JP2000512494A

JP2000512494A - 細胞増殖調節遺伝子

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Publication number: JP2000512494A
Application number: JP09543058A
Authority: JP
Inventors: ビュードリー，ゲイリー・エイ; バーテルセン，アーサー・エイチ; ガレラ，エリザベス・エイ; マッデン，スティーヴン・アイ
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1996-05-29
Filing date: 1997-05-29
Publication date: 2000-09-26
Also published as: AU3228197A; WO1997045542A3; EP0914338A2; CA2256498A1; WO1997045542A2

Abstract

(57)【要約】転写調節される増殖応答遺伝子は、細胞の運命の決定において中心的な役割を果たす。p53は細胞増殖能の調節に重要な遺伝子を転写調節するとわかっている。温度感受性p53対立遺伝子を含むラット胚繊維芽細胞の、ディファレンシャルRT-PCR解析を用い、我々は野生型p53タンパク質を保有する細胞で特異的に正に調節される、いくつかの転写産物を単離することができた。これらの遺伝子のうちの２つ、SM20およびミクロソームエポキシド加水分解酵素（mEH）は、以前に記載された遺伝子である。以前に特徴づけられていない２つのcDNA、細胞増殖調節（CGR）遺伝子CGR11およびCGR19を単離した。これらの新規タンパク質の予想アミノ酸配列には既知のモチーフ、すなわちEFハンドドメイン（CGR11)およびリングフィンガードメイン（CGR19）が含まれ、これは機能を示唆するものである。CGR11およびCGR19は、野生型p53細胞において全mRNAの0.05%および0.01%で発現する、初期応答遺伝子であるとみられる。CGR11およびCGR19ともに、SM20およびmEHと同様に、いくつかの細胞株の増殖を阻害することができる。

Description

【発明の詳細な説明】細胞増殖調節遺伝子発明の背景細胞内の数々の潜在的増殖エフェクターの同定に対して重要な発展がなされた。以前の分析は細胞環境、増殖因子及びストレスの表現型の効果を評価したが、細胞増殖を混乱させる原因である根元的な分子イベントを明らかし始めたのはつい最近のことである。多くの場合で、特定の細胞増殖反応の原因は、転写減少に帰することができる。実際、細胞周期調節に直接的に関連する最近の遺伝子の発見は、かなりの程度までディファレンシャル遺伝子発現解析に基礎をおいていた。 p53遺伝子は、細胞増殖の制御において、間違いなくこの遺伝子に対する重要な調節機能を反映するヒト癌において、もっとも頻度の高い変異された遺伝子であり続けている。p53の機能は、ウイルスの、もしくは細胞のタンパク質と細胞質隔離との相互作用によって弱めることができ、最終的には細胞増殖潜在力の変化を導いている。p53はDNA損傷に反応して、そしてDNA複製を直接的に阻害し、またはアポトーシスを誘導することにより増殖調節機能を発揮すると考えられているが、データの大部分が示すところによると、p53の主たる機能は、下流のエフェクター遺伝子を転写的に調節することである。p53は強力な転写の活性ドメインをもち、配列特異的様式によってDNAと結合することができ、これにより、標的遺伝子の転写の活性及び抑制の両方を見込んでいる。細胞増殖及び/または生存の制御に直接的に影響を及ぼすと示唆されている産物であり、p53転写反応性遺伝子であるp21^WAFl/CIPl、MDM2、GADD45、HIC、サイクリンG、及びBAXの同定は、増殖反応遺伝子の発現レベルを調節する時にp53の中心的な役割を強調する。最近までに、もっとも特徴づけられた、p53によって転写的に調節される細胞増殖の直接のエフェクターのうちの二つはp21^WAFl/CIPl 及びMDM2である。p21^WAFl/CIPlは、細胞周期の進行中、サイクリン依存キナーゼ（CDK）タンパク質と直接的に相互作用することにより、CDK阻害剤として機能する。形質導入によるp21^WAFl/CIPlの過剰発現は、癌細胞株の広い範囲で、細胞増殖を抑制する。一方、MDM2は、p53の活性をネガティブに調節することで機能し、MDM2の過剰発現により調節されない細胞増殖と腫瘍形成を導く。しかしながら、p53誘導転写反応は、疾病保護（ill-conserved）である様であり、このことは、細胞型依存性の、遺伝子依然性の、そして種依存性の因子がp53反応性に寄与する可能性があることを示唆する。例えば、p21^WAFl/CIPlとMDM2の両方は、温度感受性p53対立遺伝子を含んでいる齧歯類細胞において、p53依存の様式によって転写的に活性化されるが、p21^WAFl/CIPlだけは類似したヒトの系において誘導される。加えて、p21^WAFl/CIPlの活性化はp53依存的である場合、及び非依存である場合の両方が示され、このことはp21^WAFl/CIPlの制御に対する多くの経路を示唆する。さらにBCL2もしくはE1Bのようなアポトーシス調節遺伝子産物のレベルも、細胞がp 53依存増殖停止を受けるか、アポトーシスを受けるかを決定することを促進することが明らかである。これらの結果は、多くのエフェクター遺伝子産物を使用する複雑な調節カスケードが、細胞増殖潜在力に関して細胞の運命を決定していることを示唆する。細胞増殖調節の複雑な性質は、細胞増殖調節に影響している分子成分をさらに明らかにする必要性を強調している。発明の概要哺乳類細胞増殖調節タンパク質をコードするDNA分子を提供することは本発明の目的である。哺乳類細胞増殖調節タンパク質を提供することは本発明の他の目的である。哺乳類細胞増殖調節タンパク質に選択的に結合し、その分析に使用することができる抗体を提供することは本発明のさらなる他の目的である。腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供することは本発明のさらなる他の目的である。癌に対する診断及び診断方法を提供することは本発明の他の目的である。細胞増殖を剌激するのに有用なアンチセンス構築物を提供することは本発明の目的である。細胞増殖調節遺伝子の発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することは本発明の目的である。細胞の分裂増殖を誘導するための方法を提供することは本発明の他の目的である。癌への感受性を評価するための方法を提供することは本発明のさらなる他の目的である。本発明のこれらの、そして他の目的は、以下に記載の、一つもしくはそれ以上の態様によって提供される。本発明の一態様において、哺類のCGR11くはCGR19タンパク質をコードする、単離され、そして精製されたサブクロモゾームDNA分子が提供される。本発明の他の態様によれば、単離され、そして精製された哺乳類CGR11もしくはCGR19タンパク質が提供される。本発明の他の態様において、哺乳類CGR11もしくはCGR19タンパク質に特異的に結合する抗体が提供される。本発明の他の態様によれば、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法が提供される。この方法は、腫瘍細胞に、哺乳類CGR11もしくはCGR19タンパク質を投与することの段階を含む。本発明の他の態様によれば、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法が提供される。この方法は、 CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類タンパク質を発現させる原因となるDNA分子を、腫瘍細胞に投与することの段階を含む。本発明のさらなる他の態様によれば、癌の診断のための方法が提供される。この方法は、組織を試験して、その組織が正常組織に比べて、CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類タンパク質、または、哺乳類タンパク質をコードしているmRNAを、より少なく発現しているかどうか決定することの段階を含む。本発明のさらなる他の観点によれば、癌の診断のための方法が提供される。この方法は、組織を試験し、前記組織におけるDNAが、CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類遺伝子コーディング配列の変異形であって、遺伝子コーディング配列の野生型とは異なる変異型を含むかどうかを決定するために調べること、の段階を含む。本発明の他の態様において、アンチセンスCGR11、CGR19、mEH及びSM20構築物が提供される。この構築物は： a.転写プロモーター b.転写ターミネーター c.CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類タンパク質の遺伝子コーディング配列の一つもしくはそれ以上の区分を含むDNA区分であって、前記遺伝子コーディング配列の区分が前記プロモーターと前記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーター及び前記ターミネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作られるRNAが、哺乳類細胞によって作られる対応するmRNAの区分と相補的である前記DNA区分、を含む。本発明の他の観点において、CGR11、mEH、SM20、もしくはCGR19のアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。このオリゴヌクレオチドは、哺乳類CGR11 もしくはCGR19のmRNAに相補的な、少なくとも10ヌクレオチドを含む。本発明の一つの態様によれば、細胞の分裂増殖を促進するための方法が提供される。この方法は、 CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類遺伝子mRNAに相補的な、少なくとも10ヌクレオチドを含むものを前記細胞に投与して、CGR11、CGR19、mEH及びSM20の発現を阻害すること、の段階を含む。本発明の他の観点によれば、細胞の増殖を促進するための方法が提供される。この方法は、 CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類遺伝子に相補的な、少なくとも10ヌクレオチドを含む、三本鎖形成オリゴヌクレオチドを哺乳類細胞に対して投与し、CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類遺伝子の発現を阻害すること、の段階を含む。他の観点によれば、細胞の増殖を促進するための他の方法が提供される。この方法は、哺乳類細胞に、CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択したアンチセンス遺伝子構築物であって、 a.転写プロモーター b.転写ターミネーター c.哺乳類遺伝子コーディング配列の一つもしくはそれ以上の区分を含む DNA区分であって、前記遺伝子区分が前記プロモーターと前記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーター及び前記ターミネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作られるRNAが、哺乳類細胞によって作られる対応するmRNAの区分と相補的であるとする前記DNA区分、を含む遺伝子構築物を投与して、哺乳類遺伝子の発現を阻害すること、の段階を含む。本発明の他の態様によれば、癌への感受性を評価するための方法が提供される。この方法は、血液、絨毛膜絨毛、羊水、着床前の胚の卵割球からなる群から選択した組織を検査して、前記組織内のDNAが、CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した変異型遺伝子コーディング配列を含むかどうか決定すること、の段階を含む。本発明は従って、付加的な診察及び治療手段に関した分野を提供し、それによって癌リスク評価、初期癌、及び明らかな癌を扱う。図面の簡単な説明図１：REF-112 RNAの特性記述。図1a、WAF1誘導の速度論。示した時間(時)、3 2℃で維持したRFE12細胞からの全RNAを、ラットWAF1 cDNAにてプローブした。図1b、サイクリンG RT-PCR。8時間、38℃、もしくは32℃で維持したREF-112細胞から回収した全RNAを、固定オリゴ−dTプライマーにて逆転写した。PCRは、このプライマー及びラットサイクリンGの3'末端に特異的なプライマーで行った。矢印は約300塩基対の、ディファレンシャルに（differentially）発現したラットサイクリンG RT-PCR産物を示す。図1c、REF-112細胞からの全RNAのノザン分析。図1bに記載したサイクリンG RT-PCR cDNAを、38℃、もしくは32℃で維持したREF-112細胞から単離したRNAに対するプローブとして用いた。図2：野生型p53含有REF-112細胞からのディファレンシャルに発現した発現遺伝子。38℃、及び32℃（8時間）維持した、CGR11(図2a)、CGR19(図2b)、SM20(図 2c)、及びmEH（図2d）を発現しているREF-112細胞からのRT-PCR及びノザン分析。矢印は切り取り、再増幅し、付随したノザン分析のためのプローブとして使用した、ディファレンシャルに発現したcDNAを示している。レーン1、レーン3；8 時間インキュベーション後回収した、32℃維持したREF-112 RNA。レーン2、レーン4；38℃維持したREF-112 RNA。デュプリケーションのサンプルは全RNA調整物から独立に単離した。図3：CGR11及びCGR19についての発現図。図3a；CGR11、CGR19、及びβ−アクチンに特異的な³²P標識されたcDNA断片によりプローブした、ラットの複数の組織のノザンブロット。図3b；CGR11及びCGR19の誘導速度論。REF-112細胞を示した時間（時）32℃で維持した。全RNAを単離し、電気泳動し、ブロットし、そしてラットCGR11もしくはCGR19に対して特異的な³²P標識されたcDNAにてプローブした。図4：ラット及びヒトのCGR11とCGR19のアミノ酸配列。図4a；ヒト（上段）及びラット（下段）CGR11の推定したアミノ酸配列。ダッシュはヒト及びラット配列間での一致を示す。アスタリスクはラットCGR11配列内に存在する欠落を示す。上線は、二つの推定のEF−ハンドドメインを示す。図4b、コンセンサスのEF− ハンドメインと配列させたCGR11 EF−ハンドドメインI及びII。ヒトの配列と異なっているラットアミノ酸を下線に示す。図4c、ヒト（上）及びラット（下）CG R19の推定したアミノ酸配列。上線の配列は潜在的なジンク−バインディング、リング−フィンガードメインをコードしている。ダッシュはヒト及びラット配列間で一致を示す。図4d、CGR−9リン−ーフィンガードメインは、コンセンサスのリング−フィンガー配列とともに配列させた。好ましい態様の詳細な説明本発明者は、以前にはp53によって調節されていると知られてはいない、４つの遺伝子がp53によって調節され、本明細書で増殖調節をすることが示されることを発見した。単離された遺伝子の二つ、ラットSM20とラット及びヒトmEHは、すでに記述された遺伝子であるが、p53の状態とこれらの遺伝子の転写的誘導の間の関係は以前には確立されてはいないものである。他の二つの遺伝子、CGR11 及びCGR19は以前には単離も記述もされていない。ラットSM20は、血管平滑筋細胞のPDGF-A-誘導転写の解析により初めて単離されたが、しかしながら、ラットSM20の機能はいまだに解明されていない。一方、 mEHは、代謝反応性エポキシドを含む生体異物の触媒反応解毒化に関係することが知られている。mEHと野生型p53の間には既知の関係は何も知られていないが、エポキシドを介したp53活性の誘導は、毒素の存在下での遺伝子の安定性を保つことを助ける可能性がある。我々は、よく特徴づけられているネズミの温度感受性p53変異VAL135を利用して、野生型p53タンパク質の転写反応を同定した。活性化RAS及び、p53-VAL135を形質導入したラット胚繊維芽細胞（REF-112）の増殖は温度感受性である。これらの細胞の38℃での増殖は、細胞質中でHSP70と複合体形成する変異構造にp53タンパク質を維持する。REF-112細胞を32℃に移すと、p53タンパク質は、野生型構造を採用し、核内に移動し、そして標的遺伝子の転写を調節する。これらの細胞は、はじめに、特に細胞周期のG1期における増殖停止として記述された。我々は、p53の機能に対して、温度感受性であるラット細胞からのディファレンシャル転写解析を利用した。我々は、複製を許容する温度では存在し、しかしながら複製を許容しない温度では存在しないこれらの転写を同定した。本発明によるDNA分子は、他の遺伝子配列から単離され、そして精製される。それらは、ゲノム配列またはcDNA配列のいずれかであり、すなわちそれらは介在配列を含む可能性があるか、もしくはその可能性がない。ヒトCGR11、ヒトCGR19 、ラットCGR11、及びラットCGR19のコーディング領域のヌクレオチド配列はそれぞれSEQ ID Nos:1、3、5、及び7に示される。他の哺乳類相同物は、開示されている配列由来のヌクレオチドプローブ、またはプライマーを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングすることで、容易に得ることができる。ゲノムクローンも、遺伝子コーディング領域由来のプローブを用いて、YACもしくはP1クローンのようなゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることで入手できる。遺伝子の対立遺伝子型も、本発明の範囲に含まれている。これらは、コード配列に影響しない無影響変異、またはアミノ酸の相違を導く多型のいずれかをもちうる。アミノ酸の相違は、タンパク質の機能の変化を引き起こす可能性がある場合またはその可能性が内場合とがある。 SEQ ID Nos: 2、4、6、及び8に示したタンパク質配列を用いることで、変性したオリゴヌクレオチドプローブを使用して、対応する遺伝子及び関連した哺乳類 CGR遺伝子を同定し、入手することもできる。一つもしくはそれ以上の変性したプローブを使用して、cDNA、もしくはゲノムDNAライブラリーにハイブリット形成することができる。CGR遺伝子は、変性したプローブとハイブリット形成することによって同定できる。遺伝子の同定は、一つもしくはそれ以上の、以下の特性に基づいて確かめることができる：すなわち、コードしているタンパク質のおおよその大きさ、SEQ ID Nos:2、4、6、もしくは8のタンパク質との類似性もしくは同一性、そして野生型p53による遺伝子に対するmRNAの亢進調節である。変性したプローブの使用のデザイン及び条件は、当該技術分野においてよく知られている。全長遺伝子、もしくはcDNAの一部分は、全長遺伝子を単離することにより、もしくは全長遺伝子を単離することなく、同様に単離できる。あるいは、CG Rタンパク質（群）に特異的に結合する抗体は、SEQ ID Nos:2、4、6、及び8に示した、タンパク質もしくはそのタンパク質のポリペプチド部分に対して作り上げることができる。これらの抗体を使用して、同様の、もしくは関連したエピトープを発現している発現cDNAライブラリー中のクローンを選択することができる。同定されたCGR遺伝子の部分は、制限エンドヌクレアーゼにより、または一部の配列の増幅による遺伝子の断片化により作ることができる。ハイブリット形成により、もしくは抗体結合により単離されたCGR遺伝子の部分は、全遺伝子を単離することなしに、直接的に使用することもできる。現在、4つの哺乳類細胞増殖調節遺伝子の配列が提供されているので、当業者は、コードされているタンパク質を容易に入手できる。これらは、細菌、酵母、もしくは他の便利な細胞に発現させることができる。発現ベクターは、当該技術分野で既知のベクターに、コーディング領域をライゲーションすることによって構築することができる。一般的には、ベクターはプロモーター、エンハンサー、転写シグナルのターミネーションなどの発現調節配列を含みうる。従って、コーディング配列を、発現調節配列に関して、正しい場所にそして正しい方向に配置することによって、希望する宿主細胞内に選択された哺乳類タンパク質の発現を指向することのできる、発現ベクターを入手する。適当なベクターは当該技術分野で知られており、プラスミドもしくはウイルスゲノムに基くことができる。ベクターに対する適当な宿主細胞も知られており、そしてそれら宿主細胞が示す希望する性質について選択できる選択されたタンパク質の部分を、合成し、実験動物の免疫のための担体タンパク質に結合して、これらの特異的に免疫反応性である抗体を産生することができる。この抗体を使用して、天然の、もしくは組換え源からのタンパク質を精製することができる。このような抗体は、特定の用途に便利なように、ポリクローナルもしくはモノクローナルであってもよい。開示されたCGRタンパク質に特異的に結合する抗体は、当該技術分野にてよく知られているように、日常的なスクリーニングを用いて容易に単離することができる。本明細書で記載のように、細胞増殖調節タンパク質は、腫瘍細胞に対して増殖抑制効果をもっている。従って、細胞増殖調節タンパク質の腫瘍細胞への投与、もしくは結果としてタンパク質の発現を生ずるであろう構築物を用いたそれらに対応する遺伝子の投与は、そのような増殖抑制をもたらすために好ましい可能性がある。本発明のタンパク質は、ヒトに投与するために、薬剤組成物として製剤化されうる。一般的には、これらは発熱性成分を含まない、希釈剤もしくは賦形剤中での無菌剤形でありうる。この剤形は、鼻腔内及び非経口投与いずれにも適合する。増殖性疾患に関連する他の細胞も、細胞増殖調節遺伝子媒介性増殖抑制の標的でありうる。このような増殖性疾患は、乾鮮、ポリープ、再狭窄、いぼ、炎症性疾患を含むが、これらにの限定されない。細胞増殖調節タンパク質は、腫瘍細胞に、適切な剤形で投与されうる。それらは、腫瘍細胞への微量注入、もしくは単純に外部から供給することができる。それらは、例えばリポソーム内に被包されるうる。哺乳類に投与する場合には、循環系内で腫瘍抑制量に達することが望ましい。腫瘍抑制効果は、細胞増殖調節タンパク質が10^-10から10^-6Ｍの濃度の時に目的を達することができる。細胞増殖調節タンパク質をコードしている DNAを、腫瘍細胞に投与すると、細胞は増殖抑制のための、それ自身の細胞増殖調節タンパク質を発現することができる。そのようなDNAは、上述したように、ゲノムDNA、もしくはcDNAであり得る。増殖性疾患に関連する他の細胞は、同様にして処理されるうる。本発明の細胞増殖調節遺伝子は、ここで、野生型p53によって調節されることが示される。従って、いずれかの細胞増殖調節遺伝子の発現を、野生型p53の発現のマーカーとして使用できる。ちようど野生型p53の発現の減少、もしくは変異したp53の発現の存在が癌を示すように、正常組織と比較して増殖調節遺伝子の発現の減少は、癌を指し示すことができる。細胞増殖調節遺伝子の発現の分析は、直接的な野生型p53の分析に加えて、もしくはそれに代えて使用することができる。正常コントロールを提供するための比較目的に適合する組織は、一般的には近接した、形態学的に正常な組織である。細胞増殖調節遺伝子の発現の存在もしくはその量の試験は、細胞増殖調節タンパク質に特異的な抗体、核酸プローブ、もしくはSEQ ID Nos:1、3、5、もしくは7の配列の全部、または一部に相補的な、少なくとも約10ヌクレオチドのプライマー、もしくは当該分野で知られている他の試験の、いずれかによって行うことができる。同様に、腫瘍組織のDNAを試験して、それが変異を含んでいるかどうか決定することができる。細胞増殖調節遺伝子の変異は、p53変異がそうであるように、細胞に腫瘍形成表現型を与える。変異は、試験をする組織内の遺伝子の配列を決定し、その配列をSEQ ID Nos:1、3、5、もしくは7にて開示している配列と比較することにより決定することができる。このような変異は、生殖系列もしくは体組織で起こりうる。体組織で変異が起こった場合、同じ個体において他の組織では変異は発見されないであろう。変異が生殖系列で起こった場合、体のすべての組織で変異が発見され、生殖系列のp53変異のように癌への感受性を示すであろう。生殖系列変異について試験をするのに適した組織は、血液、粘膜スメア、子宮頸部スメア、皮膚、絨毛膜絨毛、羊水、及び着床前の卵割球を含む。アンチセンス細胞増殖調節遺伝子構築物は転写プロモーターと転写ターミネーター（ポリアデニル化シグナル）を含み、それらの間にDNA区分を持つ。DNA区分は、一つもしくはそれ以上の細胞増殖調節遺伝子区分を含むが、その区分は構築物中で、哺乳類ゲノムの方向に比べて逆になっている。この構築物の転写プロモーターからの転写は、正常哺乳類細胞における細胞増殖調節プロモーターから作られる、細胞増殖調節遺伝子RNAに相補的な（アンチセンス）RNA分子を産生する。アンチセンスRNA分予を作るのに使用したプロモーターは、ある処方された刺激物質によって調節されうる誘導可能なプロモーターであり得る。例えば、メタロチオネインプロモーターもしくはホルモン応答性プロモーターは、都合よく使用できる。他のプロモーター及びターミネーターは、特定の用途に都合よく使用できる。加えて、当該技術分野で知られているエンハンサーを使用して、希望するタンパク質の発現を高めることができる。本発明のアンチセンス細胞増殖調節遺伝子構築物は、細胞の一つのタイプにおいて使用してアンチセンスRNAを産生し、当該技術分野で知られている技術によって他の細胞に適用することができる。あるいは、細胞増殖調節遺伝子構築物を、細胞増殖調節遺伝子の調節が望まれる、最終的な標的細胞に投与できる。細胞へのDNA構築物の導入の適切な方法は、当該技術分野で知られている。アンチセンス構築物の投与は、当該技術分野で知られているような、トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーション、融合、その他によって行われうる。細胞増殖調節遺伝子発現の阻害は、細胞を増殖分裂させ、細胞死を防ぐ。これは、移植のための表皮細胞を培養する場合のように、培養中で多数のある細胞が増殖することが好ましいような状態で特に有用でありうる。あるいは、体のある細胞への投与は、老化を防ぐために老齢化（aging）あるいは老化（senescent）しつつある細胞に、もしくは免疫性の細胞または胃腸管の細胞などに関して望ましいものでありうる。細胞増殖調節遺伝子アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以上で議論したような、アンチセンス構築物と同様な目的のためにも提供される。オリゴヌクレオチドは、長さとして、少なくとも10ヌクレオチドであり、20から30ヌクレオチドであり得る。それらは、通常のヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体、または二つの混合物から成り立ちうる。類似体はメチルホスホン酸塩、アミノアルキルホスホン酸塩、ホスホロチオン酸塩、ホスホロジチオン酸塩、置換または非置換ホスホルアミデイトを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、環状分子も利用されうるが、一般的には、哺乳類細胞から作られた天然細胞増殖調節遺伝子mRNAと相補的である、直鎖で一本鎖の分子である。これらは、受動、もしくはレセプター媒介性の輸送によって細胞により取り込まれるように、リポソーム中、もしくはむきだしで細胞に投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、mRNAの5'末端、特に転写開始部位に特異的に相補的にデザインされていることがたいてい好ましい。しかしながら、mRNA分子の他の部分が、アンチセンス阻害に影響を受けやすいことが明らかになっており、本発明の実施において使用できうる。同一分子の他の部分との水素結合が関連する二次構造をもつ、アンチセンスヌクレオチドに対する標的としてのmRNAの部分をさけることも好ましい。例えば、ステム−ループ構造のステムの形態に関連していることが明らかな部位をさけることは好ましい。細胞増殖調節遺伝子の発現はまた、転写に対する干渉によって、オリゴヌクレオチド、または細胞増殖調節遺伝子の区分と複合体化することで三重鎖構造（三本鎖、triplexes）を形成できる修飾オリゴヌクレオチドを加えることによって、抑制しうる。以下の実施例は、例示の目的のためのみに提供され、そして、以上の広い用語にて記載した本発明の範囲に限定するものではない。実施例実施例１予備研究により、温度感受性p53システムの有用性を明らかにする。 38℃および32℃の両方で培養した細胞から調製した全RNAを、まずp53に調節される既知の遺伝子に関して特徴づけることにより、REF-112細胞を用いたディファレンシャルディスプレイ解析の実行可能性を評価した。p21^WAFl/CIPlのノーザン解析では急速な転写誘導が示され、p21^WAFl/CIPlRNA量が32℃に移してから8-10時間後に頂点に達した(図1a)。さらに我々は、32℃に移してから8-10時間以内のアポトーシス誘導の、同様の速度論を明らかにした。本明細書中で述べるディファレンシャル転写解析に関して、我々は８時間の誘導時間を選んだ。この時点では、ラットp21^WAFl/CIPlおよびラットサイクリンＧノーザン解析により、32℃という増殖阻害温度においては各転写産物の量が多く、38℃において対数的に増殖した細胞では転写産物はほとんどあるいは全くない、ということが示された(図１)。サイクリンＧおよびp21^WAFl/CIPlともに、同様の量まで誘導されるようであった。両方の増殖条件から単離した全RNAについて、ラットサイクリンＧの3'末端に特異的なプライマーを用いてRT-PCR反応を行い、RNA調製物について特徴を調べた後、p53に調節される新規遺伝子を同定した。予想した通り、ディファレンシャルに発現する300bpのバンドを、32℃で誘導したRNA中に検出したが、誘導していない細胞由来のRNA中にはなかった(図1b)。サイクリンG RT-PCRバンドを切り出し、続いてクローニングおよびノーザン解析（図1c）を行ったところ、このバンドがラットサイクリンＧと同一であることが確認された(データは示さず)。細胞培養：ラット胚の繊維芽細胞REF-112（p53-VAL135）およびREF-132（p53- PHE132）(B．VogelsteinおよびM．Orenのご好意によりご供与いただいた)を、10 ％ウシ胎児血清を含むDMEM中、5％CO₂、38℃あるいは32℃のいずれかにおいて培養した。いずれかの温度移動の48時間前に、細胞を分配し、まいた。温度移動は、あらかじめ平衡化したインキュベーターにサブコンフルエントなフラスコを、培地を交換せずに単に移動させて行った。トランスフェクション用に、４ｘ10⁵ 個の細胞(T98GおよびSW480細胞)、または0.8ｘ10⁵個の細胞（SKOV3-IP1）を６穴培養皿にまいた。製造者が説明する通りに、リポフェクチン（Gibco/BRL）を用いてトランスフェクションを行った。簡単にいうと、40μｌの血清低減培地（OP TIMEM^TM、Giboco/BRL）を２μｇのDNAに加えた。10μｌのリポフェクチンを含む 50μｌの混合液および、40μｌのOPTIMEM^TMを、DNA混合液に加えた。15分間、室温でインキュベートしたあと、1mlのOPTIMEM^TMを加え、optimemで洗った細胞の上に混合液を重層した。細胞を５時間、37℃/5%CO₂インキュベーター中でインキュベートし、そのあと、トランスフェクション混合液を通常の増殖培地と置き換えた。44時間後、ハイグロマイシン（0.25mg/ml）を含む選択培地に細胞を分配した。12-14日後、50%エタノール中の2%メチレンブルーにてコロニーを染め、計数した。50個以上の細胞を含むコロニーのみを取った。 RNA単離：製造者が説明する通りに、RNAzol B（Tel-Test，Inc.）中で直接可溶化することにより全RNAを単離した。製造者が説明する通りにMessageMakerkit （Gibco/BRL）を用い、全RNA調製物からpoly A⁺RNAを単離した。 RT-PCR反応：５mM MgCl₂/10mM Tris、pH8.3/10mM KCl/20μＭ dNTP's/20units Rnase阻害剤（Perkin Elmer）/50μＭ T₁₂NN中の200ngの全RNAおよび50units M MLV逆転写酵素（Perkin Elmer）を用い、試料（逆転写酵素なし）を65℃に５分間温めて逆転写反応を行い、次いで反応液を37℃に５分間置いた。逆転写を37℃ で55分間かけて行った。５分間、95℃でインキュベートすることにより、RT反応を不活性化させた。1.5mM MgCl₂/10mM Tris pH8.3/10mM KCl/4μＭ dNTP's/2.5u nits Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）/10μCi³⁵S-α-dATP（12.5μCi/μｌ、N EN）/50μＭ T₁₂MN中の２μｌの逆転写反応液および0.2μMランダム10-merを用い、PCR反応を行った。サーモサイクラー中で、94℃を３秒/40℃を２分/72℃を3 0秒というサイクルを40サイクル、PCR反応を行った。38％ホルムアミド/8mMEDTA /0.02%ブロモフェノールブルーおよびキシレンシラノールを加えることにより、反応を終了させた。試料を２分間、70℃で温め、6%変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。ゲルをWhatmann 3MM紙上に乾燥させフィルムに露光した後、PCR 産物を精製した。切り出したバンドを120μｌ H₂Oに10分間、室温で再懸濁させ、続いて15分間煮沸した。遠心して残渣をペレットにし、10μｌの3M酢酸ナトリウム、５μｌの10mg/mlグリコーゲン、400μｌエタノールを、溶出した100μｌのDNAに加えた。DNAを一晩、-20℃で沈殿させた。DNAをペレットにし、もとのRT -PCRに用いたプライマーと同じものを用いて増幅し、ゲルを精製し、pCRII (InV itrogen）にクローン化した。オリゴヌクレオチド：サイクリンG RT-PCR反応に関して、dT₁₂GCおよび5'-TCT TCACTGC-3'プライマー対を用いて約300bpの断片を増幅した。ノーザン解析：1.2%ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動した10-20μｇの全RNA を用い、ノーザン解析を行った。ブロッティングおよびプローブによる探索（pr obing）は、根本的には記載されている通りであった。プローブは、ランダムプライム（BMB）によりα-³²Pラベルしたゲル精製cDNA断片とした。ラット組織ブロットをClontechから得て、製造者が勧めるように、プローブによる探索をし、除去し(stripped)、再びプローブによる探索をした。ラットWAF1 cDNAは、B.Vog elsteinの好意によりご供与いただいた。実施例２本実施例では、p53が調節する遺伝子の同定に、温度感受性p53システムを使用することを明らかにする。増殖により調節される他の遺伝子を同定するために、我々は12の“固定された ”オリゴdTプライマーを25の“ランダムな”10-merと組み合わせて利用し、RT-P CR反応を行った。RT-PCR反応は、38℃または32℃に維持したREF-112細胞由来の、独立に単離した全RNAについてデュプリケートで行った。ラットp21^WAFl/CIPl またはMDM2のいずれかを増幅するであろうプライマー対を除外した。異なって発現した総計35のRT-PCR産物を、32℃という誘導温度単独での産物の誘導に基づいて、さらなる解析のために選んだ。RT-PCR反応を二重のRNAサンプルについて行ったが、可能性として目的の転写産物を含むすべての反応を省略せずに繰返して、ディファレンシャルディスプレイ解析における共通の問題である、生じ得る人工物をさらに避けた。続くノーザン解析では、これらのRT-PCR産物のうちすべてだが４つを、異なって発現した遺伝子として出した。これら４つの遺伝子のいずれも、32℃で培養した非温度感受性p53変異を持つ対照細胞（REF-1 32細胞[PHE132]）由来のRNAではいかなる転写誘導も示さず、観察された転写誘導は温度の移動のためのみでなく、変異のためでもあることを示唆する。誘導された遺伝子のうちの２つは、以前にSM20およびミクロソームエポキシド水酸化酵素（mEH）を含めて記載されたものである。相関的な遺伝子発現解析では、これらの遺伝子を増殖条件に依存して異なって発現するとして説明したが、これらの遺伝子の転写は、以前にp53発現とは結び付けられていなかった。 11および19と名付けられた、２つの新規cDNAに由来するディファレンシャルRT -PCR産物を、SM20およびmEHと同様に図２に示す。これらの部分cDNAのそれぞれに関するノーザン解析により、これらの転写産物が38℃または32℃で培養した細胞において異なって発現していたということが確かめられた。オリゴヌクレオチド：12の固定されたオリゴ-dTプライマー（dT₁₂［A,C,G］［ A,C,G,T］の組み合わせ）および25のランダムな10merをRT-PCR反応に用いた。サイクリンG RT-PCR反応に関しては、dT₁₂GCおよび5'-TCTTCACTGC-3'プライマー対を用いて□300bpの断片を増幅した。特異的なクローンのRT-PCR増幅を、以下のプライマー対を用いて達成した。すなわち、CGR11:dT₁₂AT/TACAACGAGG；SM20：d T₁₂GG/GATCATAGCG；CGR19：dT12CG/GATCATAGCC；mEH：dT₁₂CA/GATCATGGTCである。実施例３本実施例では、新規に同定した遺伝子、CGR11およびCGR19の組織特異的発現を明らかにする。部分cDNA断片11および19を、様々なラット組織由来の発現解析のプローブとして用いた(図3a)。部分11cDNAプローブを用いて、1.3kbの転写産物が、脳全体および腎に広く存在し、心臓、肺、肝および骨格筋では限られた発現を示し、牌および精巣には検出できるような発現は示さない、といった限定された発現パターンが観察された。部分cDNA19をプローブとして用いると、1.4kbの転写産物がラット精巣で最も高い発現量を示し、よりユビキタスな発現パターンを見せた。これらの遺伝子のいずれも以前に記載されていないため、我々はこれらを選び、細胞増殖調節（Cell Growth Regulatory）遺伝子CGR11およびCGR19と名付けた。実施例４本実施例では、温度移動の際の細胞増殖調節遺伝子の発現の速度論も、遺伝子の発現量の定量も明らかにする。 38℃から32℃への温度の移動後のREF-112細胞における、CGR11およびCGR19転写産物誘導の速度論を、これらの遺伝子の転写誘導が増殖阻害に至るカスケードにおける初期の出来事であるのか決定することを目的として行った(図3b)。誘導速度論は、CGR19に関してはp21^WAFl/CIPlと密接に対応していた(図3b)。C GR11に関してはわずかに遅い誘導速度が観察された。これは、これらの遺伝子の誘導が増殖阻害に至るカスケードにおける比較的初期の出来事であることを示唆している。誘導された転写産物の発現量は有意に異なり、CGR11は32℃で誘導したREF-112細胞においてより高く発現していた(図3b)。しかし、CGR11よりもCGR1 9について、基底状態の（誘導しない）転写産物量がより高く存在していた(図２ )。CGR11およびCGR19の発現量は、このREF-112システムにおいてp21WAFl/CIPlおよびサイクリンGと比較して間接的に評価することもできた。誘導されたREF-112 cDNAライブラリーに対するプローブハイブリッド形成では、p21^WAFl/CIPlよりも２倍高いサイクリンＧ量をもたらし、p21^WAFl/CIPlは細胞内の全mRNAの□0.1% で発現し、サイクリンＧは0.2%で発現した。実施例５本実施例では、単離された細胞増殖調節遺伝子の配列解析を提供する。 CGR11およびCGR19に対応する全長であろうcDNAを、REF-112 RNAから5'RACE（5 '末端の急速な増幅）およびヒト、胎児脳cDNAライブラリーへのハイブリッド形成により得た。得られたラットおよびヒトCGR11 cDNAは、長さが1,209および1,1 13bpである。5’RACE解析では、ヒトクローンに関してはより長い5'伸長を持ったcDNAは得られなかった。CGR11に対するラットおよびヒトcDNAは、それぞれ272 および301アミノ酸のタンパク質産物をコードするオープンリーディングフレームを有する(図4a)。どちらのcDNAの予想される開始コドンの上流にも、読み枠にあう終止コドンは一つも見られなかった。ラットおよびヒトCGR11タンパク質の間の最適な5'整列（allgnment）は、最初のラットCGR11 ATGから７アミノ酸（MS RWLMQ）を欠いており、従ってラットATG開始コドンを最終的に指定することがでぎない。ラットおよびヒトCGR11タンパク質は65%同一である。加えて、非常に保存された２つの予想Ca²⁺結合EFハンドモチーフ（ヒトタンパク質におけるアミノ酸82-94およびアミノ酸127-139；図4bに上線を引いた）は、ほとんど100%同一である。クラスター状の17アミノ酸の繰返し４つが、ヒトCGR11タンパク質のみのカルボキシ末端部分内に存在しており(コンセンサス：PGPRGEAEGQAEA［K/R］GDA)、全く異なるターンによって中断される４つのαヘリカルドメインに似た構造を示唆している。 CGR11およびCGR19タンパク質のIn vitro産生により、それぞれ□37Kdおよび34 Kdの産物を得た。CGR11タンパク質は非常に酸性で、計算された正味の負電荷が- 29でpIは4.21と予想される。ラットおよびヒトCGR19タンパク質は、アミノ酸レベルで85%同一であり、332 アミノ酸タンパク質の完全長を通して一貫して相同である（図4c)。読み枠にあう終止コドンは、予想される開始コドンより上流には一つも見つからないが、ラットおよびヒトのタンパク質相同体は開始コドンのすぐ上流で分かれており、指定したATGが本当にCGR19の開始コドンであることをさらに示唆している。CGR１9 の予想タンパク質配列は、タンパク質のアミノ末端の予想される亜鉛結合C₃HC₄ リングフィンガードメインの領域においてのみ、既知のタンパク質と重要な相同性を示す（図4d)。リングフィンガーを含むいくつかのタンパク質で見られていた通り、付随するB-boxドメインはCGR19内には一つも見られなかった。我々はREF-112細胞から、cDNAの中央部内に130bpのインサートを含む全長CGR1 9 cDNAも単離した。このインサートはエキソン−イントロン境界に一致する5'GT および3'AG末端を含む。これは、細胞内のいくつかのCGR19転写産物が不完全に加工されているか、または保持されたイントロンを含む代替の転写産物が産生されていることを示唆する。この第二のCGR19は、CGR19の最初の140アミノ酸を保持するタンパク質キメラを作り出す、読み枠にあう終止コドンを予想されるイントロン内に作り出すだろう。さらに、32℃で誘導したREF-112細胞に由来するRT- PCR解析では、２つのCGR19転写産物の安定な生成と一致する、同等の強さの２つのバンドが現れる。これらの２つの転写産物から作られる、あり得る異なるタンパク質産物のさらなる解析が、この異なって加工される転写産物が重要であるかどうかを決定するのに必要である。 5'RACE：cDNA末端の急速な増幅を、32℃処理した細胞から回収したREF-112 RN Aを使い、製造者が説明する通りにmarathon kit（Clonetech）を用いて行った。ラットCGR11およびCGR19の3’末端に特異的なオリゴヌクレオチドを手順の中で用いた。 DNA配列決定：すべてのcDNAクローンの配列決定を、完全長cDNAに沿って両方の鎖の配列決定ができるプライマーを利用した、手動のSangerダイデオキシ配列決定（USB）により行った。複数のクローンを、ラットおよびヒトCGR11およびCG R19 cDNAについて配列決定した。データベース検索：すべての相同性検索(FASTA)、整列（BESTFIT）および構造上の特徴（MOTIFS)を、The Genetics Computer Group（GCG）ソフトウエアプログラム（Madison、WI）を用いて行った。最終的な検索は、GenBank version 91 を利用して行った。実施例６本実施例では、細胞増殖調節遺伝子の増殖抑制特性を明らかにする。本研究で単離した、異なって発現する遺伝子のあり得る増殖抑制特性を評価するために、我々はコロニー阻害アッセイにおける、安定トランスフェクションによる増殖阻害を分析した。調べたすべての遺伝子は、染色体外に維持されるプラスミド（pCEP）上の唾液腺ウイルス（CMV）プロモーターから発現させ、コロニー形成はトランスフェクションの２から３週間後に計上した。対照として、p21^W ^AFl/CIPl 、p53、およびp53アンチセンス構築物もトランスフェクとした。増殖抑制機能の解析のために、我々は異なるp53対立遺伝子をすべてが持つ、３つの細胞株を選んだ。すなわち、２つの点突然変異HIS273およびSER309を含むSW480大腸カルシノーマ細胞株；卵巣カルシノーマ株、SKOV3 IP1、これはp53-nu11である；およびp53内に一つの点突然変異MET237を含むグリオブラストーマ細胞株、T 98Gである。ラットmEH、SM20、CGR11、およびCGR19は、すべていくらかの増殖抑制効果を示したが、解析した細胞に依存した様々な程度であった（表１に要約した）。この相違は、増殖抑制効果に対して臓器特異性という局面があることを示唆する。 p53は一貫して最も強力な増殖阻害効果を示した。以前の結果と一致して、p21^WA ^Fl/CIPl は65-80%の間の阻害を示した。CGR11およびSM20のみがSW480細胞において有意な増殖阻害を示したが(それぞれ80%および85%)、調べたすべてのクローンがSKOVIPlおよびT98G細胞において増殖阻害を示し(70-90%阻害)、ヒトの細胞間でCGR11およびCGR19の機能が保存されている可能性を明らかにしている。上記の結果は、調べたcDNAの増殖阻害機能を示唆するものであるが、これらのタンパク質の過剰発現が非特異的な毒性のために、観察された阻害効果をもたらしたという可能性が残っている。この可能性に焦点をあてるために、我々はヒト CGR11cDNA内のEFハンド欠失変異体を構築し、このタンパク質を増殖阻害能について評価した。EFハンドを含むタンパク質を用いた以前の結果は、２つのEFハンドモチーフのうちの一つを欠失させた結果、Ca²⁺結合能に関しては機能的なタンパク質が得られたということを示唆する。従って、我々はこの解析のために、ヒトCGR11内の両方のEFハンドドメインを欠失させた(CGR11ΔEF、アミノ酸82-139) 。EFハンドを欠失したCGR11 cDNAトランスフェクタントは、SKOV3 IP1細胞においてコロニー形成を阻害できなかった(表1)。ヒト野生型CGR11 cDNAは細胞増殖を、調べた変異体と比較して8%まで(SKOV3 IP1)および58%まで(T98G)抑制した。従って、少なくともCGR11に関しては、観察された増殖抑制効果は構造-機能相関を増殖阻害に反映しものであるかもしれない。同様の解析は、CGR19内のリングフィンガードメインに関して進行中である。本発明の原理、好ましい態様および実施方法は、先行する明細書に記載されている。しかし、本明細書中で保護しようと意図する発明は、限定というよりはむしろ説明として考えられるので、開示した特定の形態に限定されるとはみなされない。変化および変更は、本発明の精神から離れることなく、当業者によってなされ得る。 Tab1e１細胞増殖調節遺伝子によるコロニー形成阻害 ^a実験はデュプリケートで行った。^b pCEP4ベクターのみ N.D.，測定せず

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 16/18 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＺＣ１２Ｐ 21/08 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｎ 5/00 ＥＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ガレラ，エリザベス・エイアメリカ合衆国ニュージャージー州07645, ワシントン・タウンシップ，マウンテン・アベニュー 572 (72)発明者マッデン，スティーヴン・アイアメリカ合衆国ニュージャージー州08512, クランベリー，ステイション・ロード 12 ―シー

Claims

【特許請求の範囲】 1. 哺乳類CGR11タンパク質をコードする、単離され、そして精製されたサブクロモゾームDNA分子。 2. ヒトCGR11タンパク質をコードする、請求項１の単離され、そして精製されたサブクロモゾームDNA分子。 3. 介在配列を含まない、請求項２のDNA分子。 4. SEQ ID NO:1に示す配列を含む、請求項２のDNA分子。 5. ラットCGR11タンパク質をコードする、請求項１の単離され、そして精製されたサブクロモゾームDNA分子。 6. 介在配列を含まない、請求項５のDNA分子。 7. SEQ ID NO:5に示す配列を含む、請求項２のDNA分子。 8. 単離され、そして精製された哺乳類CGR11タンパク質。 9. SEQ ID NO:2に示すようなヒトCGR11の配列からなる、請求項８の単離され、そして精製された哺乳類CGR11タンパク質。 10. SEQ ID NO:6に示すようなラットCGR11の配列からなる、請求項８の単離され、そして精製された哺乳類CGR11タンパク質。 11. 哺乳類CGR11タンパク質に特異的に結合する抗体。 12. CGR11がヒトのものであってSEQ ID NO:2に示す配列からなる、請求項11 の哺乳類CGR11タンパク質に特異的に結合する抗体。 13. CGR11がラットのものであってSEQ ID NO:6に示す配列からなる、請求項1 1の哺乳類CGR11タンパク質に特異的に結合する抗体。 14. 腫瘍細胞に哺乳順CGR11タンパク質を投与すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 15. タンパク質がヒトのものであってSEQ ID NO:2に示す配列からなる、請求項14の方法。 16. タンパク質がラットのものであってSEQ ID NO:6に示す配列からなる、請求項14の方法。 17. 腫瘍細胞に哺乳類CGR11タンパク質を発現させるようなDNA分子を、前記細胞に投与すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 18. DNA分子がSEQ ID NO:1に示す配列を含む、請求項17の方法。 19. DNA分子がSEQ ID NO:5に示す配列を含む、請求項17の方法。 20.組織サンプルを分析して組織における哺乳類CGR11タンパク質またはmRNAの発現量を測定すること、その量を正常組織に見出される発現量と比較することであって、組織サンプルにおいて正常組織サンプルよりも発現量が低いことが癌であることの指標とすること、の段階を含む、癌を診断する方法。 21．哺乳類CGR11タンパク質と特異的に反応する抗体を分析段階で利用する、請求項20の方法。 22．哺乳類CGR11タンパク質がSEQ ID NO:2に示すようなヒトCGR11である、請求項21の方法。 23. 哺乳類CGR11タンパク質がSEQ ID NO:6に示すようなラットCGR11である、請求項21の方法。 24. 哺乳類CGR11 mRNAに相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブを分析段階で利用する、請求項20の方法。 25. プローブがSEQ ID NO:1から選択される配列を有する、請求項24の方法。 26. プローブがSEQ ID NO:5から選択される配列を有する、請求項24の方法。 27. 組織を分析して、哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列の変異型あって、その遺伝子のコーディング配列の野生型とは異なるものを前記組織のDNAが含むかどうか決定すること、の段階を含む、癌を診断する方法。 28. 組織のDNAを正常組織のDNAと比較して、CGR11遺伝子のコーディング配列が変異型であるかどうか決定する、請求項27の方法。 29. 野生型遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:1に示される、請求項27の方法。 30. 野生型遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:5に示される、請求項27 の方法。 31. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ以上の区分を含むDNA区分であって、前記遺伝子のコーディング配列の区分が前記プロモーターと前記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前記ターミネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作り出されるRNAが、哺乳類細胞によって作り出される対応するCGR11 RNAの区分と相補的である、前記DNA区分、を含むアンチセンスCGR11構築物。 32. 前記転写プロモーターが誘導性である、請求項31のアンチセンスCGR11構築物。 33. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:5に示すラット遺伝子配列である、請求項31のアンチセンスCGR11構築物。 34. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:1に示すヒト遺伝子コーディング配列である、請求項31のアンチセンスCGR11構築物。 35．哺乳類CGR11 mRNAに相補的な、少なくとも10ヌクレオチドを含む、CGR11 アンチセンスオリゴヌクレオチド。 36. CGR11 mRNAに相補的な少なくとも約20ヌクレオチドを含む、請求項35のC GR11アンチセンスオリゴヌクレオチド。 37. 修飾を加えたヌクレオチド類似体を一つまたはそれ以上含む、請求項35 のCGR11アンチセンスオリゴヌクレオチド。 38. 環状分子である、請求項35のCGR11アンチセンスオリゴヌクレオチド。 39. SEQ ID NO:1の配列に相補的である、請求項35のCGR11アンチセンスオリゴヌクレオチド。 40. SEQ ID NO:5の配列に相補的である、請求項35のCGR11アンチセンスオリゴヌクレオチド。 41. 哺乳類CGR11 mRNAに相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含むCGR11アンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞に投与してCGR11の発現を阻害すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 42. CGR11アンチセンスオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:5に示すようなラットCGR11に相補的である、請求項41の方法。 43. CGR11アンチセンスオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1に示すようなヒトCGR11に相補的である、請求項41の方法。 44．哺乳類CGR11遺伝子に相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、CGR11三本鎖形成オリゴヌクレオチドを、細胞に投与して哺乳類CGR11遺伝子の発現を阻害すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 45. オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:5に示すようなラットCGR11に相補的である、請求項44の方法。 46. オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:1に示すようなヒトCGR11に相補的である、請求項44の方法。 47. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ以上の区分を含むDNA区分であって、前記遺伝子配列の区分が前記プロモーターと前記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前記ターミネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作り出されるRNAが、哺乳類細胞によって作り出される対応するCGR11 RNAの区分と相補的である、前記DNA区分、を含むアンチセンスCGR11構築物を、細胞に投与して哺乳類CGR11の発現を阻害すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 48. 前記転写プロモーターが誘導性である、請求項47の方法。 49. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:5に示すラット遺伝子配列である、請求項47の方法。 50. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:1に示すヒト遺伝子コーディング配列である、請求項47の方法。 51. 血液、粘膜塗布標本（スメア）、皮膚、頚管塗布標本（スメア）、絨毛膜絨毛、羊水、および着床前の胚の卵割球からなる群から選択される組織を分析して、変異体である哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列を前記組織のDNAが含むかどうか決定すること、の段階を含む、癌に対する感受性を分析する方法。 52. DNAをヒトCGR11遺伝子のコーディング配列の野生型配列と比較する、請求項51の方法。 53．ヒト遺伝子のコーディング配列の野生型配列がSEQ ID NO:1に示される、請求項52の方法。 54. 哺乳類CGR19タンパク質をコードする、単離され、そして精製されたサブクロモゾームDNA分子。 55. SEQ ID NO:4に示すようなヒトCGR19タンパク質をコードする、請求項54 の単離され、そして精製されたサブクロモゾームDNA分子。 56. 介在配列を含まない、請求項55のDNA分子。 57. SEQ ID NO:3に示す配列を含む、請求項55のDNA分子。 58. SEQ ID NO:8に示すようなラットCGR19タンパク質をコードする、請求項5 4の単離され、そして精製されたサブクロモゾームDNA分子。 59. 介在配列を含まない、請求項58のDNA分子。 60. SEQ ID NO:7に示す配列を含む、請求項58のDNA分子。 61. 単離され、そして精製された哺乳類CGR19タンパク質。 62. SEQ ID NO:4に示すようなヒトCGR19の配列からなる、請求項61の単離され、そして精製された哺乳類CGR19タンパク質。 63. SEQ ID NO:8に示すようなラットCGR19の配列からなる、請求項61の単離され、そして精製された哺乳類CGR19タンパク質。 64. 哺乳類CGR19タンパク質に特異的に結合する抗体。 65．CGR19がヒトのものであってSEQ ID NO:4に示す配列からなる、哺乳類CGR1 9タンパク質に特異的に結合する請求項64の抗体。 66. CGR19がラットのものであってSEQ ID NO:8に示す配列からなる、哺乳類CG19タンパク質に特異的に結合する請求項64の抗体。 67. 腫瘍細胞に哺乳煩CGR19タンパク質を投与すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 68. タンパク質がヒトのものであってSEQ ID NO:4に示す配列からなる、請求項67の方法。 69. タンパク質がラットのものであってSEQ ID NO:8に示す配列からなる、請求項67の方法。 70. 腫瘍細胞に咄乳類CGR19タンパク質を発現させるようなDNA分子を、前記細胞に投与すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 71. DNA分子がSEQ ID NO:3に示す配列を含む、請求項70の方法。 72. DNA分子がSEQ ID NO:7に示す配列を含む、請求項70の方法。 73. 組織の試験サンプルを分析して哺乳類CGR19タンパク質またはmRNAの発現量を測定すること、試験サンプルにおいて正常組織よりも発現量が低いことが癌であることの指標である、試験サンプルの発現量を正常組織の発現量と比較すること、の段階を含む、癌を診断する方法。 74．哺乳類CGR19タンパク質と特異的に反応する抗体を分析段階で利用する、請求項73の方法。 75. 哺乳類CGR11(19?)タンパク質がヒトCGR19である、請求項74の方法。 76. ヒトCGR11(19?)タンパク質がSEQ ID NO:4に示す通りである、請求項75の方法。 77. 哺乳類CGR19 mRNAに相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブを分析段階で利用する、請求項73の方法。 78. プローブがSEQ ID NO:3に隣接するヌクレオチドから選択される配列を有する、請求項77の方法。 79. プローブがSEQ ID NO:7に隣接するヌクレオチドから選択される配列を有する、請求項77の方法。 80. 試験組織を分析して、哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列の変異型を前記組織のDNAが含むかどうか決定すること、の段階を含む、癌を診断する方法。 81. 組織のDNAを正常組織のDNAと比較して、CGR19遺伝子のコーディング配列が変異型であるかどうか決定する、請求項80の方法。 82. 野生型遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:3に示される、請求項80の方法。 83. 野生型遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:7に示される、請求項80の方法。 84. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ以上の区分を含むDNA区分であって、前記遺伝子のコーディング配列の区分が前記プロモーターと前記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前記ターミネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作り出されるRNAが、哺乳類細胞によって作り出される対応するCGR19 RNAの区分と相補的である、前記DNA区分、を含むアンチセンスCGR19構築物。 85. 前記転写プロモーターが誘導性である、請求項84のアンチセンスCGR19構築物。 86. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:7に示すラット遺伝子配列である、請求項84のアンチセンスCGR19構築物。 87. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:3に示すヒト遺伝子配列である、請求項84のアンチセンスCGR19構築物。 88．哺乳類CGR19 mRNAに相補的な、少なくとも10ヌクレオチドを含む、CGR19 アンチセンスオリゴヌクレオチド。 89. CGR19 mRNAに相補的な少なくとも約20ヌクレオチドを含む、請求項88のC GR19アンチセンスオリゴヌクレオチド。 90. 修飾を加えたヌクレオチド類似体を一つまたはそれ以上含む、請求項88 のCGR19アンチセンスオリゴヌクレオチド。 91. 環状分子である、請求項88のCGR19アンチセンスオリゴヌクレオチド。 92. SEQ ID NO:3の配列に相補的である、請求項88のCGR19アンチセンスオリゴヌクレオチド。 93. SEQ ID NO:7の配列に相補的である、請求項88のCGR19アンテセンスオリゴヌクレオチド。 94. 哺乳類CGR19 mRNAに相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含むCGR19アンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞に投与してCGR19の発現を阻害すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 95. CGR19アンチセンスオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:7に示すようなラットCGR19に相補的である、請求項94の方法。 96. CGR19アンチセンスオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:3に示すようなヒトCGR19に相補的である、請求項94の方法。 97．哺乳類CGR19遺伝子に相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、CGR19三本鎖形成オリゴヌクレオチドを、細胞に投与して哺乳類CGR19遺伝子の発現を阻害すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 98. オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:7に示すようなラットCGR19に相補的である、請求項97の方法。 99. オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:3に示すようなヒトCGR19に相補的である、請求項97の方法。 100. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ以上の区分を含むDNA区分であって、前記遺伝子の区分が前記プロモーターと前記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前記ターミネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作り出されるRNA が、哺乳類細胞によって作り出される対応するCGR19RNAの区分と相補的である、前記DNA区分、を含むアンチセンスCGR19構築物を、細胞に投与して哺乳類CGR19の発現を阻害すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 101. 前記転写プロモーターが誘導性である、請求項100の方法。 102. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:7に示すラット遺伝子配列である、請求項100の方法。 103. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:3に示すヒト遺伝子コーディング配列である、請求項100の方法。 104. 血液、絨毛膜絨毛、羊水、および着床前の胚の卵割球からなる群から選択される組織を分析して、変異体である哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列を前記組織のDNAが含むかどうか決定すること、の段階を含む、癌に対する感受性を評価する方法。 105. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列の野生型配列がSEQ ID NO:3に示される、請求項104の方法。 106. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列の野生型配列がSEQ ID NO:7に示される、請求項104の方法。 107. 哺乳類SM20またはmEHタンパク質を腫瘍細胞に投与すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 108. 腫瘍細胞に哺乳類SM20またはmEHタンパク質を発現させるようなDNA分子を、前記細胞に投与すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 109．組織を分析して、組織が哺乳類SM20またはmEHタンパク質あるいはmRNAを正常組織よりも少なく発現しているかどうか決定すること、の段階を含む、癌を診断する方法。 110. 組織を分析して、哺乳類SM20またはmEH遺伝子のコーディング配列の変異型であって、遺伝子のコーディング配列の野生型とは異なるものを前記組織の DNAが含むかどうか決定すること、の段階を含む、癌を診断する方法。 111. 哺乳類SM20またはmEH mRNAに相補的な少なくとも10オリゴヌクレオチドを含むSM20またはmEHアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞に投与してS M20またはああEHの発現を阻害すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 112. 哺乳類SM20またはmEH遺伝子に相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、SM20またはmEH三本鎖形成オリゴヌクレオチドを、細胞に投与して哺乳類SM2 0またはmEH遺伝子の発現を阻害すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 113. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類SM20またはmEH遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ以上の区分を含むDNA区分であって、前記遺伝子の区分が前記プロモーターと前記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前記ターミネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作り出されるRNAが、哺乳類細胞によって作り出される対応するSM20またはmEH RNAの区分と相補的である、前記DNA区分、を含むアンチセンスSM20またはmEH構築物を、細胞に投与して哺乳類SM20またはm EHの発現を阻害すること、の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 114. 血液、絨毛膜絨毛、羊水、および着床前の胚の卵割球からなる群から選択される組織を分析して、変異体である哺乳類SM20またはmEH遺伝子のコーディング配列を前記組織のDNAが含むかどうか決定すること、の段階を含む、癌に対する感受性を分析する方法。 115. SM20、mEH、CGR11、およびCGR19からなる群から選択される哺乳類タンパク質を有効量含む薬剤組成物であって、鼻腔内または非経口投与するのに適している薬剤組成物。 116. SM20、mEH、CGR11、およびCGR19からなる群から選択される哺乳類タンパク質を作り出すことができる発現ベクターを調製する方法であって、宿主細胞内でそのタンパク質を発現するDNAを発現することができるように、そのタンパク質をコードするDNAを、機能可能な位置および方向でベクターにつなぐこと、を含む方法。 117. SM20、mEH、CGR11、およびCGR19からなる群から選択される哺乳類タンパク質を、宿主細胞内で作り出すことができる発現ベクターであって、選択されたタンパク質をコードするDNA区分、および、宿主細胞内でそのタンパク質をコードするDNAを発現することができるように、作用可能な位置および方向でDNA区分がつながっている、ベクター、を含むベクター。 118. SM20、mEH、CGR11、およびCGR19からなる群から選択される哺乳類タンパク質の発現を指向することができる発現ベクターを含む、宿主細胞。 119. 細胞が哺乳類の体内にあり、そして腫瘍を抑制する量のタンパク質を投与する、請求項14、67、または107の方法。 120. 哺乳類SM20またはmEH mRNAに相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、SM20またはmEHアンチセンスオリゴヌクレオチド。 121. 細胞が哺乳類SM20またはmEH遺伝子の発現を阻害するのを助ける、哺乳類SM20またはmEH遺伝子に相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、SM20またはmEH三本鎖形成オリゴヌクレオチド。 122. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類SM20またはmEH遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ以上の区分を含むDNA区分であって、前記遺伝子の区分が前記プロモーターと前記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前記ターミネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作り出されるRNAが、哺乳類細胞によって作り出される対応するSM20またはmEH RNAの区分と相補的である、前記DNA区分、を含むアンチセンスSM20またはmEH構築物。 123. 少なくとも一組の混合オリゴヌクレオチドであって、混合オリゴヌクレオチドの前記組の各要素が、SEQ ID NO:2、4、6、または８に示すアミノ酸配列のうち少なくとも６つの隣接したアミノ酸の配列をコードするを哺乳類cDNAライブラリーとアニールさせること、 (1)混合オリゴヌクレオチドの組の少なくとも１つの要素にアニールし、 (2)約275から約335コドンの完全なオープンリーディングフレームを含み、そして、(3)哺乳類CGRタンパク質をコードする、哺乳類cDNAを単離すること(その際、CGR RNAが野生型p53の存在下で亢進調節される)、の段階を含む方法によって得られる、哺乳類CGRタンパク質をコードするDNA配列を単離する方法。 124. 少なくとも２組の混合オリゴヌクレオチドがアニールされる、請求項１の哺乳類CGR DNA配列。