JP2000511561A - 肥満症の処置のためのｃｎｔｆ（毛様体神経成長因子）受容体アクティベーターの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は，肥満症およびそれに伴う疾患たとえば高血糖症の処置用薬剤の製造のためのｈＣＮＴＦ（ヒト毛様体神経成長因子），その突然変異体，またはＣＮＴＦ受容体を活性化する他の分子の使用に関する。図１は，遺伝的な肥満マウスおよび食餌誘導性の肥満を有するマウス（ＤＩＯ）における体重（左パネル）および食餌摂取量（右パネル）に対するｈＣＮＴＦおよびレプチンの抗肥満作用を示す。

Description

【発明の詳細な説明】 肥満症の処置のためのＣＮＴＦ（毛様体神経成長因子） 受容体アクティベーターの使用 本発明の主題はＣＮＴＦ（毛様体神経成長因子）受容体−たとえばｈＣＮＴＦ （ヒトＣＮＴＦ）またはｈＣＮＴＦの突然変異体を活性化する分子−の，肥満症 および関連疾患の処置に適当な医薬組成物製剤における活性成分としての使用に 関する。ｈＣＮＴＦの突然変異体の語は１個または２個以上のアミノ酸の置換に よりｈＣＮＴＦから理論的に誘導できるアミノ酸配列を意味する意図である。 工業国における成人人口の＞30％が罹患している肥満症は重要な公衆衛生上の 問題である。それがII型糖尿病，高血圧症，高脂血症および死亡率の上昇に関連 するからである。肥満症は，カロリー摂取とエネルギー消費の比の増大の結果と しての陽性のエネルギーバランスにより生じる。処置は，計画的または非計画的 ないずれの変化ののちにも，体内組織脂肪量を回復する機構の作動により一般的 に成功しない（1）。リポスターシス（lypostasis）の理論によれば，体内脂肪 沈着の大きさは視床下部に対し食欲を低下させ，エネルギー消費を上昇させるよ うに作用する脂肪細胞由来の循環分子によって構成されるフィードバックループ によって調節されると主張されている（2）。 最近同定された16-キロダルトンの血漿タンパク質，レプチン（3）は，このよ うなリポスタティック（lypostatic）なホルモンに期待される多くの基準を満た している。それは脂肪組織で発現し，その血漿レベルは齧歯類およびヒトにおい てボディマス（body mass）指数と高い相関を示す（4）。肥満（ob/ob）突然変 異マウスにレプチンが欠乏すると体内脂肪の著しい増大を招き，それは組換えタ ンパク質の全身投与により逆転させることができる（5，6，7）。しかしながら ，レプチンのｍＲＮＡおよび血漿タンパク質のレベルは，肥満対象では痩身対象 に対して上昇を示すことから，ヒト肥満症がレプチンの発現の欠乏によるとは考 えにくい（4）。すなわち，ヒト肥満症は多分，レプチンの輸送レベル，レプチ ン受容体活性，または受容体後シグナリング機構の欠陥により，レプチンのリ ポスタティック作用に感受性を示さないものと思われる（8）。 したがって，この特殊の分野においては，レプチンに対して抵抗性を示す対象 における肥満を矯正できる新たな薬理学的作用物質の必要性が存在する。 レプチン抵抗性は，大部分の細胞質内のドメインを欠くレプチン受容体の先端 切断型を発現する糖尿病（db/db）突然変異マウスの特徴的な性質である（9）。 ヒト肥満症にさらに密接に類似する動物モデルは，高脂肪食の摂取によって肥満 するマウスのモデルである（ＤＩＯマウス）。ヒト肥満症患者と同様，ＤＩＯマ ウスでは血漿レプチンレベルが上昇していて（4），このモデルはこのホルモン の体重低下作用に対する感受性が比較的低いことが示唆される。 本発明は，肥満ならびにそれに伴う高血糖症および高インスリン血症を逆転で きる生物学的に活性な抗肥満剤を提供する。 本発明の主題は，したがって肥満症および関連疾患の処置用薬剤の製造におけ るＣＮＴＦ受容体を活性化する物質の使用である。これらの物質は，ｈＣＮＴＦ （ヒト毛様体神経成長因子；配列番号：１）自体またはその突然変異体（たとえ ば，配列番号：２〜28参照）とすることができる。位置159〜位置178が以下のア ミノ酸配列を有する（添付の配列表に配列番号：５として示す）ｈＣＮＴＦ突然 変異体（Ser166Asp/Gln167His）ｈＣＮＴＦを用いて良好な結果が得られている （10）： LeuLysValLeuGlnGluLeuAspHisTrpThrValArgSer I leHisAsp LeuArgPhe（簡略化のため，このｈＣＮＴＦ突然変異体は本明細書においては ＤＨ-ＣＮＴＦとも呼ぶ）。簡略化するため，添付の配列表においては，突然変 異体配列番号：２〜22の位置159〜位置178の部分のみを示した。 本発明の他の主題は，肥満症およびその関連疾患の処置用組成物の製造のため のｈＣＮＴＦまたはその突然変異体をコードするＤＮＡの使用である。 本発明はまたその主題として，その活性成分の少なくとも１種に，ｈＣＮＴＦ またはその突然変異体を含有し，さらに医薬的に許容されるビヒクル（vehicle ）からなる，肥満症の処置および体重の低下のための薬剤を包含する。医薬的に 許容されるビヒクルとしては患者に危険ではなく，活性成分を分解もしくは不活 性化することはなく，またその作用に干渉しないビヒクルが意図される。 好ましいビヒクルは生理的食塩水であるが，他の生理的に許容されるビヒクルも 使用が可能であり，それらは本技術分野の熟練者には容易に同定できる。良好な 結果が得られている一実施態様においては，ｈＣＮＴＦまたはその突然変異体を レプチンと併用して用いることができる。この場合，野生型または突然変異型Ｃ ＮＴＦとレプチンの比は1:500〜1:5，好ましくは1:100〜1:25の範囲から選択で きる。 ｈＣＮＴＦまたはｈＣＮＴＦ変異体は，処置を必要とする患者に体重１kgあた り1〜10,000μｇの用量範囲で投与することができる。好ましい用量は，10〜100 0μｇ/kg体重である。成人の通常の１日用量は1〜100mgである。本発明の活性成 分の必要量は１日用量を１回にまたは１日を通じて数回に投与することができる 。処置基準では長期間の投与が要求されることがある。投与される用量サイズは 医師によって決定されなければならず，多くの因子，たとえば疾患の性質および 重症度，患者の年齢および健康状態，ならびに薬剤自体に対する患者の耐容性に 依存することになる。 特定の実施態様においては，ｈＣＮＴＦまたはその突然変異体は，体重の迅速 な有意の（５〜10％）低下を達成するために短期間（１〜２週）の毎日投与によ り肥満症患者の処置に使用することが可能であり，この体重の低下は以後，適当 な食餌療法および／または運動療法によって維持することができる。 活性なタンパク質分子は非経口，経鼻，気管支内または経皮投与用に処方する ことができる。本発明の医薬組成物は，好ましくは，注射により非経口的に投与 される。好ましい実施態様においては，非経口投与は皮下または筋肉内投与であ る。他の有効な投与方法には，静脈内注射，徐放性非経口処方，吸入用ミスト， または坐剤がある。徐放性処方においては，一次溶媒は水性または非水性タイプ とすることができる。さらに，ビヒクルとしては，製剤のｐＨ，粘度，澄明性， 色調，滅菌性，安定性，溶解速度または臭気を維持もしくは改変するための医薬 的に許容される他の賦形剤を含有させることができる。同様に，ビヒクルには活 性成分の安定性，溶解速度，放出または吸収を改良または維持する医薬的に許容 される賦形剤を含有させることができる。これらの賦形剤は通常，単一用量また は多重用量の両形態の非経口投与用量の製剤化に使用される物質である。 上述のように，本発明の製剤の好ましい非経口投与形態は，皮下または筋肉内 投与形態である。最も好ましい非経口投与形態は皮下投与形態である。活性成分 の所望の１日用量の投与を達成するためには，単回または反復皮下または筋肉内 注射によることができる。好ましい実施態様においては活性成分の用量は，10〜 1000μｇ/kg/日である。肥満症の処置には，活性成分を周期的に投与することが 望ましい。周期的投与は，毎月，１週おき，毎週，毎日または毎時間の投与の形 をとることができる。必要な投与頻度は標準的な観察方法に基づき，患者の処置 の担当者には自明の通りである。 本発明の医薬製剤には経口投与を考慮することもできる。この場合には，活性 成分は好ましくはカプセルに封入される。カプセルに封入された活性成分は固体 製剤の調製に通常用いられるビヒクルを使用しまたは使用しないで，製剤化する ことができる。好ましくはカプセルは，製剤中の活性成分が胃腸管内において， 生物学的利用性が最大になり体内への吸収前における分解が最小になる時点で放 出されるように作成される。製剤にはさらに，活性成分の吸収の促進の補助する 賦形剤を包含させることもできる。希釈剤，香味剤，低融点ワックス，植物油， 滑沢剤，懸濁剤，カプセル崩壊剤および結合剤を使用することも可能である。 投与方法とは独立に，特定の用量は患者のおおよその体重により計算される。 適当な処置用量の決定に必要な計算の更なる微細化は本技術分野の通常の熟練者 によれば定常的に行われ，煩雑な実験の必要はなく，本明細書に提供される試験 および用量情報に照らしてこれらの結果に到達することができる。 本発明によれば，肥満症患者に活性成分の治療的有効量が投与される。上述の ように，必要な用量は，本技術分野の熟練者によれば，煩雑な実験の必要はなく 決定できる。「治療的有効量」は，適当な体重減少が起こり，その結果として， 代謝パラメーターたとえば肥満症患者の血糖レベルの正常化を生じるのに十分な 活性成分の量と定義することができる。 以上，本発明を一般的に説明した。以下の実施例では，本発明の目的，特徴， 利点および操作方法のよりよい理解のために特定の実施態様を参照しながら，本 発明をさらに詳細に説明する。しかしながら，これらは本発明の範囲をそれによ って限定するものではない。図面の説明 図１ 遺伝的な肥満マウス（ob/obおよびdb/db）および食餌誘発肥満（ＤＩＯ）マウ スの体重（左パネル）および食餌摂取量（右パネル）に対するｈＣＮＴＦおよび レプチンの効果 マウスには第０日から始めてビヒクルまたはタンパク質（量はμｇ/マウス） の腹腔内注射を毎日行った。体重は第−２日における元の体重の百分率として表 示し，平均±ＳＥＭで示す（ob/obおよびdb/dbについてはｎ＝３，ＤＩＯマウス についてはｎ＝５）。ビヒクル処置動物の各群についてのベースライン体重（ｇ ）はob/ob，49.3±0.3；db/db，39.1±2.5；ＤＩＯ，42.6±0.8であった。統計 的な有意差は，反復測定ＡＮＯＶＡによって決定した。すべての群において，処 置の効果，時間，および時間×処置についてのＰ値はそれぞれ，Ｐ＜0.05，Ｐ＜ 0.0001およびＰ＜0.01であった。 図２ ｈＣＮＴＦ（2μｇ/マウス）およびレプチン（100μｇ/マウス）の単独もしく は併用投与のＤＩＯマウスにおける体重減少に対する効果 マウスには指示した薬剤の腹腔内注射を毎日実施した。 図３ 肥満および痩身マウスにおける体重および食餌摂取量に対するＤＨ-CＮＴＦの 効果 Ｃ57ＢＬ/ＫＳ db/dbマウス（丸印）もしくは年齢および性のマッチしたＣ57 ＢＬ/ＫＳ+/+マウス（四角）各群５匹をケージに入れ，ビヒクル（白）または10 μｇのＤＨ-ＣＮＴＦ（黒）の腹腔内注射を毎日25日間実施した。第26日からは すべてのマウスをビヒクルで処置した。食餌摂取量は各群における消費量のｇ数 を５で除した値である。 図４ 肥満マウスのＤＨ-ＣＮＴＦ処置のカルカス（carcass）組成に対する影響 マウスにはビヒクルまたは1０μｇのＤＨ-ＣＮＴＦの腹腔内注射を毎日10日間 実施した。結果は平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝５）。^*Ｐ＜0.05,^**Ｐ＜0.01，ビ ヒクルに対するStudent's t-検定による。 図５ レプチンおよびｈＣＮＴＦの神経細胞系におけるＳＴＡＴ因子の活性化に対す る効果 ヒトＯＢ-Ｒbの発現ベクターによってトランスフェクトしたＧＴ-1-7およびＳ Ｎ-56細胞を，指示されたサイトカイン（100ng/ml）の存在下または不存在下に1 0分間インキュベートした。細胞ＳＴＡＴ因子の活性化は電気移動度シフトアッ セイによって測定した。矢印は，結合ＳＴＡＴ3ホモダイマー，ＳＴＳＴ１：Ｓ ＴＡT3ヘテロダイマーおよびＳＴＡＴ1ホモダイマーの移動位置を示す。 図６ レプチン（ＯＢ-Ｒb）およびＣＮＴＦ［ＣＮＴＦ-受容体α（ＣＮＴＦＲα） およびＬＩＦＲ］の受容体のサブユニットのインシトゥハイブリダイゼーション で測定したマウス視床下部における発現 Ａ，弓状核；Ｐ，室傍核（×100）。 図７ レプチンおよびｈＣＮＴＦのマウス視床下部におけるtis-11の発現に対する効 果 ３群のob/obマウスにビヒクル，レプチン（100μｇ）またはＤＨ-ｈＣＮＴＦ （10μｇ）を腹腔内注射して，１時間後に頸椎脱臼によって屠殺した。ビヒクル またはタンパク質処置マウスからの凍結脳皮質切片にマウスtis-11に特異的な³⁵ Ｓ-標識ｃＲＮＡプローブを用いインシトゥ（in situ）ハイブリダイゼーション を実施した（×100）。 実施例１ ｈＣＮＴＦおよびその突然変異体ＤＨ-ｈＣＮＴＦの抗-肥満作用 方法 タンパク質の製造 組換えヒトＣＮＴＦおよびＤＨ-ＣＮＴＦは以前に記載されたように（11）， 大腸菌ＢＬ21において産生された。ヒトレプチンのＤＮＡをコードする配列は， Stemmerらの方法（12）に従い，合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを用いて ＰＣＲにより組み立て，細菌発現プラスミドｐＲＳＥＴ-5dにサブクローニング した（13）。ヒトレプチンはｈＣＮＴＦの場合と同じプロトコールを用いて産生 させた。すべてのタンパク質は逆相ＨＰＬＣ（11）を使用して精製し，細菌のリ ポ多糖を除去した。精製されたプレパレーションはリムルス変形細胞測定法（Li mulus amoebocyte assay）（Sigma）によって測定し,エンドトキシンの含量は５ ng/mgタンパク質未満であった。 動物実験 実験は雄性10〜11週齢のＣ57ＢＬ/6Ｊ ob/obおよびＣ57ＢＬ/ＫＳ db/dbマウス，ならびに12週齢から開始して高脂肪食の摂取によって肥満させた1 9週齢のＡＫＲ/Ｊマウス（14）のグループを用いて実施した。とくに指摘のある 例外を除いて，動物は個別ケージに入れ，水および標準または高脂肪（ＡＫＲマ ウス）齧歯類用固形飼料を自由に摂取させ，12時間明暗サイクル（7:30に点灯， 19:30に消灯）下に置いた。ビヒクルまたはサイトカインによる処置の開始（第 ０日）前２日間動物を毎日（9:00）ビヒクル（0.9％食塩水，エンドトキシンを 含まない0.2mg/mlのウシ血清アルブミン）の腹腔内注射に順化させた。注射後動 物を秤量し，飼料皿に残った固形飼料量を記録し飼料摂取量を測定した。 結果 ヒト毛様体神経成長因子（ｈＣＮＴＦ），その突然変異体ＤＨ-ＣＮＴＦ（10 ）［(Ser166Asp/Gln167His)ｈＣＮＴＦ］，ＣＮＴＦα-受容体に対して40倍高い 親和性を有するｈＣＮＴＦの突然変異体，およびヒトレプチンを，遺伝的な肥満 マウスおよび食餌誘発性肥満マウス（ＤＩＯ）において生物学的活性について試 験した。これらの肥満および糖尿病モデルは本技術分野において肥満状態の指標 として一般に受け入れられている。これらのモデルにおいて抗-肥満作用を示す 薬剤は同様の作用を他の動物とくにヒトでも示すと考えられている。 以下からさらに明瞭にみられるように，本発明の化合物は上述のすべての生物 学的試験において活性であり，抗-肥満剤であることも認められる。さらにそれ らは肥満に伴う高血糖症および高インスリン血症を逆転する活性を示す。したが って，これらの化合物はヒト糖尿病における高血糖症の処置にも有用であると考 えられる。 以前の実験およびその結果（6〜8，15）によれば，機能性のレプチンを発現し ない突然変異ob/obマウスにレプチンを全身投与すると，レプチン欠乏に伴う肥 満および過食は逆転することが見出された。ob/obマウスへのｈＣＮＴＦの毎日 腹腔内投与（2〜50μｇ/マウス，40〜1000μｇ/kg体重に相当）も進行的な用量 依存性の体重減少ならびに食餌摂取量の迅速な低下を生じる（図１）。試験した 最高用量（50μｇ；1000μｇ/kg）では，ｈＣＮＴＦは７日後に体重の16％低下 を生じ（ビヒクル処置対照の５％上昇に対して），食餌摂取量は５分の１に低下 した。これらの効果は，レプチン100μｇ（2000μｇ/kg）の効果（体重および食 餌摂取量のそれぞれ13％および95％低下；Studentのｔ検定でＰ＜0.0001）の大 きさに匹敵する。ｈＣＮＴＦ変異体ＤＨ-ｈＣＮＴＦは，ｈＣＮＴＦの約５分の １の低用量で類似の体重および食餌摂取量の減少が起こる。これはｈＣＮＴＦの 変異体の活性の欠如（11）とともに，受容体相互作用の傷害を生じ（データは示 していない），ｈＣＮＴＦの抗肥満作用は，特異的なＣＮＴＦ受容体の活性化を 介して誘発することが示唆される。 db/db突然変異マウスはレプチンに応答しない（6〜8，15）。これは細胞質内 ドメインの先端切断を有する受容体スプライス変異体の産生を生じるレプチン受 容体ＯＢ-Ｒのコード遺伝子における突然変異によるものである（9，29）。これ に反して，db/dbマウスのｈＣＮＴＦ処置では，用量および時間依存性の体重の 減少および食餌摂取の抑制が生じる（図１）。スーパーアゴニストのＤＨ-ＣＮ ＴＦはｈＣＮＴＦの約５分の１の用量で匹敵する作用を誘発する。ob/obおよびd b/dbマウスで得られた結果はｈＣＮＴＦがレプチンの放出の刺激またはレプチン 受容体の直接活性化により作用するものではないことを示している。 高脂肪食の摂取によって肥満するＡＫＲマウス（ＤＩＯマウス）は，レプチン の体重および食欲減退作用にob/obマウスほど感受性ではないことが以前に報告 されている（7）。この所見からは，レプチンの血漿レベルがＤＩＯマウスで痩 身の同腹仔よりも高いことの観察とともに，食餌誘発性の肥満はレプチン抵抗性 を伴うとの考え方が導かれる。図１に示すように，ＤＩＯマウスのヒトレプチン （100μｇ；2500μｇ/kg）による５日間処置は中等度の体重減少（7±1％；Ｐ＜ 0.05対ビヒクル）および食餌摂取量の低下（27±2％；Ｐ＜0.05）を生じる。こ れに反し，ｈＣＮＴＦ（50μｇ;1250pｇ/kg）およびＤＨ-ＣＮＴＦ（10μｇ；25 0 μｇ/kg）は体重（それぞれ19±1％および24±1％；Ｐ＜0.0001）および食餌摂 取量（それぞれ76±4％および73±7％；Ｐ＜0.0005）のはるかに著しい低下を誘 発する。ｈＣＮＴＦがdb/dbおよびＤＩＯマウスの両者において肥満を逆転でき ることの発見は，レプチンに対する抵抗性との関連が推測されているヒト肥満症 （4，18，19）の処置に重要な関係がある。 以上から明らかなように肥満マウスに，50〜1000μｇ/kg体重に相当する2〜50 μｇの用量で毎日ｈＣＮＴＦまたはその突然変異体ＤＨ-ＣＮＴＦが腹腔内に投 与された。最高用量では，化合物は処置５日後，体重に10％以上の減少を生じる 。したがって，ｈＣＮＴＦまたはＤＨ-ＣＮＴＦの1000μｇ/kg以下の用量，好ま しくは約100μｇ/kgの用量を肥満症に冒されている患者に体重の急速な低下（５ 〜10％）を誘発するために投与する。さらに，この形の好ましい実施態様におい ては，ｈＣＮＴＦまたはＤＨ-ＣＮＴＦは１日に１回投与し，数日間，所望の体 重低下が得られるまで処置を継続する。 実施例２ ｈＣＮＴＦとの相乗作用によるＤＩＯマウスにおけるレプチンの抗-肥満作用 の増強 肥満ＤＩＯマウスに，レプチン（100μｇ；2500μｇ/kgに相当）をｈＣＮＴＦ の小用量の（2μｇ；50μｇ/kgに相当）とともに毎日腹腔内に投与した。この２ 種の薬剤はいずれもそれ自体は有意な体重減少を生じない。この処置は強力な相 乗的体重減少を生じる作用を有する（図２）。この結果は，レプチン抵抗性を伴 う肥満モデルにおいてｈＣＮＴＦの小用量がレプチンの作用を有意に増強させる ために使用できることを証明するものである。 実施例３ ＤＨ-ＣＮＴＦの抗-肥満作用の持続および特異性 方法 行動学的研究 歩行活動は，暗サイクルの３時間（21:00〜24:00）の間にマウスがホームケー ジの中央線を横切る回数を評点づけすることによって測定した。身繕い行動はホ ームケージ内の限局観察（30分の明サイクルの間にそれぞれ１分の観察５回）に より，０〜３の評価尺度（０，活動なし；１，弱い；２，正常，３，亢進）を用 いて評価した。条件づけ味覚嫌悪試験は新規な味覚として0.1％サッカリン入り の２つの瓶の規範（two-bottle paradigm）を用いて実施した（20）。 体組成 カルカスをホモジナイズし，２ｇのアリコート（aliquots）を凍結乾燥し，さ らに重量が一定になるまで90℃で乾燥した。ついで脂肪をエチルエーテル／エタ ノール（20:1，v/v）で抽出した（21）。水および脂肪含量はそれぞれ脱水およ び脂肪抽出後の重量差から計算した。赤身含量（lean mass）はカルカスの残量 と定義する。 結果 ｈＣＮＴＦは，正常マウスにおいて，体重および食餌摂取量の一過性の減少を 引き起こすことが以前に報告されている（22）。肥満動物に対するその作用は， これまで研究されていない。したがって，肥満動物において，その作用の感受性 が失われる傾向があるか否かを決定することは重要である。図３に示すように， ＤＨ-ｈＣＮＴＦは肥満マウスにおいて，長期間持続する作用を発揮する。ＤＨ- ＣＮＴＦによるdb/dbマウスの25日間処置では，漸進的で着実な体重の減少を招 来し，第８日までには年齢および性がマッチした野生型マウスの場合に相当する レベルに到達する。平行してＤＨ-ＣＮＴＦは食餌摂取量に〜50％の低下を誘発 し，これは処置の間を通じて維持される。類似の結果がｈＣＮＴＦで17日間処置 されたob/obマウスでも得られた（データは示していない）。ＤＨ-ＣＮＴＦはこ れに反し，株の一致する野生型マウスでは一過性の作用を誘発するのみである。 すなわち，ＤＨ-ＣＮＴＦは痩身マウスにおける食餌摂取量および体重の変化率 を急速に抑制するが，これらの作用はそれぞれ処置のほぼ５および10日後には減 退する（図３）。 肥満と痩身動物の間に観察される差の説明としては，ｈＣＮＴＦがレプチンと 同様に（5，6），脂肪組織量を優先的に枯渇させ，その作用の程度および持続は 脂肪沈着のサイズに依存するという可能性が考えられる。ＤＨ-ＣＮＴＦは，実 際，ob/obおよびdb/dbマウスにおいて体脂肪の百分率を特異的に低下させるが， 一方，体内の水分および赤身の量はビヒクル処置対照に比較して上昇させる （図４）。ＤＨ-ＣＮＴＦによって誘発される絶対的な体重減少は著しい体脂肪 の喪失（喪失量の60〜70％）とそれに伴う水分含量のより少ない低下（絶対重量 は図４参照）によって説明することができる。レプチンはob/obマウスにおいて 類似の作用を生じる（5，6）。すなわち，肥満マウスにおいて，ｈＣＮＴＦは特 異的な抗肥満作用を誘発する。これに反し，ｈＣＮＴＦは痩身マウスにおいては ，筋肉（23）またはタンパク質量（24）を低下させると報告されている。この明 らかな矛盾の考えられる説明は，ｈＣＮＴＦの顕著な脂肪枯渇作用が痩身マウス においては，ほとんど完全な体脂肪の喪失を招き［（23）および本発明者らの未 発表データ参照］，これが二次的現象としてタンパク質の喪失を生じるとするも のである。 ｈＣＮＴＦは毒性，倦怠または疾患を誘発しない。不可逆性の毒性は体重およ び食餌摂取量がタンパク質の投与の中断後，db/db（図２Ｇ，Ｈ）およびob/obマ ウス（データは示していない）の両者において速やかに処置前レベルを回復する 所見により除外される。歩行運動はdb/dbマウスのＤH-ＣＮＴＦ（10μg）３日問 処置により，ビヒクル処置対照と比較して有意に変化しない（活性評点はそれぞ れ，43±6および49±6；ｎ＝５）。同様にＤＨ-ＣＮＴＦ処置は身繕い行動を変 化させない（活性評点はＤＨ-ＣＮＴＦ処置およびビヒクル処置についてそれぞ れ，1.2±0.6および1.0±0.4）。さらに，ＤＨ-ＣＮＴＦはいずれのタイプの常 同行動も誘発しない。このタンパク質が味覚嫌悪を生じる可能性は新規な味覚と して0.1％サッカリン入りの２つの瓶の規範を用いてＤＩＯマウスで調べた（20 ）。ob/obマウスにおいて水の摂取量を低下させると報告されている（5）レプチ ンと同様に，ＤＨ-ＣＮＴＦ（10μｇ）ではＤＩＯマウスにおいて条件づけ２日 後に水の摂取量を低下させる（1.8±0.1ml，ビヒクル処置対照の2.8±0.2ml，ｎ ＝５に対してＰ＜0.001）。ＤＨ-ＣＮＴＦは，しかしながら，味覚嫌悪を生じな い（サッカリン摂取量：総液体摂取に対し49±2％，対照群；51±4％）。これら の結果はＤＨ-ＣＮＴＦの嫌悪作用がサイトカインにより誘発される病的行動に よるものではないことを指示している。 実施例４ ｈＣＮＴＦおよびＤＨ-ＣＮＴＦによる肥満関連代謝欠損の逆転 方法 マウスに，ビヒクル，レプチン（100μｇ），ｈＣＮＴＦ（50μｇ）またはＤ Ｈ-ＣＮＴＦ（10μｇ）を毎日腹腔内に注射した。ペアフィーディング（pair-fe eding）実験（２および４）においては，ビヒクル処置マウスは自由に飼料を摂 取させるか（対照）または前24時間ＤＨ-ＣＮＴＦ処置マウスによって消費され た飼料と同量の飼料を与えた。血液サンプルは，最後の注射から24時間後（実験 １および３），または最後の注射から７時間後飼料を与えないで（実験１および ３）採取した。血清グルコースはグルコースオキシダーゼ法により，血清インス リンは標準としてラットインスリンを用いてラジオイムノアッセイ（Amersham） により測定した。 結果 体重および食欲調節作用に加えて，ｈＣＮＴＦおよびＤＨ-ＣＮＴＦはobおよ びdb突然変異に伴う高血糖症および高インスリン血症を逆転させることができる 。 Ｃ57ＢＬ/6バックグランドにob突然変異を有するマウスは高度の高インスリン 血症（２〜３月齢後にはほぼ正常のグルコースレベル）を示し（25），これはレ プチン処置で矯正できる（5，6，15）。ｈＣＮＴＦまたはＤＨ-ＣＮＴＦによるo b/obマウスの処置も血清インスリンレベルの強力な低下招く（表１，実感１およ び２）。Ｃ57ＢＬ/ＫＳバックグランドにおけるdb/db突然変異体は，重篤な高血 糖症（２〜３月齢後にはほぼ正常のインスリンレベル）を特徴とする（26）。以 前に報告されているように（5，6，15），レプチンはdb/dbマウスにおける高血 糖症を逆転することはできない。これに反して，ｈＣＮＴＦおよびＤＨ-ＣＮＴ Ｆは，既に低いインスリンレベルに影響することなく，飼料摂取時および絶食時 両者の血清グルコースレベルを２〜３分の１に低下させる（表１，実験３および ４）。ＤＨ-ＣＮＴＦの体重減少および抗糖尿病作用は，サイトカイン処置動物 の食餌摂取量へのペアフィーディングによってob/obまたはdb/dbマウスに誘発さ れる効果を上回っている（表１，実験２および４）。これらの結果はレプチンの 場合と同様に，ｈＣＮＴＦの作用が単に食餌摂取量の低下によるものではないこ とを示している。 データは処置群あたり３〜６動物からの平均値±ＳＥＭである。nd，測定して いない。^*Ｐ＜0.05，^**Ｐ＜0.001対ビヒクル，§Ｐ＜0.05対ペアフィーディング ，¶Ｐ＜0.001対ペアフィーディング（Studentのｔ検定）。実施例５ ｈＣＮＴＦおよびレプチンは重複神経シグナリングシステムを活性化する 方法 ＳＴＡＴ活性化アッセイ ＧＴ-1-7およびＳＮ-56細胞を完全培養培地（10％ウシ胎仔血清，ペニシリン ，グルタミンおよび，ＳＮ-56についてはピルビン酸ナトリウムを含有するダル ベッコの改良イーグル培地）中に維持した。細胞を100mmの皿にプレーティング し，24時間後，セミコンフルーエント（semi-confluent）になった時点で使用し た。ヒトＯＢ-Ｒ（29）の全コード領域（ヌクレオチド141〜3770）を含有する発 現ベクターを，すでに報告されているようにして（30）調製して，リポフェクタ ミン（Lipofectamine）（Gibco BRL）により製造業者の説明書に従い細胞にトラ ンスフェクトした。24時間後，完全培養培地を含む60mmの培養皿に細胞を分配し ，さらに24時間後，血清を４時間除去し，ついで以下に特定するような様々なエ フェクターで処置した。次に，細胞を50ｍＭ ＮａＦを含有する氷冷リン酸緩衝 食塩溶液で洗浄し，遠心分離して収集し，液体窒素中で凍結した。以前に記載さ れたようにして（31）総細胞抽出液を調製した。活性化ＳＴＡＴ因子の高親和性 ＳＩＥｍ67オリゴヌクレオチド（32）への結合は，Sadowsky & Gilman（33）に 従い，10μｇの細胞抽出液を用いて電気移動度シフトアッセイにより測定した。 このオリゴヌクレオチドプローブは５'突出末端を[a-³²Ｐ]ｄＡＴＰおよび[a-³² Ｐ]ｄＣＴＰ（3000Ｃｉ/mmol）の存在下にクレノウ（Klenow）酵素で充填するこ とにより標識した。複合体は５％ポリアクリルアミド／2.5％グリセロール／0.5 ×ＴＢＥ（45ｍＭ Tris-ホウ酸塩，0.5ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ7.8）ゲル上で分割 し，ついで乾燥し，オートラジオグラフィーに付した。 インシトゥハイブリダイゼーション 視床下部の弓状核および室傍核を含む領域の一連の皮質脳切片を調製した。イ ンシトゥハイブリダイゼーションは，以前に記載された操作（34）に従い，³⁵Ｓ -標識ｃＲＮΛプローブを用いて実施した。マウスＯＢ-Ｒb，ＣＮＴＦＲa,ＬＩ ＦＲおよびtis-11のための特異的プローブは，適当なオリゴヌクレオチドプライ マーを用いて，マウス脳ＲＮＡのＲＴ-ＰＣＲによって得られ，各コード 配列のヌクレオチド2850〜3407，246〜856（ヒト配列による番号），2620〜3217 ，および1〜950に相当した。 結果 ｈＣＮＴＦおよびレプチンの部分的に共通する生物活性は，これらのタンパク 質が類似のシグナリング機構を介して作用することを示唆する。ｈＣＮＴＦおよ びレプチンがＳＴＡＴ転写因子のＤＮＡ結合活性を調節する能力を，２種の神経 細胞系，それぞれマウス中隔および視床下部ニューロンに由来するＳＮ-56（35 ）およびＧＴ-1-7（36）で調べた。細胞はＯＢ-Ｒのシグナリング適格の長型ス プライス変異体であるヒトＯＢ-Ｒbの発現ベクター（30，37，38）でトランスフ ェクトした。いずれの神経細胞系でも，ｈＣＮＴＦおよびレプチンはＳＴＡＴ3 ホモダイマーの卓越したＤＮＡ結合，程度の低いＳＴＡＴ1ホモダイマーおよび ＳＴＡＴ1/ＳＴＡＴ3ヘテロダイマーの結合の類似のパターンで，ＳＴＡＴ因子 の活性化を誘発する（図５）。このパターンは，ｇｐ130-シグナリングサイトカ インに特徴的であり（39），ＯＢ-Ｒbとｇｐ130ファミリーの受容体の間のＪＡ ＫキナーゼおよびＳＴＡＴ因子相互作用部位のコンセンサスモチーフ（consensu s motif）の存在を含めた配列類似性と一致する（9）。 レプチンとｈＣＮＴＦの重複する代謝作用の可能な説明は，これらのタンパク 質が，エネルギーの取り込みおよび消費の調節に関与する脳領域における共通の エフェクター経路を刺激することである。長型スプライス変異体は，たとえば， 視床下部の弓状核，前正中核および室傍核のような領域に顕著に発現する。視床 下部の満腹中枢がまた，ｈＣＮＴＦの標的であり得るかどうかを決定するために マウスＯＢ-Ｒb，ＣＮＴＦＲαおよびＬＩＦＲに特異的なｃＲＮＡプローブを用 いてインシトゥハイブリダイゼーションを実施した。，図６に示すように，マウ ス視床下部の弓状核および室傍核はレプチンおよびＣＮＴＦ受容体サブユニット のｍＲＮＡを発現する。予備的な結果では，付加的な核たとえば視床下部前正中 核におけるＣＮＴＦＲαおよびＬＩＦＲの発現が指示されている。 中枢の満腹中枢へのサイトカインシグナリング経路の存在と一致して，全身的 に投与されたレプチンはマウス視床下部における早期シグナリング応答を活性化 する（42，43）。ｈＣＮＴＦの作用機構がレプチンの場合と類似するとすると， ｈＣＮＴＦの末梢投与後にも視床下部応答の早期活性化が検出されなければなら ない。ｈＣＮＴＦおよび他のＳＴＡＴ3-依存性サイトカインによって迅速に誘導 される（45）tis-11一次応答遺伝子（44）を細胞の活性化のマーカーとして使用 した。ob/obマウスの視床下部tis-11ｍＲＮＡは，ビヒクル処置対照に比較しレ プチンまたはＤＨ-ＣＮＴＦの腹腔内投与１時間後に有意に増加していることが 見出された。インシトゥハイブリダイゼーションから弓状核が両サイトカインに よるtis-11誘導の主要部位であることが明らかにされた（図７）。 この結果は，全身的に投与されたｈＣＮＴＦおよびレプチンが，レプチンの作 用の重要な標的として解釈されている脳領域において早期のシグナリング応答を 誘発できること（15，41）を証明するものである。サイトカインが間接的に，た とえば末梢のメディエーターによりまたは求心性の神経を介しては視床下部細胞 を活性化することも除外することはできない。しかしながら，この作用の迅速性 は，弓状核におけるｈＣＮＴＦおよびレプチンに特異的な受容体の発現とともに 視床下部へのサイトカインの進入の結果としての，直接作用が主張されている。 ｈＣＮＴＦ（46）およびレプチン（47）はいずれも血管脳関門を通過することが できる。サイトカインも，レプチンについて報告されているように（47）特異的 な輸送システムを介して脳に浸透することが可能である。それらはまた，血管脳 関門の外部に位置する胃周辺器官を介して視床下部神経，たとえば弓状核に隣接 する（48）正中隆起にアクセスすることもできる。結論として，以上の結果は， ｈＣＮＴＦおよびレプチンの部分的に共通する生物活性が関連する作用機構に包 含されるという考え方と一致する。 実施例６ ｈＣＮＴＦおよびｈＣＮＴＦ変異体のＣＮＴＦＲα結合活性 ｈＣＮＴＦおよび様々なｈＣＮＴＦ変異体のＣＮＴＦ受容体-α（ＣＮＴＦＲ α）に対する相対的結合活性を，以前に記載されている固相結合アッセイ（10） によって測定した。表２に示すように，多数のｈＣＮＴＦ変異体がＣＮＴＦＲα に対して野生型のｈＣＮＴＦよりも高い親和性を有する。ＤＨ-ＣＮＴＦと同様 にこれらの変異体は肥満症および関連疾患たとえば糖尿病の処置における有用性 を高めるものである。

【手続補正書】 【提出日】平成１２年２月７日（２０００．２．７） 【補正内容】 請求の範囲 1. 体重を減少させるための医薬組成物を製造するためのＣＮＴＦ（毛様体神 経成長因子）受容体を活性化する物質の使用。 2. 該医薬組成物が肥満症の治療に適することを特徴とする、請求項１記載の ＣＮＴＦ受容体を活性化する物質の使用。 3. 該医薬組成物が肥満症に関連する疾患の治療に適することを特徴とする、 請求項２記載のＣＮＴＦ受容体を活性化する物質の使用。 4. 該肥満症に関連する疾患が過糖血症（hyperglycemia）または過インスリ ン血症（hyperinsulinemia）であることを特徴とする、請求項３記載のＣＮＴＦ 受容体を活性化する物質の使用。 5. 該肥満症に関連する疾患が糖尿病であることを特徴とする、請求項３記載 のＣＮＴＦ受容体を活性化する物質の使用。 6. 該物質がｈＣＮＴＦであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一 項に記載のＣＮＴＦ受容体を活性化する物質の使用。 7. 該物質がｈＣＮＴＦ変異体であることを特徴とする、請求項１〜５のいず れか一項に記載のＣＮＴＦ受容体を活性化する物質の使用。 8. 該ｈＣＮＴＦ変異体が、添付された配列表の配列番号：2〜配列番号：28 として報告されているアミノ酸配列を含む変異体からなる群から選択されること を特徴とする、請求項７に記載のＣＮＴＦ受容体を活性化する物質の使用。 9. 該ｈＣＮＴＦ変異体が、配列表に配列番号５として報告されているアミノ 酸配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載のＣＮＴＦ受容体を活性化する 物質の使用。 10．肥満症の遺伝子治療用の医薬組成物を製造するための、請求項１〜９のい ずれか一項に定義されている物質のうち少なくとも１つをコードするＤＮＡ分子 の使用。 11．該組成物が肥満症に関連する疾患の治療に適することを特徴とする、請求 項１０記載のＤＮＡ分子の使用。 12．該肥満症に関連する疾患が過糖血症（hyperglycemia）または過インスリ ン血症（hyperinsulinemia）であることを特徴とする、請求項１１記載のＤＮＡ 分子の使用。 13．該肥満症に関連する疾患が糖尿病であることを特徴とする、請求項１１記 載のＤＮＡ分子の使用。 14．該医薬組成物がカプセルの形で調製されることを特徴とする、請求項１〜 １３のいずれか一項に記載のＣＮＴＦ受容体を活性化する物質の使用。 15．少なくとも活性成分として請求項１０に定義されるＤＮＡ及び医薬的に許 容されるビヒクル（vehicle）からなる、肥満症の遺伝子治療用の医薬組成物。 16．該組成物が肥満症に関連する疾患の治療に適することを特徴とする、請求 項１５記載の医薬組成物。 17．該肥満症に関連する疾患が過糖血症（hyperglycemia）または過インスリ ン血症（hyperinsulinemia）であることを特徴とする、請求項１６記載の医薬組 成物。 18．該肥満症に関連する疾患が糖尿病であることを特徴とする、請求項１６記 載の医薬組成物。 19．少なくとも活性成分として請求項１〜９のいずれか一項に定義される物質 のうち少なくとも１つ及び医薬的に許容されるビヒクル（vehicle）からなる、 体重を減少させるための医薬組成物。 20．該組成物が肥満症の治療に適することを特徴とする、請求項１９に記載の 医薬組成物。 21．該組成物が肥満症に関連する疾患の治療に適することを特徴とする、請求 項１９記載の医薬組成物。 22．該肥満症に関連する疾患が過糖血症（hyperglycemia）または過インスリ ン血症（hyperinsulinemia）であることを特徴とする、請求項２１記載の医薬組 成物。 23．該肥満症に関連する疾患が糖尿病であることを特徴とする、請求項２１記 載の医薬組成物。 24．該活性成分がｈＣＮＴＦであることを特徴とする、請求項１９〜２３のい ずれか一項に記載の医薬組成物。 25．該活性成分がｈＣＮＴＦ変異体であることを特徴とする、請求項１９〜２ ３のいずれか一項に記載の医薬組成物。 26．該ｈＣＮＴＦ変異体が、添付された配列表の配列番号：２〜配列番号：２ ８として報告されているアミノ酸配列を含む変異体からなる群から選択されるこ とを特徴とする、請求項２５記載の医薬組成物。 27．該変異体が、配列表に配列番号：５として報告されているアミノ酸配列を 含むことを特徴とする、請求項２６記載の医薬組成物。 28．該医薬組成物が更に活性成分としてレプチンまたはレプチン様分子からな ることを特徴とする、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。 29．レプチンに対するｈＣＮＴＦ及び／または少なくとも１つのその変異体の 比率が１：５００〜１：５であることを特徴とする、請求項２８記載の医薬組成 物。 30．レプチンに対するｈＣＮＴＦ及び／または少なくとも１つのその変異体の 比率が１：１００〜１：２５であることを特徴とする、請求項２８記載の医薬組 成物。 31．該医薬組成物が更に薬理学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする 、請求項１５〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。 32．該賦形剤が活性成分の吸収を促進することを特徴とする、請求項３１記載 の医薬組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パオネッサ，ジアコモ イタリア国ローマ，ビア ソフォクル，65 (72)発明者 ラザロ，ドメニコ イタリア国ローマ，ビア アチリオ フリ ジェリ，146 (72)発明者 グロアギュアン，イザベル イタリア国ポメジア，ビア ラマルモラ, 54 (72)発明者 デイ マルコ，アナリズ イタリア国リエティ，ビア ウゴ フォス コロ，５ (72)発明者 ド マルチス，アンナ イタリア国ローマ，ビア レオポルド リ ュスポリ，64 (72)発明者 ラウフェル，ラルフ イタリア国ローマ，ビア モンターニュ ロッシオゼ，68 (72)発明者 コルテス，リカルド イタリア国ローマ，ビア マッシミリアー ノ マッシモ，16

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 肥満症およびそれに伴う疾患たとえば糖尿病の処置用医薬組成物の製造の ためのＣＮＴＦ（毛様体神経成長因子）受容体を活性化する物質の使用。 2. ＣＮＴＦ受容体を活性化する物質は，ｈＣＮＴＦ（ヒト毛様体神経成長因 子）またはその突然変異体である「請求項１」記載のＣＮＴＦ受容体を活性化す る物質の使用。 3. ｈＣＮＴＦの突然変異体は配列番号：２〜配列番号：28からなる群より選 択される「請求項２」記載のＣＮＴＦ受容体を活性化する物質の使用。 4. ｈＣＮＴＦの突然変異体は配列番号：５である「請求項３」記載のＣＮＴ Ｆ受容体を活性化する物質の使用。 5.肥満症およびそれに伴う疾患の遺伝子治療用の組成物の製造のためのｈＣＮ ＴＦまたはその突然変異体をコードするＤＮＡの使用。 6. 活性成分の少なくとも１種として，ｈＣＮＴＦまたは配列番号：２〜配列 番号：28からなる群より選択される少なくとも１種のその突然変異型を含有する ことを特徴とし医薬的に許容されるビヒクルから構成される肥満症およびそれに 伴う疾患の処置のための医薬組成物。 7. 活性成分はｈＣＮＴＦまたはその突然変異型およびレプチンであり，野生 型または突然変異体ＣＮＴＦとレプチンの比は1:500〜1:5とする「請求項６」記 載の医薬組成物。 8. 野生型または突然変異体ＣＮＴＦとレプチンの比は1:100〜1:25である「 請求項７」記載の医薬組成物。 9. 非経口，経鼻，気管支内，経皮または直腸投与用に処方された「請求項５ 〜８」に記載の医薬組成物。 10．活性成分を１日用量1〜10,000μｇ/kg体重として投与する「請求項５〜９ 」に記載の医薬組成物の投与方法。 11．１日用量は好ましくは10〜1000μｇ/kg体重である「請求項10」に記載の 投与方法。