JPH08500491A

JPH08500491A - βＡＰＰ−Ｃ１００受容体のクローニングおよび発現

Info

Publication number: JPH08500491A
Application number: JP6507417A
Authority: JP
Inventors: ピー．マンリー，スーザン; アール．コズロースキー，マイケル; エル．ニーヴ，レイチェル
Original assignee: ブリストル−マイヤーズスクイッブカンパニー; マクリーンホスピタルコーポレーション
Priority date: 1992-08-31
Filing date: 1993-08-31
Publication date: 1996-01-23
Also published as: CA2143325C; US5854392A; HUT70456A; NZ256188A; AU689441B2; EP0659217A4; EP0659217B1; ATE252636T1; FI950883L; DE69333261D1; WO1994005811A1; FI950883A7; EP0659217A1; CA2143325A1; AU4843493A; FI950883A0; ES2208643T3; DE69333261T2; HU9500619D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、βＡＰＰ−Ｃ１００受容体（Ｃ１００−Ｒ）のクローニング、およびＣ１００−Ｒを発現する遺伝子操作された宿主細胞に関する。この遺伝子操作された細胞は、アルツハイマー病に関係のあるβ−ＡＰＰの類似体および薬剤を評価してスクリーニングするのに用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】 βＡＰＰ−Ｃ１００受容体のクローニングおよび発現１．序論本発明は、（アミロイドドメインを含む）β−アミロイド前駆体タンパク質のカルボキシ末端の受容体（ここではＣ１００−Ｒと呼ぶ）のクローニング、ならびにＣ１００−Ｒを発現する遺伝子操作された宿主細胞に関する。このような遺伝子操作細胞は、アルツハイマー病の診断および／または治療に用いる薬剤を評価したり、スクリーニングするのに用いられる。２．発明の背景アルツハイマー病は老人に最も多く見られる痴呆を引き起こす神経変性疾患である。この病気は脳、特に側頭皮質と海馬に、そして大脳血管系の壁に沿ってアミロイド含有斑が蓄積する点に特徴がある（Rochら，1966，Nature 209：109-11 0；Terryら，1981，Ann．Neurol．10:184-192；Glenner G.G., 1983，Arch．Pat hol．Lab．Med．107:281-282；Katzman,R., 1983,Banbury Report15，Cold Spri ng Harbor Lab.,Cold Spring，N．Y．）。脳のアミロイド含有斑に含まれるアミロイドペプチド（βＡ４）は、アミロイド（またはβ−アミロイド）前駆体タンパク質（βＡＰＰ）と呼ばれるタンパク質に由来するものである。βＡＰＰは通常そのＣ末端の近傍にあるアミロイドドメイン内で切断されるため、完全なアミロイドは産生されない。別のプロセシング経路はアミロイドドメインのＮ末端側でβＡＰＰを切断して完全なＣ末端を放出させ、これによりアミロイド前駆体タンパク質の完全なアミロイドペプチド（ βＡ４）を生じる（Glenner andWong，1984，Biochem．Biophys．Res．Commun． 120:885-890；Masters ら，1985，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:4245-4249）最近の知見からは、βＡＰＰの異常なプロセシングがアルツハイマー病で起こるニューロン変性の原因となることが示唆されている。Neveと共同研究者達は、アルツハイマー病における一次βＡＰＰプロセシングがβ／Ａ４配列のアミノ末端の切断であり、これはβＡＰＰのカルボキシ末端の１０４アミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列から発現される１００アミノ酸残基のカルボキシ末端βＡＰＰ断片（βＡＰＰ−Ｃ１００）をもたらすことを提唱した（Yankner ら，1989，Scie nce 245:417-420）。以後、このβＡＰＰ断片は、それがβＡＰＰのカルボキシ末端の１００アミノ酸残基をコードするｃＤＮＡ配列から発現されようと１０４アミノ酸残基をコードするｃＤＮＡ配列から発現されようと、βＡＰＰ―Ｃ１００と呼ぶことにする。霊長類の細胞でβＡＰＰ−Ｃ１００ペプチドを発現させると、アミロイド様繊維の形成をもたらす沈積物のような構造へと凝集して蓄積するタンパク質が産生されることが分かっている（Wolfら，1990，EMBO J．9:2079 -2084 ）。また、βＡＰＰ−Ｃ１００を発現するレトロウイルス組換え体は、ＮＧＦ（神経成長因子）の添加により分化するように誘導されたＰＣ−１２細胞にトランスフェクトしたとき、神経毒性であることが判明した。さらに、トランスフェクトしたこれらの細胞から得られた調整培地は分化した神経芽細胞腫や神経細胞に対して毒性を示し、この神経毒性はβＡＰＰ−Ｃ１００に対する抗体を用いて免疫吸着することにより培地から取り除かれた。このことは、βＡＰＰ−Ｃ１００がトランスフェクトした細胞から分泌され、神経毒であることを示唆するものである（Ya nkner ら，1989，Science 245:417-420 ）。βＡＰＰ−Ｃ１００の毒性は、このペプチドを発現する細胞を生まれたてのマウスの脳に移植することによって、あるいはヒトβＡＰＰ−Ｃ１００の遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの作出によってさらに実証されている（Neveら，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 89:3448-3452 ）。これらの知見を総合すると、アルツハイマー病での神経変性の発生においてβＡＰＰ−Ｃ１００が何らかの役割を担っていることが明らかである。 βＡＰＰ−Ｃ１００ペプチドおよびアルツハイマー病の発症におけるその生物学的役割に大きな関心が寄せられているにもかかわらず、このタンパク質、受容体、またはβＡＰＰ−Ｃ１００ペプチドが神経毒性を示すために相互作用する他の組織要素についてはほんのわずかしか知られていない。ごく最近になって、分化したＰＣ−１２細胞の表面へのβＡＰＰ−Ｃ１００の高親和結合が実証され、神経毒性との相互関係が明らかにされた（Kozlowskiら，1992，J．of Neuroscie nce 12:1679-1687 ）。結合相互作用と神経毒性反応の出現は両方とも同一のｐＨに依存する。その上、ＰＣ−１２細胞では、結合と神経毒に対する感受性とがＮＧＦ誘導分化の間に同じ時間経過でもって現れる。さらに、神経毒作用を消滅させるβＡＰＰ−Ｃ１００ペプチドの１個のアミノ酸の変化（Tyr₆₈₇からPheへの変化）が結合能をも失わせる。しかしながら、結合に関与する分子種は同定も特性決定もなされていない。βＡＰＰ−Ｃ１００の結合部位または受容体をコードするｃＤＮＡクローンの単離は、Ｃ１００−Ｒの生物学的機能ならびにアルツハイマー病の発症におけるその役割を調べることを目的とした研究を進展させるだろう。ところが、これまで、このようなことは達成されていない。３．発明の概要本発明は、Ｃ１００−Ｒの遺伝子およびタンパク質に関するものである。βＡＰＰ−Ｃ１００とＣ１００−Ｒとの相互作用により生じる神経毒作用は、この特定の受容体／リガンドの相互作用をブロックするように設計された治療応用物がアルツハイマー病の治療に有効でありうることを示唆する。本明細書中で開示されたＤＮＡ配列は、Ｃ１００−Ｒ生産用に設計された発現系および／またはＣ１００−Ｒを発現する細胞系へと遺伝子操作することができる。こうした細胞系は β−ＡＰＰ類似体（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）のスクリーニングおよび同定に有利に使用することができよう。本発明の別の面によると、Ｃ１００−ＲのＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列、またはＣ１００−Ｒに対する抗体を含むアンタゴニストがアルツハイマー病の診断および治療に使用され得る。Ｃ１００−Ｒトランスジーンを含むトランスジェニック動物は、in viv oでβ−ＡＰＰ−Ｃ１００類似体を評価するためのモデル動物として使用することができる。本発明は、部分的には、ニューロン由来の細胞の表面に発現されるβＡＰＰ−Ｃ１００結合部位の発見、同定およびクローニングに基づいている。この結合部位は、本明細書ではＣ１００−Ｒと呼ばれるもので、ペプチドβ ＡＰＰ−Ｃ１００の神経毒作用の仲介に深く係わっていることを示す特徴を有している。また、本発明は、アルツハイマー病の診断および治療用薬剤の設計に有用でありうるＣ１００−ＲをコードするｃＤＮＡクローンの単離および特性決定に基づいている。４．図面の簡単な説明図１． βＡＰＰ−Ｃ１００による(A)ＮＧＦ処理（５ｄ）ＰＣ１２細胞および(B)ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞への³⁵Ｓ−βＡＰＰ−Ｃ１００結合の阻害を示す代表的曲線。図２．ＮＧＦ処理（６ｄ）ＰＣ１２細胞への³⁵Ｓ−βＡＰＰ−Ｃ１００結合の代表的飽和等温線（上のパネル）およびスカッチャードプロット（下のパネル）。線はコンピュータにより作成したもので、最良のデータ解釈を表す。図３．直接結合法を用いたλｇｔ１１ラットｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング。図４．ラットＣ１００−ＲクローンＡＢ１ＲのｃＤＮＡ挿入部のヌクレオチド配列。下線を引いた領域はＳＥＲ／ＴＨＲキナーゼの“サイン（signature） ”または保存された触媒コア配列を表す。図５．Ｃ１００−Ｒと (A)“Ｂ”型カルシウムチャンネル、(B)カルレチクリン（calreticulin）、および(C)リアノジンカルシウムチャンネルとの間の配列相同性。図６．ＡＢＩＲｃＤＮＡのサザンブロット分析。レーンＡはEcoRI消化ヒトＤＮＡである。レーンＢはEcoRI消化マウスＤＮＡである。レーンＣは HindII I消化マウスＤＮＡである。レーンＤは HindIII消化ヒトＤＮＡである。λ／Hin dIII マーカーを用いて分子量を決定した。図７． (A)前方レベルおよび(B)中央から後方レベルでのラット脳切片への特異的結合を代表するオートラジオグラフ。より高い結合レベルの領域がより明るくなるように、画像をデジタル化して強調した。嗅結節のある領域（(A)の切片の下方部分）および海馬（(B)の切片の中央−側方部分）は灰白質残部の比較的均一な標識化に比べて際立っていることに注目されたい。図８．ｐＡＢ１Ｒアンチセンスプローブのin situハイブリダイゼーションを代表するオートラジオグラフ。切片の位置および再現方法は図７と同じである。結合オートラジオグラフィー（図７）からの結果と一致する嗅結節および海馬の高標識化領域（最も明るい領域）に注目されたい。図９．ラットＣ１００−ＲクローンＡＢ２ＲのｃＤＮＡ挿入部のヌクレオチド配列。ヌクレオチド31からヌクレオチド409までの EcoRI断片を使ってヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。図10．ラット１００−Ｒクローンのヌクレオチド配列。記載した配列は多数の重複するラットｃＤＮＡクローンのクローニングおよび配列解析の結果である。ヌクレオチド686 の上に示した＊は、図４に示したラットＣ１００−Ｒヌクレオチド配列（ヌクレオチド40）との接合部を表す。図11．ヒトＣ１００−ＲクローンのｃＤＮＡ挿入部のヌクレオチド配列。Ｍを指定したヌクレオチドはＡかまたはＣであり、Ｋを指定したヌクレオチドはＴかまたはＧである。図12Ａ．ヒトＣ１００−ＲとラットＣ１００−Ｒとの配列相同性。ヒト＃４．ｔ３配列と、ヌクレオチド544で出発する図９に示したラットＣ１００−Ｒ配列とを並列化させてある。図l2Ｂ．ヒトＣ１００−ＲとラットＣ１００−Ｒとの配列相同性。ヒトクローンＨＡＢ１Ｒ＃１＃４と、ヌクレオチド182で出発する図４に示したラットＣ１００−Ｒ配列とを並列化させてある。図12Ｃ．ヒトＣ１００−ＲとラットＣ１００−Ｒとの配列相同性。ヒトクローン＃１＃１Ｔ３と、ヌクレオチド1868で出発する図４に示したラットＣ１００ −Ｒ配列とを並列化させてある。５．発明の詳細な説明本発明はＣ１００−Ｒのクローニングおよび発現に関する。Ｃ１００−Ｒは最初はニューロン由来の細胞の表面に存在してアミロイドペプチドβＡＰＰ−Ｃ１００と特異的に結合する結合部位として同定された。βＡＰＰ−Ｃ１００アミロイドペプチドの発現は、アルツハイマー病で起こる特殊なタイプのニューロン変性と関係があることがモデル動物ではっきりしている。本発明により調製されたＣ１００−Ｒは、アルツハイマー病の診断および／または治療に使用しうる薬剤およびβ−ＡＰＰの類似体を評価し、スクリーニングするのに用いられる。 5.1. Ｃ１００−Ｒコード配列 λＡＢ１Ｒと呼ばれる最初のラットＣ１００−ＲｃＤＮＡクローンは、³⁵Ｓ− メチオニンで標識したβ−ＡＰＰ−Ｃ１００リガンドまたはペプチドエピトープ “フラッグ（flag）”配列を用いて下記の第６節に記載するようにλｇｔ１１ラット脳発現ライブラリーをスクリーニングすることにより得られた。ｐＡＢ１Ｒ −ラットと称する最初のクローンは、図４に示したヌクレオチドコード配列から成る1970bpの挿入部および推定アミノ酸配列を含むことがわかった。対応するｃＤＮＡクローンはＡＴＣＣに寄託し、第７節に記載する受託番号を指定された。配列解析から、このクローンは該遺伝子のカルボキシ末端部分を含有し、かつ13 95塩基対のコード配列と575bpの３’非翻訳配列を含むことが明らかになった（図４）。ラット脳から調製したＲＮＡ（ＡＢ１ＲｃＤＮＡ挿入部の最も５’側の配列に特異的なプライマーを使って、逆転写酵素反応により第１鎖の合成を行った。第２鎖の合成後、ｃＤＮＡを細菌のBluescriptプラスミド（Stratagene）に挿入した。追加のラットＣ１００−ＲｃＤＮＡクローンを単離し、配列を決定した（図９および図10）。新たな配列は図４に示したラット配列と重なり合い、コード領域をＣ１００−Ｒタンパク質のアミノ末端の方へ伸長させる。図９に示した配列は図10に示したラット配列とヌクレオチド106の上流で異なっており、このことは異なる過程でスプライスされたｍＲＮＡがＣ１００−Ｒクローンに存在しうることを示すものである。Ｃ１００−Ｒへの相同についてGenebankのヌクレオチド配列データベースを検索したところ、“Ｂ”型カルシウムチャンネル、リアノジンカルシウムチャンネル、および高親和カルシウム結合タンパク質のカルレチクリンとの多くの一致が明らかになった（図５）。Ｃ１００−Ｒとカルシウムチャンネルの間の相同は、結合の異常なｐＨ依存およびニューロン（特に皮質と海馬）のカルシウムレベルの混乱が神経毒をもたらすという観察と一致する。Ｃ１００−ＲのｃＤＮＡ配列はまた、Hanksら（1988，Science241:42-52）によって記載されたＳＥＲ／ＴＨＲキナーゼの“サイン”または保存された触媒コア配列への相同を含んでいる（図４）。ノーザンブロットでの11KbのＣ１００−ＲｍＲＮＡの検出により示されるように、図４に示したヌクレオチド配列はＣ１００−Ｒ遺伝子の一部を表すにすぎない。全長ラットＣ１００−ＲｃＤＮＡ配列は多くの異なる方法を使って得ることができる。例えば、ラットクローンの最も５’側の配列に特異的なプローブを使ってラットｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングする。成功した各回のスクリーニングごとに新しい５’プローブを設計し、これを用いて完全な配列が得られるまでライブラリーを再度探索する。全長ラットＣ１００−Ｒ遺伝子を単離するのにＰＣＲの技法も使用し得る。適当なラット源から調製したＲＮＡを用いると、ラットｃＤＮＡ挿入部の最も５’ 末端側に特異的なプライマーを使って逆転写酵素反応で第１鎖合成を開始させることができる。次に、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにターミナルトランスフェラーゼを使ってグアニンを“末端付加（tailed）”させ、RNAase Hで消化し、その後ポリＣプライマーを用いて第２鎖の合成を開始させる。特定の制限部位を組み込んだプライマーを用いることにより、これらの“クローン特異的”ｃＤＮＡの適当なプラスミドベクターへの挿入および配列決定が容易になる。また、本発明は、Ｃ１００−Ｒ活性が存在する他の動物種（ヒトを含む）から単離されたＣ１００−Ｒ遺伝子に関する。Ｃ１００−Ｒファミリーのメンバーは、本明細書では、βＡＰＰ−Ｃ１００または該ペプチドの断片と結合する受容体と定義される。かかる受容体はＤＮＡ配列の実質的な範囲においてヌクレオチドレベルで約80％の相同を示し、アミノ酸レベルでは90％もの相同を示す。バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーは、低いストリンジェント条件下で、ラットＣ１００−Ｒクローンの放射性標識断片を用いてスクリーニングし得る。また、ラットＣ１００−Ｒ配列を用いて、ＰＣＲプローブとして使える縮重または完全縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計したり、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた戦略はヒトＣ１００−Ｒのクローニングに使用し得る。ラットＣ１００−Ｒとカルシウムチャンネル間の保存モチーフに対応する縮重オリゴヌクレオチドの２つのプールを設計して、ＰＣＲ反応においてプライマーとして役立てることができる。この反応で用いる鋳型はヒトＡＰＰ−Ｒを発現することが知られている細胞系または組織から調製したｍＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡである。ＰＣＲ産物をサブクローニングし、配列決定により増幅配列がＣ１００−Ｒ配列を表すことを確認する。ＰＣＲ増幅断片を放射性標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより全長Ｃ１００− ＲｃＤＮＡクローンを単離し得る。また、標識断片を使ってゲノムライブラリーをスクリーニングすることもできる。採用し得るクローニング戦略を検討する際には、例えば、Maniatis，1989，Molecula r Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press，N.Y. および A usubelら，1989，Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.）を参照のこと。また、ｃＤＮＡライブラリーは、ＣＯＳ細胞に移入したとき、高コピー数のプラスミドの発現を可能にするＳＶ４０複製起点の配列を含むｐｃＤＮＡ１のような哺乳動物の発現ベクター中に構築することもできる。トランスフェクトしたＣＯＳ細胞の表面上のＣ１００−Ｒの発現は、βＡＰＰ−Ｃ１００のような標識リガンドあるいは放射性標識、蛍光標識または酵素で標識したβＡＰＰ−Ｃ１００アゴニストの使用を含む多くの方法で検出することができる。ヒトＣ１００−Ｒを発現する細胞はトランスフェクトした細胞をＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）選別に付すことにより濃縮できる。ここに記載する特定の実施態様では、ラットＣ１００−Ｒクローンからの標識ヌクレオチド断片を用いて成人海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ヒトｃＤＮＡライブラリーを探索するにあたって、ＡＢ２Ｒラットクローンのヌクレオチド31からヌクレオチド409までの大きいEcoRI 断片を用いた（図９）。いくつかのクローンが得られ、ｃＤＮＡ挿入部の配列を決定した。図11にヒトＣ１００−Ｒ配列を示し、図12にラットとヒトのＣ１００−Ｒ配列間の相同領域を示してある。全長ラットＣ１００−Ｒクローンを単離するための上記方法はどれも全長ヒトＣ１００−Ｒクローンの単離にも同様に使用できる。例えば、ヒトクローンの最も５’側の配列に特異的なプローブを用いてヒトｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングする。成功した各回のスクリーニングごとに新しい５ ’プローブを設計し、これを用いて完全な配列が得られるまでライブラリーを再度探索する。本発明によれば、Ｃ１００−Ｒ、その断片、融合タンパク質または機能的均等物をコードするヌクレオチド配列を用いて、適当な宿主細胞においてＣ１００− Ｒまたはその機能的に活性なペプチド、融合タンパク質もしくは機能的均等物を発現する組換えＤＮＡ分子を作製することができる。また、Ｃ１００−Ｒ配列の一部にハイブリダイズするヌクレオチド配列を、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析などに使用することもできる。本発明の実施に際しては、遺伝暗号の縮重のため、Ｃ１００−Ｒのアミノ酸配列（例えば、図４に示したラット配列またはその機能的均等物）を実質的にコードする他のＤＮＡ配列もＣ１００−Ｒのクローニングおよび発現のために使用できる。このようなＤＮＡ配列として、ストリンジェント条件下でラットまたはヒトＣ１００−Ｒ配列にハイブリダイズする能力があるもの、あるいは遺伝暗号の縮重がなかったならばストリンジェント条件下でハイブリダイズし得ると推測されるものが含まれる。ストリンジェント条件はいろいろな方法で調整することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う場合は、鋳型へプライマーをアニーリングさせる温度または反応緩衝液中のＭｇＣｌ₂の濃度を調整する。放射性標識したＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドを用いてフィルターを探索する場合には、洗浄液のイオン強度を変えたり、フィルター洗浄の実施温度を慎重に制御することによってストリンジェンシーを調整できる。本発明において使用し得る改変ＤＮＡ配列は、同一のまたは機能的に均等な遺伝子産物をコードする配列をもたらすような、さまざまなヌクレオチド残基の欠失、付加または置換を含んでいる。遺伝子産物それ自体が、サイレントな変化を生じるアミノ酸残基の欠失、付加または置換をＣ１００−Ｒ配列内に含んでいてもよく、これらは機能的に均等なＣ１００−Ｒをもたらす。こうしたアミノ酸の置換は関係した残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性が類似していることを考慮して行われる。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸を、正に荷電したアミノ酸としてはリシンおよびアルギニンを、そして類似の親水値を有する非荷電極性ヘッド基をもつアミノ酸としてはロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシン；を挙げることができる。本明細書中で用いる機能的に均等なＣ１００−Ｒとは β−ＡＰＰ−Ｃ１００またはその断片と結合する受容体を指すが、必ずしも天然のＣ１００−Ｒと同じ結合親和性で結合しなくてもよい。本発明のＤＮＡ配列は、遺伝子産物のプロセシングおよび発現を改変する変化を含むがこれに限らない種々の目的のために、Ｃ１００−Ｒコード配列を改変すべく遺伝子操作することができる。例えば、新たな制限部位を挿入するために、またはグリコシル化パターン、リン酸化などを変えるために、部位特異的突然変異誘発のような公知の技法を用いて変異を導入し得る。一例として、酵母のようなある種の発現系では、宿主細胞が遺伝子産物を過剰にグリコシル化することがある。こうした発現系を用いるときは、Ｎ−結合グリコシル化部位を除くようにＣ１００−Ｒコード配列を改変することが好ましい。本発明の他の実施態様では、融合タンパク質をコードするように、Ｃ１００−Ｒまたは改変Ｃ１００−Ｒ配列を異種配列に連結させることもできる。融合タンパク質はＣ１００−Ｒ配列と異種タンパク質配列との間に切断部位を挿入するように操作してもよく、こうするとＣ１００−Ｒを異種成分から切り離すことができる。本発明の別の実施態様では、Ｃ１００−Ｒのコード配列を全部または部分的に、当分野で公知の化学的方法を使って合成することもできる。例えば、Caruther s ら，1980，Nuc．Acids Res．Symp．Ser．7:215-233；Crea and Horn，180，Nu c．Acids Res．9(10):2331；Matteucci and Caruthers，1980，Tetrahedron Let ters 21:719;および Chow and Kempe，1981，Nuc．Acids Res．9(12):2807-2817 を参照のこと。また、タンパク質自体を化学的方法を使って製造して、Ｃ１００ −Ｒのアミノ酸配列を全体的にまたは部分的に合成することもできる。例えば、ペプチドを固相法により合成し、樹脂から切り離し、そして分離用高性能液体クロマトグラフィーで精製し得る。例えば、Creighton，1983，Proteins，Structu res And Molecular Principles，W.H.Freeman and Co.，N.Y．pp．50-60を参照のこと。合成ペプチドの組成はアミノ酸の分析または配列決定法（例えば、エドマン分解法；Creighton，1983，Proteins，Structures And Molecular Principles，W. H. Freeman and Co.，N.Y．pp．34-49を参照のこと）により確かめることができる。 5.2 C100-Rの発現生物学的に活性なC100-Rを発現するためには、C100-Rをコードするヌクレオチド配列、または上記5.l の項に記載したような機能的なその均等物を適当な発現べクター、即ち、挿入されたコード配列の転写及び翻訳のための必要な要素を含むベクターに挿入する。C100-R遺伝子産物、並びに組換えC100-R発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞または細胞系は、種々の目的に使用することができる。これらは、限定するものではないが、競争的に結合を阻害しβAPPまたはβAPPの断片のβ-APP活性を「中和」するものを含む、受容体に結合する抗体（即ちモノクローナルまたはポリクローナル）の生産、及びβ−AP P類似体またはC100-Rを介して作用する薬剤のスクリーニング等を包含する。 5.2.1 発現系当業者によく知られた方法を、C100-Rコード配列及び適当な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するのに使用できる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA 法、合成法及びインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatisら，1989，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spri ng Harbor Laboratory，N.Y.及びAusubel ら，1989，Current Protocols in Mol ecular Biology，Greene Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y. に記載された技術を参照されたい。種々の宿主−発現ベクター系をC100-Rコード配列を発現するのに利用することができる。これらには、限定するものではないが、 C100-Rコード配列を含む、組換え体バクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターにより形質転換された細菌、C100-Rコード配列を含む組換え体酵母発現ベクターで形質転換された酵母、C100-Rコード配列を含む組換え体ウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞系、C100-Rコード配列を含む組換え体ウィルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウィルス，CaMV；タバコモザイクウィルス，TMV）を感染させた、もしくは組換え体プラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換された植物細胞系、二重微細（double-minute）クロモソームにおいて安定に増幅されたか（例えばCHO/dhfr）、あるいは不安定に増幅された（例えばネズミ細胞系）、C100-R DNAの多数のコピーを含むように作製された細胞系を含む、組換え体ウィルス発現ベクター（例えばアデノウィルス、ワクシニアウィルス）を感染させた動物細胞系が含まれる。これらの系の発現要素は、その強度及び特異性において変化する。使用する宿主／ベクター系に応じて、構成的なプロモーター及び誘導可能なプロモーターを含む、多数の適当な転写及び翻訳要素の任意のものを発現ベクター中に使用することができる。例えば、細菌系中にクローン化する場合は、バクテリオファージ λのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）等のような誘導可能なプロモーターを使用することができる。昆虫細胞系中にクローン化する場合には、バキュロイウィルスポリヘドリンプロモーターのようなプロモーターを使用することができる。植物細胞系中にクローン化する場合には、植物細胞のゲノムから誘導されたプロモーター（例えば熱ショックプロモーター、RUBISCO の小サブユニットのためのプロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のためのプロモーター）あるいは植物ウィルスから誘導されたプローター（例えばCaMV の35S RNAプロモーター、TMV のコートタンパク質プロモーター）を使用することができる。哺乳類細胞系中にクローン化する場合には、哺乳類細胞のゲノムから誘導されたプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウィルスから誘導されたプロモーター（例えばアデノウィルス後期プロモター、ワクシニアウィルス7.5Kプロモーター）を使用することができる。C100-R DNA の多数のコピーを含む細胞系を生成する場合には、SV40、BPV 及びEBV に基づくベクターを適当な選択可能なマーカーとともに使用することができる。細菌系においては、発現されたC100-Rに意図される用途に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の生産のために多量のC1 00-Rを製造する場合は、容易に精製できる融合タンパク質生成物の高いレベルの発現を導くベクターが望ましい。このようなベクターは、限定するものではないが、E．coli発現ベクターpUR278（Rutherら，1983，EMBO J.2:1791）が含まれ、ここではC100-Rコード配列をlacZコード領域と同じ読み枠でベクターに結合しハイブリッドC100-R/lacZ タンパク質が生産されるようにすることことができ、またpINベクター（Inouye & Inouye，1985，Nucleic acids Res．13:3101-3109；V an Heeke & Schuster，1989，J．Biol．Chem．264:5503-5509）等も含まれる。p GEXベクターも、外来ポリペプチドをグルタチオンS- トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現するのに使用できる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、アフィニティークロマトグラフィーにより、例えばグルタチオン−アガロースビーズに対する吸着及びその後の遊離のグルタチオンの存在下における溶出により、溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターはトロンビンあるいはXa因子プロテアーゼ開裂部位を含み、対象となるクローン化ポリペプチドをGST 部分から放出できるように設計されている。Booth ら，1988，Immunol Lett．19:65-70;及びGardellaら，1990，J.Biol．Chem．265：15854-15859；Pritchett ら，1989，Biotechnique s 7:580も参照されたい。酵母においては、構成的なあるいは誘導可能なプロモーターを含む多くのベクターを使用することができる。概観するためには、Current Protocols in Molec ular Biology，Vol．2，1988，Ed．Ausubel ら，Greene Publish．Assoc．& Wil ey Interscience，Ch.13；Grantら，1987，Expression and Secretion Vectors for Yeast，in Method in Enzymoloogy，Eds．Wu & Grossman，1987，Acad．Pre ss，N.Y.，Vol．153，pp．516-544；Glover，1986，DNA Cloning，Vol．II，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch．3;及びBitter，1987，Heterologous Gene Expressio n in Yeast，Mehtods in Enzymology，Eds．Berger & Kimmel，Acad．Press，N. Y.，Vol．152，pp．673-684；及びThe Molecular Biology of the Yeast Saccha romyces，1982，Eds．Strathernら，Cold Spring Harbor Press，Vols．Ｉ及びI Iを参照されたい。植物発現ベクターを使用する場合は、C100-Rコード配列の発現は多数のプロモーターの任意のもので駆動することができる。例えば、CaMVの35 S RNA及び19S RNAプロモーター（Brissoｎら，1984，Nature 310:511-514）、あるいはTMVのコートタンパク質プロモーター（Takamatsuら，1987，EMBO J．6:30 7-311）のようなウィルスプロモーターを使用でき、あるいは、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーター（Coruzziら，1984，EMBO J．3：1671-1680 ；Broglieら，1984，Science 224:838-843）；あるいは熱ショックプロモーター、例えば大豆hsp17.5-E あるいはhsp-17.3-B （Gurleyら，1986，Mol．Cell．Bi ol．6:559-565）を使用することができる。これらの構築物は、Tiプラスミド、R iプラスミド、植物ウィルスベクター、直接のDNA形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を使用して植物細胞に導入することができる。このような技術の概観のためには、例えば、Weissbach & Weissbach，1988，M ethods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp ．421-463；及びGrierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed．，Blackie，London，Ch．7-9を参照されたい。 C100-Rを発現するのに使用できるまた別の発現系は昆虫系である。１つのそのような系においては、Autographa californica核多角体病ウィルス（AcNPV）を外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用することができる。該ウィルスはSpodoptera frugiperda細胞中で増殖する。C100-Rコード配列をこのウィルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中にクローン化し、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。C100-R コード配列をうまく挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子の不活性化と非封入組換え体ウィルス（即ち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされたタンパク質コートを欠いているウィルス）の生産が得られる。これらの組換え体ウィルスを次にSpodoptera frugiperda細胞に感染するのに使用し、この中で挿入された遺伝子が発現される（例えば、Smithら，1983，J．Viol．46:584；Smith，米国特許第4,215,051 号を参照）。哺乳類宿主細胞においては、ウィルスをベースとする多くの発現系を使用することができる。アデノウィルスを発現ベクターとして使用する場合は、C100-Rコード配列を、アデノウィルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び三分割リーダー配列に結合することができる。このキメラ遺伝子は次に、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウィルスゲノムに挿入することができる。ウィルスゲノムの非必須領域（例えばE1またはE3領域）に挿入することにより、生存可能で、感染した宿主中でC100-Rを発現できる組換え体ウィルスを得ることができる（例えば、Logan & Shenk，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA ）81:3655-3659を参照）。あるいは、ワクシニア7.5Kプロモーターを使用することができる（例えば、Mackettら，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）79:74 15-7419；Mackettら，1984，J．Virol．49:857-864；Panicaliら，1982，Proc． Natl．Acad．Sci．79:4927-4931を参照）。挿入されたC100-Rコード配列の効率的な翻訳のためには特定の開始シグナルも必要な場合がある。これらのシグナルはATG 開始コドン及び隣接配列を含む。それ自体の開始コドン及び隣接配列を含む全C100-R遺伝子を適当な発現ベクターに挿入する場合には追加の翻訳制御シグナルは必要ない。しかし、C100-Rコード配列の一部のみが挿入される場合は、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルが与えられなければならない。さらに、開始コドンは、C100-Rコード配列の読み枠と同じ読み枠にして、全挿入物の翻訳が確保されなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、種々の起源のものであってよく、天然のものあるいは合成のものであってよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含ませることにより増強され得る（例えば、Bitterら，1987 ，Methods in Enzymol．153:516-544を参照）。さらに、挿入された配列の発現を変調させたり、あるいは遺伝子産物を所望の特異的な形で修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えばグリコシル化）及びプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。種々の宿主細胞が、タンパク質の翻訳後のプロセシング及び修飾のための特徴的で特異的なメカニズムを有している。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現された外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確保することができる。この目的のためには、一次転写物の適当なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳類宿主細胞には、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK 、293、WI38等が含まれる。組換え体タンパク質を長期間にわたって高い収率で生産するためには安定な発現が好ましい。例えば、C100-Rを安定に発現する細胞系を作製することができる。ウィルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）により制御されたC100-R DNA 及び選択マーカーにより宿主細胞を形質転換することができる。外来DNA の導入の後、操作された細胞を富栄養化培地中で１〜２日増殖させ、そして選択培地に切り換えることができる。組換え体プラスミド中の選択マーカーは、選択に対する抵抗性を与え、細胞がプラスミドをそのクロモソームに安定に組み込み、増殖してフォーカス（増殖巣）を形成し、その後細胞系中にクローン化し増殖できることを可能とするものである。この方法は、C100-Rを細胞表面に発現する細胞系を作製するのに有利に使用することができ、この細胞系はβAPP-C100媒介シグナル変換に応答する。このような遺伝子操作された細胞系は、βAPP-C100類似体のスクリーニングに特に有用である。多数の選択系を使用することができ、限定するものではないが、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（Wiglerら，1977，Cell 11:223）、ヒポキサンチン −グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski，1962 ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 48:2026）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら，1980，Cell 22:817）遺伝子を、tk^-、hgprt^-またはaprt^- 細胞中でそれぞれ使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を選択の基礎として使用することができ、dhfr遺伝子はメトトレキセート耐性を与えるものであり（Wigler ら，1980，Natl．Acad．Sci．USA 77;3567；0'Hareら，1981，Pro c．Natl． Acad．Sci．USA 78;1527）、gpt遺伝子はミコフェノール酸耐性を与えるものであり（Mulligan & Berg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2072）、neo 遺伝子はアミノグリコシドG-418耐性を与えるものであり（Colberre-Garapin ら，1981，J．Mol．Biol．150:1）、hygro遺伝子はヒグロマイシン耐性を与えるものである（Santerre ら，1984，Gene 30:147）。最近、別の選択可能な遺伝子が記載されており、即ち、trpBは細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするものであり、hisDは細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするものであり（Hartman & Mulligan，1988，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 85:8047）、ODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）はオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン（ DFMO）に対する抵抗性を与えるものである（McConlogue l.，1987，In：Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory ed. ）。 5.2.2 C100-Rを発現するトランスフェクタントあるいは形質転換体の同定前記コード配列を含み生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも４種の一般的な方法により同定することができ、即ち、(a)DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーション、(b)「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在、(c)宿主細胞内でのC100-R mRNA転写物の発現により測定される転写レベルの測定、及び(d)免疫アッセイまたはその生物学的活性により測定される遺伝子産物の検出である。第１の方法においては、発現ベクター中に挿入されたC100-Rコード配列の存在が、それぞれC100-Rコード配列に相同なヌクレオチド配列、またはその部分もしくは誘導体からなるプローブを使用したDNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションにより検出される。第２の方法においては、組換え体発現ベクター／宿主系が特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、メトトレキセートに対する抵抗性、形質転換表現型、バキュロウィルスにおける封入体の形成等）の存在または不存在に基づいて同定及び選択される。例えば、C100-R コード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されると、C100-Rコード配列を含む組換え体はマーカー遺伝子機能の不存在により同定できる。あるいは、マーカー遺伝子を、C100-Rコード配列の発現の制御に使用される同一または異なるプロモーターの制御下においてC100-R配列とタンデムに位置させることができる。誘導または選択に応答するマーカーの発現はC100-Rコード配列の発現を示すものである。第３の方法においては、C100-Rコード領域についての転写活性がハイブリダイゼーションアッセイにより測定できる。例えば、C100-Rコード配列あるいはその特定の部分に相同なプローブを使用したノーザンブロットによりRNAを単離し、分析することができる。あるいは、宿主細胞の全核酸を抽出し、そのようなプローブとのハイブリダイゼーションについてアッセイすることができる。第４の方法においては、C100-Rタンパク質産物の発現を、例えばウェスタンブロット、放射標識免疫沈降、酵素結合免疫アッセイ等のような免疫アッセイにより免疫学的に測定することができる。しかし、発現系の成功の最終的な試験は、生物学的に活性なC100-R遺伝子産物の検出を使用する。多数のアッセイを受容体活性を検出するのに使用でき、限定するものではないが、β-APP 結合アッセイ、及び遺伝子操作した細胞系を試験基質として使用するβ-APP生物学的アッセイが含まれる。 5.2.3 C100-Rの回収一旦生物学的に活性なC100-Rを高いレベルで生産するクローンが同定されれば、そのクローンを増殖させ、大量の受容体を生産するのに使用でき、これは当分野でよく知られた技術により精製することができる。そのような技術には、限定するものではないが、免疫アフィニティー精製、高速液体クロマトグラフィー、ビーズに結合したβ-APP-C100またはその類似体のような固定リガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー法が含まれ、免疫アフィニティー精製は抗体等を使用するものである。 C100-Rコード配列が開裂可能な融合タンパク質をコードするように操作された場合には、精製はアフィニティー精製法を使用して容易に行うことができる。例えば、コラゲナーゼ開裂認識コンセンサス配列をC100-Rのカルボキシ末端とプロテインＡの間に形成することができる。得られる融合タンパク質は、プロテインＡ部分に結合するIgGカラムを使用して容易に精製することができる。非融合C10 0-Rは、コラゲナーゼで処理することにより、カラムから容易に放出させることができる。もう１つの例は、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現するpGEX ベクターを使用することである。この融合タンパク質は、クローン化された遺伝子とGST部分の間にトロンビンまたはXa因子開裂部位を有するように形成することができる。この融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズへの吸着とその後のグルタチオンの存在下での溶出により細胞抽出物から容易に精製することができる。本発明のこの形態においては、任意の開裂部位あるいは酵素開裂基質を、C100-R配列と、精製に使用できる結合相手を有する第２のペプチドあるいはタンパク質、例えば抗原（これに対して免疫アフィニティーカラムを調製できる）との間に形成することができる。 5.3 C100-Rを規定する抗体の生成組換え技術により製造されたC100-Rのエピトープに対する抗体の製造のためには、当分野で知られた種々の方法を使用することができる。中和抗体、即ち受容体のβAPP-C100結合部位について競合するものは、診断及び治療に特に好ましい。このような抗体としては、限定するものではないが、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、Fab断片及びFab発現ライブラリーにより生産された断片が含まれる。抗体の生産のためには、種々の宿主動物をC100-Rの注射により免疫することができ、これらの動物には、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラット等が含まれる。宿主種に応じて、免疫応答を増加させるために種々のアジュバントを使用することができ、そのようなものには、限定するものではないが、フロインド（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムのような無機ゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び有用だと考えられる、BCG（カルメット・ゲラン杆菌）及びCorynebacterium parbvumのようなヒトアジュバントが含まれる。任意の方法を使用することにより、培養下の連続細胞系による抗体分子の生産が得られる。そのような方法には、限定するものではないが、Kohler及びMilste inにより最初に記載されたハイブリドーマ法(Nature, 1975, 256:495-497)、ヒトB-細胞ハイブリドーマ法(Kosborら，1983, Immunology Today, 4:72; Coteら，1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:2026-2030)及びEBV-ハイブリドーマ法(Co leら，1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp.77-96)が含まれる。さらに、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適当な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された方法(Morrisonら，1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neubergerら，1984, Nature, 312:604-608; Takedaら，1985,Nature, 314:452-454)を使用することができる。 C100-Rの特異的結合部位を含む抗体断片を公知の方法により生成することができる。例えば、そのような断片には、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化により製造できるF(ab')₂ 断片、及びF(ab')₂ 断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成できるFab断片が含まれる。あるいは、Fab発現ライブラリーを構築することにより(Huseら，1989, Science, 246:1275-1281)、C100-Rに対して所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速で容易な同定が可能となる。 5.4 アンチセンスRNA及びリボザイム C100-R mRNAの翻訳を阻害するように機能するアンチセンスRNA及びDNA分子及びリボザイムを含むオリゴヌクレオチド配列も本発明の範囲内のものである。アンチセンスRNA及びDNA分子は、標的mRNAに結合し、タンパク質翻訳を防止することによりmRNAの翻訳を直接ブロックするように働く。アンチセンスDNAに関しては、翻訳開始部位、例えばC100-Rヌクレオチド配列の-10及び+10の間の領域から誘導されたオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。リボザイムは、RNAの特異的開裂を触媒することができる酵素的RNA分子である。リボザイム作用のメカニズムには、リボザイム分子の、相補的な標的RNAに対する配列特異的ハイブリダイゼーションとその後の核酸内加水分解(endonucleol ytic)切断が関連している。C100-R RNA配列の核酸内加水分解切断を特異的に効率よく触媒する、遺伝子操作されたハンマーヘッドモチーフ(hammerhead motif) リボザイム分子も本発明の範囲内のものである。任意の可能性のあるRNA標的内の特異的リボザイム開裂部位は、次の配列：GUA 、GUU及びGUCを含むリボザイム開裂部位について標的分子を走査することにより最初に同定される。一旦同定されれば、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオチドの短いRNA 配列が、そのオリゴヌクレオチドを不適当なものにし得る二次構造のような、予期される構造的特徴について評価される。候補標的が適当であることは、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのしやすさを試験することにより評価することができる。本発明のアンチセンスRNA 及びDNA 分子の両方及びリボザイムは、RNA 分子の合成のための当分野で知られた任意の方法により製造することができる。これらの方法には、当分野で知られたオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成する方法、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成が含まれる。あるいは、RNA 分子は、アンチセンスRNA 分子をコードするDNA 配列のインビトロ及びインビボ転写により生成できる。そのようなDNA 配列は、T7あるいはSP6 ポリメラーゼプロモーターのような適当なRNA ポリメラーゼプロモーターを含む広範な種類のベクターに導入することができる。あるいは、使用するプロモーターに応じて、構成的にまたは誘導的にアンチセンスRNA を合成するアンチセンスcDNA構築物を、細胞系に安定に導入することができる。細胞内での安定性と半減期を増加させるための手段として、DNA 分子に対する種々の修飾を導入することができる。可能な修飾には、限定するものではないが、分子の5'及び／または3'末端へのリボーまたはデオキシーヌクレオチドのフランキング配列の付加、及びオリゴデオキシリボヌクレオチドバックボーン内でのホスホジエステル結合ではなくホスホロチオエートまたは2'0-メチルの使用が含まれる。 5.5 C100-R、DNA 及び遺伝子操作された細胞系の使用上記したC100-R DNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイム、APP- R発現産物、抗体及び遺伝子操作された細胞系は、アルツハイマー病の診断と治療に多数の用途を有する。例えばC100-R DNA配列は、in situ ハイブリダイゼーションアッセイを含むサザンあるいはノーザン分析のような、C100-R発現の異常を診断するバイオプシーあるいはオートプシーのハイブリダイゼーションアッセイに使用することができる。治療的な応用においては、C100-R DNA配列に基づいて設計されたアンチセンスまたはリボザイム分子は、C100-R遺伝子産物の転写及び発現をブロックするのに使用することができる。あるいはC100-R DNAは、正常な組換え遺伝子を個体の欠損細胞に導入し、あるいは内因的な変異を修正してC100-R及びその機能を再構成するための遺伝子治療法に使用することができる。本発明の別の態様においては、C100-Rに特異的な抗体を、バイオプシー組織中の受容体発現のパターンを決定するために、あるいはインビボにおける診断用画像形成に使用することができ、このような用途においては、「中和」抗体が好ましい。例えば、画像形成化合物と結合した抗体を患者に投与し、C100-Rの位置及び分布をインビボにおいて「マップ(map)」することができる。本発明の他の態様においては、APP-R 自体、あるいはそのβAPP-C100結合部位を含む断片をインビボで投与し得る。遊離のC100-Rあるいは前記ペプチド断片は β-APPに競合的に結合して、インビボにおいて天然受容体とβ-APPとの相互作用を阻害し得る。本発明のさらに別の態様においては、全C100-Rあるいはそのリガンド結合ドメインを発現する遺伝子操作された細胞系を、活性なβAPP-C100アゴニストあるいはアンタゴニストをスクリーニングし、同定するのに使用できる。あるいは、内因的にC100-Rを発現する細胞系をこの目的に使用することができ、例えば本明細書中で例示したSK-N-MCのような神経芽細胞腫細胞系を使用できる。βAPP-誘導ペプチド、その他のペプチド、合成化合物、天然産物、及び生物学的に活性でありうる物質のその他の供給源は以下のようにしてスクリーニングすることができる。βAPP-C100（これは例えば³⁵Met または「フラッグ」配列で標識でき、あるいは該ペプチドに対する抗体により検出できる）のC100-Rへの結合を阻害する被実化合物の能力、従ってそのアゴニストあるいはアンタゴニストとして作用する能力を測定することができる。受容体の供給源としては、C100-R発現細胞ホモジネートの全体、あるいは細胞下画分を使用できる。結合は、6.1.3 の項に記載したような、標準的な受容体結合法を使用して測定することができる。C100-R発現細胞におけるシグナル変換応答に対するβAPP-C100の効果を妨げるあるいは模倣する、試薬の能力を測定することができる。例えば、カルシウムの細胞質ゾル濃度の変化、特異的なプロテインキナーゼの活性化、ホルモンあるいは神経伝達物質の変化した分泌、第２メッセンジャー生産の変調、あるいは細胞代謝の変化等の応答を監視することができる。これらのアッセイは、このような目的のために開発された慣用の技術を用いて、細胞全体または膜調製物において行うことができる。βAPP-C100の毒性効果に応答する遺伝子操作された細胞または細胞系においては、毒性を誘発または防止する物質の能力を測定することができる。毒性は、文献に記載されたように (Yankner ら，1989, Science 245:417-420)、あるいはその他の確立された方法により監視することができる。上記の、あるいはその他のスクリーニングにより見出されたβAPP-C100アゴニストあるいはアンタゴニストのインビボ効果を測定するために、あるいはアルツハイマー病の治療に有効であり得るその他の薬剤を同定するために、C100-R DNA をトランスジーンとして含むトランスジェニック動物を作出することができる。最近、リガンド−受容体相互作用についてのコンピュータ作成モデルが開発されており、本発明の特定の態様においては、C100-Rのコンピュータモデル化から誘導された情報を受容体アゴニストあるいはアンタゴニストの設計に使用することができる。例えば、特定部位の突然変異誘発の技術を使用してC100-R配列に生起した変化、及び細胞系における変異体受容体の発現は、特定の受容体領域及び残基の機能的な役割をさらに規定するのに使用することができる。 6．実施例以下の小項目は、ニューロン由来の細胞において発現されたAPP 結合タンパク質の最初の特性決定と、ラットC100-Rの一部を示す相補的DNA のクローニング及び配列決定とを記載するものである。C100-Rの推定アミノ酸配列は、“Ｂ”型カルシウムチャンネル、リアノジンカルシウムチャンネル、カルレチクリン及びタンパク質セリン／トレオニンキナーゼの間に共有されているいくつかのモチーフを明らかにした。 6.1 材料及び方法 6.1.1 フラッグ−βAPP-C100のインビトロ翻訳下記の「フラッグ」配列含有オリゴヌクレオチドを合成し、pGEM7 に挿入した： ACC ATG GAC TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA TCG AT MET ASP TYR LYS ASP ASP ASP ASP LYS SER （Immunex; Prickettら，1989 BioTechniques 7:580）。さらにMETコドンの前で、ACC トリプレットが真核細胞翻訳開始のコンセンサス配列を与え、フラッグ配列の後のClaI部位をクローニングのために付加し、オリゴの5'末端におけるHi ndIII リンカーも同様であった。pGEMフラッグ構築物をSmal及びClaIで切断し、ClaI部位を修復した。βAPP-695からのBgII/SmaI断片をこの構築物中にクローン化した。適当な配向を有するクローンを選択した。この組換え体を³⁵S-βAPP- Cl00ペプチドを製造するのに、２つの方法で使用した。最初は、結合転写／翻訳システム、TNT Coupled Reticulocyte Lysate System （Promega Corp.）において、推奨された方法に従い、閉環状プラスミドDNAを³⁵S-メチオニン（6μC₁）とともに溶解物中に加えた。２番目は、非結合反応において、製造業者の手順（Pr omega Corp.）に従い、組換え体をSpeIで線状化し、５μｇ DNAをインビトロでのRNA（約20〜30μｇ）の製造に使用した。製造業者の手順（Promega Corp.）に従い、１〜５μｇのこのRNA を小麦胚芽あるいはウサギ網状赤血球翻訳システムにて翻訳した。いずれのインビトロ翻訳物も10分の１容量の100 mM N -アセチルグルコサミン（Sigma）を加え、アリコートに分けて-80℃で凍結し、使用の前に透析するか、アリコートに分けて直接凍結し、その後に使用の前に透析してスピンカラム（BoehringerーMannheim）で精製するか、あるいは市販のAff igel 10（Biorad）に結合したフラッグ-抗体（Ca ⁺⁺依存性結合M1 Ab, IBI）を使用してアフィニティー精製した。アフィニティークロマトグラフィーは、インビトロ翻訳物を、0.5mM CaCl₂ を含むPBS（120 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM リン酸バッファー、 pH 7.4）で平衡化したAffigel 10- 結合M1抗体カラム（1 ml ベッド容量）を通すことにより行った。充分に洗浄した後（５〜10カラム容量）、ペプチドをNa₂EDTA（2 mM）を含むPBSによりカラムから溶出した。ペプチドはシャープな0.7 mlピークとして溶出された。結合あるいはオートラジオグラフィーにおける使用のために、透析によりEDTAを除去した。フラッグ- βAPP-C100構築物の配列を決定し、インビトロ翻訳からの生成物ペプチドを質量分光分析法によりアミノ酸組成について分析し、その同一性を確認した。 6.1.2 細胞培養結合アッセイ用のPC12細胞（ATCC）を、10％熱不活性化ウマ血清及び5％ウシ胎児血清を補充したRPMI1640中で増殖させた。T-175フラスコに、10 ng/ml NGF を含む増殖培地60 ml中の5×10⁵ 細胞/mlを接種した。細胞を収穫するまで（通常６日目）、この培地の追加の60 mlを２日置きに添加した。示した場合は、NGF の不在下であることを除いて上記のようにPC12細胞を培養した。細胞を138×gにおける８分間の遠心分離により回収した。上清を捨て、ペレットを５ mlの増殖培地に再懸濁した。10 ccのシリンジに装着した23 g針を通して３回細胞を破砕し、単一細胞懸濁物、あるいは、最大でも小さな細胞凝集物とした。トリパンブルー染料排除により、99％を上回る細胞が生存可能なものであることが分かった。 SK-N-MC細胞（ATCC）を10％子ウシ血清を補充したDME中で増殖させた。SK-N-M C細胞は、NGFを含めなかったことを除いてPC-12細胞について記載したように培養した。 6.1.3 細胞への結合 βAPP-C100結合実験のために、上記のようにして増殖させ調製したPC-12またはSK-N-MC細胞を計測し、低速遠心分離（138xg）により回収し、1%BSA及び1%グルコースを含むリン酸緩衝溶液（PBS，pH 7.4）（PBG）中に再懸濁した。2×10⁶ 細胞を含む0.08 ml容量の細胞懸濁物を、0.01 mlの³⁵S-βAPP-C100、及び0.01 m lのPBGまたは非標識βAPP-C100もしくはそのビヒクルを含む0.01mlのPBGと混合した。反応速度及び阻害実験については、³⁵S-βAPP-C100の濃度を25 pMあるいは50 pMとした。飽和実験については、リガンド濃度を15 pM 〜6 nMの範囲とした。示していない場合は、混合物を４℃で３時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、138×gでの90秒の遠心分離により細胞をペレット化し、上清（非結合リガンドを含む）を除去し、0.2 mlの新鮮な氷冷したPBGを加えた。細胞及び新鮮なバッファーを短時間攪拌し、再度遠心分離し、上記のような新鮮な氷冷したバッファー中に懸濁した。最後に、細胞を遠心分離によりペレット化し、BSA（0.1%）処理フィルターを通して濾過し、0.1% BSAを含む氷冷PBS の1-mlリンスにより４回洗浄した。新鮮な氷冷バッファー中への細胞の再懸濁と細胞の濾過の間の時間は10分未満であった。解離実験において、及び結合リガンドのサンプルの回収のためには、細胞を２回目の洗浄液として加えたバッファー中で３時間までインキュベートして、結合したリガンドが解離するようにした。その後細胞を遠心分離によりペレット化し、上清（解離した結合リガンドを含む）を分離した。次いで細胞を再洗浄し、上記したようにして収穫した。フィルターにより保持された放射活性をシンチレーションカウントにより計測した。非特異的結合は、過剰の（3.2 nM〜18 nM）のβAPP-C100の存在下で起こるものとした。飽和データは、市販のソフトウェアを使用してコンピュータにより分析した。実験データに最も適合した結合モデルをF-検定（p<.05）により決定した。 6.1.4 結合オートラジオグラフィー Sprague-Dawleyラットを炭酸過剰により屠殺し、その脳を摘出できるまで（１時間未満）氷中においた。脳はドライアイスで-20℃に冷却したイソペンタン中で迅速に凍結させ、直ちに使用するか、使用するまで-80℃で保存した。脳を低温維持装置の標本ホルダーに固着させ、25μMの頭頂切片をゼラチン被覆顕微鏡スライド上に回収した。切片は一晩-80℃で凍結させるか直ちに使用した。切片を４℃で空気乾燥し、その後結合バッファー（PBS，1% BSA）と４℃で30分間予備インキュベートした。このバッファーを、リガンドのみ（³⁵S-βAPP-C100, 0. 01 nM）または最高10倍過剰の非標識βAPP-C100もしくはそのビヒクルとともにリガンドを含む新鮮なバッファーと置換した。インキュベーションを４℃で３時間継続した。その後リガンド含有バッファーを除去し、切片を新鮮なバッファーで２回洗浄した（15分及び１分、４℃）。そして切片を氷冷蒸留水に10回浸漬し、室温の空気流下で乾燥させた。次に切片をX-線フィルムに１〜14日間にわたり当てて、フィルムを現像した。脳領域を同定するためにいくつかの切片をクレシルバイオレットで染色した。オートラジオグラフの領域の光学密度を、画像分析システムを用いて定量的に測定した。 6.1.5. 発現クローニングによるC100-R cDNAのスクーリニング cDNAを胚18日目のラット脳mRNAからNeveらの方法にしたがって構築した（1986 ; Current Protocols in Molecular BiologyでKlicksteinおよびNeveにより詳細に記載されている）。λgt11ライブラリー（ラット脳cDNAライブラリー、RL Nev e ; ヒト脳cDNAライブラリー、Clontech）を150,000 pfu/150 mmプレートの量で Y1090大腸菌細胞に塗布した。プレートを42℃で３時間インキュベートし、この間にプラークがちょうど見えるものとなった。あらかじめ10 mM IPTG（イソプロピル-β，D-チオガラクトシド）で飽和させておいたSchleicherとSchuellの132 mmのニトロセルロースフィルターでプレートを重ねるように覆い、わずかに風乾した。プレートを37℃で３時間放置し、第一フィルターをはずし、TBS（50 mMトリス、pH 7.7,150 mM NaCl）中に入れた。IPTGに浸しておいたもう一つの第二ニトロセルロースフィルターをプレート表面上に置いて２時間放置した。第二フィルターをはずしてTBS中に入れた。これらフィルターは、ブロッキング剤を含まないTBSに12時間以上４日以内放置し、再生（refolding）させた。フィルターを５％脱脂スキムミルクを含むTBS中で２時間から一晩までの時間でブロックした。フィルターを結合用緩衝液（50 mMトリス塩酸，pH 7.7,50 mM NaCl,2 mM MgCl₂ ，1 mMジチオトレイトール）で洗浄した。インビトロで翻訳された3 nMの³⁵S- βAPP-C100といっしょにフィルターを２時間、４℃でインキュベートした。非結合標識ペプチドを除去するために、３回の３分間の洗浄（４℃）［(i)結合用緩衝液のみ、(ii)結合用緩衝液＋0.1% NP40、および(iii)結合用緩衝液］を用いた。フィルターをすぐに洗浄液から取り出し、風乾した。こうして処理したフィルターをスクリーン付きのX-OMAT RPフィルムに-70℃で６日間〜２週間さらした。十分なシグナルを得るためには、湿潤プレートは十分なタンパク質／プラークを得ることが必要なことが分かった。また、この操作全体にわたって、核酸プローブ精製の同等の段階で通常必要とされるファージよりもさらに多いファージの塗布が必要であった。β APP-C100結合タンパク質部位を有する「プラーク」的に純粋なファージ集団が上記のように塗布されたときでさえ、低いパーセントのプラークのみがβAPP-C100 に結合しただけであったが、これは結合のために適当な折りたたみが必要性とされるためであろう。デュプリケートで作成したフィルターを比較して、³⁵S-βAPPーC100に結合したタンパク質を発現するプラークを同定した。陽性プラークを集め、さらに別の結合と精製段階に供した。ラット脳のcDNAライブラリーから単一の陽性クローンを得るために６段階の単離が必要であった。このラットクローンはλAB1Rと命名した。ヒト脳のcDNAライブラリーから５陽性クローンを得るためには５段階の単離が必要であった。 λAB1Rからの挿入断片を、制限酵素部位（Sal IおよびNot I）を有するλgt11 配列決定用プライマーを用いるPCR増幅によりサブクローン化した。こうして増幅された断片を精製し、製造業者の説明書にしたがって制限酵素により切断し、 SaII/NotIで切断したBluescript（SK+, Stratragene）中にサブクローン化した。このラットサブクローンはpAB1R-ラットと命名した。第二のクローニング法は、「フラッグ」タグ（"flag" tag）に対する市販の抗体を利用して開発されたものである。βAPP-C100を³⁵S-メチオニンで標識しなかった以外は前記のようにライブラリーを塗布し、プレートにフィルターを乗せ、処理し、プローブを用いて同定し、洗浄した。フィルターをStratalinkerクロスリンカー（Stratagene）で架橋し、５％脱脂ミルクを含むTBS中で２時間インキュベートすることによりブロックした。次に、これらフィルターを、市販の抗フラッグ抗体（M2,IBI）をTBS中10μg/mlの濃度でプローブとして用いることで調べた。過剰の抗体はTBS（４℃）で３回の10分間の洗浄（その中間の洗浄溶液は0.1 % NP40を補った）で除去した。フィルターを第二抗体であるヤギ抗マウスIgG（重鎖、軽鎖）ビオチン複合体（NEN）と一緒に第一抗体と同じようにインキュベートした。洗浄後、フィルターを上記の結合用緩衝液中で0.5μCi/mlの［¹²⁵ I］-アビジン（NEN）とともにインキュベートした。最終的な３回の洗浄はTB S（その中間の洗浄液は0.1% NP40を含む）を用いた。フィルターを風乾し、スクリーン付きのXOMAT-RPフィルムに-70℃で６日間〜３週間さらした。これらフィルターのオートラジオグラフを二重試験で比較した。陽性プラークを集めて、さらに複数のスクリーニング段階に供した。 βAPP-C100結合タンパク質のヒトの同系物を有するファージを前記の直接結合法とフラッグ一抗体法の両者を用いてクローン化した。これらのcDNAをサブクローン化した後に配列を決定する。 6.1.6. cDNAの特性付け cDNAは、高コピープラスミドベクターにサブクローン化して細菌を形質転換するか、または複製連鎖反応（PCR）によりファージ組換え体から直接増幅した。前者の場合では、二本鎖DNAの小量調製物をSequenase（U.S.Bioc hemicals）を用いて配列決定を行い、後者の場合では、PCR産物を精製して、フェムト（10^-15）モル配列決定用システム（Promega）を用いて配列決定を行なった。これらクローンの配列決定は標準ジデオキシ法（Sequenase; U.S.Biochemical s）により行なった。コンピュータ分析は主にGenePro（Riverside Scientific E nterprises）とPCGene （Intelligenics）を用いて行なった。ヒトDNAまたはラットDNA（PC12）のサザン転写物を、AB1R cDNAの5'末端を表わす³²P-標識260 bp断片（EcoRI/ScaI）をプローブとして用いることで同定した。８μｇのDNAを多様な制限酵素を用いて切断し、0.8%アガロースゲルで泳動し、ナイロンまたはニトロセルロースに移した。ノーザン分析は、グアニジニウムチオシアネート法（Chirgwinら，1979 Bioch emistry 18 5294）により単離した全細胞RNAについて行なった。グリオキサルゲル、ホルムアルデヒド−アガロースゲルおよびドット・ブロットを利用して、異なる材料に由来するRNAを異なる条件下で定量、評価した（Tanziら，1987, Scie nce 235:880-884; Tanziら，1988, Nature 331:528-530）。時間を変えて神経成長因子で処理したPC12に由来するRNA、アルツハイマー病およびダウン症候群の患者脳に由来するRNA、脳小領域に由来するRNA、多様な発達段階に由来するRNA 等を泳動した。アルツハイマー病またはダウン症候群の患者脳の試料は、Childr en's Hospital（Boston）の病理部およびMcLean Hospital Brain Tissue Resour ceから得られたものである。 λgt11中の1985 bpのAB1R cDNAの溶原菌は、Yl089細菌に組換えファージを10, 000 : 1の感染多重度（moi）で感染させ、溶菌しなかった細菌から温度感受性クローンを同定することによりY1089中に構築した。この溶原菌は熱およびIPTGにより誘導し、得られた細胞溶解物はLaemmilゲル試料用緩衝液に再懸濁した。Kag eyamaとPastan（1989, Cell 59:815）の方法にしたがって、この試料の一部を10 ％PAGE上で電気泳動し、ニトロセルロース上に移し、PBS-トリトンＸ中の連続的な希釈濃度の尿素中で４℃で２日間インキュベートした。次に、³⁵S-βAPP-C100 に対する結合を、cDNAライブラリーからABlRクローンを単離するために用いた方法（但し、TBSの代わりにPBSを用いた）にしたがって行なった。 λABlRからのcDNA挿入断片を哺乳動物発現ベクターpCDNA1中にアンチセンスの向きでサブクローン化し、これをエレクトロポレーションによりPC12細胞に感染させた。これらの一時的細胞をDME培地で３日間生育させ、NGFで処理し、³⁵S-標識βAPP-C100に対するそれらの結合能を調べた。安定な移入細胞を培地中のG418 の含有により選択し、次にネオマイシン耐性細胞を、NGFによる処理後に標識βA PP-C100に対するそれらの結合能について、結合アッセイにて調べた。 6.1.7. βAPP-C100結合タンパク質プローブを用いたin situハイブリダイゼーションハイブリッド形成プローブは、多様な制限部位で直鎖状とした pAB1Rラット構築物を標識することにより調製した。アンチセンスRNAプローブは、BluescriptのT3プロモーターを利用してNcoI部位で直鎖状としたプラスミド鋳型から作製し、センスコントロールRNAプローブは、BluescriptのT7プロモーターを利用してBamHI部位で直鎖状としたプラスミドから作製した。プローブは多様な方法で作製した。インビトロ転写を用いてRNAプローブを作った。RNAは³⁵S- UTP（Promega試薬）またはジゴキシゲニン-UTP（Boehringer-Mannheim試薬）のいずれかで標識した。ジゴキシゲニン標識DNAプローブはPCRにより作った（Lanz illo,1991; M.McKennaおよびJ. Carlson, 個人的なレポート）； PCRプライマーは適当な断片を作るために作製した（Genosys BiotechnologieS社）。 in situハイブリダイゼーション用切片は結合オートラジオグラフィー用切片と同じように調製したが、RNAseを含まない条件のみを用いた。ハイブリッド形成前に、それら切片をグリシン（0.75 g/ml）を含有するリン酸緩衝液（0.1 M）を用いて３分間の洗浄を２回行なった後、リン酸緩衝液のみで15分間の洗浄を２回行なった。次に、それら切片をプロテイナーゼK（15 mMトリス塩酸，pH 7.5および15 mM EDTA中で1μg/ml）で30分間37℃で処理し、無水酢酸（0.1 Mトリエタノールアミン、pH 7.5中で0.25%）で10分間洗浄した。この後、通常の濃度の２倍（２×）のSSC（0.15 M NaCl,0.015 Mクエン酸ナトリウム，pH 7.0）を用いて 15分間の洗浄を２回行い、EtOHとクロロホルムで脱脂し、風乾した。上記のように調製したハイブリッド形成プローブは、次に50%ホルムアミド、20×Denhardt の試薬、300 μg/mlの一本鎖DN A, 150 μg/mlのtRNA, 20 mM β-メルカプトエタノール（BME）および２×SSCを含有する溶液中の切片上に置いた。カバーグラスを切片とハイブリッド形成用溶液の上に置いて、ゴムのりを用いてこれを該スライドにシールした。ハイブリッドの形成は60℃で一晩行なった。次に前記カバーグラスを取り外し、該切片を30 0 mM BMEを補った４×SSCで30分間、60℃で２回洗浄した。この後、それら切片をRNAse（２×SSC,20 mM BME中で20μg/ml）で45℃で30分間処理した。次に切片を２×SSCで４回（60分間、30分間、30分間および30分間、各60℃）洗浄し、１ × SSCで１回（30分間、60℃）洗浄し、２×SSC中に一晩放置した。翌日、切片を0.05 Mリン酸緩衝液、次に蒸留水で素早くすすいだ。次に、これら切片を風乾し、Ｘ線フィルムに接触するように置いた。これらフィルムは１日〜２週間後に現像し、これらを用いてハイブリッドを形成したプローブの全体的な分布を確かめた。プローブの微細位置決定はこれら切片を光乳剤で被覆し、次にこの乳剤を現像し、多様な脳領域の細胞体上のグレン密度を測定することにより行なった。 6.1.8. 全長ラットAPP-4のクローニング完全な長さのC100-Rを得るために、pABlR-ラットから作られた多様なプローブを用いてラットライブラリーをスクリーニングした。これらのプローブはラットクローンの最も5'側の配列に対して特異的である。ラット配列がさらに利用できるようになれば、その後の複数のスクリーニング段階は、各段階のスクリーニングに利用できて最も5'側の配列に特異的であるプローブを利用することになるであろう。さらに、第二のラット脳ライブラリーを、cDNA挿入断片の５’領域に対して特異的なプライマーを有するλZAP（Stratagene）中に構築した。このライブラリーはRACE（cDNA末端迅速増幅）法（Frohmann et al., 1988, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:8998-9002）を用いて構築したが、この際に以下の変更を行なった：（１）このcDNA合成は、オリゴ（dT）を用いる代りに、 ABlR mRNAの3'UTRに対して特異的なABlRT3-1またはABlRT3-3を用いて開始した。（２）cDNA合成前にmRNAを水酸化メチル水銀で変性させた。（３）MMLV逆転写酵素（"Superscript"- Bethesda Research Labs）をAMV逆転写酵素の代わりに用いた。（４）EcoRIリンカーの代わりにNotlアダプターをcDNAの末端に連結したために、その後のcDNAの消化はクローニング前に必要ではなかった。消化したNotl にこれらcDNAをクローン化し、λ ZAP IIに部分的に挿入して、それぞれが約10⁵ 個のcDNAクローンの２種類のライブラリーを作製した。このライブラリーは、各段階のクローニングに利用できて５’配列に対して特異的であるプローブを用いてスクリーニングされることになる。全長遺伝子のクローニングに対するもう一つのアプローチはＰＣＲ技術を利用することであろう。海馬メッセンジャーRNAを用いて、cDNA挿入断片の５’末端に対して特異的なプライマーを利用し、逆転写酵素反応が実施される。次に、ターミナルトランスフェラーゼを用いてグアニンがこのRNA/DNAハイブリッドに「末端付加され」（"tailed"）、該RNAはRNAse Hで消化され、第二鎖の伸長がpo ly-Cプライマーを用いて開始される。制限部位を導入したプライマーを用いることにより、「クローンに特異的な」cDNAがクローン化され、配列の決定がなされる。このプロセスは全11 kb配列が得られるまで複数段階にわたって繰り返される（Frohmannら，1988, Proc .Natl. Acad. Sc i. USA 85:8998-9002 ）。 6.2. 結果 6.2.1. 放射性リガンド結合 βAPP-C100は、NGFで分化させたPC12細胞に対して毒性を有するために、前もってNGFで処理しておいたPC12細胞の表面に対するインビトロ合成βAPP-C100断片の結合を調べた（Kozlowski etal. 1992 J. Neuroscience 12:1679）。分化したＰＣ１２細胞に対する³⁵S-βAPP-C100の結合は、標識していないβAPP-C100により阻害できた（図1A）。同様な結果が神経芽細胞腫細胞系のSK-N-MCを用いて得られた（図1Bを参照）。 NGFで処理したPC12細胞において、結合の阻害可能な割合は全結合の40%〜60% を占めた。阻害可能な結合に関するIC₅₀値は1.7±0.7 nM（n = ５）であった。阻害可能な結合は３時間のインキュベーション後で最大に達し、完全な解離が可能であった（図２）。飽和実験により、決定された上記IC₅₀とほぼ一致する0.81 ±0.37 nMの K_d を有する同じ種類の結合部位の存在と0.37±0.05 fmole/10⁶細胞の B_max値が示された。NGF処理PC12に対する³⁵S-βAPP-C100の結合は他のぺプチド（例えば、多くのタキキニン類（tachykinins））で顕著に阻害されることはなかった。ラット脳切片において、最大レベルの特異的結合は海馬および嗅覚器小結節の領域に見い出された。阻害可能な³⁵S-βAPP-C100結合の量は、NGFにPC12細胞をさらした時間に依存した。NGFにさらされなかったPC12細胞は阻害可能な結合をほとんど示さなかったが、他方、NGFの存在下で４日間または６日間培養したものは漸増する結合量を示した。結合に影響を与えるもう一つの変数はｐＨであった。最大量の結合はpH ７で起こった。結合はpH ６で最大量の25％だけであり、pH 8 .5では52%だけであった。このアッセイ条件での³⁵S-βAPP-C100の安定性を評価するために、インキュベーション時間後の遊離リガンド（非結合）および細胞に結合させて遊離させたリガンドの両者をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により調べた。アッセイに添加する前に、ほとんどの放射活性が15 kDaの見掛け分子量を有する単一バンドに含まれていた。これはβAPP-C100の単量体を表わしている。少量の物質が２本の別の拡散バンドにも存在した。一つは主要バンドの分子量の約２倍で移動し、おそらくβAPP-C100の二量体を表わしている。他のバンドはさらに高い分子量を有しており、凝集体であろう。インキュベーション時間後の非結合リガンドのゲルの特徴はインキュベーション前のリガンドのものと同じであり、該リガンドは分解していないことを示した。同様に、結合から遊離したリガンドは、高分子量物質の量のわずかな減少が起こりうることを除けば、最初に添加したリガンドと同じ特徴を有していた。これらのデータは、βAPP-C100リガンドの結合がその変異を引き起さないことを示している。ホスホチロシンに関する共通配列の意義を調べるために行なったβAPP-C100中のチロシンの変異（Tyr₆₈₇からPheへ）により、分化PC-12細胞に対して毒性のないぺプチドが作られた。Phe₆₈₇- βAPP-C100は、14 nM（n = 3）までの濃度では³⁵Ｓ−βAPP-C100結合を顕著には阻害せず、βAPP-C100結合部位において在来の形のものよりも効力が1/20以下のリガンドとなった。 6.2.2. C100-Rのクローニングと特性付け最終的な溶菌サイクルでタンパク質を発現させるために誘導されたλgt11プラークに対する³⁵S-βAPP-C100結合のオートラジオグラフィーのシグナルは不規則であり不定である。我々はオートラジオグラフで明確なデュプリケートを作るために、XOMAT-RP高分解能フィルムと長時間の露出を用いた（図３）。ラットクローンであるλABlRのcDNA挿入断片の大きさは1970 bpであった。その全配列を図４に示す（配列番号１〜２）。示された配列は、ベクターλgt11と Bluescriptから誘導したβ-gal遺伝子の一部を含んでいる。クローンのこのオープンリーディングフレームはβ-Gal遺伝子に記録されていないので、クローンは非融合タンパク質として発現している。175位置のATGは、大腸菌リボゾーム結合部位の-AGAAA（標準的な部位はAGGAである）として働くことのできる８塩基対離れた隣接配列を有している。このメチオニンから始まるオープンリーディングフレームの翻訳は、407アミノ酸からなる分子量45,253 Dのタンパク質を生むであろう。そのような発現はおそらく再開始の産物であり、100 kD非融合タンパク質の発現について既に記録されている（Yang C. H. Lambie,E. J.およびSnyder, M . J. of Cell Biology 116:1303-1317）。配列の分析は、該クローンが遺伝子のカルボキシル末端部分の1349塩基対（1395からβ-Gal配列を引いたもの）と３’ 非翻訳領域の 575塩基対を含むことを明らかにした。核酸の配列分析は"B"タイプのカルシウムチャンネルであるリアノジンカルシウムチャンネルおよび高親和性カルシウム結合タンパク質であるカルレチクリン（calreticulin）との相同性を示している（図５）。翻訳されたタンパク質配列の分析は、いくつかの潜在的なリン酸化部位（多様なリン酸化酵素標的部位、例えばcAMP依存性タンパク質リン酸化酵素、cG MP依存性タンパク質リン酸化酵素、タンパク質キナーゼC、カゼインリン酸化酵素II等のもの）、潜在的N-グリコシル化部位、潜在的ミリストイル化部位、チロシン硫酸化部位、およびセリン／トレオニンタンパク質リン酸化酵素に特異的なサインを明らかにしている。このセリン／トレオニンリン酸化酵素の「サイン」または保存された触媒コア配列は、翻訳配列の246〜258からのAB1Rクローン中に見つかっている（図４）。このサインは、Hunterと彼の共同研究者（Hanks, S.K ., Quinn, A.M., およびHunter, T. （1988）Science 241 42-52）により発見された共通パターンである-［LIVMFYC］-X- ［HY］-D［LIVMFY］-K-X（２）-N-［L IVMFC］と合致する。ラットABlRクローンにおいて、その配列はV-I-H-R-D-I-K-S -D-N-I-L-Lである（図４）。多くのさらに別のラットcDNAクローンを単離し、それらの配列を決定した（図９）。この新しい配列情報は、５’方向で図４に示すC100-Rのコード領域を広げている。図９のヌクレオチド686の上の＊は、ヌクレオチド40で図４に示されたラット配列との接合点を示している。ノーザン分析は、このcDNAに対応するメッセンジャーRNAは脳全体にわたって高度に発現することを示している。このcDNAは11 kbの目立つバンドとハイブリッドを形成し、約３ kbのバンドに弱くハイブリッドを形成する。PC12細胞において、NGFで誘導されるハイブリッド形成バンドが9 .5 kbに存在する。PC12細胞には長期の培養とNGF処理により現われる4.4 kbのハイブリッド形成バンドも存在する。これらのさらに弱くハイブリッドを形成する低分子量のバンドは、核酸レベルで相同性を示すカルレチクリンのような分子をコードするメッセンジャーRNAに対して交差ハイブリッド形成を示すであろう。アルツハイマー病患者の脳からのRNAのノーザン分析は、βAPP-C100結合タンパク質がコントロールにおけるよりも高い又は低いレベルで発現しないことを示している。ヒトおよびラットの染色体DNAのサザン分析は、ABlR cDNAは少数のバンドとハイブリッドを形成することを示し、これは単一のコピー遺伝子を表わすABlRと一致する（図６）。強くハイブリッドを形成する3.0 kbのバンドならびに２本の弱くハイブリッドを形成するバンド（１本は8.5 kb）および種に依存して25〜30 k bににある高分子量のバンドが観察された。 6.2.3. in situハイブリダイゼーションラット脳切片において、バックグランドよりも高いレベルのハイブリッド形成が海馬および嗅覚器小結節においてのみ明らかであった（図８）。このことはオートラジオグラフィーで測定された結合部位の分布に一致する（図７）。７．実施例：ヒトC100-RのクローニングラムダZAP 11 （Stratagene）中に構築した成人ヒト海馬cDNAライブラリーを、ラットC100-R cDNA挿入断片からの標識断片を用いてスクリーニングした。この標識断片は、図９でヌクレオチド３１から409までのEcoRI断片として表わされる。ラットC100-R EcoRI断片をランダムプライマー反応（random priming react ion）を用いて標識し、ライブラリーをストリンジェント条件下で当業者により日常的に用いられている方法を用いてスクリーニングした。スクリーニング手法の概説については、例えば、Maniatis, 1989,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPress, N.Y.を参照されたい。長さが600〜1500塩基対の範囲の幾つかのクローンが得られた。1500塩基対クローンの部分的な配列決定の結果を図11に示す。ヒトC100-R配列とラットC100-R配列の配列の相同領域を図12に示す。８．微生物の寄託以下の微生物をメリーランド州ロックビル所在のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託し、以下の受託番号が与えられた：寄託された微生物（実施態様）は発明の一つの特徴を示すことを意図するものであって、機能的に同等であるいかなる微生物も本発明の範囲内にあるので、本発明は寄託された微生物により限定されるべきものではない。本発明は、発明の一つの特徴を示すことを意図するものである例示された実施態様によってその範囲が限定されるべきものではなく、機能的に同等ないかなるクローン、ＤＮＡまたはアミノ酸配列も本発明の範囲内にある。実際、本発明の多様な改良が前述の記載および添付の図面から当業者には自明である。そのような改良は添付のクレームの範囲内にあることが意図されるものである。さらに、ヌクレオチドについて示したすべての塩基対の大きさは近似的なものであって説明の目的のみに用いられていることを理解されたい。配列表（2）配列番号１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９７１塩基体（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｉｘ）特徴（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１．．１３９５（Ｃ）鎖の数：一本鎖（ｘi）配列の記載：配列番号１：ＳＥＯＵＥＮＣＥＯＮＰＡＧＥＳ４９−５１（２）配列番号２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４６５アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配列の記載：配列番号２：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者マンリー，スーザンピー. アメリカ合衆国 06492 コネチカット州ウォーリングフォード，ノースメインストリート 245番地 (72)発明者コズロースキー，マイケルアール. アメリカ合衆国 06340 コネチカット州ノーンク，ハイストリート 71番地 (72)発明者ニーヴ，レイチェルエル. アメリカ合衆国 02178 マサチューセッツ州ベルモント，＃３，ビーチストリート 103番地

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｃ１００−ＲをコードしているｃＤＮＡ。２．Ｃ１００−Ｒをコードしているヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡベクター。３．Ｃ１００−Ｒ融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡベクター。４．Ｃ１００−Ｒのヌクレオチド配列が宿主内での遺伝子発現を制御する調節配列に機能しうる状態で連結している、請求項２に記載の組換えＤＮＡベクター。５．Ｃ１００−Ｒ融合タンパク質のヌクレオチド配列が宿主内での遺伝子発現を制御する調節配列に機能しうる状態で連結している、請求項３に記載の組換えＤＮＡベクター。６．Ｃ１００−Ｒ配列がラットのＣ１００−Ｒをコードしている、請求項１、２、３、４または５に記載のＤＮＡ。７．Ｃ１００−Ｒ配列がヒトのＣ１００−Ｒをコードしている、請求項１、２、３、４または５に記載のＤＮＡ。８．図４のＣ１００−ＲのＤＮＡ配列（配列番号：１）にストリンジェント条件下でハイブリダイズする能力があるか、または遺伝子暗号の縮重がなかったならば該ＤＮＡ配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズし得ると推測される、請求項１、２、３、４または５に記載のＤＮＡ。９．請求項１、２、３、４または５の組換えＤＮＡベクターを含有する遺伝子操作された宿主細胞。 10．請求項４の組換えＤＮＡ発現ベクターを含有しかつＣ１００− Ｒを発現する遺伝子操作された細胞系。 11．細胞の表面にＣ１００−Ｒを発現する、請求項10に記載の遺伝子操作された細胞系。 12．ヒトＣ１００−Ｒを発現する、請求項10または11に記載の遺伝子操作された細胞系。 13．請求項５の組換えＤＮＡ発現べクターを含有しかつＣ１００−Ｒ融合タンパク質を発現する遺伝子操作された細胞系。 14．細胞の表面にＣ１００−Ｒ融合タンパク質を発現する、請求項13に記載の遺伝子操作された細胞系。 15．ヒトＣ１００−Ｒ融合タンパク質を発現する、請求項13または14に記載の遺伝子操作された細胞系。 16．組換えＣ１００−Ｒの生産方法であって、 (a)請求項４の組換えＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換した、Ｃ１００− Ｒを発現する宿主細胞を培養し、そして (b)細胞培養物からＣ１００−Ｒ遺伝子産物を回収する、ことを含む方法。 17．ヒトのＣ１００−Ｒを生産する、請求項16に記載の方法。 18．組換えＣ１００−Ｒ融合タンパク質の生産方法であって、 (a)請求項５の組換えＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換した、Ｃ１００− Ｒ融合タンパク質を発現する宿主細胞を培養し、そして (b)細胞培養物からＣ１００−Ｒ融合タンパク質を回収する、ことを含む方法。 19．ヒトＣ１００−Ｒ融合タンパク質を生産する、請求項18に記載の方法。 20．単離された組換えＣ１００−Ｒ。 21．ラットＣ１００−Ｒのアミノ酸配列を有する、請求項20に記載の単離されたＣ１００−Ｒ。 22．ヒトＣ１００−Ｒのアミノ酸配列を有する、請求項20に記載の単離されたＣ１００−Ｒ。 23．異種タンパク質またはペプチド配列に結合されたＣ１００−Ｒからなる融合タンパク質。 24．Ｃ１００−Ｒ部分がラットＣ１００−Ｒのアミノ酸配列を有する、請求項23 に記載の融合タンパク質。 25．Ｃ１００−Ｒ部分がヒトＣ１００−Ｒのアミノ酸配列を有する、請求項23に記載の融合タンパク質。 26．Ｃ１００−Ｒヌクレオチド配列の一部に相補的なアンチセンス配列をコードしており、細胞内でＣ１００−Ｒ遺伝子の翻訳を阻害するオリゴヌクレオチド。 27．Ｃ１００−Ｒのアミノ末端領域をコードしているヌクレオチド配列に相補的である、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド。 28．Ｃ１００−Ｒのエピトープと免疫特異的に結合するモノクローナル抗体。 29．Ｃ１００−ＲへのβＡＰＰ−Ｃ１００の結合を競合的に阻害する、請求項28 に記載のモノクローナル抗体。 30．ヒトＣ１００−Ｒと結合する、請求項28または29に記載のモノクローナル抗体。 31．βＡＰＰ−Ｃ１００リガンドのアンタゴニストをスクリーニングして同定する方法であって、 (a)Ｃ１００−Ｒを発現する細胞系と被験化合物とを、βＡＰＰ−Ｃ１００リガンドの存在下で接触させ、そして (b)該被験化合物が該細胞系へのβＡＰＰ−Ｃ１００リガンドの結合および細胞毒作用を阻害するか否かを調べる、ことからなり、その際、アンタゴニストは該細胞系へのβＡＰＰ−Ｃ１００リガンドの結合および細胞毒作用の両方を阻害する化合物として同定される、上記方法。 32．βＡＰＰ−Ｃ１００リガンドのアゴニストをスクリーニングして同定する方法であって、 (a)Ｃ１００−Ｒを発現する細胞系と被験化合物とを、βＡＰＰ−Ｃ１００リガンドの存在下および不在下で接触させ、 (b)βＡＰＰ−Ｃ１００リガンドの存在下で、該被験化合物が該細胞系へのβ ＡＰＰ−Ｃ１００リガンドの結合を阻害するか否かを調べ、そして (c)βＡＰＰ−Ｃ１００リガンドの不在下で、該被験化合物が該細胞系へのβ ＡＰＰ−Ｃ１００リガンドの細胞毒作用を模倣するか否かを調べる、ことからなり、その際、アゴニストは該細胞系へのβＡＰＰ−Ｃ１００リガンドの結合を阻害するが細胞毒作用を模倣する化合物として同定される、上記方法。 33．細胞系が遺伝子操作された細胞系である、請求項31または32に記載の方法。 34．細胞系がＣ１００−Ｒを内因的に発現するものである、請求項31または32に記載の方法。 35．細胞系が神経芽細胞腫の細胞系である、請求項34に記載の方法。