、Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biolo gy，Units 6.3-6.4，Greene Publ.,最新版;Maniatisら，Molecular Cloning，Co ld Spring Harbor Laboratories，最新版参照)。 また、ＲＥＮＴ1をコードする特異的ＤＮＡ配列の開発も、1)ゲノムＤＮＡか らの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、2)注目するポリペプチドに対して必要なコドンを 提供するためのＤＮＡ配列の化学的製造、および3)真核生物供与細胞から単離し たｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡのin vitro合成によって行うことができ る。後者の場合、結局、ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ補体が形成され、これは一般に ｃＤＮＡと称される。 ＲＥＮＴ1をコードするＤＮＡ配列は適切な標的細胞へのＤＮＡ導入によってi n vitro、in vivo、またはex vivoで発現可能である。「標的細胞」とはそこで ベクターが増殖してそのＤＮＡを発現させるか、もしくはそこで組成物が次に続 く遺伝子発現のために細胞へ送達可能な細胞である。また、本用語は目的標的細 胞の後代の何れをも含む。複製中に突然変異が起こる可能性があるので、全ての 後代が親細胞と同一であるとは限らないことが理解される。しかしながら、かか る後代も「標的細胞」という語を用いる限りにおいて含まれると理解される。外 来ＤＮＡが宿主内で継続的に維持されることを意味する安定した導入法は、当該 技術分野で公知である。 本発明では、ＲＥＮＴ1ポリヌクレオチド配列を組換え発現ベクター構築体に 挿入すればよい。「組換え発現ベクター構築体」とはＲＥＮＴ1遺伝子配列の挿 入または組み込みによって操作されたプラスミド、ウイルスまたは当該技術分野 で公知のその他の伝達体をいう。かかる発現ベクターまたは構築体は、挿入され たその宿主の遺伝子配列の効果的な転写を 促進するプロモーター配列を含んでいる。該発現ベクターまたは構築体は典型的 には、複製起点、プロモーター並びに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特 異的遺伝子を含んでいる。本発明における使用に適するベクターまたは構築体と しては、限定されるものではないが、細菌での発現のためのＴ7ベース発現ベク ター(Rosenbergら，Gene，56:125，1987)、哺乳類細胞での発現のためのｐＭＳ ＸＮＤ発現ベクター(LeeおよびNathans，J．Biol．Chem.，263:3521，1988)およ び昆虫細胞での発現のためのバキュロウイルス由来ベクターが挙げられる。この ＤＮＡセグメントは調節エレメント、例えばプロモーター（例えば、Ｔ7、メタ ロチオネインＩまたはポリヘドリンプロモーター）に作動可能なように連結され るベクター中に存在し得る。「ドミナントネガティブ」とは、rent1ポリペプチ ドの正常形態と比べて低下している制御または支配効果を発揮するrent1ポリペ プチドの形態をコードする核酸配列を発現する発現ベクターまたは構築体の表現 型効果をいう。好ましい具体例では、該ドミナントネガテティブ表現型は正常re nt1タンパク質の機能を妨げる変異型rent1タンパク質の発現によって伝達される 。かかる効果は１対の相同染色体上に相同な遺伝子をコードする１対のアレルの 一方のアレルの優性の効果と同様であり、一方のアレルの表現型効果が他方のア レルに及ぼす有害な制御の影響を発揮する。 ＲＥＮＴ1をコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞または真核細胞の 何れかにおいて発現させることができる。宿主には、細菌、酵母、昆虫および哺 乳類生物が含まれる。原核生物で真核生物またはウイルスの配列を有するＤＮＡ 配列を発現させる方法は当該技術分野で十分に公知である。生物学的な機能を持 ち、標的細胞で発現および複製できるウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクター は当該技術分野で十分に公知である。かかるベクターを用いて、本発明のＤＮＡ 配列が組み込まれる。 組換えＤＮＡでの標的細胞の形質転換は、当該技術分野で十分公知である定法 によって行えばよい。標的がイー・コリ(E．coli)などの原核生物である場合、 ＤＮＡ取り込み能力を持つコンピテント細胞は、指数増 殖期の後に回収された細胞から調製し、次いで当該技術分野で十分に公知の手法 を用いるCaCl₂法により処理することができる。別法として、MgCl₂またはRbClも 用いることができる。また、所望により標的細胞のプロトプラストを形成した後 に、形質転換を行うこともできる。 標的細胞が真核生物である場合、リン酸カルシウム供沈殿のようなＤＮＡトラ ンスフェクション法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リ ポソームまたはリポソーム組成物、もしくはウイルスベクターに封入されたプラ スミドの挿入のごとき従来の機械的手法を用いてよい。また、真核細胞を本発明 のrent1をコードするＤＮＡ配列および単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子の ような選択可能マーカーをコードする第二の外来ＤＮＡ分子で同時形質転換する こともできる。もう１つの形質転換法としては、シミアンウイルス40(ＳＶ40)ま たはウシパピローマウイルスのような真核ウイルスベクターを用いて、真核細胞 に一時的に感染させるか、または形質転換させ、次いでタンパク質を発現させる ことである(例えば、Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laborato ry，Gluzman編，1982を参照)。 本明細書の実施例６で例示するように、rent1は試験された全ての成人ヒト組 織で発現されるが、組織に特異的なレベルの発現においては顕著な多様性が存在 する。当業者ならば、より多くの組織に由来するサンプルを加えることにより、 またマウスにおける種々の発達段階にて発現を評価することにより、rent1発現 についての調査を拡張することができる。また、当業者ならば、種々の組織にお ける、また種々の発達段階にてＮＭＲＤの欠損とrent1発現のレベルを相関させ ることも可能である。これは、β-グルクロニダーゼをコードする普遍的発現遺 伝子のエキソン10(12のうち)にＲＴＣを担持するマウス系統(gus^mps)を用いたノ ーザンブロットおよびin situハイブリダイゼーション解析の併用によって達成 できる(SandsおよびBirkenmeier，1993)。β-グルクロニダーゼのｍＲＮＡレベ ルはgus^mps/gus^mpsマウスでは200倍以下まで低下する。gus^mps/+マウスでは、定 量的ＲＴ-ＰＣＲ/ＡＳＯハイブリダイ ゼーションプロトコールを用いてβ-グルクロニダーゼｍＲＮＡ全プールに対す る野生型および変異型アレルの相対寄与度を決定することができる(Dietzら，19 93a)。５つの発達段階を標的とすることができる：10.5pc日｛Witschiステージ( ＷＳ)25]、16.5pc日(ＷＳ35)、誕生(ＷＳ36)、７日(幼体)、30日(成体)。（ＮＭ ＲＤ欠損のマーカーとしての）野生型および変異型β-グルクロニダーゼｍＲＮ Ａの相対存在量は初期の全胎児について求めることができる。組織特異的パター ンそれより後の全ての発達段階で評価することができる。in situハイブリダイ ゼーション（初期胎児）またはノーザン解析（後記胎児以降）を用いて、これら の結果をrent1の発現レベルと相関させることができる。さらに当業者ならば本 明細書の技術を用いて、rent1内のＮ末端エピトープに対する単一特異性抗体を 作製することができる。当業者は、細菌で融合タンパク質を作出することができ る(各々PharmaciaからのＧＳＴまたはＭＢＰ、またはＮＥＢベクターと結合させ たrent1のエピトープを用いる)。得られたペプチドはペプチド抗血清の作製およ びアフィニティー精製に用いることができる。次いで特異的抗体をウエスタン解 析および免疫組織化学に用いて、rent1タンパク質発現が転写物の発現と並行し ているかどうかを調べることができる。 哺乳類ＮＭＲＤが核および細胞質成分の双方を持っていれと仮定した。本明細 書の技術を用いて、rent1の細胞下位置の決定を確立することができる。ＨＡ-タ グとＲＥＮＴ１の間の融合タンパク質をコードするｐＨＡ-ＲＥＮＴ１発現ベク ターは、ＤＥＡＥ-デキストラン法を用いて、Cos-7細胞に一時的にトランスフェ クトすることができる。免疫組織化学的解析は、転写後48時間で行うことができ る。3.5％パラホルムアルデヒド中での固定および0.1％ノニデット(Nonidet)Ｐ- 40中での透過化の後、細胞を一次抗体(抗-ＨＡ 12ＣＡ5．Boehringer Mannhein) の1:100希釈液中でインキュベートし、次いで二次抗体（抗マウスIgGフルオレセ イン複合体，ＢＭ）の１：２００希釈液中でインキュベートすることができる。 二次インキュベーションの最後10分間に、１μｌのＤＡＰＩ(1ｍg/ml)を加えて 核をマークすることができる。染色は蛍光顕微鏡により視覚化可能である。無効 トランスフェクト細胞（ｐＨＡ挿入されず）および未トランスフェクト細胞を陰 性対照として全ての実験区を通じて行い得た。 本発明によって提供された微生物発現rent1ポリペプチドまたはその断片もし くは保守的変異体の単離および精製は、分取クロマトグラフィーおよびモノクロ ーナルまたはポリクローナル抗体に関する免疫学的分離を始めとする定法により 行ってよい。 また、本発明のrent1ポリペプチドを用いて、rent1ポリペプチドのエピトープ に免疫反応する、または結合する抗体を作製することもできる。異なるエピトー プ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体、および異なるモノクローナ ル抗体調製物から実質的に成る抗体が提供される。モノクローナル抗体は当該技 術分野で十分に公知の方法によって、rent1タンパク質の断片を含む抗原から作 製される(Kohlerら，Nature，256:495，1975;Current Protocols in Molecular Biology，Ausubelら編，1989)。 「抗体」には本発明で用いる場合、完全な分子、並びに抗原決定基に結合でき るFab、Fab'、F(ab')₂、およびＦυのごときその断片が含まれる。これらの抗体 断片は、その抗原または受容体に選択的に結合する能力を幾分か保持しており、 以下のように定義される。 (1)抗体分子の１価抗原−結合断片を含む断片であるFabは、酵素パパインを用 いた全抗体の消化により作製でき、完全な軽鎖およびある重鎖の一部をもたらす 。 (2)抗体分子の断片であるFab'は、ペプシンでの全抗体の消化、それに次ぐ還 元により得られ、完全な軽鎖および重鎖の一部をもたらす。２つのFab_'断片は抗 体分子毎に得られる。 (3)続いて還元をしない酵素ペプシンでの全抗体の処理により得ることができ る抗体断片、(Fab')₂。(Fab')₂。は２つのジスルフィド結合により共に保持され る２つのfab'断片の二量体である。 (4)２本の鎖として発現する種々の軽鎖領域および種々の重鎖領域を 遺伝的に操作された断片と定義されるＦυ、および (5)遺伝的に融合した一本鎖分子としての適切なポリペプチドリンカーに連結 した軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝的に操作した分子と定義される 一本鎖抗体("SCA")。 これらの断片を作製する方法は当該技術分野で公知である。（例えば、出典明 示して本明細書の一部とみなされるHarlowおよびLane，Antibodies:A Laborator y Manual,Cold Spring Harbor Laboratory，New York（最新版）参照。） 本発明で用いる場合「エピトープ」とは、そこに抗体のパラトープが結合する 抗体上の抗原決定基の何れをも意味する。抗原決定基は通常、アミノ酸または糖 側鎖のごとき化学的に活性な表面分子グループから成り、通常は特異的な三次元 構造、並びに特異的な変異特性を有する。 本発明のrent1ポリペプチドに結合する抗体は、免疫感作抗原として注目され る全ポリペプチドまたは小ペプチドを含む断片を用いて調製することができる。 動物を免疫感作させるのに用いられるポリペプチドまたはペプチドは、ｃＤＮＡ の翻訳または化学合成から誘導することができ、所望により担体タンパク質に結 合させることが可能である。該ペプチドに化学的に結合させられる、よく用いら れるかかる担体には、カサガイヘモシアニン(ＫＬＨ)、チログロブリン、ウシ血 清アルブミン(ＢＡＳ)および破傷風トキソイドが含まれる。次いで結合したペプ チドを用いて動物（例えば、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジまたはウサギ）を免 疫感作させる。 所望であれば、例えばそのポリペプチドまたはそれに対して抗体が作製される ぺプチドが結合するマトリックスに結合させさらにそこから溶離させることによ り、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体をさらに精製することができる。 当業者ならば、ポリクローナル抗体、並びにモノクローナル抗体の精製および／ または濃縮に関しての免疫学的技術において一般的な種々の技術のついての知識 があるであろう(例えば、参照として組み込まれるColiganら，Unit 9，Current Protocols in I mmunology，Wiley Interscience，最新版参照)。 また、抗−イディオタイプ技術を用いて、エピトープを模擬するモノクローナ ル抗体を作製することもできる。例えば、一次モノクローナル抗体に対して作製 された抗−イディオタイプモノクローナル抗体は、該一次モノクローナル抗体が 結合するエピトープの「イメージ」である超可変領域に結合ドメインを持つと考 えられる。 本発明は、正常細胞での発現とは異なる様式で発現可能なヌクレオチド配列を 同定し、従って、この配列に対して指定される適当な治療技術または診断技術を 計画することができる。かくして、疾患がＲＥＮＴ1の発現の変化に関連する場 合、転写または翻訳レベルでrent1発現を変調する核酸配列を用いることができ る。かかる変調は阻害また促進の何れかであり得る。このアプローチは、例えば 、アンチセンス、ミスセンスまたはナンセンス核酸およびリボザイムを利用して 、アンチセンス核酸でそのｍＲＮＡをマスキングすることによるか、またはリボ ザイムで切断することによるかの何れかで、ＲＥＮＴ1ｍＲＮＡの翻訳をブロッ クすることができる。かかるＲＥＮＴ1疾患には、有害な過剰ナンセンスアレル が細胞内で安定化される疾患、例えば未熟加齢や種々の癌が含まれると考えられ る。 ＲＥＮＴ1遺伝子はヒト遺伝子治療に用いることができる。機能の一部を切断 したタンパク質をコードするナンセンスアレルを含む遺伝子を担持する細胞は、 rent1の発現または機能を低下させるか、もしくは消失させる構築体でトランス フェクトすることが可能である。システイン繊維症のような特定の疾病の場合、 結果として生じた転写物の安定化および切断タンパク質の発現増加が疾患の症状 を減じるのに十分であると考えられる。 逆に、ＮＭＲＤにおけるrent1の発現または機能を実質的に増強する構築体は 、部分的に機能する切断タンパク質の発現をさらに減じる可能性がある。マルフ ァン症候群のような優性的に発現する特定の疾患の場合、これらの切断タンパク 質がさらに減少することが疾病の症状を減じるま たは消失させる可能性がある。 ＲＥＮＴ1遺伝子およびrent1タンパク質は、問題の遺伝子に関する先行知見を もって、未知のヒト遺伝子の発見に用いることができる。本発明の１つの明示に おいては、ナンセンス突然変異を含む遺伝子または遺伝子群によって引き起こさ れていることが疑われる特定の表現型を提示する個体から細胞を単離する。これ ら細胞のサブセットを、その細胞内のrent1の発現または機能を減じる、もしく は消失させる様式（遺伝子構築体で細胞をトランスフェクトするなど）で処理す る。かくしてこれらの細胞中にナンセンス突然変異を含むｍＲＮＡのレベルは、 より高いレベルまで上昇されるであろう。ｍＲＮＡのディファレンシャル・ディ スプレイの標準法またはｃＤＮＡによく適用される遺伝子サブトラクション法を 用いて、ナンセンス突然変異を含むｍＲＮＡを豊富にし、次いで、元の細胞のｍ ＲＮＡ集団と切断細胞のｍＲＮＡ集団を比較することにより単離してrent1活性 を消失または減じることができる。 部分的に機能する切断タンパク質をコードするナンセンスアレルを担持する細 胞は、ＲＥＮＴ1のドミナントネガティブ形態をコードする構築体でトランスフ ェクトすることができる。その変異型転写物が細胞の表現型を安定化さたかどう かは、ＲＮＡおよびタンパク質定量、並びに生物機能アッセイによって調べるこ とができる。加えて、ＮＭＲＤの崩壊は選択された細胞の表現型を救い、またＮ ＭＲＤの操作は新規な疾患遺伝子を同定するので、問題の疾病遺伝子に関する何 れの先行知見をも仮定することなく、ＮＭＲＤの阻害の後、差し引きハイブリダ イゼーション法を用いて調製されない転写物について豊富にすることができる。 さらに、治療目的のためにＮＭＲＤ経路を利用することができる。ＮＭＲＤの操 作によるナンセンス転写物の安定化の際、選択された切断タンパク質産物は疾病 表現型を救うと想定されるそれらの十分な機能にを保持すると考えられる。また 、いくつかの未知の疾病遺伝子を発現するとこが予想される培養患者細胞におけ るＮＭＲＤのダウンレギュレーションが、ナンセンス転写物の存在量に劇的な増 大をもたらし得る。その表現型が未熟 終結コドン(ＰＴＣ)によって引き起こされる場合、次いで、未操作および操作患 者細胞由来のＲＮＡを用いる差し引き法が、転写物を顕著に富ませ、かくして疾 病遺伝子の同定が可能になる。当業者ならば細胞ラインの遺伝子産物をそれ自身 と比較することにより、細胞（すなわち、かかる技術を用いて患者細胞ラインを 対照個体由来のものと比較した場合に生じる非疾病ｍＲＮＡで示された）由来の 「ノイズ」のほとんどを消去し、かくして特異的遺伝子およびアレルの同定を可 能にする。当業者ならば、かかる差し引き法を適用して、複合体多遺伝子疾患ま たは稀な表現型に関与する遺伝子および変異型アレルを同定することができる。 アンチセンス核酸とは、特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部と相補的なＤＮ ＡまたはＲＮＡ分子である(Weintaub，Scientific American，262:40，1990)。 細胞において、アンチセンス核酸は相当するｍＲＮＡとハイブリダイズして二本 鎖分子を形成する。細胞は二本鎖であるｍＲＮＡ翻訳しないので、アンチセンス 核酸はそのｍＲＮＡの翻訳を妨害する。約15個のヌクレオチドのアンチセンスオ リゴマーは容易に合成され、また標的rent1生産細胞に導入される場合に、より 大きい分子よりも問題を引き起こすことが少ないようなのでこれが調製される。 遺伝子のin vitro翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は、当該技術分野 で十分に公知である(Marcus-Sakura，Anal．Biochem.，172:289，1988)。 リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似の様式で、他の一本鎖Ｒ ＮＡを特異的に切断する能力をプロセッシングするＲＮＡ分子である。これらの ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾を通じて、ＲＮＡ分子中の特異的ヌ クレオチド配列を認識し、それを切断する分子を工作することができる(Cech，J ．Amer．Med．Assn.，260:3030，1988)。このアプローチの主な優位点は、それ らが配列特異的であるので、特定の配列を伴うｍＲＮＡだけが不活性化されると いうことである。 特に本出願において出願者らは、原核生物で同定されている自然発生する調節 相補性ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の特性を選択して利用している。全 ては高ＧＣ含量の3'ヘアピンを持つ分子をフランクする安定した大きなステムル ープ構造を有し、かつ全てが高レベルで発現する。この構造特性は分子に高い安 定性を付与すると確信されている。またこれら全ての特性は、全ての哺乳類細胞 の核に豊富で安定な哺乳類スプライソソーム複合体の必須成分であるsnRNAでも 見られる。Ｕ1は核内に豊富で、核質内に広く分散し、また豊富に発現するので 、Ｕ1 snRNAがキメラアンチセンスｃＲＮＡの構築のためのフレームワークとし て選択されている。アンチセンスターゲティングコアが２つのヘアピン間のＳｍ タンパク質結合部位に置換される。このコアは、自己触媒性ハンマーヘッドリボ ザイムループによりその中央を分断された、標的メッセージと直接的な相補性を 持つ30-35塩基対の配列を含む。二重らせんの形成は該リボザイムをリボザイム 切断に関するＧＵＣまたはＧＵＡ共通部位と一直線に並べると予測される。該コ アがフィブリリン-1ｍＲＮＡに相補的な配列を含んでいた場合、強力かつ構成的 活性を持つＵ1プロモーターの転写制御の下でのキメラｃＲＮＡの発現は、安定 的にトランスフェクトされた細胞においてフィブリリン-1タンパク質およびメッ セージが完全に無くなるという結果をもたらした。他のタンパク質および転写物 を調査したところ異常は認められず、このことはアンチセンス阻害の特異性を証 明するものである。アンチセンスを用いる標的ＲＥＮＴ1転写物に対する発現構 築体は図３に示される。 また本発明はrent1タンパク質が介在する障害に関する遺伝子送達および遺伝 子発現を提供する。このような遺伝子送達および遺伝子発現は、細胞中のＲＥＮ Ｔ1ｍＲＮＡのレベルを変化させることによりその有益な効果を達成する。これ は、ＮＭＲＤのファンクションを調整するために、標的細胞に対するＲＥＮＴ1 アンチセンスの送達および発現、もしくは標的細胞に対する異種ＲＥＮＴ1核酸 の送達および発現を必要とし得る。ＲＥＮＴ1核酸の送達および発現は、当業者 に公知の種々の手段によって達成することができる。好ましい手段は、キメラウ イルス等の組換え発現ベクター、またはコロイド分散系を用いるものである。ア ンチセンス配列 の治療的送達のため特に好ましいのは、特定細胞または受容体について標的化さ れ得るリポソーム含有組成物、リポソーム組成物、もしくはリポソーム様薬剤の 使用である。本明細書で教示したように遺伝子治療に利用できる種々のウイルス ベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好 ましくはレトロウイルス等のＲＮＡウイルスが挙げられる。 ＲＥＮＴ1アンチセンスポリヌクレオチドのための別の標的送達系はコロイド 分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイク ロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型乳濁剤、ミセル、混合ミセルおよびリポ ソームまたはリポソーム組成物を始めとする脂質を基礎とする系が挙げられる。 本発明の好ましいコロイド系は、リポソームまたはリポソーム組成物である。リ ポソームまたはリポソーム組成物とは、人工膜小胞、または他の組成物と複合化 可能なリポソーム組成物を含有する組成物である。これら組成物は正味の陽イオ ン、陰イオンまたは中性電荷の特性を有し、これはin vitro、in vivoおよびex vivo送達法にとって有用な特性である。 0.2〜0.4μｍの範囲の大きさの大きい単層小胞(large unilamellar vasicles ，LUV)は、大きな高分子を含有する水溶性緩衝液を相当な割合封入することが可 能である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび完全なビリオンを該水溶性内容物内に封入し、 生物学的に活性を持つ形態で細胞へ送達することができる(Fraleyら，Trends Bi ochem．Sci.，6:77，1981)。さらに、非膜結合リポソーム組成物を核酸の送達お よび発現のために用いることができる(Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413，1987)。哺乳動物細胞の他、植物、酵母および細菌細胞において、リ ポソームまたはリポソーム組成物がポリヌクレオチドの送達に用いられている。 リポソームまたはリポソーム組成物が、遺伝子導入伝達体として効果的であるた めには、以下の特性がなければならない：(1)目的の遺伝子を、それらの生物学 的活性を損なうことなく、高効率で封入すること、(2)非標的細胞に比べ標的細 胞に選択的かつ相当量結合すること、(3)検出可能な 生物学的効果を得ることができるレベルで遺伝子を発現させることができる機能 状態で、組成物の核酸または小胞の水溶性内容物を高効率でかつ分解することな く標的細胞の細胞質へ送達すること、および(4)送達された遺伝子情報を正確か つ効果的に発現すること(Mannioら，Biotechniques,6:682，1988)。 組換え発現ベクターでの使用のための十分に特徴付けられた「オン／オフ」ス イッチは、抗生物質（テトラサイクリン）調節プロモーター系である。かかる系 の構築のための手段は当該技術分野で十分に公知であり、この点に関する総説と して当業者にはFurthら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:9302-9306，1994を 参照して欲しい(トランスジェニックマウスにおける遺伝子発現のテトラサイク リン調節制御)。 さらに、これは特に、本発明の方法に従いＲＥＮＴ1活性を増強または低下さ せたＮＭＲＤ系に及ぼす影響を予測するトランスジェニック動物モデルを開発し 得る。かかるrent1トランスジェニック動物を作出する際に有用なプロトコール は以下に記載される。概してこのプロトコールは哺乳動物へ発現可能な導入遺伝 子を導入するための従来方法に従う。当業者はこれらの応用に精通し、過度の実 験を行うことなく本発明の文脈に添った技術を適用することができよう。 例えば、種々の発達段階の胚標的細胞を用いて導入遺伝子を導入することがで きる。胚標的細胞の発達段階に応じて種々の方法が用いられる。接合子がマイク ロインジェクションのための最良の標的である。マウスでは、雄前核は直径およ そ20マイクロメーターの大きさに達し、これは1-2plのＤＮＡ溶液の再現性ある 注入を可能にする。遺伝子導入のための標的としての接合子の使用は、ほとんど の場合で第一分裂の前に注入ＤＮＡが宿主遺伝子に組み込まれるいう主要な利点 を有する(Brinsterら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:4438-4442，1985)。結 果として、トランスジェニック非ヒト動物の全ての細胞が組み込まれた導入遺伝 子を保持する。一般に、その生殖細胞の50％が該導入遺伝子を担持するので、創 始細胞の後代への導入遺伝子の効率的な伝達にも反映される。接 合子のマイクロインジェクションが本発明を実施する際の導入遺伝子を組み込む ための好ましい方法である。 またレトロウイルス感染を用いて、導入遺伝子を非ヒト動物に導入することも できる。発達中の非ヒト胚は胚盤胞段階までin vitroで培養することができる。 この期間中、分割球がレトロウイルス感染の標的となり得る(Jaenisch，Proc．N atl．Acad．Sci．USA，73:1260-1264，1976)。分割球の効率的な感染は、酵素処 理を行い透明帯を除去することにより得られる(Hoganら，Manupulating the Mou se Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. ，1986)。導入遺伝子を導入するために用いられるウイルスベクター系は、典型 的には、導入遺伝子を担持する複製欠陥レトロウイルスである(Jahnerら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，82:6927-6931,1985;Van der Puttenら,Proc．Natl．A cad．Sci．USA，82:6148-6152)。単層のウイルス産生細胞上で分割球を培養する ことにより、トランスフェクションは容易かつ効率的に行うことができる(Van d er Puttan，前掲;Stewardら，EMBO J，6:383-388，1987)。 別法として、より後期の段階で感染を行うこともできる。ウイルスまたはウイ ルス産生細胞を分割腔に感染させることができる(Jahnerら，Nature，298:623-6 28，1982)。組み込みはトランスジェニック非ヒト動物を形成したサブセットの 細胞でしか起こらないので、ほとんどの創始細胞は導入遺伝子に関してモザイク 状であると考えられる。さらに、該創始細胞は後代において一般に分離するであ ろうゲノム中の種々の位置に導入遺伝子の種々のレトロウイルス挿入部を含むと 考えられる。加えてまた、妊娠中期の胚の子宮内レトロウイルス感染によってた とえ低効率ではあっても、導入遺伝子を生殖系に導入することも可能である(Jah nerら，前掲，1982)。 異種ＲＥＮＴ１核酸配列の導入のための第三のタイプの標的細胞は、胚幹細胞 (ＥＳ)である。ＥＳ細胞はin vitroで培養し、胚と融合した着床前の胚から得ら れる(Evansら，Nature，292:154-156，1981;Bradleyら， Nature，309:255-258，1984;Gosslerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83:9065 -9069，1986;およびRobertsonら，Nature，322:445-448，1986)。導入遺伝子は ＤＮＡトランスフェクションによって、もしくはレトロウイルス介在形質導入に よって、ＥＳ細胞に効率的に導入することができる。これらの形質転換ＥＳ細胞 はその後、非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わせることができる。該ＥＳ細胞は その後、胚コロニーを形成し、得られたキメラ動物の生殖系に寄与すると考えら れる(例えば、Jaenisch，Science，240:1468-1474，1988を参照)。 ＲＥＮＴ１導入遺伝子の構築は、本明細書のＲＥＮＴ１ヌクレオチド配列に関 する教示を用いて当業者により実施することができる。当業者ならば、ネズミRn t1遺伝子の標的化された崩壊によってマウスのＮＭＲＤ経路を「ノックアウト」 することができる。これは、標準法を用いたネズミ胚幹(ＥＳ)細胞における相同 組換えによって達成できる。Rnt1の標的化崩壊の臨床上および細胞での結果は、 近交系、多くの未定義ナンセンス対立遺伝子を持つ系統、およびそれを定義する ための既知の変異遺伝子型の系統を含む複数の遺伝的バックグランドで検討し得 る。(a)Rnt1の標的化崩壊はＮＭＲＤロス・オブ・ファンクションをもたらし得 る、(b)ＮＭＲＤロス・オブ・ファンクションは表現型を生じ得る(すなわち、ノ ックアウト表現型の創生)、(c)ＮＭＲＤのロスは「生理学的に」身体に獲得され た、または遺伝したナンセンス対立遺伝子から転写産物の安定により発現させる ことができるタンパク質の効果を明らかにする。 相同組換えによって標的するＲＥＮＴ１遺伝子のためのベクターを用いること により、トランスジェニックネズミ細胞を作出することができる。該ベクターは ネズミＲＥＮＴ１遺伝子の大きなゲノム断片を含んでいる。３つのエキソンを欠 失させ、次いでネオマイシン耐性発現カセットと置換することができる。チミジ ンキナーゼ遺伝子を相同な長腕の末端に挿入して、良好な相同組換えの選択を補 助することができる。ネズミＳＶ/129細胞のトランスフェクションおよび安定し た選択により、ある不活性化ＲＥＮＴ１対立遺伝子を担持する細胞のクローナル コロニーの同定が 可能になる。これらの細胞をマウス胚盤胞に注入してキメラを作出することが可 能である。キメラを繁殖させて標的とする対立遺伝子に対して異型接合となる動 物を得ることができる。最終的には、異型接合体を繁殖させて同型接合体を作出 することができる。特徴的な表現型を有するマウスを、ＮＭＲＤのロスしたマウ スを作ることができる。ディフェレンシャルディスプレイ、ＳＡＧＥ、または他 の方法により、ＮＭＲＤの不在下でアップレギュレーションされた転写産物の同 定を可能にする。このようにして、マウス疾病遺伝子を同定することができる。 次いで、マウス疾病遺伝子のヒト相同体が同様のヒト表現型に関わるか否かを決 定することができる。次いで必要であれば、内生遺伝子の相同組換えに基づく標 的化に関する同一のアプローチを培養されたヒト細胞にも用いることができる。 これには、両対立遺伝子を標的するために、異なる選択可能マーカーを用いる第 二段階のトランスフェクションおよび選択が必要とされる。ヒト培養細胞におい て、当業者がＲＥＮＴ１の発現を完全に阻害できるようにするためには、ネズミ 細胞に対して先に全て他の目的で使用した方法を微修正するだけでよい。かかる トランスジェニック構築の方法の１つの実施例が下に記載されている。しかしな がら、この実施例は当業者によく知られた他のトランスジェニック構築を用いる こともできるので、限定を意図するものではない。 1.2kbのPol II-ネオマイシン耐性カセットのRnt1遺伝子の初期エキソンへの挿 入により、フレーム内未熟終結コドン(ＰＴＣ)が作出され、ＲＥＮＴ１に関する 翻訳リーディングフレームが崩壊する。初期エキソン内のＰＴＣの挿入は、ＲＥ ＮＴ１の本体およびＣ末端の翻訳を妨げ、結果としてファンクションの完全なロ スをきたすと考えられる。別の戦略としては、翻訳の開始部位を消失する一番初 めのエキソンを標的とすることでるが、しかしながらこれには転写を損なう可能 性があり、ノックアウトマウスのラインにおいて、完全ＮＭＲＤの潜在的に有用 なマーカーとして標的化Rnt1転写産物の安定性を評価する能力が予め除外される 。またＮ末端エピトープも、切断タンパク質がノックアウト対立遺伝子由来の安 定 化された転写産物から発現させるかどうかを決定するのに用い得る。 ターゲッティングベクターの構築 ネズミＲＮＴ1ｃＤＮＡの大断片、第二 の推定ヌクレオチド結合モチーフからＮＴＰアーゼ活性を付与する第一のモチー フにわたる(-20kb)ネズミ(129/Sv)ゲノムクローンをクローン化し同定する。プ ラスミドベクター(pBlueprint II-SK)への比較的大きな(6-12kb)制限断片のサブ クローニングの併用により、該クローンの詳細な制限地図およびイントロン−エ キソン境界の位置を決定し、サザントランスファーおよびｃＤＮＡプライマーを 用いるｃＤＮＡ配列に相補的な放射性標識オリゴヌクレオチドのゲノムサブクロ ーンの直接的配列決定を伴うハイブリダイゼーションを行うことができる。続い て、目的とするエクソンを含む(6-12kb)ゲノム断片を用いてターゲッティングベ クターを構築し、適切なプラスミドにサブクローニングした。好ましくは、該エ クソンは該挿入部に幾分非対称に位置し、各末端に最低２kbの配列を有する(Den gおよびCapecchi，1992)。5'および3'末端の挿入部を直接フランクするゲノム配 列は、後に相同組換えを確認するサザン解析においてプローブとして使用される ために保持される。1.2kb Pol II-ネオマイシン耐性発現カセット(Wangら，1995 )は適当な制限部位を用いて注目するエキソンへ挿入される。PGKtk発現カセット は相同な長腕に対して遠位に付加してＦＩＡＵ選択により相同組換え体を富化す る(Liら，1992;Andrikopoulosら，1995)。得られた構築産物を線状化し、CsCl₂ 超遠心分離によってバンド精製する(Wangら，1995)。ＲＥＮＴ１配列を用いるタ ーゲッティングベクターは図１０に図示されている。 さらに、当業者により培養体細胞での標的化遺伝子送達における効率の最近の 進歩が使用され得る。簡単には、プロモーターを持たない、抗生物質耐性因子を コードするｃＤＮＡをべクターを標的化するために用いて、相同組換えにより標 的化対立遺伝子のプロモーターによって発現を生じさせることができる。従来法 に比べ5,000〜10,000倍までの富化率（相同組換え、対、ランダムな挿入）が達 成でき(HansonおよびSedivy，1995)、かくして、異なる選択可能遺伝子を含む２ 種のターゲッテ ィングベクターを用いた連続遺伝子標的化により、両対立遺伝子を効率的に不活 性化する。 標的化マウスの作製： 129/Sv胚盤胞の内部の細胞塊に由来するPluripotent J1 ES細胞を標準的な条件下で培養する(Liら，1992)。Bio-Rad Gene Pulserを用 いた230ｍＶ、500μＦでのエレクトロポレーションにより、およそ1x10⁷細胞を1 0-20μｇの線状化構築物でトランスフェクトし、5％ＦＢＳ、0.1ｍＭ非必須aa、 0.1ｍＭ βＭＥ、および1000U/ｍｌ白血病阻害因子で補足したデルベッコの改変 イーグル培地中で、ガンマ線照射Ｇ418耐性一次マウス胚繊維芽細胞のフィーダ ー層上で再びプレーティングする(Liら，1992)。プレーティングの24時間後、Ｇ 418およびＦＩＡＵでの選択を開始し、7〜10日間維持する。各耐性コロニーのア リコート(約90％)をその後の使用のために冷凍し、残りは再度プレーティングし てＤＮＡ抽出のための群と成るまで増殖させる。組換えクローンの同定は、サザ ン解析によって達成され、ネオカセットの単一のEcoR1部位によって容易となり 、相同配列をフランクするプローブを上記のように遺伝子ターゲッティングに使 用する。5'フランクプローブを用いて標的化対立遺伝子に独特な制限断片を検出 する。続いて、陽性のクローン全てからのＤＮＡを3'プローブを用いてスクリー ニングして最良の相同組換えを確認する(Wangら，1995)。+/+および+/-コロニー から抽出したＲＮＡについてノーザン解析を行う。Rnt1ＲＮＡのハイブリダイズ 種の大きさおよび存在量を測定することにより、当業者は、Rnt1についての半数 不足状態(haplo-insufficiency state)のＮＭＲＤの効率に対する影響に関して 初期の有益な情報を得ることができる。ノーザン解析に用いられるｃＤＮＡプロ ーブはネオ挿入部位にわたっておらず、完全および標的化対立遺伝子に対して同 等に十分ハイブリダイズしなければならない。さらに、転写速度および転写産物 の安定性は、新たな転写を阻害するためのアクチノマイシンＤ(5μｇ/ｍｌ)の添 加後、種々の間隔で抽出したＲＮＡの核ラン−オン解析およびノーザンまたはＲ Ｎアーゼプロテクション解析を用いて決定することができる(Urlaubら，1989;Ch eng およびMaquat，1993)。これらのパラメーターは、転写産物の大きさの違いを観 察することにより、またはRnt1およびネオ配列の双方を含む融合プローブを用い ることにより、対立遺伝子特異性に基づいて決定することができる。 各標的化ＥＳ細胞クローン由来のおよそ15細胞を交尾後3.5日目に回収した各 Ｃ57Ｂ1/6Ｊ胚盤胞(約15)にマイクロインジェクトする。キメラの後代をアグー チ（ＥＳ由来）外被色によって同定する。雄のキメラをＣ57Ｂ1/6Ｊ雌と交配さ せる。標的化対立遺伝子についての同型接合体は、異型接合体の育種により作出 される。マウスの遺伝子型は全て、サザン解析またはＰＣＲに基づくアッセイに より決定する。 得られたマウスの同定： 全ての開始マウスの遺伝子補体は、十分に同定され た２つの近交系の遺伝子型のみから成っている。従って、ネズミゲノムは標的化 Rnt1対立遺伝子以外の欠失劣性ナンセンス対立遺伝子を持たない。全新生マウス の一腹仔数、性比および遺伝子型を用いて胚致死率をモニターする。３つの遺伝 子型（+/+、+/-および-/-）全てのマウスを、誕生時の体重、成長、活動、並び に先天的異常性もしくは獲得異常性を含む何れの表現型の差異に関しても経時的 に注意深く調べる。生存能力のないマウスについては解剖を行う。 ３つの遺伝子型全てのマウスについて分子解析を行う。まず、ノーザン解析お よびＲＮアーゼプロテクションによって、Rnt1転写産物の特徴および定常レベル を求める。次に、ウエスタン解析および免疫組織化学によって反応性タンパク質 のレベルおよび分布を求める。同様の実験を行い、対立遺伝子特異的Rnt1転写速 度および転写産物の安定性を求めることができる。全ＲＮＡ、核ＲＮＡおよび細 胞質ＲＮＡについて同時に解析を行う（DaarおよびMaquat，1988)。最後に、ナ ンセンス転写産物安定性をＲＥＮＴ１欠損マウスでアップレギュレートし、胎児 繊維芽細胞培養物を樹立し、野生型ＲＥＮＴ１を発現する構築物でトランスフェ クトして、ＲＥＮＴ１での再構成が異常な表現型を救えるか否かを決定する。 同型接合のない(+)マウスの異型交配およびさらなる実験： 異なる遺 伝的バックグランドにおけるＮＭＲＤロス・オブ・ファンクションの表現型結果 を調べるために、以下の育種実験を行うことができる： (1)ネズミムコポリサッカリドシスＶII型（ヒトSly症候群に類似）は、β-グル クロニダーゼ遺伝子における自然突然変異(gus^mps)によって引き起こされる常染 色体劣性障害である。異型接合マウスはJackson Laboratoryから市販されている 。該遺伝子産物はリソソームにおけるグリコサミノグリアレースの分解に必要と され、同型接合変異マウスはライフスパンの短縮を引き起こす発達異常、骨格異 常および心臓異常を示す。gus^mps突然変異は最近、同じエキソンでＰＴＣを引き 起こすエキソン10（12のうち）における1bpの欠失として特徴付けられた(Sands およびBirkenmeier，1993)。β-グルクロニダーゼｍＲＮＡレベルは、gusmps/gu smpsマウスで約200倍だけ低下し、免疫反応タンパク質は検出されない。β-グル クロニダーゼが全ての組織で、発達段階を通じて発現すれば、当業者ならば(gus mps/+、Rnt1+/+)マウスにおけるgusmps対立遺伝子に由来する転写産物の発達段 階特異的、および組織特異的な相対安定性を求めることができる。その結果はre nt1組織特異的発現パターンと比較して、ＲＥＮＴ１のレベルが組織特異的ＮＭ ＲＤの効率の決定における制限因子であるか否かを決定することができる。さら に、Gus^mps/+マウスをRnt1+/-またはRnt1-/-マウスの何れかと交配させる（同型 接合体の活性および繁殖力に依存)。得られた(gus^mps/+、Rtn1+/-)マウスを交配 させて、尾部ＤＮＡ遺伝子型決定によって決定されるごとくに(gus^mps/+、Rtn1- /-)、(gus^mps/gus^mps、Rtn1-/-)および(gus^mps/gusmp゜、Rtn1+/+)マウスを得る 。このことは当業者が非連結ナンセンス対立遺伝子の由来する転写産物の安定性 に基づきRnt1遺伝子型の影響を調べることを可能にする。分子解析はβ-グルク ロニダーゼ遺伝子特異的配列およびプローブが使用されること以外は前記のもの と同一である(Birkenmeierら，１989)。全ての遺伝子型のマウスを解析し、遺伝 子型に特異的な結果を比較することができる。β-グルクロニダーゼ転写産物をR nt1-/-バックグランドで安定化させると、gus^mps/gus^mpsマウスに対する表現型 結果が決 定できる。コードされるタンパク質は約190個の野生型アミノ酸（通常は548個） の連続ストレッチを含むことができ、切断タンパク質が活性を保持している可能 性がある。これはβ-グルクロニダーゼ活性に関するウエスタン解析および組織 化学的染色によって試験することができる(SandsおよびBirkenmeier，1993)。 (2)系統IIIマウスは4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(ＨＰＤ) 活性を欠如し、Hpd遺伝子のエキソン７（14のうち）にナンセンス突然変異(Ｒ11 1Ｘ)を含む(Endoら，1991，1995)。同型接合マウスは正常に発達するが、増大し たチロシン血中レベルを有し、ヒトIII型チロンシン血症と同等の尿への代謝物 の大量の分泌を示す。Ｒ111Ｘ/Ｒ111Ｘ-同型接合マウスは、たとえ異常に小さな サイズであろうとも、大量のHpd転写産物を有する。極めて多数のメッセージが 、ｍＲＮＡ前駆体プロセッシングの間にエキソンがスキップすることにより、エ キソン７が欠損していることを示してきた(Endoら，1995)。スプライシングを調 節することが知られているシス作用性エレメントは全て変化しておらず、このこ とは異常なスプライシング表現型がナンセンス突然変異を原因としていることを 示唆している。系統IIIマウスをＲＥＮＴ１ノックアウトマウスと交配させるこ とにより、当業者はrent1およびＮＭＲＤ経路が未熟終結コドンに応答して異常 なスプライス部位選択に関与するか否かを決定することができる。これはHpdお よびRnt1遺伝子の異型接合および同型接合遺伝子型の種々の組み合わせを担持す るマウスの肝臓および腎臓から抽出したHpdｍ ＲＮＡのノーザンブロットまたは ＲＴ-ＰＣＲ解析によって、容易に試験することができる(Endoら，1995)。III型 系統はCentral Institute for Experimental Animalin Kawasaki,Japanから入手 できる。 標的対立遺伝子についての同型接合性は胚の発達に適合しないが、異型接合性 が表現型には関与しない場合、ドミナントネガティブ対立遺伝子または相対的ロ ス・オブ・ファンクション対立遺伝子(relative loss-of-function：機能喪失) が作出され得る。かかる突然変異のサイズおよび 特性は、哺乳類細胞を用いた発現研究により影響を受けるであろう。ＥＳ細胞の ゲノム内に潜伏（例えばミスセンス）突然変異を作出するプロセスは十分に記載 されており、極めて有効である(Staceyら，1994)。簡単に説明すると、まずター ゲッティングベクターを用いてＨＰＲＴ欠失ＥＳ細胞中の標的遺伝子の特定領域 (defined region)をＨＰＲＴミニ遺伝子で置換する。ＨＰＲＴ+表現型について 選択した後、第二ラウンドのターゲッティングを用いてＨＰＲＴミニ遺伝子を位 置指定突然変異を担持する所望のＤＮＡ断片で置換する。相同組換え体の濃縮は 、ＨＰＲＴ表現型への逆転について選択することにより達成される。ドミナント ネガティブ突然変異について異型接合であるかまたは相対的ロス・オブ・ファン クション突然変異について同型接合であるマウスは十分なＮＭＲＤ損傷を有し、 依然として生存能力のある表現型を示し得る。全ての可能性ある突然変異がＮＭ ＲＤ効率に対して相対的な影響力について培養細胞で評価することができ、いく つかの選択をトランスジェニック実験に用いることができる。 さらに、標的ＲＥＮＴ１対立遺伝子について同型接合性が胚の発達に適合しな い場合、当業者はバクテリオファージＰＩのCrelloxP組換え系の制御下で誘導的 遺伝子ターゲッティングを適用することができる(SauerおよびHenderson，1988) 。Creレコンビナーゼは、付加的な補助因子を用いずに２つの短い認識配列(loxP )の間での部位特異的組換えを指令する。CreはloxP部位を認識し、反対側の鎖で それらをニックし、組換え後に、単一のloxP部位を残す。loxP部位が各々頭−尾 または頭−頭の向きに配置している場合、このプロセスは介在性の［フロックス された(“floxed”)］ＤＮＡ配列を欠失または反転させる。フロックスされた対 立遺伝子を担持するマウス系統を活性化したトランスジェニック系統にかけ合わ せることにより、in vivo遺伝子不活性化を特定の発達段階または組織に限定す ることができる(Guら，1994;Kuhnら，1995)。別法として、誘導的プロモーター を用いてCre発現を駆動することもできる。まず、前記の遺伝子ターゲッティン グ法を用いて、Rnt1のエキソンまた は領域を２つのloxP部位ではさむ。耐性付与遺伝子はloxP部位の間であるがRnt1 のコーディング領域の外側に含まれ、組換えクローンの陽性選択を可能にする。 得られたマウスを、（たとえ機能的には完全であっても）標的とする対立遺伝子 について同型接合性へと改良する。得られた同型接合体を、所望の特性を持つプ ロモーターの制御下でCreを発現するトランスジェニック系統へと改良する。あ る特定の重要な発達段階または組織を経由することにより、当業者は、該遺伝子 産物が本来必須の特性であるにもかかわらずＮＭＲＤ欠損している、生存可能で 有用なモデルを作出することができる。Cre発現のためのプロモーターの選択は マウスMx1遺伝子のインターフェロン誘導的プロモーターであり得る(Kuhnら，19 95)。 本発明はまた、ＮＭＲＤを調節することにより治療目的に使用することもでき る。部分的に機能する末端切断型タンパク質をコードする安定化ナンセンス対立 遺伝子を担持する細胞は、rent1のドミナントネガティブ型をコードする構築物 でトランスフェクトすることができる。細胞の表現型はＲＮＡおよびタンパク質 の定量および生物機能学的アッセイにより決定することができる。加えて、問題 となる可能性のある疾病遺伝子に関する何れの先行知識を仮定することなく、Ｎ ＭＲＤの阻害の後にアップレギュレートされる転写体を濃縮するために、サブト ラクション法を使用することができる。ＲＥＮＴ１の使用により、ＮＭＲＤの破 壊および選択された細胞表現型の救済もしくは新規の疾病遺伝子の同定のための ＮＭＲＤの操作を可能にすることができる。かかる非限定的な実施例の１つが以 下に記載されているが、しかしながら、この実施例を使用している当業者ならば 、ＲＥＮＴ１を用いて疾病遺伝子を探究するための他のかかるバイオアッセイを 作出することができる。 所与の疾病遺伝子の対立遺伝子が未熟ターミネーションコドン(PTC)に担持さ れていることが見い出された場合、一般的に二つの優勢な病原機序が推論される 。双方ともに推定されたロス・オブ・ファンクションに関係する。予測された末 端切断型タンパク質は、目的の機能にとって 必須であるＣ末端ドメインを欠失しているか、もしくは該ＮＭＲＤ経路がナンセ ンス転写産物の大部分または全部を分解することにより突然変異体の対立遺伝子 から効率的に発現を排除するかである。これらのメカニズムは、互いに排他的な ものではなく、共同で作用し得るものである。しかしながら、あるタンパク質に おいては、選択的Ｃ末端切断型のものは、疾病表現型を予防もしくは排除するに 十分な活性を保持している。かかる場合においては、ＮＭＲＤは重要な因子とな る。これは恐らく、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質(ＣＦＴＲ)の特定のナン センス対立遺伝子の場合であろう。ＣＦＴＲのアミノ末端の半分が小さければ小 さいほど、機能的に調節されたクロリドチャンネルを形成することができる(She ppardら，1994)。選択した末端切断型タンパク質（例えば、Ｄ836Ｘ突然変異体 に相当するもの）は、野生型ＣＦＴＲと見分けのつかないコンダクタンス特性を 有している(Sheppardら，1994)。しかしながら、in vivoにおいて、転写レベル は非常に低く(例えば、突然変異体Ｗ1282ＸおよびＷ1315Ｘの場合)、一般的に野 生型対立遺伝子において認められるものの5％未満である(Hamoshら，1991，1992 )。rent1（従ってＮＭＲＤ）の操作による選択したＣＦＧＲナンセンス転写産物 の安定化は、ＣＴＦＲに冒されている細胞における重要なクロリドチャンネル機 能の出現をもたらしうる。 かかる仮説を調べるために、当業者ならば、rent1の野生型および推定上のド ミナントネガティブ型の双方をコードするベクターを用いて、呼吸上皮細胞系Ｉ Ｂ3-1を安定にトランスフェクトすることができる。ＩＢ3-1は、ＣＰＴＲ突然変 異体△Ｆ508およびＷ1282Ｘを担持しており、野生型ＣＦＴＲとの再構築につい て正常なクロリドコンダクタンスパラメーターを示す(Fulmetら，1995；全ての 図および描画を含む全文を本明細書の一部とみなす)。当業者ならばrent1のドミ ナントネガティブ型を用いて、かかる処置がＷ1282転写産物を安定化させるかど うかを判定することができる。もしそうならば、当業者は、cAMP媒介クロリドコ ンダクタンスに変化が見られるかどうかを評価するための十分に記載され た生物機能学的アッセイを使用することができる(Fulmetら，1995)。簡単に説明 すると、ＩＢ3-1細胞（非トランスフェクト、偽トランスフェクト、野生型発現 性もしくはドミナントネガティブなrent1)に³⁶Cl-をロードすることができる(Fu lmetら，1995)。細胞は、温溶液の添加に先立ち、氷冷したリンガー溶液中で十 分に洗浄することができる。CPT-cAMP(200ｍＭまで;Boehringer Mannheim)を添 加することができ、インキュベート溶液は、その後、種々の時点で交換すること ができる。最終時点の後、0.1Ｎ水酸化ナトリウム中で細胞を溶解させることが できる。各時点の保持サンプルからの放射線放射をカウントし、各時点の最終値 をゼロ時間での全細胞のカウントに対するパーセントで表し、これは、分単位で 損失してゆく。流出速度は、実験間で、一元配置分散分析法(ＡＮＯＶＡ)および ダンカンの多重変数検定(Fulmerら，1995)を用いて比較することができる。結果 は、タンパク質発現と相関し、ウエスタン解析および免疫組織化学により評価す ることができる。Ｗ1282Ｘ対立遺伝子の生産物は、そのサイズと細胞表面のでの 位置により、△F508対立遺伝子の産物と区別することができる。 タンパク質発現がアップレギュレートされるがクロリドコンダクタンスが変化 しない場合、ＣＦＴＲのＷ1262Ｘ型は輸送、プロセッシング、もしくはクロリド コンダクタンスのために必要な、重要なドメインを欠失している可能性がある。 次いで、その他の突然変異細胞系を試験することができる。もしタンパク質発現 およびクロリドコンダクタンスの双方がrent1のドミナントネガティブ型の発現 によりアップレギュレートされていれば、ＮＭＲＤの操作により安定化された転 写産物は翻訳されることが可能であり、その結果生じたタンパク質産物が残りの 機能を示すことができるのは明白である。かかる結果は、新規の治療戦略の開発 にとって重要であろう。例えば遺伝子療法もしくは薬理学的介入を用いて、in v ivoにおけるrent1の発現を操作することが可能となろう。このことは、Ｗ1282Ｘ を担持する患者(Ashkenaziユダヤ人人口において60％のＣＦ染色体を占める；Sh oshaniら，1992)、および、おそらくＣＦＴＲま たは他の遺伝子における他のナンセンス突然変異を有する個人の治療において多 大な影響を及ぼすであろう。 本発明は、ＲＥＮＴ1遺伝子における突然変異を改良するであろう。なぜなら 、突然変異体rent1ポリペプチドはナンセンスｍＲＮＡの増大する増加と相関し 、ＲＥＮＴ1核酸は遺伝子療法において有用であり得るからである。ＲＥＮＴ1構 築物を用いて、ナンセンス突然変異の蓄積により影響を受ける細胞中でのＮＭＲ Ｄを強化することにより、安定化させたナンセンス突然変異の転写産物に関連す る疾病状態の治療が可能となる。好ましい治療法においては、ＲＥＮＴ1制御遺 伝子産物は、強化されたＮＭＲＤが要求される細胞において優先的に発現される 。別法として、野生型rent1ポリペプチドの生物学的活性を模倣する、もしくは 変異体rent1ポリペプチドにおける欠損により引き起こされ、それによって野生 型生物学的活性を変異体ポリペプチドまで戻すＮＭＲＤ欠損を修飾するペプチド 模倣物質または他の組成物の投与による治療が提供される。 rent1の実験的操作は、新規の治療戦略および未知の疾病遺伝子の同定に使用 することができる。新しい疾病遺伝子を同定するための、もしくは環境的または 生理的なストレスに対する細胞応答をモニターするための多くの戦略は、対照サ ンプルと試験サンプルとの間の遺伝子特異的転写発現における差異の検出に基づ くものである。これらは、示差的ｃＤＮＡスクリーニング、差引きハイブリダイ ゼーション戦略、および多くのＲＴ-ＰＣＲにもとづく方法(MaserおよびCeibert ，1995に概説)を包含する。「罹患(affected)」細胞系もしくは組織から単離され たＲＮＡを、「非罹患」対照から単離されたものと比較する。酵母およびシィー ・エレガンス(C.elegens)双方におけるＮＭＲＤ機能の喪失は、PTCsを含有しな い多くの転写産物に対して（もしあるとしても）ごく僅かな影響を及ぼすことが 示され、従って細胞生活力は影響を受けずに維持されていることを示唆している (Leedsら，1991:Pulak & Anderson，1993)。 ＰＴＣは、ナンセンス突然変異およびフレームシフト(異常なスプライシン グ、欠失、挿入、複合体再編成)により引き起こされ、従ってナンセ ンス対立遺伝子は全てのヒトにおける疾病の大部分を説明する(CooperおよびKra wzak，1993)。この事実から、ＮＭＲＤの実験的操作とからめて、選択した疾病 遺伝子の同定を可能にすることができる。当業者ならば、既知のナンセンス対立 遺伝子を担持する患者の細胞系を用いてかかる疾病遺伝子を決定することができ る。もし、かかる細胞系の一部分の細胞において、ＮＭＲＤがダウンレギュレー トされているのであれば、ＲＥＮＴ1構築物によってトランスフェクトされた細 胞系と、操作されていない同系の培養細胞とのただ一つの違いは、ＲＥＮＴ1処 理細胞におけるナンセンス転写産物の大幅な増加であるはずである。次に、この 、推定される疾病遺伝子のナンセンス転写産物の豊富さは、本明細書に記載され ている方法を含む多くの方法により検出することができる。疾病対立遺伝子のか かる検出の一つの実施例が以下に記載されている。該実施例は例示のためのもの であり、明確的もしくは含蓄的何れの方法にせよ制限するものではない。その他 の方法は、当業者において明らかであろう。 ＯＡＴ遺伝子のコドン318における1bp欠失について同型接合である旋回萎縮患 者から、繊維芽細胞系を得た。この対立遺伝子は検出不能なレベルのＯＡＴｍＲ ＮＡと関連している(Bodyら，1992)。この系からの細胞は、rent1の野生型また はドミナントネガティブ型の何れかを発現している構築物を用いて安定してトラ ンスフェクトすることができる。双方の細胞系からＲＮＡを抽出することができ 、代表的な差異解析(ＲＤＡ)(HubankおよびSchatz，1994)により比較することが できる。ＲＤＡは、量並びに吸収の差を効率的に検出し、また差異だけを残し、 双方の細胞集団に共通するｃＤＮＡ断片を除去するので、即時的(instant)技術 を用いる比較解析の好ましい方法である(HubankおよびSchatz，1984)。その結果 得られるｃＤＮＡ断片の同一性は、サブクローニング、配列決定、およびデータ ベース解析を組合せることにより決定することができる。また、同一の方法およ びマルフェン症候群のごとき他の疾病の患者からの適当な繊維芽細胞系を用いて 、異型接合のナンセンス対立遺伝子にＲＤＡ法を適用することもできる(Distzら ，1993b)。 正常対立遺伝子から非能率的にスプライスしたｍＲＮＡ前駆体の安定化は、そ の濃度の低さから、このプロセスにおいて妨害とはならないであろう。加えて、 該ＲＤＡ解析法は、対象の表現型とは関係のない劣性ナンセンス対立遺伝子由来 の転写産物を濃縮することができる。その数は少なく、多くはＲＮＡ単離のため の組織起源において発現することができないが、対象の表現型との関連でそれが 選択される(ＯＡＴおよびフィブリリン-1双方が培養繊維芽細胞において豊富に 発現される)。かかる方法は、PTCsにより生じる突然変異に関連する症候群を決 定するために好ましい(例えば、全てのスティックラー突然変異がPTCsを作出す るスティックラー症候群遺伝子)。このアプローチは、稀な、時々起こるもしく は複雑な突然変異疾患を検出するそのユニークな適用性のゆえに好ましい。当業 者ならば複雑な突然変異疾患において、表現型の一致した多くの患者におけるナ ンセンス対立遺伝子のカタログを得ることができる。多くの疾患を持つ患者に共 通に見出されるこれらのナンセンス対立遺伝子は、さらに研究される。 遺伝子治療法の好ましい方法としては、直接的な遺伝子導入、すなわちrent1 ポリペプチドをコードする核酸を含む処方物を、罹患している部分もしくはその 他の領域に局所適用することが挙げられる。種々の周知のべクターがＲＥＮＴ1 遺伝子をスッティックラー症候群もしくはマルファン症候群に冒されている細胞 の位置と類似する位置にある標的細胞に送達するために使用され、これには、限 定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクターもしく は上皮細胞を標的とした処方物が含まれる。加えて、裸のＤＮＡ、リポソーム処 方物送達法もしくはＲＥＮＴ1遺伝子を標的細胞に送達するために開発された他 の新規処方物もまた好ましい。 上記の何れかのアプローチのために、治療のためのrent1ポリヌクレオチド構 築物を、強化されたＮＭＲＤを所望される位置へ適用することができるが（例え ば、注射による）、しかし該ＲＥＮＴ1処方物はまたＮＭＲＤによる調節が必要 とされる組織の近接部位や、ＮＭＲＤによる調節が 所望される細胞に供給する血管に適用されてもよいし、全身的に適用されてもよ い。 本発明のＲＥＮＴ1遺伝子送達処方物、ポリヌクレオチド発現は、何れの適切 なプロモーター(例えば、ヒトサイトメガロウイルス、シミアンウイルス40、ア クチンもしくはアデノウイルス構成性プロモーター；もしくは活性化されたシノ ビオサイト(synoviocyte)特異的発現のためのサイトカインまたはメタロプロデ アーゼプロモーター)から指令される。さらに、ＲＥＮＴ1ポリヌクレオチドの産 生は何れの所望の哺乳類調節エレメントにより調節することができる。例えば、 所望により、ＮＭＲＤに関連することが当該技術分野において公知である細胞に おいて優先遺伝子発現を指令することが知られているエンハンサーを、ＲＥＮＴ 1遺伝子発現を指令するために使用してもよい。かかるエンハンサーには、限定 されるものではないが、それらの発現が組織もしくは細胞に特異的であると特徴 づけられるエンハンサーが含まれる。 あるいはまた、ＲＥＮＴ1遺伝子制御ゲノムクローンが治療のための構築物と して利用される場合、発現はその同種調節配列により、もしくは所望により異種 起源の調節配列、例えば前記した何れのプロモーターもしくは調節エレメントに より調節される。 遺伝子療法はまた、該ＲＥＮＴ1調節遺伝子ｍＲＮＡを、in vitro、exvivo、 もしくはin vivoで細胞へ直接投与することにより達成されてもよい。ＲＥＮＴ1 ｍＲＮＡは標準的な何れの手法により生産され単離されてもよいが、高効率的な プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）の制御下でｃＤＮＡを用いるin vit ro転写により最も容易に生産される。蓄積された細胞へのＲＥＮT1ｍＲＮＡの投 与は、本明細書に記載された直接的な核酸投与のための方法のいずれかにより行 われる。 １つの具体例において、本明細書に記載されている遺伝子療法の試みによるre nt1タンパク質の生産の結果として、正常な個体における正常な細胞レベルと少 なくとも機能的に同等なrent1ポリペプチドの細胞内レベルが得られる。本明細 書に記載されている何れの遺伝子療法の試み による治療もより伝統的な治療法と併用してもよい。 本発明に含まれているその他の治療のための試みには、従来の組換えタンパク 質投与技術を用いる、病原性細胞が蓄積している部位における、組換えrent1タ ンパク質の直接投与（例えば、注射）もしくは全身的投与が包含される。rent1 タンパク質はまた、ＲＥＮＴ1核酸処方物を標的とするための本明細書に記載さ れている何れの方法を用いて特定の細胞もしくは受容体に向けられてもよい。re nt1タンパク質の実際の用量は、生物のサイズと健康状態を含む多くの因子に依 存するが、一般的には医薬上許容される担体の何れかを用いて、成人に１日あた り0.1ｍｇないし100ｍｇが投与される。 １つの具体例において、本発明は欠陥ＮＭＲＤ調節遺伝子またはポリペプチド 、欠陥ＲＥＮＴ1もしくはそのレベルと関連する病因をもつ健康状態である遺伝 学的異常、疾病もしくは臨床治療の結果として、初期段階の患者又はそのリスク を有する患者を治療する方法を提供し、その方法はＲＥＮＴ1遺伝子またはポリ ペプチドの発現を調節し、その結果患者の状態が改善される治療学的有効量の製 剤または組成物を患者に投与することを包含する。 治療のための適用には、細胞が特異的に野生型タンパク質、例えばrent1を発 現することを利用する選択的生存手法の利用も含まれる。かかる治療は、欠陥Ｒ ＥＮＴ1遺伝子を含有する細胞を殺すかまたは不活性化し、一方野生型もしくは 正常ＲＥＮＴ1遺伝子／ポリペプチドを含有する細胞は温存する。選択的滅殺の ためのいくつかの試みには、限定されるものではないが：1)内因性の正常ＲＥＮ Ｔ1遺伝子の発現を誘発するウイルスベクターによる感染；2)特異的に突然変異 タンパク質に結合し、野生型タンパク質には結合しない薬剤の変異型rent1タン パク質を有する細胞との接触；および3)変異型rent1タンパク質を有する細胞の 野生型ＲＥＮＴ1を保護する第一の薬剤との接触および、それに次ぐ変異型rent1 に毒性を持つ第二の薬剤との接触。実施例 以下の実施例は本発明を例示することを意図するものであるが、いかなる方法 、形状、または様式（外面的にも内面的にも）においても本発明を限定するもの ではない。それらは、それらが用いられるものの典型例であると同時に、当業者 において公知である操作、方法、または技術の何れもがその代わりとして用いら れ得る。 実施例１ 縮重プライマーを用いるヒトＲＮＴ1 ｃＤＮＡのクローン化 Upf1、Sen1、およびMov10に共通する短ペプチド断片をコードする縮重配列を 用いて、多数のプライマーを作製した(表１)。 表１：クローンヒトＲＮＴ1に用いるプライマーの縮重配列によって コードされるペプチド 次いで該プライマーを多数組み合わせて、培養したヒト繊維芽細胞から抽出し たＲＮＡのＲＴ-ＰＣＲに用いた。ＲＮＡ抽出およびＲＴ-ＰＣＲを、従来法に従 って行った。プライマーＰＧＴＧＫＴ(配列番号９)およびＣＡＰＳＮ(配列番号1 0)を一緒に用いるＲＴ-ＰＣＲによって、Upf1の大きさに匹敵する生成物を生じ た。センスおよびアンチセンスプライマーは、それぞれペプチド配列ＰＧＴＧＫ Ｔ（Upf1中のaa 432-437）およびＣＡＰＳＮ(Upf1中のaa 458-462)をコードする 。ＲＴ-ＰＣＲ生成物内に含まれる30個のコドンの概念翻訳によって、それは93 ％の配列が保存され、および酵母のUpf1と73％の配列が同一であることが明らか となり、このことはクローン化された遺伝子がＮＭＲＤの哺乳類レギュレーター をコードすることを示唆する。 実施例２ 哺乳類発現配列タグ(ＥＳＴ)用いるヒトＲＮＴ1ｃ ＤＮＡのクローン化 酵母Upf1配列をＸ-ＲＥＦデータベイスゲノムクロスレファレンシングエフォ ート(database genome cross-referencing effort)(Bassettら， 1995)に寄託した。このサービスは、ＢＬＡＳＴ局所配列サーチアルゴリズム(Al tschulら，1994)を用いて、モデルの生物タンパク質（酵母、シー・エレガンス( C．elegans)など）由来の問題の配列を哺乳類発現配列タグ(ＥＳＴ)の概念翻訳 と比較する。寄託の結果、Upf1p(p=2.8e-44)と著しい類似性を有するタンパク質 をコードする正常なヒト幼児の脳ｃＤＮＡライブラリー由来のヒト発現配列タグ (ＥＳＴ、GenBank F05433)が同定された。Human Genome Center of Lewrence Li vermore National Laboratoryから得られたｃＤＮＡクローンは、約1.5kbの挿入 断片を含んでいた。この挿入断片のＤＮＡ配列決定によって、ポリ（Ａ）尾部お よび100bpの3'UTRを有する約1.4kbの隣接オープンリーディングフレームが明ら かとなった。ＧＥＮＥ ＴＲＡＰＰＥＲ ｃＤＮＡ陽性選択系(Life Technologies )を用いて、全長ＲＥＮＴ1ｃ ＤＮＡクローンをクローニングベクターｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ(ＢＲＬ)内に含まれる成体ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーから単離し た。オリゴヌクレオチド23-5-2a8(5'-ＣＴＴＴＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＧＣ ＧＣ-3')(配列番号11)を用いる製造業者の指示に従って選抜を行った。それぞれ 約3.7kbの挿入断片を有する、２つの別個のクローンが同定された。該クローン のＤＮＡ配列決定によって、231bpの5'ＵＴＲ、103bpの3'ＵＴＲ、およびポリ（ Ａ）尾部が隣接する3,354bpのオープンリーディングフレームが明らかとなった 。ＢＬＡＳＴを使用してこのクローンの配列を酵母Upf1の配列と比較することに より、単離したクローン、ＲＮＴ1が、Upf1の配列に類似する(p=0.00)ポリペプ チドをコードすることが示唆された。製造業者のプロトコールに従つてPerkin E lmer Applied Biosystems Division（ＡＢｄ）373a自動化ＤＮＡシークエンサー を用いて、配列決定を行った。直接配列決定により、ポリ（Ａ）尾部を除く231b pの5'ＵＴＲおよび103bpの3'UTRを有する3354bpのＯＲＦが予想される。推測さ れる開始メチオニンは、３位に高度に保存されたプリンを含むKozak共通配列Ｇ ＣＣ（Ａ/Ｇ）ＣＣＡＴＧＧ(配列番号13)(Kozak，1991)とよく一致するコンテキ スト(ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡ)(配列番号12)内に存在するＡＴＧコドンによってコ ードされる。さらに、こ れはフレーム内アンバーコドン(上流の23コドン)の最初のＡＴＧ3'である。 哺乳類ポリペプチドはrent1と命名した。 実施例３ マウスＲＮＴ１ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡのクローン化 放射性標識したヒトｃＤＮＡ断片を用いて129/SV系統のマウスゲノムライブラ リー(Strataqene)のプローブ化の後に、大きい(約15.5kb)マウスＲＥＮＴ1ゲノ ムクローンを同定した。約8.2kbのＢａｍＨＩ制限断片をｐBluescriptII/SK＋（ Strataqene）中にサブクローニングして先に記載した通りに配列決定した。同一 のゲノムクローン由来の7kbのＢａｍＨＩ-NotI制限断片をサブクローニングして 約4.4kbの配列決定した。配列決定分析ソフトウェアのMacVector４．５．３パッ ケージ(Kodak)を用いて、ヒトｃＤＮＡの概念翻訳をマウスゲノムクローンのそ れと並べることによってコーディング配列を同定した。 Rnt1遺伝子もまたマウスの肝から部分的にクローン化された。ＲＥＮＴ1とUpf 1との間が同一である短ペプチド配列をコードする縮重PCRプライマーを、マウス 肝ＲＮＡのＲＴ-ＰＣＲに用いた。ヒトおよび酵母の配列に基づく予測された414 bpのＲＴ-ＰＣＲ生成物を回収するために、プライマーＬＥＣＹＮＣＫおよびＬ ＥＡＤＹＤＫを一緒に用いた。12.6kbの配列の概念翻訳および相同分析は、ヒト 配列中の78から1118個の残基に対応する予想したマウスタンパク質の1041個の残 基は22個のエキソンによってコードされることを実証する。1041個の残基のうち 14個だけがヒトタンパク質とマウスタンパク質との特徴のある部分の間で異なっ ていることは、哺乳類rent1タンパク質中のほとんどの残基が高程度の機能的な 意義を有しており他のＮＭＲＤの哺乳類レギュレーター中に保存されているとい うことを示唆する。Upf1pのためのヘリカーゼスーパーファミリー1(21)のメンバ ーに共通する７つの領域の整列は、Sen1およびMov-10とともにヒト、マウスおよ びエス・ポムベ(S．pombe)に相同であり、このグループのタンパク質をヘリカー ゼスーパーファミリー内の異なるサブセットと定義することを許す保存された共 通配列を示す。全 ゲノムマウスＲＥＮＴ1配列は、アミノ酸配列を含む図４中に示す。マウスＲＥ ＮＴ1ゲノムクローンは、図11に示されているベクター中に導入される。さらに 、ノックアウト表現型の生成のためにマウスＲＥＮＴ1配列を用いるターゲティ ングベクターを図10に示す。 実施例３ ＲＥＮＴ1ヒトおよびマウス染色体位置のマッピング Jackson Laboratory ＢＳＳ種間戻し交雑ＤＮＡパネルを用いてマウスRnt1遺 伝子をマッピングした。これは、ヒトＲＮＴ1 ｃＤＮＡプローブを用いたハイ ブリダイゼーションで検出されたＣ57ＢＬ/6Ｊ-特異的な1.6kbのTaqI制限酵素断 片の系統分布パターンに従うことによって達成された。ヒトプローブはＣ57ＢＬ /6Ｊ-特異的な1.6kbのTaqI制限酵素断片を検出し、これをマウス遺伝子のマップ 位置を決定するために用いた。Rnt1は、マイクロサテライトマーカーＤ8Ｍｉｔ5 とＤ8Ｍｉｔ78との間のマウス染色体８、ヒト染色体19p13.2-p13.11で合成する 領域をマッピングすることがわかった。Neurocan(Ncan)は、83匹のマウスにおい てゼロ交差を用いて最も近くにマッピングしたマウス遺伝子(Raunchら，1995)で あった。ヒト特異的なHindIII制限断片のためのＮＩＧＭＳヒト／齧歯類体細胞 雑種マッピングパネル(２型、Coriell Cell Repositories)のそれ以後のタイプ 分類によって、明白にＲＮＴ1のためのヒト染色体１９の局在を確認した。関連 したデータは、World Wide WebのＵＲＬ http://www.ncbi.nlm.nih.gov./ＸＲＥ Ｆdb/で見られ得る。マウス染色体８またはヒト染色体19のそれぞれの指定した 領域をマッピングされるはっきりしたマウスまたはヒトの表現型は知られていな い。マウスのフック(Ｈｋ)およびクィンキー(Ｑ)表現型は、それぞれ26および38 cＭの10個のセントロメア由来のオフセットを用いてマウス染色体８上にマッピ ングする。双方は尾部の奇形によって特徴づけられる。フックマウスは肛門の奇 形を示す一方で、クィンキーマウスは異常なサイクリング挙動を示す。 実施例４ ＲＥＮＴ1の配列決定分析 直接配列決定は、ポリ（Ａ）尾部を除く231bpの5’ＵＴＲおよび103bpの3'Ｕ ＴＲを有する3,354bpのＯＲＦを予想した。推定開始メチオニンは、Kozak共通配 列(12)、フレーム内翻訳ターミネーターの下流の23個のコドンのコンテキスト内 に生ずるＡＴＧによってコードされる。３つのタンデム共通ポリアデニル化シグ ナル(ＡＡＴＡＡＡ)は、104位にポリ（Ａ）尾部の開始点を持つ3'ＵＴＲの63、7 0、および76位で始まる。ＲＥＮＴ1の配列とUpf1との比較は、タンパク質はアミ ノおよびカルボキシル末端が異なるけれどもその２つのタンパク質の中心部分内 にかなりの配列の相同が存在する(Upf1のアミノ酸60-853およびrent1のアミノ酸 121-917)。それらの中心部分を通して、ＲＥＮＴ1およびupf1は、58％のアミノ 酸同一性および80％の保存を共有する。さらに、ＲＥＮＴ1およびUpf1は、２つ のジンクフィンガー様のドメインを共有する。これらのタンパク質はまた、ＮＴ Ｐ加水分解活性を与えると考えられているモチーフを含む、ヘリカーゼスーパー ファミリー１のメンバーに共通するモチーフを共有する。これらのモチーフの２ つは共通配列ＧＸＸＸＸＧＫ（Ｓ／Ｔ)（配列番号14）およびＤＸＸＧ（配列番 号15）が完全に一致する(Deverら，1987)。さらに、ＲＥＮＴ1の配列はUpf1の配 列と、改変した場合にUpf1にドミナントネガティブ活性を与える残基において同 一である(Leedsら，1992)。ＲＥＮＴ1およびUpf1の中心部分におけるこれらの類 似性は、ＲＥＮＴ1は哺乳類においてＮＭＲＤを制御することを示唆する。ＲＥ ＮＴ1の中心部分はUpf1の中心部分と類似するけれども、これらのタンパク質は それらのアミノおよびカルボキシル末端の双方が異なる。 ＲＥＮＴ1とUpf1との間の類似および相違の理解を容易にするためには、タン パク質の配列を３つの領域、Ａ)Ｎ末端、Ｂ)ボディ、およびＣ)Ｃ末端に分割す ることが最善である。２つのタンパク質のボディ（それぞれUpf1およびrent1中 のaa 60-853および121-917）は、極めて良好なアラインメントおよび高程度の類 似性を示す。この領域を通して、その２つのタンパク質配列は58％の残基同一性 および80％の保存を示す。さら に、ＲＥＮＴ1は初めてUpf1中に見出される推測の機能性要素のすべてを含むヒ トタンパク質配列であると同定された。これらには、推測のヌクレオチド結合機 能を果たすシステインが豊富なジンクフィンガー様のドメインおよびＮＴＰ加水 分解活性を与えると信じられているものを含むヘリカーゼスーパーファミリー１ のメンバーに共通するモチーフが含まれる。最初の２つのＮＴＰ加水分解モチー フは、共通ＧＸＸＸＸＧＫ（Ｓ／Ｔ）およびＤＸＸＧと完全な一致を示し、適切 な間隔を保っている(Deverら，1987)。ＧＴＰ結合特異性の原因であると信じら れている３番目の配列エレメントは、共通ＮＫＸＤと完全には一致しない。Upf1 においては共通配列の一致が見出されているけれども、その機能の重要性に疑わ しさが残る２番目のＮＴＰ加水分解エレメントから予想された距離において該モ チーフは見つかっていない(Leedsら，1992)。ＲＥＮＴ1はUpf1の強力な構造的ホ モローグであり、酵母タンパク質中に見出されている公知のまたは推定機能的エ レメントのすべてを含む。現在の学説は、配位ヌクレオチド結合、ヘリカーゼ、 及び活性化されたＮＴＰaseが、ナンセンス転写と未熟停止コドンおよび他の適 切なcis作動性エレメントをスキャンする因子との間の適当な相互作用に不可欠 であり得るということを支持する(Czapliniskiら，1995)。 ＲＥＮＴ1のＮおよびＣ末端は、Upf1の対応する領域と配列しない。最初の注 目に値する差異は、ＲＥＮＴ1のＮ末端はUpf1中で見出されるものよりも長い（ それぞれ120対59aa）ということ、ならびに酵母タンパク質中では見出されてい ないプロリン、グリシン、およびアラニン残基のすべてからなる長い(26ss)スト レッチを含むことである。この領域の機能の重要性は知られていない一方で、Ｐ ＧＡが豊富なストレッチが直接転写レプレッサーとして作用することが見出され ている(Catronら，1995)。ＰＧの高含量によって加えられたらせんを妨害する性 質が、分子に対して都合のよいコンホメーションを与えることもまた可能である 。ＰＧＡが豊富な領域を取り除くと、ある類似性がＲＥＮＴ1およびUpf1のＮ末 端の間にあることは明らかである。その双方は、比較的セリンおよび スレオニン（それぞれ19対24％）および酸性残基(ＤまたはＥ、それぞれ22対18 ％)が豊富である。かかる特徴は、トランス活性化または転写制御性質を有する ヌクレオチド結合タンパク質中に共通してみられる(例えば、Calvertら，1991;S eipalら，1992)。ＲＥＮＴ1の単離したＮ末端配列のＢＬＡＳＴ分析によって、 転写の制御に関与する多数のホメオボックス/ＰＯＵドメインタンパク質に対す る相同が明らかになる。ＲＮＡと相互作用することが知られている類似のタンパ ク質は、酵母のSis1熱ショックタンパク質およびB．napusのGr10ＲＮＡ結合タン パク質を含む(それぞれp＝5.6e-07および1.2e-04)。特に興味があるものの中で 、Sis1は、40Ｓリボソームサブユニットおよびそれより小さいポリソームと関連 して核および細胞質の双方に局在化することが示され、翻訳の開始に必要であり 、および翻訳機構内のタンパク質複合体の会合を媒介し得る(Lukeら，1991;Hong ＆ Arndt，1993)。 ＲＥＮＴ1のＣ末端は、Upf1中で見出されるものよりも長い(それぞれ203対118 aa)。注目すべきものの中に、両Ｃ末端はセリンおよびグルタミンが豊富である( それぞれ21対18％)。これらの残基の大部分がＳＱジペプチド(n=14)として見出 されることは、ヒトタンパク質に独特の特徴である。多くのＲＮＡ認識モチーフ (ＲＲＭ)を含むタンパク質は、ＲＮＡ処理の多数の局面を制御すると仮定されて いるグルタミンの豊富な領域を有する(DeAngeloら，1991)。ＲＥＮＴ1の単離し たＣ末端のＢＬＡＳＴ分析は、ヒトまたはマウスEＷSＲＮＡ結合タンパク質との 著しい相同を実証する(p=8.9e.3)。興味深いことに、ＲＥＮＴ1およびＥＷＳの Ｎ末端の双方は、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、およびＰ残基の高頻度を示す(それ ぞれ60対90％)。ＥＷＳはＲＮＡ合成および処理に関与していると提案されてい る(Delattreら，1992)。 Ｎ末端のように、ＲＥＮＴ1のＣ末端（203個のアミノ酸）は、Upf1の対応する 領域（116個のアミノ酸）よりも長い。多様性は端のＮおよびＣ末端で見られる けれども、Upf1pおよびＲＥＮＴ1の大きな中心領域(それぞれ60-853および121-9 17）は58％の同一性および80％の保存を示 す。さらに、ＲＥＮＴ1は、Upf1pにおいて見出された推測の機能性エレメントの すべてを含んでいる最初に同定された哺乳類タンパク質であり、ヌクレオチド結 合に関与し得るシステインが豊富なジンクフィンガー様のドメイン、推測のＮＴ Ｐase活性を有するドメイン、およびヘリカーゼスーパーファミリー１のメンバ ーに共通するモチーフを含む。 実施例５ ドミナントネガティブrent1の作製 rent1のドミナントネガティブ型を、以前に記載した方法(DietzおよびKendzio r,1994)に従って行った位置指定突然変異誘発によって生成した。rent1のドミナ ントネガティブ型を生成するために用いる突然変異は、Upf1のドミナントネガテ ィブ型を生成するために用いる突然変異に類似している(Leedsら，1992)。タン パク質上でのドミナントネガティブ表現型を与える哺乳類におけるＲＥＮＴ1突 然変異は、酵母におけるドミナントネガティブUpf1突然変異に近似している。 実施例６ rent1 の発現 従来の組換えＤＮＡ技術および遺伝子発現方法を用いて、細胞中において野生 型ＲＥＮＴ1又はＲＥＮＴ1のドミナントネガティブ型を発現させることが可能で ある。ＲＥＮＴ1の種々の型を発現させるための遺伝構築物は、ベクターｐＨβA pr-1を改変することによって生成したｐβＲＮＴ1-ＮＥＯである(Gunningら，19 87)。ｐＨβApr-1は、ヒトβアクチンプロモーター(約3kbの5'隣接配列)、エキ ソン１中に含まれる77bpのβアクチン5'ＵＴＲ、および（その中で見出されるス プライスドナーおよびアクセプターならびにエンハンサーコア配列を含む）全β アクチンイントロン１を含み、続いてポリリンカーを含む。ｐβＲＮＴ1-ＮＥＯ を生成するために、ネオマイシン耐性カセットの添加によってｐＨβApr-1を改 変した。さらに、5'ＵＴＲおよび全3'ＵＴＲの短領域を含むＲＮＴ1オープンリ ーディングフレームを、ｐＨβApr-1のポリリンカー中にサブクローニングした 。ｐβＲＮＴ1-ＮＥＯ由来のＲＥＮＴ1の発現は、サイトメガロウイル ス(ＣＭＶ)プロモーターによって駆動される。ｐβＲＮＴ1-ＮＥＯ転写産物は、 それらの5'末端にβアクチンの5'ＵＴＲの一部を有する。この5'タグは、ベクタ ー誘導転写産物とトランスフェクトされた細胞に対して内生である転写産物とを 区別するのに有用である。ノーザン分析及びＲＴ-ＰＣＲを用いて転写産物を区 別することが可能である。構築物の他のセットは、ＲＥＮＴ1のＮ末端において ヘマグルチニン(ＨＡ)タグをコードする配列とともにフレーム内にクローン化さ れたＲＮＴ1オープンリーディングフレームを有する。得られるrent1/ＨＡ融合 タンパク質は、細胞下コンパートメント局在化がrent1産物中で起こるかどうか を決定する必要を持つものなど免疫組織化学的分析を使用する研究に用いること ができる。 実施例７ ノーザンブロットによるＲＥＮＴ1 ｍＲＮＡの分析 Clontechから入手した調製された多数のヒト組織ノーザンブロットを、製造業 者の指示に従って、(aa644-745をコードする)300bpのＲＥＮＴ1 ｃＤＮＡ断片で 、またはb-アクチンｃＤＮＡプローブ(Clontech)を用いてプローブ化した。ポリ （Ａ）ＲＮＡのノーザンブロット分析によって、試験した全部の成体組織におい て約5.4kbの大きさの主要な転写産物が示された。約3.7kbにおけるより強度の低 いシグナルが、膵臓に特有の付加的なおよび有意に小さいハイブリダイズする転 写産物とともにレーンにおいて肉眼で見ることができる。試験したほかの組織（ 脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血の白血球）は全て 、等しい強度のシグナルが観測される精巣以外は、主要な約5.4kbおよびより強 度の低い3.7kbのバンドを示した。 実施例８ rent1 のための酵母発現ベクター構築物 ヒトrent1タンパク質を発現させる酵母構築物を調製した。ＵＰＦ遺伝子(Leed ら，1991)を同定およびクローン化するために用いられるアロサプレッションア ッセイを改変することによって、当業者はＰＬＹ38酵母系統(MATa、ura3-52、hi s-38、ＳＵＦ1-1、Upf1-2)を用いてrent1の発現 がUpf1欠乏表現型を相補することができるかどうかを決定することが可能である 。この系統はＨＩＳ4転写産物の5'末端近くに+1フレームシフト突然変異(his4-3 8)およびグリシンｔＲＮＡフレームシフトサプレッサーをコードするＳＵＦ1-1 対立遺伝子もまた担持し、ならびにフレームシフト突然変異の低レベルリードス ルーを可能にする。30℃および37℃の何れにおいてもＰＬＹ38はHis+表現型を有 するが、野生型Upf1で再構築する際には、37℃では細胞はHis-であり、増殖でき ない。基本的なアッセイを用いて、当業者はこの遺伝的バックグランドにおいて rent1の発現が37℃での増殖を阻害することができるかどうかを決定することが 可能である。発現を最適のものとするために、ＵＰＦ1およびＲＮＴ1ＯＲＦの双 方をＭＥＴ25プロモーターを含む２ミクロンベクター中にサブクローニングした 。ＭＥＴ25プロモーターは、酵母における異種タンパク質の発現にすばらしい性 能を示し、細胞の呼吸状態によって過度に影響されず、およびメチオニンの非存 在下で誘導される(Mumbergら，1994)。ＭＥＴ25プロモーターを用い37℃でＰＬ Ｙ38中で野生型Upf1を発現させることにより、増殖表現型を形質転換されていな い細胞またはメチオニンの存在下で２日間増殖させた形質転換細胞と容易に区別 することが可能であった。 酵母における異種遺伝子の発現は、ＵＴＲ配列の長さおよび起源に敏感である (Romanosら，1992に総括されている)。酵母ＵＴＲは、１次ヌクレオチド配列に よって指令されるように、これらの領域において極めて短くてＲＮＡコンホメー ションをとる傾向にあり、転写産物の輸送および翻訳に影響し得る。この問題を 解決するために、２つのほかの酵母発現構築物を調製した。最初のものは、酵母 アルコールデヒドロゲナーゼ(ＡＤＨ1)プロモーターを用いてＨＡタグ付き融合 タンパク質の発現を駆動するpAD54LEu2の改変型であり、酵母ＡＤＨ 5'ＵＴＲ、 ターミネーター、3'ＵＴＲ、およびポリ(Ａ)シグナルを含む。ＵＲＡ3を（ＰＬ Ｙ38において使用するためのベクターとする）ＬＥＵ2選択可能マーカーに切り 換え、ＨＡタグコード領域の下流またはそしてフレーム内に、それぞれUpf1 およびrent1のために酵母およびヒトＯＲＦ中にサブクローニングした。ＲＮＴ1 およびＵＰＦ1 ＵＴＲは構築物中には含まれていなかった。異種ＵＴＲによる発 現の阻害が除去されているので、むしろこれらの構築物のほうが好まれ、当業者 は抗ＨＡ抗体(Boehringer Mannheim)を用いて融合タンパク質の発現を直接アッ セイすることが可能である。このベクターは、酵母における異種タンパク質の発 現にうまく使用することが可能である。さらに、Ｎ末端エピトープの付加は、野 生型Upf1の機能を阻害しない(Cuiら,1995)。これらの構築物はpAD54-RNT1または pAD54-ＵＰＦ1と表される。 ＰＭＥＴ25-ＲＮＴ1またはＵＰＦと表される構築物の２番目のセットは、野生 型Upf1を発現させるベクターを利用する。異種ＵＴＲによる可能な妨害を防ぐた めに、発明者らはＲＮＴ1のＯＲＦをＵＰＦ1のそれと置換し、その代わりに5'Ｕ ＴＲ、開始メチオニン、ターミネーター、およびＵＰＦ1の3'ＵＴＲを残す。 ＨＩＳ4転写産物の5'末端の近くに+1フレームシフト突然変異(his4-38)を担持 するＰＬＹ38系統(MATa、ura-3-52、his4-38、ＳＵＦ1-1、Upf1-2)を用いてＲＮ Ｔ1酵母発現ベクターを構築した。該系統はまたグリシンｔＲＮＡフレームシフ トサプレッサーをコードするＳＵＦ1-1対立遺伝子を含み、フレームシフト突然 変異の低レベルリードスルーを許容する。30℃および37℃のどちらにおいてもこ の系統はHis+表現型を有するが、野生型Upf1で再構築する際には、37℃では細胞 はHis-であり、増殖できない。先に記載したアロサプレッションアッセイ(Leeds ら，1991:1992)を用いるrent1がこの能力においてUpf1を置換し得るかどうかを 決定するための試験が確立され得る。簡単には、pmL-UPF1、pmt-RNT1、または（ 挿入断片のない）pmtを含むＰＬＹ35形質転換体は、ウラシル欠乏培地上で選択 することができる。３つの別個の形質転換体ごとに0.4-0.6の間のＯＤ600まで液 体培地中で生育させることが可能である。一連の希釈した培養物(希釈していな い、１：100、1:100、および1:1000)の４μｌの一部を、（プロモーター誘発の ために）メタン、ウラシル、および ヒスチジンを欠いた固体培地上に播種することができる。生育は30および37℃の 双方でモニターし得る。pmt-RNT1がUpf1表現型の相補することができない場合に は、（構築ＡＤＨ1プロモーターの制御下において）pAD54-UPF1、pAD54-RNT1、 およびpAD54を含むＰＬＹ38形質転換体を発生させて上記のようにアッセイし得 る。ベクターのこの２番目のセットの利点は、それらがＮ末端ＨＡタグをコード することである。ほかの酵母組換え発現ベクター構築物は図５および６に示され 、これらは当業者が本明細書中で提供された技術を用いて他のベクター構築物を 作製し得るということを実証するための目的を図示するために示されている。 酵母において相補性が見られる場合には、このことによって発明者らは有効で 強力な酵母系においてrent1の特異的な残基の機能の重要性を質問することが可 能になる。例えば、酵母系統ＰＬＹ154(Matα、ura3-52、his4-38、upfl-Δ1、l eu2-1、rpb1-1)は、ＨＩＳ4転写の崩壊速度を測定するのに特に有用である。温 度感受性rbp1-1ポリメラーゼII対立遺伝子は、25から36℃へのシフトの後に新し い転写を迅速に停止させる。温度シフトの後に指定された時間間隔で除去する細 胞の一部から単離したＲＮＡ上で定量的ノーザンブロッティングを実施すること ができる(Ｐarkerら，1991)。このアッセイを用いて、ＲＮＴ1において種々の推 測のドミナントネガティブおよび機能欠損突然変異の相対強度を比較することが できる。最初に、ＰＬＹ154を野生型rent1で相補化させることが可能である。得 られた系統(ＰＬＹ154Ｒ)をrent1の推測のドミナントネガティブ型を発現する構 築物で形質転換することができる。次いでHis4転写の崩壊速度を決定し、野生型 rent1を有するＮＭＲＤ機能を前もって再構築することなく、ＰＬＹ154において アッセイすることができる。最も好ましい機能持性を示す対立遺伝子を、哺乳類 細胞培養実験に使用するために標的とすることが可能である。また、Upf1におけ る突然変異の何れもがrent1の機能に類似の効果を与えない場合には、rent１の ドミナントネガティブ型について選抜することが必要であり、次いでランダ ム突然変異誘発が行われているＲＥＮＴ1発現構築物で形質転換する(Leedsら，1 992)。37℃で増殖可能な形質転換体はドミナントネガティブＲＮＴ1対立遺伝子 を担持し、次いでそれは特徴づけられてさらなる実験に用いられ得る。 実施例９ ヒトＲＥＮＴ1タンパク質(ＡＡ121-917)はUPF1p活性を欠損した酵母においてＮ ＭＲＤを回復する rent1の機能上の性質を調査するために、発明者らは、Upf1p活性を欠損した酵 母中でのその発現がＮＭＲＤを回復することができるかどうかを、Upf1pを同定 するためにオリジナルに用いられているアロサスペッションアッセイを改変した ものを用いて決定した。発明者らは、ＨＩＳ４転写産物中における＋１フレーム シフト突然変異を担持するＰＬＹ38系統(MATa、ure3-52、his4-38、ＳＵＦ1-1、 upf1-2)および高温で効率のおちたｔＲＮＡフレームシフトサプレッサーを利用 した。この系統は、Upf1pの存在しない状態でｔＲＮＡサプレッサー活性およびh is4-38 ｍＲＮＡの安定性を組み合わせることによって、ヒスチジン欠乏培地に おいて増殖する。Upf1p活性を用いた再構築はhis4-38の多量のメッセージを減少 させ、サプレッサーｔＲＮＡ機能に対する寛容性が劣る高培養温度において増殖 の失敗を引き起こす。 ＲＥＮＴ1発現構築物での酵母系統ＰＬＹ38の形質転換は、酵母Upf1p欠乏性表 現型を相補することに失敗した。酵母ＡＤＨ1 ＵＴＲを置いて全ＲＥＮＴコーデ ィング配列をフランクした場合に、同一の結果が得られた(データは示されてい ない)。端のＮおよびＣ末端における分化が種特異的な機能上の束縛を与えるか どうかを試験するために、発明者らはUpflp 5'ＵＴＲおよびＮ末端(aa1-59)、ヒ トタンパク質のボディ(aa121-917)、およびUpf1pＣ末端(aa854-971)および3'Ｕ ＴＲをコードする構築物(pMET-キメラ)を調製した。高温でpMET25-キメラ形質転 換体において劇的な増殖の阻害が見られ、このことはヒトrent1タンパク質の中 心部分が酵母において機能して欠陥Upf1pタンパク質を有する突然変異 酵母表現型をレスキューすることが可能であることを指摘する。 実施例９ rent1 のための哺乳類発現ベクター構築物 哺乳類の細胞においてrent1を発現させるために、哺乳類発現構築物を作製し た。それぞれの構築物を多数の型、発現野生型ＲＥＮＴ1または２つの推測のド ミナントネガティブ型の１つの何れかに作成した。該ドミナントネガティブ突然 変異を、オリゴヌクレオチド媒介位置指定突然変異誘発(Dietz & Kendzior，199 4)によって発生させた。突然変異の位置および性質はUpf1に関する以前の研究(L eeds，1992)に基づいて選択された。ＵＰＦ1、Ｇ556Ｄ、およびＲ779Ｃにおける ２つの突然変異は、最も強力なドミナントネガティブ表現型を与えた。対応する 突然変異がヒトＲＮＴ1のＯＲＦにおいて行われた(Ｇ619ＤおよびＲ843Ｃ)。 ｐβＲＮＴ1-ＮＥＯと表された哺乳類発現構築物は、ベクターｐＨβApr-1の 改変を基礎としている(Gunningら，1987)。該ベクターは、ヒトβアクチンプロ モーター(約3kbの5'フランキング配列)、エキソン１中に含まれる77bpのβアク チン5'ＵＴＲ、およびその中で見出されるスプライスドナーおよびアクセプター およびエンハンサーコア配列を含むβアクチンイントロン１を含み、続いてポリ リンカーを含んでいる。このベクターは、種々の哺乳類の細胞において極めて高 レベルの発現を支持する(Gunningら，1987)。ネオマイシン耐性カセットの添加 によって該ベクターを改変して5’ＵＴＲの短領域および全3’ＵＴＲを含むＲＥ ＮＴ1 ＯＲＦを用いてポリリンカー中にサブクローニングした。ノーザン分析ま たはＲＴ-ＰＣＲを基礎とした方法の何れかを用いて、内生の転写産物とベクタ ー由来の転写産物とを判別することが可能なβアクチン5’ＵＴＲで、結果とし て得られた転写産物を5'タグ付きにする。pCMV-RNT1構築物は、ＣＭＶプロモー ターによって駆動されたRNTIORF（野生型および多数の推測のドミナンロネガテ ィブ型）を含む。融合タンパク質の免疫組織化学分析によって、rent1の細胞下 コンパートメント局在化の決定が可能となる。pHA-RNT1と命名された構築物の最 後のセットは、一過性 のトランスフェクションの研究に有用であるＮ末端ＨＡタグをコードする配列を 有するフレーム内にクローン化したＲＮＴ1 ＯＲＦを有する。 pMET25-RENT構築物のためには、全ＲＥＮＴ1コード領域を含むXhol断片をp426 MET25のSmaI部位に挿入した。pBM272UPF1由来のBamHI断片は、p426MET25のBamHI 部位に挿入してpMET25-UPFIを作出した。クローン化のための制限部位の付加を 伴う高中忠実度Taqポリメラーゼ(Pfu，Stratagene)を用いて、pMET25-キメラを 以下のように構築した：Upf1pの5'領域（5'ＵＴＲおよびaa1-59をコードする配 列）は、UPF-Bam-S(5'-ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＧ-3')（配列 番号１６）およびUPF-Sal-AS(5'-ＧＴＣＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＡ ＡＣＧＧ-3'戸配列番号17）を用いるＰＣＲによって増幅した。Upf1pの3'領域（ aa854-971および3'ＵＴＲをコードする）は、UPF-Not-S(5'-ＧＣＧＧＣＣＧＣＧ ＡＡＡＧＡＣＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＡＴ-3')（配列番号18）およびUPF-Hind-AS( 5'-ＡＡＧＣＴＴＡＴ-ＣＣＡＡＡＧＴＡＴＡＴＴＧＧＡＣＣＧＧＯ3'）（配列番 号19）によって増幅させた。ＲＥＮＴ1の中央領域（aa121-917をコードする）は 、PNT-SalS-1(5'-ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＴＧＴＧ ＧＡＡＴＡＣ-3')（配列番号20）およびRNT-NotAS-1(5'-ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣ ＧＧＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＣＡＣＧ-3')（ 配列番号21）で増幅させた。各ＰＣＲ産物をpBluescriptII/SK+(Stratagene)のS mal部位へサブクローニングし、適当な制限酵素で切り出し、BamHIおよびHindII Iで消化したp426MET25へ連結した。pMET25-y5'は、5'ＵＰＦ1 BamHI/SalI断片を BamHI/SalI消化p426MET25へ挿入することにより構築した。形質転換体を同様の ＯＤ６００までの液体培養にて増殖させ、連続的に希釈した培養物の4mlアリコ ートをメチオニン（プロモーター誘導用）、ウラシル（形質転換体の選択用）お よびヒスチジン（his4-38転写産物の安定性に関するマーカーとして）を欠いた 固形培地に播種した。さらなつ哺乳類の組換え発現ベクター構築物は図７、８お よび９に示し、当業者が本明細書で供された技術を用いて他のベクター構築物を 作製できるように例示目的で提供されている。実施例１０ ＮＭＲＤおよびＲＮＴ1発現を用いる疾病診断 ＮＭＲＤのＦＢＮ1遺伝子型特異的効果はマルファン症候群において表現型の 重篤度を変調する：極めて穏和なマルファン症候群(ＭＦＳ)疾患を患う患者のフ ィブリリン-1をコードする遺伝子(ＦＢＮ1)における１つの対立遺伝子のヌクレ オチド5138において4bpのタンデム挿入が同定された(Dietzら，1993b)。変異型 対立遺伝子由来の転写産物レベルは、野生型対立遺伝子によって産生される画分 の６％であった。突然変異は野生型由来の同レベルのｍＲＮＡに関与し、変異型 対立遺伝子は典型的かつ重度のＭＦＳ疾病を引き起こすが、この患者における表 現型は僧帽弁脱出症、長骨過形成および皮膚萎縮線条に限定される。この臨床上 の表示はＭＦＳに関する診断基準に適合せず、より厳密にはＭＡＳＳ表現型とし て特徴付けられよう。この穏和な表現型に関する病原性の基礎のための１つの仮 定として、野生型対立遺伝子由来のそれと比べて低レベルの変異型転写産物およ びタンパク質が、たとえ量が減じられても、結果として、構造的に正常な多量体 の形成のために好ましい化学量論となり、ゆえに穏和な疾病であることを示唆し ている。ＭＦＳを引き起こす付加的なナンセンス対立遺伝子を用いた実験は、発 明者らにこの仮説を検討させた。野生型対立遺伝子由来のそれと比較して、変異 型転写産物の約15％またはそれ以上のレベルと関連する変異型対立遺伝子は、重 度のＮＳＦ疾病に関連するが、一方、６％より小さい場合と関連しているものは より穏やかなＭＳＦ表現型に明白に関連していたことが観察された。記載したご とくに、疾病、骨形成不全症において、恐らく変異型転写産物およびモノマーの 幾分明白な閾値は、野生型レベルの６ないし16％の間である可能性があり、典型 的なＭＦＳの発現に必要とされる。 ナンセンス対立遺伝子を担持するセルラインにおいてフィブリリン-1の代謝を 調べた(Aoyamaら，1993;1994)。規定のＦＢＮＩ突然変異を持つ患者由来の繊維 芽細胞を放射性標識したシステインの存在下で増殖させた。次いで、細胞コンパ ートメントおよび細胞外マトリックスにおけ る放射性標識フィブリリン含量の測定に先立ち、特定の時間間隔で非標識媒体で その培養物を「追跡」した。興味深いことに、15％以下の変異型転写産物レベル に関連する突然変異は全て、対照のラインに比べ50％のフィブリリン-1合成を示 したが、合成されるタンパク質の重度に損なわれたマトリックス利用は野生型対 立遺伝子由来の産物であることが推定される。これに対し、６％の変異型転写産 物レベルと関連した突然変異もまた、およそ50％の合成を示したが、このタンパ ク質は全てマトリックスに効果的に組み込まれた。 本発明の多くの具体例を示したが、本発明の精神並びに範囲を逸脱せずに種々 の変更を行えることが理解されよう。従って、本発明は特に例示された具体例に よって制限されるものではなく、添付の請求の範囲によってのみ限定されるもの である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/7088 Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３Ｑ 48/00 31/70 ６２３ Ｃ０７Ｋ 14/47 48/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 5/10 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ 33/53 33/53 Ｄ 33/566 33/566 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｒｅｎｔ１の生物活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸。 ２．前記核酸が図１の配列番号１の配列を含む配列を有する、請求項１に記載の 核酸、およびその縮重変異体。 ３．配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を有する、単離さ れた核酸、およびその縮重変異体。 ４．配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を有する、単離さ れた核酸、およびその縮重変異体。 ５．配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する、単離さ れた核酸、およびその縮重変異体。 ６．前記核酸が配列番号１のｒｅｎｔ１の保存されたＮ末端アミノ酸配列中の保 存された少なくとも約５個の連続アミノ酸をコードする断片を含む配列を有す る、請求項１に記載の核酸、およびその縮重変異体。 ７．前記核酸が配列番号１のＲＥＮＴ１の保存されたＣ末端アミノ酸配列中の保 存された少なくとも約５個の連続アミノ酸をコードするセグメントを含む配列 を有する、請求項１に記載の核酸、およびその縮重変異体。 ８．前記核酸がヒトのものである、請求項２、３、４、５、６、または７のいず れか１項に記載の核酸。 ９．前記核酸が配列番号２の配列を含む配列を有する、請求項１に記載の核酸、 およびその縮重変異体。 10．配列番号２と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を有する、単離さ れた核酸、およびその縮重変異体。 11．配列番号２と少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を有する、単離さ れた核酸、およびその縮重変異体。 12．配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する、単離さ れた核酸、およびその縮重変異体。 13．前記核酸がマウスのものである、請求項９、１０、１１、または１２のいず れか１項に記載の核酸。 14．前記核酸の配列が、 （ａ）請求項２または９のヌクレオチド配列（ここで、ＴはＵでもよい）、 （ｂ）請求項２または９のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする 核酸配列、および （ｃ）少なくとも９ヌクレオチドを含み、かつ請求項２または９のヌクレオ チド配列の相補体にハイブリダイズする（ａ）または（ｂ）の断片、 よりなる群から選択される、請求項２または９に記載の単離された核酸。 15．ドミナントネガティブ活性を有する配列番号１の配列を含む配列を有する、 単離された核酸。 16．請求項２または９に記載の核酸を含有する組換え発現ベクター。 17．実質的に純粋なｒｅｎｔ１ポリペプチド。 18．ヒトのものである、請求項１７に記載のポリペプチド。 19．マウスのものである、請求項１７に記載のポリペプチド。 20．ｒｅｎｔ１のアミノ酸配列（配列番号２）で保存されている少なくとも５個 の連続アミノ酸の断片を含んでなる、請求項１８に記載のポリペプチド。 21．薬剤学的に許容される担体中の、請求項２または９に記載の核酸の遺伝子送 達と遺伝子発現のための製剤。 22．ＲＥＮＴ１組換え発現ベクター構築物を含有する安定な形質転換細胞。 23．前記組換え発現ベクター構築物がＲＥＮＴ１ポリヌクレオチドの発現または ｒｅｎｔ１ポリペプチドの機能を調節する、請求項２２に記載の細胞。 24．前記調節が阻害性である、請求項２３に記載の細胞。 25．前記調節が刺激性である、請求項２３に記載の細胞。 26．ドミナントネガティブｒｅｎｔ１組換え発現ベクターを含有する、請求項２ ３に記載の細胞。 27．原核細胞である、請求項２３に記載の細胞。 28．真核細胞である、請求項２３に記載の細胞。 29．哺乳動物細胞である、請求項２７に記載の細胞。 30．突然変異アレルを有する遺伝子の同定方法であって、 （ａ）細胞をｒｅｎｔ１組換え発現ベクターでトランスフェクションし、 （ｂ）トランスフェクション後の細胞の表現型を決定し、 （ｃ）トランスフェクション後の細胞の表現型を、トランスフェクション前 の細胞の表現型と比較し、そして （ｄ）トランスフェクションされた細胞の突然変異アレルを含む遺伝子を同 定する、 ことを含んでなる上記方法。 31．前記ｒｅｎｔ１組換え発現ベクターがドミナントネガティブｒｅｎｔ１をコ ードする、請求項２９に記載の方法。 32．前記組換え発現ベクターがアンチセンスＲＥＮＴ１をコードする、請求項２ ９に記載の方法。 33．欠陥マルチマータンパク質が関与する疾病状態の同定方法であって、 （ａ）細胞をｒｅｎｔ１組換え発現ベクターでトランスフェクションし、 （ｂ）トランスフェクション後の細胞の欠陥マルチマータンパク質の割合を 決定し、 （ｃ）トランスフェクション後の細胞の欠陥マルチマータンパク質の割合を トランスフェクション前の細胞の欠陥マルチマータンパク質の割合と比較する 、 ことを含んでなる上記方法。 34．前記ｒｅｎｔ１組換え発現ベクターがドミナントネガティブｒｅｎｔ１表現 型をコードする、請求項３２に記載の方法。 35．前記組換え発現ベクターがアンチセンスＲＥＮＴ１をコードする、請求項３ ２に記載の方法。 36．ｒｅｎｔ１発現またはＮＭＲＤを調節する試験組成物の同定方法であって、 （ａ）ｒｅｎｔ２と試験組成物を含む成分をインキュベートし、そして （ｂ）ＮＭＲＤに及ぼす作用を測定する、 ことを含んでなる上記方法。 37．（ａ）ｒｅｎｔ１またはＮＭＲＤを調節する請求項３５に記載の試験組成物 を細胞に導入し、 （ｂ）（ａ）後の細胞の表現型を決定し、 （ｃ）（ａ）後の細胞の表現型を（ａ）前の細胞の表現型と比較し、そして （ｄ）試験組成物が導入された細胞の遺伝子を同定する、 ことを含んでなる遺伝子の同定をさらに含む、請求項３５に記載の方法。 38．ｒｅｎｔ１が、ｒｅｎｔ１（配列番号２）またはｒｅｎｔ１（配列番号４） のアミノ酸配列中に保存されている少なくとも８個の連続アミノ酸のセグメン トを含むポリペプチドによりコードされる、請求項３５または３６に記載の方 法。 39．ｒｅｎｔ１が、請求項２または９に記載のＲＥＮＴ１のヌクレオチド配列と 少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸により コードされる、請求項３５または３６に記載の方法。 40．ｒｅｎｔ１への結合を調節する試験組成物の同定方法であって、 ａ）ｒｅｎｔ１と試験組成物とを含む成分をインキュベートし（その際、イ ンキュベーションは前記成分が相互作用するのに十分な条件下で行う）、そし て ｂ）ｒｅｎｔ１への結合に及ぼす試験組成物の作用を測定する、 ことを含んでなる上記方法。 41．（ａ）ｒｅｎｔ１への結合を調節する請求項３９に記載の試験組成物を細胞 に導入し、 （ｂ）（ａ）後の細胞の表現型を決定し、 （ｃ）（ａ）後の細胞の表現型を（ａ）前の細胞の表現型と比較し、そして （ｄ）試験組成物が導入された細胞の遺伝子を同定する、 ことを含んでなる遺伝子の同定をさらに含む、請求項３９に記載の方法。 42．ｒｅｎｔ１ポリペプチドの発現に関連した疾患の検出方法であって、疾患を 有するかまたは疾患を有することが疑われる被験体由来のサンプルを、前記ポ リペプチドの発現を検出する試薬と接触させて、サンプル中の前記試薬の結合 を検出する、ことを含んでなる上記方法。 43．前記試薬が抗体である、請求項４１に記載の方法。 44．前記試薬が核酸である、請求項４１に記載の方法。 45．前記核酸が請求項２または９のいずれか１項に記載の核酸とハイブリダイズ する、請求項４３に記載の方法。 46．ＲＥＮＴ１ヌクレオチド配列を利用して作出されたノックアウト動物。 47．ＲＥＮＴ１ヌクレオチド配列を利用して作出されたトランスジェニック動物 。 48．請求項４７に記載のトランスジェニック動物由来のタンパク質、細胞、体液 、組織、器官、または生物学的組成物。 49．標的細胞中のＲＥＮＴ１ ｍＲＮＡのレベルに影響を与える方法であって、 ａ）ＲＥＮＴ１核酸を含む製剤を標的細胞に送達し、そして ｂ）ＲＥＮＴ１核酸を含む製剤を標的細胞内で発現させる、 ことを含んでなる上記方法。 50．工程（ｂ）後に標的細胞中のＲＥＮＴ１ ｍＲＮＡのレベルの変化を検出す ることをさらに含む、請求項４９に記載の方法。 51．ＲＥＮＴ１核酸を含む製剤がin vitroで標的細胞中に導入される、請求項４ ９に記載の方法。 52．ＲＥＮＴ１核酸を含む製剤がin vivoで標的細胞中に導入される、請求項４ ９に記載の方法。 53．ＲＥＮＴ１核酸を含む製剤がex vivoで標的細胞中に導入される、請求項４ ９に記載の方法。