JP2000512980A

JP2000512980A - 腫瘍のｉｌ―１２遺伝子治療

Info

Publication number: JP2000512980A
Application number: JP10500803A
Authority: JP
Inventors: エル．ラクミレビッチ，アレキサンダー; ヤン，ニン―サン
Original assignee: パウダージェクトバクシーンズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 2000-10-03
Also published as: US5922685A; EP0963207A1; EP0963207B1; HK1024622A1; DE69735643D1; ES2262180T3; EP0963207A4; DE69735643T2; WO1997046263A1

Abstract

(57)【要約】腫瘍を処置するための遺伝子治療へのアプローチにおいて、サイトカインIL-12のp35およびp40をコードする遺伝子構築物が、細胞中でIL-12を発現するため、および確立された腫瘍の退行を生じるために、治療を必要とする個体の細胞に送達される。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍のIL-12遺伝子治療発明の分野本発明は一般に、腫瘍の処置の分野に関し、そして詳細には、IL-12遺伝子を含む遺伝子構築物の皮膚細胞への直接的な送達に関する。発明の背景インターロイキン(IL)12（以前は、ナチュラルキラー細胞刺激因子または細胞毒性リンパ球成熟因子と呼ばれていた）は、35kDaおよび40kDaのサブユニットからなるジスルフィド結合性ヘテロ二量体サイトカインである；サブユニットは、一般に「p35」および「p40」と呼ばれる。マウスおよびヒトの両方に由来するp3 5およびp40サブユニットをコードする相補的DNAは配列決定され、クローン化されている。そしてヒトおよびマウスの両方のIL-12は、インビトロおよびインビボでナチュラルキラー（「NK」）細胞およびＴ細胞の増殖因子として作用することが示されている。さらに、IL-12がマウスの腫瘍の退行および完全な消滅に有効であることもまた証明されている。Taharaら、Cancer Research 54(1):182-9 ，1994;Brundaら、J ．EXP．MED．178(4):123-30，1993。しかし、IL-12はインビボで短い半減期を有するので、サイトカインの頻繁な注射が、治療効果を達成するために必要とされる。さらに、比較的多量のIL-12 （１〜10μｇ/日の範囲）が代表的に必要とされる。従って、組換えIL-12の投与はしばしば細胞傷害性を生じた。レトロウイルスベクターを使用するIL-12遺伝子治療はいくつかの研究室で進行中であり、そしてその抗腫瘍効果が示されている。Lotze，M.T.ら、J ．Cell． Biochem. 、184頁、1993；Robbinsら、Cancer Gene Therapy 1(2):147、1994。Lo tzeらの研究において、IL-12 p35およびp40サブユニットの遺伝子がNIH 3T3線維芽細胞に挿入された。線維芽細胞は、腫瘍の部位にIL-12を送達するために使用され、種々のマウスの腫瘍の増殖を遅延させた。Robbinsらの研究において、接種前のレトロウイルス媒介性形質導入によるいくつかの異なるマウスの腫瘍細胞系統への、または次に腫瘍細胞と同時投与される線維芽細胞へのIL-12の直接的な送達は、腫瘍増殖の阻害、ならびに抗腫瘍免疫性の誘導を生じた。しかし、今日まで、直接的なIL-12遺伝子治療を使用して、確立された腫瘍の確かな退行およびそれらの自発的な転移（metastases）を生じることは不可能であった。発明の要旨本発明は、サイトカインIL-12をコードするDNA分子の哺乳動物への転移後に抗腫瘍応答がもたらされ得ることに要約される。１つ局面において本発明は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトにおける腫瘍を、遺伝子治療によって処置するための方法である。この方法において、外来の遺伝子構築のコピーが好ましい。遺伝子構築は、動物の細胞中で作動するプロモーター、ならびにサイトカインIL-12のp35およびp40サブユニットの両方をコードするタンパク質コード領域を含む。次いで、外来の遺伝子構築物は、そのような遺伝子治療を必要とする腫瘍を有する動物の表皮に物理的に送達される。別の局面において、本発明は、腫瘍を処置するための遺伝子構築物を提供する。この構築物は、動物の細胞内で有効なプロモーターに、サイトカインIL-12のp 35およびp40サブユニットをコードするDNA配列を作動可能に結合させることによって提供される。この構築物は、例えば、粒子媒介性トランスフェクションプロセスによる動物の細胞への導入に適切である。本発明の目的は、IL-12の遺伝子構築物の使用を通じて腫瘍の処置を可能にすることである。本発明の特徴は、その処置が遺伝子構築物の表皮または粘膜送達のいずれかに適応されることである。本発明の遺伝子処置の利点は、その処置が本質的に安全であり、投与に痛みを伴わず、そして処置された個体に有害な結果を生じないはずであることである。本発明の遺伝子処置のさらなる利点は、腫瘍から離れた部位に送達された場合でさえその遺伝子処置が有効であり、そして免疫学的な記憶が遺伝的処置をやめた後も維持されることである。本発明の他の目的、利点、および特徴は、以下の明細書から明らかになる。図面の簡単な説明図１は、IL-12プラスミドpWRG3169のプラスミドマップである。図２は、IL-12プラスミドpWRG3196のプラスミドマップである。図３は、IL-12遺伝子処置したマウスおよびコントロールマウス中の腫瘍増殖パターンを示すグラフである。図４Ａ〜４Ｆは、IL-12遺伝子を使用する処置の後の、種々の誘導された固形の腫瘍の直径における変化を示すグラフである。発明の詳細な説明本明細書は、腫瘍部位において患者の表皮中にIL-12タンパク質のp35およびp4 0サブユニットをコードする遺伝子構築物を送達することにより、腫瘍を処置するための方法を記載する。腫瘍は、固形腫瘍または転移性もしくは散在性腫瘍であり得、そして微細であり得るかまたは裸眼で可視であり得る。一旦構築物が送達されると、ヘテロダイマー性IL-12サイトカインは発現され、たとえ腫瘍が送達部位から遠く離れていても、処置される個体において抗腫瘍応答の生成を生じる。本発明の求められる遺伝子処置を達成するために、IL-12遺伝子構築が作製され、ここでIL-12コード遺伝子は、標的哺乳動物の細胞中で作動性のプロモーターの制御下に置かれる。処置される動物の細胞中にトランスフェクトされると、適切な構築物は、IL-12タンパク質の発現を引き起こす。 IL-12タンパク質は、実際、35kDa（p35）および40kDa（p40）サブユニットを含むヘテロダイマーである。各サブユニットは異なる遺伝子によりコードされる。IL-12 p35およびp40コードDNA配列は、咄乳動物供給源、好ましくはヒト供給源から得られ得るか、またはそれに由来し得る。ヒトIL-12サブユニットをコードする完全長DNA配列は、Gublerら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 88:4143-4 147，1991により公開されている。p35サブユニットの公開されたヒト核酸およびアミノ酸配列は、GenBank登録番号M65271において入手可能である。同様に、ヒトp40サブユニットの核酸およびアミノ酸配列はまた、GenBank登録番号M65272において入手可能である。あるいは、IL-12サブユニットコード配列は、IL-12を産生する任意の他の非ヒト動物から得られ得る。IL-12サブユニットコード配列は、ヒトIL-12と機能的に等価であるに十分な配列同一性を示す他の種から得られ得るか、またはそれに由来し得る。例えば、IL-12は、マウスにより産生されることが知られている。マウス配列は、本明細書中に報告される構築物の例において使用された。p35コードDNAは、GenBank登録番号M86672において報告される。p40コードDNAもまたGenB ankから入手可能である。また、IL-12 p35およびp40サブユニットをコードするインビトロ合成コード配列は、公開されたDNA配列をガイドテンプレートとして使用して、標準的な組換え分子生物学的技術（PCR増幅およびハイブリダイゼーションを含む）を使用する分子クローニングのために十分な量で容易に調製され得る。本発明の抗腫瘍活性をなお維持しながら、本明細書中に開示されるサブユニットコードDNA分子およびタンパク質サブユニットをさらに改変することもまた可能であり得る。本発明は、本明細書中に記載の核酸配列を有する短縮型天然IL-1 2 DNA、および全ての変化された（altered）、変形された(varied)、および改変された（modified）形態のDNAを含むことが意図される。これらは、5'および／または3'末端における短縮を含む、開示される核酸配列に比較して、付加、欠失、および点変異を有する、実質的に相同なDNAフラグメントを含み得るが、それらに限定されない。実質的に相同なDNAフラグメントは、たとえ、そのようなDNA が、本明細書中に開示されるDNAフラグメントまたはタンパク質とは、核酸配列が異なるか、またはアミノ酸配列が異なるタンパク質をコードしても、フラグメントが、送達後に有意な抗腫瘍活性および／または後退を示すポリペプチドをコードするものである。そのような短縮型DNA分子の抗腫瘍活性は、下記のようにモニターされ得る。当業者は、核酸配列に対する特定のサイレントな変化が、特定のトリプレットによりコードされるアミノ酸に対して効果を有さないことを認識する。コードされるタンパク質のIL-12活性に影響を及ぼさない、またはいくらかのみ影響を及ぼす特定のアミノ酸変化でさえ、本発明の範囲内で使用され得る。以下の実施例に記載のように試験されるマウスIL-12（mIL-12）遺伝子を使用して得られる活性の少なくとも75％である抗腫瘍活性を生じる任意の核酸またはアミノ酸配列が、本発明において使用され得る。もちろん、IL-12タンパク質をコードする遺伝子が、その遺伝子が由来する種以外の種の宿主中への送達のための遺伝子構築物に加工される場合、免疫応答が遺伝子移入の後に生じ得る。しかし、当業者は、送達遺伝子の成熟IL-12部分の核酸配列を改変することにより、そのような効果を排除することが可能であることを理解する。トランスフェクトされた細胞においてIL-12サブユニット遺伝子配列を適正にに発現させるために、標的細胞において作動可能なプロモーター配列が必要とされる。いくつかのそのようなプロモーターが哺乳動物系について公知であり、これは発現されるべきタンパク質に対するコード配列の5'側、または上流に連結され得る。好ましいプロモーターはCMVプロモーターであり、その配列は周知であり、そしてCell，41:521-530(1995)において公開されている。下流転写ターミネーター、またはポリアデニル化配列はまた、タンパク質コード配列の3'側に付加され得る。好ましいポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンポリＡ領域であり、その配列は公知である。スプライスドナーおよびスプライスアクセプター（SD /SA）部位（例えば、SV40 SD/SA）はまた、所望であれば、内部リボソームエントリー部位（IRES）（例えば、脳心筋炎ウイルスからクローン化されたIRES）がそうであり得るように、構築物中に配置され得る。本発明者らが以下の実施例においてより詳細に記載するように、単一のプラスミド上の別々の転写単位からの２つのタンパク質コード配列の発現が、遺伝子のバイシストロン性発現が単一のプロモーターから駆動される場合に観察されるよりも有意に高いタンパク質レベルを生じることが決定された。従って、本発明の目的のためには、各々のコード領域が別々のプロモーターを有して提供されることが好ましい。遺伝子物質の導入本発明において、IL-12タンパク質サブユニットをコードする適切な遺伝子構築物は、感受性個体中に移入される。遺伝子処置は、個体において所望の免疫学的応答を達成するために、非侵襲的様式で、種々の感受性組織型に送達され得る。腫瘍をIL-12遺伝子構築物で処置する場合、好ましい標的細胞は、真皮のようなより深い皮膚層の細胞よりむしろ表皮細胞であることが、本明細書において開示される。表皮細胞はIL-12遺伝子構築物の好ましいレシピエントである。なぜなら、それらは身体の最も接近しやすい細胞であるからである。それゆえ、そのような遺伝子治療が必要な患者は、有利に非侵襲的に処置され得る。さらに、非常に予想外なことに、そして考えられ得ることに反して、IL-12遺伝子の表皮送達は、送達部位から遠く離れた腫瘍を首尾良く処置し、そしてさらに、全身的抗腫瘍免疫、免疫学的記憶、および細胞傷害性応答を生じる。それゆえ、表皮送達は、IL-12遺伝子の非侵襲的送達のために全く特に適切である。 IL-12遺伝子構築物処置が、皮膚への遺伝子銃に基づくIL-12遺伝子構築物送達の後に首尾良い抗腫瘍応答を誘起することに成功することが判明したので、粘膜性表面へのIL-12遺伝子構築物の非侵襲的送達が、同様に首尾良い処置応答を生じることもありそうである。裸のIL-12 DNAを含む水性液滴が、処置されることが求められる個体の組織に直接送達され得ることもまた、具体的に意図される。いくらかの頻度で、そのような「裸の」DNAは、処置される組織中に取り込まれる。非侵襲的送達のための好ましい移入手段は、加速粒子遺伝子移入装置であるが、構築物を適切な標的部位（表皮または粘膜性組織）中へ確実に移入し得る任意の手段が受容可能である。加速粒子遺伝子送達の技術は、細胞中に送達されるべき遺伝子構築物の、非常に小さなキャリア粒子（好ましくは、金粒子）上へのコーティングに基づき、この粒子は、このプロセスにより形質転換されることが求められる細胞と比較して小さいように設計される。金粒子は、ビーズまたは球体またはアモルファス金であり得る。全てが本発明における使用のために適切である。粒子に対する本明細書中の言及は、全てのそのような形態を含むことが意図される。アモルファス金（例えば、Englehard微晶質金）は、他の生物学的標的システムにおいて、他の型の金よりも標的細胞中へのより高い送達を達成することが実証されている。使用される粒子加速装置または適切な粒子の型にかかわらず、次いで、コートされたキャリア粒子は、形質転換されるべき細胞に向かって物理的に加速され、その結果、キャリア粒子は標的細胞の内部で止まる。この技術は、インビトロまたはインビボのいずれにおける細胞についても使用され得る。いくらかの頻度で、キャリア粒子上に以前にコートされたDNAは、標的細胞において発現される。この遺伝子発現技術は、原核生物および真核生物において（細菌および酵母から高等植物および動物まで）作用することが実証されている。従って、加速粒子法は、広範な組織型の細胞中に遺伝子を送達ための便利な方法を提供し、そしてそれらの遺伝子を、細胞に、インサイチュまたはインビボで、処置される個体に対するいかなる有害な衝撃も影響もなしに、送達する能力を提供する。加速粒子法はまた、遺伝子処置構築が、送達部位および粒子が加速される力をそれぞれ変動させることにより、特定の組織、および組織中の特定の細胞層の両方に指向されることをそれが可能にする点で、好ましい。加速粒子遺伝子トランスフェクション技術の一般的なアプローチは、Sanford に対する米国特許第4,945,050号に記載されている。そのアプローチの改善された変形に基づく機器は、BioRad Laboratoriesから市販されている。加速粒子トランスフェクション装置に対する代替のアプローチは、米国特許第5,015,580号に開示されている。これは、ダイズ植物のトランスフェクションに関するが、哺乳動物細胞およびインタクトな全体の哺乳動物についての使用のために等しく適応可能である機器を記載している。米国特許第5,149,655号は、便利な手持ち型の加速粒子遺伝子送達装置を記載している。その他のそのような装置は、原動力として、例えば、圧縮気体を使用する他の推進源に基づき得る。遺伝子銃送達は、所定の表皮部位におけるIL-12産生のレベルおよび形態の正確な制御を可能にする。なぜなら、細胞内DNA送達は、送達される粒子の数および粒子当たりのプラスミドのコピー数を体系的に変動させることにより制御され得るからである。サイトカイン産生のレベルおよび形態のこの正確な制御は、得られる応答の性質の制御を可能にし得る。本明細書中で用いられる用語トランスフェクトは、どのような送達技術が使用されても、送達された外来IL-12遺伝子構築を取り込んだ細胞をいう。用語形質転換よりもむしろ、用語トランスフェクトが使用されて、後者の用語（これは、腫瘍形成のプロセスにおける細胞性変化をいうためにも使用される）に固有の曖昧さを回避する。本発明は、以下の実施例を参照してより完全に理解される。実施例は、単に本発明の例示であることが意図される。実施例において、マウスが、IL-12発現構築物のためのモデルレシピエントとして使用された。マウスは、ヒト腫瘍への外挿のための標準的動物モデルであり、そして一般的なFDAの方針は、研究者に、臨床試験を行う前に、マウスモデルにおける提唱されたガン処置の効力を実証することを要求する。実施例マウスIL-12をコードするプラスミドの構築２つのマウスIL-12構築物を用いる。各々は、mIL-12のp35およびp40サブユニットの両方をコードする。これらのサブユニットを、マウス脾臓cDNAライブラリーからクローン化した。全てのプラスミドを、IL-12のサイトカイン遺伝子発現を増大する明確な目的のため、およびガン遺伝子治療プログラムにおいて直接的に意図される使用のために作製した。プラスミドpWR3169は、両方のmIL-12サブユニット遺伝子をコードするタンデムプラスミドである。プラスミドpWRG3169のマップを図１に提供し、そしてこのプラスミドの完全なヌクレオチド配列を配列番号１に示す。このプラスミドのp3 5およびp40産物を、それぞれ配列番号２および配列番号３として報告する。各々のサブユニットをコードする遺伝子は、別々のサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの転写制御下にある。SV40スプライシングドナー/スプライシングアクセプター（sa/sd）を、各サブユニットをコードするセグメントとそのCMVプロモーターとの間に提供する。各サブユニットをコードするセグメントのすぐ下流 (3')は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（bGH pA）である。各ユニット（プロモーター-sa/sd-コード領域-ポリＡシグナルユニット）は、このプラスミドから直列に（すなわち同じ方向に）転写される。pUC19プラスミドの骨格は、Stratagaene Cloning Systems，La Jolla，CAから市販されているアンピシリンプラスミドpWRG3196は、mIL-12の両方のサブユニットをコードするバイシストロン性プラスミドである。プラスミドpWRG3196のマップを図２に提供し、そしてこの完全な配列を配列番号４に示す。このプラスミドのp35およびp40産物を、それぞれ配列番号５および配列番号６として報告する。pUC19プラスミドの骨格は、アンピシリン耐性遺伝子を有するBluescript SK(+)ベクターに由来した。このベクターは、単一のサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、SV40スプライシングドナー/スプライシングアクセプター、およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む。p35およびp40の両方の遺伝子は、sd/sa部位から下流に、そしてSV40ポリA部位から上流に提供される。p35遺伝子は、p40遺伝子から上流である（すなわち、p40遺伝子よりもプロモーターに近い）。p35遺伝子とp4 0遺伝子との間は、脳心筋炎ウイルスからクローン化された内部リボゾームエントリー部位エレメント（IRES）である。IRESエレメントは、真核生物のリボソームによる開始または持続翻訳のための内部進入点として機能する非コード領域である。 pWRG3169およびpWRG3196の両方が、mIL-12の発現を指揮する。しかし、分子の観点からは、バイシストロン性IRESベクター（pWRG3196）は、単一のmRNAを産生し、一方、タンデムベクター（pWRG3169）は、p35およびp40に対する別々のmRNA を産生する。遺伝子発現研究において、本発明は、pWRG3169がインビボおよびインビトロの両方で、バイシストロン性pWRG3196の発現を少なくとも２倍誘導することを見出した。例えば、pWRG3169およびpWRG3196ベクターを、インビトロでB1 6腫瘍細胞内に、またはインビボでマウスの皮膚内に別々にトランスフェクトした場合、pWRG3169ベクターをトランスフェクトした場合の3〜8倍高いmIL-12タンパク質発現レベルを観察した。２つの別々のベクター（各々がmIL-12サブユニットタンパク質の１つをコードする）をトランスフェクトした場合、より低い発現レベルを観察した重要なことに、生物学的に活性なIL-12サイトカインを、B16マウスメラノーマ細胞に移入した後、および粒子加速装置を用いる皮膚照射（bombardment）の後に、局所的に検出した。1.25μｇのpWRG3169 DNAを、粒子加速によって1×10⁶B1 6細胞に送達した場合、49.8±10.2ng/mlを24時間後に検出した。24時間後に皮膚に、総量５μｇのpWRG3169 DNAを４回照射し、266±27.8pgのIL-12を、標準的な 1.5×1.5cm²の完全な厚さの皮膚のバイオプシーにおいて、0.172±0.026gmの組織あたりで検出した。IL-12のレベルを、Schoenhautら、J.Immunol ．148:3433(1 992)によって記載されたように、マウスCon-A-活性化脾細胞を使用して、細胞増殖アッセイを用いて検出した。ヒトp35およびヒトp40を含む類似の発現コンピテントベクター構築物が作製され得ることが意図され、その配列は、ガン遺伝子治療の臨床研究における使用のために本明細書中に提供される。さらに、有望なベクターは、イントロンＡを含み、そしておそらく、エプスタイン-バーウイルス由来のEBNA-1のようなエピソームエレメントを含む。マウスにおける腫瘍の移植腎臓細胞腺ガン（Renca）およびメチルコラントレン誘導性線維肉腫（MethA）腫瘍細胞株は、Balb/cマウスにおいて同系（syngeneic）である。L5178Yリンパ腫およびP815肥満細胞腫は、DBA/2マウスにおいて同系である。SA-1肉腫およびB 16メラノーマは、それぞれA/SnおよびC57B1/6において同系である。腫瘍細胞株を、確立された条件下でインビトロで維持した。腫瘍形成を誘導するために、適切なレシピエントマウスを、それらの腹腔領域において剪毛し、そして50μｌのPBS中の1×10⁶腫瘍細胞を（10⁵のB16細胞を送達した以外は）皮内に注射した。腫瘍増殖を、ノギスを用いて２つの腫瘍垂直直径を測定することによって週に２〜３回モニターした。腫瘍処置におけるmIL-12プラスミドの使用実験は、公開されたPCT出願番号PCT/US95/00780（公開番号WO 95/19799）に記載される型のヘリウムパルス粒子加速装置を利用した。プラスミドDNAを、PEG/CaCl₂またはスペルミジン/CaCl₂を用いて２ミクロン金粒子上に沈着させた。粒子を、0.1mg/mlポリビニルピロリドンの無水エタノール溶液に懸濁した。このDNA/金粒子調製物を、公開番号WO 95/19799に記載されるようにTefzel管の内部表面上に被覆した。次いで、この管を0.5インチの長さのカートリッジに切断し、単一のカートリッジでの照射あたりに0.5mg金および1.2 5μｇプラスミドDNAの送達を達成した。沈着DNAを被覆した粒子を、カートリッジからリフトし、そして300psiヘリウムパルスの力場の下でマウス表皮内に送達した。組織検査およびモノクローナル抗IL-12抗体を用いる標準的な免疫組織化学的分析は、この力場の下で、金粒子は、主として、マウス皮膚組織の上皮細胞層に浸透するが、下にある腫瘍細胞に浸透せず、そして同様に、このトランスジェニックmIL-12は、上皮細胞層でのみ発現した。各々のトランスフェクション時点で、個々のマウスにmIL-12DNA遺伝子構築物またはコントロールDNAでの４回の照射を与えた（pCMVLuc，Chengら、90Proc.Na tl.Acad.Sci.USA 4455(1993)）。１回の照射を腫瘍上に直接行い、そして３回のさらなる照射を３角形パターンで腫瘍の外周の周囲に等間隔で行った。マウスにおけるマウスRencaおよびMethA腫瘍の退行 Balb/cマウスに、1×10⁶のRencaまたはMethA腫瘍株細胞を上記に記載されるように播種した。播種の後の示した時間に、腫瘍注射部位に、３〜５日間に１日あたり１回、pWRG3196、pWRG3169またはコントロールプラスミドpCMVLucを照射した。これは、腫瘍増殖の７日目に開始した（最初の実験においては、腫瘍増殖の１、４、または７日目に照射を開始した）。４つの予備的実験の結果を表１に示す。最初の実験において、７匹の内の３匹 (42％)、６匹の内の３匹(50％)、および７匹の内の５匹(71％)のマウスを、それぞれ、１〜５、４〜８、および７〜11日目に処置し、それらは腫瘍を完全に拒絶した。一方、全てのコントロール（未処置）マウスは、18日目までに進行性の腫瘍増殖の犠牲になった。IL-12遺伝子-処置マウスおよびコントロールマウスにおける腫瘍増殖パターンを図３に示す。退行が、処置を終結した後の数日目に開始したことが観察され得る。これは、抗腫瘍効果が免疫学的媒介であることを示唆する。さらに、これおよび他の実験において、mIL-12コードプラスミドでのインサイチュ照射が、確立された（直径５〜10mm）固形マウス腫瘍の退行を引き起こしたことに留意することは重要である。第２の実験において、mIL-12処置は、全てのマウスにおいて腫瘍の迅速な退行を引き起こした。しかし、強い皮膚照射のために、コントロール遺伝子でトランスフェクトしたマウスの28％もまた、それらの腫瘍を拒絶した。この非特異的かつ抗腫瘍性の効果を除去するために、処置の持続時間を、一日おきに３回の照射に減らした。実際に、第３の実験において、コントロール遺伝子で照射された全ての腫瘍は、進行的に増殖し、一方、mIL-12遺伝子構築物を照射したマウスの62％は、それらの腫瘍を拒絶した。実験４において、MethA肉腫がRenca腫瘍のかわりに使用され、そしてIL-12遺伝子処置に対して類似の高感受性を示した。表１ IL-12遺伝子治療の後の皮内マウス腫瘍の拒絶ａ−pWRG3196（IRES）；ｂ−pWRG3169（タンデム）腫瘍退行のさらなる実証本発明者らはまた、下記のように、他のマウス腫瘍を用いて本発明のIL-12処置法を使用した。全てのケースにおいて、腫瘍増殖の減少を、mIL-12遣伝子トランスフェクションの後に観察した。所定のマウス免疫学的腫瘍が、規定された腫瘍モデルにおいて、腫瘍増殖の７〜９日目に最も良好に検出されるＴ細胞媒介免疫応答を誘導し得ることが知られている（17）。それゆえ、mIL-12 cDNA処置を、腫瘍細胞の移植後７日目に開始し、すでに活性化された内因性の抗腫瘍免疫応答を増強した。この実験ストラテジーを用いて、確立された７日目の腫瘍の上にある皮膚組織内へのキメラIL-12 遺伝子のインビボ送達は、４つの腫瘍モデルにおいて完全な腫瘍の退行または腫瘍増殖の抑制を生じる。Renca、L5178Y、MethAまたはSa-1腫瘍を有する適切なマウスにおいて、完全な腫瘍退行を、それぞれ、87.5％(7/8)、87.5％(7/8)、57％ (4/7)および37.5(3/8)の試験マウスで達成した。ほぼ同一の結果を、７日目に単一のIL-12cDNA処置の後にRenca腫瘍で達成した。これらの４つの腫瘍モデルの腫瘍増殖におけるmIL-12遺伝子治療の効果を図４に示す。さらに、P815肥満細胞腫またはB16メラノーマを有するマウスにおいて、腫瘍増殖の有意な抑制を達成した（図４）。例えば、同一の発現プラスミド(p<0.001 )におけるpCMVLucコントロール遺伝子に関する12.28±0.46mmとは対照的に、P81 5腫瘍細胞移植の後の13日目に、pWRG3169で処置したマウスにおける平均腫瘍直径は、8.89±0.27mmであった。同様に、B16腫瘍細胞移植の15日後に、pWRG3169 で処置したマウスにおける腫瘍直径は、pCMVLucコントロール遺伝子プラスミド( p<0.001)に関する11.8±0.31mmとは対照的に、6.30±0.045mmであった。これらの２つの弱い免疫学的腫瘍系について、改変遺伝子転移のレジメまたはスケジュールが治療を改善し、そして腫瘍退行を生じるか、そしてこれが有望な研究において系統的な評価を明白に約束するかどうかは不明である。 mIL-12遺伝子治療実験を、Renca腫瘍系で５回、MethAおよびP815腫瘍で４回、 B16腫瘍で３回、そしてL5178Y腫瘍モデルで１回繰り返し、そして同様の結果を得た。各処置で、マウスに、IL-12 DNA（円）またはpCMVLuc DNA（四角）で４回のトランスフェクションを与えた。図4A〜4Fの矢印は、処置を行った腫瘍移植後の日を示す。各群は、群あたり12匹のマウスを含んでいたB16腫瘍モデル以外は、７〜８匹のマウスを含んでいた。全ての試験したマウス腫瘍モデルに関して、腫瘍は治療の開始時にすでに十分に確立されており、そしてこれが直径５〜８mmに達していたことに留意することが重要である。本発明者らの知見によると、これは、IL-12遺伝子治療が大きな確立された腫瘍の完全な退行を引き起こし得ることの最初の証拠である。以前の研究は、レトロウイルスベクターを用いるIL-12遺伝子治療が腫瘍発達の予防をもたらすか、または処置マウスの33％における小さな３日齢MCA207肉腫の退行をもたらすことを示している。１〜４日のみの治療（治療の各々の日に腫瘍部位あたり４回の照射を用いる）が、本発明者らの実験の事実上全てにおいて、腫瘍退行または増殖抑制を生じたことはまた注目すべきである。組換えタンパク質治療を用いる以前の研究において、腫瘍退行には、１週間の 0.1〜10μｇの用量でのIL-12の日周注射、または４週間の週あたり５日の注射が必要とされた。他のサイトカイン遺伝子を用いる本発明者らの以前の知見と組み合わせて、図１、２に示される結果は、腫瘍の近傍の正常な内皮細胞によるトランスジェニックIL-12産生が、IL-12遺伝子治療の抗腫瘍効果を担い得ることを示唆する。IL-12 誘導性腫瘍退行はCD8⁺細胞を含む観察された腫瘍退行はCD8⁺細胞の存在に依存する。CD4⁺Ｔ細胞の枯渇ではなく、CD8⁺Ｔ細胞のインビボでの枯渇が、mIL-12遺伝子治療の効果を抑止する。このことを実証するために、Balb/cマウスに、1×10⁶ Renca細胞を皮内に注射した。皮膚を、腫瘍移植後の７、９および11日目にIL-12またはpCMVLuc cDNA発現ベクターでトランスフェクトした。抗CD4mAb（クローンGK1.5）または抗CD8mAb（クローン2.43）（両方ともTrudeau Institute，Saranac Lake，NYから得た）を腫瘍移植の後の８日目（300μｇ/マウス）および12日目（150μ/マウス）に腹腔内に投与した。コントロール群は、IL-12遺伝子で処置し、そして抗CD8およびCD4m Abと同じ用量ならびにスケジュールでラットIgG（Sigma）を与えたマウス、またはIL-12遺伝子のかわりにpCMVLuc遺伝子で処置したマウスを含んでいた。この研究で用いた抗CD4および抗CD8mAbは、単回注射の後の４〜５日の間に、マウスにおいて90％以上の関連Ｔ細胞サブセットの枯渇を引き起こした。CD8⁺Ｔ細胞を除去した場合、群あたり８匹のマウスに関する腫瘍質量は増大し続けたが、CD4⁺Ｔ細胞を除去した場合またはラットIgGを注射した場合には、腫瘍退行または除去が観察された。これらのデータは、組換えIL-12によって引き起こされる腫瘍退行が、CD4⁺Ｔ細胞ではなく、CD8⁺Ｔ細胞によって媒介されるという、Brundaら、 J.Exp.Med．178(4):123-30(1993)の知見と一致する。実際、抗CD4モノクローナル抗体（mAb）でのCD4⁺Ｔ細胞の枯渇は、わずかに促進された腫瘍退行を生じるようであり、これは、CD4⁺Ｔ細胞がこの腫瘍モデルにおいてIL-12の抗腫瘍効果を抑制し得ることを意味する。実際に、確立された腫瘍が、Th2様CD4⁺Ｔサプレッサー細胞を誘導することが示され、これは、CD8⁺Ｔ細胞媒介免疫応答を阻害し得る。組換えIL-2タンパク質またはIL-12遺伝子での腫瘍免疫治療のための抗CD4mAb処置の有益な効果は、以前に報告されている。支持データは、IL-12タンパク質がインビトロで腫瘍特異的CD8⁺Ｔ細胞を活性化し、そしてインビボでTh 2 CD4⁺Ｔ細胞における抗抑制効果を媒介し得ることを示す。腫瘍部位へのIL-12遺伝子の遺伝子銃送達は、遠位腫瘍の増殖の減少を生じる、全身性の抗腫瘍効果を引き起こす局所的なIL-12遺伝子治療によって引き起こされる腫瘍退行がCD8⁺Ｔ細胞を必要とするという観察は、局所的なIL-12遺伝子送達が全身性抗腫瘍効果を生じ得ることを示唆する。この仮説を、P815腫瘍系を用いて試験した。この系において、腫瘍細胞は、皮内移植の数日後に内臓器官に転移し、それによって原発腫瘍が外科的に除去された場合にもマウスの死を引き起こす。 DBA/2マウスに、1×10⁶のP815細胞を皮内に注射した。標的腫瘍を覆う皮膚組織および標的腫瘍を取り囲む皮膚組織を、腫瘍細胞移植の12および14日目に粒子加速によって送達されるpWRG3169（８マウス/群）、またはpCMVLuc（５マウス/ 群）によって処理した。腫瘍サイズが直径約13mmになった場合には、腫瘍の外科的切除を15日目に行った。腹部の両端の皮膚へのコントロールおよび試験構築物のさらなるトランスフェクションを、移植後16、18および20日目に行った。 pCMVLucで処置した全てのマウスが、腫瘍細胞移植の28.0±0.6日目に死亡した。巨視的検査は、死亡が内部器官（主に肝臓）への腫瘍細胞の自然発症的な転移によって引き起こされたことを明らかにした。mIL-12遺伝子治療は、マウスの生存度を効果的に延長し（生存時間41.4±4.9日、p＜0.05）、そして８匹のマウスの内の１匹が「治癒」した。本実験は、腫瘍切除後のさらなるトランスフェクションを行うことなく、繰り返し、そしてLuc cDNA処置マウスの全て（n＝11）が、43.9±7.1日目に死亡し、一方、IL-12遺伝子治療処置マウスの12匹の内の５匹（41.6％）が少なくとも180 日間生存し、従って「治癒」したと考えられた。これらの結果は、原発腫瘍の上にあり、そしてそれを取り囲む皮膚組織へのIL-12遺伝子の局所送達が全身性の抗腫瘍免疫応答を増強し、そして確立された自然発症的な転移の根絶を導き得ることを示唆する。 Balb/cマウスに、10⁶のRenca細胞を腹部の左右両端に皮内で注射した。右側の腫瘍に、pWRG3169またはpCMVLucのいずれかを腫瘍増殖の５、７、および９日目に照射した。IL-12遺伝子治療は、コントロールマウスにおける未処置腫瘍の増殖と比較して、未処置（左）腫瘍において有意な増殖減少を生じた（22日目の腫瘍直径；それぞれ、9.58±1.82および13.18±2.03；n＝８マウス/セット、p＜0. 005）。類似の実験を行った。ここで、腹部の右側のL5178Y腫瘍にpWRG3169またはpCMVLucのいずれかを腫瘍増殖の３および６日目に照射した。この実験設定において、IL-12遺伝子治療は、全てのマウス（n＝８）において処置（右）ならびに未処置（左）の完全な腫瘍退行を生じた。さらなる実験は、腫瘍の近傍から離れた皮膚のIL-12遺伝子照射が、腫瘍増殖に影響を及ぼさないことを示した。これらの結果は、IL-12遺伝子治療の間の腫瘍部位での免疫細胞の局所活性化が、全身性抗腫瘍免疫を産生することを示唆する。IL-12 遺伝子治療後に腫瘍を拒絶したマウスは腫瘍特異的免疫学的記憶を発生するＡ．IL-12遺伝子治療後の二次腫瘍チャレンジの拒絶． IL-12遺伝子治療の後にRencaまたはMethA腫瘍を拒絶したBalb/cマウスに、１ヶ月後に、1×10⁶のRenc a細胞およびMethA細胞をそれぞれ腹部の右側および左側に注射した。コントロールとして、腫瘍細胞を、年齢が一致した未処置のBalb/cマウス（群あたり５〜８匹のマウス）に注射した。 IL-12遺伝子治療の後に皮内Renca（群Ａ）もしくはMethA腫瘍（群Ｂ）を拒絶したマウス、またはコントロール未処置マウスに、腹部の右側にRenca細胞を、腹部の左側にMethA細胞を注射した。全てのコントロールマウスは、両方の腫瘍を発達させたが、群ＡのマウスはRenca腫瘍ではなくMethA腫瘍を発達させ、逆もまた同様に、すなわち、群Ｂのマウスは、MethA腫瘍ではなくRenca腫瘍を発達させた。Ｂ．IL-12遺伝子治療後に腫瘍を拒絶したマウスにおけるCTL活性の誘導．腫瘍特異的CTLをRakhmilevichら、Int.J.Cancer ，55:338(1993)に記載されるようにインビトロで産生した。IL-12遺伝子治療に起因してRenca腫瘍を拒絶し、そして２ヶ月間腫瘍を有さないままであったBalb/cマウス、または年齢が一致した未処置マウスに由来する、脾臓細胞（5×10⁶）を、24ウェル培養プレートにおいて完全RPMI-1640培地中で5×10⁴のマイトマイシン-C処置Renca細胞とともに同時培養した。５日間のインビトロでの培養の後、段階的な数の生存エフェクター細胞および⁵¹Cr-標識Renca細胞（10⁴）を、丸底96ウェルプレートのウェルにプレートした。37℃で４時間インキュベートした後に、上清の放射活性を測定した。群あたり４匹のマウスの平均±SEM。IL-12遺伝子処置マウス由来の脾臓細胞は、未処置マウス由来の脾臓細胞よりも３〜４倍高いレベルのCTL活性を産生した（p＜ 0.005）。これらの結果は、IL-12遺伝子治療が全身性の抗腫瘍免疫を産生することを示す。 L5178Y腫瘍を以前に拒絶したマウス由来の脾臓細胞を用いる同様の研究において、産生されたCTLは、L5178Y細胞を溶解し得たが、全身性P815細胞を溶解し得なかった。全体で、結果は、粒子媒介遺伝子導入装置でのIL-12遺伝子治療が種々のマウス腫瘍に対して効果的であり、そして免疫原性のヒト腫瘍の処置として適用され得ることを示す。さらに、この知見は、IL-12 DNAは皮膚に送達されるが、インビボ照射の後の腫瘍組織には送達されないことを示す。それゆえ、粒子媒介IL-1 2遺伝子治療は、いかなる外科的操作をともなうことなく、皮下の腫瘍または転移性小結節にルーチン的に適用され得る。さらに、本発明者らは、腫瘍照射部位で約250pgのIL-12を見出した。これは、組換えIL-12の「治療用量」(0.1〜10μｇ)の1/400〜1/40,000である。さらに、I L-12のこの治療用量はまた、容認し得ない毒性レベルを引き起こすことが知られている。それゆえ、組換えIL-12での処置と比較して、本発明のIL-12遺伝子治療は、（あるとしても）大いに低い毒性であり、そして大いに廉価である。従って、これは、循環レベルのサイトカインIL-12が、大量のIL-12自身を腫瘍の処置を必要とする患者に送達するのではなく、むしろその患者に、処置される個体の細胞におけるIL-12の発現を引き起こす遺伝子配列を送達することによってインビボで作製され得ることを示している。本発明の遺伝子治療法は、個体に IL-12タンパク質を送達することなく、処置される個体に抗腫瘍応答の作製を可能にする。

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物における腫瘍の処置方法であって、該方法が：（ａ）該哺乳動物の表皮細胞中で作動するプロモーター、サイトカインIL-12 のp35サブユニットをコードするDNA配列、およびサイトカインIL-12のp40サブユニットをコードするDNA配列を含む発現可能な外来の遺伝子構築物のコピーを調製する工程；および（ｂ）該外来の遺伝子構築物のコピーをインビボで該哺乳動物の標的細胞に送達する工程、を包含する、方法。２．前記送達工程が：前記哺乳動物の細胞のサイズに比較して小さいサイズのキャリア粒子上に前記外来の遺伝子構築物のコピーをコーティングする工程：および該コーティングしたキャリア粒子をインビボで哺乳動物の標的細胞中へ加速する工程、を包含する、請求項１に記載の方法。３．前記キャリア粒子が、前記哺乳動物に向かう気体状の放出によって加速される、請求項１に記載の方法。４．前記p35サブユニットをコードするDNA配列が配列番号２をコードし、そして前記p40サブユニットをコードするDNA配列が配列番号３をコードする、請求項１に記載の方法。５．前記p35サブユニットをコードするDNA配列が配列番号１の塩基953〜1258および1332〜1673であり、そして前記p40サブユニットをコードするDNA配列が配列番号１の塩基2377〜3381である、請求項１に記載の方法。６．前記p35サブユニットをコードするDNA配列が、IL-12 p35サブユニットをコードするように配列番号１の塩基953〜1258および1332〜1673に十分に相同であり、そして前記p40サブユニットをコードするDNA配列が、IL-12 p40サブユニットをコードするように配列番号１の塩基2377〜3381に十分に相同である、請求項１に記載の方法。７．前記遺伝子構築物がpWRG3169である、請求項６に記載の方法。８．前記遺伝子構築物がpWRG3196である、請求項６に記載の方法。