JP2000512160A - Ｈｉｖ−１およびｈｉｖ−２を検出するための核酸プライマーおよびプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 試験試料中のＨＩＶ（ＨＩＶ１およびＨＩＶ２のいずれか一方、または両方）の検出に有用なプライマー／プローブセットが提供される。これらのプライマー／プローブセットは、ＰＣＲまたはＲＴ ＰＣＲを含む核酸増幅法に従って使用することができる。プライマー／プローブセットは、核酸増幅反応を行うための他の試薬とともにキットの形ででも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を検出するための核酸プライマーおよびプローブ 発明の分野 本発明はＨＩＶに関する。特には、本発明はＨＩＶ１およびＨＩＶ２を検出す るためのオリゴヌクレオチドおよび方法に関する。発明の背景 ＨＩＶに分類されるウィルスは自らの遺伝情報としてのＲＮＡを有しており、 ＨＩＶの感染性は、宿主のＤＮＡにその遺伝情報を挿入するというウィルスの能 力に依るものである。遺伝情報を挿入し、その結果、宿主をうまく感染させるた めには、ＨＩＶウィルスはその遺伝物質（ＲＮＡ）をＤＮＡに変換して、ＨＩＶ の遺伝情報が宿主の遺伝情報と適合するようにしなければならない。ＡＩＤＳの 流行を考えれば、明らかにＨＩＶは自らのＲＮＡをＤＮＡに変換することに成功 している。しかしながら、ウィルスがうまくＲＮＡをＤＮＡに変換しうる一方で 、その変換が正確に行われることは滅多にない。言い換えれば、 ウィルスのＲＮＡのＤＮＡ複製物は常に正確であるとは限らず、ＤＮＡ複製物は ウィルスのＲＮＡとは数塩基対異なっている場合がある。したがって、宿主が最 初に単一のウィルス粒子に感染したとしても、何回かの複製の後には、遺伝的に 多様なウィルス集団に感染することになる。 ＨＩＶは統一的に分類されていないものの、ＨＩＶ１とＨＩＶ２が異なるウィ ルスであることは一般に認められている。これら各ウィルスの分類としてはいく つかのグループまたはサブタイプがある。たとえば、ＨＩＶ１の分類としては、 サブタイプＡ〜Ｅにさらに分類される「グループＭ」と、「グループＯ」とがあ る。一方、ＨＩＶ２はサブタイプＡ〜Ｅを含む。ＨＩＶ１およびＨＩＶ２のサブ タイプは、本文中に記載するように、さらに多くのカテゴリーに細分化される。 しかしながら、これらすべての分類はウィルス間の遺伝的差異に基づいており、 分類学的理論によれば、これらのウィルスの多くは単一のウィルスの子孫である 。したがって、多数のＨＩＶのタイプおよびサブタイプは、ＨＩＶの高い突然変 異性およびＨＩＶゲノムの遺伝的多様性を実証するものである。 ウィルスの遺伝的多様性は、上述のようにウィルスが自らの ＲＮＡをＤＮＡに変換するときの非効率さに起因するものと考えることができる 。ウィルスの遺伝的多様性に関する他の理論は、上述のように宿主が複数の異な るＨＩＶ集団に感染することがあり（上述のように単一のウィルスによる感染か ら発することもある）、ウィルスの遺伝情報の複製とパッケージングの過程で、 あるウィルスゲノムの一部分が別のウィルスゲノムの部分と組み換えられるとい うものである。したがって、組み換えられたゲノムのパッケージングによって、 遺伝的に区別されるウィルスが生み出されることになる。ウィルスが突然変異す るときの様式に関わらず、ＨＩＶとして知られるウィルスは非常に突然変異性の 高いゲノムを有し、したがって常に変化し続けていることが分かる。このため、 ウィルスの検出をその遺伝的情報に基づいて行おうとしている研究者は、常に動 いているターゲットに直面することになる。 ＨＩＶゲノムのある領域が保存されていることが知られている。しかしながら 、特にこれらの領域における突然変異が、該領域によってコードされるタンパク 質の構造に影響を及ぼさなければ、これらの領域が突然変異を免れているとは言 えない。したがって、ＨＩＶの遺伝情報に基づいてＨＩＶを検出するた めの試薬および方法の開発が引き続き課題となっている。発明の要約 本発明は、ＨＩＶウィルスの遺伝情報に基づいて、ＨＩＶ（ＨＩＶ１およびＨ ＩＶ２の様々なサブタイプ）を検出するのに有用な試薬を提供する。特には、そ れらの試薬はプライマーとプローブのセットの形態のものであり、該試薬は核酸 増幅法に従って使用することができ、様々なサブタイプのＨＩＶ１およびＨＩＶ ２を特異的かつ高感度で検出する。好適には、ここで提供されるプライマー／プ ローブセットは、２つのプライマー配列と１つのプローブ配列とを含み、逆転写 酵素（ＲＴ）ＰＣＲフォーマットに従って使用される。 ＨＩＶ１の検出に使用することのできる本発明のプライマー／プローブセット は、ここで、プライマー／プローブセット１（配列番号２、３および４）、プラ イマー／プローブセット２（配列番号５、６および７）、プライマー／プローブ セット３（配列番号８、９、１０お１２、１３よび１１）、およびプライマー／ プローブセット４（配列番号および１４）として定義する。ＨＩＶ２の検出に使 用することのできるプライマー／プローブセットは、ここで、プライマー／プロ ーブセット５（配 列番号１６、１７および１８）、プライマー／プローブセット６（配列番号１９ 、２０および２１または２２）、プライマー／プローブセット７（配列番号２３ 、２０および２１）、およびプライマー／プローブセット８（配列番号１６、２ ４および１８）として定義する。 ＨＩＶの検出方法は、一般に以下の段階を含んで構成される。（ａ）核酸増幅 試薬と、少なくとも１つの上記プライマー／プローブセットと、ＨＩＶターゲッ ト配列を含む試料とを含む反応混合液を調製する。（ｂ）反応混合液を増幅条件 下におき、ターゲット配列に相補的である核酸配列を少なくとも１コピー生産す る。（ｃ）プローブをターゲット配列に相補的である核酸配列とハイブリダイズ させ、プローブとターゲット配列に相補する核酸配列とを含むハイブリッドを形 成する。（ｄ）試料中にＨＩＶが存在することを示すハイブリッドを検出する。 好適な逆転写酵素ＰＣＲフォーマットは上記と同じ段階を含むが、増幅試薬が 逆転写酵素活性を有する酵素を含む。さらに、本発明において提供されるいずれ の方法によっても、ターゲット配列のコピー数を増やすために段階（ｂ）を複数 回繰り返すことができる。段階（ｂ）は反応混合液の熱サイクル処理によ って繰り返すことができることは、当業者によって理解されよう。発明の詳細な説明 本発明において提供されるプライマー／プローブセットは、２つのプライマー と少なくとも１つのプローブとを含んで構成される。これらのプライマー／プロ ーブセットは核酸増幅技術に従って使用することができる。したがって、いずれ のプライマー／プローブセットのプライマーも、ターゲット配列を増幅するため に使用することができる。ほとんどの場合、プローブはプライマーの１つによっ て生産されたターゲット配列の複製物とハイブリダイズし、増幅反応中に生産さ れるターゲット配列のあらゆる複製物の検出を容易にする。すべてのプライマー ／プローブセットは、核酸増幅技術に従って使用され、ＨＩＶ１グループＭおよ びグループＯ、並びに様々なサブタイプのＨＩＶ２を特異的かつ高感度で検出す ることができる。ＨＩＶ１のサブタイプを検出するためのプライマー／プローブ セットを下記の表１に、ＨＩＶ２のサブタイプを検出するためのプライマー／プ ローブセットを下記の表２に示した。 前に触れたように、プライマー／プローブセットに含まれるプライマーは、配 列番号２、３、５、６、８、９、１２および１３の場合にはＨＩＶ１ターゲット 配列の複製物の合成を、配列番号１６、１７、１９、２０、２３および２４の場 合にはＨＩＶ２ターゲット配列の複製物の合成を開始させるために使用すること ができる。残りの配列番号（配列番号４、７、１０、１１、１４、１８、２１お よび２２）は、同一のプライマー／プローブセット内のプライマー配列のいずれ か一方または両方の増幅産物とハイブリダイズする。たとえば、プライマー／プ ローブセット６は、配列番号１９および２０がＨＩＶ２ターゲット配列の合成を 開始させ、配列番号２１および２２が配列番号１９および２０によって生産され た増幅産物とハイブリダイズする限りにおいて、ＨＩＶ２に特異的である。した がって、プローブ配列は、ＨＩＶ１またはＨＩＶ２の様々なサブタイプに対して も特異的である。 プライマー配列は一般に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮ Ａ）から成る。一方、プローブ配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸アナログなど から成ってもよく、該核酸アナログは、たとえば、国際特許出願ＷＯ９２／２０ ７０２に 開示されている、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むがそれに限定されることはない 無荷電の核酸アナログ、あるいは、ここで引用によって援用する米国特許第５， １８５，４４４号、第５，０３４，５０６号および第５，１４２，０４７号に記 載されている、モルホリンアナログ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ａｎａｌｏｇ）な どである。そのような配列は、現在利用可能な様々な技術を用いて常套的に合成 することができる。たとえば、ＤＮＡ配列は、従来のヌクレオチドホスホルアミ ダイト化学、および、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、デュポン（Ｗｉ ｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、またはミリゲン（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）より入手 可能な装置を用いて合成することができる。同様に、配列は所望により、ここで 引用によって援用する米国特許出願第５，４６４，７４６号、第５，４２４，４ １４号、および第４，９４８，８８２号などに記載されているような、当該技術 分野における周知の方法を用いて標識することもできる。 ここで用いる「ラベル」という用語は、検出可能な性質または特性を有する分 子または部分を意味する。ラベルは、たとえ ば放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、酵素、コロイド粒子、蛍光性微粒 子などによる直接的に検出可能なものであってもよいし、あるいは、たとえば特 異的に結合する要素などによって間接的に検出可能なものであってもよい。直接 的に検出可能なラベルは、ラベルの検出を可能にする追加の成分、たとえば基質 、引き金（トリガー）試薬、光線などを必要とすることもあることが理解されよ う。間接的に検出可能なラベルを使用する場合、それらのラベルは典型的にはコ ンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と組み合わせて使用される。コンジュゲー トは、典型的には直接検出可能なラベルに、連結またはカップリングされた特異 的結合要素である。コンジュゲートを合成するためのカップリング化学は当該技 術分野において周知であり、たとえば、特異的結合要素の特異的結合特性または ラベルの検出可能特性を損なわないあらゆる化学的手段および／または物理的手 段が含まれる。ここで用いる「特異的結合要素」とは、結合対、すなわち一方の 分子がたとえば化学的または物理的手段を介して特異的に他方の分子に結合する ような異なる分子の対の１要素を意味する。抗原抗体特異的結合対に加えて、他 の特異的結合対としては、アビジンとビオチン、ハプテンと ハプテンに特異的な抗体、相補的核酸配列、酵素補因子または基質と酵素などが 含まれるが、これらに限定されることはない。 ここで用いる「試料」という用語は、ＨＩＶターゲット配列を含む疑いのある あらゆるものを意味する。試験試料は、たとえば血液、眼球レンズ液、大脳脊椎 液、乳汁、腹水、滑液、腹膜液、羊水、組織、発酵培養液、細胞培養物などのあ らゆる生物学的起源に由来するものであるか、由来するものであることができる 。試験試料は（ｉ）起源から得たものを直接、あるいは（ｉｉ）試料の性質改変 するための前処理を行った形で使用することができる。したがって、試験試料は 使用に先だって、たとえば、血液から血漿を調製する、細胞またはウィルス粒子 を分離する、固体物質から液体を調製する、粘性の液を希釈する、液体を濾過す る、液体を蒸留する、液体を濃縮する、干渉成分を不活性化する、試薬を添加す る、核酸を精製するなどの方法で前処理することができる。 ここで用いる「ターゲット配列」という用語は、本発明で提供されるプライマ ー／プローブセットを用いて検出、増幅、あるいは検出および増幅される核酸配 列を意味する。さらに、ターゲット配列という用語は時として一本鎖のことを指 すが、当 業者であればターゲット配列が実際には二本鎖であってもよいことを理解するで あろう。したがって、ターゲットが二本鎖である場合には、本発明のプライマー 配列により、ターゲット配列の両方の鎖が増幅される。 先に述べたように、どの特定のプライマー／プローブセット（それら自身また は付加的なオリゴヌクレオチドを有する）のプライマー配列も、当該技術分野に おいて周知の核酸増幅法に従って増幅用プライマーとして使用することができる 。そのような反応としては、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８ ３，２０２号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＥＰ−Ａ−３ ２０ ３０８に記載されているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および、米国特許 第５，４２７，９３０号に記載されているギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）などが含 まれるが、これらに限定されることはない。上記文献はすべてここで引用によっ て援用する。上に例示したすべての増幅反応は包括して、ＤＮＡターゲット配列 の複製物を複数生産する。 本発明に従えば、ターゲット配列は実際にＤＮＡであってもよいが、ＨＩＶゲ ノムがＲＮＡからなることを考慮すると、プライマー／プローブセットは、ここ で引用によって援用する米 国特許第５，３２２，７７０号および第５，３１０，６５２号に記載されている 「ＲＴ ＰＣＲ」フォーマットに従って使用してもよい。簡単に説明すると、Ｒ Ｔ ＰＣＲはＲＮＡターゲット配列をＤＮＡ鎖に転写する方法を提供する。ＲＮ Ａターゲットから転写されて複製されたＤＮＡ鎖は、一般に「ｃＤＮＡ」と呼ば れ、上述のあらゆる方法による増幅のための鋳型として使用することができる。 ｃＤＮＡの生産方法は、ＰＣＲなどの上述の他の増幅方法に関連するハイブリダ イゼーションおよび伸長方法の多くと共通するものであるが、使用する酵素が逆 転写酵素活性を有していなければならない。逆転写酵素活性を有する酵素はＲＴ ＰＣＲ法とともに周知であり、これ以上の説明は必要ないであろう。さらに、 ｃＤＮＡを合成するための別法も周知であり、これには、ここで引用によって援 用する１９９５年２月２２日付で出願された、公知の米国特許出願番号０８／３ ５６，２８７が含まれる。 好適な実施態様によれば、プライマー／プローブセットは、ここで引用によっ て援用する１９９５年８月１４日付で出願された米国特許出願番号０８／５１４ ，７０４に記載されている「オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションＰＣ Ｒ」（本 文中では「ＯＨ ＰＣＲ」と呼ぶ場合もある）増幅反応において使用する。簡単 に説明すると、好適な方法において使用される試薬は、（プライマー／プローブ セット１〜８として示される）少なくとも１つのプライマー／プローブセット、 ならびに増幅反応を行うための他の試薬を含む。「増幅反応を行うための他の試 薬」または「核酸増幅試薬」は、周知の試薬を含み、ポリメラーゼ活性、酵素補 因子（たとえばマグネシウム）、塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ ＮＡＤ）、およびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）（たとえばデオ キシアデニン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸 、およびデオキシチミン三リン酸）などを含んでいてもよいが、これらに限定さ れることはない。 好適な方法は一般に以下の段階（ａ）〜（ｄ）を含む。（ａ）核酸増幅試薬と 、少なくとも１つの本発明のプライマー／プローブセットと、ターゲット配列を 含む疑いのある試料とを含む反応混合液を調製する。（ｂ）混合液を増幅条件下 におき、ターゲット配列に相補的な核酸配列を少なくとも１コピー生成させる。 （ｃ）プローブをターゲット配列に相補的な核酸配列とハイブリダイズさせ、プ ローブとターゲット配列に相補的な核 酸配列とによるハイブリッドを形成させる。（ｄ）サンプル中にターゲット配列 （ＨＩＶ）が存在することを示すものとしてのハイブリッドを検出する。上記方 法において、段階（ｃ）に先だって、当該技術分野において周知のように、反応 混合液の熱サイクルを１０〜１００回、より典型的には２０〜６０回行うことに より、段階（ｂ）を数回繰り返すことができることが理解されよう。 増幅条件は、一般に、１またはそれ以上の核酸配列のアニーリングおよび伸長 を促進する条件として規定される。そのようなアニーリングは、かなり予測でき るやり方で、温度、配列の長さ、相補性、および配列のＧ：Ｃ含量を含むいくつ かのパラメータ次第で変わることは、当該技術分野において周知である。たとえ ば、相補的核酸配列の置かれる環境中の温度を低くすることにより、アニーリン グが促進される。任意の配列の組に対して、融解温度あるいはＴｍをいくつかの 既知の方法によって見積もることができる。典型的には、診断用途においては、 融解温度近く（すなわち１０℃以内）のハイブリダイゼーション温度を使用する 。イオン強度または「塩」濃度もまた融解温度に影響を与える。これは、小さな カチオンがリン酸ジエステル のバックボーン上の負荷電を打ち消して二重らせんの形成を安定化させる傾向に あるためである。典型的な塩濃度はカチオンの性質と原子価に依存するが、当業 者によって容易に理解されよう。同様に、Ｇ：Ｃ含量が高い場合と、配列の長さ が長い場合にも二重らせんが安定化されることが知られている。これは、Ａ：Ｔ 対が２つの水素結合しか持たないのに対し、Ｇ：Ｃ対は３つの水素結合を含んで いるためであり、また配列が長くなると配列同士を繋ぎ止めている水素結合の数 も増加するためである。したがって、高いＧ：Ｃ含量および長い配列長は、融解 温度を上昇させることによって、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える。 任意の診断用途に対する配列が選択されると、Ｇ：Ｃ含量および配列長を知る ことができ、ハイブリダイゼーション条件に包含されるものを正確に決定するた めにこれらを考慮に入れることができる。イオン強度は典型的には酵素活性に対 して最適化されるので、変化させることのできるパラメータは温度だけになる。 一般に、ハイブリダイゼーション温度は、プライマーまたはプローブのＴｍ付近 またはＴｍに選ばれる。したがって、ある特定のプライマー／プローブセットに 対する適切なハイブ リダイゼーション条件を得ることは、当業者の通常の知識の範囲にある。 ＯＨ ＰＣＲ法によれば、プライマー、プローブ、および反応条件は、プロー ブ配列がプライマー配列よりも低い融解温度を有し、反応混合液を増幅条件にお いた場合に、プローブのＴｍよりも高い温度でターゲット配列の複製物またはそ の相補物（アンプリコンと呼ばれる場合もある）が生産されるように選択するこ とが好ましい。そのような複製物が合成された後、それらを変性させて混合液を 冷却し、プローブと、ターゲットの複製物またはその相補物との間でハイブリッ ドを形成させる。温度を変性温度からプローブが一本鎖複製物と結合する温度ま で低下させる速度は、好適には、たとえば約８分〜約１５分とかなり速く、好適 には２分未満である。このように急速に冷却することは、アンプリコンの相補鎖 間でのハイブリッド形成ではなく、たとえばターゲット配列の複製物とプローブ の間でのハイブリッド形成にとって有利である。 プライマー配列産物を検出するためにラベルを使用する場合には、捕捉ラベル または検出ラベルのいずれかでプライマー配列を標識する。プローブ配列は、プ ライマー配列によって生産 された配列とハイブリダイズさせるために使用され、典型的にはプライマー配列 を含まない配列とハイブリダイズする。プライマー配列の場合と同様に、プロー ブ配列もまた捕捉ラベルまたは原子価を有する検出ラベルのいずれかでラベルさ れる。プローブのラベルは、プライマーが捕捉ラベルでラベルされている場合に は検出ラベルであり、逆にプライマーが検出ラベルでラベルされている場合には 捕捉ラベルである。検出ラベルは前に定義した「ラベル」と同一の定義のもので あり、「捕捉ラベル」は典型的には、伸長産物および他の増幅反応物に由来する 副産物と結合したプローブを分離するために用いられる。（前に定義した）特異 的結合要素がこの目的のために特に適している。また、本方法に従って使用され るプローブは、ハイブリダイゼーション条件下で伸長しないように、３’末端に おいてブロックされていることが好ましい。プローブの伸長を防止する方法は周 知であり、当業者による選択事項である。典型的には、プローブの３’末端にリ ン酸基を添加するだけで、プローブの伸長を阻止する目的に対しては十分である 。 複製配列／プローブハイブリッドが形成されると、複製配列およびプローブ配 列上の異なるラベル（すなわち捕捉ラベルと 検出ラベル）を用いて、そのようなハイブリッドを分離、検出することができる 。好ましくは、検出は市販のＡｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（登録商標）機器（Ａｂｂｏ ｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）によって用 いられるプロトコールに従って行う。 前に検討したように、ターゲット配列はＤＮＡであってもよいし、ターゲット 配列はＨＩＶゲノム中に埋め込まれていてもよく、したがってターゲット配列は ＲＮＡの形であってもよい。ターゲット配列がＨＩＶゲノムの一部である場合に は、いわゆる核酸増幅試薬の一部として逆転写酵素活性を有する酵素を含め、続 く増幅反応のためにｃＤＮＡを生産することが好ましい。本実施態様によれば、 プライマー配列はｃＤＮＡ合成のためのプライマーとしての役割も果たす。本発 明では、ｃＤＮＡの生産、次に増幅、そして増幅されたｃＤＮＡ配列の検出とい うように段階を区別したが、これらのプロセスを１つの増幅反応混合液中で同時 に行ってもよいことが理解されよう。 他の実施態様によれば、２つのプライマー／プローブセットの組み合わせ（一 方はＨＩＶ１特異的プライマー／プローブセットから選ばれ、他方はＨＩＶ２特 異的プライマー／プローブ セットから選ばれる）を用いた１つの反応において、ＨＩＶ１およびＨＩＶ２を 同時に検出することができる。たとえば、試験試料を、逆転写酵素活性を有する 酵素を含んでいても含んでいなくてもよい増幅試薬とともにプライマー／プロー ブセット１および８に接触させて、増幅を行い、試験試料中のＨＩＶ１およびＨ ＩＶ２の存在を検出することができる。 本発明のオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ１またはＨＩＶ２を検出するための有 用なキットの一部として提供されることもできる。このキットは、本発明による １またはそれ以上のプライマー／プローブセットを収容する１またはそれ以上の 適切な容器と、ポリメラーゼ活性を有する酵素と、デオキシヌクレオチド三リン 酸と、任意に逆転写酵素活性を有する酵素とを含んで構成される。典型的には、 少なくとも１つの配列がラベルを持つが、ラベルなしでも検出は可能である。 以下の実施例は、本発明をさらに説明するためのものであって、本発明を限定 するものではない。 実施例 以下の実施例では、本発明において提供されるプライマー／プローブセットを 用いてＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の様々な サブタイプが検出されることを実証する。プライマー／プローブセットを構成す るＤＮＡプライマーおよびプローブは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０ 、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、 配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配 列番号２２、配列番号２３、および、配列番号２４として同定される。配列番号 ２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号 ８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、 および、配列番号１４はＨＩＶ−１に対して特異的である。ＨＩＶ−１（サブタ イプＢ、ＭＮ株）からの代表的なターゲット配列をここで配列番号１として定義 する。配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２ ０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および、配列番号２４はＨＩ Ｖ−２に対して特異的である。ＨＩＶ−２（サブタイプＡ、ＮＩＨ−Ｚ株）から の代表的なターゲット配列をここで配列番号１５として定義する。すべてのプラ イマーおよびプローブは、３１個のＨＩＶ−１グループＭ（サブタイ プＡＮＢおよびＤ）およびグループＯの単離体に由来するコンセンサス配列であ り、またＨＩＶ−２配列についてはサブタイプＡおよびＢの両方の単離体に由来 するコンセンサス配列である。 以下の実施例においては、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６ 、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、および、配列番号１３をＨＩＶ−１ ターゲット配列に特異的なコンセンサス増幅プライマーとして使用する。配列番 号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１４をＨＩＶ −１増幅産物に対するコンセンサス内部ハイブリダイゼーションプローブとして 使用する。配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番 号２３、および配列番号２４を、ＨＩＶ−２ターゲット配列に対して特異的なコ ンセンサス増幅プライマーとして、また、配列番号１８、配列番号２１および配 列番号２２を、ＨＩＶ−２増幅産物に対するコンセンサス内部ハイブリダイゼー ションプローブとして使用する。 実施例１ ＨＩＶプライマーおよびプローブの調製 Ａ．ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のコンセンサスプライマー コンセンサスプライマーは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣ Ｒによって、すべての既知のＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２を検出するように設計 した。ＨＩＶ−１に対しては配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６ 、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、および配列番号１３のプライマーを 作製し、ＨＩＶ−２に対しては、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、 配列番号２０、配列番号２３、および配列番号２４を作製した。プライマー配列 は標準的なオリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成し、ここで引用によって援 用する米国特許第５，４２４，４１４号に記載されている標準的なシアノエチル ホスホルアミダイト結合化学を用いて、該プライマー配列の５’末端をアダマン タンによってハプテン化した。 Ｂ．ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のコンセンサスプローブ コンセンサスプローブは、増幅されたＨＩＶターゲット配列とオリゴヌクレオ チドハイブリダイゼーションによってハイブリダイズするように設計した。ＨＩ Ｖ−１に対しては配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、およ び配列番 号１４のプローブを作製し、ＨＩＶ−２に対しては、配列番号１８、配列番号２ １、および配列番号２２を作製した。プローブ配列は標準的なオリゴヌクレオチ ド合成方法を用いて合成し、（ここで引用によって含める）米国特許第５，４６ ４，７４６号に記載されている標準的なシアノエチルホスホルアミダイト結合化 学を用いて、該プローブ配列の５’末端を２つのカルバゾールによってハプテン 化し、３’末端をリン酸によってブロックした。 実施例２ ＨＩＶ−１検出の感度 ＨＩＶ−１のサブタイプＢは、欧州および米国において最も一般的なＨＩＶ− １株であると報告されているので、この株を種々のＨＩＶ−１のコンセンサスプ ライマー／プローブセットの感度を調べるために使用した。ＲＮＡは、勾配精製 したＨＩＶ−１のサブタイプＢビリオンから、製造業者（キアゲン，Ｆｒａｎｋ ｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の説明に従って、キアゲンＲＮＡ抽出法およびカラ ム技法を用いて単離した。ＲＮＡを１ミリリットル当たりのウィルスＲＮＡのコ ピー数として定量し、検出に適した濃度まで、１ｎｇ／μｌのリボゾームＲ ＮＡ中に希釈した。 以下に示す４つの異なるＨＩＶ−１コンセンサスプライマー／プローブセット について評価を行った。セット＃１：配列番号２および３をプライマーとして用 い、配列番号４をプローブとして用いたもの。セット＃２：配列番号５および６ をプライマーとして用い、配列番号７をプローブとして用いたもの。セット＃３ ：配列番号８および９をプライマーとして用い、配列番号１０および１１をプロ ーブとして用いたもの。セット＃４：配列番号１２および１３をプライマーとし て用い、配列番号１４をプローブとして用いたもの。すべての配列は実施例１に 記載したようにして調製した。 上記４種のＨＩＶ−１コンセンサスプライマー／プローブセットに対して別々 の準備された反応系を用いて、精製ＨＩＶ−１ ＲＮＡの希釈液の逆転写、ＰＣ Ｒ増幅および検出を行った。ＲＴ−ＰＣＲは、５０ｍＭビシン、ｐＨ８．２５、 １１５ｍＭ酢酸カリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、８％グリセロール、１０μｇ ／μｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．０２％アジ化ナトリウムを用 いて行った。組換えサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏ ｐｈｉｌｕｓ）ポリメ ラーゼを１反応あたり５ユニットの濃度で用い、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ 、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）をそれぞれの最終濃度が０．１５ｍＭとなるように 共存させた。プライマーはそれぞれ５００ｎＭの濃度で使用し、プローブはそれ ぞれ１０ｎＭの濃度で使用した。２５〜５０μｌ容積の試料を含む全容積０．２ ｍｌの反応溶液に対して、最終濃度が２．５ｍＭとなるようにＭｎＣｌ₂を使用 した。反応溶液中に１００ｎｇのリボゾームＲＮＡのみを含むものを陰性対照と した。 反応混合液の逆転写および増幅は、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ ｅｒ）４８０型サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４８０ Ｔｈ ｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）中で行った。まず最初に反応混合液を６２℃で３０ 分間インキュベートしてＲＮＡの逆転写を行った後、９４℃に３０秒間保持した 。その後、増幅の初期段階における反応の厳密さを確保するためにタッチダウン またはステップダウンプロトコールを介して、ＰＣＲ増幅を開始した。このプロ トコールでは、以下の８サイクルを記載の順序で用いた。７０℃、８０秒間→９ ４℃、３０秒間を１サイクル。６９℃、８０秒間→９４℃、３０秒間を１サイク ル。６８℃、８０秒間→９４℃、３０秒間 を１サイクル。６７℃、８０秒間→９４℃、３０秒間を１サイクル。６６℃、８ ０秒間→９４℃、３０秒間を１サイクル。６５℃、８０秒間→９４℃、３０秒間 を１サイクル。６４℃、８０秒間→９４℃、３０秒間を１サイクル。６３℃、８ ０秒間→９４℃、３０秒間を１サイクル。その後、６２℃、８０秒間→９４℃、 ３０秒間を１サイクルとして、このサイクルを３５サイクル繰り返し、さらなる 増幅を行った。熱サイクルの終了後、混合液を９７℃で１５分間保持し、２分以 内に温度を４℃まで低下させることにより、プローブオリゴハイブリダイゼーシ ョンを行った。反応産物の検出を行うまで、試料は４℃に保持した。 反応産物はＡｂｂｏｔｔ Ｌｃｘ（登録商標）システム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬより入手可）上で検出し た。抗カルバゾール抗体で被覆された微粒子の懸濁液と、抗アダマンタン抗体／ アルカリホスファターゼコンジュゲート（これらはすべてＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬより市販されている）とを 、ＬＣｘ（登録商標）との結合に使用し、反応産物を捕捉、検出した。使用した 酵素基質はメチル ウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）であり、ＭＵＰからＭＵ（メチルウン ベリフェロン）への変換速度を、数／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）として表した。 本実験から得られたデータを表３に示す。これらのデータは、ＨＩＶ−１プラ イマー／プローブセット１、２および３を用いた場合には１０分子／検定（モル ／検定）の濃度までＨＩＶ−１のサブタイプＢの検出が可能であるが、プライマ ー／プローブセット４を用いた場合には１００分子／検定までしか検出できない ことを示している。 実施例３ ＨＩＶ−２検出の感度 種々のＨＩＶ−２コンセンサスプライマー／プローブセットの感度を調べるた めに、ＨＩＶ−２のサブタイプＡを使用した。 ＲＮＡは、勾配精製したＨＩＶ−２のサブタイプＡビリオン（ＨＩＶ−２_NIHZ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂ ｉａ，ＭＤ）から、製造業者（キアゲン，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ ）の説明に従って、キアゲンＲＮＡ抽出法およびカラム技法を用いて単離した。 ＲＮＡは、最初に電子顕微鏡で定量しておいたビリオンから精製した。得られた 精製ＲＮＡは、１ｎｇ／μｌのリボゾームＲＮＡ中に検出に適切な濃度まで希釈 した。 以下に示す３つの異なるＨＩＶ−２コンセンサスプライマー／プローブセット について評価を行った。セット＃５：配列番号１６および１７をプライマーとし て用い、配列番号１８をプローブとして用いたもの。セット＃６：配列番号１９ および２０をプライマーとして用い、配列番号２２をプローブとして用いたもの （配列番号２１をプローブとして単独で、あるいは配列番号２２と組み合わせて 使用することもできる）。セット＃７：配列番号２０および２３をプライマーと して用い、配列番号２１をプローブとして用いたもの。すべての配列は実施例１ に記載したようにして調製した。 実施例２の記載と同様にして、別個の反応系として３種のＨ ＩＶ−２コンセンサスプライマー／プローブセットを用いた反応混合液を調製し 、逆転写および増幅を行った後、検出を行った。 表４に示した結果は、ＨＩＶ−２プライマー／プローブセット５および６を用 いた場合には１分子／検定（モル／検定）の濃度までＨＩＶ−２の検出が可能で あるが、プライマー／プローブセット７を用いた場合には１００分子／検定まで しか検出できないことを示している。 実施例４ ＨＩＶ−１サブタイプの検出 ＨＩＶの遺伝的多様性は検出に対して最も問題となる事項である。検定では、 最も広範に多様化したサブタイプ「Ｏ」を含 むすべてのサブタイプを正確に検出することが必要とされる。血清試料は、ＨＩ Ｖ−１のサブタイプＡ〜ＦのＤｉｇｅｎｅ（Ｓｌｉｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ ＭＤ ）および、ＨＩＶ−１のサブタイプＯの２つの単離体より得た。各単離体からキ アゲンカラムを用いてウィルスＲＮＡを抽出、精製した。方法は製造業者（キア ゲン，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の説明に従った。ＲＮＡを１ミリ リットル当たりのウィルスＲＮＡのコピー数として定量し、検出のために１ｎｇ ／μｌのリボゾームＲＮＡによって１０倍連続希釈を行った。表５は、各サブタ イプに対する各希釈試料において使用したＲＮＡ（分子／検定）の量を示してい る。 別個の反応系において４つの異なるコンセンサスプライマー／プローブセット を用いて、実施例２に記載のように、種々のＨＩＶ−１サブタイプからのＲＮＡ 試料の逆転写、増幅および検出を行った。サブタイプＯはＨＩＶ−１プライマー ／プローブセット＃１のみを用いて試験した。以下の表６〜９に試験の結果を示 す。 ＨＩＶ−１プライマー／プローブセット＃１により、広範に多様化したサブタ イプＯを含む上記表６中の試験したすべてのＨＩＶ−１サブタイプが、１００〜 １分子／検定の感度範囲で検出された。 ＨＩＶ−１プライマー／プローブセット＃２により、上記表７中の試験したす べてのＨＩＶ−１サブタイプが、ＨＩＶ−１プライマー／プローブセット＃１と 同様の感度で検出された。 （ＮＤ＝測定せず） ＨＩＶ−１プライマー／プローブセット＃３により、上記表８中の試験した６ つのＨＩＶ−１サブタイプのうち５つのサブタイプが検出され、検出の感度は約 ２００モル／検定であった。 （ＮＤ＝測定せず） ＨＩＶ−１プライマー／プローブセット＃４により、上記表９中の試験した６ つのＨＩＶ−１サブタイプのうち４つのサブタイプが検出され、検出の感度は２ ０００〜２００モル／検定であった。 実施例５ ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２プライマー／プローブセットの特異性 ＨＩＶ−１プライマー／プローブセット＃１および＃２の、ＨＩＶ−１のサブ タイプＢ（ＭＮ株および３Ｂ株）から抽出、精製したＲＮＡに対する特異性、お よび実施例４と同様のＨＩＶ−２血清試料に対する特異性を調べた。２つの異な るＨＩＶ−１コンセンサスプライマー／プローブセットを使用して、別個の反応 系において、実施例２に記載したようなＲＮＡ試料の１：１０希釈液に対する逆 転写、増幅および検出を行った。表１０に示されるように、どちらのＨＩＶ−１ プライマー／プロ−ブセットも、両方のＨＩＶ−１ ＲＮＡを検出したが、ＨＩ Ｖ−２血清からＲＮＡは検出しなかった。このことは、ＨＩＶ−１プライマー／ プローブセットがＨＩＶ−１の検出に特異的であり、ＨＩＶ−２とは交差反応せ ず、ＨＩＶ−２を検出しないことを示す。 次にＨＩＶ−２プライマー／プローブセット＃５の、実施例２のような勾配精 製ＨＩＶ−１から単離したＲＮＡに対する特異性を調べた。精製ＨＩＶ−１ Ｒ ＮＡの希釈液に対し、ＨＩＶ−２コンセンサスプライマー／プローブセット＃５ を用いて実施例２のように、逆転写、ＰＣＲ増幅、および検出を行った。対照と して、別の反応系においてＨＩＶ−１コンセンサスプライマー／プローブセット ＃１を使用した。表１１の結果は、ＨＩＶ−２プライマー／プローブセット＃５ はＨＩＶ−１のＲＮＡと交差反応せず、ＨＩＶ−１ ＲＮＡを検出しないことを 示している。 実施例６ ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２プライマー／プローブによるＨＩＶ−１またはＨＩ Ｖ−２の検出 ２つの別個の反応ではなく、１つの反応においてＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ の両方を検出することを可能にするために、ＨＩＶ−１に対するプライマー／プ ローブセットとＨＩＶ−２に対するプライマー／プローブセットとを同じ反応に おいて使用することが当然考えられる。これが実現可能であるかどうかは、ＨＩ Ｖ−１に対するプライマー／プローブセットとＨＩＶ−２に対するプライマー／ プローブセットとを混合し、これを用いてＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のいずれ かの精製ＲＮＡを検出することによって試験した。 ＨＩＶ−１ ＲＮＡおよびＨＩＶ−２ ＲＮＡは、それぞれ実施例２および３ のようにして精製、定量した。ＨＩＶ−１プライマー／プローブセット＃１と、 実施例１に記載のようにして調製した、プライマーとしての配列番号１６および ２４およびプローブとしての配列番号１８から成るＨＩＶ−２プライマー／プロ ーブセット＃８とを、一緒に、あるいは別個に使用して、実施例２に記載したよ うにして、精製ＨＩＶ−１およびＨ ＩＶ−２ ＲＮＡの希釈液に対する逆転写、増幅、および検出を行った。結果を 表１２に示す。 （ＮＤ＝測定せず） ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２にプライマー／プローブセットを同一の反応混合 物において使用した場合、ＨＩＶ−２の検出にはｌｏｇ１〜１．５の低下が見ら れたが、感度に関しては１反応あたり約１０分子と許容範囲に保たれていた。重 要なのは、ＨＩＶ−１の反応混合物中に、ＨＩＶ−１プライマー／プローブセッ トとＨＩＶ−２プライマー／プローブセットを共存させても、ＨＩＶ−２の検出 に変化は無く、感度も１反応あたり約１０分子に維持されていたことである。 本発明を詳細に、また特別な実施態様を参照しながら説明してきたが、本発明 の精神と範囲を逸脱しない限りにおいて、そのような実施態様に対して様々な変 更および改変ができることは当業者にとって明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エスピング，クローデイア・エイ・サイガ ン アメリカ合衆国、イリノイ・60134、ジエ ニーバ、クリツシー・アベニユー・321 (72)発明者 ゴルゾウスキー，ヤセツク・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60073、ラウ ンド・レイク・パーク、ノース・リンデ ン・ドライブ・210 (72)発明者 ホーンル，ロバート・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60014、クリ スタル・レイク、テインバー・ヒル・ドラ イブ・97 (72)発明者 ムーア，ジエニフアー・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60614、シカ ゴ、アパートメント・１、ノース・セミナ リー・2520

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． プライマー／プローブセット１（配列番号２、３および４）と、プライマ ー／プローブセット２（配列番号５、６および７）と、プライマー／プローブセ ット３（配列番号８、９、１０および１１）と、プライマー／プローブセット４ （配列番号１２、１３および１４）と、プライマー／プローブセット５（配列番 号１６、１７および１８）と、プライマー／プローブセット６（配列番号１９、 ２０および２１または２２）と、プライマー／プローブセット７（配列番号２３ 、２０および２１）と、プライマー／プローブセット８（配列番号１６、２４お よび１８）とからなるプライマー／プローブセットの群より選択される、ＨＩＶ −１またはＨＩＶ−２を検出するためのプライマー／プローブセット。 ２． 試験試料中のＨＩＶの検出方法であって、該方法は （ａ）核酸増幅試薬と、請求項１の少なくとも１つのプライマー／プローブセ ットと、ＨＩＶターゲット配列を含む試料とを含む反応混合液を調製する段階と 、 （ｂ）該混合液を増幅条件下におき、ターゲット配列に相補 的である核酸配列を少なくとも１コピー生産する段階と、 （ｃ）プローブをターゲット配列に相補的である核酸にハイブリダイズさせ、 プローブとターゲット配列に相補的である核酸配列とを含むハイブリッドを形成 する段階と、 （ｄ）試験試料中にＨＩＶが存在することを示すものとしてハイブリッドを検 出する段階と、 を含むことを特徴とする方法。 ３． 前記増幅試薬は逆転写酵素活性を有する酵素を含み、前記方法は段階（ａ ）と段階（ｂ）の間に、ＨＩＶゲノムからＣＤＮＡを生産する段階をさらに含む ことを特徴とする、請求項２に記載の方法。 ４． 前記少なくとも１つのプライマー／プローブセットが、プライマー／プロ ーブセット１（配列番号２、３および４）と、プライマー／プローブセット２（ 配列番号５、６および７）と、プライマー／プローブセット３（配列番号８、９ 、１０および１１）と、プライマー／プローブセット４（配列番号１２、１３お よび１４）とからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方 法。 ５． 前記少なくとも１つのプライマー／プローブセットが、 プライマー／プローブセット５（配列番号１６、１７および１８）と、プライマ ー／プローブセット６（配列番号１９、２０および２１または２２）と、プライ マー／プローブセット７（配列番号２３、２０および２１）と、プライマー／プ ローブセット８（配列番号１６、２４および１８）とからなるプライマー／プロ ーブセットの群より選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。 ６． 段階（ｂ）が１０〜１００回繰り返されることを特徴とする請求項２に記 載の方法。 ７． ａ）プライマー／プローブセット１（配列番号２、３および４）と、プラ イマー／プローブセット２（配列番号５、６および７）と、プライマー／プロー ブセット３（配列番号８、９、１０および１１）と、プライマー／プローブセッ ト４（配列番号１２、１３および１４）と、プライマー／プローブセット５（配 列番号１６、１７および１８）と、プライマー／プローブセット６（配列番号１ ９、２０および２１または２２）と、プライマー／プローブセット７（配列番号 ２３、２０および２１）と、プライマー／プローブセット８（配列番号１６、２ ４および１８）とからなるプライマー／プローブセットの群 より選択される、少なくとも１つのプライマー／プローブセットと、 ｂ）増幅試薬と、 を含むことを特徴とするキット。 ８． 前記増幅試薬は、逆転写酵素活性を有する酵素を含むことを特徴とする請 求項７に記載のキット。 ９． 前記キットは少なくとも２つのプライマー／プローブセットを含み、 （ａ）該少なくとも２つのプライマー／プローブセットの一方は、プライマー ／プローブセット１（配列番号２、３および４）と、プライマー／プローブセッ ト２（配列番号５、６および７）と、プライマー／プローブセット３（配列番号 ８、９、１０および１１）と、プライマー／プローブセット４（配列番号１２、 １３および１４）とからなる群より選択され、 （ｂ）該該少なくとも２つのプライマー／プローブセットの一方は、プライマ ー／プローブセット５（配列番号１６、１７および１８）と、プライマー／プロ ーブセット６（配列番号１９、２０および２１または２２）と、プライマー／プ ローブセット７（配列番号２３、２０および２１）と、プライマー／ プローブセット８（配列番号１６、２４および１８）とからなるプライマー／プ ローブセットの群より選択されることを特徴とする、請求項７に記載のキット。