JP2000511889A - ホモ二官能性およびヘテロ二官能性ビニルスルホンを用いたタンパク質―多糖コンジュゲートの調製 - Google Patents

ホモ二官能性およびヘテロ二官能性ビニルスルホンを用いたタンパク質―多糖コンジュゲートの調製

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Abstract

(57)【要約】 コンジュゲート、好ましくはタンパク質／多糖コンジュゲートを形成するための方法が開示されている。この方法では、多糖分子上に官能基を付与する試薬と多糖を反応させる。官能基が所定の位置に置かれた後、多糖をホモ二官能性およびヘテロ二官能性のビニルスルホンと反応させてビニルスルホン誘導体化多糖を形成する。その後、ビニルスルホン誘導体化多糖をタンパク質と反応させてコンジュゲートを形成する。所望により、コンジュゲート形成反応工程の前に官能基を用いてタンパク質の誘導体を形成してもよい。もう１つの実施態様では、タンパク質を反応性基を用いて官能化し、次いで、ビニルスルホン基で誘導体化することにより、ビニルスルホン誘導体化タンパク質を形成する。次に、このタンパク質を多糖と反応させてコンジュゲートを形成する。場合により、コンジュゲート形成反応の前に多糖を反応性基で誘導体化してもよい。もう１つの方法では、架橋剤のペンダントビニルスルホンを用いて多糖を直接誘導体化する。次に、ビニルスルホン誘導体化多糖をタンパク質(このタンパク質は官能化されていても官能化されていなくてもよい)に結合する。同様に、架橋剤のペンダントビニルスルホンを用いてタンパク質誘導体を直接形成し、次に、多糖分子(この多糖分子は官能化されていても官能化されていなくてもよい)に結合してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 ホモ二官能性およびヘテロ二官能性ビニルスルホンを用いた タンパク質‐多糖コンジュゲートの調製 関連出願データ 本出願は、1996年5月9日出願の米国仮特許出願第60/017,103号に基づいて35U. S.C.§119による優先権を主張するものであるが、該米国仮特許出願の全内容を 、参考として本明細書中に組み入れるものとする。 発明の背景 ワクチンは、ウイルス、細菌、または真菌のいずれに起因するかにかかわらず 、多種多様な疾患から人々を守るうえで非常に有効なものである。このような多 岐にわたる病原生物に対してワクチンが特異的な保護作用を誘発する能力は、特 異的な体液性抗体応答ならびに細胞性応答を刺激するワクチンの能力から生じる ものである。本発明は、このようなワクチンに関し、特に、ワクチンおよび他の 価値ある免疫試薬の調製に使用されるコンジュゲート、例えばタンパク質／多糖 コンジュゲートの形成方法に関する。本発明は更に、本発明に従って形成された コンジュゲートから調製されるワクチンおよび免疫試薬に関する。 薬剤の中には、例えば、アジュバントが存在しないでも免疫原性を示す破傷風 トキソイドなど、最小限の化学的修飾で免疫応答を刺激できるものがある。他の 重要な薬剤は、非免疫原性または弱い免疫原性のものであるが、これらの薬剤は 、強い免疫応答を誘発することのできる形態の免疫原性分子または構成体に変換 することができる。例えば、ほとんどの多糖は免疫原性が弱い。しかしながら、 これらの多糖をタンパク質に結合すると、生成する構成体は免疫原性を示すよう になる。タンパク質を多糖にコンジュゲートすると、多糖は、弱い免疫原性を有 するＴ細胞非依存性抗原から、Ｔ細胞介助を漸増する、従って、増大された免疫 応答を刺激するＴ細胞依存性抗原に変化する。J.M．Cruseら(編者),Conjugate V accines ，Karger，Basel，(1989)に記載の解説、およびR.W．Elissら(編者),Dev elopment and Clinical Uses of Haemophilus B Conjugate Vaccines ，Marcel D ekker，New Yoil(1994)に記載の解説に注目されたい。これらの本の内容を、参 考として本明細書中に組み入れるものとする。 タンパク質と多糖とのコンジュゲートは、他の有利な結果を提供する可能性も ある。例えば、本出願人は、タンパク質／多糖コンジュゲートが多糖成分に対す る抗体応答だけでなくタンパク質成分に対する抗体応答をも促進することを見出 した。この効果については、例えば、米国特許出願第08/402,565号(1995年3月13 日出願)、同第08/444,727号(1995年5月19日出願)、および同第08/468,060号(199 5年6月6日出願)の二重コンジュゲートの特許出願書中に記載されている。これら の特許出願の全内容はいずれも、参考として本明細書中に組み入れるものとする 。この効果については、A．Leesら，「タンパク質‐デキストランコンジュゲー トの増強された免疫原性:I.弱い免疫原性分子に対する増強された抗体応答の迅 速刺激」，Vaccine，Vol．12，No．13(1994)，pp．1160-1166にも記載がある。 この論文の全内容は、参考として本明細書中に組み入れるものとする。 タンパク質と多糖との結合を促進するための技術が開発されてきた。W.E．Dic kら，「細菌性炭水化物抗原のグリコンジュゲート:設計および調製要因の調査お よび考察」，Conjugate Vaccines(編者Cruseら)，Karger，Basel，1989，開始頁 48に注目されたい。この論文についてもまた、参考としてその全内容を本明細書 中に組み入れるものとする。しかしながら、炭水化物を活性化するための技術の 多くは、水性媒体中で使用するのに適していない。なぜなら、活性化試薬または 官能性試薬は水中で安定でないからである。例えば、米国特許第4,695,624号(参 考として該特許の全内容を本明細書中に組み入れるものとする)には、N,N'-カル ボニルジイミダゾールの利用についての記載がある。この試薬は、有機媒体中で 使用しなければならない。 水性媒体中で使用するために、本出願人は、1-シアノ-4-(ジメチルアミノ)-ピ リジニウムテトラフルオロボレート(本特許出願では「CDAP」とも呼ぶ)を利用し て多糖を活性化する方法を開発した。CDAPの利用については、Andrew Leesの以 下の米国特許出願、すなわち、米国特許出願第08/124,491号(1993年9月22日出願 て、現在は放棄されている)、米国特許出願第08/408,717号(1995年3月22日出願) 、および米国特許出願第08/482,666号(1995年6月7日出願)に記載がある。これら の米国特許出願の全内容はいずれも参考として本明細書中に組み入れるものとす る。CDAPの利用については、Leesら，「タンパク質‐多糖コンジュゲートワクチ ンおよび免疫試薬に使用するための1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテ トラフルオロボレートによる可溶性多糖の活性化」，Vaccine，Vol．14，No．3( 1996)，pp．190-198にも記載がある。この論文についても、その全内容を参考と して本明細書中に組み入れるものとする。 多糖の中には、ヒドロキシルをほとんどもたないものまたは隠蔽されたヒドロ キシルをもつものがある。この場合、これらの多糖は、ビニルスルホンを用いた 直接的誘導体化に適していないうえに、CNBr活性化などの他の通常の方法による 活性化にも適していない。このような多糖としては、例えば、Vi抗原およびNeis seria menigiditis多糖タイプC(「Neisseria PsC」)がある。このほか、多糖の 中にはpHに敏感なものがある。この場合、これらはビニルスルホンを用いた直接 的誘導体化に適していない。このような多糖としては、例えば、Haemophilus in fluenzaeタイプB(「PRP」)およびViがある。この場合、より低いpHにおいて全 誘導体形成プロセスを実施できる能力が、特定の多糖の誘導体を形成するうえで 重要である可能性がある。 しかしながら、タンパク質と多糖との結合プロセスは、望ましからぬ作用を呈 することが多い。場合によっては、直接的な結合によりタンパク質と多糖とが互 いに非常に近接して配置され、タンパク質と多糖との過剰な架橋の形成が促進さ れることもある。このような極端な条件下では、得られる物質が非常に濃厚に( 例えばゲル化状態に)なる可能性がある。このような物質は、ワクチン製剤とし ては有用でないと考えられる。 過剰な架橋が起こると、タンパク質成分および多糖成分の免疫原性が低下する 恐れもある。更に、架橋プロセスにより外来エピトープがコンジュゲート中に混 入する可能性もある。過剰な架橋の導入は、こうした問題を悪化させる。 タンパク質と多糖との過剰な架橋が起こる確率を制限するために、タンパク質 と多糖との間にスペーサーを配置してもよい。スペーサーは、タンパク質分子と 多糖分子との物理距離を保持する働きをするため、タンパク質と多糖との架橋の 数を制限するために使用できる。このほかの利点として、得られるコンジュゲ ートの構造を制御するためにスペーサーを使用することもできる。コンジュゲー トが正しい構造をもたない場合、コンジュゲート物質の免疫原性に悪影響を及ぼ すという問題を生じる可能性がある。また、結合速度が速すぎても遅すぎても、 得られるコンジュゲート産物の全収率、構造、および免疫原性に悪影響を及ぼす 可能性がある。Schneersonら，Journal of Experimnetal Medicine，Vol．152， 開始頁361(1980)に注目されたい。この論文の全内容を参考として本明細書中に 組み入れるものとする。 スペーサーを利用する潜在的利点を考慮すると、スペーサーを介してタンパク 質を多糖に結合するプロセスを提供することが望ましい。この結合手順において 、スペーサーは、タンパク質と多糖とを連結するために必要な化学反応に使用さ れる。一方の分子上に存在する基と反応する官能基を他方の分子上に配置するこ とにより、スペーサーはこの化学反応を促進する。反応性官能基を含有するスペ ーサー分子を用いて、多糖分子またはタンパク質分子のいずれの誘導体を形成し てもよい。必要な場合には、コンジュゲート形成の際にスペーサーとの反応を促 進する反応性官能基(例えば、チオール、ヒドラジド、またはアミン)を用いて他 方の分子の誘導体を別に形成してもよい。 特定のコンジュゲート形成反応プロセスに対して、ホモ二官能性ビニルスルホ ンの利用可能性を検討した。このグループの１つのメンバーは、次の構造： を有するジビニルスルホンである。ジビニルスルホンは、タンパク質を架橋する ために、およびハプテンを有するタンパク質の誘導体を形成するために利用され てきた。例えば、「ジビニルスルホンおよびヨード酢酸を使用した予備活性化タ ンパク質へのコンジュゲート化」，Gunnar Houen，et al.著，Journal of Immun ological Methods，Vol．181(1995)，pp．187-200に注目されたい。この論文の 全内容は参考として本明細書中に組み入れるものとする。Houenの論文には、ジ ビニルスルホン(DVS)を用いて誘導された低分子量タンパク質(10kDa)を45kDaタ ンパク質のリシンに結合することについての記載がある。低レベルのタンパク質 の結合が観測されたにすぎなかった。この論文にはまた、低分子量のハプテンお よびペプチドをかなり修飾されたDVS‐タンパク質に結合することについての記 載がある。大過剰のハプテンが、記載のプロセスに使用された。この方法では、 ジビニルスルホンを用いた誘導体化の程度を制限すること、またはタンパク質の 完全性を保持することに対する努力が払われていない。実際には、Houenの論文 の目的は、タンパク質の最大限の誘導体化を行うことであった。 他の研究者らは、アフィニティークロマトグラフィー用ゲルを得ることを目的 に、ジビニルスルホンを使用して固相ゲルにタンパク質およびハプテンを結合す ることについて報告した。Porath，「一般的方法および結合手順」，Methods in Enzymolog，Vol．34(1974)，pgs．13-30およびPorath et al.，「寒天、アガロ ース、およびセファデックス担体への酵素の固定」，Methods in Enzymology，V ol．44(1976)，pgs．19-45を参照されたい。これらのPorathの報告の全内容もま た、参考として本明細書中に組み入れるものとする。このほか、S．Pepper，「 アフィニティークロマトグラフィーのためのいくつかの代替結合化学組成」，Mo lecular Biotechnology，Vol．2(1994)，pp．157-178にも注目されたい。この論 文の全内容は参考として本明細書中に組み入れるものとする。過剰な架橋および 劣悪な収率に関する問題についてはPortathにより報告されている。更に、ジビ ニルスルホンを用いた誘導体の形成を行うためのこれらに記載の方法では、高pH (pH11)に長時間暴露する必要があった。多数の多糖ヒドロキシル基と過酷な反応 条件とが組み合わさると、過剰な架橋および多糖の凝結が促進または誘発される 。このような反応条件は、可溶性のタンパク質‐多糖コンジュゲートを調製する のに不適当であると考えられる。 タンパク質チオールおよびアミンと反応させるためにビニルスルホン誘導体化 ポリエチレングリコール(「PEG」)を使用することについて他の研究者により報 告されている。例えば、Morpurgo，et al.，「ポリエチレングリコールビニルス ルホンの調製およびキャラクタリゼーション」，Bioconjugate Chemistry，Vol ． 7(1996),開始頁363(この論文の全内容は参考として本明細書中に組み入れるもの とする)を参照されたい。しかしながら、PEGを用いた官能化の目的は、タンパク 質の免疫原性を低下させることである。 ジビニルスルホンを使用した反応プロセスにおける上記のすべての問題のほか に、この物質を使用する際に他の問題も存在する。一般的には、ホモ二官能性試 薬はジビニルスルホンも含めて、多岐にわたる不明確なコンジュゲートを形成す ることが判明した。G.T．Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Pres s，San Diego，California，(1996)，pg．187に注目されたい。 しかしながら、ジビニルスルホンを使用する際にこうした問題が存在するにも かかわらず、この物質を使用することに対して特定の利点が存在する。ジビニル スルホンはヨードアセトアミドまたはマレイミドと比較してより多くの求核試薬 と反応するため、より汎用的な結合試薬である。ジビニルスルホンの他の利点は 、その入手可能性、安定性、水溶性、およびコストに関するものである。タンパ ク質および／または多糖の誘導体を形成するために使用されるいくつかの試薬と 比較して、ジビニルスルホンはかなり低廉で入手がより容易である。 発明の概要 本発明の目的は、上述の問題および欠点を回避したコンジュゲートを形成する 方法を提供することである。本発明の更なる目的は、これらのコンジュゲートか ら調製されるワクチンおよび他の免疫試薬を提供することである。 本発明に係る1方法の第1のステップにおいて、多糖をホモ二官能性ビニルスル ホン試薬またはヘテロ二官能性ビニルスルホン試薬と反応させてビニルスルホン 誘導体化多糖(「Ps-Vs」)を形成する。ビニルスルホン試薬との反応を促進する ために、最初に１つ以上のステップで多糖を誘導体化してもよい。第2のステッ プにおいて、適切な条件下でタンパク質、ペプチド、またはハプテンを多糖に結 合させるべくPs-Vsと反応させてコンジュゲートを形成する。この結合を容易に 行うために、タンパク質、ペプチド、またはハプテンの内在性アミンよりも反応 性の高い求核性基を付加させることによりタンパク質、ペプチド、またはハプテ ンを修飾してもよい。例えば、チオール求核試薬またはヒドラジド求核試薬を用 いてタンパク質を誘導体化した後でコンジュゲート形成反応を行うこともできる 。 本発明はまた、上述の方法で形成されたコンジュゲート物質(例えば、タンパ ク質／多糖コンジュゲート)に関する。このコンジュゲートには、スペーサーま たは架橋剤の一部分としてその構造中にビニルスルホン由来のスルホン基 本発明に係るコンジュゲートを形成するための他の方法として、タンパク質ペ プチド、またはハプテンをホモ二官能性ビニルスルホン試薬またはヘテロ二官能 性ビニルスルホン試薬と反応させてビニルスルホン誘導体化物質（例えば、「Pr otein-Vs」）を形成する。ビニルスルホン試薬との反応を容易にするために他の 反応性基を用いてタンパク質、ペプチド、またはハプテンの誘導体を形成しても よい。次に、適切な条件下で多糖をビニルスルホン誘導体化物質と反応させるこ とによりタンパク質、ペプチド、またはハプテンを多糖に結合し、コンジュゲー トを形成する。この結合を促進するために、官能基(例えば、チオール、アミン 、またはヒドラジドなどの求核性基)で多糖を誘導体化した後でコンジュゲート 形成反応を行うこともできる。 この方法により形成されたコンジュゲートもまた、本発明の一部分をなす。こ のコンジュゲートには、スペーサーまたは架橋剤の一部分としてその構造中にビ ニルスルホン由来のスルホン基が含まれていてもよい。 本発明に係る上述の方法は、上記の文献中に記載のジビニルスルホンを用いた 様々な方法と比較して、タンパク質、ペプチド、ハプテン、または多糖の選択的 で限定的でかつ穏和な誘導体化を可能にする。 多糖の限定的誘導体化は、(a)制限された数の反応性基を用いて最初に多糖の 誘導体を形成し、続いて過剰のホモ二官能性ビニルスルホン試薬との反応を行う 多段階誘導体形成プロセスによって、または(b)制限された数の求核試薬を用い て多糖の誘導体を形成し、続いてヘテロ二官能性ビニルスルホン試薬と反応させ ることによって行われる。特定の多糖に関して、アミンまたはヒドラジドビニル スルホン試薬を酸化型多糖に結合する方法、カルボジイミドを結合する方法など 、他の誘導体形成手段を利用してもよい。多糖の中には、反応条件を制御するこ とによりビニルスルホン試薬を用いて部分的な誘導体形成を行うことのできる多 くの求核性基(例えば、ヒドロキシル基またはアミン基)を含有するものがある。 タンパク質、ペプチド、またはハプテンの限定的誘導体化は、(a)反応時間、 試薬濃度、pHなどを制御しながら、ホモ二官能性ビニルスルホン試薬またはヘテ ロ二官能性ビニルスルホン試薬を、ダンパク質、ペプチド、またはハプテンと直 接反応させることによって、または(b)内在性アミンよりも反応性の高い制限さ れた数の基を用いて最初にタンパク質、ペプチド、またはハプテンの誘導体を形 成し、続いてホモ二官能性ビニルスルホン試薬またはヘテロ二官能性ビニルスル ホン試薬と反応させることによって行ってもよい。特定のタンパク質、ペプチド 、またはハプテンに関して、アミンまたはヒドラジドビニルスルホン試薬を酸化 型のタンパク質、ペプチド、またはハプテンに結合する方法、またはカルボジイ ミドを用いてカルボキシルに結合する方法など、他の限定的誘導体形成手段を利 用してもよい。 本発明に係る方法により、ビニルスルホンを用いて、多糖、タンパク質、ペプ チド、またはハプテン出発原料の誘導体化の程度を制御することができるため、 自己架橋および重合を最小限に抑えることができる。このほか、本発明に係る方 法において、反応成分間の架橋の程度を制御することができる。 本出願人はまた、架橋剤としてホモ二官能性ジビニルスルホン物質、特にジビ ニルスルホンを用いてコンジュゲートを形成するための好適な方法を開発した。 本出願において、「ジビニルスルホン物資」という用語は、一般的な意味で使用 され、その構造の中に２つのビニルスルホニル基またはビニルスルホン基を含有 する任意のスルホン分子を示すものとする。「ジビニルスルホン」という用語は 、次の特定のジビニルスルホン物質：を示すために使用される。ジビニルスルホンは比較的安価で安定な水溶性の試薬 であり、しかも容易に入手可能であるため、コンジュゲート形成プロセスにジビ ニルスルホンを使用することは有利である。先に述べたように、ジビニルスルホ ンを用いた他の誘導体形成方法では非常に高いpH(通常11以上)が必要であった。 この高pHが必要な理由は、ジビニルスルホンとの反応を誘発すべく十分な求核性 を多糖に付与するためである。これとは対照的に、本発明に係る方法では、ジビ ニルスルホンを用いた多糖の誘導体形成を誘発するうえで高いpHは必要ではない 。 本発明の以下の一般的な説明において、および実際上は本出願全体にわたり、 単純明快に示すために「タンパク質」という用語がしばしば使用される。当業者 は、本発明から逸脱することなく本反応プロセスにおいてタンパク質、ペプチド 、またはハプテンを使用できることが分かるであろう。 本発明のプロセスにおいて、最初に、多糖上の内在性基(例えば、ヒドロキシ ル基)よりも求核性の高い１つ以上の「Ｘ」基を用いて多糖物質の誘導体を形成 する。このＸ基は、例えば、アミン基、チオール基、またはヒドラジド基であっ もよい。適切な制限された数のＸ基を用いて多糖の誘導体を形成した後、高濃度 の(例えば、大過剰の)ジビニルスルホン物質を添加し、次いで、ジビニルスルホ ン物質とＸ基との反応を促進するうえで適切な範囲であるが、ただし、多糖ヒド ロキシルのpKaよりも低い範囲になるように溶液のpHを調節する。ジビニルスル ホン物質とＸ基との反応は、この低pHにおいて進行するが、ジビニルスルホン物 質と多糖上の内在性基(例えば、他のヒドロキシル基)との反応は実質的に誘発さ れない。これにより、ジビニルスルホン物質を用いた多糖物質の選択的かつ限定 的誘導体形成が可能になる。高濃度のジビニルスルホン物質を用いることにより 、反応は促進され、かつＸ基を介した架橋は最小限に抑えられる。このプロセス により得られるジビニルスルホン誘導体化多糖(「Ps-Vs」)は非常に安定であり 、凍結乾燥(すなわち、「フリーズドライ」)を行って凍結状態で保存し、その後 で使用することができる。 Ps-Vs物質を形成した後で、これをタンパク質成分と反応させてコンジュゲー トを形成する。タンパク質は、それ自体のアミンまたはチオールにより多糖と直 接反応させることもできるが、「Ｙ」基を用いてその誘導体を形成してからコン ジュゲートを形成してもよい。Ｙ基の利用は、例えば、次の場合：すなわち、(a )タンパク質と多糖との間の架橋の数を制限することが望ましい場合、または(b) より低いpHでコンジュゲート形成反応を進行させることが望ましい場合、に適し たものであってもよい。好適なＹ基としては、チオールまたはヒドラジドが挙げ られる。 本発明に係る他の代替プロセスにおいて、多糖の誘導体ではなくタンパク質の 誘導体をジビニルスルホン物質を用いて形成する。最初に、タンパク質上の内在 性基(例えば、アミン)よりも求核性の高いチオールまたはヒドラジドなどの適切 な制限された数のY基を用いてタンパク質を官能化する。その後、この官能化さ れたタンパク質に大過剰のジビニルスルホン物質を添加し、ジビニルスルホンを 用いてタンパク質の誘導体(「タンパク質‐Vs」)を形成させる。ジビニルスルホ ン物質とタンパク質上の他の内在性基(例えば、アミン基)との反応を実質的に誘 発しない低いpHにおいてジビニルスルホン物質とY基との反応を進行させる。こ のようにして、ジビニルスルホン物質を用いた選択的かつ制限的タンパク質誘導 体形成が達成される。タンパク質‐Vsを形成させた後、これを多糖分子に結合さ せてコンジュゲートを形成させる。コンジュゲート形成反応プロセスを促進する ために、コンジュゲート形成を行う前に、X基(例えば、チオール基、ヒドラジド 基、アミン基、または他の求核性基)を用いて多糖の誘導体を形成することもで きる。 本発明は更に、上述のプロセスにより形成されたコンジュゲートを用いて調製 できるコンジュゲートワクチンおよび他の価値ある免疫試薬に関する。 上述のプロセスにおいて、Ps-Vs物質およびタンパク質‐Vs物質は非常に安定 である。従って、長時間にわたリコンジュゲート形成反応を継続することが可能 である。このほか、ジビニルスルホンと、チオール、アミン、およびヒドラジド との結合もまた安定である。タンパク質と多糖との間に形成される多数の架橋に より、コンジュゲート産物の安定性が改良される。こうした高い安定性によりコ ンジュゲート産物の収率が改良される。これとは対照的に、他の架橋剤には、コ ンジュゲート形成反応プロセスにおいて加水分解を起こす反応性基(例えば、マ レイミド)が含まれる傾向があり、これによりコンジュゲートの収率が低下する 。この安定性に由来する更なる利点は、コンジュゲート形成反応をより均一なも のにできる点である。なぜなら、コンジュゲート形成反応は比較的遅いものであ るため、より完全な混合を行うことができるからである。 コンジュゲート形成反応の進行は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー( 「HPLC」)によりうまくモニタリングすることができる。なぜなら、ビニルスル ホン基は280nm(これはタンパク質をモニタリングするために通常使用される波長 である)における吸収にほとんど寄与しないからである。残存する反応性ビニル スルホン基は、メルカプトエタノール、グリシン、エタノールアミンなどの低分 子量求核試薬を添加することにより失活させる(quench)ことができる。更に、ビ ニルスルホン試薬を用いた多糖成分またはタンパク質成分の誘導体形成の程度は 、メルカプトエタノールを用いてこうした物質のアッセイを行うことにより間接 的に、またはこうした物質とチオールフルオレセインなどのチオール試薬との反 応により直接的にうまく決定することができる(例えば、(オレゴン州EugeneのMo lecular Probes製の)SAMSAアッセイ)。 従って、本発明のプロセスにおいてジビニルスルホンスペーサーを使用するこ とにより多くの利点が得られる。こうした利点のいくつかを以下に簡単に略述す る。 * 試薬は比較的安価であり、しかも水溶性である。 * 多糖の誘導体形成の程度をモニタリングすることが容易である。 * 2段階誘導体形成方法により、制御かつ制限された誘導体形成を行うことが できる。 * pH制御により結合選択性および反応速度を制御することができる。 * 試薬は大抵の通常の求核試薬(例えば、アミン、チオール、ヒドラジド、ヒ ドロキシルなど)と結合する。 * 適切なpHになるまで反応は開始されないので、均質な生成物が得られる。 * ビニルスルホンは280nmにおける吸収にほとんど寄与しないので、HPLCに より反応の進行をモニタリングするのが容易である。 * 未反応基を容易に失活させることができる。 * 形成された結合は中性pHで安定であり、更に、多数箇所で結合されるので より高いpHにおける安定性が増大する。 * ビニルスルホン基が安定であるため、活性化多糖の保存が可能である。 * ビニルスルホンは比較的低分子量のエピトープである。 * タンパク質との直接的結合により、コンジュゲート形成していないタンパ ク質を回収することができる。 図面の簡単な説明 以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると、本発明の有用な態様がより 完全に理解されるであろう。 図1(a)〜1(c)は、ホモ二官能性ジビニルスルホン物質を用いて多糖の誘導体を 形成する場合の本発明に係るプロセスについての一般的な反応スキームを模式的 に示している。 図2は、マイケル付加反応についての一般的な手順を示している。 図3(a)〜3(d)は、本発明に係る実施例Iに対する一般的な反応スキームを模式 的に示している。 図4(a)〜4(d)は、実施例IIの結果を示す高速液体クロマトグラフである。 図5は、実施例VIのコンジュゲート形成の量をコンジュゲート形成反応時間の 関数として示したグラフである。 図6(a)〜6(d)は、実施例VIIの結果を示す高速液体クロマトグラフおよびグラ フである。 図7(a)〜7(d)は、ヘテロ二官能性ビニルスルホン物質を用いて多糖の誘導体を 形成する場合の本発明に係るプロセスに対する一般的な反応スキームを模式的に 示している。 図8(a)〜8(c)は、ホモ二官能性ジビニルスルホン物質を用いてタンパク質の誘 導体を形成する場合の本発明に係るプロセスに対する一般的な反応スキームを模 式的に示している。 図9(a)〜9(d)は、実施例XIの結果を示す高速液体クロマトグラフである。 図10(a)および(b)は、それぞれ実施例XIIIに関連したクロマトグラフおよびグ ラフである。 発明の詳細な説明 本発明は、ワクチンおよび他の価値ある免疫試薬の調製に使用されるコンジュ ゲートの製造方法に関する。1つの特定の実施例として、本発明は、Salmonella typhi由来のVi抗原を用いてタンパク質／多糖コンジュゲートを調製するために 使用できる。 タンパク質(またはペプチドもしくはハプテン)と多糖とを結合させて有用な免 疫原性コンジュゲートを形成するには困難が伴う。物質を互いに結合させて適切 な化学構造をもたせる必要があり、さもなければ、得られた物質は非免疫原性に なる恐れがある。タンパク質および多糖は大きな嵩高い分子であり、各分子上に は反応しうる多数の部位が存在する。反応部位のサイズおよび数が大きくなると 、生成するコンジュゲートが不適当な化学構造を有する可能性が増大する。更に 、反応部位の分子サイズおよび数が大きくなると、こうした部位がタンパク質と 多糖との間の架橋に利用される可能性が増大する。過剰の架橋が起こると、ワク チンおよび免疫試薬の形成に有用でない濃厚なゲル化したコンジュゲート物質が 生成する恐れがある。架橋プロセスはまた、重要なエピトープの破壊、免疫学的 に重要な部位の修飾、および望ましからぬ外来エピトープの混入を引き起こす恐 れもある。 タンパク質と多糖とのコンジュゲート形成を行うためのプロセスを補助するた めに、タンパク質または多糖のいずれかに架橋剤またはスペーサーを付与するこ とができる。架橋剤はより小さな分子であるため、大きな分子への接近が良好に 行われ、それにより反応性が増大し、より大きなタンパク質および多糖の分子に 対する結合反応をより迅速に進行させる働きをする。このほか、架橋剤を使用す ると、架橋度および得られるコンジュゲートの化学構造をより効果的に制御する ことができる。 上述したように、種々の手順および化学作用を利用して、スペーサーの活性化 ならびにタンパク質および多糖へのスペーサーの結合を行うことができる(例え ば、CDAP、カルボジイミド、NHSエステル、CNBr、およびカルボジイミドを利用 する)。上記のDickらの論文を参照のこと。しかしながら、本発明に従ってビニ ルスルホンを架橋剤中の反応性基として使用するかまたはスペーサーを使用する と多数の驚くべき利点が得られることが判明した。ビニルスルホンを使用すると 、反応溶液のpHを制御することにより反応の選択性を容易に制御できる。ビニル スルホンはまた、良好な水溶性および優れた水中安定性を呈する。ジメチルホル ムアミド(「DMF」)などの補助溶剤を使用して、試薬の可溶化および分散を助長 す ることができる。架橋剤と、架橋剤が結合するタンパク質または多糖分子との間 の結合は、本発明に従ってビニルスルホンを使用した場合、特に、多数のビニル スルホン結合が存在する場合、より安定である。こうした性質により、反応手順 がより単純になりかつより容易に取り扱えるようになるとともに、収率の改良が 実現される。本発明に使用するための好適なビニルスルホンについて以下でよリ 詳細に説明する。 本発明に係る1プロセスにおいて、最初に「X」基を用いて多糖の誘導体の形成 を行う。このX基は、多糖上のどの内在性基(例えば、ヒドロキシル基)よりも高 い求核性および／または高い反応性をもつものでなければならない。例として、 X基は、アミン、チオール、またはヒドラジドであってもよい。多糖上にX基を付 与するために、CDAP、CNBr(例えば、Pneumococcalタイプ14(「Pn14」)およびPRP に対するもの)、カルボジイミド(例えば、Vi抗原およびNeisseria PsCに対する もの)、などを利用して多糖を活性化してもよい。このような誘導体形成を行う 方法は、当該技術分野で周知である。例えば、上記のDickらの論文を参照のこと 。 X基を用いて多糖の誘導体を形成した後、高濃度(例えば、0.1Mを越える濃度) のジビニルスルホン物質(これはホモ二官能性ビニルスルホンである)を添加する 。X基のタイプにもよるが、溶液のpHを反応に適切なpH、例えば5〜10に調節する 。ジビニルスルホン物質が高濃度であるため、反応の進行が促進され、しかもX 基を介した架橋が最小限に抑えられる。また、より低いpHを用いると、多糖ヒド ロキシルの架橋が最小限に抑えられる。得られる物質は、ビニルスルホン誘導体 化多糖(「Ps-Vs」)である。 必要な場合には、ビニルスルホン誘導体形成プロセスの後で未反応X基をキャ ッピングすることができる。X基としてアミンおよびヒドラジドを使用した場合 、N-ヒドロキシスクシンイミド-アセテート(「NHS-アセテート」)との反応を利 用して過剰のX基をキャッピングすることができる。X基としてチオールを使用し た場合、ヨードアセトアミドによりキャッピングすることができる。このような キャッピング反応は、当該技術分野では普通に使用されている。過剰のキャッピ ング試薬は、当該技術分野で周知の標準的な方法、例えば、透析、脱塩、限外濾 過などにより除去することができる。 Ps-Vs物質を形成した後、これをタンパク質(ペプチドまたはハプテン)成分と 反応させてコンジュゲートを形成させる。Ps-Vsとの反応の前にタンパク質成分 の誘導体を形成する必要はない。例えば、タンパク質アミンを多糖に直接結合さ せることもできる。このほか、初期段階として、コンジュゲート形成を行う前に 、「Y」基を用いてタンパク質の誘導体を形成することもできる。好適なY基として は、チオールまたはヒドラジドが挙げられる。このようなY基の利用は、タンパ ク質と多糖との間の架橋の数を制限しようとする場合に適したものでありうる。 更に、適切なY基を利用して、他の方法により実施可能なものよりも早い速度で および／または低いpHでコンジュゲート形成反応を進行させることができる。 上記の基本的な手順は、図1(a)〜1(c)に模式的に示されている。図1(a)に示さ れているように、最初に、制限された数(n≧1)の「X」基を用いて多糖(「Ps」) の誘導体を形成する。X基の数は、例えば、X試薬の量の制御および／または反応 時間の制限および／または活性化試薬の量の制限を行うことにより制御してもよ い。X基には、アミン基(「-NH2」)、チオール基(「-SH」)、またばヒドラジド基 (「-C(=O)-NH-NH2)」)含まれていてもよい。この後、この官能化された多糖物質 にホモ二官能性ジビニルスルホン物質を反応させることによりビニルスルホン誘 導体化多糖を形成する。図1(b)に示すように、この第2の処理工程でジビニルス ルホン物質と反応させる場合、X基へのビニルスルホン基の結合を促進するよう な適切なレベルに混合物のpHを調節する(ただし、ビニルスルホンと、多糖上の 内在性基(例えば、ヒドロキシル基)との反応が回避されるようにする)。図1(b) は、ジビニルスルホンまたは他のジビニルスルホン物質が利用可能であることを 示している。過剰の試薬は除去する。この後、誘導体化されていないタンパク質 またはY基を用いて誘導体化されたタンパク質を、この反応を促進する（ただし 、他の望ましくない架橋反応は回避する）のに適切なpHにおいてビニルスルホン 誘導体化多糖と反応させる。図1(c)を参照されたい。得られるタンパク質／多糖 コンジュゲートは、図1(c)に示す。タンパク質がY基で官能化されている場合、Y 基の一部分が最終コンジュゲート中に含まれていてもよい(図1(c)には示してい ない)。 ホモ二官能性ジビニルスルホン架橋物質を使用する代わりに、本発明に係るプ ロセスにおいてヘテロ二官能性ビニルスルホン架橋物質を使用することもできる 。上述した方法により、最初に、制限された数の反応性求核試薬、例えば、チオ ール、アミン、またはヒドラジドを用いて多糖の誘導体を形成する。こうして誘 導体化された多糖を、次に、ヘテロ二官能性ビニルスルホン試薬と反応させてビ ニルスルホン誘導体化多糖(「Ps-Vs」)を形成する。過剰の試薬を除去し、その 後、Ps-Vs物質をタンパク質と反応させてコンジュゲートを形成する。この場合 にも、上述したように、コンジュゲート形成反応を行う前にタンパク質の誘導体 化を行わないでもよいし、Y基を用いてタンパク質を誘導体化してもよい。 ホモ二官能性ビニルスルホン物質およびヘテロ二官能性ビニルスルホン物質の 両方を利用して多糖の誘導体を形成してから、上述したようにコンジュゲートを 形成してもよい。本発明に係る種々のホモ二官能性ジビニルスルホン物質を使用 することができる。1つの好適な物質は、次の構造式： を有するジビニルスルホンそのものである。 ビニルスルホン基は中性pHで非常に安定であるので、ジビニルスルホンを用い て多糖の誘導体を形成することは有利である。このため、ビニルスルホン誘導体 化多糖(「Ps-Vs」)は凍結乾燥させてから凍結した状態で保存することができる 。Ps-Vs物質はこうした高い安定性および保存性を有するため、他の架橋剤を使 用した場合と比較して、ジビニルスルホンを使用することは非常に有利である。 多糖上のこのビニルスルホン基の高い安定性は、もう1つの利点を提供する。こ の安定なビニルスルホン誘導体化多糖を使用した場合、長時間にわたリコンジュ ゲート形成反応を継続することが可能である。このため、特に、アミン、ヒドラ ジド、または他の安定な基に結合した場合にタンパク質／多糖コンジュゲートの 収率が改良される。これとは対照的に、他の架橋剤は、コンジュゲート形成反応 の際に加水分解を起こす傾向があり、従って、コンジュゲートの収率は低下する 。 ジビニルスルホンを使用する場合は注意が必要である。例えば、フード中で使 用するなどの適切な安全対策を施したうえで使用しなければならない。更に、誘 導体形成反応でジビニルスルホンを使用する場合、溶液をよく混合してジビニル スルホンが溶解状態で確実に保持されるようにしなければならない。誘導体形成 反応時にジビニルスルホンが溶液状態で確実に保持されるように、補助溶剤(例 えば、DMF)を使用してもよい。 他の好適なホモ二官能性ジビニルスルホン物質には2つのスルホン基が含まれ るが、この場合、分子の各末端が好適なR基により互いに連結されたものである 。その一般構造式は次の通りである：式中、Rは、1〜20個の炭素を有する置換または無置換のアルキル鎖などの任意の 好適な連結基である。アルキル鎖上の置換基にはカルボキシル基が含まれていて もよい。もう1つの例として、Rはポリエチレングリコールであってもよい。 ジビニルスルホンのほかに、本発明に使用できるもう1つの特定のホモ二官能 性ジビニルスルホン物質は、1,6-ヘキサン-ビス-ビニルスルホン(分子量266)で ある。この架橋物質は次の構造式を有する。 先に記載の一般構造に対して、この場合は「R」は無置換のヘキサン基である。1 ,6-ヘキサン-ビス-ビニルスルホンは、ジビニルスルホンよりも毒性が低くかつ 扱い易い固体物質である。このほか、1,6-ヘサン-ビス-ビニルスルホンは、ジビ ニルスルホンよりも低い揮発性を有する。この物質は非揮発性であり、タンパク 質および多糖の誘導体の形成を促進する試薬の扱いが容易になるとともに、コン ジュゲート結合中へのスペーサーの導入が可能になる。1,6-ヘキサン-ビス-ビニ ルスルホンの供給源の1つは、「BioLinkTM-6」として知られる物質である。BioL inkTM-6は、アラバマ州HuntsvilleのMolecular Bio-Sciencesにより製造されて いる。 上記の1,6-へキサン-ビスビニルスルホンの構造から明らかであるように、こ の架橋剤の各末端は、誘導体化の際にタンパク質または多糖の分子と反応しうる ビニルスルホン基を有する。これはホモ二官能性ジビニルスルホン物質の共通し た特徴である。従って、特に長鎖ジビニルスルホン物質(すなわち、ビニルスル ホン基に結合した「R」基がかなり長い場合)を用いて誘導体を形成する際、ジビ ニルスルホン物質の各末端は、単一のタンパク質または多糖の異なる部分と反応 して閉環型構造を形成する可能性がある。これは望ましいことではない。なぜな ら、タンパク質または多糖上の少なくとも2つの架橋しうるまたはコンジュゲー トしうる部位が、ビニルスルホン環によって、コンジュゲート形成に対して不活 性になるからである。このほか、ホモ二官能性ジビニルスルホン物質の各末端は 反応性であるため、誘導体形成プロセス時にジビニルスルホン物質により2つの タンパク質分子または2つの多糖分子が互いに連結される可能性もある。これも また望ましいことではない。なぜなら、これによりタンパク質／多糖コンジュゲ ートの収率が低下するからである。これらの問題を回避するために、本発明に係 るプロセスにおいて、過剰のホモ二官能性ジビニルスルホン物質を使用すること が好ましい。過剰量を使用すると、特に、多糖分子がX基で官能化されている場 合、ジビニルスルホン物質の単一の分子の各末端が単一の多糖分子上の2つの異 なる位置で反応する可能性が低下する。また、これにより、ジビニルスルホン物 質の単一の分子の各末端が、誘導体形成工程時に2つのタンパク質または2つの多 糖に結合する可能性も低下する。 これらの問題を回避するもう1つの方法として、ホモ二官能性ビニルスルホン の代わりにヘテロ二官能性ビニルスルホンを使用することができる。ヘテロ二官 能性ビニルスルホンはビニルスルホン基を1つ有する。従って、適切な反応条件 を選択することによって、ヘテロ二官能性ビニルスルホンの一方の末端だけを誘 導体化に利用するか、または多糖(もしくはタンパク質)分子に結合させることが できる。こうした点を考慮すれば、単一の多糖分子またはタンパク質分子へのビ ニルスルホンの各末端の望ましからぬ結合の可能性が除去される。また、これに より、2つの多糖分子または2つのタンパク質分子が、誘導体形成プロセスの際に 互いに結合すかまたはそれぞれに結合する可能性が除去される。このような望ま しからぬ結合の形態を除去すると、タンパク質への結合に利用可能な多糖上の部 位の数が増加する(またはその逆)。 好適なヘテロ二官能性ビニルスルホン物質として、次の一般構造式を有するエ ステル基含有N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)ビニルスルホンを使用してもよ い： 式中、Rは、1〜20個の炭素原子を有する置換または無置換のアルキル鎖などの任 意の好適な連結基であってよい。Ｒ基上の適切な置換基にはカルボキシルが含ま れる。また、R基は、例えば、ポリエチレングリコールであってもよい。この一 般構造式に含まれる特定の好適なビニルスルホンの1つは、次の通りである： ポリエチレングリコール(「PEG」)を基剤とした種々の分子量のNHS-ビニルス ルホンもまた、本発明に係るプロセスに使用することができる。このような物質 は、Shearwater Polymers，Inc．(アラバマ州Huntsville)から市販されている。 このようなエステル基を含むNHS-ビニルスルホンの1つは、次の一般構造式を有 する： 上述のホモ二官能性およびヘテロ二官能性のビニルスルホン物質は、後続のタ ンパク質／多糖コンジュゲート形成反応に対して反応性部位を提供するために、 多糖分子またはタンパク質分子上に結合されて誘導体を形成する。コンジュゲー ト形成工程の際、誘導体化されたビニルスルホンは、タンパク質または多糖上の 求核試薬と反応してコンジュゲート形成工程を終了する。大きな嵩高い求核試薬 は、典型的には、ビニルスルホンと小分子(例えば、メルカプトエタノール)との 反応に比べて、比較的ゆっくりとビニルスルホンと反応する。上記のMorpurgo， et al.の論文を参照されたい。従って、ビニルスルホンが高分子量多糖の誘導体 の形成およびその後のタンパク質(これもまた大きな嵩高い分子である)への多糖 の結合に好適であるとは予期されなかった。しかしながら、本発明に係るプロセ スは、ビニルスルホンがタンパク質と多糖とを結合してコンジュゲートを形成す るためのスペーサーまたは架橋剤としてかなり好適であることを示している。 本発明のプロセスでは、処理工程の1つにおいてビニルスルホン物質を用いて 多糖の誘導体を形成する。この誘導体形成により、多糖上に活性反応部位が形成 される。チオール、アミン、ヒドロキシルなどの求核試薬は、マイケル付加反応 により、誘導体化されたタンパク質または多糖上のビニルスルホンと反応するこ とができる。一般的なマイケル付加反応のプロセスは、図2に示されている。一 般的には、チオールは6〜9のpH領域で反応性を呈し、アミンは7〜10のpH領域で 反応性を呈し、ヒドロキシルは10を越えるpHで反応性を呈する。マイケル付加反 応については、「擬糖タンパク質(Neoglycoproteins)合成のためのマイケル付加 」，A．Romanowska，et al.，Methods In Enzymology，Vol．242(1994)，pp．90 -101に記載されている。このRomanowskaの論文の全内容は引用により本明細書中 に含まれるものとする。 ビニルスルホンとチオール求核試薬との反応(例えば、図2において、Nuがチオ ール基の場合)は、安定なチオール‐エーテル結合が形成されるため、有利であ る。このほか、この反応は、7〜10のpH領域にわたり好適な速度で進行する。ビ ニルスルホン基は、ハロ酸またはマレイミド基よりも多くの求核試薬と反応する 。上述のマレイミドを用いた結合手順と比較して、ビニルスルホンを用いて得ら れるチオール‐エーテルはより小さいエピトープである。更に、ビニルスルホン 基は、マレイミド基よりもはるかに安定である。α-ハロ酸を用いた上述のプロ セスと比較して、ビニルスルホンを用いた手順は、α-ハロ酸に基づく手順とは 異 なり光に敏感でない。このほか、ビニルスルホン基は、Romanowskaが使用した基 よりも反応性が高い。 本発明によれば、種々の異なるタンパク質を種々の異なる多糖に結合すること ができる。以下のリストは、本発明において使用される適切なタンパク質の例を 含む：ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、寄生虫タンパク 質、動物タンパク質、脂質、糖脂質、およびペプチド、または免疫学的性質を増 強するのに使用される他のハプテン。具体的なタンパク質としては、破傷風トキ ソイド（ＴＴ）、百日咳トキソイド（ＰＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、 リポタンパク質、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、熱ショックタンパク質、Ｔ細 胞スーパー抗原、および細菌の外膜タンパク質がある。これらのタンパク質出発 物質のすべては、生化学薬品または医薬品供給会社から購入することができる（ 例えば、メリーランド州ロックビルのAmerican Tissue Type Collection、また はフロリダ州のBerna Laboratories）か、または標準的方法、例えばJ.M．Cruse and R.E．Lewis（編）、Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiolo gy and Immunology，Vol．10(1989)に記載されているような方法により、調製で きる。このCruse書は引用により本明細書に組み込まれるものとする。 本発明の方法で使用される適切な多糖の例としては、細菌性、真菌性、および ウイルス性の多糖がある。可溶性多糖（すなわち、溶液中に存在する多糖）が好 適であり、本発明の使用においては水溶性多糖が特に好ましい。適切な多糖の具 体例としてはサルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）Ｖｉ抗原；髄膜炎菌（ Neisseria meningiditis）多糖Ｃ；肺炎球菌（Pneumococcal）多糖タイプ１４の ような肺炎球菌（Pneumococcal）多糖；およびデキストランがある。本発明にお いて使用される追加の多糖の適切なリストは、１９９５年６月７日に出願された Andrew Leesの米国特許出願第０８／４８２，６６６号に記載の多糖がある。前 述のように、本出願は引用によりその全文を本明細書に組み込むものとする。 ビニルスルホン誘導体化工程を使用してコンジュゲートを生成する実際の方法 については、種々のプロセス条件が記載されるであろう。コンジュゲーション工 程（すなわち、タンパク質と多糖を結合する工程）中の反応溶液のｐＨは、好ま しくは６〜１０の範囲である。一般に、この範囲でｐＨが高いほど反応はより迅 速かつ完全に進行することが観察されている。 本発明のプロセスの1つの目的は、ワクチンまたは他の免疫学的に有用な試薬 を調製するのに有用なコンジュゲート（例えば、タンパク質／多糖コンジュゲー ト）を提供することである。本発明のプロセスにおいて、ホモ二官能性またはヘ テロ二官能性ビニルスルホンを使用してタンパク質または多糖成分を軽度にかつ 限定的に誘導体化または官能基化すると、免疫学的に重要なエピトープへの傷害 の官能性が最小になる。さらに、この反応条件は、未反応のタンパク質をコンジ ュゲートから分離することを可能にする。これは、タンパク質が重合を受けるこ とを防止するのに有用であり、より純粋なコンジュゲート生成物を与える。結合 反応は、妥当な速度（すなわち、妥当な反応速度論）かつ妥当なｐＨで進行する 。さらに、コンジュゲーション工程の残存試薬はすべて、例えばメルカプトエタ ノール、エタノールアミン、またはグリシンによりクエンチすることができる。 以下に種々の好適な実施態様および具体例により、本発明をさらに詳細に記載 する。これらの好適な実施態様および具体例は、本発明の例示のためであり、決 して本発明を限定するものと考えてはならない。さらに、いくつかの例では、モ デルタンパク質としてＢＳＡを、および／またはモデル多糖としてデキストラン を使用する。もちろん生物学的に関連するタンパク質や多糖は、本発明の実施に おいて使用されるであろう。生物学的に関連するタンパク質や多糖を含む具体例 もまた、本出願に包含される。 以下の実施例はまた、当業者に公知の種々の略語、標準法および材料を含む。 以下の情報は、以下の実施例に含まれる情報をより容易に理解するのに有用であ ろう。これらの定義は、特に明記しない場合は、以下の実施例において適用され る。 これらの実施例で使用されるモノマー性ＢＳＡは、Lees et al.，Vaccine，Vo l.14，No.3（1996）pp．190-198に記載のように、２．５×１００cmのＳ１００ ＨＲカラム（Pharmaciaより）でのゲルろ過により、CohnのフラクションＶ Ｂ ＳＡ（Sigma Chemical Co.）から調製した。デキストランは、Pharmacia製のＴ ２０００デキストランとした。ジビニルスルホンは、Aldrichから入手した。１ ，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホンは、アラバマ州ハンツビル（Huntsville ）のMolecular Biosciencesから入手した。破傷風トキソイド、サルモネラ・テ ィフィ（Salmonella typhi）Ｖｉ抗原、および髄膜炎菌（Neisseria）ＰｓＣは 、Smith Kline Beecham（ベルギー、Rixensart）から入手した。本発明の適当な多糖のた めの市販の供給源は、メリーランド州ロックビルのAmerican Tissue Type Colle ction、およびSigma Chemical Co.である。 チオール基の有無を測定するための試験は、G.L．Ellman，Arch．Biochem．Bi ophys.，Vol．82，pg．70(1959)に記載の方法でEllman's試薬を使用した。Ellma n's試薬はまた、５，５’−ジトールビス（２−ニトロ安息香酸）すなわち「Ｄ ＴＮＢ」として知られている。アミンの有無は、J．Vidal and C．Franci，J．I mmunol．Meth.，Vol．86，pg．155(1986)により記載されたトリニトロベンゼン スルホン（ＴＮＢＳ）酸アッセイを使用して測定した。ヒドラジドの有無は、Qi ，et al.，Anal．Chem.，Vol．275，pg．139(1988)により記載されたＴＮＢＳア ッセイにより測定した。多糖の有無は、関連する多糖標準物質を使用する、Mons igny，et al.，Anal．Chem．Vol．175，pg．525(1988)のレゾルシノール／硫酸 法を使用して測定した。タンパク質の有無は、Coomassie Plus Protein Assay R eagent（イリノイ州ロックポートのPierce Chemical Co.から入手できる）（標 準物質としてＢＳＡまたは破傷風トキソイドのような適当なタンパク質標準物質 を使用した）を使用して測定した。これらの引用文献は、すべて引用により本明 細書に組み込まれるものとする。 本出願において「ＮａＡｃ緩衝液」は、１０mM酢酸ナトリウム、２mMエチレン ジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、および０．０２％アジ 化ナトリウムの混合物であり、ｐＨ５を有する溶液を提供する。「ＨＥＰＥＳ」 緩衝液（または「ＨＥ」緩衝液）は、０．１５Ｍヒドロキシルエチルピペラジン Ｎ’−２−エタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）と２mM ＥＤＴＡの混合物であ り、ｐＨ７．３の溶液を提供する。「ＨＥＰＥＳのみ」または「ＨＥのみ」とは 、ＥＤＴＡを含まないＨＥＰＥＳ単独を意味する（ｐＨ＝８）。「５×ＨＥＰＥ Ｓ」緩衝液（または「５×ＨＥ」）は、０．７５Ｍ ＨＥＰＥＳと１０mMＥＤＴ Ａの混合物であり、ｐＨ７．３の溶液を提供する。「食塩水」は、０．１５Ｍの ＮａＣｌ溶液である。 高速液体クロマトグラフィー（［ＨＰＬＣ」）を行う場合には、Watersモデル ６２６ポンプを、モデル６００Ｓコントローラーとモデル４８６吸光度検出器と ともに使用した。ＨＰＬＣクロマトグラフィーを行う前に、すべての試料は、ウ ルトラフリーのＭＣ０．４５μｍフィルターユニットを使用して遠心分離してろ 過した。ＨＰＬＣカラムは、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で平 衡化したPhenomenex Biosep G4000カラム（３００×７．８mm）とした。流速は １ml／分とした。いくつかの実験では、同じ物質のガードカラムを使用した。 これらの実施例において、タンパク質は、Bioconjugate Techniques、前述、2 30頁に記載の一般的プロトコールを使用して、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピ リジルジチオ）プロピオネート（「ＳＰＤＰ」、イリノイ州ロックポートのBioA ffinity Sciencesから入手できる）を使用してチオール化した。標識は、ＨＥＰ ＥＳ緩衝液中でｐＨ７．３で、次に５０mMのジチオスレイトール（「ＤＴＴ」） を使用してｐＨ５でチオールを脱保護して行なった。チオール化したタンパク質 をゲルろ過カラムで脱塩し、Centricon装置（Amiconから入手できる）を使用し て濃縮した。ＳＰＤＰ以外のチオール化剤（例えば、シスタミン、ＳＡＭＳＡ、 Ｔraut's試薬、メルカプトエチルアミン、およびＮ−スクシニミジルＳ−アセチ ルチオアセテート（「ＳＡＴＡ」）も使用することができる。 アミノエチルカルボキシメチルデキストラン（ＡＥＣＭ−Ｄｅｘ）は、Inman ，Journal of Immunology，Vol．114，page 704(1975)に記載された方法で調製 した。この論文はまた、引用によりその全文を本明細書に組み込むものとする。 Ｓ４００ＨＲカラム（Pharmacia製）でゲルろ過して、高分子量画分を得た。 実施例１ この実施例は、多糖にタンパク質を結合するのにジビニルスルホン物質が使用 できることを例示する。結合した物質（すなわち、コンジュゲート）は、ワクチ ンまたは他の免疫学的試薬を作製するのに使用してもよい。この実施例では、ホ モ二官能性であるビス−ビニルスルホンを使用して、タンパク質を多糖に結合し た。反応手順を、図３（ａ）〜３（ｄ）に模式的に示す。 Ａ．チオール化タンパク質の調製 第１の工程で、チオール化タンパク質物質（ＢＳＡ−ＳＨ）を調製した。図３ （ａ）を参照されたい。このプロセスを以下に示す。 １．チオールピリジルジスフィドタンパク質 この実施例ではモデルタンパク質としてＢＳＡを使用した。食塩水で平衡化し たＳ１００ＨＲカラム（Pharmaciaから入手できる）でゲルろ過し、Lees et al. ，Vaccine，前述、1996，Vol．14，No．3，pgs．190-198に記載の方法で限外ろ 過により６６mg/mlに濃縮して、モノマー性ＢＳＡを調製した。０．７５mlのＢ ＳＡ溶液（５０mgのＢＳＡに相当する）に５０μｌの５×ＨＥ緩衝液と５９μｌ のＯ．１Ｍ ＳＰＤＰ（チオール化のため）を加え、ｐＨを７．３に維持した。 このＳＰＤＰの量は、ＢＳＡ含量に比較して８倍モル過剰のＳＰＤＰを与えた。 ２．チオールの脱保護 次に、２時間の反応時間後、ＢＳＡ物質上のチオールを脱保護した。上記ＢＳ Ａ溶液０．３４mlに、攪拌しながらｐＨ５の１Ｍ ＮａＡｃ緩衝液１００μｌを 加えた。次に２２μｌの１Ｍ ＤＴＴを加え、約２０分反応させた。この方法に よりチオールが脱保護された。 ３．さらなる方法 脱保護後、得られた物質を、２つのHiTrapカラム（Pharmaciaから入手できる ）を直列に使用して脱塩した（ここで、カラムは、ＮａＡｃ緩衝液ｐＨ５で平衡 化させた）。次に、Amiconから得られるCentricon30装置を使用して、溶液を濃 縮した。得られたチオール化ＢＳＡ（「ＢＳＡ−ＳＨ」）物質は、以下の性質を 有していた：（ａ）ＢＳＡ含量４７mg/ml（２８０nmでの光学密度（ＯＤ）、吸 光係数１．５mg/mlＢＳＡ／吸光度単位により測定した）；および（ｂ）チオー ル（「ＳＨ」）含量４．６mM ＳＨ（ＤＴＮＢアッセイで測定した）。重量平均 分子量６８，０００を使用して、得られたＢＳＡ−ＳＨ物質は６．６ ＳＨ基／ ＢＳＡであると測定された。 Ｂ．ビニルスルホン誘導体化多糖の調製 このプロセスの別の工程として、ビニルスルホン誘導体化デキストラン多糖物 質を調製した。図３（ｂ）と３（ｃ）を参照されたい。このプロセスで使用した ホモ二官能性ジビニルスルホンは、１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン物 質（「BioLink（登録商標）-6」、アラバマ州ハンツビル（Huntsville）のMolec ular Bio-sciencesから入手できる）であった。図３（ｂ）に一般的に示すよう に、以下の反応手順で、まずアジピン酸ジヒドラジド（「ＡＤＨ」）とＣＤＡＰ を使用して、デキストラン物質をヒドラジドで誘導体化した。２５０μｌのＣＤ ＡＰ（アセトニトリル中１００mgＣＤＡＰ／mlの濃度）と２５０μｌの０．２Ｍ トリエチルアミンを、１０mlのデキストラン（濃度１０mg/ml）に加えた。２分 後、ＨＥＰＥＳのみ中０．５Ｍ ＡＤＨ ４mlを加えると、得られた混合物のｐ Ｈは８であった。この混合物を約１時間反応させた。次にこれを透析し、脱塩し 、濃縮し、そして得られたヒドラジド誘導体化デキストラン生成物（「デキスト ラン−Ｈｚ」）は、８mgデキストラン／ml食塩水の濃度を有し、２１ヒドラジド ／１００ｋＤａデキストランの比率を有していた。デキストラン−Ｈｚ物質を調 製するためのこの方法は、Vaccine（前述）の1996 Lees文献に記載の一般的プロ トコールに従う。 １．チオールピリジルジスルフィドデキストラン 次にデキストラン−Ｈｚをチオールピリジンで誘導体化した。このプロセスで は、１．５mlの上記デキストラン−Ｈｚ物質（８mg/ml）を５０μｌの５×ＨＥ 緩衝液（ｐＨ７．３）と混合した。デキストランを誘導体化するためにＤＭＦ中 の０．１Ｍ ＳＰＤＰ ５０μｌを加え、反応を約２時間進行させた。図３（ｂ ）を参照されたい。 ２．チオールの脱保護 次にデキストラン上のチオールを脱保護した。ｐＨ５の１Ｍ ＮａＡｃ緩衝液 ２００μｌを、デキストラン含有溶液に加えた。次に、１１０mgのＤＴＴを加え てチオールを脱保護した。１５分のインキュベーション期間後、ＮａＡｃ緩衝液 で平衡化し直列に置いた２つのHiTrap脱塩カートリッジ（ｐＨ５）で脱塩した。 ３．ジビニルスルホン物質による誘導体化 デキストラン含有試験管を一緒にプールして、４mlのデキストラン物質を形成 した。過剰の１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホンを加えて、チオールをで きるだけ迅速に誘導体化した。１００μｌのＤＭＦ中の１，６−ヘキサン−ビス −ビニルスルホン ７．６mgと２００μｌの０．７５Ｍ ＨＥ緩衝液（ｐＨ＝７ ．３）を、攪拌しながらデキストラン含有プールに加えた。前記したように、過 剰のジビニルスルホン物質は、２つの多糖分子の好ましくない結合およびジビニ ルスルホン物質の２つの反応性末端による好ましくない環形成を防止するのを助 ける。 チオールのＤＴＮＢアッセイにより、この反応プロセスでデキストラン上のチ オールが消費されたことを確認した。測定結果を表１に示す。 ＊ アッセイ条件−１０μｌ試料／２００μｌ総量、４１０nmで読んだ。 時間の増加の関数として低下する光学密度は、反応操作が継続していくに従っ てチオールが反応（および消費）していることを示す。 ２０分後、０．５Ｍヨードアセトアミド１００μｌを溶液に加えて残存チオー ルをキャップした。さらに１５分後、溶液をCentricon50（Amicon製）で約２ml に濃縮し、次に約ｐＨ５のＮａＡｃ緩衝液で平衡化した直列の２つのHiTrapカラ ムで脱塩した。 チオール脱保護の完全性を試験するために、デキストランにＤＴＴを加えた。 ３４３nmで光学密度の増加は観察されなかった。この試験により、得られた物質 中にチオールまたはＳＰＤＰ保護されたチオールが残存していない（すなわち、 脱保護は完全である）ことを確認した。 β−メルカプトエタノール（「βＭＥ」）とＤＴＮＢを用いる逆滴定により、 １００ｋＤａのデキストラン当たり約８ビニルスルホンがあることが判明した。 得られたｄｅｘ−ビニルスルホン溶液は、５．１mgデキストラン／mlを有した。 図３（ｃ）に例示した一般的化学構造を有する物質が生成した。 Ｃ．コンジュゲーション 工程ＡのＢＳＡ−ＳＨチオール化タンパク質と工程Ｂのｄｅｘ−ビニルスルホ ン多糖を一緒に反応させて、図３（ｄ）に一般的に示すタンパク質／多糖コンジ ュゲートを形成した。表２に示すように種々の異なる反応条件を使用して、コン ジュゲート形成プロセスを試験した。 ＊ 特に明記しない場合。実施例番号Ｄ４とＤ５では、記載の反応物の代わりに ＮａＡｃを加えた。これらの実施例は、バックグランドの目的で行なった。 得られたコンジュゲート物質を、ガードカラムの付いたPhenomonex Biosep G4 000でサイズ排除ゲルろ過ＨＰＬＣに付した。モニタリングした波長は２８０nm であった。高分子量（ＨＭＷ）コンジュゲート物質に対応して、コンジュゲート のピークが最初に溶出された。コンジュゲートの高分子量領域に対応する領域中 の、実施例Ｄ４とＤ５のＨＰＬＣ曲線下の面積をバックグランドとして使用し、 これらのバックグランド値を実施例Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３の各々についてのピ ーク面積から引いた。ＢＳＡ総量は、結合したタンパク質と多糖のパーセントを 計算するのに使用した。結果を表３に示す。 この試験データは、ホモ二官能性ジビニルスルホン物質１，６−ヘキサン−ビ ス−ビニルスルホンをスペーサーとして使用して、ビニルスルホン誘導体化とタ ンパク質結合が可能であることを例示する。約５０％のタンパク質をｐＨ９．３ で多糖に結合させるのに、１８時間は充分な時間であった。より低いｐＨでは、 より長い反応時間が必要であった。 この例はまた、ホモ二官能性ジビニルスルホン物質が、多糖の限定されかつ制 御された誘導体化を行うのに使用できることを証明する。誘導体化した多糖は、 チオール化タンパク質に結合させて、タンパク質／多糖コンジュゲートを高収率 で製造することができる。コンジュゲーション反応は、比較的穏やかな制御され た方法で進行する。 実施例II 本発明において、ジビニルスルホンはまた、多糖を活性化しコンジュゲートを 製造するためのホモ二官能性ジビニルスルホン物質として使用することができる 。ジビニルスルホンは高濃度で水溶性であり、安定で比較的安価であり、かつ前 記した長鎖ホモ二官能性およびヘテロ二官能性ビニルスルホン物質に比較して容 易に入手できる。 この実施例では、チオール化ＢＳＡ物質（ＢＳＡ−ＳＨ）を、ジビニルスルホ ンで誘導体化しておいたデキストラン多糖と結合させた（Ｖｓ−デキストラン） 。 Ａ．チオール化ＢＳＡの調製 第１の工程で、チオール化ＢＳＡタンパク質物質（ＢＳＡ−ＳＨ）を、実施例 Ｉに記載の方法と同じ一般的方法により調製した。 １．タンパク質のチオール保護 市販のＢＳＡ（Pharmacia製）をモデルタンパク質出発物質として使用した。 このＢＳＡをゲルろ過カラムに流してモノマー性生成物を得た。４００μｌのモ ノマー性ＢＳＡ溶液（濃度４７mgＢＳＡ／ml）から出発して、５×ＨＥ緩衝液１ ００μｌと０．５Ｍヨードアセテート２０μｌをこの溶液に加え、２０分間反応 させ、次に０．１ＭＳＰＤＰ ５５μｌ（チオール化のため）を加えた。 ２．チオールの脱保護 約１時間反応させた後、ＢＳＡ物質上のチオールを脱保護した。上記ＢＳＡ溶 液を充分量の１Ｍ ＮａＡｃ緩衝液と混合してｐＨを約５に調整した。次に充分 なＤＴＴを加えて５０mM ＤＴＴ溶液とし、チオールを脱保護した。 ３．追加の操作 脱保護後、得られた物質を、ＮａＡｃ緩衝液でｐＨ５に平衡化した２つの直列 のHiTrapカラムを使用して脱塩し、プールし、Centricon30装置（Amicon製）を 使用して濃縮した。得られたＢＳＡ−ＳＨ物質は以下の性質を有していた：（ａ ）ＢＳＡ含量５５．３mg/ml（２８０nmの光学密度（ＯＤ）で測定した）；およ び（ｂ）約６．２ ＳＨ／ＢＳＡ。 Ｂ．ビニルスルホン誘導体化多糖の調製 デキストランはまた、この実施例でモデル多糖物質として使用した。まずデキ ストランをアミノエチルカルボキシメチル基で官能基化してＡＥＣＭ−デキスト ランを製造した。食塩水中でＳ４００ＨＲカラム（Pharmaciaから入手できる） でゲルろ過して高分子量ＡＥＣＭ−デキストラン画分を得た。得られたＡＥＣＭ −デキストラン生成物は、３０mg ＡＥＣＭ−ｄｅｘ／mlの濃度で、２８アミン ／１００ｋＤａデキストランの比率を有していた。 １００μｌの１Ｍ炭酸ナトリウムを１mlのＡＥＣＭ−Ｄｅｘ物質(３０mgのＡ Ｅ ＣＭ−Ｄｅｘに相当する）と混合した。必要に応じてＨＣｌおよび／またはＮａ ＯＨを加えて、溶液のｐＨを８に調整した。ドラフト内で、混合しながら１００ μｌのジビニルスルホンを加えた。反応はシェーカー上で一晩進行させた。得ら れた物質を、１．５×１５cmのＰ６ＤＧカラム（BioRadから入手できる）で脱塩 し、食塩水で平衡化し、そして次にCentricon50装置（Amicon製）で１５mg/mlに 濃縮した。得られた物質はビニルスルホン誘導体化デキストラン（Ｄｅｘ−Ｖｓ ）であった。 ｃ．コンジュゲーション ＢＳＡ−ＳＨ物質を、ｐＨ８と９．３でビニルスルホン誘導体化デキストラン に結合させた。下記の表４は、この実施例のコンジュゲーション反応操作で使用 した種々の反応条件を記載する（コンジュゲーション反応時間：４８時間）。コ ンジュゲート生成物がＢＳＡ−Ｓ−Ｖｓ−Ｄｅｘである実施例Ｄ６とＤ８に注意 されたい。ＢＳＡ−ＳＨ対照物質は実施例Ｄ７のように作製した。コンジュゲー ト生成物のＨＰＬＣクロマトグラムをこの対照と比較して、実施例Ｄ６とＤ８で 観察された高分子量ピークがチオール化タンパク質の酸化や自己重合ではないこ とを確認できるように、この対照を実施した。同様に、実施例Ｄ９のようにＤｅ ｘ−Ｖｓ対照物質を作製した。この対照は、最終コンジュゲート生成物について クロマトグラフィーを行なった時、比較して２８０nmの吸光度がビニルスルホン 基またはビニルスルホン誘導体化デキストランに起因するものではないことを確 認できるようにするために行なった。 ｐＨ９．３で調製したコンジュゲート生成物（実施例Ｄ７）のＨＰＬＣクロマ トグラフム（２８０nmで）を図４（ａ）に示す。前記と同様にサイズ排除ＨＰＬ Ｃを行なった。高分子量ピーク（４７％、溶出時間約６分に示す）は、コンジュ ゲート生成物に対応する。図４（ｃ）は、実施例Ｄ９のクロマトグラムを示し、 ６３％の高分子量ピークを示す。コンジュゲート生成物のクロマトグラム（図４ （ａ）と図４（ｃ））を対照生成物（図４（ｂ）と４（ｄ））に対して比較する と、ｐＨ８と９．３の両方で、実施例Ｄ７とＤ９でＢＳＡ−Ｓ−Ｖｓ−Ｄｅｘコ ンジュゲートが生成したことが容易に理解できる。 コンジュゲート形成の程度の尺度として、コンジュゲートピーク中のタンパク 質／多糖の重量比を測定する（例えば、mgＢＳＡ／mgＤｅｘ）。サイズ排除カラ ムを用いる上記ＨＰＬＣ装置は、図４（ａ）と４（ｃ）に示すように、曲線下の 総面積に対するピーク下の面積に対応する、各ピークのパーセント値を与える。 これらの図中の、約６分で溶出する高分子量ピーク（ＨＭＷ）は、コンジュゲー ト生成物に対応する。コンジュゲートのタンパク質対多糖重量比は、以下の式か ら決定される：HMW ピーク％×コンジュゲーション反応中の総タンパク質mg ＝ タンパク質mg １００×コンジュゲーション反応中の総多糖mg 多糖mg バックグランド測定の結果として存在する面積パーセントを引くことにより、 バックグランドについて％ＨＭＷ値を補正してもよい。しかし典型的には、コン ジュゲートの量に比較してバックグランドレベルは充分に小さく、この計算の目 的のためには無視できる。 図４（ａ）に示す情報に基づき、ｐＨ９．３で作製したコンジュゲート物質は 約０．６１mgＢＳＡ／mgデキストランを有していることがわかった。ｐＨ８での 反応からのコンジュゲート生成物は、図４（ｃ）に示すように、約０．８３mgＢ ＳＡ／mgデキストランを有していた。 従って、本実施例は、ジビニルスルホンを、ｐＨが１０未満のコンジュゲーシ ョン反応プロセスにおいて、高収率でタンパク質／多糖コンジュゲートを作製す るのに使用できることを証明する。実施例Ｉのように、実施例IIはまた、ホモ二 官能性ジビニルスルホン物質（すなわち、ジビニルスルホン）が、多糖の限定的 かつ制御された誘導体化を行うのに使用できることを示す。この誘導体化多糖は チオール化タンパク質に結合させて、タンパク質／多糖コンジュゲートを高収率 で得ることができる。コンジュゲーション反応は、比較的穏やかで制御された方 法で進行する。 実施例III この実施例では、誘導体化されていないＢＳＡを、ジビニルスルホンで誘導体 化したデキストラン多糖（Ｄｅｘ−Ｖｓ）に直接結合させた。本出願人は特定の 操作理論に拘泥されるつもりはないが、この結合は、タンパク質上で得られるア ミンを介して起きると考えられる。 この実施例で使用されるモデルタンパク質は、実施例IIで一般的に記載した方 法で調製したモノマー性ＢＳＡ物質である。この物質は、６６mgＢＳＡ／mlの濃 度を有していた。この実施例で使用したＤｅｘ−Ｖｓ物質は、前記実施例IIに記 載したように、ＡＥＣＭ官能基化デキストランを介して調製した。得られたＤｅ ｘ−Ｖｓ物質は、１５mg/mlの濃度を有していた。 結合反応のために、１０７μｌのモノマー性ＢＳＡ物質（約７mgのＢＳＡに相 当する）を、２００μｌのＤｅｘ−Ｖｓ物質（約３mgのＤｅｘ−Ｖｓに相当する ）と混合した。４３μｌの食塩水と５０μｌの１Ｍ炭酸ナトリウムをこれらの反 応物に加えて、反応ｐＨ約１０を得た。得られた生成物はＢＳＡ−Ｖｓ−デキス トランコンジュゲートである。 以下の表５は、コンジュゲーション反応の速度論を例示する。前述のような方 法でコンジュゲーション反応操作中に種々の時間にＨＰＬＣを行なつた。約６分 で溶出した高分子量画分のピークを測定した。この情報を、前述の方法でＢＳＡ 対デキストランの重量比に変換した。 この実施例は、ジビニルスルホンは、直接ＢＳＡに結合する誘導体化多糖を作 製するのに使用できることを示す。結合の速度論（すなわち、反応時間の関数と しての結合の上昇）を、表５に示す。 実施例IV 前記実施例IIで使用したように、チオール求核物質でタンパク質を誘導体化す る代わりに、この実施例ではタンパク質をヒドラジドで誘導体化した。ヒドラジ ド求核物質は、チオール求核物質またはアミン求核物質より低いｐＫａを有する 。この実施例は、低ｐＫａを有するヒドラジド求核物質を使用すると、基本的に 中性のｐＨ条件下で結合またはコンジュゲート形成を行うことができることを示 す。ヒドラジド（ｐＫａは約２）はチオールまたはアミンより弱い求核物質であ るが、中性ｐＨではプロトン化されないであろう。低いｐＨも使用することがで きる。 この実施例では、ヒドラジド誘導体化タンパク質（ＢＳＡ−Ｈｚ）をジビニル スルホン誘導体化多糖物質（Ｄｅｘ−Ｖｓ）に結合させた。Ｄｅｘ−Ｖｓ物質は 、前記実施例IIに記載した方法で調製した。モノマー性ＢＳＡ（前記実施例IIに 記載の方法で得られた）を、以下の方法でカルボジイミドとアジピン酸ジヒドラ ジド（ＡＤＨ）を使用して誘導体化した。食塩水中２０mg/mlの濃度を有するＢ ＳＡ ０．２ｇ（エンドトキシン還元ＢＳＡとしてIntergenから入手できる）を 出発溶液として使用した。ストックＡＤＨ溶液を加えて、この物質を０．２５Ｍ ＡＤＨとした。この混合物のｐＨを５に調整した。１００mg ＥＤＣ／ml水の濃 度を有する１mlの（１−（３−ジメチルアミノプロピル）３−エチルカルボジイ ミド塩酸塩（「ＥＤＣ」）をこの溶液に加えた。反応を６時間進行させた。反応 後、反応溶液を、食塩水で平衡化したＳ１００ＨＲ（２．６×９７cm）カラムを 通 してゲルろ過し、次に２２．６mg ＢＳＡ／mlに濃縮して、モノマー性ＢＳＡを 得た。得られたＢＳＡ−Ｈｚは約１９Ｈｚ／ＢＳＡを有することが測定された。 ２００μｌのＤｅｘ−Ｖｓ（濃度１５mg/m1、３mgのＤｅｘ−Ｖｓに相当する ）を、２２．６mg/mlの濃度を有する３１０μｌのＢＳＡ−Ｈｚ（７mgのＢＳＡ −Ｈｚに相当する）および１００μｌの１．５Ｍ ＨＥＰＥＳと混合した。対応 する反応ｐＨは７．３であった。１８時間後、コンジュゲート生成物を回収した 。サイズ排除ＨＰＬＣに基づき、得られたコンジュゲートピーク（約６分で溶出 ）は、０．５８mg ＢＳＡ−Ｈｚ／mgデキストランを有していた。 従って本実施例を考慮してヒドラジド誘導体化タンパク質を使用すると、基本 的に中性のｐＨ条件下でジビニルスルホンスペーサーを使用して、タンパク質／ 多糖コンジュゲート生成物が作製された。本出願人は、低ｐＨも使用可能である ことを見いだした。 実施例Ｖ この実施例では、破傷風トキソイドをタンパク質物質として使用して、臨床的 に関連するタンパク質／多糖コンジュゲートを調製した。この実施例の多糖は、 ジビニルスルホンで誘導体化したサルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）Ｖ ｉ多糖抗原である。破傷風トキソイドとサルモネラ・ティフィ（Salmonella typ hi）Ｖｉ多糖抗原はともにSmithKline Beechamから入手した。 第１の工程では、エチレンジアミンとカルボジイミドを使用してＶｉ抗原を誘 導体化し、Ｖｉ−ＮＨ2を作製した。これは以下の操作により行なった。 ５mgＶｉ／ml水の濃度を有するＶｉ抗原５mlに、５００μｌの１Ｍ ２−（Ｎ −モルホリノ）エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）を加えて、ｐＨ５．５の溶液を 得た。この混合物に２５０μｌの０．１Ｍ スルホ−Ｎ−ヒドロキシルスクシン イミド（「スルホ−ＮＨＳ」）を加えた。この混合物に０．５Ｍ ＥＤＣストッ ク溶液（水溶液）を加えて、ＥＤＣＣＰ０．１Ｍとした。４時間後、さらに１０ ０μｌのＥＤＣストック溶液を加えた。 一晩反応させた後、食塩水に対して該溶液を透析し、Ｐ６ＤＧカラム（BioRad から入手できる）で脱塩し、Macrosep50装置（Filtronから入手できる）で濃縮 した。Ｖｉ−ＮＨ2生成物の濃度は３．８mg/mlであり、２１ＮＨ2基／１００ｋ ＤａＶｉを有していた。 次に、このＶｉ−ＮＨ2生成物をジビニルスルホンで誘導体化した。０．７８m lの上記Ｖｉ−ＮＨ2生成物（３mgのＶｉ−ＮＨ2に相当する）を、ｐＨ約１０． ５で１００μｌの１Ｍ炭酸ナトリウムと混合した。その後、この溶液に５０μｌ のジビニルスルホンを加えた。溶液の色はわずかに黄色になった。アミンとジビ ニルスルホンとの反応の完全性を試験するためにＴＮＢＳアッセイを行なった。 このアッセイでは２分以内に陰性であることがわかり、ジビニルスルホンがすべ てのアミンと反応したことを示していた。 １．５時間後、５００μｌの１Ｍ ＮａＡｃ緩衝液を使用して溶液のｐＨを５ に低下させた。この溶液を一晩食塩水に対して透析し、１．５×１５cmのＰ６Ｄ Ｇカラムで脱塩し、食塩水で平衡化し、Centricon50装置（Amicon製）で濃縮し た。得られた生成物は、ビニルスルホンで誘導体化されたサルモネラ・ティフィ （Sa lmonella typhi）Ｖｉ抗原（Ｖｉ−Ｖｓ）である。Ｖｉ−Ｖｓの濃度は、３．１ mg/mlであった。 Ｖｉ−Ｖｓ物質とは別に、チオール化破傷風トキソイドを調製した。１８．６ mg/mlの濃度を有する０．３８mlの破傷風トキソイド（７mgの破傷風トキソイド に相当する）を、２００μｌのHEPES緩衝液（０．１５Ｍ）と混合して、ｐＨ７ ．３の溶液を得た。その後、４１μｌの０．１Ｍ ＳＰＤＰ（４０×モル過剰） を加えてチオール化を行なった。１時間後、適当量の１Ｍ ＮａＡｃ緩衝液を使 用してｐＨを５に下げた。１Ｍストック溶液からＤＴＴを加えて、反応混合物を ＤＴＴ中５０mMとした。２時間後、ＨＥ中でＰ６ＤＧカラム（BioRadから入手で きる）で脱塩し、次いでCentricon50装置（Amicon製）を使用して濃縮した。得 られたチオール化破傷風トキソイド（ＴＴ−ＳＨ）濃度は、9.8mg/mlであった。 チオール化破傷風トキソイド物質を、ジビニルスルホン誘導体化Ｖｉ抗原物質 と結合させた。この反応では、０．４mlのＶｉ−Ｖｓ溶液（１．２mgのＶｉ−Ｖ ｓに相当する）を、１２５μｌのＴＴ−ＳＨ溶液（１．２mgのＴＴ−ＳＨに相当 する）と混合した。さらに、１０μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡと５０μｌの０．５ Ｍ HEPESのみを加えた。結合反応は、ｐＨ８で１８時間進行させた。ＨＰＬＣ クロマトグラフデータに基づき、得られたＴＴ−ＳＨ−Ｖｓ−Ｖｉコンジュゲー トは、約０．４３mgＴＴ／mgＶｉ抗原を有すると推定された。 従って、この実施例は、チオール化破傷風トキソイド（すなわち、チオール基 で誘導体化した破傷風トキソイド）が、ジビニルスルホンを使用して誘導体化さ れたサルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）Ｖｉ抗原と反応して、臨床的に 関連するタンパク質／多糖コンジュゲートを調製できることを示す。 実施例VI この実施例では、破傷風トキソイドをビニルスルホン誘導体化Ｖｉ抗原に直接 結合して、臨床的に関連するタンパク質／多糖コンジュゲートを調製した。破傷 風タンパク質をトキソイド化し、従ってトキソイドは、直接結合に利用できる比 較的少ない遊離アミンを有していた。この処理は一般的に使用され、当業者に公 知である。従ってこの実施例は、結合前にチオール基でトキソイドを誘導体化す ることは、すべての場合に必要となる訳ではないことを示す。 Ｖｉ−Ｖｓ物質は、実施例Ｖに記載の方法で調製した。結合反応のために、０ ．３５mlのＶｉ−Ｖｓ（約０．８mgのＶｉ−Ｖｓに相当する）を、１８．６mg/m lの濃度を有する１１０μｌの破傷風トキソイド（２mgのＴＴに相当する）と混 合した。０．２５μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウムも加えて、得られる溶液のｐ Ｈを９．３とした。結合反応はこのｐＨで進行した。 図５は、コンジュゲート中のＶｉ抗原の量（mgＶｉ）に基づく破傷風トキソイ ドの量（mgＴＴ）の比を、結合反応時間（時間）の関数として示す。４０時間の 反応後（ｐＨ＝９．３）、約０．６mgＴＴ／mgＶｉの比が得られた。反応の関数 として作製されるコンジュゲート生成物の量の増加が、図５から明らかである。 ４０時間で、残存する溶液を、リン酸緩衝化生理食塩水で平衡化させたＳ４０ ０ＨＲカラムに通した。高分子量画分に対応するボイド容量画分をプールし、こ れを０．２μｍのMillex ＧＶフィルター（Milliporから入手できる）に通して 無菌ろ過した。得られた物質を、Coomassie Plus Protein Assay Reagentを使用 してタンパク質についてアッセイし、リゾルシノール／硫酸法を使用して多糖に ついてアッセイした。これらのアッセイにより、得られたコンジュゲートは０． ５８mg破傷風／mgＶｉを有することがわかった。顕著には、これらのアッセイで 得られた比率（０．５８mg／mg）は、ＨＰＬＣクロマトグラフから得られた上記 比率（０．６mg／mg）と非常によく一致する。 実施例VII この実施例では、毒素タンパク質をビニルスルホン誘導体化ナイセリアＰｓＣ （Neisseria PsC）に直接結合させて、臨床的に関連するタンパク質／多糖コン ジュゲートを調製した。ナイセリアＰｓＣ物質はSmithKline Beechamから入手し た。 第１の工程として、ナイセリアＰｓＣ物質をアジピックジヒドラジド（ＡＤＨ ）で誘導体化した。４．８mg/ml水の濃度を有するナイセリアＰｓＣ３mlを、１ ７１μｌの０．１Ｍスルホ−ＮＨＳ（水中）および０．５mlの１Ｍ ＭＥＳと混 合した。得られた溶液のｐＨは５．８であった。この溶液に、濃度が０．２５Ｍ になるまで固体ＡＤＨを加えた。次に、３５０μｌの０．５Ｍ ＥＤＣを加え、 反応を室温で４．５時間進行させた。 反応後、得られた混合物を食塩水で透析し、食塩水中でＰ６ＤＧカラムを用い て脱塩し、Centricon50装置（Amicon製）で０．７mlに濃縮した。得られたナイ セリアＰｓＣ−Ｈｚ物質（すなわち、ヒドラジド誘導体化ナイセリアＰｓＣ物質 ）は、１５．５mgナイセリアＰｓＣ−Ｈｚ／mlの濃度を有していた。また、誘導 体化したナイセリアＰｓＣ物質は４８ヒドラジド／１００ｋＤａ多糖を有するこ とが測定された。 次に、ヒドラジド誘導体化ナイセリアＰｓＣ物質を、ジビニルスルホンで誘導 体化した。１００μｌの０．５Ｍ HEPESのみ（ｐＨ＝８）と５０μｌのジビニ ルスルホンを、０．７mlのナイセリアＰｓＣ−Ｈｚ物質（濃度１５．５mg/ml） に加えた。２時間反応後、混合物を食塩水で一晩透析し、Ｐ６ＤＧカラムを用い て食塩水で脱塩し、その後、Centricon50装置（Amicon製）で４mg/mlに濃縮した 。得られた物質は、ビニルスルホン誘導体化ナイセリアＰｓＣ物質（すなわち、 ナイセリアＰｓＣ−Ｖｓ）であった。 次に、このナイセリアＰｓＣ−Ｖｓ物質を、以下の反応操作により破傷風トキ ソイドタンパク質と直接結合させた。１００μｌのナイセリアＰｓＣ−Ｖｓを、 ５４μｌの破傷風トキソイド（濃度１８．６mg/ml）と５０μｌの０．１Ｍホウ 酸ナトリウムと混合した。得られた溶液のｐＨは９．３であった。この反応によ りＴＴ−Ｖｓ−ナイセリアＰｓＣコンジュゲートが生成した。 ３分と２２時間の結合時間後にクロマトグラム（ＨＰＬＣ）を取った。図６（ ａ）は、３分後のクロマトグラムを示し、図６（ｂ）は２２時間後のクロマトグ ラムを示す。示したクロマトグラムにおける約６分で溶出する高分子量ピークの サイズの上昇から、ＴＴ−Ｖｓ−ナイセリアＰｓＣコンジュゲートの量の増加は 明らかである。図６（ｃ）は、この結合反応の反応速度論を示す。グラフに示す ように、約２０時間の反応後、得られたコンジュゲートは、０．５mgＴＴ／mgナ イセリアＰｓＣ以上であった。約８０時間の反応後、ほとんど１．２mgＴＴ／mg ナイセリアＰｓＣで比率は基本的に平坦化した。 この実施例では、ＨＰＬＣ対照試料を流して、高分子量ピークはＴＴ−Ｖｓ− ナイセリアＰｓＣコンジュゲートの生成に起因し、ビニルスルホン基が原因では ないことを証明した。対照として、ナイセリアＰｓＣ−Ｖｓ物質を、コンジュゲ ートの調製で使用したものと同じｐＨと濃度条件で、単独で、およびβ−メルカ プトエタノールとともにインキュベートした。得られたβ−メルカプトエタノー ル−ビニルスルホン−ナイセリアＰｓＣ生成物（ＭＥ−Ｖｓ−ナイセリアＰｓＣ ）から、ＨＰＬＣクロマトグラフィーを行なった。これらの対照ＨＰＬＣを図６ （ｄ）に、１８時間の反応後に作製されたＴＴ−Ｖｓ−ナイセリアＰｓＣコンジ ュゲート物質からのＨＰＬＣとともに示す。この図から明らかなように、混合物 中に破傷風トキソイドタンパク質が存在しない場合は、６分の溶出時間において ほとんど吸光度はなかった。すなわち、ビニルスルホンの集合は、高分子量ピー ク中の吸光度の供給源ではない。さらに、破傷風は、このｐＨでは自己重合しな かつた。すなわち、これらの試験は、ＴＴ−Ｖｓ−ナイセリアＰｓＣコンジュゲ ート物質の存在を証明する。 この実施例において上述した一般的方法を使用して、別のコンジュゲート調製 物を作製した。２１５μｌの破傷風トキソイド（濃度１８．６mgＴＴ／mlに基づ き４mgＴＴに相当する）と５０μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウムを、上述の方法 と同じ方法で調製した０．５mlのナイセリアＰｓＣ−Ｖｓ（２mg）に加えた。反 応溶液のｐＨは９．３であった。反応を２４時間進行し、コンジュゲートが生成 した。 実施例VIにおいて上述したものと同様の方法で、コンジュゲート溶液を、リン 酸緩衝化生理食塩水で平衡化させたＳ４００ＨＲカラムに通し、高分子量画分に 対応するボイド容量画分を得た。上述したタンパク質アッセイと多糖アッセイに より、単離されたコンジュゲート物質は０．４２mgＴＴ／mgナイセリアＰｓＣを 有していた。 実施例VIII 本実施例は、ヘテロ二官能性ビニルスルホンを使用してタンパク質／多糖コン ジュゲートを生成させるために、タンパク質を多糖に結合させる方法を記載する 。一般的反応操作は図７（ａ）〜７（ｄ）に示す。 モノマー性ＢＳＡなどのタンパク質を、ｐＨ７．３でＳＰＤＰを使用してチオ ール保護する。次にタンパク質上のチオールを、ｐＨ５で５０mM ＤＴＴを使用 して脱保護する。得られた物質を、ｐＨ５で平衡化させた直列につないだ２つの H iTrapカラムを使用して脱塩する。次に得られた物質を濃縮する。こうしてチオ −ル化タンパク質（タンパク質−ＳＨ）が生成する（図７（ａ）を参照）。 別の工程で、Leesら，Vaccine，(1996)、前述、に記載の方法により、ヘキサ ンジアミンとＣＤＡＰを使用して多糖（「Ｐｓ」、デキストランなど）を誘導体 化してＰｓ−ＮＨ2(すなわち、アミン誘導体を含む多糖)を作製する。図７（ｂ ）を参照されたい。図７（ｃ）に示すように、このＰｓ−ＮＨ2物質をｐＨ７． ３でヘテロ二官能性ＮＨＳ−ビニルスルホンと反応させる。適当なＮＨＳ−ビニ ルスルホンの例は上述したが、一般的には図７（ｃ）に示す。この一般的タイプ のヘテロ二官能性ＮＨＳ−ビニルスルホンは、上述したようにShearwater Polym ers，Inc.から入手できる。 得られた物質をｐＨ５で脱塩し、濃縮して図７（ｃ）に示す構造を有するＰｓ −ビニルスルホン物質を得る。 次にタンパク質−ＳＨとＰｓ−ビニルスルホンをｐＨ７．３で一緒に反応させ る。得られるのは、図７（ｄ）に示す一般式を有する結合したタンパク質と多糖 である。 実施例IX 別の代替プロセスとして、多糖をジビニルスルホン物質で誘導体化する代わり に、タンパク質分子をジビニルスルホン物質で誘導体化してもよい。 図８（ａ）〜８（ｃ）はこの手順を一般的に示す。まず、タンパク質（例えば 、ＢＳＡ）を、適当なＹ基（例えば、チオールまたはヒドラジド）を結合させて 官能基化する。ヒドラジド（Ｈｚ）を図８（ａ）のＹ基として使用する。次にこ の官能基化したタンパク質を、ｐＨ約５の過剰のジビニルスルホン物質（例えば 、ジビニルスルホン）と反応させる。この反応工程は、Ｙ基はジビニルスルホン 物質と反応するが、タンパク質上のアミンは反応しないように選択された比較的 低いｐＨで行う。こうして、ビニルスルホン誘導体化タンパク質物質（タンパク 質−Ｖｓ）が作製される。 次に、タンパク質−Ｖｓ物質を、ヒドラジド（または他の適当なＸ基）であら かじめ誘導体化した多糖と反応させて、コンジュゲートを形成させる。図８（ｃ ）を参照されたい。例示した反応プロセスでは、多糖は結合の前にＸ基で官能基 化される。この反応プロセスが進行するためには、Ｘ基は内因性タンパク質アミ ンより求核性（例えば、チオール基）であるか、またはより低いｐＨで内因性タ ンパク質アミンより反応性（例えば、ヒドラジド基）でなければならない。例示 された結合反応工程は、ｐＨ約５で進行する。 図８（ａ）〜８（ｃ）の一般的方法はまた、ヘテロ二官能性ビニルスルホン架 橋剤を使用するタンパク質の誘導体化を伴ってもよい。 実施例Ｘ この実施例では、臨床的に関連するタンパク質／多糖コンジュゲートを調製し た。該多糖は、ヘテロ二官能性ビニルスルホンを使用して誘導体化したＶｉ抗原 多糖である。該タンパク質は破傷風トキソイドである。以下に、反応手順を記載 する。 ４mlのＶｉ抗原多糖（濃度５mg/ml食塩水）を、ｐＨ５で０．８mlの１Ｍ １ −メチルイミダゾールと混合した。１９０mgのＡＤＨを加え、１Ｍ ＨＣｌを加 えて溶液のｐＨを５に調整した。その後、２０mgのＥＤＣを４回に分けて加えた 。 混合物を１時間反応させ、次いで食塩水中に透析した。得られた溶液の濃度は 、３．８mgＶｉ／mlと１１ヒドラジド／１００ｋＤａ Ｖｉ抗原であった。 次に、この官能基化したＶｉ物質をチオール化した。０．９mlのＶｉ溶液（濃 度３．８mg/mlを有する）を、１００μｌのＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ５を有する） と８０μｌの０．１Ｍ ＳＰＤＰと混合した。１時間の反応後、さらに３５μｌ の０．１Ｍ ＳＰＤＰを加えた。全体で２時間の反応後（すなわち、１時間後） 、さらに３５μｌの０．１Ｍ ＳＰＤＰを加えた。全体で３時間の反応後、反応 混合物がＤＴＴＣＰ０．５ＭになるまでＤＴＴを加えた。さらに２０分の反応後 、この混合物をＰ６Ｇカートリッジで脱塩し、ＮａＡｃ緩衝液で平衡化した。得 られたチオール化Ｖｉ抗原多糖溶液（「Ｖｉ−ＳＨ」）は１２７μＭ ＳＨであ り、０．５３mgＶｉ／mlと２４ＳＨ／１００ｋＤａ Ｖｉの濃度を有していた。 このＶｉ−ＳＨ物質（１．６mgに相当）３mlを、２２５μｌの０．１Ｍスクシ ニミジル４−ビニルスルホニル安息香酸（これは、アラバマ州ハンツビル（Hunt sville）のMolecular Biosciencesから入手できる）と混合した。このビニルス ルホン物質は、ヘテロ二官能性ビニルスルホン物質である。さらにこの溶液に２ ０ ０μｌの５×ＨＥ緩衝液（ｐＨ＝７．４）を加えた。２時間の反応後、得られた ビニルスルホン誘導体化Ｖｉ抗原（「Ｖｉ−Ｖｓ」）物質を脱塩し、Centricon5 0装置（Amicon製）で０．８mlに濃縮した。 破傷風トキソイド出発物質を別の操作でチオール化した。３１２μｌの破傷風 トキソイド（１６mg/mlの濃度を有し、約５mgのＴＴに相当する）を５０μｌの ５×ＨＥ緩衝液及び１３μｌの０．１Ｍ ＳＰＤＰと混合した。１時間後、１Ｍ ＭＥＳを使用して反応ｐＨを５．５に下げた。２２μｌの１Ｍ ＤＴＴを加え 、３０分後、溶液を脱塩した（ＭＥＳ中０．１ＭでｐＨ６．８で平衡化したＰ６ ＤＧカラム）。次に、この溶液をCentricon50装置（Amicon製）で１５０μｌに 濃縮した。得られた物質はチオール化破傷風トキソイド（「ＴＴ−ＳＨ」）であ った。チオールの存在を、ＤＴＮＢ試薬の添加に対する陽性反応で確認した。 １５０μｌのＴＴ−ＳＨを、上記で調製した０．８mlのＶｉ−Ｖｓおよび１０ ０μｌの０．５Ｍ HEPESのみ（ｐＨ＝８）と混合した。反応は１３日間進行さ せた。実施例VIに記載した方法で、Ｓ４００ＨＲカラム（１×５０cm）を用いて ボイド容量画分を集めた。実施例VIに記載した方法でタンパク質アッセイを行う と、得られるコンジュゲート物質は４１μｇＴＴ／mlを有していた。多糖アッセ イから、コンジュゲートは１６８μｇＶｉ／mlを有していた。これは、０．２４ mgＴＴ／mgＶｉに相当した。 すなわちこの実施例は、ヘテロ二官能性ビニルスルホンが、多糖を誘導体化し 、コンジュゲートを作製するのに使用できることを示す。 実施例XI 以下の実施例は、タンパク質と多糖のヘテロ二官能性ビニルスルホンによる誘 導体化を記載する。Lees，Vaccine、1996（前述）に記載の方法で、Ｐｎ１４多 糖をアミンで誘導体化した。得られたＰｎ１４−ＮＨ2物質は、９．９アミン／ １００ｋＤａ Ｐｎ１４を有することがわかった。 ビニルスルホン誘導体化Ｐｎ１４物質を、以下の方法でこのＰｎ１４−ＮＨ2 物質から作製した。０．５mlの食塩水中のＰｎ１４−ＮＨ2物質（濃度６mg/mlを 有する）を１００μｌの５×ＨＥ緩衝液（ｐＨ＝７．３）および２５μｌのＤＭ Ｆ中の０．１Ｍスクシニミジル４−ビニルスルホニル安息香酸と混合した。約２ 時 間の反応後、得られるビニルスルホン誘導体化Ｐｎ１４物質（「Ｐｎ１４−Ｖｓ 」）を、ＮａＡｃ緩衝液で平衡化した直列に並べた２つのＨｉｔｒａｐカラムで 脱塩した。 別の試料について、Ｐｎ１４−ＮＨ2物質をチオール化した（「Ｐｎ１４−Ｓ Ｈ」）。０．５mlのＰｎ１４−ＮＨ2物質（３mgのＰｎ１４−ＮＨ2に相当する） を１００μｌの５×ＨＥ緩衝液（ｐＨ＝７．３）および２５μｌの０．１Ｍ Ｓ ＰＤＰと混合した。２時間後、溶液のｐＨを５に下げ、次いでＤＴＴストック溶 液を加えてＤＴＴ中５０mMにした。２０分後、この混合物を、ＮａＡｃ緩衝液で 平衡化した直列に並べた２つのＨｉｔｒａｐカラムで脱塩した。得られた物質は Ｐｎ１４−ＳＨである。 チオール化ＢＳＡ（ＢＳＡ−ＳＨ）もまた別の試料として作製した。この物質 は、１５０μｌのＢＳＡモノマー（６６．５mg/mlの濃度を有し、１０mgＢＳＡ に相当する）を２００μｌのＨＥ緩衝液（ｐＨ＝７．３）および２２μｌの０． １Ｍ ＳＰＤＰ（１５倍モル過剰のＳＰＤＰに相当する）と混合することにより 、作製した。反応を２時間進行させ、次に反応溶液のｐＨを５に下げた。次にＤ ＴＴをストック溶液から加えて、溶液をＤＴＴ中５０mMにした。２０分後、この 物質を、ＮａＡｃ緩衝液で平衡化したＨｉｔｒａｐカラムで脱塩した。この物質 はＢＳＡ−ＳＨであった。 最後に、ビニルスルホン誘導体化ＢＳＡ（ＢＳＡ−Ｖｓ）物質も作製した。こ の物質は、１５０μｌのＢＳＡモノマー（濃度６６．５mg/mlを有する）に２０ ０μｌのＨＥおよび２２μｌのＤＭＦ中の０．１Ｍ スクシニミジル４−ビニル スルホニル安息香酸と混合することにより、作製した。２時間後、混合物を、Ｎ ａＡｃ緩衝液で平衡化した直列に並べた２つのＨｉｔｒａｐカラムで脱塩した。 こうしてＢＳＡ−Ｖｓ物質を調製した。 ＢＳＡ物質をCentricon30装置で濃縮し、Ｐｎ１４物質をCentricon50装置で濃 縮した。以下の表は試料に関連する情報を示す。 結合反応は、表６の成分を使用して室温で混合しながら一晩進行させた。さら に、同じ反応条件下で、適当な対照試料を作製した。以下に、調製した種々の物 質を示す。 １つの結合反応については、２４０μｌのＰｎ１４−ＳＨを１００μｌのＢＳ Ａ−Ｖｓおよび５０μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．３）と混合した 。得られたコンジュゲートはＢＳＡ−Ｖｓ−ＳＨ−Ｐｎ１４である。コンジュゲ ートのＨＰＬＣクロマトグラムを図９（ａ）に示す。 第２の結合反応については、４００μｌのＰｎ１４−Ｖｓを１５０μｌのＢＳ Ａ−ＳＨおよび５０μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．３）と混合した 。得られたコンジュゲートはＢＳＡ−ＳＨ−Ｖｓ−Ｐｎ１４である。コンジュゲ ートのＨＰＬＣクロマトグラムを図９（ｄ）に示す。コンジュゲートがゲル化し たため、このクロマトグラムは、完全な結合の程度を示さない。しかし、混合物 がゲル化したため、これはコンジュゲートが生成したことを示す。 １つの対照として、１５０μｌのＢＳＡ−Ｖｓを５０μｌの０．１Ｍホウ酸ナ トリウムと混合した。この対照のＨＰＬＣクロマトグラムは、図９（ｂ）に示す 。第２の対照として、１３０μｌのＢＳＡ−ＳＨを５０μｌの０．１Ｍホウ酸ナ トリウム（ｐＨ＝９．３）と混合した。この対照のＨＰＬＣクロマトグラムは、 図９（ｃ）に示す。 両方のコンジュゲート反応溶液とも、約７分の溶出時間で始まる高分子量コン ジュゲートピーク（それぞれ、２２．０％と２２．８％）から証明されるように 、ＨＰＬＣでコンジュゲート形成を示した（図９（ａ）および９（ｄ）を参照） 。一方、対照は、コンジュゲートピークに対応する領域にほとんどまたは全く吸 収を示さなかった。ＢＳＡ−Ｖｓ対照（図９（ｂ））は、ＢＳＡ−Ｖｓのわずか な２量体化を示した。 従ってこれらの試料は、タンパク質または多糖の誘導体化に、ヘテロ二官能性 ビニルスルホン物質を使用できることを示す。次に、誘導体化物質を使用してタ ンパク質／多糖コンジュゲートを作製することができる。 実施例XII 以下の実施例は、ジビニルスルホンをスペーサーとして使用するときの、求核 物質のタイプに依存する、ビニルスルホン誘導体化反応のｐＨ選択性を例示する 上記実施例に記載の基本的な誘導体化反応操作に従つて、デキストランーアミ ン（Ｄｅｘ−ＮＨ2）およびデキストラン−ヒドラジド（Ｄｅｘ−Ｈｚ）を調製 した。Ｄｅｘ−ＮＨ2物質は、濃度３０mg/mlと２８ＮＨ2／１００ｋＤａデキス トランを有していた。Ｄｅｘ−Ｈｚ物質は、濃度６．４mg/mlと１６Ｈｚ／１０ ０ｋＤａデキストランを有していた。 以下の混合物は、これらのデキストラン物質をジビニルスルホンで誘導体化し てＤｅｘ−Ｖｓを作製するために調製した： Ａ−０．５mlのＤｅｘ−ＮＨ2、１００μｌの０．５Ｍ HEPESのみ（ｐＨ＝８） および５０μｌのジビニルスルホン； Ｂ−０．５mlのＤｅｘ−ＮＨ2、１００μｌの１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ＝６）および ５０μｌのジビニルスルホン； Ｃ−１mlのＤｅｘ−Ｈｚ、１００μｌの０．５Ｍ HEPESのみ（ｐＨ＝８）およ び１００μｌのジビニルスルホン；そして Ｄ−１mlのＤｅｘ−Ｈｚ、１００μｌの１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ＝６）および１００ μｌのジビニルスルホン。 それぞれの場合において、反応は一晩進行させた。反応後、物質を、食塩水で 平衡化したＰ６ＤＧカラム（１．５×１０cm）で脱塩した。得られた各溶液中の デキストラン濃度は、約１．３mgｄｅｘ／ml溶液であった。 チオール化ＢＳＡ物質（ＢＳＡ−ＳＨ）を別の反応操作で調製した。約６６． ５mg/mlの濃度を有する３７６μｌのＢＳＡモノマーを６００μｌのＨＥ緩衝液 および９２μｌの０．２Ｍ ＳＰＤＰと混合した。１時間後、３００μｌの１Ｍ ＮａＡｃ緩衝液を使用して、ｐＨを５に下げた。１０mgのＤＴＴを加えた。１ 時間後、混合物を、食塩水で平衡化したＰ６ＤＧカラム（１．５×１０cm）で脱 塩し た。得られたＢＳＡ−ＳＨ物質をプールし、この溶液は濃度３．８mgＢＳＡ／ml を有し、１．３５mMＳＨであった。これは、２４ＳＨ基／ＢＳＡに相当する。 上記で作製した１mgの各Ｄｅｘ−Ｖｓ物質を、別々に６６０μｌのＢＳＡ−Ｓ Ｈ（２．５mgのＢＳＡ−ＳＨに相当する）、１００μｌの０．５Ｍ ＨＥのみ（ ｐＨ＝８）および１０μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡと混合した。３日間の反応後、 得られた反応混合物をＨＰＬＣに供した。以下の表７に、結合反応操作の結果を まとめる。 このデータは、Ｄｅｘ−Ｈｚが、ｐＨ８または６でビニルスルホンで同等に官 能基化されたことを示す。Ｄｅｘ−ＨｚベースのＤｅｘ−Ｖｓ物質を使用して適 当なコンジュゲート生成物を得た（表７のＣとＤを参照）。一方、Ｄｅｘ−ＮＨ2 は、ｐＨ８でのみ官能基化された。デキストランＡ（ｐＨ８で調製）から適当 なコンジュゲートが生成されたが、デキストランＢ（ｐＨ６で調製）からは生成 しなかった。このデータは、アミンとヒドラジドのｐＫａに一致する。すなわち 、データに示すように、ジビニルスルホンを使用する誘導体化は、誘導体化され る分子上に存在する求核物質と誘導体化反応のｐＨに依存する。多糖とタンパク質の直接誘導体化 多糖はペンダントビニルスルホンで誘導体化でき、これらの誘導体化多糖は、 誘導体化または非誘導体化タンパク質に結合することができる。同様に、タンパ ク質はペンダントビニルスルホンで誘導体化でき、誘導体化または非誘導体化多 糖に結合することができる。タンパク質または多糖の直接誘導体化は、比較的穏 和な条件下で起こすことができる。ペンダントビニルスルホンを使用する直接結 合は、未使用のおよび／または未反応のタンパク質または多糖出発物質の回収を 可能にするため、有利である。 実施例XIII この実施例は、多糖物質は、穏和な反応条件下でペンダントビニルスルホン物 質で直接誘導体化できることを示す。次にこの誘導体化多糖物質は、直接タンパ ク質に結合される。 このプロセスにおいて、デキストランはモデル多糖として使用され、ＢＳＡは モデルタンパク質として使用される。食塩水中０．５mlのデキストラン（濃度１ ２mg/mlを有する）を、ｐＨ１０．３の炭酸ナトリウム１００μｌと混合した。 ５０μ１ｌのジビニルスルホンを、ボルテックス混合しながら溶液に加えた。溶 液はピンク／茶色になった。１時間の反応後、７５０μｌの１Ｍ ＮａＡｃ緩衝 液（ｐＨ５）の添加によりｐＨを約５に下げた。この溶液を、食塩水で平衡化し た直列に連結した２つのＨｉｔｒａｐカラムで脱塩した。ビニルスルホン誘導体 化デキストラン物質（Ｄｅｘ−Ｖｓ）の濃度は２．２mg/mlであると測定された 。 結合反応のために、０．５mlのＤｅｘ−Ｖｓ物質を３０μｌのＢＳＡモノマー （食塩水中、濃度６６．５mg/mlを有する）と混合した。５０μｌの０．１Ｍホ ウ酸ナトリウムを加え、得られた溶液のｐＨは９．３であった。 対照物質として、上記結合反応のＢＳＡの代わりに３０μｌの食塩水を使用し た。 結合反応と対照混合物をＨＰＬＣで追跡した。２０時間後、約０．４３mgＢＳ Ａ／mgデキストランの比が得られた（ＨＭＷピーク面積の％を使用し、対照ピー ク面積を使用して補正した）。ＨＰＬＣを図１０（ａ）に示す。２０時間目に、 コンジュゲート生成物は約２３．８％のピークを有し、対照溶液は、約３％に相 当するピークを有した。対照は、高分子量ピークにおいて少量の吸光度における 増加も示さなかった。 図１０（ｂ）は、結合反応の一般的速度論を示す。mgＢＳＡ/mgｄｅｘの比率 の増加は、この図から明らかである。 この実施例は、穏やかな反応条件により、可溶性多糖がジビニルスルホンで直 接官能基化可能であり、直接タンパク質を結合するのに使用できるできることを 示す。 実施例XIV いくつかの臨床的に関連するコンジュゲートからの免疫原性データが得られた 。実施例VIIのコンジュゲートについて、Ｂａｌｂ／ｃマウス群を、２．５μｇ のナイセリアＰｓＣで皮下に、単独（対照試料として）またはコンジュゲートと して免疫した。１４日目に同じ量の同じ抗原でマウスを追加免疫し、１４日後に 放血させた。血清をＥＬＩＳＡにより抗ＰｓＣ ＩｇＧ抗体についてカットオフ ０．１ＯＤでアッセイした。抗血清の生物学的活性（すなわち、防御する能力） を、殺菌活性を使用してアッセイした。以下の試験結果が得られた： ＊ Wong，K.H.ら，journal of Biological Standards，Vol．5（1977）(page 197から開始、この論文は参考のためその全体が本明細書に組み込まれる)に記載 のように行なった。 このデータから、実施例VIIで作製したコンジュゲートは良好な抗体応答（殺 菌性、例えば防御性である高度に機能的な抗体応答を含む）を示すことが明らか である。 実施例XV また、実施例ＶとVIのコンジュゲートの免疫原性も測定した。５匹のＢａｌｂ ／ｃマウスの群を、記載の量のＶｉで単独（対照試料として）またはコンジュゲ ートとして皮下免疫した。１４日目に同じ量の同じ抗原でマウスを追加免疫し、 １４日後に放血させた。血清をＥＬＩＳＡにより抗Ｖｉ ＩｇＧ抗体についてカ ットオフ０．１ＯＤでアッセイした。以下の試験結果が得られた： このデータから明らかなように、本発明に従って作製したコンジュゲートは、 両方の投与量で良好な抗Ｖｉ応答を与えた。コンジュゲートワクチンおよび免疫学的試薬に関する情報 本発明はさらに、本発明に従って作製したコンジュゲートから調製できるワク チンおよび他の免疫学的試薬に関する。例えば、ワクチンまたは他の免疫学的試 薬を作製するために、本発明の方法により作製したコンジュゲートは、当業者に 公知の通常の技術により、薬剤学的に許容される媒体または送達ビヒクルと組合 せられる。そのようなワクチンまたは免疫学的試薬は、患者への正しい投与のた めの型を与えるための適当量のビヒクルとともに、治療上有効な量の本発明のコ ンジュゲートを含有するであろう。これらのワクチンは、ミョウバンその他のア ジュバントを含んでいてもよい。 薬剤学的に許容される媒体またはビヒクルの例としては、例えば、無菌の液体 、例えば水や油（石油、動物起源、植物起源、または合成起源のもの、例えば、 ピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など）がある。医薬組成物が静脈内に投与 される場合には、食塩水が好適なビヒクルである。デキストロースおよびグリセ ロールの水溶液は、液体ビヒクル（特に注射溶液）として使用することができる 。適当な薬剤学的ビヒクルは、当該分野で公知であり、例えば、E.W．Martin，R emington's Pharmaceutical Sciences（これは、参考のため本明細書に組み込ま れる）に記載されている。 本発明はまた、免疫剌激量のワクチンを投与することによる患者の治療に関す る。「患者」という用語は、治療が有効である任意の被験体を意味し、特にヒト 、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、イヌ、およびネコ、ならびに他の動物（例 えば、ニワトリ）などの哺乳動物を含む。「免疫刺激量」という用語は、疾患の 予防、緩和、または治療のために患者の免疫応答を刺激することができるワクチ ンの量を意味する。本発明のワクチンは、任意の適当な経路で投与されるが、好 ましくは静脈内、筋肉内、鼻内、または皮下注射により投与される。 さらに、本発明のワクチンおよび免疫学的試薬は、任意の適当な目的（例えば 、治療用、予防用、または診断用）のために投与することができる。 本発明の説明において、本出願人は、本発明が機能する方法と理由を開示する 目的で、いくつかの理論を記載した。これらの理論は、情報目的のみで示されて いる。本出願人は、特定の化学的または物理的機序または理論に拘泥されるつも りはない。 本発明を種々の好適な実施態様および具体例に関して説明したが、当業者は、 請求の範囲に記載の本発明の精神と範囲を逸脱することなく、種々の変更および 修飾が可能であることは理解されるであろう。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．アミン基、チオール基、およびヒドラジド基から成る群より選ばれたメンバ ーである少なくとも１つの官能基を多糖に付与する試薬と多糖を反応させ、 該官能基を含む多糖をホモ二官能性またはヘテロ二官能性のビニルスルホン と反応させてビニルスルホン誘導体化多糖を形成し、 該ビニルスルホン誘導体化多糖を、タンパク質、ペプチド、およびハプテン から成る群より選ばれた反応物質と反応させてコンジュゲートを形成する、 ことを含んでなるコンジュゲートの形成方法。 ２．前記反応物質がタンパク質である請求項１記載の方法。 ３．前記ビニルスルホン誘導体化多糖を前記反応物質と反応させる工程の前に、 チオール基およびヒドラジド基から成る群より選ばれたメンバーを用いて前記 反応物質を誘導体化する工程を更に含む請求項２記載の方法。 ４．前記ビニルスルホンがジビニルスルホン物質である請求項１記載の方法。 ５．前記ジビニルスルホン物質がジビニルスルホンである請求項４記載の方法。 ６．請求項１記載の方法により形成されたコンジュゲート。 ７．請求項２記載の方法により形成されたタンパク質／多糖コンジュゲート。 ８．請求項１記載の方法により形成されたコンジュゲートワクチンまたは免疫試 薬。 ９．請求項２記載の方法により形成されたコンジュゲートワクチンまたは免疫試 薬。 １０．チオール基およびヒドラジド基から成る群より選ばれたメンバーである少 なくとも1つの官能基を反応物質に付与する試薬と、タンパク質、ペプチド、 およびハプテンから成る群より選ばれた反応物質を反応させ、 該官能基を含む反応物質をホモ二官能性またはヘテロ二官能性のビニルスル ホンと反応させてビニルスルホン誘導体化反応物質を形成し、 該ビニルスルホン誘導体化反応物質を多糖と反応させてコンジュゲートを形 成する、 ことを含んでなるコンジュゲートの形成方法。 １１．前記ビニルスルホン誘導体化反応物質を前記多糖と反応させる工程の前に 、アミン基、チオール基、およびヒドラジド基から成る群より選ばれたメンバ ーを用いて前記多糖を誘導体化する工程を更に含む請求項１０記載の方法。 １２．前記ビニルスルホンがジビニルスルホン物質である請求項１０記載の方法 。 １３．前記ジビニルスルホン物質がジビニルスルホンである請求項１２記載の方 法。 １４．前記反応物質がタンパク質である請求項１０記載の方法。 １５．請求項１０記載の方法により形成されたコンジュゲート。 １６．請求項１４記載の方法により形成されたタンパク質／多糖コンジュゲート 。 １７．請求項１０記載の方法により形成されたコンジュゲートワクチンまたは免 疫試薬。 １８．請求項１４記載の方法により形成されたコンジュゲートワクチンまたは免 疫試薬。 １９．多糖をホモ二官能性ビニルスルホンまたはヘテロ二官能性ビニルスルホン と反応させてビニルスルホン誘導体化多糖を形成し、 タンパク質、ペプチド、およびハプテンから成る群より選ばれた反応物質を 求核性基含有化合物と反応させて誘導体化された物質を形成し、それにより該 誘導体化された物質が該ビニルスルホン誘導体化多糖から分離された状態で保 持されるようになし、 該ビニルスルホン誘導体化多糖を該誘導体化された物質と反応させてコンジ ュゲートを形成する、 ことを含んでなるコンジュゲートの形成方法。 ２０．前記ビニルスルホンがジビニルスルホン物質である請求項１９記載の方法 。 ２１．前記ジビニルスルホン物質がジビニルスルホンである請求項２０記載の方 法。 ２２．前記反応物質がタンパク質である請求項１９記載の方法。 ２３．請求項１９記載の方法により形成されたコンジュゲート。 ２４．請求項２２記載の方法により形成されたタンパク質／多糖コンジュゲート 。 ２５．請求項１９記載の方法により形成されたコンジュゲートワクチンまたは免 疫試薬。 ２６．請求項２２記載の方法により形成されたコンジュゲートワクチンまたは免 疫試薬。 ２７．タンパク質、ペプチド、およびハプテンから成る群より選ばれた反応物質 を、ホモ二官能性ビニルスルホンまたはヘテロ二官能性ビニルスルホンと反応 させてビニルスルホン誘導体化物質を形成し、 多糖を求核性基含有化合物と反応させて誘導体化多糖を形成し、それにより 該誘導体化多糖が該ビニルスルホン誘導体化物質から分離された状態で保持さ れるようになし、 該ビニルスルホン誘導体化物質を該誘導体化多糖と反応させてコンジュゲー トを形成する、 ことを含んでなるコンジュゲートの形成方法。 ２８．前記ビニルスルホンがジビニルスルホン物質である請求項２７記載の方法 。 ２９．前記ジビニルスルホン物質がジビニルスルホンである請求項２８記載の方 法。 ３０．前記反応物質がタンパク質である請求項２７記載の方法。 ３１．請求項２７記載の方法により形成されたコンジュゲート。 ３２．請求項３０記載の方法により形成されたタンパク質／多糖コンジュゲート 。 ３３．請求項２７記載の方法により形成されたコンジュゲートワクチンまたは免 疫試薬。 ３４．請求項３０記載の方法により形成されたコンジュゲートワクチンまたは免 疫試薬。 ３５．ビニルスルホン基を用いて多糖を誘導体化してビニルスルホン誘導体化多 糖を形成し、 該ビニルスルホン誘導体化多糖を、タンパク質、ペプチド、またはハプテン から成る群より選ばれた反応物質と反応させてコンジュゲートを形成する、 ことを含んでなるコンジュゲートの形成方法。 ３６．前記反応物質がタンパク質である請求項３５記載の方法。 ３７．請求項３５記載の方法により形成されたコンジュゲート。 ３８．請求項３６記載の方法により形成されたコンジュゲート。 ３９．ビニルスルホン基を用いてタンパク質、ペプチド、およびハプテンから成 る群より選ばれた反応物質を誘導体化してビニルスルホン誘導体化物質を形成 し、 該ビニルスルホン誘導体化物質を多糖と反応させてコンジュゲートを形成す る、 ことを含んでなるコンジュゲートの形成方法。 ４０．前記反応物質がタンパク質である請求項３９記載の方法。 ４１．請求項３９記載の方法により形成されたコンジュゲート。 ４２．請求項４０記載の方法により形成されたコンジュゲート。
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