JP2000512301A - 殺微生物組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 水溶性ポリマーと活性成分，1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンからなり，細菌およびかびの夾雑の制御のために培養培地の化学滅菌剤として用いられる殺微生物組成物が提供される．この技術的な解決は，固体および液体培養培地の滅菌，とくに「インビトロ」栽培植物の生産に有用であり，また驚くべきことに，従来の培地に要求される滅菌過程を，穀類の「インビトロ」植物の根づけ過程に必要なホルモンの添加も含めて完全に置換することが見出された．

Description

【発明の詳細な説明】 殺微生物組成物 技術分野 本発明は，微生物学の分野，とくに活性成分として1-(5-ブロモフラン-2-イル )-2-ブロモ-2-ニトロエテンを含有する殺微生物組成物に関し，それは細菌およ びかびの夾雑物質の制御のために培養培地の化学滅菌剤として使用される． 従来技術 たとえば「インビトロ」で栽培される植物の生産における培養培地の夾雑物に 対し，即座に汚染を排除できるのはオートクレーブしかないことから，その全体 的過程にかなりの損失を生じる．場合により，様々な抗生物質たとえばセフォタ キシム，ノボビオシン，およびジヒドロストレプトマイシンが夾雑物質の防止に 使用されてきたが，満足できる結果は得られていない． 他方．特許出願ＷＯ 89/11793には，広いスペクトルの工業的抗微生物剤とし て2-(2-ブロモ-2-ニトロエテニル)-フランの使用が記載されている． 化合物，１-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンは，以前に記 載されていて（Z.N.Nazarova，1972，"Synthesis of some furylnitroolefins， with potential biological activity"，Khim.Farm.Zh．6(10):5-8ならびにZ.N. Nazarovaら，1972，"Physicochemical properties and reactivity of furyl-ni troolefins，Zh.Org.Khim．8(2):404-11），また強力な抗細菌および抗かび活性 を有する物質として知られている（欧州特許出願ＥＰ-Ａ 0 678 516）． 発明の開示 本発明は，培養培地中の夾雑物質たとえば細菌またはかびの夾雑物質の制御に 有利に使用できる殺微生物組成物を提供する． 固体および液体培養培地の滅菌に使用できるこの技術的解決はとくに，「イン ビトロ」栽培植物の生産に有用であり，また驚くべきことに，その利用は，従来 の培地に要求される穀類インビトロ植物の根づけ過程に必要なホルモンの添加を 含めて従来の滅菌方法を完全に置換できることが見出されたのである． 固体培地におけるこの活性成分の滅菌剤としての使用に際しての主な限界は， そのほとんど０に近い水溶性であり，また水性培地における低い溶解速度であっ た．この問題の解決の可能性には，粒子サイズを分子レベルまで低下させること を可能にする固体の分散が考えられる． 本発明において提案される方法では，滅菌剤として活性成分1-(5-ブロモフラ ン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンを含有し，高分子量ポリエチレングリコー ルおよび他のポリマーによって形成される生理学的に不活性で水に易溶性のマト リックス中における上記化合物の融合または共沈殿による分散物から構成される 殺微生物組成物が提供される． 1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンの融合による分散を行 うためには，製造方法および温度パラメーターの選択ならびに攪拌時間の選択を 活性成分および選ばれたポリマーの融点および熱安定性に基づいて実施した． 化合物，1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンは89〜90℃の 温度で分解することなく融解し，110℃まで熱に安定である． しかしながら，活性成分と融点110℃以上のポリマーの固体分散系の処理は， 活性成分の熱安定性に影響し，したがって溶媒中での共沈殿が推薦される． 1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンの融合による分散を行 うためには，活性成分とＰＥＧ-6000の1:20〜1:1の比率における物理的混合物を 60〜80℃で融合するまで加熱し，15分間絶えず攪拌下に維持して完全に均一な融 解物を達成する．ついで融解した混合物を冷蔵庫で冷却したステンレス鋼のプレ ート上に注いで薄い層に広げ，このようにして固化過程の速度を保証する．得ら れた固体を粉砕機で粉末化し．0.2mm未満の粒子サイズに篩過する． 活性成分とＰＥＧ-6000の固体分散物の融点の範囲はその混合物の組成により 変動し，組成が活性成分とＰＥＧ-6000の二成分系の共融混合物に一致する30％ での融合分散による固体分散物については53〜54℃である． 1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンの共沈殿によって分散 物を得るためには．活性成分とポリマーの1:20〜1:1の比率での混合物を極性溶 媒中，10〜60分間の間隔で40〜60℃の温度範囲に加熱して溶解する．ついで温度 を40〜80℃に制御しながらそれを真空中ロータリーエバポレーターで蒸発させ る．このようにして得られた固体を粉砕機で粉末化し，0.2mm未満の粒子サイズ で篩過する． １-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンを含有する液体培養培 地の調製には，この化合物を，張力活性を有する化合物たとえば可溶性IIＳ-15 およびとくにCremophoreを用いた水性処方中に包含させる．この組成物は上記化 合物の優れた安定性および溶解性，ならびに上記培地中で栽培される生物体に悪 影響を与えない濃度を期待して調製された． 上述の方法を用いて1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンを 含有する安定な組成物が得られたならば，とくに「インビトロ」栽培植物の増殖 に用いられる固体培養培地の滅菌剤として使用する場合の至適用量を知るために 様々なアッセイを実施した．植物毒性は，壊死，白化，増殖係数および接合部- 接合部距離（馬鈴薯について）を考慮して評価した． これらの培養試験（バナナ，馬鈴薯およびサトウキビ）では，1-(5-ブロモフ ラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンの至適用量は30〜45μｇ/mlの範囲であ った． 以下の実施例は本発明の例示を目的とするものであり，本発明の範囲の限定を 意図するものではない． 実施例１：融合法によって得られた固体分散物の純度に対する温度および時間 の影響． 融合法によって得られた1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテ ン含有組成物の純度に対する温度および時間の影響の試験を実施した． 得られる固体分散物中の活性成分の純度は，使用された温度および攪拌時間に 依存することが観察された． 表１は，1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンをＰＥＧ-6000 中（30：70）において融解温度80〜120℃および攪拌時間15〜60分を用いて固体 分散した場合に得られるこの化合物の純度百分率を示す． すべての場合，試験は以下の記載のようにして行った． 80℃の温度および15分の攪拌時間では1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2 -ニトロエテンおよびＰＥＧ-6000の物理的混合物（30：70）を融解するまで加 熱し，一定の攪拌下に15分間維持し融解物の完全な均一化を達成する．この融解 した混合物を冷却したステンレス鋼のシート上に薄い層として注ぐ．このように して得られた固体を粉砕機で粉末化し，0.2mm未満の粒子サイズに篩過する． 上述の条件下に得られた分散物中の活性物質の純度をガスクロマトグラフィー により測定したところ，約99.89％であった． 表１：融合法により得られた固体分散物の純度に対する温度と時間の影響． 実施例２：融合または共沈殿による分散過程後における1-(5-ブロモフラン-2- イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンの溶解像の測定． 活性成分の水性均一溶液／懸濁液を得るにはその溶解像が重要である． 表２は加湿，微粉化および標準粒子サイズの活性成分ならびに30％のＰＥＧ− 6000を用いた活性成分の溶解速度間の比較を行った結果である．活性成分の性質 がいかに有意に改善され，その培養培地中への分散の速度および均一性が保証さ れるかに注目すべきである． 表２：様々な形態で培養培地中に存在する1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロ モ-2-ニトロエテンの溶解速度の評価． 実施例３：ＰＥＧ中に希釈／分散された活性成分の化学的安定性の測定． ポリエチレングリコール中に溶解／分散された活性成分の化学的安定性をその 定量分析技術としてガスクロマトグラフィーを用いて試験した． 385日間継続した化学的安定性の試験により分解はないことが証明された． 表３：ＰＥＧ30％中の分散固体の貯蔵化学的安定性の評価． 実施例４：選択され４た微生物に対する１-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロ モ-2-ニトロエテン含有製剤の活性． 製剤試験の完了後，農業有害生物および「インビトロ」培養植物の生産過程に おいて存在する夾雑微生物に対する生成物の活性を測定するために，インビトロ アッセイを実施した．細菌に対する試験は試験管中で系列希釈法（Beiley W.R.& Scott E.S.，Diagnostic Microbiology 4th Ed.，pp.319-329，The C.V.Mosby Co，St.Louis，1974）のE.Silveriaによる改良方法（Silveria E.ら，Determina tion dela minima concentration inhibitoria（M.C.I.）de sustancias bio-ac tivas，Boletin Cientifico ISCM IV(2)，1986）に従い実施し，また，かびに対 する作用は，コロニー増殖直径（Casadens II:Metodo de investigaciones fito patologices，Instituto Ibeeroamericano de Cooperracion para la Agric ult ura．San Jose de Costa Rica，1985）により評価した． 生物活性生成物の挙動の評価に用いる濃度は1〜100μｇ/mlとした．インキュ ベーションの培養培地．温度および間隔は，アッセイする微生物の条件および特 性によって調整した． ＬＤ₅₀はプロビット法（Finney D.J.，Probit analysis．3rd Ed.，Cambridge University Press，1971）によりμｇ/mlで計算した． この試験で得られた結果は表４に示す． 表４：農業において重要な以下の微生物に対する関連ＬＤ₅₀値について実施し たインビトロ試験． 実施例５：「インビトロ」栽培植物の生産に使用される培養培地における1-(5 -ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンの活性の測定． バナナ，馬鈴薯およびサトウキビのインビトロ栽培におけるかびおよび細菌の 夾雑に対する活性成分のインビトロ活性が証明されたのち，本発明者らは以下の ように実験を進めた． インビトロ植物の生産に使用するフラスコおよび蓋の効果的な洗浄は界面活性 剤を用いて行い，それらを十分な水で濯ぎ，ついで容器を次亜塩素酸ナトリウム の0.5％溶液に３分以上の間隔で沈めた．ついでフラスコを上下逆さにし，24時 間前に完全に乾燥させて使用した． 培養培地が調製され．温度が約60〜80℃に達したならば，組成物の必要な重量 を加えて濃度を35μｇ/mlとし，ついでその所要量を24時間後に植え付け操作に 先立って各フラスコに注いだ． 濃度は，試験する培養培地中におけるその有効性および植物毒性作用の欠如に 基づいて選択した． アッセイの範囲は1〜50μｇ/mlとした．バナナ，馬鈴薯，およびサトウキビの インビトロ栽培における挙動を72時間後および，増殖培地における以後の二次培 養を実施するためその培養に要する期間中，評価を行った．このような試験は根 づけ培養培地中で実施した． 植物毒性は壊死，白化，繁殖係数および接合部-接合部距離（馬鈴薯の場合） を考慮して評価した．３種の培養の至適用量は約30および45μｇ/mlとした． 増殖相におけるMusa sp（バナナ樹）の培養に対して２種のスケールアップ試 験を実施した．３回のアッセイ時における枯死の百分率は，活性成分を添加して 行ったスケールアッブ試験では0.81％，標準方法では１％であった． この試験で得られた結果は表５に示す． 表５：Musa spのビトロ植物の生産に使用する培養培地中の微生物の夾雑に対 する1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンを含有する固体分散 物の作用． ３つのアッセイから，夾雑物はオートクレーブを用いて培養培地の物理的滅菌 を使用した対照の場合と同様に挙動し，それらは第11日目から上昇を始めた．さ らに，化学的滅菌剤を作用させた場合には．増殖係数の上昇が認められた． オートクレーブ処理も根の誘導を刺激するホルモンの添加も行わない根づけ培 地は，より短時間の間により強力でより豊富な根の出現によって標準培地の場合 より優れた肉眼で確認可能な効果を示した．検出された増殖百分率は，対照と比 較して有意ではなかった． 表６：1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテン含有固体分散物 の「インビトロ」植物の発生に対する作用． ２つのスケールアップ試験はMusa spに対し実施した．クローンGran nayneお よびFHIA-03を根誘導ホルモン（A.I.A.）を添加しない根づけ培養培地中で試験 した．両クローンでは５日後により多量のより強力な根が観察され，一方，標準 操作によった対照では同じ期間内に小さな根の発生を示したのみであったことか ら，化学滅菌を行った変異株よりも良好に挙動した．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ディアズ マルチネズ，グリセル キューバ国50100 ビラ クララ，サンタ クララ，エントレ マセオ イ ユニオ ン，ナザレノ ナンバー 27 (72)発明者 ラミレズ ディエグエズ，アラン キューバ国50300 ビラ クララ，サンタ クララ，レパルト ユニベルシダッド, エントレ ４タ イ ６タ ナンバー 209，カルレ ５タ (72)発明者 マルチン トリアナ，エステル リリア キューバ国50300 ビラ クララ，サンタ クララ，レパルト サンタ カタリナ, エントレ ジー イ エイチ，カルレ １ ラ，ナンバー 206 (72)発明者 サラザール イエラ，エロイザ キューバ国53310 ビラ クララ，サグア ラ グランデ，エントレ コロン イ フランクリン，アベラネダ ナンバー 12 (72)発明者 ゴンザレス ベディア，ミルサ マイラ キューバ国50100 ビラ クララ，サンタ クララ，カレッテラ デ カマユアニ ケイエム ２ １／２ (72)発明者 マチャド ロドリグエズ，ローザ，マルガ リータ キューバ国50400 ビラ クララ，サンタ クララ，レパルト カミロ シェンフエ ゴス，エントレ ダニエリト イ アムパ ロ，エドアルド マチャド，アパルタメン ト ナンバー４，エディフィシオ ナンバ ー 17 (72)発明者 ゴンザレズ ロレンゾ，カルロス マヌエ ル キューバ国50100 ビラ クララ，サンタ クララ，ミナグリ，レパルト，カレッテ ラ デ カマユアニ ケイエム １ (72)発明者 クエト サンチェズ，マダイシイ デ ラ カリダド キューバ国50200 ビラ クララ，サンタ クララ，ビジア，エントレ シー イ ディ，カルレ ６タ，ナンバー 136

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンまたはその類縁体 ，同族体もしくは均等化合物，およびさらに水溶性のポリマーを含有する殺微生 物組成物． ２．使用されるポリマーは高分子量のポリエチレングリコールである「請求項 １」記載の殺微生物組成物． ３．使用される高分子量ポリエチレングリコールは好ましくは分子量6,000〜2 0,000である「請求項２」記載の殺微生物組成物． ４．上記ポリエチレングリコールはＰＥＧ6000である「請求項３」記載の殺微 生物組成物． ５．培養培地の夾雑物の制御用の滅菌剤として使用される殺微生物組成物． ６．液体および固体培地の夾雑物の制御のために使用される「請求項５」記載 の殺微生物組成物． ７．「インビトロ」栽培植物固体培地の夾雑物の制御のために使用される「請 求項６」記載の殺微生物組成物． ８．「インビトロ」栽培植物の生産過程において，根づけ剤として使用される 「請求項１〜４」のいずれかに記載の殺微生物組成物． ９．固体分散方法を用いる「請求項１」記載の殺微生物組成物の製造方法． 10．組成物は融合による分散によって得る「請求項９」記載の方法． 11．組成物は溶媒を用いる共沈殿によって得る「請求項９」記載の方法． 12．使用する溶媒は極性溶媒である「請求項11」記載の方法． 13．使用する溶媒はとくにエタノール，クロロホルム，メタノールまたはイソ プロピルアルコールである「請求項12」記載の方法． 14．培養培地の夾雑物の制御のための滅菌剤としての1-(5-ブロモフラン-2-イ ル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンまたはその類縁体，同族体もしくは均等化合物の 使用． 15．「インビトロ」栽培植物の生産に使用する培養培地中の夾雑物の制御のた めの滅菌剤としての1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンの使 用． 16．「インビトロ」栽培植物の生産に使用する培養培地中の根づけ剤としての 1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンまたはその類縁体，同族 体もしくは均等化合物の使用． 17．滅菌剤として1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンまた はその類縁体，同族体もしくは均等化合物を用いる「インビトロ」栽培植物の生 産に使用する培養培地の滅菌方法． 18．上記滅菌剤は同時に「インビトロ」栽培植物の生産に使用する培養培地中 の根づけ剤としても使用する「請求項17」記載の方法． 19．使用される1-(5-ブロモフラン-2-イル)-2-ブロモ-2-ニトロエテンの至適 用量は30〜45μｇ/mlである「請求項17および18」のいずれかに記載の方法．