JPH09503910A

JPH09503910A - トラコーマ・クラミジア検出のためのオリゴヌクレオチド及び方法

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Publication number: JPH09503910A
Application number: JP7508333A
Authority: JP
Inventors: バーチヤツク，ジヨン・デイー; カリーノ，ジヨン・ジェイ; サリチユーロ，ジヨン・エイ; パビツク，エドワード・ケイ; クロノウスキー，ポール・エイ; マンラブ，マシユー・テイー; マーシヤル，ロナルド・エル
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-08-18
Publication date: 1997-04-22
Anticipated expiration: 2018-06-23
Also published as: EP0716714A1; ES2171529T3; WO1995006756A3; AU1334495A; DE69429626D1; CA2170870C; EP0716714B1; CA2170870A1; DE69429626T2; WO1995006756A2; US5601978A; JP3418401B2; US5756298A; US5846785A; ATE211769T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachom atis)のＤＮＡを、他の関連したＤＮＡの存在下で例えばハイブリダイゼーション又はリガーゼ連鎖反応によって検出するために有用なオリゴヌクレオチドプローブに関する。本発明はまた、リガーゼ連鎖反応を使用した検体中のChlamydia trachomatis の検出方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】トラコーマ・クラミジア検出のためのオリゴヌクレオチド及び方法発明の分野本発明は、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法によるトラコーマ・クラミジア（Chlamydia trachomatis）を検出するために有用なオリゴヌクレオチドに関する。発明の背景クラミジア属の微生物は、真核細胞の真正細胞内寄生虫である。それは宿主細胞で生育増殖し、細胞の細胞質に封入体（inclusion）を形成し宿主の臨床的症状の原因となる。クラミジア属は３つの異なる種からなる。即ち、Chlamydiapsittaci，Chlamyd ia trachomatis ，Chlamydia pneumoniaeである。これらの種のうち、Chlamydia trachomatis 及びChlamydia pneumoniaeは結膜炎、トラコーマ生殖器感染、肺炎などの病気の原因となるヒトに一般的な病原菌である。 Chlamydia trachomatis を検出するために、臨床標本を真核細胞培養単層の上に接種し、４８時間以上インキュベートし、その後ヨウ素又はギムザで染色する。Chlamydia trachomatis 抗原を検出するために、及びクラミジア感染に反応して産生される抗体を検出するために、種々の免疫蛍光アッセイも使用される。クラミジア抗原の検出のための免疫蛍光の使用には、クラミジアを含む疑いのある臨床標本を、クラミジア抗原に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したモノクローナル抗体に接触させることが含まれる。抗クラミジア抗体の検出のための免疫蛍光技術にはミクロ免疫蛍光（ＭＩＦ）及び間接免疫蛍光が含まれる。ＭＩＦアッセイは、顕微鏡のスライドに精製した微生物を固定することにより行う。ＭＩＦ及び間接免疫蛍光の両者は、患者の標本中の生物に対する抗体の検出のための試薬としてクラミジアを利用する。ＭＩＦはガラススライドに固定した精製クラミジアを利用し、一方間接免疫蛍光は感染細胞の核の周囲の細胞質内封入体として組織培養細胞中で生育しているクラミジアを利用する。クラミジア種の検出のために酵素免疫アッセイも使用される。これらの方法のすべてが労力と時間を要する。 Chlamydia trachomatis を含む種々の病原菌を検出するための有用である可能性のある方法として、ドットブロット、スロットブロット、サザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション、in situ ハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション技術が提案されてきた。Mullisらの米国特許第4,683,195 号明細書に述べられているようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法をまた種々の病原菌の検出のために使用することが提案されてきた。 Hogan らによるＰＣＴ出願の国際公開第88/03957号明細書（1988年 6月25日公開）は核酸ハイブリダイゼーション技術を使用する非ウイルス生物の検出を提出している。この方法は、識別することが求められている特定の非ウイルス生物に独特であるとして選択したリボソームＲＮＡの一領域に相補的であるオリゴヌクレオチドを構築することを含む。Hogan の出願は、Chlamydia trachomatis の検出に有用であり得て、E.coli ｒＲＮＡの塩基６０−１０５、１７５−２１０、６００−６３５、８３０−８７０の配列にそれぞれ対応し、及びＥ．ｃｏｌｉ２３ＳＲＮＡの塩基２７５−３２０、３３０−３６５、１１６０−１１９０、１４５０−１４９０、１５１０−１５４５、１７１０−１７５０の配列にそれぞれ対応する１６Ｓ及び２３ＳリボソームＲＮＡに対する配列を含むオリゴヌクレオチド配列を提出している。該出願はまた、多数の他の非ウイルス生物に対するプローブを提出している。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）として知られる核酸増幅のための別の方法は、本発明の背景として更なる関心が持たれる。ＬＣＲでは、２つの１次（primary）プローブ（第１プローブ及び第２プローブ）及び２つの２次（secondary）プローブ（第３プローブ及び第４プローブ）を含むプローブ対を、いずれも標的に対しモル過剰で使用する。第１プローブは標的鎖の第１のセグメントにハイブリダイズし、第２プローブは標的鎖の第２のセグメントにハイブリダイズし、１次プローブが５′リン酸基−３′水酸基の関係で互いに隣接し、リガーゼが２つのプローブを共有結合的に融合産物に融合又は連結できるように第１セグメント及び第２セグメントが隣接する。更に、同様の隣接様式で第３プローブ（２次プローブ）は第１プローブの一部にハイブリダイズでき、第４プローブ（２次プローブ）が第２プローブの一部にハイブリダイズできる。勿論、標的が初めから２本鎖ならば、２次プローブもまず第１に標的の相補鎖にハイブリダイズするであろう。１次プローブの連結鎖が標的鎖から離れると、１次プローブの連結鎖は第３プローブ及び第４プローブにハイブリダイズする。第３プローブ及び第４プローブは連結し相補的な２次連結産物を形成する。連結産物が標的又は標的の相補鎖のどちらか一方に機能的に等価であることを理解することは重要である。ハイブリダイゼーション及び連結のサイクルを繰り返すと、標的配列が増幅される。この技術は、1989年 6月16日公開のK.Backman の欧州特許出願公開第320308号明細書及び1991年７月31日公開のK.Backman らの欧州特許出願公開第439182号明細書により完全に述べられている。両明細書は引用により本明細書に含まれるものとする。現在利用できる技術にもかかわらず、Chlamydia trachomatis を検出するために感度が良く、迅速で、特異的で、再現性のある技術が必要である。発明の概要本発明は、Chlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡの特異的検出に有用なオリゴヌクレオチドプローブに関する。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、長さが１０ないし約５０ヌクレオチドで、配列番号１、６、１１、１６又は２１記載の配列に対し、本明細書記載のハイブリダイゼーション条件下でこのような配列又はその相補鎖にハイブリダイズするために十分な相補性又は相同性を有する。十分な相補性又は相同性のためには一般的に約８０％ないし１００％の相補性又は相同性が必要とされる。典型的にはより短いプローブには高いパーセンテージが必要とされ、より長いプローブには低いパーセンテージでも有用である。長さが１５ないし４０、通常は約２０−２５ヌクレオチドの範囲のプローブが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドプローブは少なくとも２種のChlamydia trachomatis の血清学的変異株、好ましくは３種以上、理想的には１０種以上を検出するが、クラミジア属の他の生物を含む他の関連生物とは実質的に交差反応を起こさない。本発明のこのようなオリゴヌクレオチドプローブの好ましい例は配列番号２−５、７−１０、１２ −１５、１７−２０及び２２−２５のプローブである。本発明はまた、本明細書記載のプローブセット１（配列番号２−５）、プローブセット２（配列番号７−１０）、プローブセット３（配列番号１２−１５）、プローブセット４（配列番号１７−２０）及びプローブセット５（配列番号２２ −２５）、並びにそのコンビネーション、サブコンビネーションを含むChlamydi a trachomatis からの標的ＤＮＡを検出する２種以上、好ましくは４種のオリゴヌクレオチドプローブの組成物に関する。本発明のもう一つの特徴は、Chlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡの検出方法に関するが、該方法は、Chlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡを含む疑いのあるサンプルを供給する段階と、本明細書記載の配列番号１、６、１１、１６又は２１の配列の一つとハイブリダイズさせるために上記のオリゴヌクレオチドプローブとサンプルＤＮＡをハイブリダイズさせる段階（ここでオリゴヌクレオチドプローブは好ましくは直接的に又は間接的に信号を発生できるレポーター基で標識されるものとする）と、更にハイブリッドを検出することにより、通常はレポーターにより産生される信号を検出することにより標的ＤＮＡの存在を測定する段階を含む方法である。本発明の重に別の特徴は、上記の標識したオリゴヌクレオチドプローブによりリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を使用してChlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡを増幅し検出する方法を提供することである。該方法は一般的に、標的ＤＮＡを含む疑いのあるサンプル及び本発明の４種のプローブセットの１つ以上を供給する段階（ここで好ましくはプローブセットの少なくとも１つのプローブが検出することができるレポーター基で標識されるものとする）、更にリガーゼ連鎖反応を行い、レポーター基を検出する段階を含む方法である。ＬＣＲの特に好ましい変法では、標的依存性補正段階に先立ってプローブが互いに連結できないように修飾された形でプローブを準備する。好ましい一つの方法として、修飾されたプローブセットが連結する前に充填されなければならない少なくとも一つのギャップを含むという方法がある。標的依存性様式でのギャップの充填は、適当なデオキシヌクレオチド三リン酸（１種又は複数）を供給し、更にポリメラーゼ試薬を供給することで達成されるが、デオキシヌクレオチド三リン酸は４種全部よりは少ないものとする。その後、少なくとも一度、以下の段階を行う。プローブセットを標的ＤＮＡを含む疑いのあるサンプルと混合すること、ハイブリダイズした標的とハイブリダイズしたプローブを変性させること、変性させたプローブを変性させた標的ＤＮＡにハイブリダイズさせること、もしプローブ修飾が存在すれば、それを鋳型依存性様式で補正し、それにより隣接したプローブを産生させること、リガーゼを使用して隣接プローブを連結し再構成プローブを形成させること、再構成プローブ中の標識を検出すること。本明細書で使用する「補正（correction）」という用語は、欧州特許第439,182号明細書と同じ意味で使用する。本発明の更に別の特徴は、Chlamydia trachomatis の検出に有用なキットを含むというものである。該キットは、本発明のプローブセットを１種以上、リガーゼ試薬、ポリメラーゼ試薬、１種以上であるが４種全部ではないデオキシヌクレオチド三リン酸を含む１種以上の適当な容器を含む。典型的には、プローブセットからの少なくとも一つのプローブは標識又はレポーター基を有するが、これが無くとも検出は可能である。図面の簡単な説明図１はChlamydia trachomatis ＭＯＭＰ特異的な標的ＤＮＡとそれぞれの標的に並列されたオリゴヌクレオチドプローブを示す。図２はChlamydia trachomatis の潜在プラスミド特異的な標的ＤＮＡとそれぞれの標的に並列されたオリゴヌクレオチドプローブを示す。図のプローブセット１−４で、ＣＺはカルバゾール由来ハプテンを表し、ＡＤはアダマンタン由来ハプテンを表す。プローブセット５で、Ｂはビオチン残基を表し、Ｆはフルオレセイン残基を表す。これらの標識を本明細書で更に述べる。図と配列表の配列はプローブの正確な配列を示すが、同様の特徴（例えば、C ．trachomatis ＤＮＡの検出）を有するプローブが得られるそれらの配列の修飾又は変異も本発明の範囲内と精神内であると認められることを理解すべきである。発明の詳細な説明本発明のオリゴヌクレオチド配列（配列番号１−１５）（図１）は、Baehr，W ．ら、Proc．Nat'l．Acad．Sci.(USA),85,4000-4004(1988)により報告されたChl amydia trachomatis の主要外膜蛋白質（ＭＯＭＰ）をコードする遺伝子由来である。該遺伝子は少なくとも１１２０ヌクレオチドの長さであり、典型的には生物あたり１コピー存在している。本発明の配列番号１６−２５、図２に対応する他のオリゴヌクレオチドは、Chlamydia trachomatis に見出だされた潜在プラスミド由来である（Hatt,C，ら、Nucl.Acids Res,16(9):4053-4067）。潜在プラスミドは典型的には生物あたり７−１０コピー存在し、７４９８塩基対の長さであり、幾つかの読取り枠を含んでいる。本発明で使用されるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）の変法は、本明細書でＡ，Ｂ（１次プローブ）、Ａ′，Ｂ′（２次プローブ）と命名した２対のプローブを使用する。Ａ′はＡに実質的に相補的であり、Ｂ′はＢに実質的に相補的である。ＤＮＡの逆平行の性質の故に、プローブＡとプローブＢ′は本明細書で「上流」プローブと命名し、それぞれのパートナーＢ，Ａ′に近接した３′末端を有し、プローブＢとプローブＡ′は「下流」である。プローブ対の一つの少なくとも一つのプローブは初めは、ハイブリダイズしたプローブを「非平滑末端」にし、及び／又は２種のプローブ二重鎖のリガーゼに触媒される融合のための適切な基質ではないものにする「修飾」末端を含む。「修飾末端」は、その相補的プローブに関してよりも連結点に関して定められる。他の「修飾末端」は公知であり、本発明の範囲内であるが、本明細書で述べる全部の「修飾末端」は、塩基を欠失しプローブ対が標的配列にアニールされるとき、上流のプローブと下流のプローブの間に「ギャップ」を生じる。これらの修飾末端の存在は、標的の無いときに相補的プローブ二重鎖の相互の平滑末端連結によって生じる偽陽性信号を減少させる。次に修飾の「補正」を行い、プローブを連結可能なものとする。本明細書で使用する「補正」という用語は、標的依存性様式で２種の１次プローブ又は２種の２次プローブをそれぞれのパートナーに連結可能なものとする方法を指す。標的、標的の相補鎖、それらから産生されるポリヌクレオチオド配列にハイブリダイズするプローブだけが「補正」される。「補正」は使用される修飾末端の型により幾つかの方法で達成される。ギャップ充填による補正を本明細書で例示する。この方法は鋳型依存性ポリメラーゼと必要なデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）を使用し、上流プローブを伸展させ、その末端を下流プローブに隣接させる。必要なｄＮＴＰは標的配列に基づいて決定される。本明細書で使用される「連結点」又は「連結予定点」は、鋳型依存性様式で連結される２種のプローブパートナー間の特異的な位置を指す。それは，「補正」されたプローブが３′水酸基−５′リン酸基の関係でそのパートナーに隣接して存在する部位である。４種のＬＣＲプローブの各セットの場合、２種の「連結点」がある。即ち、１次プローブパートナーのための点と２次プローブパートナーのための点である。慣用のＬＣＲでは、２つの連結点は互いに向き合い、プローブ対が互いにハイブリダイズするとき平滑末端二重鎖を形成する。本発明の実施態様で使用されるＬＣＲ法では、連結点は互いに向き合うものではなく、ギャップのために１以上の塩基により互いに離れている。連結の正確な点は、選択される配列により異なるものであり、それ故各実施態様の中で更に記述する。各プローブは、慣用のヌクレオチドホスホルアミダイト化学及びApplied Bios ystems,Inc.,(Foster City,CA);DuPont,(Wilmington,DE);又はMilligen,(Bedfor d,MA)から入手できる装置を使用して慣用的に合成できるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。リガーゼによる連結に必要な、適当なプローブの５′末端のリン酸化は当業界公知であるキナーゼ又は市販の合成試薬によって達成できる。プローブにおいて１つ以上のリボヌクレオチド残基を使用することがまた望ましい。一般的に、本発明を実行するにあたり有用なＬＣＲ法は変性とその後の以下の繰り返しの段階を含む。即ち（ａ）修飾されたプローブを標的にハイブリダイズさせること（及び標的相補鎖が存在する二重鎖ならば、標的の相補鎖にハイブリダイズさせること）、（ｂ）プローブを連結可能にするために標的依存性様式で修飾を補正すること、（ｃ）補正されたプローブをそのパートナーに連結し融合産物又は連結産物を形成させること、（ｄ）標的から連結産物を解離させ、ハイブリダイゼーション、補正、連結の各段階を繰り返し、所望の標的配列を増幅することである。（ａ）（ｃ）（ｄ）の段階は全ての実施態様で基本的に同じであり、一緒に論じることができる。（ｂ）段階は使用する修飾の型によって異なり、ギャップ充填だけを本明細書で論じる。プローブの標的（必要により標的の相補鎖）へのハイブリダイゼーションは当業界で広く公知であり、欧州特許出願公開第320308号明細書で説明されている。プローブの長さ、プローブの濃度、実験条件の厳格さは全てハイブリダイゼーションが起こる程度及び速度に影響を与える。好ましくは、プローブは所望の特異性をもたらすために十分な長さである。即ち、サンプルにおいて非標的配列にハイブリダイズ可能なことを避けるために十分な長さである。典型的には、１５ないし１００塩基のオーダーのプローブがこの目的に合う。現在、約１５ないし約４０の長さのプローブが好ましい。プローブは化学量論的に反応することが予期されるので、ほとんど等モル濃度で加えられる。一般的に各プローブは約５ｎＭないし約９０ｎＭの範囲の濃度で存在する。好ましくは約１０ｎＭないし約３５ｎＭである。典型的な反応容量である２００μＬでは、これは各プローブを約１．２×１０¹²ないし約４×１０¹²分子加えることに等しい。２００μＬ当たり約２×１０¹²分子が良好な出発点であったが、反応容量は変更できる。各反応のために使用するプローブの最適量も、行う必要のあるサイクル数と反応容量で変わる。所定のサイクル数で最適の信号を与えるためのプローブ濃度は当業者によって容易に決定される。「ハイブリダイゼーション」条件又は「ハイブリダイジング」条件は一般的に核形成（nucleation）及びアニーリングを促進する条件として定められる。しかし、このようなアニーリングはかなり予測できる様式で温度、イオン強度、プローブの長さ、プローブのＧ：Ｃ含量などの幾つかの要因に依存することは当業界公知である。例えば、反応温度を下げるとアニーリングを促進する。プローブのいかなるセットにとっても融解温度即ちＴｍは幾つかの公知の方法のいずれによっても決定できる。典型的には、診断への適用では融解温度よりわずかに低いハイブリダイゼーション温度を使用する。イオン強度即ち「塩」濃度はまた融解温度に大きな影響を与える。なぜなら、小カチオンはホスホジエステル骨格上の負電荷を打ち消して二重鎖の形成を安定化する傾向があるからである。典型的な塩濃度はカチオンの種類と価数に依存するが、当業者に容易に理解される。同様に、高Ｇ：Ｃ含量と長いプローブの長さはまた二重鎖形成を安定化することが知られている。なぜなら、Ａ：Ｔペアが２つの水素結合をもつのに対しＧ：Ｃペアは３つの水素結合をもつからであり、より長いプローブはプローブを保持する、より多くの水素結合をもつからである。このように高Ｇ：Ｃ含量とより長いプローブの長さは融解温度を上昇させて「ハイブリダイゼーション条件」に大きな影響を与える。ある診断への適用のためにプローブを選択すると、Ｇ：Ｃ含量及び長さを知り説明することができ、「ハイブリダイゼーション条件」を正確に決定できる。イオン強度は典型的に酵素活性のために最適化されるので、変わり得る唯一の要因は温度である。特異性を改善するために、ハイブリダイゼーション温度をプローブのＴｍより僅かに低い温度に選択する。典型的にはＴｍより２−１０℃低い温度に選択する。このようにある特定のプローブセットとシステムのための適切な「ハイブリダイゼーション条件」を得ることは当業者の通常の技術の範囲内である。プローブの提供の後、本発明で使用されるＬＣＲ法の次の段階は「隣接した」プローブを産生する特異的な補正段階である。この段階の次に一つのプローブを隣接パートナーに連結する。このようにして、各補正１次プローブをその関連した１次プローブに連結し、各補正２次プローブをその関連した２次プローブに連結する。ＤＮＡポリメラーゼを使用して補正を成し得る。各サイクル毎に追加のポリメラーゼを加える必要性を無くする熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが最も好ましい。「隣接したプローブ」の連結は「再構成されたプローブ」を産生する。酵素による連結は２つの隣接したプローブを共有結合で結合させる好ましい方法なので、「連結（ligation）」という用語を本明細書で使用する。しかし、「連結」は一般的用語であり、２つのプローブを共有結合で結合させるいかなる方法を含むと理解すべきである。酵素連結の一つの代替法は、欧州特許出願公開第3246 16号明細書に記載の光連結である。好ましい酵素連結段階を可能なものとする条件及び試薬は一般的に当業者に公知である。本発明で有用な連結試薬には、Ｔ４リガーゼ、並びに欧州特許第3203 08号明細書と欧州特許第373962号明細書で教示のE.coliＤＮＡリガーゼ及びTher mus thermophilus ＤＮＡリガーゼ（例えばATCC27634）などの原核生物リガーゼが含まれる。後者のリガーゼは、ＬＣＲの熱サイクルの間で活性を保持する能力を有するので現在では好ましい。熱安定性のリガーゼが無ければ、サイクルを繰り返す毎にリガーゼを加えなければならない。Rabin ら、J.Biol.Chem,261:10637-10 647(1986)によって報告されているDrosophilaのＤＮＡリガーゼなどの真核生物のリガーゼもまた有用である。連結後、連結（再構成）鎖を標的から解離し（例えば、融解）、ＬＣＲの慣用法のように工程を数回繰り返す。繰り返しサイクル数は１ないし約１００回の間であり得る。現在、約１５ないし約７０回が好ましい。相補的（２次）プローブにハイブリダイズするときに、連結予定点から離れた末端が他の望ましくない連結反応に加わらないようにプローブを設計することが望ましい。このため、粘着末端又は平滑末端は避けるべきである。このような末端を使用しなければならないときは、５′末端リン酸基を避け、除去し、又はブロックすべきである。オリゴヌクレオチドプローブを合成する（これらは通常５ ′末端リン酸基を有しない）かホスファターゼ酵素を使用して末端リン酸基を（例えば、ＤＮＡの制限消化により産生されたオリゴヌクレオチドから）除去することにより以上のことを達成できる。あるいは、プローブの「間違った」外部末端の連結を、「ホック（hook）」残基又はマーカー残基でプローブの少なくとも一つのプローブの末端をブロックして防止できる。このことは以下に詳細に述べる。上述したように、４種のプローブを使用すると、連結したプローブ又は再構成プローブはそれ自体、更なるサイクルで標的と等価の鋳型として働き、指数関数的増幅をするので、最大の増幅が可能となる。米国特許第5,185,243 号明細書に述べられているように、検出手段として一本鎖上で伸展し連結した２種のプローブを使用することも可能となる。こうした繰り返し段階で（相補的プローブの存在しないとき）線形増幅が生ずる。当業者ならば連結対のためのプローブセットから適切なプローブ対（例えば、プローブＡ及びＢ；又はプローブＢ′及びＡ′ ）を容易に選択できる。増幅後、増幅した配列を当業界公知の多数の方法で検出できる。非標識プローブは、重量又は長さに基づくゲル上での分離と当業界公知の適切な色素による染色の後、検出できる。より典型的には、検出は、標識した連結産物から連結していない標識したプローブを分離させた後、分画フラクションの一つにおいて標識量を測定して行える。分離は電気泳動、免疫クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、濾過、下記の好ましい特異的リガンド捕捉法、又はこれらの方法の組合わせによって行える。標識プローブには直接又は間接的に検出可能なレポーター基又は標識が含まれる。直接標識には色原体、酵素のような触媒、蛍光化合物、発光化合物、化学発光化合物、及び³²Ｐ又は³Ｈなどの放射性元素が含まれる。間接標識には、下記のような特異的結合リガンドが含まれる。特に好ましい態様では、ハプテンすなわち「ホック」は、少なくとも２種のプローブの利用できる外側の末端（融合産物の反対側末端）にレポーター基として結合する。「ホック」は結合パートナーに親和性を有するリガンド又は部分である。典型的にはホックには、融合産物の一端（例えば、第１上流プローブＡの５ ′末端及び第２下流プローブＡ′の３′末端）で、固相上にコートした抗体又はアビジンなどの特異的結合試薬によって固定化されうる抗原又はハプテンが含まれる。他端（例えば、第１下流プローブＢの３′末端及び第２上流プローブＢ′ の５′末端）でホックは抗体−酵素結合体などの標識又は標識システムによって認識されうる別の抗原又はハプテンを含む。ホックとしては、特に限定されないがハプテン（下記のような）、相補的ポリヌクレオチド「テール」領域、レクチン／炭水化物対、酵素及び補酵素、及び当業界公知の他のものが例示される。多数の異なるハプテンが当業界公知である。ハイブリダイゼーション又は連結を妨害しないならば、実質的にいかなるハプテンをも本発明で使用できる。幾つかの代表的ハプテンには、多数の薬剤（例えば、ジゴキシン、テオフィリン、フェンサイクリジン（ＰＣＰ）、サリチル酸塩等）、Ｔ３、ビオチン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ダンシル，２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ），ブロモウラシルなどの修飾ヌクレオチド、Ｎ−アセチル−７−ヨード−２−フルオレニルアミノ（ＡＩＦ）基を加えて修飾した塩基、及び多数の他のものが含まれる。本明細書で述べるハプテンのあるものは、本出願人の係属中の1991年12月17日出願の米国特許出願第07/808,508号（アダマンタン酢酸）及び米国特許出願第07/8 08,839号（カルバゾール及びジベンゾフラン）、本出願人の係属中の1992年 3月 27日出願の米国特許出願第07/858,929号（アクリジン）及び米国特許出願第07 /858,820号（キノリン）に開示されている。上記したハプテンに関する各出願の開示内容はすべて引用により本明細書に取り込まれるものとする。ハプテンをプローブに加える方法は多数文献で公知である。Enzo Biochemical (New York)及びClontech(Palo Alto)の両者はプローブ標識技術を述べ、市販化している。例えば、第１級アミンは、３′−アミン−ＯＮＣＰＧ^TM(Clontech, Palo Alto,CA)を使用して３′オリゴ末端に結合させることができる。使用して５′オリゴ末端に結合させることができる。アミンは、慣用の活性化及び結合化学を使用して種々のハプテンと反応できる。更に、共に係属中の1990年 12月11日出願の米国特許出願第625,566号及び1990年12月20日出願の米国特許出願第630,908号はそれぞれ５′及び３′末端でプローブを標識する方法を教示している。上記の共に係属中の出願は引用により本明細書に取り込まれるものとする。 1992年 6月25日公開の国際公開第92/10505号及び1992年 7月 9日公開の国際公開第92/11388号はそれぞれ５′及び３′末端でプローブを標識する方法を教示する。オリゴヌクレオチドを標識する一つの公知の方法によれば、標識−ホスホルアミダイト試薬を調製し、オリゴヌクレオチドへその合成の間に標識を加えるために使用する。例えば、Th uong,N,T．ら、Tet.Letters,29(46);5905-5908(1988)又はCohen,J.S.ら、発行された米国特許出願第07/246,688号(NTIS ORDER No.PAT-APPL-7-246,688)(1989)を参照せよ。こうして、典型的な連結されたオリゴヌクレオチドは一端にカルバゾールを有し、他端にアダマンタンを有し、それにより装置（Abbott Laboratories,Abbott Park,IL）により検出できる。アッセイ手順は市販のアルファフェトプロテインアッセイで使用されるものと同様であるが、以下のとおりである。（１）抗アルファフェトプロテイン抗体で被覆された微粒子を抗カルバゾール抗体で被覆された微粒子で置き換えること、（２）抗アルファフェトプロテイン抗体：アルカリ性ホスファターゼ結合体を抗３−フェニル− １−アダマンタン酢酸抗体：アルカリ性ホスファターゼ結合体で置き換えること。疫アッセイ（ＭＥＩＡ）の手順は更に、欧州特許出願公開第 439,182号、欧州特許出願公開第288,793号、Flore,M.らのClin.Chem.,34/9;1726 -1732(1988)に記述されている。典型的な手順は次のとおりである。ＬＣＲで増幅したサンプルの１００μＬをサンプルウェルにピペットで入れる。それから、このサンプルの３０−５０μＬをインキュベーションウェルにピペットで入れ、抗カルバゾール抗体で被覆された微粒子をそのウェルに加える。続いて抗カルバゾール抗体とカルバゾール末端を有する核酸配列の複合体が形成される適切な時間インキセルのガラスファイバー捕捉マトリックス上に該混合物をピペットで注ぎ、アルカリ性ホスファターゼと結合した抗アダマンタン抗体を加える。これにより、ガラスファイバー捕捉マトリックスに捕捉される微粒子−オリゴヌクレオチド−酵素複合体が形成される。洗浄段階で過剰の試薬を除去した後（この手順では、ガラスファイバー捕捉マトリックスの下の吸取紙が試薬溶液を吸収し、さもなければガラスファイバー捕捉マトリックス上で溢れてしまう）、ガラスファイバー捕捉マトリックスを４−メチルウムベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）で処理する。表面に結合した酵素により、蛍光を発生しないＭＵＰがその蛍光を測定できる４−メチルウムベリフェロン（ＭＵ）に転換する。後述の実施例で与えるＩＭｘ速度値は、カウント／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）で表される蛍光産物の形成速度を示す。連型的に２−１２ｃ／ｓ／ｓの範囲で「機械」ノイズ又はバックグラウンドを生じることを注意すべきである。後述する実施例では、フルオレセインハプテン及びビオチンハプテン又はカルバゾールハプテン及びアダマンタン酢酸（アダマンタン）ハプテンでプローブ対を標識する。実質的にはいずれのハプテンのいずれの組合わせも可能であるけれども、典型的には上記に従い、フルオレセイン及びビオチンを一緒に使用し、アダマンタン及びカルバゾールを一緒に使用する。好ましくはプローブ対の各メンバーは異なる標識をもったほうがよい。本発明の実施に於いて有用な他の等しく適切な検出方法には、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、免疫クロマトグラフィー、及びサザンブロット、ドットブロット、スロットブロット、溶液ハイブリダイゼーション、他の当業界公知の他の方法などの核酸ハイブリダイゼーションが含まれる。ポリメラーゼの量は以下のように定義された単位で表わされる。酵素の１単位は、７０℃で３０分間で酸不溶性物質に１０ナノモルの全ヌクレオチドを取り込むのに必要とされる酵素量に等しい。リガーゼ酵素の単位は本明細書で次のように定義する。９５％精製Thermus thermophilus DNAリガーゼの１ｍｇは約１×１０⁸単位の比活性を持つ。この定義は正確に標準化されておらず２０％は変わりうるが、最適化は当業者により容易に達成される。本発明の目的のために標的配列を一本鎖として記述してある。しかし、これは、標的が実際に二重鎖でありプローブとのハイブリダイゼーションの前にその相補鎖から簡単に解離される場合を含むことが理解されるべきである。二重鎖標的の場合、第３及び第４プローブ（２次プローブ）であるＡ′およびＢ′はそれぞれ標的の相補鎖とのハイブリダイゼーションによる最初の段階に参加するであろう。一本鎖標的の場合では、それらは最初のハイブリダイゼーション段階に参加せず、次のハイブリダイゼーション段階に参加し、第１及び第２プローブを連結することにより産生される１次融合配列と結合する。標的配列にはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）が含まれる。しかし、本明細書で示し、請求の範囲に記載した標的はＤＮＡである。本発明の目的のためにまた、デオキシヌクレオチド三リン酸にはデオキシアデノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸及びデオキシシトシン三リン酸が含まれる。しかし、これは、類似の方法で水素結合を形成できるならば上記４種のアナログである修飾された塩基又は伝統的でない塩基を除外することを意味しない。本発明を実施例で更に記述するが、実施例は本発明の例であり、いずれにせよ本発明を限定するつもりはない。例えば、特異的である長さを有する配列をリストする。同一のマップの位置をカバーするが僅かに少ない又は多い塩基数を有する配列は、リストした配列と標的上の同一の位置にハイブリダイゼーションするのならば、これらの配列と等価であり本発明の範囲内であると認められることを理解すべきである。標的配列と約８０％以上の相同性を有する配列もまた本発明の範囲内であることも理解される。好ましくは、本発明のＬＣＲ配列のいかなる塩基の置換も、ギャップ又は凹所から３つ以上離れているべきである。 Chlamydia は真正細胞内寄生虫であるので、正確に対照希釈を数量化するのは困難である。一つの基本体（ＥＢ）（elementary body）及び一つの封入体形成単位（ＩＦＵ）は理論的に一個の生物に等価であるが、この等価性はめったに実際には起こらない。死生物が同一のＥＢ又はＩＦＵに存在しているとき、実際の生物数は不正確である。ＥＢ又はＩＦＵを評価するために、培養したストック溶液に対し作成された標準曲線を使用して、ＩＭｘ速度によって対照溶液ＩＦＵを評価する。実施例１：プローブセット１（配列番号２−５）を使用したChlamydia trachoma tis の検出 Chlamydia trachomatis のＭＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド４３５−４８２（配列番号１）に対応する標的配列を検出するためにオリゴヌクレオチドプローブを選択した（図１）。多数のChlamydia trachomatis serovars（血清学的変異株）からなる一連の生物からの標的ＤＮＡを検出できるかどうかを判定するために、これらの生物に対しプローブセット１（配列番号２−５）を試験した。ＬＣＲ反応混合物は、ＬＣＲ緩衝液（５０ｍＭＥＰＰＳ、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＫ⁺（ＫＯＨ及びＫＣｌから）、１０μＭＮＡＤ）、１．７μＭのｄＡＴＰ、１．７μＭのｄＣＴＰ（ギャップ充填ヌクレオチド）、上述したカルバゾール及びアダマンタンで標識した各オリゴヌクレオチドプローブ８×１０¹¹個の分子、５μｇ／ｍｌのアセチル化したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），０．５ｍＭのＥＤＴＡ，０．０２重量％アジ化ナトリウム、２単位のThermus 種のＤＮＡポリメラーゼ（Molecular Biology Resources,Milwauke e,WI）、18,000単位のThermus thermophilusＤＮＡリガーゼ（Abbott Laborator ies）及び標的ＤＮＡ（Chlamydia trachomatis の１０個の基本体に相当）を全容量２００μＬに含んでいた。Perkin-Elmer Model 480 サーモサイクラーで、９７℃で１秒、５５℃で１秒、６２℃で５０秒、の設定で合計４０サイクルのサイクルを行った。標的ＤＮＡは、多数の当業界公知の方法で調製できる。本実施例では、標的ＤＮＡを、５ｍＭＥＰＰＳ、６０ｍＭＭｇＣｌ₂からなる緩衝液中で８５−９５ ℃で１０分間、該生物（McCoy 細胞中で生育した）を熱処理することで標的ＤＮＡを調製した。機を使用したサンドイッチ免疫アッセイを使用して検出した。表１はカウント／秒／秒（Ｃ／Ｓ／Ｓ）として表現したアッセイの結果を示す。これらの結果は、プローブセット１（配列番号２−５）がChlamydia trachoma tis の１５種の異なる血清学的変異株からの標的ＤＮＡを検出できることを示す。実施例２：プローブセット１（配列番号２−５）を使用した微生物源からの標的ＤＮＡの検出プローブセット１（配列番号２−５）（図１）を、幾つかの微生物源からの一連の標的ＤＮＡに対してＬＣＲアッセイで使用した。標的ＤＮＡを微生物源から抽出し、標的ＤＮＡが１反応当たり約１０⁵コピー存在するということを除いて、実施例１で記述したようにＬＣＲを行った。プローブを、上述したように図１で示すようにカルバゾール及びアダマンタンで装置の複数のランを分析し、陽性対照（ＰＣ）及び陰性対照（ＮＣ）の数値を各ランごとに求めた。各ランに於ける陽性対照はChlamydia の５．０ＩＦＵであると推定した。陰性対照はサケ精子ＤＮＡ３３０ｎｇであった。表２はアッセイの結果を示す。結果は、Chlamydia trachomatis からのＤＮＡで生じた信号と比較して、ＬＣＲを使用して多数の微生物源からの標的ＤＮＡで試験したとき、プローブセット１はほとんど検出できない信号しか与えないことを示す。幾つかの細菌種からの信号はバックグラウンドより大きかったけれども、いずれもChlamydia 陽性対照からの信号の１／６もなかった。実施例３：プローブセット４（配列番号１７−２０）によるChlamydia trachoma tis の検出プローブセット４（配列番号１７、１８、１９及び２０）（図２）を使用して、上述のChlamydia trachomatis の潜在プラスミドのオリゴヌクレオチド６９１７−６９６４（配列番号１６）に対応する標的ＤＮＡを検出した（図２）。ギャップ充填のヌクレオチドがｄＣＴＰ及びｄＴＴＰであり、1.2 単位のThermus 種のＤＮＡポリメラーゼと10,800単位のThermusthermophilusのＤＮＡリガーゼを使用したことを除いて実施例１で述べたように反応を行った。プローブは２００ μＬ反応液中６．２×１０¹¹分子であり、９７℃で１秒、５５℃で１秒、及び６２℃で５０秒で、合計４０サイクルのサイクルを行った。析した。結果を表３に示す。これらの結果は、プローブセット４（配列番号１７−２０）は試験したChlamy dia trachomatis 血清学的変異株の１５株全部からの標的ＤＮＡを検出できることを示した。実施例４：プローブセット４（配列番号１７−２０）を使用した完全な微生物からの標的ＤＮＡの検出プローブセット４（配列番号１７−２０）（図２）の特異性を評価するために、種々の細菌、カビ、ウイルス及びChlamydia pneumoniae、Chlamydia psittaci の株を含む多数の完全な（intact）微生物を使用して、ＬＣＲを行った。２単位のThermus 種のＤＮＡポリメラーゼ及び18,000単位のThermus thermophilusのＤＮＡリガーゼを使用したことを除い複数のランで分析を行った。各ランのプローブ濃度及び陽性対照（ＰＣ）と陰性対照（ＮＣ）の値を後述の表５に示す。結果を表４（微生物）と４Ａ（Chlamydi a 種）に示す。実施例４の各ランでのプローブ濃度及び結果の陽性対照（ＰＣ）と陰性対照（ＮＣ）の値を表５に示す。各ランで、陽性対照はChlamydia trachomatis の５．０ＩＦＵであると推定され、また陰性対照は３３０ｎｇサケ精子ＤＮＡであった。これらの結果は、プローブセット４（配列番号１７、１８、１９及び２０）はChlamydia trachomatis がＬＣＲ反応混合液に存在するときのみ連結産物を産生し、近縁のChlamydia pneumoniae、Chlamydia psittaciの株を含めて多数の他の微生物が存在するときには、そうではないことを示す。実施例５：プローブセット５（配列番号２２−２５）によるChlamydia trachoma tis の検出プローブセット５（配列番号２２−２５）（図２）を使用して上述のChlamydia trachomatis の潜在プラスミドのヌクレオチド６１０７−６１６０（配列番号２１）（図２）に対応する標的ＤＮＡを検出した（図２）。ギャップ充填のヌクレオチドｄＡＴＰ及びｄＣＴＰを使用し、アセチル化ＢＳＡを使用せずに、実施例１で述べたように反応を行った。９７℃で１秒、５８℃で１秒、及び６５℃で２０秒で合計３７サイクルのサイクルを行った。上述したように、プローブをビオチンとフルオレセインで標識し、２００μＬ反応中２×１０¹² 分子のプロー連結産物を分析した。結果を表６に示す。これらの結果は、プローブセット５（配列番号２２−２５）はChlamydia trac homatis の１５の異なる血清学的変異株を検出できることを示す。実施例６：プローブセット５（配列番号２２−２５）を使用した微生物起源からの標的ＤＮＡの検出一連の非クラミジア微生物からの標的ＤＮＡを使用して、プローブセット５の特異性を評価した。標的ＤＮＡが約１０⁵ゲノム／反応で存在することを除いて、４つのランで実施例５で述べたようにＬＣＲを行った。各ランで、陽性対照（ＰＣ）は５．０ＩＦＵであると推定され、陰性対照（ＮＣ）は３３０ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡであった。各ランのＰＣ値及びＮＣ値をたこれらの結果を示す。これらの結果は、プローブセット５（配列番号２２−２５）は多数の非クラミジア微生物又はChlamydia psitticiからの標的ＤＮＡと交差反応性を示さないことを示す。実施例７：プローブセット２（配列番号７−１０）を使用したChlamydia trac homatis の標的ＤＮＡの検出プローブセット２（配列番号７−１０）を使用してChlamydia trachomatis のＭＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド７８８−８３５（配列番号６）に対応する標的ＤＮＡを検出した（図１）。図１に示すように及び上述したようにプローブを合成し標識した。プローブは２００μＬ反応液中２×１０¹²分子を用いた。ギャップ充填ヌクレオチドとしてｄＡＴＰ及びｄＣＴＰを用いて、実施例１で記述したようにＬＣＲアッセイを行った。表８はアッセイの結果を示す。これらの結果は、プローブセット２は試験した大部分の血清良の結果は、血清学的変異株Ｄ、Ｆ、Ｌ１及びＬ２で得られた。実施例８：プローブセット２（配列番号７−１０）を使用した非クラミジアの標的ＤＮＡの検出多数の非クラミジア微生物からの標的ＤＮＡを使用して、ＬＣＲアッセイで２００μＬ反応液中２×１０¹²分子でプローブセット２を用いた。標的ＤＮＡが反応中約１０⁸ゲノムで存在することを除いて、実施例７で述べたようにＬＣＲを行った。各ランで、陽性対照（ＰＣ）は５．０ＩＦＵであると推定され、陰性対照（ＮＣ）は３３０ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡであった。これらのアッセイの結果を表９に示す。これらの結果は、標的ＤＮＡとして多数の非クラミジア細菌からのＤＮＡを使用するとき、プローブセット２は検出できる連結産物を産生しなかったことを示す。実施例９：プローブセット３（配列番号１２−１５）を使用したChlamydia trac homatis の検出多数のChlamydia trachomatis の血清学的変異株のＭＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド１５０１−１５０６に対応する標的ＤＮＡを検出できる能力について、プローブセット３（配列番号１２−１５）を評価した（図１）。９７℃で１秒、５８ ℃で１秒、６５℃で１０秒、合計３７サイクルのサイクルを行ったことを除いて、実施例１で述べたように（充填ヌクレオチドとしてｄＡＴＰ及びｄＣＴＰを使用）、ＬＣＲを行った。２００μＬ反応液中２×１０¹²分子のプローブを使用した。結果を表１０に示す。結果は、プローブセット３（配列番号１２−１５）はChlamydia trachomatis 血清学的変異株Ｂ，Ｂａ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｊ，Ｌ１，Ｌ２及びＬ３からの標的ＤＮＡを検出できるが、血清学的変異株Ａ，Ｃ，Ｉ及びＫからの標的ＤＮＡはほとんど信号を与えないことを示す。前述の実施例を例示として示したが、添付の請求の範囲で示した本発明の範囲を制限することを意図していない。例えば、特定の長さの配列をリストしてある。同一のマップ位置をカバーするが、より少ない又はより多くのヌクレオチド数を有する配列は、リストした配列と標的上で同一の位置にハイブリダイズするならば、上記の配列の等価物であり、本発明の範囲内であると理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者サリチユーロ，ジヨン・エイアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、ケノーシヤ、トウエンテイ・サード・アベニユー・8341 (72)発明者パビツク，エドワード・ケイアメリカ合衆国、イリノイ・60639、シカゴ、ノース・マクビツカー・2450 (72)発明者クロノウスキー，ポール・エイアメリカ合衆国、イリノイ・60097、ワンダー・レイク、ヒルトツプ・ドライブ・ 3105 (72)発明者マンラブ，マシユー・テイーアメリカ合衆国、イリノイ・60061、バーモン・ヒルズ、エコー・コート・11、アパートメント・５ (72)発明者マーシヤル，ロナルド・エルアメリカ合衆国、イリノイ・60099、ザイオン、ウインスロツプ・コート・900

Claims

【特許請求の範囲】１．トラコーマ・クラミジア（Chlamydia trachomatis）からの標的ＤＮＡを検出するための組成物であって、該組成物が本明細書で定義されたプローブセット１（配列番号２−５）、プローブセット２（配列番号７−１０）、プローブセット３（配列番号１２−１５）、プローブセット４（配列番号１７−２０）及びプローブセット５（配列番号２２−２５）並びにその組合わせからなる群から選択される４種のオリゴヌクレオチドプローブセットを含むことを特徴とする組成物。２．該組成物がプローブセット１（配列番号２−５）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の組成物。３．該組成物がプローブセット４（配列番号１７−２０）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の組成物。４．該組成物がプローブセット５（配列番号２２−２５）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の組成物。５．セットの少なくとも１つのプローブがレポーター基を有することを特徴とする請求項１記載の組成物。６．検体中のChlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡの存在の検出方法であって、該方法は、ａ）標的ＤＮＡを含む疑いのある検体と請求項１記載の少なくとも１つのプローブセットを混合し、ｂ）１種又は複数の、しかし４種全部よりは少ないデオキシヌクレオチド三リン酸、ポリメラーゼ及びリガーゼを供給し、ｃ）検体とプローブセットの混合物を変性させ、二本鎖ＤＮＡを解離させ、ｄ）変性したＤＮＡに該プローブセットをハイブリダイズさせ、各プローブ対の各プローブの間にギャップを有するハイブリダイズしたプローブを作成し、ｅ）鋳型依存性様式でハイブリダイズしたプローブを補正し、隣接し連結可能なプローブを作成し、ｆ）隣接したプローブを連結し、再構成したプローブを形成させ、ｇ）段階ｂ）ないしｆ）を少なくとも一度繰り返し、及びｈ）Chlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡの存在の尺度として再構成されたプローブの形成の程度を測定することの各段階を含むリガーゼ連鎖反応を利用することを特徴とする方法。７．段階ｂ）ないしｆ）を約１０回ないし約５０回繰り返すことを特徴とする請求項６記載の方法。８．リガーゼが熱安定性リガーゼであることを特徴とする請求項６記載の方法。９．ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項６記載の方法。１０．ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性であることを特徴とする請求項８記載の方法。１１．プローブセットの少なくとも１つのプローブがハプテンで標識され、該方法が更に、免疫アッセイ様式を使用して該標識を検出することを含むことを特徴とする請求項６記載の方法。１２．プローブセットが本質的にプローブセット１（配列番号２−５）からなることを特徴とする請求項６記載の方法。１３．プローブセットが本質的にプローブセット４（配列番号１７−２０）からなることを特徴とする請求項６記載の方法。１４．プローブセットが本質的にプローブセット６（配列番号２２−２５）からなることを特徴とする請求項６記載の方法。１５．Chlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡを検出するために有用なキットであって、該キットが、ａ）プローブセットが、プローブセット１（配列番号２−５）、プローブセット２（配列番号７−１０）、プローブセット３（配列番号１２−１５）、プローブセット４（配列番号１７−２０）及びプローブセット５（配列番号２２−２５）からなる群から選択されることを特徴とする４種のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つのセット、ｂ）ポリメラーゼ試薬、ｃ）１種又は複数であるが、４種全部よりは少ないデオキシヌクレオチド三リン酸、及びｄ）リガーゼ試薬を含有する１つ又は複数の適切な容器を含むキット。１６．プローブセットの少なくとも１つのプローブが検出可能な標識を有することを特徴とする請求項１５記載のキット。１７．ポリメラーゼ試薬が熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、リガーゼが熱安定性リガーゼであることを特徴とする請求項１５記載のキット。１８．Chlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡの検出に有用であるオリゴヌクレオチドプローブであって、該プローブが１０ないし約５０ヌクレオチドの長さであり、配列番号１、６、１１、１６又は２１記載の配列に対し、ハイブリダイゼーション条件下でこのような配列又はその相補鎖にハイブリダイズするために十分な相補性又は相同性を有すること及び該プローブが少なくとも２種のChlamydia trachomatis の血清学的変異株を検出するが他の生物とは実質的に交差反応を起こさないことを特徴とするプローブ。１９．プローブが、配列番号２、３、４、５、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４及び２５として本明細書で命名したプローブからなる群から選択されることを特徴とする請求項１８記載のオリゴヌクレオチドプローブ。２０．更に検出を容易にする標識を有することを特徴とする請求項１８記載のオリゴヌクレオチドプローブ。２１．検体中のChlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡの存在の検出方法であって、該方法が、ａ）標的ＤＮＡを含む疑いのある検体を用意し、ｂ）検体中の標的ＤＮＡに、検出可能な信号を発生可能な標識に結合させた請求項１８記載のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ｃ）発生した信号を検出することにより標的ＤＮＡの存在を測定することの各段階を含むことを特徴とする方法。２２．ハイブリダイゼーション段階の後に少なくとも１回の増幅段階を更に含むことを特徴とする請求項２１記載の方法。２３．該増幅段階がリガーゼ連鎖反応であることを特徴とする請求項２２記載の方法。２４．Chlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡを検出するための組成物であって、該組成物が配列番号２及び４、配列番号３及び５、配列番号７及び９、配列番号８及び１０、配列番号１２及び１４、配列番号１３及び１５、配列番号１８及び１９、配列番号１８及び２０、配列番号２２及び２４、並びに配列番号２３及び２５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブ対を含むことを特徴とする組成物。２５．組成物が、配列番号２及び４又は配列番号３及び５からなる群から選択されることを特徴とする請求項２４記載の組成物。２６．組成物が、配列番号１８及び１９又は配列番号１８及び２０からなる群から選択されることを特徴とする請求項２４記載の組成物。２７．組成物が、配列番号２２及び２４又は配列番号２３及び２５からなる群から選択されることを特徴とする請求項２４記載の組成物。２８．検体中のChlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡの存在の検出方法であって、該方法は、ａ）標的ＤＮＡを含む疑いのある検体と請求項２４記載の少なくとも１つのプローブ対を混合し、ｂ）１種又は複数の、しかし４種全部よりは少ないデオキシヌクレオチド三リン酸、ポリメラーゼ及びリガーゼを供給し、ｃ）検体とプローブセットの混合物を変性させ、二本鎖ＤＮＡを解離させ、ｄ）変性したＤＮＡに該プローブセットをハイブリダイズさせ、各プローブ対の各プローブの間にギャップを有するハイブリダイズしたプローブを作成し、ｅ）鋳型依存性様式でハイブリダイズしたプローブを補正し、隣接し連結可能なプローブを作成し、ｆ）隣接したプローブを連結し、再構成したプローブを形成させ、ｇ）Chlamydia trachomatis からの標的ＤＮＡの存在の尺度として再構成されたプローブの形成の程度を測定することの各段階を含むことを特徴とする方法。２９．プローブ対の少なくとも１つのプローブをハプテンで標識し、該方法が、免疫アッセイ様式を使用して標識を検出することを更に含むことを特徴とする請求項２８記載の方法。３０．段階ｂ）ないしｆ）を少なくとも一度繰り返し、標的ＤＮＡの線形増幅を生じさせることを特徴とする請求項２８記載の方法。