CZ2003214A3 - Zesílení odpovědi mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících uptake imunocytokinu - Google Patents

Zesílení odpovědi mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících uptake imunocytokinu Download PDF

Info

Publication number
CZ2003214A3
CZ2003214A3 CZ2003214A CZ2003214A CZ2003214A3 CZ 2003214 A3 CZ2003214 A3 CZ 2003214A3 CZ 2003214 A CZ2003214 A CZ 2003214A CZ 2003214 A CZ2003214 A CZ 2003214A CZ 2003214 A3 CZ2003214 A3 CZ 2003214A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
immunocytokine
domain
tumor
antibody
cytokine
Prior art date
Application number
CZ2003214A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen D. Gillies
Yan Lan
Sylvia A. Holden
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of CZ2003214A3 publication Critical patent/CZ2003214A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/282—Platinum compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

Zesíleni odpovědí mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících 1' uptake imunocytokinu z Oblast techniky
Vynález se týká fúzních proteinů protilátka-cytokin použitelných pro cílenou imunitní terapii. Obecně se vynález týká použití činidel zvyšujících uptake imunocytokinů při kombinované léčbě pro zvýšení imunitní odezvy mediované fúzním proteinem protilátka-cytokin proti předem zvolenému cíli, například proti nádorovým buňkám. Vynález se zejména týká podání fúzních proteinů protilátka-cytokin v kombinaci s chemoterapeutickými činidly, jakými jsou například taxany a/nebo alkylační činidla, při léčbě nádorových buněk a dalších rakovinových nebo chorobných buněk.
Dosavadní stav techniky
Účinná léčba chorob, jakou je například rakovina, vyžaduje silné imunitní odpovědi jednoho nebo několika typů efektorových buněk, jakými jsou například přirozené „zabijete nebo-li NK buňky, makrofágy a T lymfocyty. U živočichů a pacientů trpících nádory se imunitní systém nedokáže účinně vypořádat s rostoucím nádorem, zejména z toho důvodu, že specifické mechanismy působí tak, že nádor potlačuje imunitní odpověď. V mnoha případech migrují monocytické buňky potenciálně destruující nádor, např. makrofágy, do ložisek rostoucích nádorů, ale sekrece faktorů, jakými jsou například prostaglandiny, TGF-β a
01-3623-02-Ma
IL-10, nádorovými buňkami moduluje jejich cytotoxickou aktivitu (viz například Sharma a kol., 1999, J. IMMUNOL. 163: str. 5020 až 5028). Podobně mohou být faktory, které » jsou sekretovány nádory, a stejně tak interakcemi s receptory, které se exprimují na povrchu nádorových buněk a ” které aktivují apoptózu imunitních buněk, potlačeny lymfocytické buňky migrující do nádorů, jako například NK a T buňky, (viz například Villunger a kol; 1997, BLOOD 90: str. 12 až 20) . Vystavení těchto lymfocytů působení imunosupresivních monocytických buněk v ložisku nádoru může dále snižovat jejich schopnost vytvořit účinnou protinádorovou odpověď.
Snahy překonat imunitně supresivní účinky místního mikroprostředí nádoru zahrnují cílenou imunitní stimulaci, například léčbu nádorově specifickými fúzními proteiny protilátka-cytokin. Účinnost tohoto přístupu byla demonstrována na několika myších modelech nádorových metastáz, nicméně léčba je mnohem méně účinná, jakmile se nádor zvětší. Tato snížená účinnost je pravděpodobně způsobena zvýšenou hladinou supresivních faktorů sekretovaných nádorovou hmotou, a stejně tak celou řadou * dalších faktorů, jakými jsou například zvýšení tlaku v nádorové intersticiální tekutině (Griffon-Etienne a kol., 1999, CANCER RES. 59: str. 3776 až 3782) a neschopnost terapeutických činidel pronikat pevnými nádory.
Přestože se k léčbě většiny pacientů trpících rakovinou stále používá jeden nebo několik cyklů chemoterapie, je známo, že cytotoxická léčba rakoviny současně poškozuje imunitní systém. Imunitní buňky patří mezi nejrychleji se dělící buňky v lidském těle a jakákoliv léčba, která hubí dělící se buňky, bude hubit i imunitní buňky. Všechny léčby, které zahrnují ozařování,
01-3623-02-Ma
DNA-poškozující chemikálie, inhibitory DNA syntézy a inhibitory submikroskopické funkce tedy současně poškozuji imunitní systém. Transplantáty kostní dřeně jsou nutným doplňkem protirakovinové terapie, která, společně s nádorovými buňkami, poškozuje i imunitní systém, jenž je třeba obnovit. Jako imunosupresivní látka se často používá methotrexat a další protirakovinové účinné složky. Rovněž je prokázáno, že protirakovinová léčba může specificky inhibovat funkci T buněk. Například u pacientů s Hodgkinovou chorobou, kteří byli léčeni ozařováním celého těla, vznikla zřejmě trvalá ztráta naivních T buněk (Watanabe a kol., 1997, Blood 90: str. 3662).
S přihlédnutím k současným znalostem se zdá být nepravděpodobné, že by byly standardní léčebné postupy (chemoterapie a ozařování) a lokální imunitní stimulace použitelnou kombinací pro účinnou léčbu rakoviny. Tato oblast si tedy žádá navržení způsobů, které zesílí imunitní odpovědi mediované fúzním proteinem protilátka-cytokin proti předem zvoleným buněčným typům, například proti nádorovým buňkám. Žádané jsou rovněž kompozice využitelné v rámci těchto způsobů.
Podstata vynálezu
Zjistilo se, že pokud se podá savci postiženému nádorem nebo nádorovou metastázou fúzní protein protilátka-cytokin (imunocytokin), potom je možné vytvořit účinnější protinádorovou odpověď, pokud se podá před léčbou, současně s léčbou nebo po léčbě savce činidlem posilujícím uptake imunocytokinu, který zvyšuje nebo zesiluje terapeutický účinek fúzního proteinu protilátka-cytokin zesílením nebo
01-3623-02-Ma zvýšením jeho absorpce nádorem. Ukázalo se, že použitelná činidla zvyšující uptake imunocytokinů obsahují alkylační chemoterapeutická činidla a taxany, jakým je například paclitaxel. Zejména se zjistilo, že takové kombinace jsou použitelné při zprostředkování imunitní destrukce předem zvoleného buněčného typu, například nádorových buněk nebo virem infikovaných buněk.
V jedné kategorii vynález poskytuje způsob indukce cytocidní imunitní odpovědi proti předem zvolenému buněčnému typu u savce. Tento způsob zahrnuje podání (i) imunocytokinu obsahujícího vazebné místo protilátky, které je schopno navázat předem zvolený buněčný typ, a cytokin, který je schopen indukovat imunitní odpověď proti takovému předem zvolenému buněčnému typu, a (ii) činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu v množství dostatečném pro zesílení imunitní odpovědi, v porovnání s imunitní odpovědí získanou při stimulaci samotným imunocytokinem, savci.
U výhodného provedení může být předem zvoleným buněčným typem rakovinová buňka, přítomná například v pevném nádoru, výhodně ve větším pevném nádoru (tj. větším než přibližně 100 mm3) . Alternativně může být předem zvoleným buněčným typem rakovinová buňka malých metastáz.
U dalšího výhodného provedení lze činidlo zvyšující uptake imunocytokinu podávat současně s imunocytokinem. Alternativně lze činidlo zvyšující uptake imunocytokinu podávat před podáním imunocytokinu. Do rozsahu vynálezu patří i způsob, kdy lze imunocytokin podávat společně s množinou různých činidel zvyšujících uptake imunocytokinů. Alternativně lze činidlo zvyšující uptake imunocytokinu podávat společně s množinou různých imunocytokinů.
01-3623-02-Ma
V další kategorii vynález poskytuje kompozici pro indukci cytocidni imunitní odpovědi proti předem zvolenému buněčnému typu u savce. Tato kompozice obsahuje v kombinaci: (i) imunocytokin obsahující vazebné místo protilátky, které je schopno navázat předem zvolený buněčný typ, a cytokin, který je schopen indukovat takovou imunitní odpověď proti předem zvolenému buněčnému typu u savce, a (ii) činidlo zvyšující uptake imunocytokinu v množství dostatečném pro zesílení cytocidni odpovědi indukované kombinací imunocytokinu, v porovnání s cytocidni odpovědí získanou při stimulaci samotným imunocytokinem.
U výhodného provedení vazebné místo protilátky v imunocytokinu výhodně zahrnuje těžký řetězec imunoglobulinu nebo jeho fragment vážící antigen. Těžký řetězec imunoglobulinu výhodně zahrnuje, ve směru N-konec -> C-konec, imunoglobulinovou doménu proměnné oblasti (VH) , která je schopna navázat předem zvolený antigen, imunoglobulinovou konstantní těžkou 1 (CH1) doménu, imunoglobulinovou konstantní těžkou 2 (CH2) doménu, a případně může dále zahrnovat imunoglobulinovou konstantní těžkou 3 (CH3) doménu. U výhodnějšího provedení je imunocytokinem fúzní protein obsahující imunoglobulinový těžký řetězec nebo jeho fragment vážící antigen navázaný přes polypeptidovou vazbu na cytokin. Výhodný fúzní protein protilátka-cytokin tedy obsahuje ve směru N-konec C-konec (i) vazebné místo protilátky, které obsahuje imunoglobulinovou proměnnou oblast schopnou vázat antigen buněčného povrchu předem zvoleného buněčného typu, imunoglobulinovou CH1 doménu, imunoglobulinovou CH2 doménu (případně CH3 doménu), a (ii) cytokin. Způsoby výroby a použití takových fúzních proteinů podrobně popisuje Gillies a kol., (1992) Proc. Natl. Acad.
01-3623-02-Ma
Sci. USA 89: str. 1428 až 1432; Gillies a kol., (1998) J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203; a patent US 5 650 150.
Imunoglobulinovými doménami konstantní oblasti (tj. CHI, CH2 a/nebo CH3 doménami) mohou být domény konstantní oblasti zpravidla spojované s doménou proměnné oblasti v přirozeně se vyskytující protilátce. Alternativně lze jednu nebo několik imunoglobulinových domén konstantních oblastí odvodit z protilátek jiných, než je protilátka použitá jako zdroj domény proměnné oblasti. Jinými slovy, imunoglobulínovou doménu proměnné oblasti a konstantní oblasti lze odvodit z různých protilátek, například z protilátek odvozených z různých zdrojů. Viz například patent US 4 816 567. Imunoglobulinové proměnné oblasti mohou dále obsahovat sekvence úseků základní struktury (FR) odvozené z jednoho druhu, například lidské, a komplementaritu určující regionální (CDR) sekvence vložené mezi sekvence FR odvozené z druhého „odlišného druhu, například z myší. Způsoby výroby a použití takových chimérických imuno-globulinových proměnných oblastí jsou popsány například v patentech US 5 225 539 a US 5 585 089.
Imunocytokiny na bázi protilátky dále výhodně obsahují imunoglobulinový lehký řetězec, který je výhodně kovalentně navázán na imunoglobulinový těžký řetězec, například pomocí disulfidové vazby. Proměnné oblasti navázaných imunoglobulinových těžkých a lehkých řetězců společně definují jediné a kompletní vazebné místo pro navázání předem zvoleného antigenu. U dalších provedení imunocytokiny obsahují dva chimérické řetězce, přičemž každý obsahuje alespoň část imunoglobulinového těžkého řetězce navázaného na cytokin. Tyto dva chimérické řetězce jsou výhodně vzájemně kovalentně navázány, například pomocí jedné nebo několika meziřetězcových disulfidových vazeb.
01-3623-02-Ma
Vynález tedy poskytuje fúzní proteiny, ve kterých je specifičnost pro navázáni antigenu a aktivita protilátky zkombinována s účinnou biologickou aktivitou cytokinu. Fúzní protein podle vynálezu lze použit pro selektivní dopravu cytokinu k cílové buňce in vivo tak, aby cytokin mohl vyvinout lokalizovaný biologický účinek v bezprostředním okolí cílové buňky. U výhodného provedení je protilátka, jako jedna ze složek fúzního proteinu, specificky navázána na antigen na rakovinové buňce nebo uvnitř rakovinové buňky, a v důsledku toho vykazuje fúzní protein lokalizovanou protirakovinovou aktivitu. U alternativního výhodného provedení je protilátka jako jedna ze složek fúzního proteinu specificky navázána na virem infikovanou buňku, například na HIV infikovanou buňku, a v důsledku toho fúzní protein vykazuje lokalizovanou antivirovou aktivitu.
Cytokiny, které lze zabudovat do imunocytokinů podle vynálezu, zahrnují například nádor nekrotizující faktory, interleukiny, kolonie stimulující faktory a lymfokiny, a stejně tak další, v daném oboru známé cytokiny. Výhodné nádor nekrotizující faktory zahrnují například tkáně nekrotizující faktor a (TNFa). Výhodné interleukiny zahrnují například interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5), interleukin-7 (IL-7), interleukin-12 (IL-12), interleukin-15 (IL-15) a interleukin-18 (IL-18). Výhodné kolonie stimulující faktory zahrnují například faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů (GM-CSF) a faktor stimulující kolonie makrofágů (M-CSF). Výhodné lymfokiny zahrnují například lymfotoxin (LT). Další použitelné cytokiny zahrnují interferony včetně IFN-a, IFN-β a IFN-γ, které mají imunologické účinky, a stejně tak
01-3623-02-Ma antiangiogenní účinky, které jsou nezávislé na jejich antivirových aktivitách.
U několika typů chemoterapeutických činidel se prokázalo, že jsou účinnými činidly zvyšujícími uptake imunocytokinů. Použitelná činidla zvyšující uptake imunocytokinů zahrnují zejména taxany a alkylační chemoterapeutická činidla. V dané oblasti je známo několik taxanů (viz Bissery a Lavelle, 1997, v Cancer Therapeutics: Experimental and Clinical Agents, kapitola 8, vydavatel B. Teicher). U výhodného provedení je taxanem Taxol, který je rovněž znám jako paclitaxel. Další provedení zahrnují semisyntetický taxan, docetaxel, který je u některých nádorových modelů a klinických indikací účinnější než paclitaxel. Další provedení zahrnují další deriváty taxanu, například deriváty odvozené z přírodního výchozího materiálu, kterým je 10-deacetyl Baccatin III a který je extrahován z jehličí tisu evropského. Příkladem takového derivátu je orálně dostupná sloučenina, IDN5109, která je rovněž slabým substrátem pro P-glykoprotein a zpravidla je účinnější proti „multidrogově rezistentním nádorům (nádorům rezistentním proti více účinným látkám). Kromě toho, že je orálně biologicky dostupná, má rovněž vyšší tolerovanou dávku a vykazuje méně neurotoxických vedlejších účinků (Polizzi a kol., 1999, Cancer Res. 59: str. 1036 až 1040) .
Vynález rovněž poskytuje výhodné dávky a režimy pro podávání imunocytokinů v kombinaci s činidly zvyšujícími uptake imunocytokinů.
01-3623-02-Ma
Stručný popis obrázků
Obr. 1 je schématickou reprezentaci cytokinu.
Obr. 2 znázorňuje vliv paclitaxelu a imunocytokinu na objem nádoru LLC/KSA v závislosti na čase.
Obr. 3 znázorňuje vliv množiny dávek paclitaxelu a imunocytokinu na nádor středního objemu v závislosti na čase.
Obr. 4 znázorňuje vliv paclitaxelu a imunocytokinu na hmotnost nádoru v testu plicní metastázy.
Obr. 5 znázorňuje vliv paclitaxelu a imunocytokinu na objem CT26/KSA nádoru v závislosti na čase.
Obr. 6 znázorňuje vliv paclitaxelu a imunocytokinu na hmotnost nádoru v testu metastaz střev.
Obr. 7A a 7B znázorňují vliv paclitaxelu na uptake imunocytokinu nádorem.
Obr. 8 znázorňuje vliv cyklofosfamidu na uptake imunocytokinu nádorem.
Obr. 9 znázorňuje vliv cyklofosfamidu a imunocytokinu na hmotnost nádoru při testu metastáz plic.
Obr. 9B znázorňuje vliv cyklofosfamidu a imunocytokinu na objem nádoru v testu růstu nádoru.
Obr. 90 znázorňuje vliv cyklofosfamidu a imunocytokinu na objem nádoru v testu růstu nádoru.
Obr. 10 znázorňuje vliv karboplatiny a imunocytokinu na objem nádoru v testu růstu nádoru.
01-3623-02-Ma
1θ“* ’
Studie ukázaly, že velké pevné nádory mnohem více odolávají terapeutické intervenci mediované protilátkou a imunitním terapiím obecně, než roztroušená metastatická centra (Sulitzeanu a kol., (1993) Adv. Cancer Res. 60: str. 247 až 267). Předpokládá se, že podstatou nižší citlivosti pro terapie na bázi protilátky jsou částečně imunosupresivní faktory produkované nádory.
Ačkoliv není mechanismus zneškodnění nádoru zcela pochopen,. předpokládá se, že cytotoxické odpovědi T lymfocytu (CTL) mohou vést k destrukci rakovinové buňky a poskytnout imunitní paměť. Dále se předpokládá, že za určitých okolností jsou přirozené (killer cells) NK buňky odpovědné za zneškodnění nádoru při absenci CTL. Rozdílné imunitní odpovědi mohou být způsobeny faktem, že určité nádory produkují různé typy nebo různá množství látek schopných omezovat T buňky. Spíše než v případě mikrometastatických center to platí v případě pevných nádorů, které dosáhly kritické hmotnosti a jsou schopny produkovat a vylučovat imunosupresivní faktory v hladinách dostatečných pro modulaci imunitní odpovědi proti nádorům.
Zjistilo se, že cytocidní imunitní odpovědi iniciované imunocytokinem proti předem zvolenému buněčnému typu lze významně zesílit podáním imunocytokinu společně s činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu. Kombinovaná terapie je účinná, zejména při mediaci imunitní destrukce nemocné tkáně, jakou je například založený nádor. Bez snahy vázat se na určitou konkrétní teorii se dá předpokládat, že činidlo zvyšující uptake imunocytokinu zlepšuje průnik imunocytokinu do mikroprostředí nádoru, a tak mu umožňuje překonat imunitní supresivní účinek a zefektivnit aktivaci buněčných imunitních odpovědí proti nádoru. Podobně se předpokládá, že tato metoda může být použitelná při léčbě
01-3623-02-Ma určitých virových onemocněni, kdy podobný imunitu potlačující mechanismus brání účinné buněčné imunitě, například při HIV infekci. Předpokládá se, že činidlo zvyšující uptake imunocytokinu působí synergicky s imunocytokinem při mediaci imunitní destrukce nemocné tkáně, jakou je například založený nádor nebo virově infikovaná buňka. Vynález rovněž popisuje způsoby výroby a použití použitelných imunocytokinu, a stejně tak testy použitelné pro testování jejich farmakokinetických aktivit u pre-klinických in vivo modelů zvířat, pokud se použijí v kombinaci s vhodnými činidly zvyšujícími uptake imunocytokinů.
Výraz „činidlo zvyšující uptake imunocytokinu, jak je zde použit, je třeba chápat tak, že znamená libovolné činidlo, které zesiluje cytocidní imunitní odpovědi indukované imunocytokinem proti předem zvolenému buněčnému typu. Konkrétněji je výhodným činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu činidlo zvyšující uptake imunocytokinu, které podporuje pronikání imunocytokinu do nádoru. Příklady činidel zvyšujících uptake imunocytokinu zahrnují neomezujícím způsobem chemoterapeutická činidla, jakými jsou například taxany, činidla poškozující DNA včetně alkylačních chemoterapeutických činidel, činidel používaných při léčebném ozařování a činidel, které modulují krevní tlak. Výhodnými taxany jsou Taxol, docetaxel, 10-deacetyl Baccatin III a jejich deriváty. Výhodnými alkylačními činidly jsou cyklofosfamid, karboplatina, cisplatina a jejich deriváty. Výhodnou formou záření je γ-záření. Výhodným činidlem modulujícím krevní tlak je agonizující činidlo angiotensinu II, například angiotensin II samotný, výhodně podávaný periodicky podle obecných principů, které popsal Netti a kol., (Cancer
01-3623-02-Ma
Research [1995] 55: str. 5451 až 5458) a Netti a koi., (Pros. Nat. Acad. Sci. [1999] 96: str. 3137 až 3142). Imunitní odpověď lze určit metodami, které jsou odborníkům v daném oboru známé a/nebo za použití metod, které jsou zde popsané.
Výraz „cytocidní imunitní odpověď, jak je zde použit, je třeba chápat tak, že znamená jakoukoliv imunitní odpověď v těle savce, a to buď humorální nebo celulární povahy, která je stimulována imunocytokinem a která bud hubí, nebo jiným způsobem omezuje životnost předem zvoleného buněčného typu u savce. Imunitní odpověd muže zahrnovat jeden nebo více buněčných typů včetně T buněk, NK buněk a makrofágů.
Výraz „imunocytokin, jak je zde použit, je třeba chápat tak, že znamená fúzi (i) vazebného místa protilátky, které má vazebnou specifičnost a které je schopno navázat předem zvolený antigen, například antigen specifický pro daný buněčný typ, a (ii) cytokinu, který je schopen indukovat nebo stimulovat cytocidní imunitní odpovědi, zpravidla proti rakovinové nebo virově infikované buňce. Příklady předem zvolených antigenů zahrnují antigeny buněčného povrchu, jakými jsou například antigeny na rakovinových buňkách nebo virově infikovaných buňkách, a nerozpustné intracelulární antigeny, například antigeny nekrotických buněk, které mohu zůstat navázané na buněčné membráně. Výhodnými antigeny jsou cílové antigeny, které jsou charakteristické pro nádorové buňky, jakými jsou například antigeny specifické pro nádor. Imunocytokin je tedy schopen selektivně dopravovat cytokin k cíli (kterým je zpravidla buňka) in vivo tak, aby cytokin mohl mediovat lokalizované imunitní odpovědi proti cílové buňce. Pokud se například protilátka jako složka imunocytokinu selektivně naváže na antigen na rakovinové buňce, například na
01-3623-02-Ma
rakovinové buňce v pevném nádoru, a zejména v pevném nádoru, jehož objem je větší než přibližně 100 mm3, potom imunocytokin vykazuje lokalizovanou protinádorovou aktivitu. Alternativně, pokud se protilátka jako složka imunocytokinu selektivně naváže na antigen na virově infikované buňce, jakou je například HIV infikovaná buňka, potom imunocytokin vykazuje lokalizovanou antivirovou aktivitu.
Výraz „vazebné místo protilátky, jak je zde použit, je třeba chápat tak, že znamená alespoň část imunoglobulinového těžkého řetězce, například imunoglobulinovou proměnnou oblast, která je schopna navázat antigen předem zvoleného buněčného typu. Vazebné místo protilátky rovněž výhodně zahrnuje alespoň část imunoglobulinové konstantní oblasti zahrnující například CH1 doménu, CH2 doménu a případně CH3 doménu nebo alespoň CH2 doménu, nebo její jednu nebo více částí. Kromě toho imunoglobulinový těžký řetězec může být asociován kovalentním nebo nekovalentním způsobem na imunoglobulinový lehký řetězec obsahující například proměnnou oblast imunoglobulinového lehkého řetězce, a případně konstantní oblast lehkého řetězce. Předpokládá se tedy, že vazebné místo protilátky může obsahovat intaktní protilátku nebo její fragment nebo jednořetězcovou protilátku, které jsou schopné navázání na předem zvolený antigen.
Pokud jde o imunocytokin, předpokládá se, že fragment protilátky lze navázat na cytokin celou řadou odborníkům v daném oboru známých způsobů. Vazebné místo protilátky se například výhodně naváže přes polypeptidovou vazbu nebo přes linker na cytokin v konstruktu fúzního proteinu. Alternativně lze vazebné místo protilátky chemicky navázat na cytokin prostřednictvím reakčních skupin, například
01-3623-02-Ma
.................
prostřednictvím sulfhydrylových skupin, v aminokyselinových bočních řetězcích přítomných v místě pro navázání protilátky a v cytokinu.
Výraz „cytokin, jak je zde uveden, je třeba chápat tak, že znamená libovolný protein nebo peptid, jejich analog nebo funkční fragment, který je schopen stimulovat nebo indukovat cytocidní imunitní odpovědi proti předem zvolenému buněčnému typu, například proti rakovinové buňce nebo virově infikované buňce, v těle savce. Předpokládá se tedy, že lze do imunocytokinů podle vynálezu zabudovat celou řadu různých cytokinů. Použitelné cytokiny zahrnují například nádor nekrotizující faktory (TNF) , interleukiny (IL), lymfokiny (L) , kolonie stimulující faktory (CSF), interferony (IFN) včetně jejich druhových variant a zkrácených analogů, které jsou schopny stimulovat nebo indukovat takové cytocidní imunitní odpovědi. Použitelné nádor nekrotizující faktory zahrnují například TNFa. Použitelné lymfokiny zahrnují například LT. Použitelné kolonie stimulující faktory zahrnují například GM-CSF a M-CSF. Použitelné interleukiny zahrnují například IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12, IL-15 a IL-18. Použitelné interferony zahrnují například IFN-a, IFN-β a IFN-y.
Gen kódující příslušný požadovaný cytokin lze klonovat de novo, získat z dostupného zdroje nebo syntetizovat standardní DNA syntézou ze známé nukleotidové sekvence. Například je známa DNA sekvence LT (viz například Nedwin a kol., (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13: str. 6361), stejně jako jsou známy sekvence pro IL-2 (viz například Taniguchi a kol., (1983) NATURE 302: str. 305 až 318), GM-CSF (viz například Gasson a kol., (1984) SCIENCE 266: str. 1339 až 1342) a TNFa (viz například Nedwin a kol., (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13: str. 6361).
01-3623-02-Ma
U výhodného provedeni jsou imunocytokiny rekombinantní fúzni proteiny produkované konvenčními rekombinantními DNA metodami, tj. navázáním nukleokyselinového konstruktu kódujícího chimérický imunocytokin. Konstrukce rekombinantnich fúzních proteinů protilátka-cytokin je popsána ve stavu techniky, viz například Gillies a kol., (1992) Proč. Natl. Acad. Sci. USA 89: str. 1428 až 1432; Gillies a kol., (1998) J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203; a v patentu US 5 650 150. Výhodně zahrnuje genový konstrukt kódující imunocytokin podle vynálezu, ve směru 5' -> 3', DNA segment kódující doménu proměnné oblasti imunoglobulinového těžkého řetězce, DNA segment kódující konstantní oblast imunoglobulinového těžkého řetězce a DNA kódující cytokin. Fúzovaný gen je součástí expresního vektoru nebo se do něj zavede ve snaze transfektovat jej do vhodného buněčného příjemce, kde se fúzovaný gen exprimuje. Hybridní polypeptidový řetězec se výhodně kombinuje s imunoglobulinovým lehkým řetězcem, například v kombinaci imuno— globulinové proměnné oblasti těžkého řetězce (VH) a imunoglobulinové proměnné oblasti lehkého řetězce (VL) , za vzniku jediného a kompletního místa pro navázání předem zvoleného antigenu. U výhodného provedení jsou imunoglobulinový těžký a lehký řetězec kovalentně spojeny, například pomocí meziřetězcové disulfidové vazby. Kromě toho mohou být například pomocí jedné nebo několika meziřetězcových disulfidových vazeb kovalentně spojeny dva imunoglobulinové těžké řetězce, z nichž jeden nebo oba jsou navázány na cytokin.
Způsoby podle vynálezu jsou tedy použitelné pro zesílení protinádorové aktivity imunocytokinu použitého v rámci terapeutické metody při léčbě nádoru, která zahrnuje přípravky imunocytokinu a způsoby, popsané v mezinárodních
01-3623-02-Ma patentových přihláškách WO 99/29732, WO 99/43713, WO 99/52562, WO 99/53958 a WO 01/10912, a rovněž zahrnuje fúzni proteiny na bázi protilátky se změněnou aminokyselinovou sekvencí v oblasti připojení. U jednoho provedení jsou způsoby podle vynálezu použitelné v kombinaci s Fc fúzními proteiny, jakým je například Fc-interferon-α.
Obr. 1 je schématickou reprezentací příkladného imunocytokinu 1.. U tohoto provedení jsou molekuly 2 a £ cytokinu navázány pomocí peptidové vazby na C-konce €> a CH3 oblastí 10 a 12 těžkých řetězců 14 a 16 protilátky. Je známo, že VL oblasti 26 a 28 jsou spárovány s VH oblastmi 18 a 20 v typické IgG konfiguraci, čímž poskytují dvě vazebná místa 30 a 32 pro navázání antigenu na N-koncich imunocytokinu 2 a dvě vazebná místa 40 a 42 pro navázání cytokinového receptoru na C-koncích imunocytokinu 1. Samozřejmě, že v širších aspektech nemusí být imunocytokiny spárovány zde ilustrovaným způsobem nebo může být na molekulu cytokinu navázán pouze jeden ze dvou imunoglobulinových těžkých řetězců.
Imunocytokiny podle vynálezu lze díky dvěma aspektům jejich struktury považovat za chimérické. Za prvé je imunocytokin chimérický proto, že obsahuje imunoglobulinový těžký řetězec mající vazebnou specifičnost pro navázání antigenu navázaného na daném cytokinu. Za druhé může být imunocytokin podle vynálezu chimérický v tom smyslu, že obsahuje imunoglobulinovou proměnnou oblast (V) a imunoglobulinovou konstantní oblast (C), přičemž každá z nich je odvozena z jiné protilátky, takže výsledným proteinem je V/C chimérou. Proměnnou a konstantní oblast lze například odvodit z přirozeně se vyskytujících molekul protilátky izolovatelné z různých druhů, viz například
01-3623-02-Ma patent US 4 816 567. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají konstrukty, ve kterých jedna nebo obě imunoglobulinové proměnné oblasti obsahují sekvence úseků základní struktury (FR) a sekvence oblasti určující komplementaritu (CDR) odvozené z různých druhů. Takové konstrukty jsou například popsány v Jones a kol., (1986) Nature 321: str. 522 až 525, Verhoyen a kol., (1988) SCIENCE 239: str. 1534 až 1535 a v patentech US 5 225 539 a US 5 585 089. Kromě toho se předpokládá, že lze sekvence proměnné oblasti odvodit screeningem knihoven, například fágy zobrazujících knihoven, zaměřeným na sekvence proměnných oblastí, které vážou předem zvolený antigen s požadovanou afinitou. Způsoby sestavení a screeningu fágy zobrazujících knihoven jsou popsány například v Huse a kol., (1989) Science 246: str. 1275 až 1281 a v Kang a kol., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: str. 11120 až 11123.
Domény konstantní oblasti imunoglobulinového těžkého řetězce imunocytokinů lze zvolit z kterékoliv z pěti imunoglobulinových tříd označených jako IgA (Iga), IgD (Igě), IgE (Ige), IgG (Igy) a IgM (Igp) . Nicméně jako výhodné se jeví konstantní oblasti imunoglobulinového těžkého řetězce z IgG třídy. Kromě toho se předpokládá, že imunoglobulinové těžké řetězce lze odvodit z kterékoliv podtřídy IgG protilátek, které jsou v daném oboru označovány jako IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4. Je známo, že každá konstantní oblast imunoglobulinového těžkého řetězce obsahuje čtyři nebo pět domén. Domény jsou postupně označeny následujícím způsobem: CHl-pant-CH2-CH3-(-CH4). CH4 Se nachází v IgM, který nemá pantovou oblast. DNA Sekvence domén těžkého řetězce mají křížovou homologii mezi imunoglobulinovými třídami, například CH2 doména IgG je homologická s CH2 doménou IgA a IgD a současně s CH3
01-3623-02-Ma doménou IgM a IgE. Imunoglobulinové lehké řetězce mohou mít buď kapa (k) nebo lambda (λ) konstantní řetězec. Sekvence a zarovnáni sekvenci těchto imunoglobulinových oblastí jsou v daném oboru známy (viz například Kabat a kol., „Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 3. vydání 1983, 4. vydání 1987, a Huck a koi., (1986) NUC. ACIDS RES. 14: str. 1779 až 1789).
U výhodných provedení je proměnná oblast odvozena z protilátky specifické pro antigen předem zvoleného buněčného povrchu (antigen asociovaný s nemocnou buňkou, jakou je například rakovinová buňka nebo virově infikovaná buňka), a konstantní oblast zahrnuje CHI a CH2 (a případně CH3) domény z protilátky, která je shodná s protilátkou, jenž je zdrojem proměnné oblasti nebo se od této protilátky liší. Při realizaci vynálezu je protilátka, která je částí imunocytokinu, výhodně neimunogenní nebo slabě imunogenní v jí určeném příjemci. Tato protilátka se, pokud je to možné, výhodně odvodí ze stejných druhů jako zamýšlený příjemce. Pokud se má imunocytokin například podávat lidem, potom jsou domény konstantní oblasti výhodně lidského původu. Viz například patent US 4 816 567. Kromě toho, pokud se imunoglobulinová proměnná oblast odvodí z druhu jiného, než jakým je zamýšlený příjemce, například pokud jsou sekvence proměnné oblasti myšího původu a pokud je zamýšleným příjemcem člověk, potom proměnná oblast výhodně obsahuje lidské FR sekvence s myšími CDR sekvencemi zavedenými mezi FR sekvencemi, které tak vytvářejí chimérickou proměnnou oblast mající vazebnou specifičnost pro předem zvolený antigen, ale současně minimalizují imunoreaktivitu v těle zamýšleného hostitele. Návrh syntézy takových chimérických proměnných oblastí popsal Jones a kol., (1986) v Nature
01-3623-02-Ma
321: str. 522 až 525; Verhoyen a koi., (1988) SCIENCE 239: str. 1534 až 1535 a rovněž jsou popsány v patentech US 5 225 539 a US 5 585 089. Klonování a expresi humanizovaného fúzního proteinu protilátka-cytokin, fúzního proteinu KS-1/4 anti-EpCAM protilátka-IL-12, a stejně tak jeho schopnost zneškodnit založené metastázy karcinomu střev popsal Gillies a kol., (1998) v J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203.
Gen kódující cytokin je napojen buď přímo, nebo pomocí linkeru, například pomocí DNA kódující (Gly4-Ser)3 linker na 3' konci genu kódujícího imunoglobulinovou konstantní oblast (např. CH2 nebo CH3 exon). U určitých provedení může linker obsahovat nukleotidovou sekvenci kódující místo proteolytického štěpení. Toto místo, pokud je zařazeno mezi imunoglobulinovou konstantní oblastí a cytokinem, může být navrženo tak, aby umožnilo proteolytické uvolnění cytokinu v cílovém místě. Je například známo, že se plasmin a trypsin štěpí za lysinovým a argininovým zbytkem, což jsou místa, která jsou přístupná proteáze. V daném oboru je známo mnoho dalších místně specifických endoproteáz a aminokyselinových sekvencí, které tyto endoproteázy štěpí. Výhodná místa proteolytického štěpení a proteolytické enzymy, které jsou reaktivní v takových místech štěpení, jsou popsány v patentech US 5 541 087 a US 5 726 044.
Nukleokyselinový konstrukt může případně zahrnovat endogenní promotor a zesilovač pro gen kódující proměnnou oblast, jejichž úkolem je regulovat expresi chimérického imunoglobulinového řetězce. Geny kódující proměnnou oblast lze například získat jako DNA fragmenty obsahující vedoucí peptid, VJ gen (funkčně přeuspořádané proměnné (V) oblasti se spojovacím (J) segmentem) pro lehký řetězec, nebo VDJ gen pro těžký řetězec a endogenní promotor a zesilovač
01-3623-02-Ma těchto genů. Alternativně lze gen kódující proměnnou oblast získat bez endogenních regulačních prvků a použít jej v expresním vektoru, který tyto prvky poskytuje.
Geny kódující proměnnou oblast lze získat standardními DNA klonovacími postupy z buněk, které produkují požadovanou protilátku. Screening genomové knihovny, zaměřený na specificky funkčně přeuspořádanou proměnnou oblast, lze provádět za použití vhodných DNA sond, jakými jsou například DNA segmenty obsahující DNA sekvenci J oblasti a následující (downstream) sekvence. Identifikace a potvrzení správných klonů se dosáhne sekvencováním klonovaných genů a porovnáním sekvence s odpovídající sekvencí celodélkové a správně sestřižené mRNA.
Cílovým antigenem může být antigen buněčného povrchu nádorové nebo rakovinové buňky, virem infikované buňky nebo jinak nemocné buňky. Cílovým antigenem může rovněž být nerozpustný intracelulární antigen nekrotické buňky (viz například patent US 5 019 368). Geny kódující vhodné proměnné oblasti lze zpravidla získat z lymfoidních buněčných linií produkujících imunoglobulin. Například hybridomové buněčné linie, produkující imunoglobulin specifický pro antigeny asociované s nádorem nebo pro virové antigeny, lze vyrábět standardními technikami hybridizace somatických buněk, které jsou v daném oboru známy (viz například patent US 4 196 265) . Tyto buněčné linie produkující imunoglobulin poskytují zdroj genů proměnných oblastí ve funkčně přeuspořádané formě. Geny proměnné oblasti budou zpravidla myšího původu, protože tento myší systém vyhovuje produkci širokého spektra různých imunoglobulinů s požadovanou specifičností. Kromě toho lze sekvence proměnné oblasti odvodit screeningem knihoven, například fágy zobrazujících knihoven, zaměřeným
01-3623-02-Ma na sekvence proměnných oblasti, které vážou předem zvolený antigen s požadovanou afinitou. Způsoby sestavování a screeningu fágy zobrazujících knihoven jsou popsány například v Huse a kol., (1989) Science 246: str. 1275 až 1281 a v Kang a kol., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: str. 11120 až 11123.
DNA Fragment kódující funkčně aktivní gen proměnné oblasti je navázán na DNA fragmentu obsahujícím gen kódující požadovanou konstantní oblast (nebo její část). Imunoglobulinové konstantní oblasti (těžký a lehký řetězec) lze získat z buněk produkujících protilátku standardními technikami klonování genů. Již byly klonovány geny pro dvě třídy lidských lehkých řetězců (k a λ) a pět tříd lidských těžkých řetězců (α, β, ε, γ a μ) a z těchto klonů jsou tedy konstantní oblasti lidského původu snadno dostupné.
Fúzovaný gen kódující hybridní imunoglobulinový těžký řetězec se zkompletuje nebo zavede do expresního vektoru s cílem zabudovat jej do recipientní buňky. Zavedení genového konstruktu do plasmidových vektorů lze realizovat za použití standardních postupů genového sestřihu. Chimérický imunoglobulinový těžký řetězec se může koexprimovat ve stejné buňce jako odpovídající imunoglobulinový lehký řetězec, takže lze kompletní imunoglobulin exprimovat a kompletovat současně. Pro tyto účely lze konstrukt těžkého řetězce a konstrukt lehkého řetězce umístit do stejného vektoru nebo do různých vektorů.
Recipientními buněčnými liniemi jsou zpravidla lymfoidní buňky. Výhodnou recipientní buňkou je myelom (nebo hybridom). Myelomy mohou syntetizovat, kompletovat a vylučovat imunoglobuliny kódované transfektovanými geny, kterými mohou být glykosylátové proteiny. Zvláště výhodné
01-3623-02-Ma recipientni neboli hostitelské buňky zahrnují buňky Sp2/0 myelomu, který zpravidla neprodukuje endogenní imunoglobulin, a buňky myšího myelomu NS/0. Při transfekci buňky produkují pouze imunoglobulin kódovaný transfektovanými genovými konstrukty. Transfektované myelomy lze pěstovat v kultuře nebo v peritoneu myší, kde lze imunocytokin izolovat od ascitické tekutiny. Jako recipientni buňky lze použít další lymfoidní buňky, jakými jsou například B lymfocyty.
Existuje několik způsobů transfekce lymfoidních buněk vektory obsahujícími nukleokyselinové konstrukty kódující chimérický imunoglobulinový řetězec. Vektory lze do lymfoidních buněk například zavést pomocí fúze sferoblastů (viz například Gillies a kol., (1989) BIOTECHNOL. 7: str. 798 až 804) . Další použitelné metody zahrnují elektroporaci nebo vysrážení fosforečnanu vápenatého (viz například Sambrook a kol., vydavatelé (1989) „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press).
Další použitelné metody výroby imunocytokinu zahrnují přípravu RNA sekvence kódující konstrukt a její translaci do vhodného in vivo nebo in vitro expresního systému. Předpokládá se, že rekombinantní DNA metody pro syntézu genů kódujících fúzní proteiny protilátka-cytokin, pro zavedení genů do hostitelských buněk, pro expresi genů v hostiteli a pro sklizeň výsledného fúzního proteinu jsou známy a jsou podrobně zdokumentovány. Specifické protokoly jsou popsány například v Sambrook a kol., vydavatelé (1989) „Molecular Cloning: 4 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press.
Je známo, že chemicky navázané imunocytokiny lze produkovat za použití celé řady odborníkům v daném oboru
01-3623-02-Ma známých metod. Protilátku nebo fragment protilátky lze na cytokin chemicky navázat, například pomocí chemicky reaktivních aminokyselinových bočních řetězců obsažených v protilátce nebo ve fragmentu protilátky a v cytokinu. Aminokyselinové boční řetězce lze kovalentně spojit, například pomocí disulfidových vazeb nebo pomocí homo- nebo heterobifunkčních síťovacích činidel, která zahrnují například N-sukcinimidyl-3(-2-pyridyldithio)propionát, m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxysukcinát ester, m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxysulfosukcinimid ester a 1,4-di-[3'(2'-pyridylthio)propionamido]butan, které jsou komerčně dostupné u Pierce, Rockford, IL.
Podle způsobu podle vynálezu je kombinace imunocytokinů s činidly zesilujícími uptake imunocytokinu použitelná pro zesílení stimulace imunitního systému způsobující cytotoxickou odpověď na místě cílového buněčného typu, například na nádorových buňkách nebo jinak nemocných buňkách. Dalo by se očekávat, že kombinace imunocytokinu a činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu nebudou mít kombinovaný nebo synergický protinádorový účinek in vitro, protože imunocytokin samotný je necytotoxický.
Bez snahy vázat se na některou konkrétní teorii se dá předpokládat, že účinky kombinované léčby in vivo mohou zahrnovat zesílený uptake jednoho z činidel, který je způsoben účinkem druhého činidla, což vede buď (1) ke zvýšené chemoterapeutické cytotoxicitě (pokud imunocytokin zvýší uptake činidla zvyšujícího uptake chemoterapeutického imunocytokinu v nádorových buňkách; a/nebo (2) ke zvýšené imunitní stimulaci (pokud činidlo zvyšující uptake imunocytokinu nějakým způsobem zvýší uptake imunocytokinu v nádoru). Pokud jde o mechanismus (1),
01-3623-02-Ma dřívější studie ukázaly, že je možné zvýšit uptake radioaktivně značených protilátek (a podle všeho léčiv, která mají malou molekulu) do nádorů předběžným ošetřením vysokými dávkami imunokonjugátu protilátka-IL2, který indukuje lokální vaskulární propustnost, viz například Hornick a kol., 1999, CLIN CANCER RES 5: str. 51 až 60). Pokud by příslušný mechanismus fungoval při kombinované léčbě imunocytokiny a činidly zvyšujícími uptake imunocytokinů, potom by bylo nezbytné, aby byl živočich trpící nádorem nejprve léčen imunocytokinem. Nicméně pokud by se před ošetřením imunocytokinem poskytla živočichovi jediná dávka činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu, a tento postup by vedl k dosažení synergického účinku v případě protinádorové aktivity, potom by popsaný mechanismus nemohl fungovat. Jako pravděpodobnější se tedy jeví vysvětlení, že léčba činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu zvýšila uptake imunocytokinu v důsledku mechanismu (2). Tuto hypotézu lze dále podložit skutečností, že souběžné podávání s činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu zvyšuje uptake radiologicky značeného imunocytokinu v pevném nádoru.
Výhodou kombinované léčby je podle způsobů podle vynálezu skutečnost, že podání imunocytokinu zesiluje cytotoxický účinek chemoterapeutického činidla, které působí jako činidlo zvyšující uptake imunocytokinu. Pacientovi tedy lze podávat nižší dávku chemoterapeutického činidla. Potlačení některých aspektů imunitního systému pacienta, které často souvisí s ošetřením, které používá chemoterapeutická činidla, se tedy redukuje. U jednoho provedení podle vynálezu se pacientovi před podáním imunocytokinu podá jedna dávka činidla zvyšujícího uptake chemoterapeutického imunocytokinu. Činidlo zvyšující uptake
01-3623-02-Ma ·*· chemoterapeutického imunocytokinu se výhodně podává přibližně 4 dny až 4 h a nejvýhodněji přibližně 24 h až 48 h před podáním imunocytokinu. U dalšího provedení podle vynálezu se pacientovi před podáním imunocytokinu podá několik dávek činidla zvyšujícího uptake chemoterapeutického imunocytokinu. U dalších provedení podle vynálezu lze činidlo zvyšující uptake chemoterapeutického imunocytokinu podávat před, současně s a/nebo po imunocytokinu.
Paclitaxel je příkladem činidla zvyšujícího uptake chemoterapeutického imunocytokinu, které může potlačit nebo oslabit aspekty imunitního systému pacienta. Zatímco většina vlivu paclitaxelu je v případě potlačení imunity mediována přes buňky makrofágů/monocytů, mnoho studií funkce lymfocytů naznačilo škodlivý vliv paclitaxelu na tento podsoubor. Například se ukázalo, že léčba paclitaxelem závažně oslabuje proliferační kapacitu lymfocytů jak u zdravých, tak u nádorem trpících myší (Mullins a kol., 1998, IMMUNOPHARMACOL IMMUNOTOXICOL 20: str. 473 až 492) a poškozuje jak cytotoxicitu NK buněk, tak tvorbu lymfokinem aktivované cytotoxicity v buněčných kulturách obsahujících IL-2 (Chuang a kol., 1993, GYNECOL ONCOL 49: str. 291 až 298). Ve skutečnosti dostupné důkazy poukazují na lymfocytový podsoubor buněk jako na esenciální efektorovou populaci při protinádorové aktivitě imunocytokinu (Lode a kol., 1998, PHARMACOL THER 80: str. 277 až 292). Výsledky experimentů, které jsou součástí předloženého vynálezu, odhalují několik nových zjištění, která nebylo možné odvodit z dosavadního stavu techniky, a zejména několik nových zjištění týkajících se pořadí podávání účinných složek.
Taxany lze podávat souběžně s imunocytokinem nebo samostatně, různými způsoby podání. Kompozice podle
01-3623-02-Ma
vynálezu lze podávat libovolnou cestou, která je slučitelná s příslušnými molekulami. Vhodným podáním může být tedy orální podání nebo parenterální podání včetně intravenózního a intraperitoneálního podání.
Kompozice podle vynálezu lze podávat živočichovi pomocí libovolného vhodného prostředku přímo (například lokálně, tj. například formou injekce, implantátu nebo topického podání do tkáně) nebo systemicky (například parenterálně nebo orálně). Pokud má být kompozice podána parenterálně, například intravenózně, subkutánně, oftalmicky, intraperitoneálně, intramuskulárně, bukálně, rektálně, vaginálně, intraorbitálně, intracerebrálně, intrakraniálně, intraspinálně, intraventrikulárně, intra fekálně, intracisternálně, intrakapsulárně, intranazálně nebo v aerosolu, potom část kompozice výhodně tvoří vodná suspenze nebo roztok nebo suspenze nebo roztok fyziologicky slučitelné tekutiny. Nosič neboli vehikulum je tedy fyziologicky přijatelný, takže kromě dopravy požadované kompozice do těla pacienta jinak nežádoucím způsobem neovlivňuje rovnováhu elektrolytů a/nebo objemovou rovnováhu pacienta. Tekutým médiem muže tedy být normální fyziologický roztok (například 9,85·β vodný roztok NaCl, 0,15 M, pH 7 až 7,4). U mnoha taxanů jsou formulace zpravidla složitější, což je dáno jejich obecně horší rozpustností. Standardní formulace paclitaxelu například zahrnuje 10% Cremophor, 10% ethanol a 80% solný roztok (0,9% NaCl), zatímco formulace docetaxelu zahrnuje 1:1 roztok ethanolu a polysorbátu 80, který se před podáním naředí v poměru 1:10 5% glukózovým roztokem (Bissery a Lavelle, 1999). Nicméně odborníci v daném oboru jsou schopni vyvinout další formulace zahrnující taxany a/nebo jejich nově syntetizované analogy.
01-3623-02-Ma
Výhodné dávky imunocytokinu pro jedno podáni se pohybují v rozmezí 0,1 mg/m2 až 100 mg/m2, výhodněji 1 mg/m2 až 20 mg/m2 a nej výhodněji 2 mg/m2 až 6 mg/m2. Výhodné dávky činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu budou obecně záviset na typu použitého činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu, nicméně optimální dávky lze určit pomocí rutinních experimentů. Podání imunocytokinu a/nebo činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu lze realizovat pomocí periodických bolusových injekcí nebo kontinuálním intravenózním nebo intraperitoneálním podáním z externího zdroje (například z intravenózního vaku) nebo vnitřně (například z biologicky degradovatelného implantátu). Imunocytokiny podle vynálezu lze příjemci rovněž podávat společně s množinou různých činidel zvyšujících uptake imunocytokinů. Nicméně se předpokládá, že optimální kombinaci imunocytokinů a činidel zvyšujících uptake imunocytokinů, způsoby podání a dávky lze určit pomocí v daném oboru známých rutinních experimentů.
K posouzení účinnosti kombinované terapie používající fúzní proteiny protilátka-cytokin a činidla zvyšující uptake imunocytokinů na imunitní odpovědi lze použít celou řadu způsobů. Odborník v daném oboru může například použít zvířecí model popsaný v níže uvedených příkladech nebo další vhodné zvířecí modely k posouzení toho, která činidla zvyšující uptake imunocytokinů nebo které kombinace činidel zvyšujících uptake imunocytokinů jsou nejvýhodnější při synergickém spolupůsobení s imunocytokinem (například fúzní protein protilátka-IL2) při zesilování imunitní destrukce založených nádorů. Činidlo zvyšující uptake imunocytokinu nebo kombinaci činidel zvyšujících uptake imunocytokinů lze podávat před nebo současně s probíhající imunocytokinovou terapií a vliv na nádor lze monitorovat pomocí
01-3623-02-Ma volumetrického měření. Odborník v daném oboru bude rovněž schopen použít zde popsané metody pro testování potenciálu nově identifikovaných činidel zvyšujících uptake imunocytokinu, ve smyslu zesílení nebo jiné modifikace protirakovinové aktivity fuzmch proteinu protilátka cytokin.
Alternativně lze po terapii nádory vyjmout z těla, nařezat na plátky a obarvit standardními histologickými metodami nebo specifickými imuno-histologickými reakčními činidly, ve snaze určit vliv kombinované terapie na imunitní odpověď. Zabarvení hematoxolinem a eosinem může například odhalit rozdíly v lymfocytické infiltraci do pevných nádorů, což lze označit jako celulární imunitní odpověď. Imunologické zabarvení řezů nádoru protilátkami proti specifickým třídám imunitních buněk muže dale odhalit povahu indukované odpovědi. Pro určení typu imunitní odpovědi, která byla mediována imunocytokiny podle vynálezu, lze například použít protilátky, které se váží na CD45 (obecný marker leukocytů), CD4 a CD8 (pro identifikaci podtřídy T buněk) a NK1.1 ( marker na NK buňkách).
Alternativně lze typ imunitní odpovědi mediované imunocytokiny zjišťovat studiem konvenčních deplecí buněčného podsouboru, které například popsal Lode a kol., (1998) Blood 91: str. 1706 až 1715. Příklady deplečních protilátek zahrnují ty, které reagují s T buněčnými markéry CD4 a CD8, a stejně tak ty, které se váží na NK markéry NK1.1 a asialo GM. Stručně řečeno, tyto protilátky se injektují do těla savce před počátečním ošetřením fúzním proteinem protilátka-cytokin ve vysokých dávkách (například v dávce přibližně 0,5 mg/myš) a následně se podávají v týdenních intervalech až do ukončení experimentu. Tato
01-3623-02-Ma technika může identifikovat buněčné typy nezbytné pro zjištění pozorované imunitní odpovědi u savce.
Další přístup představuje metoda, při které se cytotoxická aktivita splenocytů izolovaných z těla zvířat ošetřovaných kombinovanou terapií může porovnat s cytotoxickou aktivitou splenocytů izolovaných z dalších ošetřovaných skupin. Kultury splenocytů se připraví mechanickým rozemíláním izolované sterilní sleziny standardními technikami, které lze nalézt ve většině manuálů imunologických laboratoří. Viz například Coligan a kol., (vydavatelé) (1988) „Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc. Výsledné buňky se následně kultivují ve vhodném médiu pro kultivaci buněk (například DMEM od GIBCO), které obsahuje sérum, protilátky a nízkou koncentraci IL-2 (přibližně 10 U/ml). Pro porovnání NK aktivity je zpravidla optimální třídenní kultura, zatímco pro porovnání T buněčné cytotoxické aktivity je zpravidla optimální pětidenní kultura. Cytotoxickou aktivitu lze měřit 30min radioaktivním značením nádorových cílových buněk (například LLC buněk) pomocí 51Cr. Po odstranění přebytku radioaktivního chrómu se označené buňky 4 h misi s různými koncentracemi kultivované sleziny. Na konci inkubace se pomocí gama čítače změří 51Cr uvolněný z buněk a výsledek se následně použije pro kvantifikaci rozsahu buněčné lyže indukované imunitními buňkami. Tímto způsobem se měří tradiční cytotoxická aktivita T lymfocytu (neboli CTL).
Vynález bude dále ilustrován pomocí následujících příkladů, které mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.
01-3623-02-Ma
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Zvířecí modely
Pro studium účinku kombinace imunocytokinů a taxanů při mediaci účinných cytotoxických odpovědí proti nádoru byly vyvinuty myší rakovinové modely. Imunocytokiny použité v následujících příkladech váží EpCAM, což je lidský nádorový antigen, který se nachází na většině nádorů odvozených z epitelu (viz Perez a Walker (1989) J. Immunol. 142: str. 3662 až 3667). Pro test účinnosti u imunokompetentního myšího modelu bylo nutné exprimovat na povrchu buňky myšího nádoru lidský antigen, který je syngenní s myším hostitelem. Buňky Lewisova plicního karcinomu (LLC), což je známá buněčná linie rakoviny plic u myší, byly první buněčnou linií zvolenou pro tento účel. O této buněčné linii je známo, že produkuje vysoké hladiny inhibitorů imunitního systému a indukuje produkci IL-10 imunitními buňkami v mikroprostředí nádoru, což vede k lokalizované imunitní supresi (Sharma a kol., 1999, J IMMUNOL 163: str. 5020 až 5028). Na povrchu LLC buněk se exprimoval lidský nádorový antigen EpCAM (rovněž označovaný jako KSA), takže mohl být zacílen in vivo imunocytokiny odvozenými z myší protilátky anti-EpCAM, KS-1/4. To se realizovalo transdukcí EpCAM cDNA sekvence popsaným rekombinantním retrovirovým vektorem (Gillies, patentová přihláška US 09/293 042), což poskytlo buněčnou linii označenou jako LLC/KSA. Tyto buňky se uchovávaly při 37 C a 7,0% CO2 v DMEM obohaceném 10% tepelně inaktivovaným fatálním bovinním sérem, L-glutaminem, penicillinem/streptomycinem a Geneticinem (GIBCO).
01-3623-02-Ma
Další buněčné linie reprezentující karcinom různých tkáňových původů se geneticky upravily podobným způsobem. 4T1 Neimunogenní buněčnou linii karcinomu mléčné žlázy u myší poskytl Dr. Paul Sondel (Univerzita Wisconsin) . Tato linie po subkutánní implantaci pozvolna a progresivně rostla a spontánně vytvářela metastázy v mnoha orgánech, a to i před chirurgickým odstraněním primárního nádoru. Rovněž je možné indukovat do plic experimentální metastázi pomocí intravenózní injekce. CT26 Buněčná linie karcinomu střev u myší odvozenou intrarektální injekcí N-nitroso-N-methyluretanu u myší BALB/C poskytl Dr. I.J. Fidler (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). Buňky 4T1 a CT26 se transfektovaly popsaným Ep-CAM (Gillies a kol., 1998, J IMMUNOL 160: str. 6195 až 6203). Buňky 4T1/KSA se uchovávaly při 37 °C a 7,0% CO2 v RPMI obohaceném 10% tepelně inaktivovanem fetalm bovinnim seru, L glutaminem, penicillinem/streptomycinem a Geneticinem (GIBCO). Buňky CT26/KSA se uchovávaly při 37 °C a 7,0% CO2 v DMEM obohaceném 10% tepelně inaktivovaném fetální bovinním séru, L-glutaminem, vitaminy, pyruvátem sodným, neesenciálními aminokyselinami, penicillinem/streptomycinem a Geneticinem (GIBCO, Gaithersberg, MD) . Ve snaze udržet KSA expresi se do transfektovaných buněk přidal geneticin. Všechny transfektované buněčné linie rostly progresivně jako kožní nádory (po subkutánní injekci) nebo jako metastázy (po intravenózní injekci) a hubily myši, navzdory expresi molekuly lidského EpCAM (potenciální cizí antigen) na jejich povrchu.
Při studiích růstu nádoru se do hřbetu myší subkutánně implantovaly LLC/KSA nebo CT26/KSA nádory. U studií LLC/KSA se nádory transplantovaly z několika zásobních nádorů injektovaných pomocí jediné buněčné suspenze Ix 10 buněk
01-3623-02-Ma ve 100 μΐ PBS. Přibližně po dvou týdnech se nádory asepticky jímaly a vedly přes síta s velikostí ok 150 μm. Buňky se následně dvakrát nebo třikrát vedly injekční stříkačkou s jehlou velikosti 23, dvakrát propláchly a resuspendova1y v PBS. Jediná buněčná suspenze Ix 106 LLC/KSA buněk ve 100 μΐ PBS se pomocí jehly o velikosti 30½ subkutánně injektovala do hřbetu myší. Při studiích CT26/KSA se buňky rostoucí v kultuře exponenciálně injektovaly ve formě jediné buněčné suspenze lx 106 buněk ve 100 μΐ PBS. Po založení nádorů, tj. přibližně dva týdny po implantaci, byla podána první dávka a tento den se označil jako den 0. Nádory se měřily dvakrát týdně pomocí kaliperu, a to ve třech směrech. Objem nádoru se vypočetl za použití následující rovnice:
Objem = 1/2 x 4/3 π (L/2 x W/2 x H) , kde L = délka, W = šířka a H = výška nádoru.
Během studie se zvířata vážila a sledoval se jejich celkový zdravotní stav. Jakmile se nádory staly nekrotickými nebo pokud se zvířata stala moribundními, potom byla znecitlivěna pomocí zadušení CO2.
Výsledky jsou prezentovány v grafické formě. Grafy ukazují objemy jednotlivých nádorů nebo jejich průměry (+/-SEM) během a po dávkování. Výsledky jsou rovněž vyjádřeny jako procento kontroly průměrných objemů nádoru léčených myší, vztažené k průměrným objemům nádoru myší, kterým bylo podáváno pouze vehikulum. Ke stanovení signifikantních rozdílů se použil Studentův t test aplikovaný na objemy jednotlivých nádorů.
Při studiích experimentálních hepatických metastáz se myši znecitlivěly 80 mg/kg ketaminu HC1 (Fort Dodge Animal
01-3623-02-Ma
Health, Fort Dodge, ΙΑ) a 5 mg/kg xylazinu (Bayer, Shawnee Mission, KS) . V den 0 se v průběhu 60 s injektovala jediná buněčná suspenze lx 105 CT26/KSA buněk ve 100 μΐ DMEM obsahujícího 25 mM HEPES (GIBCO) pomocí jehly o velikosti 271 /2 pod slezinné pouzdro. Po dalších 2 min se slezinné cévy kauterizovaly kauterizační jednotkou (Roboz, Rockville, MD) a slezina se vyjmula. Těla zvířat se uzavřela pomocí autoklipů. Tři týdny po inokulaci se zvířata usmrtila, jejich játra se vyjmula a zvážila. Po zvážení se játra fixovala a obarvila pomocí Bouinova roztoku (Sigma, St. Louis, MO).
Výsledky jsou znázorněny grafickou formou. Grafy ukazují průměry zátěží jednotlivých nádorů (+/-SEM) v době usmrcení. Nádorové zátěže se určí tak, že se od hmotnosti experimentálních jater odečte hmotnost normálních jater. Výsledky jsou rovněž vyjádřeny jako procento kontroly průměrných nádorových zátěží léčených myší, vztažené k průměrným objemům nádoru myší, kterým bylo podáváno pouze vehikulum. Ke stanoveni signifikantních rozdílu se použil Studentův t test aplikovaný na jednotlivé nádorové zátěže.
Při studiích experimentálních plicních metastáz se jediná buněčná suspenze 2,5x 105 4T1/KSA buněk ve 100 μΐ PBS v den 0 pozvolna injektovala za použití jehly o velikosti 27^/2 do lateralni ocasní žily. Přibližně tři týdny po naočkování se zvířata usmrtila a jejich plíce se vyjmuly a zvážily. Plíce se následně fixovaly a zabarvily pomocí Bouinova roztoku (Sigma). Výsledky jsou znázorněny grafickou formou. Grafy ukazuji průměry zátěži jednotlivých nádorů (+/—SEM) v době usmrceni. Nádorové zátěže se urči tak, že se od hmotnosti experimentálních plic odečte hmotnost normálních plic. Výsledky jsou rovněž vyjádřeny jako procento kontroly průměrných nádorových zátěží
01-3623-02-Ma léčených myši, vztažené k průměrným objemům nádoru myší, kterým bylo podáváno pouze vehikulum. Ke stanovení signifikantních rozdílu se použil Studentův t test apli kovaný na jednotlivé nádorové zátěže.
Příklad 2
Příprava fúzních proteinů protilátka cytokin (imuno cytokiny)
V následujících příkladech bude diskutováno několik fúzních proteinů protilátka-cytokin.
huKS-huyl-huIL2 (zkráceně KS-IL2)
Gen kódující huKS-huyl-huILP fúzní protein se připravil a exprimoval v podstatě způsobem, který popsal Gillies a kol., (1998) J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203 a který je popsán v patentu US 5 650 150. Stručně řečeno, humanizované proměnné oblasti myší KS1/4 protilátky (Varki a kol., (1984) Cancer Res. 44: str. 681 až 687) se modelovaly za použití metod, které popsal Jones a kol., (1986) Nature 321: str. 522 až 525 a které zahrnují inzerci CDR každé KS 1/4 proměnné oblasti do konvenčních sekvencí základní struktury lidských proměnných oblastí s nejvyšším stupněm homologie. Molekulová modelace pomocí pracovní stanice Silicon Graphics Indigo pracující s BioSym software potvrdila zachování tvaru CDR. Potom se provedla reverzní translace proteinových sekvencí a geny se konstruovaly ligaci překrývajících se oligonukleotidů.
Výsledné proměnné oblasti se inzertovaly do expresního vektoru obsahujícího konstantní oblasti lidského κ lehkého
01-3623-02-Ma řetězce a lidského Cyl tezkeho řetězce způsobem, který v podstatě popisuje Gillies a kol., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: str. 1428 až 1432, s tou výjimkou, že metallothioneinové promotory a zesilovače imunoglobulinového těžkého řetězce byly v případě exprese obou řetězců nahrazeny CMV promotorem/zesilovačem. Fúze zralých sekvencí IL-2 na C-konec lidských těžkých řetězců se provedly způsobem, který popsal Gillies a kol., (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: str. 1428 až 1432, s tou výjimkou, že se 3' netranslatované oblasti IL 2 genu odvodily z SV40 póly(A) oblasti.
IL-2 Fúzní protein se exprimoval transfekcí výsledného plasmidu do NS/0 myelomové buněčné linie selekčním médiem obsahujícím 0,1 μΜ methotrexat (MTX). Stručně řečeno, pro získání stabilně transfektovaných klonů se plasmidová DNA zavedla do NS/0 buněk myšího myelomu elektroporací. Buňky NS/0 se pěstovaly v Dulbecco modifikovaném Eagleho médiu obohaceném 10% fetálním bovinnim sérem. Přibližně 5x 10 buněk se jednou propláchlo PBS a resuspendovalo v 0,5 ml PBS. 10 μς Linearizované plasmidové DNA se následně 10 min inkubovalo na ledu, společně s buňkami v Gene Pulser Cuvette (0,4 cm rozestup elektrod, BioRad). Elektroporace se prováděla za použití Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) při nastavení 0,25 V a 500 μΕ. Buňky se nechaly 10 min na ledu zotavit, načež se resuspendovaly v růstovém mediu a následně umístily do dvou 96jamkových ploten. Stabilně transfektované klony se vyselektovaly růstem v přítomnosti 100 nM methotrexatu, který se zaváděl dva dny po transfekcí. Buňky se zavedly ještě třikrát v třídenních intervalech a MTX-rezistentni klony se objevily během dvou až tří týdnů.
01-3623-02-Ma
Expresní klony se identifikovaly pomocí Fc nebo cytokin ELISA za použití vhodných protilátek (viz například Gillies a kol., (1989) Biotechnol. 7: str. 798 až 804). Výsledný fúzní protein se purifikoval navázáním a eluací z protein A Sepharose (Pharmacia) podle instrukcí výrobce.
huKS-huy4-huIL2
Gen kódující huKS-huy4-huIL2 fúzní protein se konstruoval a exprimoval v podstatě způsobem popsaným v patentové přihlášce US 09/256 156 podané 24. února 1999, která nárokuje prioritu z patentové přihlášky US 60/075 887 podané 25. února 1998.
Stručně řečeno, Igy4 verze huKS-huyl-huIL2 fúzního proteinu popsaná výše, se připravila odstraněním genového fragmentu imunoglobulinové konstantní oblasti Cyl z huKS-huyl-huIL2 expresního vektoru a jeho nahrazením odpovídající sekvencí z lidského Cy4 genu. Sekvence a sekvenční zarovnání konstantních oblastí Cyl, Cy2, Cy3 a Cy4 lidského těžkého řetězce jsou popsány v Huck a kol., (1986) NUC. ACIDS RES. 14: str. 1779 až 1789.
Výměna Cyl a Cy4 fragmentů se realizovala digescí původní Cyl-obsahu j ici plasmidové DNA Hind III a Xho I a purifikací fragmentu o velikosti 7,8 kb agarózovou gelovou elektroforézou. Druhá plasmidová DNA obsahující Cy4 gen se digerovala Hind III a Nsi I a purifikoval se fragment o velikosti 1,75 kb. Třetí plasmid obsahující lidskou IL-2 cDNA a SV40 polyA místo navázaný na C-konec lidského Cyl genu se digeroval Xho I a Nsi I a purifikoval se fragment o velikosti 470 bp. Všechny tři fragmenty se vzájemně
01-3623-02-Ma ligovaly v přibližně ekvimolárnich množstvích. Produkt ligace se použil pro transformaci kompetentní E. coJ.i a kolonie se vyselektovaly růstem na plotnách obsahujících ampicillin. Správně sestavené rekombinantní plasmidy se identifikovaly restrikční analýzou plasmidových DNA preparátů z izolovaných transfortmantu a pro diskriminaci Cyl (žádné Fsp I) a Cy4 (jedno místo) genových inzertů se použila digesce Fsp I.
Výsledný vektor obsahující náhradu ve formě Cy4-IL2 těžkého řetězce se zavedl do buněk NS/0 myšího myelomu elektroporací (0,25 V a 500 μΕ) a transfektanty se vyselektovaly růstem v médiu obsahujícím methotrexat (0,1 μΜ) . Buněčné klony exprimující vysoké hladiny huKS-huy4-huIL2 fúzního proteinu se identifikovaly a rozšířily a fúzní protein se purifikoval z kultivačních supernatantů za použití protein A Sepharose chromatografie. Čistota a integrita Cy4 fúzního proteinu se stanovila pomocí SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy. IL-2 Aktivita se měřila v testu T-buněčné proliferace (Gillis a kol., (1978) J. Immunol. 120: str. 2027 až 2032) a ukázalo se, že je identická s T-buněčnou proliferací yl konstruktu.
01-3623-02-Ma huKS-muy2a-muIL2
Gen kódující huKS-muy2a-muIL2 fúzní protein se konstruoval tak, že se konstantní oblasti lidské protilátky a lidský IL-2 huKS-huyl-huIL2 fúzního proteinu, který je popsán výše, nahradily odpovídajícími myšími sekvencemi. Konkrétně se lidská Cyl-IL2 DNA nahradila myším Cy2a cDNA fragmentem navázaným na DNA kódující myší IL-2. Stručně řečeno VH oblast huKS je ve struktuře navázána na myší y2a cDNA realizací překryvu PCR za použití překrývajících se oligonukleotidových primerů:
(smyslná) 5' CC GTC TCC TCA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC (SEQ ID NO: 3);
(protismyslná) 5' GG GGC TGT TGT TTT GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA CG (SEQ ID NO: 4) ;
(smyslná) 5' C TTA AGC CAG ATC CAG TTG GTG CAG (SEQ ID NO: 5) ; a (protismyslná) 5' CC CGG GGT CCG GGA GAA GCT CTT AGT C (SEQ ID NO: 6).
Oligonukleotidy SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 4 byly navrženy pro hybridizaci na spoj Vh domény huKS a konstantní oblasti myší y2a cDNA (kurzívou) . V prvním kole PCR se provedly dvě samostatné reakce. V první reakci se VH huKS DNA použila jako templát s oligonukleotidy SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 5. Primer SEQ ID NO: 5 zavedl AfIII (CTTAAG) restrikční místo před (upstream) sekvence kódující zralý N-konec huKS VH (tučně). Ve druhé reakci se myší y2a cDNA použila jako templát s oligonukleotidy SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6. Primer SEQ ID NO: 6 se hybridizoval na cDNA kódující oblast okolo C-konce y2a a
01-3623-02-Ma
zavedl Xmal (CCCGGG) restrikčni místo pro následnou ligaci na muIL2 cDNA. PCR Produkty obou reakcí se smísily a podrobily druhému kolu PCR, kdy se použily oligonukleotidy SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 6. Výsledný PCR produkt se klonoval a po ověření sekvence se AfIII-Xmal fragment kódující VH huKS a myší y2a konstantní oblast použil pro ligaci na DNA kódující signální peptid v AfIII místě a muIL2 cDNA v Xmal místě.
pjygf IL2 cDNA se klonovala z mRNA myších periferních krevních jednojaderných buněk za použití oligonukleotidů SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 8, konkrétně:
(smyslná) 5' GGC CCG GGT AAA GCA CCC ACT TCA AGC TCC (SEQ ID NO: 7); a (protismyslná) 5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (SEQ ID NO: 8).
Primer SEQ ID NO: 7 se přizpůsobil muIL2 (sekvence vyznačená tučným písmem), který má být připojen k muy2a v Xmal restrikčním místě (CCCGGG). Primer SEQ ID NO: 8 zavedl Xhol restrikčni místo (CTCGAG) bezprostředně za translační terminační kodon (protismyslná tučně).
Podobným způsobem se doména proměnného lehkého řetězce (VL) huKS navázala na mu κ cDNA sekvenci překryvem PCR. K překryvu se použily následující oligonukleotidy.
(smyslná) 5'G GAA ATA AAA CGG GCT GAT GGT GCA CCA ACT G (SEQ ID NO: 9) ;
(protismyslná) 5' GC AGC ATC AGC CCGTT TTA TTT CCA GCT TGG TCC (SEQ ID NO: 10);
(smyslná) 5' C TTA AGC GAG ATC GTG CTG ACC CAG (SEQ ID NO: 11) ; a
01-3623-02-Ma (protismyslná) 5' CTC GAG CTA ACA CTC ATT OCT GTT GAA GC (SEQ ID NO: 12).
Tyto oligonukleotidy byly navrženy pro hybridizaci na spoj VL huKS a konstantní oblasti myší κ cDNA (kurzívou). V prvním kole PCR proběhly dvě samostatné reakce. V první reakci se jako templát použila VL doména huKS DNA s oligonukleotidy SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 11, které zavedly AfIII (CTTAAG) restrikční místo před (upstream) sekvenci kódující zralé N-konce huKS VL (tučně). Ve druhé reakci se jako templát použila myší κ cDNA s oligonukleotidy SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 12, které zavedly Xhol restrikční místo za translační terminační kodon (proti smyslná tučně).
PCR Produkty z obou reakcí se smísily a podrobily druhému kolu PCR, při kterém se použily oligonukleotidové primery SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12. Výsledný PCR produkt se klonoval a po ověření sekvence se AfIII-Xhol fragment kódující VL huKS a myší κ konstantní oblast ligovaly na DNA kódující signální peptid v AfIII místě.
Jak sekvence myšího těžkého řetězce, tak sekvence myšího lehkého řetězce se použily jako náhrada lidských sekvencí v pdHL7. Výsledný expresní vektor protilátky obsahující gen dhfr selektovatelného markéru se elektroporoval (6,25 V, 500 pF) do buněk myšího NS/0 myelomu a klony se vyselektovaly kultivací v médiu obsahujícím 0,1 μΜ methotrexat. Transfektované klony rezistentní proti methotrexatu se použily v testech, ve kterých se pomocí standardních ELISA metod určovala sekrece determinantů protilátky. Fúzní proteiny se purifikovaly pomocí protein A Sepharose chromatografie podle instrukcí výrobce.
01-3623-02-Ma
huKS-muy2a-muIL12
Gen kódující huKS-muy2a-muIL12 fúzní protein se konstruoval a exprimoval v podstatě stejným způsobem jako v patentové přihlášce US 08/986 997 podané 8. prosince 1997, a Gillies a kol., (1998) J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203. Stručně řečeno, provedla se fúze myší p35 IL-12 podjednotky cDNA na již připravenou oblast kódující húKS-muy2a těžký řetězec. Výsledný vektor se následně transfektoval do NS/0 myelomové buněčné linie předtransfektováné pomocí p40 IL-12 podjednotky a schopné tuto podjednotku exprimovat. Jinými slovy, buněčná linie se transfektovala samotným p40 a vyselektovaly se stabilní vysoce exprimující buňky, které se následně použily jako příjemce pro transfekci fúzním proteinem obsahujícím p35 (tj. pro sekvenční transfekci).
Myší podjednotky p35 a p40 IL-12 se izolovaly pomocí PCR z mRNA připravené ze slezinných buněk aktivovaných Concanavalinem A (5 μρ/ml v kultivačním médiu po dobu tří dnů). PCR Primery použité pro izolaci p35 kódující nukleosidové sekvence, které jsou rovněž přizpůsobeny pro p35 cDNA jako Xmal-Xhol restrikční fragment, zahrnovaly:
5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (SEQ ID NO: 13); a
5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (SEQ ID NO: 14).
PCR Primer použitý pro izolaci p40 kódující nukleokyselinové sekvence zahrnoval:
5' TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (SEQ ID NO: 15); a
5' CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (SEQ ID NO: 16).
Plasmidový vektor (pdHL7-huKS-muy2a-p35) se konstruoval již popsaným způsobem (Gillies a kol., J.
01-3623-02-Ma
Immunol. Methods 125: str. 191) a obsahoval dhfr selektovatelný markerový gen, transkripční jednotku kódující lehký řetězec humanizované KS protilátky a transkripční jednotku kódující myší těžký řetězec navázaný na p35 podjednotku myšího IL-12. Navázání neboli fúze se dosáhlo ligací Xmal na Xhol fragment přizpůsobené podjednotky cDNA p35 na unikátní místo Xmal na konci CH3 exonu předem připraveného myšího y2a genu. Transkripční jednotka těžkého řetězce i lehkého řetězce zahrnuje cytomegalovirový (CMV) promotor (namísto metallothioneinového promotoru v původní referenci) na 5' konci a polyadenylační místo na 3' konci.
Podobný vektor (pNC-p40) se sestrojil pro expresi volné p40 podjednotky, která zahrnovala selektovatelný markerový gen (neomycinově rezistentní gen), ale současně používala pro transkripci CMV promotor. Kódovací oblast v tomto případě zahrnovala přirozenou vedoucí sekvenci p40 podjednotky pro správnou dopravu do endoplasmického retikula a sestavu s fúzním proteinem. Plasmid pNC-p40 se elektroporoval do buněk a buňky se umístily a vyselektovaly v médiu obsahujícím G418. V tomto případě se kultivační supernatanty klonů rezistentních proti účinné látce testovaly pomocí ELISA na produkci p40 podjednotky.
Expresní vektor pdHL7—huKS—muy2a—p35 se elektroporoval do NS/0 buněčné linie již exprimující myší p40, viz Gillies a kol., (1998) J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203. Transfektované klony rezistentní proti methotrexatu se testovaly na sekreci determinantů protilátky a myšího IL-12 standardními ELISA metodami. Výsledný protein se purifikoval navázáním na a elucí z protein A Sepharose kolony podle instrukcí výrobce.
01-3623-02-Ma
Přiklad 3
In vitro cytotoxická aktivita kombinované léčby
U buněčných linii geneticky upravených pro použiti ve zvířecích modelech (příklad 1) se testovala jejich citlivost na taxanem indukovanou cytotoxicitu v buněčně Lultuře v přítomnosti nebo za absence imunocytokinu na bázi IL-2 tvořeného humanizovanou formou KS-1/4 protilátky navázané na C_konec těžkého řetězce lidského IL 2 (huKS-huyl-hu!L2, dále jen zkráceně KS-IL2). Buňky se naočkovaly v koncentraci 1000 buněk/jamka do 96jamkových ploten s plochým dnem a 24 h inkubovaly při 37 °C a 7% CO2. Do buněčné kultury na plotnách se duplicitně přidal paclitaxel, při dvojnásobném ředění z 200 ng/ml na 3,125 ng/ml, KS-IL2, při 200 ng/ml a IL-2, při 33,3 ng/ml (ekvivalentní množství IL-2 v KS-IL2) a 6 dní inkubovaly při 37 °C a 7% CO2. Přímo v 96jamkových plotnách se provedl MTS kolorimetrický test (Promega) určující životnost buňky na základě buněčné konverze tetrazoliové soli. Po provedení odečtu ploten a záznamu výsledku se životaschopné adherentní buňky obarvily krystalovou violetí (Sigma, St. Louis, MO) . Plotny obarvené krystalovou violetí se použily pro ověření výsledků NITS testu. Výsledky se vyjádřily v tabulární formě. IC5o Je koncentrace účinné složky, která produkuje cytotoxicitu na úrovni z 50 % kontrolované cytotoxicity.
Test cytotoxicity se prováděl za použití paclitaxelu samotného (3 ng/ml až 200 ng/ml) nebo v kombinaci s KS-IL2 (200 ng/ml) nebo IL—2 (33,3 ng/ml, což je ekvivalentní množství IL-2 v KS-IL2) proti CT26/KSA, LLC/KSA a 4T1/KSA buňkám. V případě těchto tří testovaných buněčných linií byla zjištěna pouze malá nebo žádná cytotoxicita KS-IL2
01-3623-02-Ma nebo samotného IL-2 (81% až 101% kontrola, tabulka 1) . Přídavek KS-IL2 nebo IL-2 neměl žádný vliv na cytotoxicitu paclitaxelu. Vzhledem k tomu, že ani KS-IL2 ani IL-2 neovlivnil cytotoxicitu paclitaxelu, muselo být jakékoliv zvýšení protinádorové aktivity u myší při kombinované léčbě způsobeno jinými mechanismy, které se objevují pouze u zvířat trpících nádorem.
Tabulka 1 Cytotoxicita paclitaxelu v kombinaci s IL-2 nebo KS-IL2
Paclitaxel IC5Q (ng/ml)
CT26/KSAa LLC/KSAb 4Tl/KSAb
Taxol 27 6 16
Taxol + IL-2 (33 ng/ml) 30 8 20
Taxol + KS-IL2 (200 ng/ml) 26 5 19
% Kontroly
CT26/KSAa LLC/KSAb 4Tl/KSAb
IL-2 (33 ng/ml) 97 100 95
KS-IL2 ( 200 ng/ml) 90 101 81
A o průměr tří experimentů
b o sz průměr dvou experimentů
Příklad 4
Kombinovaná léčba LLC kožních nádorů KS-IL2 a taxanu
Regresní test růstu nádoru se prováděl za použití agresivně rostoucího nádoru LLC/KSA, kdy byla jedna dávka paclitaxelu (80 mg/kg) o týden později následována KS-IL2
01-3623-02-Ma (20 pg) podávaným 5 dnů intravenózní injekci do ocasní žíly (obr. 2). Nebyl pozorován žádný vliv paclitaxelu nebo samostatně podávaného KS-IL2 (v den 0 až 4). Avšak pokud se podal KS-IL2 jeden týden po paclitaxelu, potom byla pozorována významná redukce průměrného objemu nádoru (41% redukce kontroly) a přibližně o 8 dnů opožděný růst nádoru (TGD), což je velký rozdíl oproti případu, kdy je podáván samotný paclitaxel (p = 0,023). V souvislosti s účinnou složkou nebyla pozorována žádná významnější toxicita, s výjimkou nižšího než 5% hmotnostního úbytku než u skupin léčených paclitaxelem.
Potom se provedlo srovnání léčby, při které se aplikovalo více dávek paclitaxelu a která je považována za účinnější chemoterapii, s léčbou, při které se aplikovala jedna dávka paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2 a určilo se, jak ovlivňuje schéma chemoterapie zesílení účinku. Samotný KS—IL2 (20 mg v den 0 až 4) neměl opět žádný vliv na růst nádoru LLC/KSA, ale samotný paclitaxel, pokud se podal v několika dávkách (50 mg/kg každý druhý den), redukoval průměrný objem nádoru na 63 % kontroly a způsobil čtyřdenní prodlevu růstu nádoru (TGD) (obr. 3). Pokud se KS-IL2 imunocytokin podal jeden týden po léčbě paclitaxelem, potom byla pozorována redukce objemu nádoru odpovídající 27 % kontroly lOdenni TGD, což je významný rozdíl v porovnáním se samotným paclitaxelem (p = 0,016). V souvislosti s účinnou složkou nebyla pozorována žádná významnější toxicita, s výjimkou menšího než 5% úbytku u skupin ošetřovaných paclitaxelem. U skupiny postupující kombinovanou léčbu byl hmotnostní úbytek dokonce nižší. Tyto pozitivní výsledky kombinované léčby jsou překvapující, pokud se vezme v úvahu relativně krátký interval mezi chemoterapeutickou léčbou (a potenciálním
01-3623-02-Ma zhoršeni imunity) a zahájením léčby založené na schopnosti stimulovat proliferace lymfocytů a cytotoxicitu.
Jedním z vysvětlení kombinovaného účinku je to, že taxanem indukovaná apoptóza části hmoty rostoucího nádoru snižuje intersticiální tlak, a ten zase zvyšuje účinnost uptake KS-IL2 do nádoru. Nedávné studie (Griffon-Etienne a kol., 1999, CANCER RES. 59: str. 3776 až 3782) naznačují, že vliv jedné dávky paclitaxelu účinně snižuje intersticiální tlak tekutiny, přičemž maximální účinek je patrný po 24 h až 48 h (Griffon-Etienne a kol., 1999, CANCER RES. 59: str. 3776 až 3782). I když se zdá, že toto je nejlepší okamžik pro uptake imunocytokinu do nádoru, současně představuje velmi krátký časový interval po chemoterapii. Nicméně se provedla léčba myší trpících LLC/KSA nádory pomocí KS-IL2, který se podával po dobu pěti po sobě následujících dnů a léčba se zahájila právě 24 h po podání jediné dávky paclitaxelu. Výsledky naznačují, že dřívější zahájení léčby imunocytokinem než týden po podání jediné dávky paclitaxelu poskytuje u této nádorové linie dokonce lepší kombinovanou odpověď. A totéž platí i pro střevní karcinom CT26 (viz níže).
Přiklad 5
Kombinovaná léčba 4T1 metastáz pomocí KS-IL2 a taxanu
Vzhledem k tomu, že se zjistilo, že léčebné intervaly mezi podáním taxanu a imunocytokinu by mohly být kratší, než se očekávalo, bylo možné provést testy kombinovaných režimů, při kterých se taxan a imunocytokin podají ve stejný den, a porovnat jednu dávku (75 mg/kg) paclitaxelu s dělenou dávkou (25 mg/kg po 3 dny) podanou souběžně s
01-3623-02-Ma léčbou KS-IL2 (15 μg/dávka po tři dny podávaná 4 h po paclitaxelu). Pro tento experiment se použil model experimentálních plicních metastáz indukovaný 4T1/KSA buňkami karcinomu prsu. Dávky účinných složek se zvolily tak, aby byly nižší než jejich optimální dávky a aby nebylo možné pozorovat jakoukoliv případnou aditivní nebo synergickou aktivitu.
Každé činidlo podané samostatně významně (p <0,02) a podobnou měrou redukovalo průměrné hmotnosti plic: 43% redukce pro jednu dávku paclitaxelu, 49% redukce pro množinu dávek samotného paclitaxelu a 39% redukce při použití samotného KS-IL2 (obr. 4) . Kombinace paclitaxelu a KS-IL2 dále mírně, ale méně než aditivně, redukovala plicní metastázy: 58% redukce pro jednu dávku paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2 a 68% redukce pro množinu dávek paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2. Přestože nebyl pozorován žádný synergismus, vedla jedna dávka paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2 k dosažení velmi odlišných výsledků v porovnání s paclitaxelem podávaným samostatně (p = 0,047).
Nižší než 10% ztráta hmotnosti byla pozorována u všech skupin, nicméně nejvyšší ztráta hmotnosti byla pozorována u skupiny, které se podávalo 25 mg/kg paclitaxelu v režimu třikrát každý druhý den. Na základě získaných výsledků byl jako nejlepší režim tohoto testu 4T1 plicních metastáz, s ohledem na nejvyšší účinnost kombinované léčby, vyhodnocen režim, při kterém po jedné dávce paclitaxelu následovalo podání KS-IL2, což odpovídá zjištění při použití regresního modelu růstu LLC/KSA nádoru. Protože interval dávek v tomto případě byl pouhé 4 h, nemusely být výsledky získané pro účinný nádorový uptake optimální.
01-3623-02-Ma
Příklad 6
Kombinovaná léčba CT26 kožních nádorů pomocí KS-IL2 a taxanu
Z výsledků příkladu 5 vyplývá, že časový interval 4 h mezi podáním dávek dvou účinných složek může být příliš krátký. Je to pravděpodobně způsobeno tím, že hladiny paclitaxelu v těle zvířat, které zůstávají v okamžiku podání KS-IL2 ještě zachovány, nemohou přímo interferovat s aktivitou lymfocytů, což redukuje jejich potenciální protinádorovou aktivitu při kombinované léčbě. Při časovém intervalu 4 h nebylo rovněž dosaženo maximálního účinku na nádorový intersticiální tlak. Proto byl navržen další experiment, tentokrát používající založené kožní nádory CT26/KSA karcinomu střev, při kterém se podala jedna dávka paclitaxelu (75 mg/kg) a pětidenní podávání KS-IL2 bylo zahájeno 24 h po podání taxanu. Samotný paclitaxel neměl žádný vliv na růst nádoru (obr. 5) . Léčba nižšími než optimálními dávkami KS-IL2 (10 μg, dny 1 až 5) vedla k dosažení objemu nádoru, který odpovídal 71 % kontroly. Prudká a synergická redukce objemu nádoru na 8 % kontroly byla pozorována při aplikaci kombinace paclitaxelu a KS-IL2, jejíž výsledky se výrazně odlišovaly od výsledků léčby paclitaxelem samotným (p <0,001). Minimální hmotnostní úbytek, tj. přibližně 5 %, byl pozorován u obou skupin léčených paclitaxelem.
Druhý experiment se prováděl za použití modelu CT26/KSA, a tentokrát se testoval vliv kombinované terapie na založené metastázy jater, opět za použití 24 h prodlevy mezi podáním paclitaxelu a KS-IL2 léčbou. Rovněž se porovnávala dávková odpověd paclitaxelu při kombinované léčbě. Do těla myší se v den 5 po indukci metastáz zavedlo
01-3623-02-Ma
pomocí injekce 25 mg/kg, 50 mg/kg nebo 75 mg/kg paclitaxelu samotného nebo následovaného o den později pětidenní léčbou KS-IL2 (7 pg) . V případě samotného paclitaxelu vedly dávky 25 mg/kg, 50 mg/kg a 75 mg/kg k nádorovému zatížení, které odpovídalo 49 %, 23 %, resp. 10 % kontroly (obr. 6). Kombinace paclitaxelu (stejné dávky paclitaxelu jako v případě podání paclitaxelu samotného) s KS-IL2 dále redukovaly plicní metastázy na 12 %, 9 % a 6 % kontroly. Nižší dávka paclitaxelu (25 mg/kg) vedla v kombinaci s KS-IL2 k největší a nejvýznamnější (p <0,001) redukci nádorového zatížení v porovnání s vyššími dávkami paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2. Kombinace podání KS-IL2 s předchozím podáním paclitaxelu tedy vede k vyššímu protinádorovému účinku než mají jednotlivá činidla podaná samostatně. Navíc nejnižší dávka paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2 vede k dosažení podobné protinádorové účinnosti jako nejvyšší dávka paclitaxelu samotného. Použitím nižší dávky paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2 by se tedy redukovala toxicita při současném zachování dobré účinnosti.
Příklad 7
Měření uptake KS-IL2 do nádorů
Pokud má být vliv jednoduchých dávek cytotoxické účinné složky před zahájením imunocytokinové léčby takový, že bude snižovat intersticiální tlak nádoru a zesilovat pronikání nádorem, potom by měl být měřitelný pomocí radioaktivně značeného imunocytokiny, například pomocí KS-IL2. Purifikovaný KS-IL2 se označil isotopem I za použití standardních postupů (viz odkaz) pomocí kontraktů uzavřených s komerčním dodavatelem (New England Nuclear,
01-3623-02-Ma
Billerica, MA). Kožní nádory CT26/KSA se implantovaly subkutánně způsobem popsaným v příkladu 1 a nechaly růst, dokud nedosáhly objemu 100 mm2 až 200 mm . Dvěma skupinám po čtyřech myších se injektoval paclitaxel (50 mg/kg) ve vehikulu nebo vehikulum samotné a následně, po 1 h (experiment 1) nebo 24 h (experiment 2) , 10 μρ I-KS-IL2 (95 μϋί) . Šest hodin po aplikaci radiologicky značeného imunocytokinu se myši usmrtily a nádory se chirurgicky odstranily. Pro kontrolu se zvířatům rovněž odebrala játra a všechny tkáně se zvážily a následně podrobily odečtu v gama čítači. Výsledky jsou vyjádřeny jako počet za minutu (CPM) na gram tkáně vyděleno celkovým CPM ve tkáni a hmotností.
Při injektování značeného KS-IL2 1 h po léčbě paclitaxelem (obr. 7A) se dosáhlo pouze malého zvýšení radioaktivity u nádorů vyjmutých z těl zvířat, kterým byla podána účinná složka. Naopak, pokud se značený KS-IL2 injektoval 24 h po aplikaci paclitaxelu, potom došlo ke dramatickému zvýšení uptake (větší než 200 %) v porovnání s kontrolou, kde bylo aplikováno pouze vehikulum (obr. 7B). Tento velký rozdíl mezi nádorovým uptake v případě podání lha 24 h po léčbě paclitaxelem je v souladu s výsledky získanými při posuzování taxanem indukovaných změn intersticiálního tlaku (Griffon—Etienne a kol., 1999, CANCER RES. 59: str. 3776 až 3782) a souhlasí rovněž s výsledky získanými při hodnocení nádorových modelů, které ukazují, že léčba zahájená 24 h po podání paclitaxelu je účinnější než léčba zahájená dříve (4 h).
Rovněž se zjišťovalo, zda by mohly i další třídy účinných složek zvyšovat uptake značeného imunocytokinu do pevných nádorů. V tomto případě se do těla myší injektovala
01-3623-02-Ma jednoduchá dávka cyklofosfamidu (40 mg/kg), a to buď 24 h nebo 3 dny před experimentem. 125I-Značený KS-IL2 se injektoval do těla všech myši včetně kontrolních myší předem ošetřených PBS a množství radioaktivity v nádorech vyjmutých z těl těchto myší se hodnotilo o 16 h později. Výsledky (obr. 8) ukazují, že předběžná léčba cyklofosfamidem zvýšila uptake KS-IL2 o 48 % u myší, které byly předběžně ošetřeny 24 h před experimentem a o 70 % u myší, které byly ošetřeny tři dny před experimentem.
Příklad 8
Kombinovaná léčba pomocí huKS-huy4-IL2 a taxanu
Nedávno byly popsány nové formy imunocytokinů, které mají delší cirkulační poločasy života a zvýšenou účinnost v důsledku redukované afinity pro Fc receptory (viz Gillies a kol., 1999, CANCER RES. 59: str. 2159 až 2166). Jedním reprezentativním příkladem těchto zlepšených IL-2 imunocytokinů je huKS-huy4-IL2, který se testoval při kombinované léčbě s jednoduchou dávkou paclitaxelu. Pokud se tyto dvě účinné složky postupně podaly myším trpícím CT26/KSA kožními nádory, potom se opět prokázala zvýšená účinnost.
Příklad 9
Kombinovaná léčba pomocí huKS-muy2a-muIL12 a taxanu
Ve snaze zjistit, zda-li je synergický terapeutický účinek specifický pouze pro imunocytokiny na bázi IL-2 se založené CT26/KSA objemné nádory léčily nejprve
01-3623-02-Ma paclitaxelem (jednoduchá dávka 75 mg/kg) a o 24 h později se zahájila pětidenní léčba huKS-muy2a-muIL12 (5 μς na den). Tento imunocytokin reprezentuje fúzi mezi myší formou HuKS protilátky (tj . konstantních oblastí, ve kterých byly převedeny myší C kapa a C gama 2a) a myšího IL—12. Bylo nutné použít myší IL-12 sekvence, protože na rozdíl od IL-2 je tento cytokin vysoce druhově specifický a jeho lidská forma není v těle myši příliš aktivní. Výsledky ukazuji, že léčba paclitaxelem samotným má velmi malý vliv na růst nádoru. Léčba nižšími než optimálními dávkami huKS-muy2a-muIL12 měla protinádorový účinek, který byl vyšší u myší předem léčených jednoduchou dávkou paclitaxelu.
Příklad 10
Kombinovaná léčba pomocí huKS-IL2 a alkylačního činidla
i. Rovněž byl demonstrován zvýšený terapeutický účinek kombinace huKS-IL2 s cyklofosfamidem, což je chemoterapeutická účinná látka spadající do třídy alkylačních činidel. Buňky 4T1 karcinomu prsu se tři dny před léčbou intravenózně injektovaly do těla imunokompetentních myší ve snaze založit plicní metastázy. Myši se léčily jednoduchou dávkou cyklofosfamidu (15 mg/kg, 40 mg/kg nebo 80 mg/kg) a o tři dny později se zahájila pětidenní léčba huKS-IL2 (15 μg/den). I přesto, že dvě nejnižší dávky při samotném podání cyklofosfamidu způsobily pouze mírnou redukci plicní metastatické záteže, kombinace s huKS-IL2 vedla k významnému snížení této nádorové zátěže, v porovnání s výsledkem dosaženým při podání samotného
01-3623-02-Ma
cyklofosfamidu (p <0,05, obr. 9). Nicméně při nejvyšší dávce (80 mg/kg) nedošlo k žádnému synergickému účinku.
ii. Zvýšený terapeutický účinek kombinace huKS-IL2 s cyklofosfamidem byl rovněž demonstrován v testu nádorového růstu prováděném u imunokompetentnich myši trpících subkutánně založenými nádory vyvolanými plicním karcinomem. Myši se léčily buď samotnou jedinou dávkou 80 mg/kg cyklofosfamidu, nebo touto dávkou použitou v kombinaci s pětidenní léčbou huKS-IL2 (30 pg) , která se zahájila tři dny po léčbě cyklofosfamidem. Průměrné objemy nádorů se v případě samostatně podaného huKS-IL2 a 80 mg/kg cyklofosfamidu redukovaly o 31 %, resp. o 69 % (obr. 9B) . Kombinovaná léčba zredukovala průměrné objemy nádorů v den 25 o 100 %, což je významně vyšší terapeutický účinek než v případě samostatného podání huKS-IL2 nebo cyklofosfamidu (p <0,05). Zvířata snášela léčbu ve všech případech velmi dobře a u všech skupin byla pozorována nižší než 10% ztráta hmotnosti.
iii. Zvýšený terapeutický účinek kombinace huKS-IL2 s cyklofosfamidem byl rovněž demonstrován v testu nádorového růstu prováděném u imunokompetentních myší trpících subkutánně založenými nádory vyvolanými plicním karcinomem. Myši se léčily buď samotnou jedinou dávkou 80 mg/kg cyklofosfamidu, nebo touto dávkou použitou v kombinaci s pětidenní léčbou huKS-IL2 (20 pg) , která se zahájila tři dny po léčbě cyklofosfamidem. Průměrné objemy nádorů se v případě samostatně podaného huKS-IL2 a 80 mg/kg cyklofosfamidu redukovaly o 2 %, resp. o 27 % (obr. 9C) . Kombinovaná léčba zredukovala průměrné objemy nádorů v den 20 o 48 %, což je významně vyšší terapeutický účinek než v případě samostatného podání huKS-IL2 nebo
01-3623-02-Ma cyklofosfamidu (p <0,05). Zvířata případech velmi dobře a u všech nižší než 10% ztráta hmotnosti.
snášela léčbu ve všech skupin byla pozorována
Příklad 11
Kombinovaná léčba pomocí huKS IL2 a alkylačního činidla
V tomto příkladu se demonstroval zvýšený terapeutický účinek huKS-IL2 a karboplatiny, což je další chemoterapeutické činidlo spadající do třídy alkylačních činidel. Myši trpící subkutánně založenými nemalými nádory karcinomu plicních buněk (LLC/KSA) se léčily karboplatinou (75 mg/kg v den 0), načež o tři dny později následovala pětidenní léčba KS-IL2 (20 pg/den). Léčba samotnou karboplatinou a samotným KS-IL2 způsobila mírné snížení nádorového růstu, avšak k významné redukci průměrného objemu nádoru došlo jedině v případě kombinované léčby v den 20 (p <0,05, obr. 10). Růst nádorů u myší, které byly léčeny kombinací zmiňovaných účinných látek byl výrazně nižší než při léčbě samotnou karboplatinou (p <0,05).
Každý výše uvedený patentový dokument a vědecká publikace jsou zde zabudovány formou odkazů.

Claims (27)

1. Použití imunocytokinů obsahujícího vazebné místo protilátky pro výrobu léčiva pro indukci cytocidní imunitní odpovědi proti nádoru u savce, kdy se tento imunocytokin podá společně s činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinů, které zesiluje imunitní odpovědi indukované imunocytokinem.
2. Použití podle nároku 1, kdy se vazebné místo protilátky váže na rakovinovou buňku.
3. Použití podle nároku 1, kdy se vazebné místo protilátky váže na antigen specifický pro nádor.
4. Použití podle nároku 1, kdy se činidlo zvyšující uptake imunocytokinů podává souběžně s imunocytokinem.
5. Použití podle nároku 1, kdy se činidlo zvyšující uptake imunocytokinů podává před podáním imunocytokinů.
6. Použití podle nároku 1, kdy vazebné místo protilátky obsahuje ve směru N-konec ->· C-konec imunoglobulinovou proměnnou oblast, CH1 doménu a CH2 doménu.
01-3623-02-Ma
7. Použiti podle nároku 6, kdy vazebné místo protilátky dále obsahuje CH3 doménu navázanou na C-konec CH2 domény.
8. Použití podle nároku 1, kdy imunocytokinem je fúzní protein obsahující ve směru N-konec -> C-konec (i) vazebné místo protilátky obsahující imunoglobulinovou proměnnou oblast schopnou navázat antigen buněčného povrchu předem zvoleného buněčného typu, imunoglobulinovou CH1 doménu, imunoglobulinovou CH2 doménu a (ii) cytokin.
9. Použití podle nároku 8, kdy vazebné místo protilátky dále obsahuje CH3 doménu zavedenou mezi CH2 doménu a cytokin.
10. Použití podle nároku 1, kdy se cytokin imunocytokinu zvolí z množiny sestávající z nádor nekrotizujícího faktoru, interleukinu, kolonie stimulující ho faktoru a lymfokinu.
11. Použití podle nároku 1, kdy činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu je taxan.
12. Použití podle nároku 11, kdy se taxan zvolí z množiny zahrnující Taxol, docetaxel, 10-deacetyl Baccatin III a jejich deriváty.
01-3623-02-Ma • · · · · ···· ·
I I I I I I II I ···· ··· ·· ··· ·· ·· 57
13. Použiti podle nároku 1, kdy činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu je alkylační chemoterapeutické činidlo.
14. Použití podle nároku 13, kdy se alkylační chemoterapeutické činidlo zvolí z množiny zahrnující cyklofosfamid, karboplatinu a jejich deriváty.
15. Použití podle nároku 1, kdy se savci podávají dvě nebo více různých činidel zvyšujících uptake imunocytokinu.
16. Použití podle nároku 1, kdy se savci podávají dva nebo více různých imunocytokinu.
17. Použití podle nároku 1, kdy se činidlo zvyšující uptake imunocytokinu podává přibližně 24 h před imunocytokinem.
01-3623-02-Ma
18. Kompozice pro indukci imunitní odpovědi proti nádoru u savce, vyznačující se tím, že obsahuje:
(i) imunocytokin obsahující vazebné místo protilátky cytokin a (ii) činidlo zvyšující uptake imunocytokinu.
19. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že vazebné místo protilátky obsahuje ve směru N-konec C-konec imunoglobulinovou proměnnou oblast, CH1 doménu a
CH2 doménu.
20. Kompozice podle nároku 19, vyznačující se tím, že vazebné místo protilátky dále obsahuje CH3 doménu navázanou na C-konci CH2 domény.
21. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že imunocytokinem je fúzní protein obsahující ve směru N-konec -> C-konec (i) vazebné místo protilátky obsahující imunoglobulinovou proměnnou oblast schopnou navázat antigen buněčného povrchu předem zvoleného buněčného typu, imunoglobulinovou CH1 doménu, imunoglobulinovou CH2 doménu a (ii) cytokin.
22. Kompozice podle nároku 21, vyznačující se tím, že vazebné místo protilátky dále zahrnuje CH3 doménu zavedenou mezi CH2 doménu a cytokin.
01-3623-02-Ma
23. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že je cytokin imunocytokinu zvolen z množiny sestávající z nádor nekrotizujícího faktoru, interleukinu, kolonie stimulujícího faktoru a lymfokinu.
24. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu je taxan.
25. Kompozice podle nároku 24, vyznačující se tím, že je taxan zvolen z množiny zahrnující Taxol, docetaxel, 10-deacetyl Baccatin III a jejich deriváty.
26. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu je alkylační chemoterapeutické činidlo.
27. Kompozice podle nároku 26, vyznačující se tím, že je alkylační chemoterapeutické činidlo zvoleno z množiny zahrnující cyklofosfamid, karboplatinu a jejich deriváty.
CZ2003214A 2000-06-29 2001-06-29 Zesílení odpovědi mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících uptake imunocytokinu CZ2003214A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21503800P 2000-06-29 2000-06-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2003214A3 true CZ2003214A3 (cs) 2003-08-13

Family

ID=22801380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2003214A CZ2003214A3 (cs) 2000-06-29 2001-06-29 Zesílení odpovědi mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících uptake imunocytokinu

Country Status (22)

Country Link
US (2) US7517526B2 (cs)
EP (1) EP1294401B1 (cs)
JP (1) JP5390055B2 (cs)
KR (1) KR20030064275A (cs)
CN (1) CN1270775C (cs)
AT (1) ATE368475T1 (cs)
AU (2) AU2001271729B2 (cs)
BR (1) BR0112111A (cs)
CA (1) CA2412845C (cs)
CZ (1) CZ2003214A3 (cs)
DE (1) DE60129695T2 (cs)
DK (1) DK1294401T3 (cs)
ES (1) ES2288967T3 (cs)
HU (1) HUP0300868A3 (cs)
MX (1) MXPA02012734A (cs)
NO (1) NO20026245L (cs)
PL (1) PL358582A1 (cs)
PT (1) PT1294401E (cs)
RU (1) RU2272644C2 (cs)
SK (1) SK982003A3 (cs)
WO (1) WO2002002143A2 (cs)
ZA (1) ZA200300759B (cs)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2221717T3 (es) 1997-12-08 2005-01-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Proteinas de fusion heterodimeras utiles para inmunoterapia dirigida e inmunoestimulacion general.
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
CN1318092C (zh) * 1998-04-15 2007-05-30 利思进药品公司 含有抗体－细胞因子融合蛋白和血管生成抑制剂的免疫治疗用组合物
KR20020018197A (ko) * 1999-05-19 2002-03-07 추후보정 Ｆｃ 융합 단백질로서의 인터페론-알파 단백질의 발현 및분비
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2001010912A1 (en) 1999-08-09 2001-02-15 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Multiple cytokine-antibody complexes
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
JP5179689B2 (ja) * 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
CZ2003214A3 (cs) * 2000-06-29 2003-08-13 Merck Patent Gmbh Zesílení odpovědi mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících uptake imunocytokinu
DK1366067T3 (da) 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
US20030190705A1 (en) 2001-10-29 2003-10-09 Sunol Molecular Corporation Method of humanizing immune system molecules
EP1454138B1 (en) 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
ATE471946T1 (de) * 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
KR101163424B1 (ko) 2003-12-30 2012-07-13 메르크 파텐트 게엠베하 Ｉｌ－７ 융합 단백질
EP1699821B1 (en) * 2003-12-31 2012-06-20 Merck Patent GmbH Fc-ERYTHROPOIETIN FUSION PROTEIN WITH IMPROVED PHARMACOKINETICS
CA2552590A1 (en) 2004-01-05 2005-07-21 Emd Lexigen Research Center Corp. Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
CA2553883C (en) * 2004-01-22 2013-04-02 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
CN101072793B (zh) * 2004-12-09 2012-06-20 默克专利有限公司 具有降低的免疫原性的il-7变体
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
WO2007045465A1 (en) 2005-10-21 2007-04-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the recombinant expression of a polypeptide
EP1960435A1 (en) * 2005-12-15 2008-08-27 Micromet AG Domain-grafted antibodies
AU2006332155B2 (en) 2005-12-30 2013-01-10 Cancer Research Technology Limited Anti-CD19 antibodies with reduced immunogenicity
SI1966238T1 (sl) * 2005-12-30 2012-08-31 Merck Patent Gmbh Variante interlevkina-12P40 z izboljšano stabilnostjo
TW200817438A (en) * 2006-08-17 2008-04-16 Hoffmann La Roche A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide
WO2008124086A2 (en) * 2007-04-05 2008-10-16 President And Fellows Of Harvard College Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
BRPI0812924A2 (pt) * 2007-06-28 2014-12-09 Philogen Spa Imunocitocinas para o tratamento de câncer em combinação com agentes quimioterapêuticos
AR067584A1 (es) * 2007-07-20 2009-10-14 Hoffmann La Roche Un conjugado de un anticuerpo contra la cd4 y peptidos antifusogenicos
EP2044949A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Immutep Use of recombinant lag-3 or the derivatives thereof for eliciting monocyte immune response
JP2012506394A (ja) * 2008-10-21 2012-03-15 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 放射線および免疫サイトカインによる癌治療
AU2010238858A1 (en) * 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites
RU2583876C2 (ru) * 2009-08-17 2016-05-10 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты направленного действия
US20120244145A1 (en) * 2009-11-16 2012-09-27 Duke University Enhanced immunological responses
US11492383B2 (en) 2011-06-24 2022-11-08 Stephen D. Gillies Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
GB201419184D0 (en) 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising biomolecule-effector/reporter-conjugates using affinity resins
US9139653B1 (en) 2015-04-30 2015-09-22 Kymab Limited Anti-human OX40L antibodies and methods of treatment
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US20200306301A1 (en) * 2017-07-03 2020-10-01 Torque Therapeutics, Inc. Polynucleotides Encoding Immunostimulatory Fusion Molecules and Uses Thereof
JP7765181B2 (ja) 2017-12-19 2025-11-06 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ－２ ｆｃ融合タンパク質
KR102884523B1 (ko) 2018-10-03 2025-11-10 젠코어 인코포레이티드 IL-12 이종이량체 Fc-융합 단백질
CN113811549A (zh) 2019-02-21 2021-12-17 Xencor股份有限公司 非靶向和靶向性il-10 fc融合蛋白
EP3969119A1 (en) 2019-05-17 2022-03-23 Xencor, Inc. Il-7-fc-fusi0n proteins
EP4037700A2 (en) 2019-10-03 2022-08-10 Xencor, Inc. Targeted il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
KR20220140514A (ko) 2020-01-10 2022-10-18 브라이트 피크 테라퓨틱스 아게 변형된 il-2 폴리펩타이드 및 그의 용도
AU2021254283B2 (en) * 2020-04-10 2025-12-11 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
KR20230157448A (ko) 2021-03-16 2023-11-16 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 마스킹된 활성화 가능한 사이토카인 작제물 및 관련 조성물 및 방법
AU2022307460A1 (en) * 2021-07-09 2024-01-04 Bright Peak Therapeutics Ag Checkpoint inhibitors conjugated to il-2, and uses thereof
KR20240034221A (ko) 2021-07-09 2024-03-13 브라이트 피크 테라퓨틱스 아게 염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료를 위한 변형된 il-2 폴리펩티드
US20230201364A1 (en) * 2021-07-09 2023-06-29 Bright Peak Therapeutics Ag Antibody conjugates and manufacture thereof
MX2024001877A (es) 2021-08-10 2024-02-28 Kymab Ltd Tratamiento de dermatitis atopica.

Family Cites Families (205)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196265A (en) * 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
DE2952486A1 (de) * 1978-12-26 1980-07-17 Canon Kk Elektrophotographisches verfahren und einrichtung zu dessen durchfuehrung
US4469797A (en) 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US5082658A (en) * 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
EP0158198A1 (en) 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
US5807715A (en) * 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US5643565A (en) * 1985-09-20 1997-07-01 Chiron Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4676980A (en) * 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5359035A (en) * 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
JPS63267278A (ja) 1986-03-14 1988-11-04 Toray Ind Inc インタ−フエロン結合体を暗号化する塩基配列
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4894227A (en) * 1986-08-01 1990-01-16 Cetus Corporation Composition of immunotoxins with interleukin-2
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5508031A (en) * 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
JP3101690B2 (ja) * 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
JPH02500329A (ja) 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
ATE122238T1 (de) 1987-06-10 1995-05-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Bifunktionelle antikörperkonstruktionen und verfahren zur selektiven tötung von zellbeständen.
US5064646A (en) 1988-08-02 1991-11-12 The University Of Maryland Novel infectious bursal disease virus
PH26813A (en) 1987-09-02 1992-11-05 Ciba Geigy Ag Conjugates of cytokines with immunoglobulins
CA1338518C (en) 1987-09-23 1996-08-13 Joyce M. Zarling Antibody heteroconjugates for the killing of hiv-infected cells
NZ226414A (en) 1987-10-02 1992-07-28 Genentech Inc Cd4 peptide adhesion variants and their preparation and use
AU2635088A (en) 1987-12-04 1989-06-08 Du Pont Merck Pharmaceutical Company, The Immobilized interleukin 2 and interleukin 2 containing a carboxyl-terminal extension
WO1989006692A1 (en) * 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
US5120525A (en) * 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
DE3812605A1 (de) 1988-04-15 1990-06-07 Leskovar Peter Dipl Ing Dr Hab Immunregulative stoffe und stoffgemische zur aktiven beeinflussung des krankheitsverlaufes
US4975369A (en) 1988-04-21 1990-12-04 Eli Lilly And Company Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen
IT1217724B (it) 1988-05-26 1990-03-30 Ist Naz Ric Sul Cancro Anticorpo monoclonale specifico per una sequenza di fibronettina espressa in cellule trasformate ibridoma secernente tale anticorpo e impiego dell'anticorpo monoclonale per la diagnosi di tumori
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
US5601819A (en) * 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
IL91933A (en) 1988-10-11 1994-12-29 Univ Southern California Vasoactive immunoconjugates useful for increasing the vascular permeability or the blood supply to neoplastic or otherwise diseased tissues
US5457038A (en) * 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US6750329B1 (en) * 1989-05-05 2004-06-15 Research Development Foundation Antibody delivery system for biological response modifiers
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US6291158B1 (en) * 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5399346A (en) * 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
DE69019609T2 (de) * 1989-07-07 1995-11-30 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren Herstellung.
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
DE69034022T2 (de) 1989-09-20 2003-07-10 Abbott Laboratories, Abbott Park Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen
US5856298A (en) * 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
DK0433827T3 (da) 1989-12-22 1998-09-28 Hoffmann La Roche Cytotoksisk lumfocytmodningsfaktor
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
EP0517754A1 (en) 1990-03-02 1992-12-16 Repligen Corporation Antibody constructs with enhanced binding affinity
DE69127749T2 (de) 1990-03-20 1998-04-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York, New York, N.Y. Chimäre antikörper mit rezeptor-bindenden liganden anstelle ihrer konstanten region
US5349053A (en) * 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
EP0541716A1 (en) 1990-07-27 1993-05-19 Repligen Corporation Novel methods and compositions for treatment of angiogenic diseases
ATE218889T1 (de) 1990-11-09 2002-06-15 Stephen D Gillies Cytokine immunokonjugate
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
WO1992008801A1 (en) 1990-11-09 1992-05-29 Abbott Laboratories Bridging antibody fusion constructs
DK0561907T3 (da) 1990-12-05 1999-05-31 Novo Nordisk As Proteiner med ændrede epitoper og fremgangsmåder til fremstilling deraf
US5709859A (en) * 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
GB9105245D0 (en) 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US5199942A (en) * 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
WO1993003157A1 (en) 1991-07-29 1993-02-18 Dana Farber Cancer Institute Plasmids for the rapid preparation of modified proteins
AU666866B2 (en) 1991-08-30 1996-02-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Hybrid cytokines
US20020037558A1 (en) * 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US5376367A (en) 1991-11-22 1994-12-27 Immunex Corporation Fusion proteins comprising MGF and IL-3
US6627615B1 (en) * 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
PT633929E (pt) 1992-04-01 2004-07-30 Merix Bioscience Inc Metodo para proliferacao (in vitro) de precursores de celulas dentifricas e sua utilizacao para produzir imunogenios
ATE311895T1 (de) * 1992-05-26 2005-12-15 Immunex Corp Neue zytokine die cd30 binden
EP0646178A1 (en) * 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
EP0671926B1 (en) * 1992-08-11 2002-11-13 President And Fellows Of Harvard College Immunomodulatory peptides
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
CA2126967A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 Anna M. Wu Novel antibody construct
EP1757695A3 (en) * 1992-11-05 2008-02-27 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US5738849A (en) * 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5543297A (en) * 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
US6096331A (en) * 1993-02-22 2000-08-01 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents
WO1994024160A2 (en) 1993-04-21 1994-10-27 Brigham And Women's Hospital Erythropoietin muteins with enhanced activity
US5759551A (en) * 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
WO1994025609A1 (en) 1993-04-28 1994-11-10 Hybritech Incorporated Method for creating optimized regulatory regions affecting protein expression and protein trafficking
KR960701650A (ko) 1993-04-29 1996-03-28 찰스 엠. 브룩 에리트로포이에틴 유사체 조성물 및 방법(Eythropoietin analog compositions and methods)
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
CA2125763C (en) * 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
GB9316989D0 (en) 1993-08-16 1993-09-29 Lynxvale Ltd Binding molecules
IL110669A (en) 1993-08-17 2008-11-26 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
DE69521789T2 (de) 1994-02-01 2002-04-25 The United States Of Amerika Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Fusionierte proteine die antikörper-teile und nicht-antikörper-teile enthalten
WO1995028427A1 (en) 1994-04-15 1995-10-26 Imclone Systems Incorporated Chimeric interleukin-3/mutein interleukin-6 lymphokine
US5639725A (en) * 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
CN1636594B (zh) * 1994-04-26 2012-08-29 儿童医学中心公司 血管生成抑制素和用于抑制血管生成的方法
DK0759944T3 (da) 1994-05-13 2001-11-26 Biovation Ltd Forbedringer af og relateret til peptidfremføring
CU22615A1 (es) * 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
CZ25697A3 (en) 1994-07-29 1997-09-17 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5888773A (en) * 1994-08-17 1999-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing single-chain Fv molecules
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5541087A (en) * 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
PT706799E (pt) 1994-09-16 2002-05-31 Merck Patent Gmbh Imunoconjugados ii
CA2205572A1 (en) 1994-12-12 1996-06-20 Beth Israel Hospital Association Chimeric cytokines and uses thereof
US6086875A (en) * 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5552524A (en) * 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5891680A (en) * 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
EP0815224B1 (en) * 1995-03-10 2004-07-21 Genentech, Inc. Receptor activation by gas6
US5719266A (en) * 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
AU5539596A (en) 1995-04-06 1996-10-23 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Anti-obesity agents
US6281010B1 (en) * 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
WO1997000317A1 (en) 1995-06-07 1997-01-03 Osteosa Inc. Osteoclast growth regulatory factor
AU5893796A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
GB9511935D0 (en) 1995-06-13 1995-08-09 Smithkline Beecham Plc Novel compound
AU695934B2 (en) * 1995-06-30 1998-08-27 Eli Lilly And Company Methods for treating diabetes
US6406689B1 (en) * 1995-10-03 2002-06-18 Frank W. Falkenberg Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases
EP0857210B1 (en) 1995-10-23 2003-09-03 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US5678543A (en) * 1995-11-16 1997-10-21 Portable Hyperbarics, Inc. Hyperbaric chamber
AU1407997A (en) 1995-12-01 1997-06-19 Beth Israel Hospital Il-12 p40 subunit fusion polypeptides and uses thereof
IL124831A0 (en) 1995-12-27 1999-01-26 Genentech Inc Ob protein derivatives having prolonged half-life
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6080409A (en) * 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US7063958B1 (en) 1996-01-16 2006-06-20 The Rockefeller University Nucleic acids db, the receptor for leptin
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
WO1997030089A1 (en) 1996-02-13 1997-08-21 Regents Of The University Of California Novel antibody-cytokine fusion protein, and methods of making and using the same
US5756541A (en) 1996-03-11 1998-05-26 Qlt Phototherapeutics Inc Vision through photodynamic therapy of the eye
AU2527397A (en) 1996-03-13 1997-10-01 Protein Design Labs, Inc. Fas ligand fusion proteins and their uses
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
WO1997043316A1 (en) 1996-05-10 1997-11-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Physiologically active molecules with extended half-lives and methods of using same
CA2205757C (en) * 1996-05-30 2006-01-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Pyridazinone derivatives and their use as inhibitors of prostaglandin g/h synthase i and ii(cox i and ii)
US5922685A (en) * 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
WO1998000127A1 (en) 1996-07-02 1998-01-08 Bar-Ilan University Retinoyloxy(substituted)alkylene butyrates useful for the treatment of cancer and other proliferative diseases
WO1998006752A1 (en) 1996-08-16 1998-02-19 The Rockefeller University A leptin binding protein and its use in methods for diagnosing and treating abnormalities of the endogenous leptin pathway
EP0826696B1 (de) * 1996-09-03 2002-05-29 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität
EP0930892A1 (en) * 1996-10-16 1999-07-28 The Johns Hopkins University Cytokine enhanced immunotherapy for brain tumors
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
EP1835030A1 (en) 1996-12-20 2007-09-19 Amgen, Inc. OB fusion protein compositions and methods
US6737057B1 (en) 1997-01-07 2004-05-18 The University Of Tennessee Research Corporation Compounds, compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors
US6100387A (en) * 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2284726A1 (en) * 1997-04-11 1998-10-22 G.D. Searle & Co. Antagonistic anti-avb3 integrin antibodies
IL132380A0 (en) 1997-04-17 2001-03-19 Amgen Inc Compositions comprising conjugates of stable active human ob protein with antibody fc chain and methods
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
GB9712892D0 (en) 1997-06-20 1997-08-20 Eclagen Ltd Identification of mhc binding peptides
WO1999002709A1 (en) 1997-07-10 1999-01-21 Beth Israel Deaconess Medical Center Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins
ATE375363T1 (de) 1997-07-14 2007-10-15 Bolder Biotechnology Inc Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
ES2221717T3 (es) * 1997-12-08 2005-01-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Proteinas de fusion heterodimeras utiles para inmunoterapia dirigida e inmunoestimulacion general.
BR9908226A (pt) 1998-02-25 2000-10-24 Lexigen Pharm Corp Melhoramento da meia vida de circulação de proteìnas de fusão com base em anticorpo
US20030105294A1 (en) 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
CN1318092C (zh) * 1998-04-15 2007-05-30 利思进药品公司 含有抗体－细胞因子融合蛋白和血管生成抑制剂的免疫治疗用组合物
HK1038881A1 (zh) 1998-04-17 2002-04-04 利思进药品公司 通过共同给予前列腺素抑制剂增强抗体-细胞因子融合蛋白介导的免疫应答
AU3655899A (en) * 1998-04-20 1999-11-08 Regents Of The University Of California, The Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof
WO1999058662A1 (fr) 1998-05-14 1999-11-18 Merck Patent Gmbh Proteine fusionnee
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6620382B1 (en) * 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
CA2331370A1 (en) 1998-06-03 1999-12-09 The Children's Medical Center Corporation Protein oligomer compositions comprising endostatin protein and methods of using the same
DK1088084T3 (da) 1998-06-15 2007-01-29 Gtc Biotherapeutics Inc Erythropoietin analog-humant serumalbumin fusionsprotein
GB9814383D0 (en) 1998-07-02 1998-09-02 Cambridge Antibody Tech Improvements relating to antibodies
JP2002522063A (ja) 1998-08-17 2002-07-23 アブジェニックス インコーポレイテッド 増加した血清半減期を有する改変された分子の生成
JP2002523036A (ja) 1998-08-25 2002-07-30 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション イムノフュージンとしての新脈管形成インヒビターの発現および輸送
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) * 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
DE69935345T3 (de) 1998-10-23 2018-03-01 Amgen Inc. Methoden und zusammensetzungen zur prävention und behandlung der anämie
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
MXPA01006922A (es) 1999-01-07 2002-04-24 Lexigen Pharm Corp Expresion y exportacion de proteinas de anti-obesidad como proteinas de fusion en fc.
KR100773109B1 (ko) 1999-05-06 2007-11-02 웨이크 포리스트 유니버시티 면역 반응을 유발하는 항원을 동정하기 위한 조성물과 방법
EP1177285A1 (en) 1999-05-07 2002-02-06 Genentech, Inc. Chimpanzee erythropoietin (chepo) polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6348192B1 (en) * 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
KR20020018197A (ko) 1999-05-19 2002-03-07 추후보정 Ｆｃ 융합 단백질로서의 인터페론-알파 단백질의 발현 및분비
WO2000078334A1 (en) 1999-06-17 2000-12-28 University Of Maryland Biotechnology Institute Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor
PE20010288A1 (es) * 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2001010912A1 (en) 1999-08-09 2001-02-15 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Multiple cytokine-antibody complexes
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
US8623373B2 (en) * 2000-02-24 2014-01-07 Philogen S.P.A. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
NZ522320A (en) 2000-05-12 2007-03-30 Neose Technologies Inc In vitro modification of glycosylation patterns of recombinant glycopeptides
CZ2003214A3 (cs) 2000-06-29 2003-08-13 Merck Patent Gmbh Zesílení odpovědi mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících uptake imunocytokinu
WO2002057435A2 (en) * 2001-01-18 2002-07-25 Merck Patent Gmbh Bifunctional fusion proteins with glucocerebrosidase activity
JP4279554B2 (ja) * 2001-02-19 2009-06-17 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｔ細胞エピトープの識別方法および低減された免疫原性を有する分子の製造方法
PL362324A1 (en) * 2001-02-19 2004-10-18 Merck Patent Gmbh Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
DK1366067T3 (da) 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
CA2456470A1 (en) 2001-08-13 2003-02-27 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
EP1454138B1 (en) 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
CA2479212A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
US6996009B2 (en) * 2002-06-21 2006-02-07 Micron Technology, Inc. NOR flash memory cell with high storage density
ATE471946T1 (de) * 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA02012734A (es) 2003-04-25
HUP0300868A2 (hu) 2003-07-28
US7517526B2 (en) 2009-04-14
EP1294401A2 (en) 2003-03-26
JP5390055B2 (ja) 2014-01-15
JP2004501981A (ja) 2004-01-22
US20100297060A1 (en) 2010-11-25
ES2288967T3 (es) 2008-02-01
SK982003A3 (en) 2004-05-04
NO20026245D0 (no) 2002-12-27
PL358582A1 (en) 2004-08-09
CA2412845C (en) 2014-07-22
AU2001271729B2 (en) 2007-01-04
DK1294401T3 (da) 2007-10-08
CN1529619A (zh) 2004-09-15
HUP0300868A3 (en) 2005-11-28
WO2002002143A2 (en) 2002-01-10
US20030049227A1 (en) 2003-03-13
CN1270775C (zh) 2006-08-23
RU2272644C2 (ru) 2006-03-27
ATE368475T1 (de) 2007-08-15
NO20026245L (no) 2003-02-26
CA2412845A1 (en) 2002-01-10
WO2002002143A3 (en) 2002-07-18
PT1294401E (pt) 2007-11-09
AU7172901A (en) 2002-01-14
ZA200300759B (en) 2004-04-28
EP1294401B1 (en) 2007-08-01
BR0112111A (pt) 2003-05-06
DE60129695D1 (de) 2007-09-13
KR20030064275A (ko) 2003-07-31
DE60129695T2 (de) 2008-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7517526B2 (en) Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
AU2001271729A1 (en) Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
CZ20003767A3 (cs) Kompozice pro indukci imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buňek v organismu savce a její pouľití pro výrobu léčiva
CZ20003817A3 (cs) Léčivo pro indukci cytocidní imunitní odpovědi
JP2012506394A (ja) 放射線および免疫サイトカインによる癌治療
HK1065262A (en) Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
KR20250175725A (ko) Cd80 단백질 및 il-2 단백질을 포함하는 융합단백질 및 항체-약물 접합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물