JP2000512131A

JP2000512131A - プリオン蛋白結合蛋白およびその使用法

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Publication number: JP2000512131A
Application number: JP09541946A
Authority: JP
Inventors: ネイルアールキャッシュマン; ヴィンセントドデレット
Original assignee: マクギルユニバーシティー
Priority date: 1996-05-29
Filing date: 1997-05-29
Publication date: 2000-09-19
Also published as: WO1997045746A2; EP0920630B1; BR9709900A; WO1997045746A3; DE69714451D1; AU3186397A; EP0920630A2; CA2256312A1; ATE221663T1; DE69714451T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、プリオン蛋白結合蛋白（ＰｒＰＢＰｓ）及びそれを用いた診断、治療及び除去方法を特徴とする。本発明はＰｒＰＢＰの単離のための融合蛋白試薬を特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】プリオン蛋白結合蛋白およびその使用法発明の背景本発明は、プリオン蛋白結合蛋白、核酸、およびその使用法に関する。プリオン疾患は、急性進行性で致死的かつ治療不能な神経変性症候群である。ヒトのプリオン疾患には、偶然汚染された非経口治療物質（死体から抽出される下垂体ホルモン等）および移植された組織（角膜や硬膜移植片等）を介して伝染されうるクロイツフェルト−ヤーコプ病（ＣＪＤ）がある。現在までに、カナダ赤十字は、後にＣＪＤを発病したドナーや、家族にＣＪＤ患者のいるドナーによる汚染の危険性があるとして、１２００万ドルを越える血液製剤をカナダ市場から回収している。また北米では、英国のウシ海綿状脳症と同じく、ヒツジおよびヤギのスクレイピーが一般的かつ経済的に重要なプリオン関連疾患である。ウシ海綿状脳症はまた、人間の牛肉消費およびこれらの種からの生物学的産生品の調製に対して、健康および経済の面で大きな意味をもつ。プリオン疾患の病理学的特徴は、海綿状の変化（つまり通常は灰白質において主に発生する脳の微細空洞化）、ニューロン細胞の損失、ニューロン細胞の損失とは比例しない星状細胞の増殖、および時には脳の個別プラーク中の異常アミロイド形成蛋白の蓄積である。プリオン疾患における神経変性は、アルツハイマー症、筋萎縮側索硬化症、およびパーキンソン症等の他のより一般的な神経変性症候群と同じある基本的メカニズムをもつ可能性がある。これらの疾患を伝染させる物質は、感染物質中で核酸成分の化学的または物理的証拠が複製可能に検出されていないため、ウイルスおよびウイロイドとは大きく異なる（Prusiner，Science 216:136-144，1982）。プロテイナーゼＫ消化を利用したスクレイピー物質の精製方法により、スクレイピーに冒されたハムスターの脳中にＰｒＰ２７−３０と呼ばれる２７−３０ｋＤ耐プロテアーゼ蛋白が発見された（Bolton et al.，Science 218:1309-1311，1982）。ＰｒＰ２７−３０はスクレイピー物質の活性とともに精製され、その後、伝達可能物質の主たる（または唯一の）高分子であることが示された（McKinley et al.，Cell 35:57- 62，1983）。ＰｒＰ２７−３０は後に、やはり疾患を伝染しうるスクレイピー物質蛋白（ＰｒＰ^SCと呼ばれる）の３３−３７ｋＤ完全形の蛋白分解消化産生物であると判断された。ＰｒＰ２７−３０のアミノ酸配列の一部を決定し、ｃＤＮＡをクローニングすると、この蛋白をコードする遺伝子は宿主に由来することがわかった(Oesch et al.，Cell 40:735-746，1985)。この細胞蛋白は正常な脳から単離され、ＰｒＰ^S ^C と異なりプロテアーゼに感受性であり、スクレイピー疾患を発生する活性とは無関係である（Bendheim et al.，Ciba Found．Symp．164-177，1988）。感染粒子関連のＰｒＰ^SCは、正常細胞の前駆体ＰｒＰ^Cに由来すると仮定される（Prusi ner，Science 252:1515-1522，1991）。近年、ＰｒＰ^CからＰｒＰ^SCへの無細胞ＰｒＰ^SCを触媒とした転化が報告されている（Kocisko et al.，Nature 370:471 -473，1994）。プロテアーゼ感応性の正常細胞アイソフォームであるＰｒＰ^Cは、進化過程で保存されてきた未知の機能をもつ膜蛋白である。近年、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合された蛋白であるＰｒＰ^Cが、コンカバナリンＡ刺激（stimulation）によってＴ細胞の活性化を修飾することが示されており（Cashman et al.，Cell 61:185-182，1990）、この蛋白の重要な機能上の役割を示唆している。種と種との間のプリオン疾患の伝染は、主にＰｒＰアミノ酸配列によって決定される「種のバリア」によって制限される。さらに、最近の形質転換（トランスジェニック）実験でも、やはりプリオン物質の形成に参画する、ＰｒＰとは異なる種特異的な高分子の役割を示唆している。プリオン疾患をもつヒトの脳抽出物を接種した、高レベルのヒトキメラＰｒＰ^Cを発現しているトランスジェニックマウスは、ヒトプリオンに耐性があった。ヒトプリオンに感染するのは、マウスのＰｒＰ遺伝子を切除した場合、またはヒト−マウスキメラプリオン遺伝子が発現した場合のみであった。これらの発見は、ヒトよりもマウスプリオン蛋白に対する親和性が高い種特異的な結合蛋白が存在する可能性を示唆している（Tellin g et al.，Cell 83:79-90，1995）。現在のところ、感度の高い診断テストは市場にでておらず、またヒトプリオン疾患の治療法もない。発明の概要本発明は、全般的には実質的に純粋なプリオン蛋白結合蛋白（ＰｒＰＢＰｓ）に関する。これら蛋白は、飽和可能なもしくは置換可能な形式でプリオン蛋白（ＰｒＰ）に結合するという特徴を有している。好ましくは、この結合は高い親和性を有し、その結果、適切な機能的な兆候を生じさせる。この適切な機能的兆候の例としては、細胞増殖の阻止又は細胞死のレベルの上昇などである。以下に、二つのＰｒＰＢＰｓについて述べる。これら蛋白はマウス細胞から単離されたものであり、細胞表面蛋白である。これらＰｒＰＢＰｓをコードする遺伝子のクローニング及び特徴決定について本明細書において述べる。他の好ましいＰｒＰＢＰｓは、哺乳動物、特にヒトや家畜又はペットなどの種類に由来することが好ましいように思われるが、これに限られず、いかなる生物から由来する細胞又は組織サンプルより単離されたものでもよい。また本発明は、ＰｒＰＢＰｓをコードする精製された核酸、ベクター、及びこれら核酸を含む細胞、ＰｒＰＢＰｓに対して特異的に結合する抗体及び組換えＰｒＰＢＰを生産する方法をも含む。この方法は、ＰｒＰＢＰをコードするＤＮＡを用いて細胞を形質転換して細胞内で発現するような位置に組み込み、そして、形質転換した細胞をＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、最終的に組換えＰｒＰＢＰを回収する。これらＰｒＰＢＰｓはプリオン関連疾患と同様に非プリオン関連疾患の治療、検出にも有用である。この非プリオン関連疾患は、例えば、例えば筋ジストロフィや異常な細胞増殖または異常な細胞死に関連した疾患で見られるような種々の変異性症候群などである。これらＰｒＰＢＰｓはプリオンを含むことが明らかな場合又は予想されるサンプルからプリオンを取り除くためにも役立つ。本発明の他の側面としては、ＰｒＰ部分とアルカリフォスファターゼ部分とを含む融合蛋白質を包含している。好ましくは、この蛋白はＰｒＰドメインの内、結合活性と機能活性とをそのまま維持している。これらＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白は、細胞、組織、体液、他の生物学的サンプル中のＰｒＰＢＰｓ又はＰｒＰ^SCなどのラベリング、検出又は同定のための有用な親和性試薬となり得る。さらに、ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白は細胞サンプル中のＰｒＰＢＰ蛋白の同定及びアフィニティ精製を行う際にも、また、ＰｒＰＢＰ蛋白をコードする配列のクローニングにも有効である。本発明に従った一つの特定の方法としては、細胞表面にＰｒＰＢＰｓの発現が最も少ないというバックグラウンドを有するカエルの卵母細胞を用いた方法である。この方法は、前記卵母細胞に、ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白に関連するｃＤＮＡライブラリの集合又は単離クローン由来のインビトロで転写されたｍＲＮＡを注入する。そして、ＰｒＰ−ＡＰが結合し得る蛋白を発現している細胞を同定し、これによってＰｒＰＢＰをコードするｃＤＮＡクローンの大まかな同定が可能となる。最終的にこれら細胞からｃＤＮＡを精製して、ＰｒＰＢＰをコードする配列が回収されることになる。また、本発明に関連する側面としては、生物学的サンプル中のＰｒＰ^SCを検出する方法及びキットに関する。好ましい形態としては、この方法は次の工程から構成される。すなわち、（ａ）生物学的なサンプル中のＰｒＰ^Cを破壊する（この破壊する方法としては、例えば蛋白溶解性の変性を用いることができる）。次に（ｂ）この生物学的サンプルをＰｒＰＢＰと接触させる。そして最終的に（ｃ）生物学的サンプル中におけるＰｒＰＢＰとＰｒＰ^SCとの間で形成される複合体を検出する。この複合体形成の検出は生物学的サンプル中にＰｒＰ^SCが存在していることを示す。この検出解析に使用されるＰｒＰＢＰは、融合蛋白（例えばＰｒＰＢＰ−ＡＰ）、又はＰｒＰ^SCと結合し得るＰｒＰＢＰフラグメント又はそのアナログである。好ましい形態においては、複合体形成は直接標識されたＰｒＰＢＰ（又はそのフラグメント、又はそのアナログ）を用いることによって検出される。他の好ましい形態としては、複合体形成は、例えばＰｒＰＢＰ（又はフラグメント、又はそのアナログ）に対する抗体を用いることによって間接的に検出される。さらに他の好ましい形態としては、ＰｒＰ^SCの検出はＰｒＰＢＰ：ＰｒＰ^SC複合体中における標識されたＰｒＰ^SCが生物学的サンプル中に存在する非標識ＰｒＰ^SCに置換される量を測定することによって検出される。本発明のもう一つの関連する側面としては、生物学的サンプルからＰｒＰ^SCを取り除くための方法及びキットに関する。好ましい形態としては、この方法は次の工程から構成される。（ａ）ＰｒＰＢＰ（又はそのフラグメント、又はそのアナログ）又はＰｒＰＢＰ融合蛋白と生物学的サンプルを十分な時間処理する。そして、この処理により、ＰｒＰＢＰ：ＰｒＰ^SC複合体を形成させる。（ｂ）生物学的サンプルからＰｒＰＢＰ：ＰｒＰ^SC複合体を回収する。こうした除去方法においては、生物学的サンプル（例えば、移植用に調整された細胞又は臓器など）にＰｒＰＢＰ（又はフラグメント又はそのアナログ）を混合して、ＰｒＰ^SCを回収し又はＰｒＰ^SCを不活性化をする。他の形態としては、ＰｒＰＢＰ（又はフラグメント又はそのアナログ）に結合したＰｒＰ^SCは抗ＰｒＰ抗体によって検出してもよい。ＰｒＰ^SCに結合するＰｒＰＢＰｓは、診断又は他の解析においてＰｒＰ^SCの定量を行う際に用いることもできる。仮に、得られたＰｒＰＢＰがＰｒＰ^SCに対して結合せず、その代わりにＰｒＰ^C にのみ結合する場合には、そのようなＰｒＰＢＰは、ＰｒＰ^SCとＰｒＰ^Cとの双方を含むサンプルからＰｒＰ^Cを取り除くために用いることができる。その後、ＰｒＰ^SC、ＰｒＰ^C双方に結合し得る抗体を用いれば、サンプル中に残存するＰｒＰ^SCを検出することができる。本発明のさらにもう一つの関連する側面としては、動物（例えば、ヒト）におけるプリオン疾患の治療又は予防方法に関する。好ましい形態としては、この方法はＰｒＰＢＰ：ＰｒＰ^SC複合体形成を拮抗する物質、ＰｒＰ^CからＰｒＰ^SCへの転換を阻止する物質、又はＰｒＰＢＰ−ＰｒＰ^SC複合体に起因した生物学的活性を抑制する物質を治療に効果的な量において動物に投与することを含む。さらに好ましいもう一つの形態は、この方法はＰｒＰ^CからＰｒＰ^SCへの転換を拮抗する物質を治療に効果的な量において動物に投与する方法を含む。もう一つの治療アプローチとしては、本発明は、動物におけるＰｒＰＢＰ：ＰｒＰ^SC複合体に起因した生物学的活性を抑制する方法が含まれる。好ましい形態としては、この方法は、物質（例えば、ＰｒＰＢＰに対する抗体、ＰｒＰＢＰ、又はこれらのフラグメント又はそのアナログ）を動物に投与してＰｒＰＢＰ：ＰｒＰ^SC複合体相互作用を阻害することが含まれる。さらに、ＰｒＰＢＰｓを用いた処置は、生体内における細胞毒性を有するシグナルの発生を阻止してＰｒＰ^C とＰｒＰ^SCとの相互作用を防止する。本発明のもう一つの側面は、ＰｒＰＢＰ（又はフラグメント又はそのアナログ）とＰｒＰとの結合相互作用を低下させるための物質を同定する方法に関する。好ましい形態としては、本発明は次の工程から構成される。すなわち、（ａ）ＰｒＰＢＰとＰｒＰとを試験物質と混合する。（ｂ）試験物質の存在下におけるＰｒＰＢＰのＰｒＰに対する結合量を測定する。そして（ｃ）コントロールサンプルと比較して、試験物質がＰｒＰＢＰのＰｒＰに対する結合能を低下させるかどうかを同定する。もう一つの治療的なアプローチでは、本発明は機能的に活性化されたＰｒＰＢＰを抑制することにより神経変性症候群を治療する方法に関する。好ましい形態としては、この方法は、物質、例えば小さな分子のアンタゴニスト又はアゴニスト、ＰｒＰＢＰｓ由来の細胞内シグナルの生成を阻止又は促進するペプチド又は疑似ペプチドを動物に注入する。特定の疾患、例えば神経変性疾患、ガン及び免疫学的疾患は、ＰｒＰＢＰの一つであるカドヘリンとＰｒＰ^Cとの相互作用を増大又は減少させる分子を投与することによって治療され得る。例えば、カドヘリン全体又はカドヘリンのＰｒＰ結合部位は内在のカドヘリンとＰｒＰ^Cとの相互作用を阻害するために用いることができる。さらに、神経変性疾患、ガン及び免疫学的疾患の治療に有用な物質は、選択された試験物質がカドヘリンとＰｒＰ^Cとの間の結合を増大又は減少させるかどうかを決定することによって同定され得る。上記において「プリオン蛋白結合蛋白」すなわち「ＰｒＰＢＰ」には、「プリオン蛋白」すなわち「ＰｒＰ」と飽和可能な又は置換可能な形式で結合し得るいかなる蛋白をも含まれる。好ましくは、この結合は、通常の生理学的条件下において「高親和性」であり、形態依存的である。本発明によるＰｒＰＢＰｓは、通常の細胞の存在状態において、少なくとも一時の間、細胞表面上に発現されていることが望ましく、また、宿主細胞の細胞質、細胞質のオルガネラ又は核において常に又は一時的に自然の状態で発現されているものであってもよい。ＰｒＰＢＰｓは特定の細胞、組織又は生物において、その蛋白のファミリーとして存在しているものであってもよい。ＰｒＰＢＰｓはいかなる生物（特にヒトのような哺乳動物、又は家畜、例えばヒツジ、ウシ、ネコ及びヤギ）由来のものも本発明に包含される。ここで「高親和性」の結合とは、親和性定数（プリオン蛋白とＰｒＰＢＰとの親和性定数）が１００μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、さらに好ましくは２ｎＭ以下又はちょうど１ｎＭであることを意味する。ここで「飽和可能な」結合とは、結合（プリオン蛋白とＰｒＰＢＰとの結合）が特定の最大値に達した後はその増加が停止するような結合を意味する。こうした結合は、一蛋白あたりの結合部位の数が限られ、また結合部位が特異的であることを示す。これは、細胞表面に非特異的に付着する蛋白の特性、例えば非特異的及び結合の増加が止まることがないという特性とは相反する結合である。ここで「形態依存的結合」とは、通常の生理学的結合特性をそのまま残している蛋白のように翻訳後に正しく修飾され、折りたたまれ（ホールディングされ）、輸送が行われている非変性蛋白において生じる結合を意味する。ここで「拮抗的な（競合的な）」結合とは、競合する蛋白群の一つ（例えば、ＰｒＰ）が非標識の場合に、この非標識の蛋白の濃度が増加することにより進行的に阻害されるような結合（プリオン蛋白とＰｒＰＢＰの結合）を意昧する。また、「プリオン疾患」とは、急性進行性、致死的な及び治療不可能な脳変性疾患群を意味し、これらには、例えばクロイツフェルト−ヤーコプ病（ＣＪＤ）、クールー、ゲルストマン−ストラウスラー症候群及びヒトの致死的な家系性不眠症（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１５１５−１５２２，１９９１）、ヒツジ及びヤギのスクレイピー、及び畜牛における海綿状の脳障害、同様に近年報告されている他の反芻動物や猫におけるプリオン疾患などが含まれるが、これらのものに限定されない。「プリオン疾患の治療」とは、プリオン疾患に伴う症状の発生を減少、予防又は遅延させることを意味する。このプリオン疾患に関連する疾患としては特に、最終的に海綿状への変性、神経細胞の消失、星状細胞の増殖、ＰｒＰ^SC蛋白の増殖及び痴呆、及び死に至らしめる種々の疾患が含まれる。「実質的に純粋」とは、目的の物質が重量（乾燥重量）として少なくとも６０パーセントとなるように調整されていることを意味する。好ましくは、この調整品は少なくとも７５パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９９パーセントの重量パーセントとして目的物質が含まれている。この純度は、いかなる適切な方法、例えばポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法又はＨＰＬＣ解析によって測定することもできる。「精製されたＤＮＡ」とは、コーディング配列が、生物内の天然に存在するゲノムでは両端に（５’末端及び３’末端に）隣接している配列を直接隣接していないことを意味する。従って、この「精製されたＤＮＡ」には、例えば、組換えＤＮＡ）すなわちベクターに導入されたもの、自己複製可能なプラスミド又はウイルスに導入されたもの、原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡ内に導入されたＤＮＡも含まれる。さらに、このＤＮＡには、他の配列とは独立して単離された分子（例えば、ＰＣＲ又は制限酵素処理によって生成されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）も含まれる。また、この「精製されたＤＮＡ」には、ポリペプチド配列をコードする遺伝子の融合遺伝子の一部に含まれている組換えＤＮＡが含まれる。「形質転換された細胞」とは、（ここで用いているものの例として）ＰｒＰＢＰをコードするＤＮＡ分子が組換えＤＮＡ技術によって導入された細胞（又は、前記ＤＮＡ分子がその祖先の細胞に導入された場合の子孫の細胞）を意味する。「発現のために配置させる」とは、ＤＮＡ配列の転写、翻訳を誘導するＤＮＡ配列の近傍にＤＮＡ分子を配置させることを意味する（これにより、例えばＰｒＰＢＰの産生を可能にさせる）。「精製された抗体」とは、少なくとも重量として６０パーセントの純度において、天然で関連している他の蛋白や自然に発生する有機分子から精製された抗体を意味する。好ましくは、この調整品は少なくとも７５パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、さらに最も好ましくは少なくとも９９パーセントの重量パーセントである。この抗体は、例えばＰｒＰＢＰ特異的抗体である。精製されたＰｒＰＢＰ抗体は、例えば組換え技術によって生成されたＰｒＰＢＰを用いたアフィニティ・クロマトグラフィや、スタンダードな技術を用いて得ることができる。「特異的な結合」とは、抗体が、天然の状態でＰｒＰＢＰを含むサンプル、例えば、生物学的サンプル中のＰｒＰＢＰを認識し結合するが、他の物質は実質的に認識せず又結合しないことを意味する。「アルカリフォスファターゼ」とは、検出可能なシグナルを発生させ得る活性を有するアルカリフォスファターゼ蛋白の画分のすべてを意味する。上述したように本願発明は、プリオン疾患の診断及び治療のための二つの非常に重要な効果をもたらす。第一に、本願発明はＰｒＰＢＰｓを同定及び単離する際に用いることができるＰｒＰ融合蛋白を提供し、これにより、これらＰｒＰＢＰｓをコードする遺伝子又はｃＤＮＡをクローン可能とすることがである。特に、一つの好ましいＰｒＰ融合蛋白は、アルカリフォスファターゼと融合させて作られる。このＰｒＰ−ＡＰ蛋白は種々の効果を有する。例えば、ＰｒＰ−ＡＰ蛋白は、ＰｒＰの通常の形態に最小限の影響しか与えないため、ＰｒＰのＰｒＰＢＰｓに対する結合（及び、特に、高親和性結合）を維持できるという利点を有する。また、このＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白は、通常の細胞内のＰｒＰ機能を引き起こさせる活性を維持している。この点は、従来のＰｒＰ発現構築体に比べて非常に有利な点である。おそらく最も重要な点としては、このＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白は、ＰｒＰＢＰｓと特異的に結合可能であり、またに高親和性を有している。従って、この融合蛋白は、組織源からＰｒＰＢＰｓを取得又は単離する有用な親和性試薬となり得る。また、これは新たなＰｒＰＢＰｓを同定する手段を提供するものとなり、また、これら蛋白（例えば、ゲル上の新たな蛋白バンドとして存在する蛋白）の迅速な精製を可能にする。ここで精製された蛋白は、ｃＤＮＡのクローニングやゲノムの配列のような蛋白のミクロ的な配列決定のために用いることができる。一つの特定の技術としては、ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白は、新たなＰｒＰＢＰＳの同定及びクローニングに用いることができる。この同定としては、ｃＤＮＡライブラリ由来のインビトロで転写させたｍＲＮＡを用いてマイクロインジェクションを行ったカエルの卵母細胞をスクリーニングし、融合蛋白と特異的に結合するクローンを選択する。このＰｒＰＢＰによるスクリーニングの方法は、次の点で有利である。通常では細胞内の発現レベルが非常に低く又は通常ではＰｒＰ−ＡＰ結合に利用し得ないＰｒＰＢＰｓの同定が可能になる。さらに、ＰｒＰ− ＡＰ融合蛋白は測定が容易な酵素であるアルカリフォスファターゼを含んでいることから、実験又は治療、診断条件においてＰｒＰＢＰｓの定量化又は視覚化を行う道具として役立つ。本発明のもう一つの重要な側面としては、プリオン蛋白と飽和可能な又は置換可能な形式で結合するプリオン蛋白融合を提供する。これらＰｒＰＢＰｓは種々の利点を有している。第一に、これら蛋白はＰｒＰｓと特異的に結合することから、これらを検出可能なマーカーで標識することにより、細胞、組織、又は生物学的液体中のＰｒＰ^SCの存在を分析する簡便な手段を提供し得る。また、標識された場合には、これら蛋白は、ＰｒＰに結合する他の薬学的物質の同定を行うための薬剤（ドラッグ）スクリーニング・プロトコル（例えば、拮抗的（競合的）結合解析）において用いることができる。このようなＰｒＰ^SCに対する特異的な又は飽和可能な結合親和性を有していることから、ＰｒＰＢＰｓは感染した細胞、組織又は生物学的液体を二次的な分離技術を通してＰｒＰ^SCを回収するか、又は体内におけるＰｒＰ^SC活性の回復を中和することによって、治療するためのよき候補となる物質を提供する。ＰｒＰＢＰｓは、プリオン疾患に苦しめられている患者の治療に使用し得るという点においても、また利点を有している。例えば、ＰｒＰＢＰｓ、ペプチド・フラグメント又はそのアナログを体内に注入することにより、これらがプリオン蛋白群のいずれかと結合することによって、ＰｒＰ^C からＰｒＰ^SCへの転換を抑制することに使用し得る。本発明の他の特徴及び効果は詳細な説明からさらに明らかになり、またクレームにおいて明らかとされる。図面の説明図１Ａは、ネズミのＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白発現ベクターの概略図である。図１Ｂは、分泌されたアルカリフォスファターゼを発現する対照プラスミドの概略図である。図２は、ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白がＰｒＰ^CおよびＡＰ双方の免疫学上の決定基を含むことを示す放射能写真である。ＡＰを発現するＣＭＶ／ＳＥＡＰベクター（レーン１および２）またはＰｒＰ−ＡＰを発現するＡＰｔａｇベクター（レーン３および４）でトランスフェクトされた、³⁵［Ｓ］−メチオニン標識されたＣＯＳ細胞の上清を、成熟蛋白のＮ末端の１７のアミノ酸に対する抗ＡＰモノクローナル抗体（レーン１および３）またはＰｒＰウサギポリクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った。各免疫沈降反応には等価ＡＰ活性を加えた。図３は、ＰｒＰ−ＡＰが、ＰｒＰ^Cドメインを介して選択細胞系に特異的に付着することを示す棒グラフである。これらの異なるマウス細胞系を６０ｍｍプレート（約１００，０００個の細胞）中で融合するまで培養し、３ｍｌのＣＯＳ細胞の検査上清を加えて室温で９０分間インキュベートし、洗浄、溶解を行い、アルカリフォスファターゼの活性を判定した。結果は次の通りである。対照：疑似トランスフェクトされたＣＯＳ細胞由来の調整済み媒体で、検出可能なアルカリフォスファターゼ活性を含まなかった。ＳＥＡＰ：ＣＭＶ／ＳＥＡＰ構築体でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞由来の上清で、対照と比べて表面結合をまったく示さなかった。ＰｒＰ−ＡＰ：ＰｒＰ−ＡＰ構築体でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞由来の上清で、表面結合を示した。ＳＥＡＰおよびＰｒＰ−ＡＰ上清は同じアルカリフォスファターゼ活性（１時間あたり約５０００Ｄ単位）を含んでいた。図４は、ＡＰではなくＰｒＰ−ＡＰが「間接免疫蛍光」プロトコルによって細胞表面分子を認識する様子を示す２枚の写真パネルである。Ｇ８細胞（マウスの筋細胞系）をプロテアーゼを用いずに機械的に解離させ、ＰｒＰ−ＡＰ蛋白またはＡＰ蛋白でインキュベートし、洗浄し、抗ＡＰモノクローナル抗体でインキュベートし、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネートでタグされたヤギの抗マウス免疫グロブリンでインキュベートし、洗浄し、蛍光顕微法で検査した。ＰｒＰ−ＡＰでインキュベートした細胞（左側のパネル）の蛍光信号は、ＡＰでインキュベートした細胞（右側のパネル）と比較すると、ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白のＰｒＰドメインに起因する特定の細胞表面結合を示す。図５は、ＰｒＰ−ＡＰ結合がそのＰｒＰ^Cドメインを介して競合かつ置換可能であることを示すグラフである。３５ｍｍプレート中のＮＩＨ３Ｔ３細胞を、上記と同じく、代謝的に³⁵［Ｓ］−メチオニン標識されたＰｒＰ−ＡＰ構築体でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から得られた上清でインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、溶解し、結合された放射能をβ計数法で定量した。³⁵［Ｓ］−ＰｒＰ−ＡＰの結合は、いわゆる「コールド（放射能活性のない）」未標識ＰｒＰ−ＡＰの濃度増加によって進行的に競合されるが、同じ濃度をもつＣＭＶ／ＳＥＡＰトランスフェクトされたＣＯＳ細胞由来のＡＰでは競合されない。図６は、ＰｒＰ−ＡＰに接触させたＧ８筋細胞系培養物中の細胞数の減少を示す２枚の写真パネルである。複数の２４ウェルプレート（well plates）中の姉妹Ｇ８培養細胞を、ＡＰを２５％ｖ／ｖ含むＣＯＳ細胞上清中またはＰｒＰ−ＡＰを２５％ｖ／ｖ含むＣＯＳ細胞上清中で、３日間インキュベートした。ＰｒＰ −ＡＰに接触させた培養細胞は、一貫してＡＰに接触させた培養細胞よりも濃度が低く、ＰｒＰＢＰ結合が細胞の成長または生存能力またはこの両方に影響することを示唆する。図７は、クローン６のＰｒＰＢＰの核酸配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）である。詳細な説明ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白を、ＰｒＰＢＰのマーカおよび「親和性試薬」として機能するように構成した。新規のＰｒＰＢＰ群は選択マウス細胞系の表面上で検出された。これらＰｒＰＢＰ群は、競合的、飽和可能、かつ形態依存的な形式で、ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白のＰｒＰ部分に高い親和性で結合した。ＰｒＰ結合蛋白検出システムの作成ＰｒＰＢＰ検出システムを作成するために、プリオン蛋白部分とアルカリフォスファターゼ部分とからなる可溶性組換え融合蛋白（ＰｒＰ−ＡＰと称する）を、ヒト胎盤から分泌された熱安定性のＡＰと、ネズミＰｒＰ遺伝子とをインフレームとなるように構成した（図１Ａ）。ネズミＰｒＰフラグメント(Locht et al .，PNAS 83:6372-6，1986;GenBank Accession #M13685)は、標準的ＰＣＲによってマウスの脳のｃＤＮＡから生成され、開始メチオニンから（従ってＰｒＰリーダ配列を含む）ＧＰＩアンカー付着信号配列の最初のＡｒｇ²²⁹まで（従ってＧＰＩアンカーの付着を回避する）の完全長のオーープンリーデンフレームが含まれている。この配列の増幅に用いたＰＣＲプライマーは、５’ＡＧＡＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＣＴＴＧＧＣ３’（前進プライマー）と、５’ＧＡＧＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＴＣＧＴＡＡＴＡＧ３’（逆向きプライマー）とであった。これらのプライマーは適切な制限サイト（前進：ＨｉｎｄＩＩＩ、逆向き：ＢａｍＨＩ）を含むように設計された。これは、カセット挿入部位の下流にＡＰ遺伝子を含むＡＰｔａｇ−２発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩサイト中へ連結させる（Cheng and Flanagan，Cell 79:157-168，1994）ためである。ＰＣＲ産生物がこのベクター中に連結されると、ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ接合部は、融合蛋白のプリオン部分とアルカリフォスファターゼ部分との間にＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーが挿入される。ＡＰｔａｇ−２発現ベクターは、ＳＶ４０複製起点とＣＭＶプロモータとを含み、ＣＯＳ細胞中でベクターの増幅と高レベルのタンパクの発現を可能にする。融合蛋白のＡＰ部分にのみ結合する蛋白を検出可能となるが、この検出を制御するために、本来のリーダ配列を有するＡＰを、同様にＣＭＶプロモータとＳＶ４０起点とを含むｐＣＤＮＡ１ベクターを用いて、発現させた（Invitrogen，San Diego，CA）。この構築体をＣＭＶ／ＳＥＡＰと名付けた（図１Ｂ）。ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白はＰｒＰ^CおよびＡＰ両方の免疫決定基を含むＣＯＳ細胞は、ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白ベクターまたはＣＭＶ／ＳＥＡＰベクターのいずれかを用いて、標準的なＤＥＡＥ−デキストラン技術によってトランスフェクトされた。ＰｒＰ−ＡＰがトランスフェクトされたＣＯＳ細胞上清（図２、レーン３および４）を、³⁵［Ｓ］−メチオニンでインキュベートし、ＡＰモノクローナル抗体を用いて（MIA 1801，human placenta;Medix Biotech，San Carl os，CA;lane 3）標準的技術（Antibodies，A Laboratory Manual，Harlow & Lan e，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1988）に従って免疫沈降させると、予想通り、９７ｋＤに顕著なバンドを示し、これはＡＰの存在およびＰｒＰ−ＡＰの設計と一致する。ＰｒＰウサギポリクローナル抗体（Be ndheim et al.，Nature 310:418-21，1984;lane 4)を用いた同じ上清の免疫沈降もまた９７ｋＤバンドを形成し、ＰｒＰ−ＡＰトランスフェクトされたＣＯＳ細胞系が、ＡＰおよびＰｒＰ抗体の両方と免疫反応する９７ｋＤを分泌したことを示す。さらに、ＣＭＶ／ＳＥＡＰがトランスフェクトされたＣＯＳ細胞系上清（図２、レーン１および２）も、上記と同じく³⁵［Ｓ］−メチオニンでインキュベートし、抗ＡＰ抗体（レーン１）を用いて免疫沈降させると、予想通り６７ｋＤ蛋白を発現し、その分子量は融合蛋白の設計と一致し、該蛋白中のＡＰの存在を示した。これら同一のＣＯＳ細胞系上清を、ＰｒＰに対するポリクローナル抗体を用いて免疫沈降した場合、６７ｋＤ蛋白は検出されず、ＣＭＶ／ＳＥＡＰ蛋白内にプリオン部分がないことを示した。ＰｒＰ−ＡＰおよびＡＰはともに、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞において、上清１ｍｌあたり約５μｇの蛋白濃度で、発現かつ分泌され、どちらも同じ上清ＡＰ活性を呈した（Cheng and Flanagan，Cell 79:157-168，1994で説明された方法で測定）。トランスフェクトされなかった、または疑似トランスフェクトされたＣＯＳ細胞系は、ＡＰ活性または免疫検出可能なＰｒＰ^Cは含まなかった。このデータは、ＰｒＰ結合蛋白の分布、機能、および分子特性の決定に使用されるＰｒＰ−ＡＰ「親和性試薬」の構築および発現が成功したことを示す。選択細胞系表面上のＰｒＰＢＰｓの検出ＰｒＰ−ＡＰ蛋白が細胞上のＰｒＰＢＰを検出可能かどうかを判断するために、マウス、ヒト、霊長類および神経／神経芽細胞腫細胞系由来の数種類の異なる細胞系を、６０ｍｍプレート（約１００，０００個の細胞）中で、ＤＭＥＭ／１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）存在下で融合するまで培養した。これらの細胞をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、ＤＭＥＭ／５％ＦＣＳまたは疑似トランスフェクトされたＣＯＳ細胞系由来の調整済み媒体にＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白またはＣＭＶ／ＳＥＡＰ蛋白（すなわちＰｒＰ部分が欠如している）を含む３ｍｌのＣＯＳ細胞系上清で、室温で７５〜９０分問インキュベートした。ＰｒＰ−ＡＰトランスフェクトされた細胞上清は、平均５０００Ｄ単位／時間のＡＰ活性を発現し（Cheng and Flanagan，supra）、約５μｇ／ｍｌのＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白の存在を示した。その後、細胞を洗浄、溶解し、６５℃で１０分間加熱して、内在ホスファターゼを不活性化し、アルカリフォスファターゼの活性を上記と同じく判定した。特にＡＰ活性の判定は、ＥＬＩＳＡリーダ（EAR 400 AT Easy Reader， SLT Instruments，Austria）によって、リン酸ｐ−ニトロフェニルから転換した黄色い生成物を４０５ｎｍで測定した。３つの異なるマウス細胞系から入手した結果を図３に示す。ＮＩＨ３Ｔ３およびＬ９２９細胞は、胚性繊維芽細胞から得た。Ｇ８細胞はミオブラストイド（ myoblastoid）(筋の系統)である。やはり陽性反応を示したのは、ヒト神経芽細胞腫系ＳＫ−Ｎ−ＳＨおよびＳＫ −Ｎ−ＭＣならびにグリオーマ細胞系Ｕ８７およびＵ３７３、ヒト腎臓内皮（ＨＥＫ）細胞、霊長類ＣＯＳ細胞、マウスおよびヒト末梢リンパ球、ならびにマウスおよびヒトの解離脳細胞であった。ＰｒＰＢＰはほぼ遍在し、上記に示す種において制限的に観察された結合には見えない。しかし、これらは末梢赤血球およびアフリカツメガエルの卵母細胞には存在しなかった。ＰｒＰ−ＡＰトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の上清からのＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白でインキュベートした場合、熱処理したＧ８、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＬ９２９細胞系で高いＡＰ活性が検出された（図３の「ｐｒｐａｐ」参照）。この結果から、ＰｒＰＢＰはＧ８、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＬ９２９細胞系の表面上に豊富に存在し、ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白由来のＰｒＰと高い親和性で結合できることがわかる。これらのマウス細胞系を疑似トランスフェクトされた（つまりＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白が存在しない、図３の「コントロール」参照）ＣＯＳ細胞の上清からの調整済み培地でインキュベートした場合は、ＡＰ活性はほとんどまたはまったく検出されなかった。また、これらの細胞系をＣＭＶ／ＳＥＡＰトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの上清でインキュベートした場合もＡＰ活性はほとんどまたはまったく検出されず、Ｇ８、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＬ９２９細胞系中でＡＰ活性の増加が検出されるのは、ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白のＡＰ部分にのみ結合する他の蛋白ではなく、特定のＰｒＰＢＰが検出されるためであることを示す。これらの実験では、ＳＥＡＰおよびＰｒＰ−ＡＰ上清は同じアルカリフォスファターゼ活性（１時間あたり−５０００Ｄ単位）を含んでいた。筋細胞がＰｒＰＢＰを高レベルで発現したことは、ＰｒＰ^Cを過剰に発現しているトランスジェニック動物中での筋細胞の選択的な弱さ（vulnerablility）と一致する（ Westway et al.，Cell 76:117-129，1994）。他の技術を用いてＰｒＰＢＰを検出し、かつその細胞局在性を求めるために、間接免疫蛍光法を用いて懸濁液中の細胞をＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白で標識した。細胞をプロテアーゼなしで機械的に解離し、ハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で粉砕し、ＰｒＰ−ＡＰまたはＡＰ蛋白で室温で６０分間インキュベートし、氷冷ＨＢＳＳ中で３回洗浄し、その後、抗ＡＰモノクローナル抗体(MIA 1801，hum an placenta，Medix Biotech，San Carlos，CA)で30分間氷上でインキュベートした。その後、細胞を４℃に保ち、再び洗浄し、蛍光イソチオシアネートに結合されたヤギの抗マウスＩｇＧでインキュベートし（Jackson Immunoresearch，Ph iladelphia，PA）、洗浄し、蛍光顕微鏡分析（Orthoplan蛍光顕微鏡上）またはフローサイトメトリー（Facscan;Becton Dickinson，Oakville，Ontario，Canad a）によって検査した。Ｇ８細胞（マウス筋細胞系）の蛍光顕微鏡分析の結果を図４に示す。ＰｒＰ− ＡＰ蛋白でインキュベートした場合は、Ｇ８細胞の細胞表面がはっきりと標識された（図４、左パネル）が、ＡＰ蛋白では標識されなかった（図４、右パネル）。これらの結果は、Ｇ８細胞の細胞表面上に特異的なマウスＰｒＰＢＰが存在することを示す。ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＬ９２９細胞等の他の細胞系も、Ｇ８で説明したのと同じ結果を示した。Ｇ８および他の細胞系の表面上でＰｒＰＢＰに結合するＰｒＰの特定の部位を同定するために、上記と同じ実験を行った。但し、ここではＰｒＰ蛋白の選択されたドメインに特異的なドメイン阻害抗体の存在下で行った。この目的のために有用なドメイン阻害抗体には、ＰｒＰカルボキシ末端に特異的な抗体（「蛋白質Ｘ」による種特異的な結合を決定すると仮定される、Telling et al.，Cell 83: 79-80，1995）、中間コドン領域９６−１７６に特異的な抗体（ＰｒＰ^CからＰｒＰ^SCへの認識−転換およびＰｒＰ^Cペプチドのアポトーシス特性に重要と仮定される、Forloni et al，Nature 362:543-546）、ならびにアミノ末端オクタペプチド反復領域（家族ＣＪＤ中で顕著に現れる、Prusiner，Ann．Rev．Microbiol ． 48：655-686，1994）に特異的な抗体などがある。結合ドメインの構造上の特徴およびアミノ酸配列を用いて、ＰｒＰＢＰに高い親和性で結合する他の物質を形成する。ＰｒＰＢＰ結合の特徴ＰｒＰＢＰがＰｒＰに競合的な形式で結合するかどうかを判定するために、上記で示したＰｒＰ−ＡＰ結合活性を有する細胞系中で、³⁵［Ｓ］標識されたＰｒＰ−ＡＰを検査した。３５ｍｍの培養皿中で融合するまで成長させた細胞を、³⁵ ［Ｓ］−メチオニンで代謝的に標識されたＣＯＳ細胞の上清で、上記と同じくインキュベートした。その後、細胞を洗浄、溶解し、結合した放射能をβ−計数法で定量した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞についての結果を図５に示す。³⁵［Ｓ］標識されたＰｒＰ −ＡＰによるＰｒＰＢＰへの結合は、インキュベートさせる非標識のＰｒＰ−ＡＰ濃度を増加させることによって阻害され、標識されたＰｒＰ−ＡＰが非標識のＰｒＰによって競合的に置換されることを示す。さらに、³⁵［Ｓ］標識されたＰｒＰ−ＡＰによる）ＰｒＰＢＰへの結合は、ＣＭＶ／ＳＥＡＰ融合蛋白から由来したＡＰの濃度増加によっては阻害されず、結合が融合蛋白のＡＰ部分ではなくＰｒＰ部分で起こっていることを示す。ＰｒＰＢＰとＰｒＰとの間の結合親和性、および所与の細胞個体群上に存在する結合サイトの総数を求めるために、Ｇ８細胞を用いてChengおよびFlannaganの技術（Cell 79:157-168，1994）を変形した技術に従って、スキャッチャード分析を行った。ＰｒＰ−ＡＰおよびＣＭＶ／ＳＥＡＰでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の上清をAmicon限外濾過細胞中で濃縮し、その後、ＨＢＨＡ緩衝液（０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．１％ＮａＮ₃、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）のハンクスの平衡塩類溶液）中で連続希釈した。リガンドの希釈シリーズで平衡インキュベーションを行った後、細胞をＨＢＨＡ中で十分洗浄し、溶解し、上記で説明した結合ＡＰ活性を熱量測定的に解析した。Ｋ_d親和性調査のためにＰｒＰ−ＡＰの結合量および総量を求め、Ｂ_max判定（細胞ごとの結合サイト数）をＡＰの特異的な活性から計算した（１ｐｍｏｌのＰｒＰ−ＡＰは、解析条件下およびインキュベーション期間中は約３ＯＤ単位に対応する）。精製した³⁵［Ｓ］標識されたＰｒＰ−ＡＰに特異的な結合量は、未標識のＰｒＰ−ＡＰとの競合から簡単に計算することができ、Ｂ_max値は³⁵［Ｓ］標識されたＰｒＰ−ＡＰ競合調査のＸインターセプトから計算できる。コンピュータプログラムＬＩＧＡＮＤを用いて、スキャッチャードデータのグラフ化および分析を行った。Ｇ８細胞は解離定数（Ｋ_d）１．４８ｘ１０^-9Ｍで−１ｘ１０⁵のＰｒＰ−ＡＰ結合サイトを有することがわかった。この高親和性結合は、特定の受容体−リガンド相互作用と一致する。ＰｒＰの形態がＰｒＰＢＰへの高親和性結合にとって重要かどうかを決定するために、³⁵［Ｓ］標識されたＰｒＰ−ＡＰを１００℃で５分間煮沸して、その形態を分裂させた。この処理はＮＩＨ３Ｔ３細胞への結合を完全に切断し、ＰｒＰ蛋白の形態がＰｒＰＢＰへの高親和性結合に重要なことを示す。ＰｒＰとＰｒＰＢＰとの結合は細胞増殖および生存力に影響するような生物学的信号を形質導入するＰｒＰＢＰの生理学的機能を求めるために、ＰｒＰＢＰを含むことがわかっているＧ８筋細胞系をＰｒＰ−ＡＰ蛋白またはＡＰ蛋白のいずれかでインキュベートして、細胞の増殖を測定した。２４ウェルプレート中の姉妹G8培養細胞を、ＰｒＰ−ＡＰまたはＡＰを２５％ｖ／ｖ含むＣＯＳ細胞上清中で３日間インキュベートした。２つの発現蛋白で３日間インキュベートした後、細胞を培養ウェル中の８つの高出力フィールド中でカウントした。その結果、Ｇ８筋芽細胞系の自発増殖は、ＡＰのみの場合（２３８±２４．５細胞；ｐ＝０．００２、Mann-Whitn ey nonparametic test）に比べて、ＰｒＰ−ＡＰが存在した場合（６４±９．８ＳＥＭ細胞）において、より抑制された。定性的には、ＰｒＰ−ＡＰに接触させたＧ８培養細胞は、ＡＰに接触させたものに比べて、より小さく、位相が暗く(phase-dark)、未吸着の（unattached）細胞を含んでいるように見え、増殖の低下はおそらく細胞死が増えたためであることを示唆する（図６）。ＰｒＰ−ＡＰに接触させたＧ８培養細胞中で観察された細胞数の減少は、ＰｒＰのＰｒＰＢＰへの結合は細胞増殖を阻害する信号または細胞死を促進する信号を誘導することを強く示唆する。ＰｒＰＢＰの特徴上述したＰｒＰＢＰが本当に蛋白であることを証明するために、姉妹ＮＩＨ３Ｔ３培養細胞を０．２５％トリプシンの存在下また非存在下で、カルシウムを含まないＨＢＳＳ中で３０分間室温でインキュベートし、その後、ＰｒＰ−ＡＰインキュベーションを行い、上記と同じく結合されたＡＰ活性を熱量測定分析した。この比較的穏やかな蛋白質分解は、ＰｒＰ−ＡＰの表面結合をバックグラウンドレベルまで完全に解離させるのに十分であった（ペアードｔ−テスト（paired t-test）によってｐ＜０．００１）。これらの結果は、ＰｒＰＢＰは本当に蛋白である、または少なくとも蛋白質のバックボーンに存在するという考えと一致した。ライブラリの調製２つのｐｃＤＮＡ３．１プラスミドライブラリを、以下のようにＧ８細胞から調製した。すべてのＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（GIBCO BRL）で抽出し、ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡをＯｌｉｇｏｔｅｘｄＴ（Qiagen）を用いて単離した。二重鎖ｃＤＮＡの合成は、ｄＴまたはランダムヘキサマープライマーのいずれかでＴｉｍｅＳａｖｅｒｃＤＮＡキット（Pharmacia）を用いて行った。その後、ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化し、ＢａｍＨＩオリゴをアダプターとして接合させ、Ｓ−５００カラム（Pharmacia）上でサイズを細分画した。その後、サイズが選択されたｃＤＮＡをｐｃＤＮＡａ中へ連結し、ライブラリは標準的技術によって高効率のコンピテントＥ．Ｃｏｌｉ（Invitrogen）へエレクトロポレートされた。プラスミドの調製、インビトロ転写、およびマイクロインジェクション双方のｐｃＤＮＡ３．１プラスミドライブラリは、約０．５ｘ１０⁶の独立クローンを含んでいた。ＰｒＰリガンドのｍＲＮＡの発現量は「中の下（low mode rate）」（転写産物の０．０１％内）であり、この発現量より次のようなことが予想された。すなわち、正方向の完全長ｃＤＮＡが細胞中の対応するｍＲＮＡのほぼ１／１０の頻度でｐＣＤＮＡ３中でうまくクローニングされ得ると仮定すると、単独に陽性のクローンを同定するには、少なく見積って１〜５ｘ１０⁵個のクローンの検査が必要と推定された。ライブラリをＥ．Ｃｏｌｉ中で増幅して、それぞれ１，５００〜２，０００コロニー毎に集合（プール）体を形成した。各集合はレプリカ平板法を行い、一方のフィルタはプラスミドＤＮＡの成長および調製に用い、他方は保存した。集合体由来のプラスミドは、プラスミドＭＩＤＩキット（Qiagen）を用いて調製し、ｍＲＮＡはmMessage mMachine（Ambion，Aus tin TX）を用いて集合体からインビトロで転写されキャップされた。上記と同じくアフリカツメガエルの卵母細胞を調製し（Seguela，P.et al.，J．Neurosci． 16：448-455，1996）、ナノリットル注射器（World Precision Instruments）を用いて卵母細胞１個あたり５０ｎＬ（７５〜１２５ｎｇのｍＲＮＡ）をマイクロインジェクション（微量注入）した。ＰｒＰ−ＢＰのクローニングおよび特徴決定１０〜２０個の卵母細胞は５００，０００個分のＧ８細胞に相当するメンブレン領域を所有し、この上でＰｒＰ−ＡＰ結合を簡単に検出できると推定した。ＰｒＰ−ＡＰ上清で４時間室温でインキュベートして卵母細胞のＰｒＰＢＰ発現を注射後４８時間モニターした。その後、卵をＨＢＨＡで６回洗浄した。細胞内皮ホスファターゼを不活性化させる均一加熱を加熱ブロック中で６５℃で行った。ＡＰ緩衝液（１００ｍＭトリ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣＬ₂）中で０．３３ｍｇ／ｍｌのＮＢＴおよび０．１７ｍｇ／ｍｌのＢＣＩＰで０．５〜１２時間インキュベーションして、結合ＡＰ活性を検出した。すべての注入シリーズには、ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、Invitrogen）のみを注入した卵からなるネガティブ対照と、ＥＬＦ−１プラスミドクローン（Chan g et al.k，79:157-168，1994）から調製し、ＭＥＫ−４−ＡＰ融合蛋白を用いて検出したｍＲＮＡを注入した卵からなるポジティブ対照とが含まれた。３３の集合（約６６０のアフリカツメガエルの卵母細胞を含む）をスクリーニングしたところ、どれも有意なＰｒＰ結合を示さなかったが、その後の３４番目の集合のＰｒＰ−ＡＰ結合が陽性であることがわかった。その後の集合体もＰｒＰ結合は陰性であった。集合３４は、適切なストックバクテリア培養物を希釈して、それぞれ約２００のｃＤＮＡクローンを含む１０の集合体に分別した。これらのうち、もっとも高いＰｒＰ結合を示した集合群を選択して、１つの陽性クローンが単離されるまでさらに分別を行った。結合活性をテストした３２個のｃＤＮＡクローンのうち、クローン６がバックグラウンドに対して最高レベルのＰｒＰ−ＡＰ結合活性を示した。クローン７は並のＰｒＰ−ＡＰ活性を示した。配列決定クローン６および７中のｃＤＮＡインサートを標準的方法で配列決定した。相同性検索のために、ＢＬＡＳＴネットワークサーバ（National Library of Medicine）を用いて、ＥＭＢＬおよびＧＥＮＢＡＮＫ核酸データベースの最新版を利用し、かつＢＬＡＳＴおよびＢＬＩＴＺネットワークサーバ（Heidelberg）の両方を用いて蛋白質データベースを調べた。クローン６中のｃＤＮＡインサートは、プロトカドヘリン−４３の一画分（プロトカドヘリン−４３のアミノ酸６７−２５２）をコードした。クローン６のこの部分の核酸および推定アミノ酸配列を図７に示す。プロトカドヘリン−４３はサノら（EMBO J．12:2249-2256，1993）に記載されている。プロトカドヘリン− ４３の配列情報は、ＧＥＮＢＡＮＫＬ１１３７３（プロトカドヘリン−４３）で入手できる。クローン７中のｃＤＮＡインサートは、ＯＢ−カドヘリン−１の一部分（アミノ末端カドヘリン反復）をコードしていた。ＯＢ−カドヘリン−１はオザキら（ J．Biol．Chem．269:12092-12098，1994）に記載されている。ＯＢ−カドヘリン −１配列情報は、ＤＢＪＤ２１２５３（マウスＯＢ−カドヘリン）およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ５５２８７（ヒトＯＢ−カドヘリン）より入手できる。一次および二次スクリーニング規準に合致するクローンが同定されると、一連の実験を行う。例えばノーザンブロット分析を行って、ハイブリッド形成するｍＲＮＡ種のサイズを明らかにしたり、またサイズの異なる複数の関連のある転写産物写しがあるかどうかを判断する。異なる細胞、臓器、および種のノーザンブロット、ならびに異なる進化および疾患状態（特にマウススクレイピー）の組織を用いるブロットは、ＰｒＰＢＰの細胞特異性および調節に関する重要な情報を与える。細胞表面のＰｒＰ−ＡＰ結合とＰｒＰＢＰ発現との間の差は、ＰｒＰＢＰを可溶性型として発現する細胞があることを示唆する。さらに、アミノ酸配列を用いて、ＰｒＰＢＰに対する有効な抗体プローブの生産を容易にする免疫性配列が同定される。また生理学的に適切なＰｒＰＢＰの配列を同定することで、プリオン疾患およびその他の神経変性疾患の理解をさらに深め、かつ相互作用を阻害する小分子治療物の開発、またはこれらの疾患の治療としてこの形質導入分子を不活性化させる様々な研究が可能となる。または、ＰｒＰＢＳは、ＰｒＰ−ＡＰ親和性カラムおよび標準的カラム精製技術を用いて、ＰｒＰＢＰ蛋白の精製によってクローニングしてもよい。有用なＰｒＰＢＰ源には、組織、細胞、またはメンブレンのホモジェネートがある。カラム単離の後、ＰｒＰＢＰの特徴を生化学的が決定され、分子量、ｐＫ、およびグリコシル化等の特性についての情報を与える。さらに、この蛋白をミクロ的に配列決定して、データベースの検索と、変性オリゴヌクレオチドおよび標準的なハイブリッド形成スクリーニングまたはＰＣＲ増幅技術を用いるｃＤＮＡクローニングとを容易にすることができる。カドヘリンカドヘリンは初期においては、カルシウム依存性でホモフィリックな細胞間接着分子であり、発生学的形成および組織の維持における細胞間認識および接着現象にて、他のファミリーの接着分子（インテグリン、免疫グロブリンファミリー接着分子、およびセレクチンを含む）と共同で作用すると認識されていた。カドヘリンスーパーファミリーは、細胞外の「カドヘリンモチーフ」（約１１０個のアミノ酸を有する）の所有によって規定される多種の蛋白のグループである。「カドヘリンモチーフ」は、折りたたみ構造によって反復するドメインを有し、免疫グロブリン折りたたみ構造と一部同様の三次構造的特徴を有する。それと対照的に、カドヘリンの細胞質ドメインは著しく多様であり、これらの分子の広く異なる機能を反映している。配列相同性分析からの示唆によれば、カドヘリンスーパーファミリーは、標準的カドヘリンおよびプロト（原形）カドヘリンの、少なくとも二つのサブファミリーを含むと考えられる。他の見解によればカドヘリンは、標準的カドヘリン、デスモソーム用カドヘリン、プロトカドヘリン、およびカドヘリンに関連した他の蛋白の、四つの機能的サブグループに分けられる（Suzuki,J.Cell.Biochem.61:531-542,1996）。最初に認識されたカドヘリンは、Ｅ−カドヘリン（またはウボモルリン）であり、発生の初期段階において、割球のカルシウム依存性の圧密化（compaction）に介在することが発見された。初期の標準的カドヘリンは全て、五つの細胞外カドヘリンドメインを有するホモフィリックな接着分子であった。このグループにはさらに、Ｍ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、およびＲ−カドヘリンが含まれる。より最近に発見された標準的カドヘリン（これらによりサブファミリーを構成するかもしれない）は、カドヘリン５〜１３を含む。これらの新しい非典型的な「標準的」カドヘリンのいくつか（カドヘリン５および８を含む）は、Ｌ細胞に形質導入されたときにはホモフィリックな結合作用を実施しないようである。しかし同じカドヘリンは、細胞間の接触点にてカルシウム依存性の局在化を示し、ヘテロフィリックなリガンドの存在を示唆する（Suzuki，J.Ce ll.Biochem.61:531-542,1996）。ホモフィリックな結合を示す標準的カドヘリンでさえも、ヘテロフィリックな結合リガンドを有すると考えられる。これは、インテグリンαＥβ７がＥ−カドヘリンと結合すること（Cepek，Nature 372:190- 193,1994）、および繊維芽細胞増殖因子がＮ−カドヘリンと結合することによって示唆される。カドヘリンのヘテロフィリックなリガンドが、今後さらに多数同定される可能性が高い。我々は、ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白を検出試薬およびカエル卵母細胞の発現システムとして用い、プリオン蛋白がカドヘリン蛋白にとっての新たなリガンドとして作用することを実証した。標準的カドヘリンの接着部位および特異性決定部位は、カドヘリンの最も多いＮ末端ドメインであるＥＣ１に含まれると考えられている（Shapiro et al.,Nat ure 374:327-337,1995）。大多数の標準的カドヘリンの細胞質ドメインにおけるＣ末端は、よく保全され、カテニンに対するそれらの結合を反映している。そしてそれにより、細胞の細胞骨格を表している（Ozawa et al.,1990,Hirano et al .,1992）。例外は、Ｔ−カドヘリン（カドヘリン−１３）およびカドヘリン８のスプライスバリアントである。カドヘリン１３は、膜貫通ドメインを有さず、プリオン蛋白と同様に、グリコシル−ホスファチジルイノシトールの末端を介して細胞表面に結合する。カドヘリン８は細胞によって、膜アンカ−手段が完全に欠如した溶解性アイソフォームとして分泌されることがある（Suzuki et al.,1996 ）。プロトカドヘリンは、特徴づけが不完全な大きな蛋白グループであり、カドヘリンの細胞外ドメインを有する点で、標準的カドヘリンとの相同性がある。しかし、特徴づけられたプロトカドヘリンは全て、五つより多くのカドヘリンドメインを有するようであり、標準的カドヘリンのドメインＥＣ３およびＥＣ５との類似が最も際立っている（Sano et al.,EMBO J.12:2249-2256,1993）。このように、標準的カドヘリンのＥＣ１結合モチーフは、プロトカドヘリンには含まれない。当然の結果として、プロトカドヘリンのホモフィリックな接着作用は、この蛋白ファミリーの全ての既知の蛋白によって実施されるわけではない。プロトカドヘリンはまた、標準的カドヘリンのものとは異なる、多様な細胞質ドメインを有する。このことは、プロトカドヘリンの特別な機能的役割を示唆する。したがって、プロトカドヘリンは、現在知られていない新規のヘテロフィリックな分子に結合すると仮定されてきた。カドヘリンの機能は、現時点では全ては解明されていない。いくつかの標準的カドヘリンは明らかに、発生の細胞層分離および形態形成に関与している。Ｎ− カドヘリンは、軸索の伸長において重要な役割を果たす。カドヘリンはまた、成熟した組織における細胞間認識の維持に関与する。さらに、転移ガンなどの、認識が欠乏する疾病に関与すると考えられる。ベータカテニンのために、ｗｎｔガン原遺伝子生成物と競合することから、腫瘍形成での役割が示唆される。天庖瘡は、デスモソーム用カドヘリンの免疫認識が介在する自己免疫性疾患である。カドヘリンはさらに、神経変性疾患、筋肉疾患、および免疫学的疾患に関与する可能性がある。プリオン蛋白のカドヘリンとの結合への関与は、プリオン蛋白のカドヘリン機能への作用、またはカドヘリンのプリオン蛋白機能への作用を、妨害または促進する作用剤の開発につながる。ＰｒＰＢＰのＰｒＰとの結合はカルシウム依存性である標準的カドヘリンは、カルシウム依存性のホモフィリックな細胞間接着への関与を通じて初めて認識された。さらなる研究により、カルシウムは接着相互作用自体には必要ないが、カドヘリンの折りたたみ構造間のカルシウム結合部位と反応することによって、その分子を細胞表面上でより堅固で安定したものにすることが明らかになった（Shapiro et al.,Nature 374:327-337,1995）。ホモフィリックな結合相互作用に関与しないカドヘリンファミリー構成物でさえ、カルシウムによって誘発されることによって細胞間接着点に局在化する（このことは、ヘテロフィリックなリガンドへのカルシウム介在の結合を示唆する）。最初にＧ８およびＣＯＳ細胞の表面上にて同定されたＰｒＰＢＰが、カルシウム依存性結合というカドヘリン蛋白の主要な特徴を有するかどうかを更に調査するために、以下の実験を行った。ＰｒＰ−ＡＰ上清を２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を用いて室温で２時間培養して、その培地内のカルシウムをキレート化した。並行して、集密的ＣＯＳおよびＧ８細胞を、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）の中で５分間培養して、細胞を容器の底から引き離した。続いて細胞を、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）内で一回洗浄した。コントロール細胞は、１．３ｍＭのＣａＣｌ₂および１ｍＭのＭｇＣｌ₂のみを含むＨＢＨＡの中で培養した。その間実験細胞は、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳの中で室温で３０分間培養して、その培地内のカルシウムを除去した。第一のグループであるネガティブコントロール細胞は、ペレット状にして（pelleted）ＤＭＥＭ５％（ＰｒＰ−ＡＰを含まない）の中に再度懸濁させた。第二のグループであるポジティブコントロール細胞（培地にカルシウムが存在する）、および第三のグループである実験細胞（ＥＤＴＡで処理された）は、ＥＤＴＡ処理されたＰｒＰ−ＡＰの中で室温にて１．５時間再度懸濁させ、その後コールド（非放射性の）ＨＢＨＡ内で三回洗浄した。続いて、これらの細胞を前述したとおりに溶解し、これらの細胞の上清におけるＰｒＰ−ＡＰ作用を検査した。カルシウムキレート化剤であるＥＤＴＡの存在下では、ＣＯＳおよびＧ８細胞の双方への結合は有意に減少していた(ＣＯＳおよびＧ８細胞の双方において、ｐ＜０．０００１、Ｎ＝６）。これは、最適な結合のためにはＣａ²⁺などの二価の陽イオンの存在が必要であることを示す。ＰｒＰＢＰのＰｒＰとの結合は、カルシウムに依存した、トリプシンに対する耐性を示すカルシウムとの結合によって、いくつかのカドヘリンは、トリプシン消化から保護される（Takeichi,J.Cell.Biol.75:464-474,1977）。これはおそらく、カルシウム結合が、プロテアーゼ感受性部位を遮断する構造的変化を誘発することによる。最初にＧ８およびＣＯＳ細胞の表面上にて同定されたＰｒＰＢＰが、カルシウム存在下での蛋白質分解に対する耐性というカドヘリン蛋白の主要な特徴を有するかどうかを更に調査するために、以下の実験を行った。集密的な（コンフルエントな）ＣＯＳおよびＧ８細胞を、０．２５％トリプシンおよび１０ｍＭのＣａＣｌ₂、もしくは０．２５％トリプシンおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳの中で、３７℃で２０分間培養し、その後ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ内で三回洗浄した。１本のエッペンドルフチューブ（eppendorf tube）当たり約１×１０⁶個の細胞が分布しており、これらの細胞をＨＢＨＡ培地で二回洗浄した。細胞をＰｒＰ− ＡＰ上清を用いて室温で１．５時間培養し、その後コールドＨＢＨＡ内で三回洗浄した。続いて細胞を氷上で、５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトン−Ｘ１００、０．０２％ＮａＮ₃（ｐＨ８．０）の中に懸濁した。その懸濁液を、マイクロ遠心分離した。上清は、加熱ブロック上で６５℃にて１２分間均一に加熱し、内因性細胞ホスファターゼを不活性化した。結合ＡＰの作用が、ＡＰ緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ）５ｍＭのＭｇＣｌ₂で、０．５から１２時間）の中で、ＮＢＴおよびＢＣＩＰを用いて検出された。Ｃａ²⁺イオンの存在下では、ＰｒＰ−ＡＰのＣＯＳおよびＧ８細胞との結合は、ＰｒＰ−ＡＰを用いた培養に先立って細胞をトリプシン処理したにもかかわらず保持された。Ｃａ⁺²が不在の場合には、ＰｒＰ−ＡＰ結合には有意の減少が見られた（ＣＯＳ細胞においてｐ＜０．００１、Ｇ８細胞においてｐ＜０．０５、Ｎ＝４）。このデータは、ＣＯＳおよびＧ８細胞の表面上のＰｒＰＢＰ類が、Ｃａ²⁺ の存在下ではトリプシンによる蛋白質分解から保護されるという、カドヘリン分子の既知の特徴を示す（Takahashi et al.,Oncogene 8:2925-2929,1993）。したがって、このデータは、ＰｒＰがカドヘリンファミリー構成物に結合するという見解を支持する。ヒトＰｒＰＢＰの単離およびクローニングヒトＰｒＰＢＰは、マウスのそれに関して上述したと同様に単離できる。詳細には、組換えヒトＰｒＰ−ＡＰ融合遺伝子は、マウスＰｒＰ遺伝子の代わりにクレッツシュマーら（Kretzschmar et al.DNA 5:315-324,1986）によって説明されるヒトＰｒＰｃＤＮＡを用いて、本質的に上述のとおりに構築される。ヒトＰｒＰフラグメントは、以下のプライマを用いてスタンダードなＰＣＲ増幅によって生成される：５’ＡＧＡＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＣＴＴＧＧＣ３’（前進プライマ）；および５’ＧＡＧＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧＴＡＡＴＡＧＧＣＣＴＧ３’（逆向きプライマ）。続いてこのフラグメントは、ＡＰタグ−２発現ベクターの中へインフレームとなるようにクローン化される（Cheng and Flanagan,supra)。このベクターから発現された融合蛋白生成物を用いて、上述のいずれかのアフィニティ技術によって（例えばヒトＰｒＰＢＰ産生細胞からの沈降によって）、ヒトＰｒＰＢＰは単離される。単離された蛋白が実際にヒトＰｒＰＢＰであるかの検証も、上述のとおりに実施できる。単離後、ヒトＰｒＰＢＰ蛋白はミクロ的に配列決定してもよい。このアミノ酸配列は、ハイブリッド形成スクリーニングのためのオリゴヌクレオチドの設計に使用してもよく、もしくはいずれかの適切なヒトｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーからのヒトＰｒＰＢＰをコードする配列の増幅のためのＰＣＲプライマの設計に使用してもよい。代替案としては、ヒトＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１クローニングシステムおよび上述の技術によって、ヒトＰｒＰＢＰを発現するｃＤＮＡクローンを単離することができる。もしくは好ましくは、さらに他の代替技術において、マウスＰｒＰＢＰをコード化する配列（上述したもの）をプローブとして用いて、ヒトの脳ｃＤＮＡライブラリーの、低減された緊縮条件下でのスクリーニングを実施する。ここでも、ハイブリッド形成プローブとしてマウスＰｒＰＢＰ配列を使用してもよいし、または異なる種間で保全されるであろうマウスＰｒＰＢＰ配列の領域に基づいてＰＣＲプライマを設計し、それをヒト配列の増幅に使用することが可能である。ＰｒＰＢＰ蛋白の発現本発明によるＰｒＰＢＰは一般的に、適切な発現担体に含まれる、ＰｒＰＢＰをコードするｃＤＮＡフラグメントの全体または一部を用いて、適切なホスト細胞を形質転換させることにより生成される。分子生物学の分野において知識を有する者にとっては、組換え蛋白を供給するために、多様な発現システムのいずれを使用してもよいことは明らかであろう。本発明にとって、厳密にどのホスト（宿主）細胞を使用したかは決定的事項ではない。ＰｒＰＢＰは、原核細胞ホスト（例えばＥ．ｃｏｌｉ）または真核細胞ホスト（例えばSaccharomyces cerevisiae）例えばＳｆ２１細胞である昆虫細胞、もしくは、例えばＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、または好ましくはＣＯＳ細胞である哺乳類細胞）において産生される。このような細胞は、多様な供給元から入手できる（例えばAmerican Type Culture Collection，Rockland，MD；さらに、例えばAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &S ons,New York,1994を参照のこと）。形質転換または形質導入の方法、および選択する発現方法は、選択したホストシステムによって決まる。形質転換またはトランスフェクションの方法は、例えばAusubel et al.(supra)に記載されている。発現担体は、例えばCloning Vectors:ALaboratory Manual(P.H.Pouwels et al .,1985,Supp.1997)に記載されたものから選択できる。代替案として、ＰｒＰＢＰは、安定して形質導入された哺乳類細胞系によって産生されることもできる。哺乳類細胞の安定した形質導入に適した数々のベクターが、一般的に入手可能である。例えば、Pouwels et al.(supra)を参照されたい。このような細胞系の構築方法も、例えばAusubel et al.(supra)などから一般的に入手可能である。一例として、ＰｒＰＢＰをコードするｃＤＮＡは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む発現ベクター内にクローン化される。プラスミドの、およびそれに従ってＰｒＰＢＰをコードする遺伝子の、ホスト細胞の染色体への組込みは、細胞培養液に０．０１〜３００μＭのメトトレキセートを含有させること（Ausubel et al.,supraに記載されたとおり）によって、選択される。この優性選択は、多数の細胞の種類において実施することができる。形質導入された遺伝子のＤＨＦＲ介在による増幅によって、組換え蛋白の発現を増加させることができる。遺伝子増幅を担う細胞系の選択方法は、Ausube l et al.(supra)に記載されている。これらの方法は一般的に、培地中のメトトレキセートの含有レベルを徐々に増加させながら、長時間の培養を行う。本目的で一般的に使用される、ＤＨＦＲを保持する発現ベクターは、ｐＣＶＳＥＩＩ− ＤＨＦＲおよびｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）（Ausubel et al.,supraに記載されたとおり）を含む。上述したホスト細胞のいずれか、または好ましくはＤＨＦＲを欠失（欠損）したＣＨＯ細胞系（例えばＣＨＯＤＨＦＲ^-細胞、ATCC Accession No.CRL 9096）は、安定して形質導入された細胞系のＤＨＦＲ選択、またはＤＨＦＲ介在の遺伝子増幅のために好ましいホスト細胞である。組換えＰｒＰＢＰは発現させた後は、例えばアフィニティー・クロマトグラフィによって単離される。一例としては、抗ＰｒＰＢＰ抗体（例えば本明細書に記載したとおりに生成したもの）をカラムに付着させることにより、ＰｒＰＢＰの単離に使用できる。アフィニティー・クロマトグラフィに先立って、ＰｒＰＢＰを保持している細胞の溶解および分別は、スタンダードな方法によって実施してもよい（例えばAusubel et al.,supra参照のこと）。組換え蛋白は単離後、必要であれば、例えば高性能液体クロマトグラフィによってさらに精製できる（Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry And M olecular Biology ,eds.,Work and Burdon,Elsevier,1980参照のこと）。本発明のポリペプチド、特に短いＰｒＰＢＰフラグメントは、化学的合成によっても生成できる（例えばSolid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,1984 The Ｐierce Chemical Co.,Rockford,ILに記載の方法による）。ポリペプチドの発現および精製に関する以上の一般的な技術は、有用なＰｒＰＢＰフラグメントまたはそのアナログ（本明細書に記載のもの）の生成および単離にも使用できる。抗ＰｒＰＢＰ抗体ＰｒＰＢＰに特異的な抗体を生成するために、ＰｒＰＢＰをコードする配列は、そのＣ末端融合としてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を発現させてもよい（Smith et al.,Gene 67:31-40,1988）。融合蛋白は、グルタチオンセファローズのビーズ上で精製され、グルタチオンで溶出され、トロンビンを用いて（操作した分裂部位において）分裂され、そしてウサギを免疫感作するに必要な度合いまで精製される。一次免疫は完全フロイントアジュバンドを用いて実施され、続く免疫感作は不完全フロイントアジュバンドを用いて実施される。抗体価の変化は、ＧＳＴ−ＰｒＰＢＰ融合蛋白のトロンビン分裂されたフラグメントを用いて、ウェスタンブロット法および免疫沈降分析法によって監視される。免疫血清は、ＣＮＢｒセファローズが結合したＰｒＰＢＰ蛋白を用いてアフィニティ精製される。抗血清の特異性は、関連のないＧＳＴ蛋白のパネルを用いて判定される。ＧＳＴ融合蛋白の代替または補助免疫原として、ＰｒＰＢＰの比較的ユニークな免疫原性領域に相当するペプチドを生成し、導入されたＣ末端のリシンを通じてＫＬＨ（keyholel impet hemocyanin）と結合させることができる。これらの各ペプチドに対する抗原は、ＢＳＡに抱合されたペプチド上で同様に、アフィニティ精製される。特異性は、ペプチド抱合体を用いてＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法によって検査される。また、ＧＳＴ融合蛋白として発現したＰｒＰＢＰを使用してウェスタンブロット法および免疫沈降法によって検査される。代替案として、モノクローナル抗体を、上述のＰｒＰＢＰおよびスタンダードなハイブリドーマ技術を用いて生成してもよい（例えばKohler et al.,Nature 2 56:495,1975;Kohler et al.,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler et al.,Eur.J.I mmunol.6:292,1976;Hammerling et al.,In Monoclonal Antibodies and T CellH ybridomas,Elsevier,NY,1981;Ausubel et al.,supraを参照のこと）。生成後、モノクローナル抗体も、ウェスタンブロット法および免疫沈降分析法によって（ Ausubel et al.,supraに記載の方法によって）ＰｒＰＢＰ特異的認識が検査される。ＰｒＰＢＰを特異的に認識する抗体が、本発明においては有用とされる。このような抗体は例えば、哺乳動物が産生するＰｒＰＢＰのレベルを監視するイムノアッセイにおいて利用できる（例えば、ＰｒＰＢＰの量または亜細胞性位置を検出するため）。他の代替手順として、モノクローナル抗体は、上述のＰｒＰＢＰおよびフアージディスプレイライブラリーを使用して生成することができる（ Vaughan et al.,Nature Biotech 14:309-314,1996）。本発明の抗体は好ましくは、一般的に保全される領域外に位置し、電荷を有する残基の高頻度の発生などを基準として抗原性を示すと思われる、ＰｒＰＢＰのフラグメントを使用して生成される。具体的な一例として、これらのフラグメントはスタンダードなＰＣＲの技術によって生成され、ｐＧＥＸ発現ベクター内にクローン化される（Ausubel et al.,supra）。融合蛋白はＥ．ｃｏｌｉ内に発現され、Ausubel et al.に記載されるとおり、グルタチオンアガロースの親和性マトリックスを用いて精製される。発生し得る問題である抗血清の低親和性または特異性を最小限にする試みとして、各蛋白に対しこのような融合体を二つまたは三つ形成し、各融合体を少なくとも二匹のウサギに注入する。抗血清は、好ましくは少なくとも三回の追加免疫注入を含む一連の注入により産生される。プリオン疾患検出アッセイＰｒＰＢＰは一般的に、プリオン疾患の検出または監視において有用である。ＰｒＰＢＰは例えば、スタンダードな検出アッセイによって生物学的サンプル（例えば組織生検または体液）内にＰｒＰ^SCが存在するか否かの監視をするために利用できる。ここで言う検出アッセイは、例えば標識されたＰｒＰＢＰ、標識されたＰｒＰＢＰ融合蛋白、または標識されたＰｒＰ^SCなどの、検出可能に標識された要素に依存する方法を含むが、それに限られない。本発明による検出アッセイは、ＰｒＰ^SCの直接検出を含むことができ、または間接検出（例えば、ＰｒＰＢＰをＰｒＰに結合し、その後ＰｒＰＢＰに対抗させる第二の標識された抗体を用いて、その複合体を検出することによる）を含むことができる。これらの検出方法に使用するＰｒＰＢＰ（例えばマウスまたはヒトＰｒＰＢＰ）は、組換えによっていずれかの細胞内で産生されるが、ホスト細胞としてはＣＯＳ細胞が好適である（例えばCullen,Meth.Enzymol.152:684-704,1988の方法によれば）。代替案として、ＰｒＰＢＰは、ＰｒＰ−ＡＰ蛋白およびスタンダードな技術を用いてアフィニティ精製によって単離できる。一つの特に好適な実施形態では、本発明の検出方法において、溶解性ＰｒＰＢＰ結合ドメインが発現され使用される。他の好適な実施形態では、ＰｒＰＢＰ結合ドメインは、マウスおよびヒトＰｒＰＢＰコード化配列の双方を含む融合蛋白として発現される。これらの融合蛋白は同様に、前述した検出方法で使用される。一つの実施例においては、プリオン病原体を含むことが判明しているまたは疑われている生物学的サンプルは、以下のように検査される。生物学的サンプルは、スタンダードな技術に従いプロテアーゼで処理される（例えばPrusiner et al .,Science 216:136-144,1982に記載のとおり）。プロテアーゼ不活性化処理後にサンプルは、既知の濃度にて存在する、検出可能に標識されたＰｒＰＢＰ（またはフラグメントまたはそのアナログ）またはＰｒＰＢＰ融合蛋白のどちらかを用いて培養される。そこで得られた複合体は、例えばフィルタ結合、免疫沈降法、ゲル電気泳動分離、沈降、または濾過などによって単離または同定される。単離された複合体は続いて、スタンダードな方法に従い分析され測定される。これらの検出アッセイにおいては、直接的または間接的に可視化されるいずれの適切な標識を用いてもよい。これらの標識には、いずれの放射性、蛍光性、染色原性（ chromogenic）（例えばアルカリフォスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または化学発光性標識、もしくは、標識されたハプテン特異的抗体または他の結合物質（例えばアビジン）を用いて可視化されるハプテン（例えばジゴキシゲニンまたはビオチン）が含まれるが、それらに限られない。免疫学をベースにした解析が実施される場合、（上述の）ＰｒＰＢＰまたはＰｒＰ（Bendhe im et al.,Nature 310:418-21,1984）に対抗するよう生成されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、いずれのスタンダードなイムノ解析の形態（例えば、ＥＬＩＳＡ）ウェスタンブロット法、またはＲＩＡ解析）にて使用でき、それにより複合体形成を測定できる。このようなイムノ解析の例は、例えばAusu bel et al.,supraに記載される。適切なコントロールサンプルに比べて、標識された複合体を高いレベルで含むと判定されたサンプルは、プリオン蛋白が存在していること、すなわちプリオン関連疾患の罹患を示している。他の検出解析では、生物学的サンプル内のＰｒＰ^SCは、固形支持体（例えばニトロセルロース、イモビロン、アガロースビーズ、シアンに活性化されたアガロース、または組織培養ウェル）上で担持され、ＰｒＰＢＰ（またはフラグメントまたはそのアナログ）またはＰｒＰＢＰ融合蛋白による結合が検出される。代替形態では、ＰｒＰＢＰまたはＰｒＰＢＰ融合蛋白は固形支持体に固定され、ＰｒＰ^SCの結合が検出される。これらの解析形態では、上述のとおりいずれのスタンダードな方法によって検出が実施されてもよく、例えば固形支持体に関与しているＰｒＰ^SCの検出は、前述のとおりＰｒＰＢＰを用いて直接的または間接的に実施される。代替案として、捉えられたＰｒＰ^SC：ＰｒＰＢＰ複合体内のＰｒＰ^SC は、ＰｒＰ^SCに対抗する抗体を用いて検出できる（Bendheim et al.,Nature 310 :418-21,1984）。同様に、放射性または蛍光性マーカー、もしくは代わりにアルカリフォスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼを含む（がそれに限られない）酵素マーカーなどの、いずれかの適切な標識を使用できる。そして検出は、染色原性または蛍光原性基質を添加することにより実施できる。上記のように、ＰｒＰ^Cと結合するがＰｒＰ^SCとは結合しないＰｒＰＢＰは、生物学的サンプルからＰｒＰ^Cを除去することに使用できる。サンプル内に残存するＰｒＰ^SCは、例えばＰｒＰ^SCおよびＰｒＰ^Cの双方に結合する抗体などの試薬に結合させることにより定量できる。このように、ＰｒＰ^Cと結合するがＰｒＰ^SCとは結合しないＰｒＰＢＰであっても、ＰｒＰ^SC用の解析において使用できる。さらに他の検出解析では、検出可能に標識されたＰｒＰ^SCはＰｒＰＢＰを用いて培養され、その後ＰｒＰ^SCを含むことが疑わしい生物学的サンプルと共に培養される（もし所望であれば、プロテアーゼ処理後）。この結果得られた複合体は、上述のとおり通常の方法に従って測定および定量化される。この解析形態では、コントロールサンプルとの比較で、ＰｒＰ^SC：ＰｒＰＢＰ複合体内の標識されたＰｒＰ^SCの存在の減少が見られると、生物学的サンプル内にＰｒＰ^SCが存在することを示すと理解される。それは、サンプル内の標識されないＰｒＰ^SCが、複合体内の標識されたＰｒＰ^SCを競合的に置換するからである。プリオン除染本明細書で説明する方法および構成は、プリオン蛋白による汚染が明らかな又は疑わしい生物学的サンプルの除染に有用である。詳細に言えば、ＰｒＰＢＰはＰｒＰ^SCに結合可能なため、生物学的サンプルをＰｒＰＢＰと共に培養し、例えば二次隔絶法（secondary sequestration）または分離法などのスタンダードな方法を用いてＰｒＰＢＰ複合体を除去することができる。代替案として、単純に、ＰｒＰＢＰを生物学的サンプルと共に培養し、ＰｒＰと複合させ、それによってＰｒＰの影響を阻止してもよい。プリオン関連疾患および他の神経変性疾患の治療本発明の方法および構成は、ヒトを含む哺乳類のプリオン疾患の治療および防止手段を提供する。この治療は、例えばＰｒＰＢＰ：ＰｒＰ^SC複合体形成に関連する生物学的事象を阻害、抑制、低減、または中和するアンタゴニストを用いて動物を治療することによって、直接実施してもよい。このようなアンタゴニストは、本発明の分子および機能的解析を用いて単離することができる。例えば本発明は、ＰｒＰＢＰ：ＰｒＰ^SC複合体の相互作用に拮抗可能な物質（例えばペプチド、小さな分子の阻害物質、または疑似体）を同定する手段を提供する。これらのアンタゴニストには以下を含むが、それに限られない：ＰｒＰＢＰ；ＰｒＰ^SC と結合してＰｒＰ^SCの生物学的作用を制限および不活性化するＰｒＰＢＰフラグメントまたはアナログ；抗ＰｒＰＢＰ抗体；ＰｒＰＢＰと相互作用して、ＰｒＰＢＰ−ＰｒＰ複合体形成を阻止することにより、その複合体形成に起因する一連の生物学的作用を妨害するＰｒＰ、ＰｒＰ^SC、またはＰｒＰ^Cのフラグメントもしくはアナログ；ＰｒＰ^SC、ＰｒＰＢＰ、またはＰｒＰＢＰ：ＰｒＰ^SC複合体形成に関連する生物学的作用を干渉および阻止し、例えば細胞抽出物、哺乳類血清、または哺乳類細胞が培養されている生育培地に存在する、薬学的物質を含むペプチドまたは非ペプチド分子。本発明に有用なアンタゴニスト分子には、以下を含む：高親和性をもってＰｒＰ^SCに結合し、ＰｒＰ^SCを、ＰｒＰ^Cからの更なる自身のコピーの補充が不可能な状態にさせる能力を有するものとして選択された分子；高親和性をもってＰｒＰ^Cに結合し、それのＰｒＰ^SCへの転換を阻止することが可能な分子；ＰｒＰ^CとＰｒＰ^SCまたはその複合体との相互作用を阻止することにより、細胞毒性シグナルの生成を阻止することが可能な分子；隣接するＰｒＰ^C発現細胞による溶解性の毒性媒介物（例えば活性酸素類および腫瘍壊死因子）の生成を妨害することが可能な分子；またはこれらの前述の機構のいずれかの組み合わせ。例えばＰｒＰＢＰである候補のアンタゴニストの効力は、プリオン蛋白と相互作用する能力に依存する。この相互作用は、スタンダードな結合技術および機能的解析（例えば本明細書に記載のもの）をいくつでも用いて容易に分析される。一つの具体例として、候補のアンタゴニストは、インビトロでＰｒＰ^SCとの相互作用が検査される。候補のアンタゴニストの、ＰｒＰ^SCが介在する生物学的作用を変調する能力は、本明細書に記載の機能的テストのいずれによっても分析できる。本発明においては、ＰｒＰＢＰ：ＰｒＰ^SC複合体形成の減少、またはＰｒＰＢＰ：ＰｒＰ^SCが介在するインビトロでの生物学的作用の減少を促進する分子は有用だと考えられる。このような分子は、例えばプリオン疾患の発生を治療または防止する治療物質として利用できる。テストアンタゴニストが生体内インビボでプリオン疾患の発生に対する保護を供与するかどうかの評価は通常、このような疾患が発生すると知られている動物を使用して行われる（例えば、Chandler，Lancet 6:1378-1379,1961;Eklund et al.,J.Infectious Disease 117:15-22,1967;Field，Brit.J.Exp.Path.8:129-239 ,1969）。適切な動物（例えばマウスまたはハムスタ）は、スタンダードな方法に従ってテスト物質で処理される。そして、未処理のコントロール動物との比較で、プリオン関連疾患の発病率の減少または発生の遅延が、保護を表す指標として検出される。テスト物質は、以前にプリオン病原体が注入された動物に投与してもよい。またはその代わりに、プリオンおよびテスト物質を事前培養し、プリオン／テスト物質混合物をテスト動物に注入することにより、テスト物質のプリオン病原体を中和する作用を試験してもよい。プリオン疾患の治療または防止に利用される分子（例えば上述のアンタゴニスト）は、「抗プリオン治療物質」と称される。本発明による抗プリオン治療物質は、薬学的に容認される希釈剤、キャリヤ、または賦形剤と共に、投薬単位の形状で投与してもよい。例えば典型的な薬学的実施手法を用いてもよく、それによりこのような抗プリオン治療物質を、プリオン疾患を患うまたはその症候を表す前段階にある、もしくはプリオン疾患の発生の危険がある動物に投与するために適切な製剤または組成物を提供することができる。いずれの適切な投与の経路を使用してもよく、例を挙げると、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、心室内、包（関節包）内、脊髄内、（クモ膜下）槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾール、または経口の投与が考えられる。当業界で周知の製剤作成方法は、例えば”Remington's Pharmaceutical Scien ces”に記載される。非経口の投与用の製剤は例えば、賦形剤、滅菌水または塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール類、野菜由来の油類、もしくは水素添加したナフタレンを含むことが可能である。抗プリオン治療物質の放出を制御するために、生物学的適合性があり生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドのコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンのコポリマーを使用できる。抗プリオン治療物質の、他の本質的に有用な非経口の放出システムは、エチレン−ビニルアセテートのコポリマー粒子、浸透ポンプ、埋込み可能な注入システム、およびリポソームを含む。吸入用の製剤は例えばラクトースなどの賦形剤を含んでもよい。または、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレート(glycocholate)、およびデオキシコレート(deoxycholate)を含む水溶液でもよい。もしくは、点鼻薬の形状での投与のための油性溶液か、ゲル状であってもよい。本発明の方法は、例えばヒト、家庭向きのペット、または家畜などのいずれの動物においても、本明細書に記載の疾病を減少させるまたは防止することに利用できる。ヒトでない動物の治療の場合、使用する抗プリオン治療物質は、その類に特異的であることが好ましい。他の実施形態本発明は一般的に、ＰｒＰ−ＡＰ融合蛋白を用いて本明細書に記載のとおりに単離されるいずれのＰｒＰＢＰをも含み、または上述のマウスＰｒＰＢＰを用いて相同スクリーニングまたはＰＣＲ増幅によって単離されるいずれのＰｒＰＢＰをも含む。同様に本発明には、結合作用を破壊しないように修飾されたＰｒＰ− AP融合蛋白およびＰｒＰＢＰも含まれる（それらの結合作用は、例えば本明細書に記載のとおりに検査される）。これらの変形は、特定の突然変異、欠失、挿入、または翻訳後修飾を含むことができ、またはその蛋白（例えばＰｒＰＢＰ）を更に大きな融合蛋白の一構成要素として包含することを伴うこともできる。このように本発明は、他の実施形態においては、ＰｒＰＢＰポリペプチドと実質的に同一であり、適切なＰｒＰ（例えば本明細書に記載のとおりに検査されたもの）と結合するいずれの蛋白をも含む。このようなホモログ（相同体）には、以下を含む：実質的に純粋で自然に存在する他の哺乳類ＰｒＰＢＰおよび対立遺伝子バリアント；自然突然変異体；誘発変異体；高緊縮条件下で、または好適さに劣るが低緊縮条件下（例えば、２ＸＳＳＣで４０℃にて、少なくとも４０個のヌクレオチドの長さのプローブを用いた洗浄）でマウスＰｒＰＢＰのＤＮＡ配列とハイブリッド形成するＤＮＡに、コードされた蛋白；およびＰｒＰＢＰに対抗する抗血清に特異的に結合される蛋白。同じホモログという用語には、ＰｒＰＢＰ部分を含むキメラポリペプチドをも含む。本発明はさらに、自然に存在するいずれのＰｒＰＢＰポリペプチドのアナログを含む。アナログは、自然に存在するＰｒＰＢＰ蛋白とは、アミノ酸配列の相違、翻訳後修飾、またはその双方によって異なることが可能である。本発明によるＰｒＰＢＰアナログは同様に、ＰｒＰに結合する性能を保持しなければならない。本発明のアナログは一般的に、自然に存在するＰｒＰＢＰアミノ酸配列の全体または一部との、少なくとも８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％または９９％の同一性を示す。配列比較の長さは、少なくとも１５個のアミノ酸残基であり、より好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸残基であり、さらに好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸残基である。修飾は、ポリペプチドのインビボ及びインビトロでの化学的誘導体形成をも含む。その化学的誘導体形成は、例えばアセチル化、カルボキシル化、またはグリコシル化を含む。このような修飾は、ポリペプチド合成またはプロセシングの間に、または単離された修飾酵素を用いた処理に続いて実施され得る。アナログはまた、自然に存在するＰｒＰＢＰとは、一次配列における変性によって異なることが可能である。これらの変性には、自然の遺伝的バリアントおよび誘発された遺伝的バリアントの双方（例えば、放射線照射またはエタンメチル硫酸(ethanemethylsulfate)の露出によるランダムな変異誘発、もしくはSambrook,Fritsch及びManiatisによるMolecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.),CSH Press,1989またはAusubel et al.,supra に記載の部位特異的突然変異誘発から得られるもの）を含む。さらに変性には、例えばＤ−アミノ酸残基、もしくは、βまたはγアミノ酸などの自然に存在しない又は合成のアミノ酸であるＬ−アミノ酸以外の残基を包含する、環化されたペプチド、分子、およびアナログが含まれる。ポリペプチド全体に加え、本発明はＰｒＰＢＰフラグメントをも含む。本明細書にて使用するとおり、「フラグメント」という用語は、少なくとも５個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０個の連続的なアミノ酸を意味し、さらに好ましくは少なくとも５０個の連続的なアミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも６０個から８０個もしくはそれ以上の連続的なアミノ酸を意味する。ＰｒＰＢＰのフラグメントは、当業者に知られている方法によって生成され得るし、もしくは通常の蛋白プロセシング（例えば、発生期のポリペプチドからの、生物学的作用には必要のないアミノ酸の除去、もしくは、選択的ｍＲＮＡスプライシングまたは選択的蛋白プロセシング事象によるアミノ酸の除去）から得ることができる。本明細書に記載された全ての刊行物および特許出願を、各刊行物および特許出願に対して個別に明確に引用して援用するとの旨を記した場合と同様に、本願に引用して援用する。他の実施形態は、請求の範囲内である。

【手続補正書】【提出日】平成１０年１２月４日（１９９８．１２．４）【補正内容】（１）明細書第１２頁１２行、第２１頁１７行に記載の「図７」を『図７Ａ及び７Ｂ』に補正する。（２）明細書第１３頁３行に記載の「（前進プライマー）」を『（前進プライマー）（配列番号３）』に補正する。（３）明細書第１３頁５行に記載の「（逆向きプライマー）」を『（逆向きプライマー）（配列番号４）』に補正する。（４）明細書第２７頁１５行に記載の「（前進プライマ）」を『（前進プライマー）（配列番号５）』に補正する。（５）明細書第２７頁１７行に記載の「（逆向きプライマ）」を『（逆向きプライマー）（配列番号６）』に補正する。（６）明細書第３８頁２９行に記載の「請求の範囲内である。」の次に下記の通り配列表を追加する。（７）図３を別紙の通り補正する。【図３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｌ 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims

【特許請求の範囲】１．プリオン蛋白の存在に関連した疾病の治療に使用し得る治療物質を同定する方法であって、ａ）テスト物質の存在下で選択されたプリオン結合蛋白のＰｒＰ^SC又はＰｒＰ^C に対する結合量を測定し、ｂ）前記テスト物質の非存在下で選択されたプリオン結合蛋白の前記ＰｒＰ^SC 又は前記ＰｒＰ^Cに対する結合量を測定し、ここで、テスト物質の存在下で選択されたプリオン結合蛋白のＰｒＰ^SC又はＰｒＰ^Cに対する結合量が、前記テスト化合物の非存在下で選択されたプリオン結合蛋白の前記ＰｒＰ^SC又は前記ＰｒＰ^Cに対する結合量よりも低いときに、前記テスト化合物が、プリオン蛋白の存在に関連した疾病の治療に使用し得る治療物質であることが示される方法。２．前記選択されたプリオン結合蛋白がカドヘリンであることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。３．前記カドヘリンがプロトカドヘリン４３であることを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。４．前記カドヘリンがＯＢ−カドヘリン−１であることを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。５．前記選択されたプリオン結合蛋白が配列番号２の配列を有することを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。６．プリオン結合蛋白をコードする核酸分子を同定する方法であって、ａ）哺乳動物ｃＤＮＡ分子の集合物を形質導入したカエルの卵母細胞の個体群を準備し、ｂ）検出可能に標識されたＰｒＰに前記カエルの卵母細胞の個体群を接触させ、ｃ）検出可能に標識されたＰｒＰに結合したカエルの卵母細胞を選択し、ｄ）前記ｃ工程において選択された卵母細胞内に存在するｃＤＮＡと同一のｃＤＮＡ分子が形質導入されたカエルの卵母細胞の第二の個体群を調整し、ｅ）検出可能に標識されたＰｒＰにカエルの卵母細胞の前記第二の個体群を接触させ、ｆ）前記第二の個体群中で検出可能に標識されたＰｒＰに結合するカエルの卵母細胞を同定し、ｇ）前記ｆ工程で同定されたカエルの卵母細胞を形質導入するために使用したｃＤＮＡと同一のｃＤＮＡ分子を取得する、ことを含む方法。７．ＰｒＰと、全ての又は一つのアルカリフォスファターゼ蛋白とを含む融合蛋白。８．生物学的サンプルからＰｒＰ^SCを回収する方法であって、ａ）ＰｒＰ^SCとＰｒＰ結合蛋白との間で複合体が形成可能な条件において、前記生物学的サンプルを請求の範囲１のＰｒＰＢＰと接触させ、ｂ）生物学的サンプルからＰｒＰ^SC−ＰｒＰ結合蛋白複合体を回収する、ことを含む方法。９．プリオン蛋白の存在に関連した疾病を治療する方法であって、前記方法が、カドヘリン全体又はカドヘリンのＰｒＰ結合部分を投与することを含む方法。１０．前記カドヘリンがプロトカドヘリン４３であることを特徴とする請求の範囲９に記載の方法。１１．前記カドヘリンがＯＢ−カドヘリン−１であることを特徴とする請求の範囲９に記載の方法。１２．前記選択されたプリオン結合蛋白が配列番号２の配列を有することを特徴とする請求の範囲１０に記載の方法。１３．選択されたカドヘリンとＰｒＰ^Cと間の望ましくないレベルの相互作用に関連する疾病の治療に使用し得る治療用物質を同定する方法であって、ａ）テスト化合物存在下で、前記選択されたカドヘリンのＰｒＰ^Cに対する結合量を測定し、ｂ）前記テスト化合物非存在下で、前記選択されたカドヘリンのＰｒＰ^Cに対する結合量を測定し、前記テスト化合物存在下で前記選択されたカドヘリンのＰｒＰ^Cに対する結合量が低下している場合に、前記テスト化合物が前記選択されたカドヘリンとＰｒＰ^Cと間の望ましくないレベルの相互作用に関連する疾病の治療に使用し得る治療用物質であることを示す方法。１４．カドヘリンとＰｒＰ^Cと間の望ましくないレベルの相互作用に関連する疾病の治療方法であって、カドヘリン全体又はカドヘリンのＰｒＰ^C結合部分を投与することを含む方法。１５．疾病は癌であることを特徴とする請求の範囲１４に記載の方法。１６．疾病は神経変性疾患であることを特徴とする請求の範囲１５に記載の方法。１７．疾病は免疫学的疾患であることを特徴とする請求の範囲１５に記載の方法。１８．前記カドヘリンがプロトカドヘリン４３であることを特徴とする請求の範囲１５に記載の方法。１９．カドヘリンがＯＢ−カドヘリン−１であることを特徴とする請求の範囲１５に記載の方法。