JP2000513016A - 置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドが開示されており、これは、以下の構造を有する： ここで、Xは、アミノアルカン酸、アルキルアミノ安息香酸、α-アミノ酸、および4-アミノ-2-ブチン酸からなる群から選択される。R₁およびR₂は、別個に、−H、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される；R₃は、−Hおよび低級アルキルからなる群から選択される。Bは、7-デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である。Bがプリンまたは7-デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのN⁹位にて結合しており、Bがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのN¹位にて結合している。Bがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、このプリンの8位に結合しており、Bが7-デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、この7-デアザプリンの7位に結合しており、Bがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、このピリミジンの5位に結合している。W₁は、−Hおよび−OHからなる群から選択される。W₂は、−OH、またはこのヌクレオシドがその3'位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である。W₃は、−PO₄、-P₂O₇、-P₃O₁₀、ホスフェートアナログ、および−OHからなる群から選択される。さらに、プライマー伸長方法が提供され、これは、上記X置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドを使用し、そして、上記X置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドを含有するポリヌクレオチドが提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド 発明の分野 本発明は、一般に、ポリメラーゼ酵素の基質として有用なヌクレオチド化合物 、プライマー伸長反応でこのようなヌクレオチド化合物を使用する方法、および このようなヌクレオチド化合物を含有するポリヌクレオチドに関する。 参考文献 背景 核酸配列決定は、現代の生物学および生物工学において必須の重要な技術とな っており、基本的な生物研究から薬剤の発見や臨床医学までの範囲の分野に関連 した情報を提供する。大容量のDNA配列データが収集されているので、核酸配列 決定法のスループットを高めると共にコストを下げるために、自動化技術が開発 されている(Smith；Connell；Trainor)。 好ましい自動化核酸配列決定法は、Sangerにより開発された酵素複製技術に基 づいている(Sanger)。Sangerの方法では、一本鎖テンプレート核酸の配列は、一 組のポリヌクレオチドフラグメントを合成するための核酸ポリメラーゼを用いて 決定され、ここで、このフラグメントは、(i)このテンプレート配列に対する配 列相補性を有し、(ii)単一ヌクレオチドにより長さが変わり、そして(iii)公知 のヌクレオチド(例えば、A、C、GまたはT)での5'-末端終止を有する。この方法 では、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定されるテンプレート核酸の3' -末端にアニールされ、このプライマーの3'-末端は、相補的ポリヌクレオチドフ ラグメントのポリメラーゼ媒介重合に対する開始部位として、役立つ。この酵素 的重合工程は、このテンプレート−プライマーハイブリッドと４個の天然デオキ シヌクレオチド(「dNTP」)、核酸ポリメラーゼ酵素および2',3'-ジデオキシヌク レオチド三リン酸(「ddNTP」)「ターミネーター」とを組み合わせることにより 、行われる。このターミネーターの組み込みは、この3'-末端の水酸基を欠いた フラグメントを形成し、それゆえ、このポリメラーゼによって、さらに伸長され 得ない(すなわち、このフラグメントは、「終止されている」)。組込みのための ddNTPおよびその対応dNTPの間の競合の結果、異なるサイズのフラグメントが分 配され、各フラグメントは、この反応で使用される特定のターミネーターで終止 される。このテンプレート核酸の完全な配列を発見するために、４個の並発反応 が行われ、各反応は、異なるddNTPターミネーターを使用する。これらのフラグ メントのサイズ分配を決定するために、これらのフラグメントは、サイズが異な るフラグメントを単一ヌクレオチドによって分割するように、電気泳動により分 離される。 古典的なSanger法の現代版変形法では、このヌクレオチドターミネーターは、 蛍光色素で標識され(Prober；Hobbs)、熱安定性のDNAポリメラーゼ酵素が使用さ れる(Murray)。色素標識したターミネーターを使用することにより、以下のいく つかの利点が得られる：(i)放射性同位体の貯蔵、使用および廃棄に付随した問 題がなくなる；(ii)色素標識したプライマーを合成する必要性がなくなる；およ び(iii)各A、G、CまたはTヌクレオチド用に異なる色素標識を使用するとき、単 一の管にて、４個の反応の全てを同時に行うことができる。熱安定性のポリメラ ーゼ酵素を使用することにより、(i)この重合反応を高温で行うことが可能にな り、それにより、このテンプレートのいずれかの二次構造が分断され、その結果 、より少ない配列依存性アーチファクトが得られ、そして、(ii)この配列決定反 応が熱サイクルでき、それにより、生成する伸長生成物の量を線形的に増幅させ るのに役立ち、それゆえ、配列を得るのに必要なDNAテンプレートの量が低減さ れる。 Sanger配列決定法のこれらの現代版変形法は、効果的であることが証明されて いるものの、それらの性能および経済性を最適化することに関して、いくつかの 問題点が残っている。Sanger型核酸配列決定法で熱安定性のポリメラーゼ酵素と 組み合わせて現在入手できる色素標識ターミネーターを使用するとき、特に、フ ルオレセイン型色素標識の場合に遭遇する１つの問題点には、50：１の比まで、 非標識dNTPよりも大過剰の色素標識ターミネーターが必要なことがある。この大 過剰の標識ターミネーターにより、この電気泳動分離工程を行う前に、この配列 決定反応生成物を精製する必要が生じる。この清浄化(clean-up)工程は、組み込 まれていない標識化ターミネーター種および真正の配列決定フラグメントの同時 移入により起こる干渉を回避するために、必要である。典型的な清浄化方法には 、エタノール沈殿またはクロマトグラフィー分離が含まれる(ABI PRISM^TM Dye T erminator Cycle Sequencing Core Kit Protocol)。このような清浄化工程は、 完全に自動化した配列決定系(ここで、その配列決定反応生成物は、電気泳動分 離プロセスに直接移される)を開発する仕事を著しく複雑にする。 Sanger型核酸配列決定法で熱安定性のポリメラーゼと組み合わせて現在入手で きる色素標識ターミネーターを使用するとき遭遇する第二の問題点には、これら の反応生成物を電気泳動により分離し蛍光検出を用いて検出するとき、ピーク高 さの不均一な分布が得られることがある。このような不均一なピーク高さは、自 動化した配列測定およびヘテロ接合体の検出を実質的に信頼できないものとする ために、不利である。 要旨 本発明は、プライマー伸長反応(例えば、Sanger型DNA配列決定反応またはPCR 反応)において、鎖終止ヌクレオチドおよび鎖伸長ヌクレオチドとして有用な、 新規なクラスの置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドの本発明者らによ る発見に関する。 本発明の目的は、標識した鎖終止ヌクレオチドを形成するのに使用できるヌク レオチドを提供することにある。 本発明のさらなる目的は、標識を含む鎖終止ヌクレオチドを提供することにあ る。 本発明のなおさらなる目的は、蛍光標識を含む鎖終止ヌクレオチドであって、 Sanger型DNA配列決定法において、非標識の鎖終止ヌクレオチドよりも低い過剰 濃度のこのような標識した鎖終止ヌクレオチドを必要とするものを提供すること にある。 本発明の別の目的は、Sanger型DNA配列決定法において、ピーク高さのより均 一な分布が得られる標識した鎖終止ヌクレオチドを提供することにある。 本発明の目的は、標識した鎖伸長ヌクレオチドを形成するのに使用できるヌク レオチドを提供することにある。 本発明のさらなる目的は、標識を含む鎖伸長ヌクレオチドを提供することにあ る。 本発明の別の目的は、標識したポリヌクレオチドを提供することにある。 本発明のさらなる目的は、本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオ チドを使用するプライマー伸長反応を包含する方法を提供することにある。 第一の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、以下の構造を有する ヌクレオシド化合物により、達成される： ここで、Xは、 ここで、ｎは、１〜５の範囲である、 ここで、ｎは、１〜５の範囲である、 および からなる群から選択される；そしてR₁およびR₂は、別個に、−H、低級アルキル 、保護基、および標識からなる群から選択される。R₃は、−Hおよび低級アルキ ルからなる群から選択される。Bは、7-デアザプリン、プリン、またはピリミジ ンヌクレオシド塩基であり、ここで、Bがプリンまたは7-デアザプリンのとき、 その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのN⁹位にて結合しており、Bがピ リミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのN¹位にて結合しており、Bが プリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、このプリンの8位に結合しており 、Ｂが7-デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、この7-デアザプリ ンの7位に結合しており、Bがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、 このピリミジンの5位に結合している。W₁は、−Hおよび−OHからなる群から選択 される；W₂は、−OH、またはこのヌクレオシドがその3'位でホスホジエステル結 合を形成できなくする部分である；そしてW₃は、−PO₄、−P₂O₇、−P₃O₁₀、ホス フェートアナログ、および−OHからなる群から選択される。 本発明の第一の局面の第一の好ましい実施態様では、R₁およびR₂の１個は、標 識であり、より好ましくは、この標識は、フルオレセイン型色素、ローダミン型 色素またはFLAN型色素である。 本発明の第一の局面の第二の好ましい実施態様では、W₁は、−Hである；W₂は 、−OH、またはその3'位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である ；そしてW₃は、−P₃O₁₀である。より好ましくは、W₂は、−OH、−H、アジド、ア ミノ、フルオロおよびメトキシからなる群から選択される。 本発明の第一の局面の第三の好ましい実施態様では、Bは、ウラシル、シトシ ン、7-デアザアデニンおよび7-デアザグアノシンからなる群から選択される。 本発明の第一の局面の第四の好ましい実施態様では、Xは、 であり、ｎ＝１であり、そしてΦ基は、パラ立体配置にある。 第二の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、プライマー伸長反応 を行う方法により達成され、この方法は、テンプレート核酸を提供する工程;こ のテンプレート核酸の一部にオリゴヌクレオチドプライマーをアニールする工程 ;およびこのプライマーを伸長するために、このプライマー−テンプレートハイ ブリッドに、プライマー伸長試薬を添加する工程を包含し、このプライマー伸長 試薬は、上記の本発明の第一局面のヌクレオシド化合物を含有する。 第三の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、上記の本発明の第一 の局面のヌクレオシド化合物を含有するポリヌクレオチドにより、達成される。 図面の簡単な説明 図1A〜1Cは、種々の濃度の色素標識ターミネーターを用いたターミネーター滴 定アッセイから得た結果を示す。 図２は、2-フタルイミドエタノール(3)および3-(2-フタルイミドエトキシ)プ ロピン(5)の合成を示す。 図３は、5-{3-(2-フタルアミドエトキシ)プロピン-1-イル}-2',3'-ジデオキシ シチジン(7)および5-{3-(2-トリフルオロアセトアミドエトキシ)プロピン-1-イ ル}-2',3'-ジデオキシシチジン(8)の合成を示す。 図４は、5-{3-(2'-トリフルオロアセトアミドエトキシ)プロピン-1-イル}-2', 3'-ジデオキシシチジン一リン酸(10)の合成を示す。 図５は、5-{3-(2-トリフルオロアセトアミドエトキシ)プロピン-1-イル}-2',3 '-ジデオキシシチジン三リン酸(12)および5-{3-(2-アミドエトキシ)プロピン-1- イル}-2',3'-ジデオキシシチジン三リン酸(13)の合成を示す。 図6A〜Cは、トリフルオロアセトアミドグリシンNHSエステル(15)、4-(トリフ ルオロアセトアミドメチル)安息香酸NHSエステル(18)、およびトリフルオロアセ トアミドブト-2-イノイックNHSエステル(21)の合成を示す。 図７は、5-[3-{2-[N-(2-アミノアセチル)]アミノエトキシ}プロピン-1-イル]- 2',3'-ジデオキシシチジン三リン酸(23)の合成を示す。 図８は、5-[3-{2-[N-(4-アミノメチルベンゾイル)]アミノエトキシ}プロビン- 1-イル]-2',3'-ジデオキシシチジン三リン酸(25)の合成を示す。 図９は、5-[3-{2-[N-(2-アミノ-ブト-2-イノイック)]アミノエトキシ}プロピ ン-l-イル]-2',3'-ジデオキシシチジン三リン酸(27)の合成を示す。 図10は、３個の異なる色素ターミネーター配列決定反応から得た結果を示し、 ここで、各反応は、色素をターミネーターに結合する異なるリンカーを使用した 。 好ましい実施態様の詳細な説明 ここで、本発明の好ましい実施態様に対して、詳細な参照がなされ、その実施 例は、添付の図面に例示されている。本発明は、その好ましい実施態様に関連し て記述されているものの、それらは、本発明をこれらの実施態様に限定する意図 はないことが分かる。反対に、本発明は、その代替、改変および等価物を含むこ とを意図しており、これらは、添付の請求の範囲で規定される本発明の範囲内に 含まれ得る。 一般に、本発明は、ポリメラーゼ酵素に対して基質として有用な新規な種類の 置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド化合物、このようなヌクレオシド 化合物を含むポリヌクレオチド、およびプライマー伸長反応においてこのような ヌクレオシド化合物を使用する方法を包含する。本発明の化合物は、Sanger型DN A配列決定法で使用する色素標識ヌクレオチド鎖終止試薬の調製、およびプライ マー伸長反応(例えば、PCR)を含む方法で使用する色素標識ヌクレオチド鎖伸長 試薬の調製において、特定の用途が見出されている。 本発明は、一部には、目的の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドが 、熱安定性DNAポリメラーゼ酵素用の特に良好な基質であること、すなわち、(i) Sa nger型DNA配列決定反応にて、現在入手できる標識ターミネーターを使用したと きに必要なものと比較して、著しく低いモル過剰しか必要としないこと、および (ii)Sanger型DNA配列決定プロセスにて、現在入手できる標識ターミネーターを 使用したときに見られるものと比較して、ピーク高さのより均一な分布が見られ ることの発見に基づいている。Ｉ．定義 他に述べられていなければ、本明細書中で使用する以下の用語および語句は、 以下の意味を有することを意図している： 「低級アルキル」との用語は、１個〜８個の炭素原子を含有する直鎖および分 枝炭化水素部分(すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、tert-ブ チル、イソブチル、sec-ブチル、ネオペンチル、tert-ペンチルなど)を表わす。 「標識」との用語は、本発明のヌクレオシドに結合したとき、このようなヌク レオシドおよびこのようなヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを、公知の 検出手段を用いて検出可能にする部分を意味する。例示の標識には、蛍光体、発 色団、放射性同位元素、スピン標識、酵素標識、化学発光標識など(これらは、 適切な検出器による標識化合物の直接的な検出を可能にする)、またはリガンド 、例えば、抗原またはビオチン(これは、検出可能な抗リガンド(例えば、標識抗 体またはアビジン)に、高い親和性で特異的に結合できる)が挙げられる。好まし くは、これらの標識は、蛍光色素(例えば、フルオレセイン型色素またはローダ ミン型色素(Lee；Menchen))である。 「ヌクレオシド」との用語は、2'-デオキシ形状および2'-ヒドロキシル形状を 含めて、その1'位でペントースに結合したプリン、デアザプリンまたはピリミジ ンヌクレオシド塩基(例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミ ン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど)からなる化合物を意味する(Stryer )。本明細書中で使用する「ヌクレオチド」との用語は、ヌクレオシドのリン酸 エステル(例えば、三リン酸エステル)を意味し、ここで、最も一般的なエステル 化部位は、このペントースのC-5位に結合した水酸基である。多くの場合、本発 明の開示では、ヌクレオシドとの用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両 方を包含することを意図している。ヌクレオシドに関する「アナログ」には、例 えば、他の文献で記述のように(Scheit；Eckstein 1991)、変性塩基部分、変性 糖部分および/または変性リン酸エステル部分を有する合成アナログが挙げられ る。 本明細書中で使用する「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」と の用語は、天然ヌクレオチドモノマーまたはそれらのアナログの線状ポリマーを 意味し、これには、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌク レオチド、それらのα−アノマー形状などが含まれる。通常、このヌクレオシド モノマーは、ホスホジエステル連結により連結されており、本明細書中で使用す る「ホスホジエステル連結」との用語は、ホスホジエステル結合またはそれらの ホスフェートアナログを含む結合を意味し、これらには、会合した対イオンが存 在するなら、このような対イオン(例えば、H、NH₄、Naなど)を含む。このポリヌ クレオチドの大きさは、典型的には、数個(例えば、８個〜40個)のモノマー単位 から、数千個のモノマー単位までに及ぶ。ポリヌクレオチドが「ATGCCTG」のよ うな一連の文宇で表わされるときは、このヌクレオチドは、他に指示がなければ 、5'→3'の順序で左から右に配列されており、「A」は、デオキシアデノシンを 表わし、「C」は、デオキシシチジンを表わし、「G」は、デオキシグアノシンを 表わし、そして「T」は、チミジンを表わすことが分かる。 「ホスフェートアナログ」との用語は、ホスフェートのアナログであって、こ こでそのリン原子が＋５酸化状態であり、そしてその酸素原子の１個またはそれ 以上が非酸素部分で置き換えられているものを意味し、例示のアナログには、ホ スホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジ セレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロア ミデート、ボロノホスフェートなど(会合した対イオン(例えば、H、NH₄、Naなど )があれば、このような対イオンを含めて)が挙げられる。 本明細書中で使用される「プロパルギルアミドリンカー」との用語は、以下の 構造を有するリンカーを意味する： また、「プロパルギルエトキシアミドリンカー」との用語は、以下の構造を有す るリンカーを意味する： ここで、上記構造のそれぞれについて、そのアセチレンの終止末端は、ヌクレオ チド塩基に結合しており、そしてそのアミド窒素は、標識との好都合な連結を介 して、結合される。 本発明の「X」部分に関連して、「アミノアルカン酸」との用語は、以下の構 造を意味する：ここで、ｎは、１〜５の範囲である；「アルキルアミノ安息香酸」との用語は、 以下の構造を意味する： ここで、ｎは、１〜５の範囲である；「α-アミノ酸」との用語は、以下の構造 を意味する： そして「4-アミノ-2-ブチン酸」との用語は、以下の構造を意味する： ここで、上記構造では、R₁およびR₂は、別個に、−H、低級アルキル、保護基ま たは標識であり、そしてR₄は、アミノ酸側鎖(天然(Stryer)または合成のいずれ か)である。 「プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのヌ クレオ塩基に結合したプロパルギルエトキシアミドリンカーを含むヌクレオチド を意味する。 「フルオレセイン型色素」との用語は、以下の縮合三環系を含有する種類のキ サンテン色素分子を意味する： ここで、各デオキシ環位置では、広範囲の置換が可能である。フルオレセイン型 色素の特に好ましいサブセットには、4,7-ジクロロフルオレセイン(Menchen)が 挙げられる。DNA配列決定法で蛍光標識として使用されるフルオレセイン型色素 の例には、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、5-カルボキシフルオレセイン( 5-FAM)、6-カルボキシ-4,7,2',7'-テトラクロロフルオレセイン(TET)、6-カルボ キシ-4,7,2',4',5',7'-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、5-(および6)カルボ キシ-4',5'-ジクロロ-2',7−ジメトキシフルオレセイン(JOE)、および5-カル ボキシ-2',4',5',7'-テトラクロロフルオレセイン(ZOE)が包含される。多くの場 合、-1または-2との名称は、特定の色素(例えば、HEX-1)の略語の後で、付けら れる。この「−1」および「-2」との名称は、使用する特定の色素異性体を意味 する。これらの１および２異性体は、C-8カラムおよび溶出勾配(15％アセトニト リル/85％0.1M酢酸トリエチルアンモニウム〜35％アセトニトリル/65％0.1M酢酸 トリエチルアンモニウム)を使用する逆相クロマトグラフィー分離系にて、遊離 色素の溶出順序(この１異性体が最初に溶出する)により、定義される。 「ローダミン型色素」との用語は、以下の縮合三環系を含有する種類のキサン テン色素分子を意味する： ここで、好ましくは、Y₁〜Y₄は、別個に、水素または低級アルキルであり、また は一緒になって、Y₁およびR₂は、プロパノであり、そしてY₂およびR₁は、プロパ ノであるか、または一緒になって、Y₃およびR₃は、プロパノであり、そしてY₄お よびR₄は、プロパノである。R₁〜R₄位置を含めた各デオキシ環位置にて、広範囲 の置換が可能である。ヌクレオシド標識として有用な例示のローダミン型色素に は、テトラメチルローダミン(TAMRA)、4,7-ジクロロテトラメチルローダミン(DT AMRA)、ローダミンＸ(ROX)、ローダミン6G(R6G)、ローダミン110(R110)などが挙 げられる(Bergot；Lee)。 本明細書中で使用する「FLAN色素」との用語は、次式を有する非対称ベンゾキ サンテン色素化合物を意味する：ここで、Y₁およびY₂は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミニウムまたはアミン である。R₁〜R₈は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン 、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、ア ルコキシ、連結基、またはそれらの組合せである。そして、R₉は、アセチレン、 アルカン、アルケン、シアノ、置換フェニル、またはそれらの組合せ、以下の構 造を有する置換フェニルである： ここで、X₁は、カルボン酸またはスルホン酸である；X₂およびX₅は、別個に、水 素、塩素、フッ素または低級アルキルである；そしてX₃およびX₄は、別個に、水 素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸または連結基である (Benson)。 本明細書中で使用する「プライマー伸長試薬」との用語は、オリゴヌクレオチ ドプライマーの酵素的テンプレート媒介の伸長を起こすのに必要な成分を含有す る試薬を意味する。プライマー伸長試薬には、以下が挙げられる：(i)ポリメラ ーゼ酵素、例えば、熱安定性ポリメラーゼ酵素(例えば、Taqポリメラーゼ)；(ii )緩衝液；(iii)鎖伸長ヌクレオチド、例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸 （例えば、ジオキシグアノシン5'-三リン酸、7-デアザデオキシグアノシン5'-三 リン酸、デオキシアデノシン5'-三リン酸、デオキシチミジン5'-三リン酸、デオ キシシチジン5'-三リン酸）；および必要に応じて、Sanger型DNA配列決定反応の 場合に、(iv)１個またはそれ以上の鎖終止ヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌ クレオチド三リン酸(例えば、ジデオキシグアノシン5'-三リン酸、7-デアザジデ オキシグアノシン5'-三リン酸、ジデオキシアデノシン5'-三リン酸、ジデオキチ ミジン5'-三リン酸、およびジデオキシシチジン5'-三リン酸)。 「テンプレート核酸」とは、単一鎖形状で提示できる任意の核酸であって、プ ライマーオリゴヌクレオチドでアニールできるものを意味する。例示のテンプレ ート核酸には、DNA、RNAが挙げられ、このDNAまたはRNAは、一本鎖または二本鎖 であり得る。さらに特定すると、テンプレート核酸は、ゲノムDNA、メッセンジ ャーRNA、cDNA、PCR反応に由来のDNA増幅生成物などであり得る。テンプレートD NAの調製方法は、他の文献に見られ得る(ABI PRISM^TM Dye Primer Cycle Sequen cing Core Kit)。II ．置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド化合物 第一の局面では、本発明は、すぐ下の式Ｉで示す一般構造を有する新規なクラ スの置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド化合物を包含する。(本開示 全体で提供された全ての分子構造は、提示した正確な電子構造だけでなく、それ らの全ての共鳴構造およびプロトン化状態を含むことを意図することに留意のこ と)。 式Ｉの構造では、Bは、7-デアザプリン、プリンまたはピリミジンヌクレオチ ド塩基であり、好ましい実施態様では、Bは、ウラシル、シトシン、7-デアザア デニンおよび7-デアザグアノシンからなる群から選択される。Bがプリンまたは7 -デアザプリンのとき、このヌクレオチドの糖部分は、このプリンまたはデアザ プリンのN⁹位にて結合され、Bがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミ ジンのN¹位にて結合される。Bがプリンのとき、隣接三重結合炭素は、このプリ ンの8位に結合され、Bが7-デアザプリンのとき、隣接三重結合炭素は、7-デアザ プリンの7位に結合され、Bがピリミジンのとき、隣接三重結合炭素は、このピリ ミジンの5位に結合される。 W₁は、−Hおよび−OHから選択される。W₁が−OHであるとき、このヌクレオシ ドは、リボヌクレオチドであり、そしてW₁が−Hであるとき、このヌクレオシド は、デオキシリボヌクレオチドである。 W₂は、−OH、またはこのヌクレオシドがその3'位でホスホジエステル結合を形 成できなくする部分である。この機能に有用な好ましい部分には、−H、アジド 、アミノ、ハロ、メトキシなどが挙げられる。特に好ましい実施態様では、W₂は 、−Hまたはフルオロである。 W₃は、−PO₄、−P₂O₇、−P₃O₁₀、ホスフェートアナログ、および−OHからなる 群から選択される。ポリヌクレオチドの酵素的合成に有用な好ましい実施態様で は、W₃は−P₃O₁₀である。 Xは、アミノアルカン酸、アルキルアミノ安息香酸、α-アミノ酸、および4-ア ミノ-2-ブチン酸からなる群から選択される。好ましくは、Xは、アルキルアミノ 安息香酸である。Xがアミノアルカン酸またはアルキルアミノ安息香酸のとき、 ｎは、１〜５の範囲であり、さらに好ましくは、ｎは、１〜３の範囲である。X がアルキルアミノ安息香酸のとき、そのフェニル基は、その隣接するカルボニル 基およびメチレン基に関して、メタ、パラまたはオルト配置であり得る。好まし い実施態様では、フェニル基は、パラ配置である。Xがα-アミノ酸のとき、アミ ノ酸側鎖は、任意の適切な天然または合成のアミノ酸側鎖であり得る。 上記X部分のうちの任意のものについて、R₁およびR₂は、−H、低級アルキル、 保護基または標識から選択される。好ましくは、標識は、蛍光色素である。より 好ましくは、標識は、フルオレセイン型蛍光色素、ローダミン型蛍光色素または FLAN型蛍光色素である。好ましくは、R₁およびR₂の一方が標識のとき、他方は、 −Hまたは低級アルキルのいずれかである。好ましい保護基には、ハロアセチル 、アシル、アルコキシカルボニルまたはスルホニルが挙げられる。より好ましく は、この保護基は、トリフルオロアセチルである。 この標識は、置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドの第一級または第 二級アミノ部分と、標識上に位置している「相補的官能性」との反応により、典 型的に形成される「連結」を介して、このヌクレオシドに結合される。好ましく は、この相補的官能性は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド 、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、スルホニルクロライド、アルデ ヒドまたはグリオキサール、エポキシド、カーボネート、ハロゲン化アリール、 イミドエステル、カルボジイミド、無水物、4,6-ジクロロトリアジニルアミンま たは他の活性カルボキシレートである(Hermanson)。特に好ましい実施態様では 、この相補的官能性は、活性化NHSエステルであり、これは、本発明の置換プロ パルギルエトキシアミドヌクレオシドのアミンと反応し、この場合、活性化NHS エステルを形成するには、カルボキシレート相補的官能性を含む標識は、ジシク ロヘキシルカルボジイミドおよびN-ヒドロキシスクシンイミドと反応されて、NH Sエステルを形成する(Khanna；Kasai)。以下の表１は、代表的な相補的官能性お よびこの相補的官能性とこの置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドのア ミンとの反応により形成されて得られた連結のサンプリングを示す。 R₃は、−Hおよび低級アルキルからなる群から選択される。III ．置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドおよび標識ヌクレオチドの 合成 図２〜９は、本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドのいくつ かの代表的な合成を示す。この合成では、ブロモエタノール１は、フタルイミド カリウム２と反応して、フタルイミド誘導体３が得られる。このフタルイミド誘 導体は、次いで、NaHの存在下にて、プロパルギルブロマイド４で0-アルキル化 されて、保護した3-(2-フタルイミドエトキシ)プロピン連結アーム５が得られる 。図２を参照せよ。次いで、ヨードヌクレオシド６は、ジメチルホルムアミド中 、ヨウ化第一銅、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム、およびトリ エチルアミンの存在下にて、室温でおよそ12時間またはこの反応がTLCで決定さ れるように完結するまで、保護連結アームと反応されて、それにより、化合物７ が形成される。この溶液は、次いで、真空下で濃縮され、生成物は、シリカゲ ルフラッシュクロマトグラフィーにより精製され、そして同定および純度測定の ために、プロトンNMRおよび分析用逆相HPLCにより分析される。エチレンジアミ ンでの処理に続いて、トリフルオロ酢酸エチルでのアセチル化により、ヌクレオ シド連結アーム化合物８が得られる。図３を参照せよ。リン酸トリメチル中にて 、−30℃で、このヌクレオシド連結アーム化合物８に、新たに蒸留したオキシ塩 化リンを添加して、対応するジクロロモノホスフェート９を形成する。反応混合 物を２M重炭酸テトラエチルアンモニウム(TEAB)(pH8.0)でクエンチして、モノホ スフェート10を得、これは、次いで、分取逆相HPLCにより精製される。図４を参 照せよ。モノホスフェート10は、カルボニルジイミダゾール(CDI)で活性化され 、過剰のCDIは、MeOHでクエンチされて、活性化モノホスフェート11が得られる 。この活性化モノホスフェートは、室温で、ピロリン酸トリブチルアンモニウム と反応される。この反応は、完結したとき、0.2M TEABでクエンチされ、そして 逆相HPLCにより精製されて、保護トリホスフェート12が得られる。精製した保護 トリホスフェートは、乾燥するまでエバポレートされ、そして濃NH₄OH水溶液中 に再懸濁されて、TFA基が除去され、プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド1 3が得られる。図５を参照せよ。 一般に、X部分のプロパルギルエトキシアミドヌクレ才チド(例えば、13)への 結合は、以下のようにして行われる。X部分のアミン官能性を保護するために、X 部分とアミン保護試薬(例えば、トリフルオロアセテート、例えば、図6A〜Cの化 合物14、17または20)とを反応させることにより、アミン保護X部分が形成される 。アミン保護X部分の酸官能性を活性化するために、アミン保護X部分は、酸活性 化剤(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド、例えば、図6A〜Cの化合物15、１8 または21)と反応される。次に、酸活性化されたアミン保護X部分は、塩基条件下 (例えば、250mMの重炭酸塩緩衝液、pH9)で、プロパルギルエトキシアミドヌクレ オチドと反応されて、アミン保護された置換プロパルギルエトキシアミドヌクレ オチド(例えば、図７の化合物22、図８の化合物24、または図９の化合物26を参 照のこと)を生じる。最後に、アミン保護基は、強塩基(例えば、NH₄OH)との反応 により、アミン保護された置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドから除 去されて、置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド(例えば、図 ７の化合物23、図８の化合物25、または図９の化合物27を参照のこと)が得られ る。 一般に、好ましい方法では、本発明の標識した置換プロパルギルエトキシアミ ドヌクレオシドは、以下のようにして調製される。置換プロパルギルエトキシア ミドヌクレオシド(例えば、23、25または27)は、中性緩衝溶液(例えば、100mM T EAB(pH7.0))に溶解され、溶液を乾燥状態までエバポレートされ、そして、ヌク レオシドを塩基性緩衝溶液(例えば、250mM重炭酸ナトリウム緩衝液、pH＝９)に 再懸濁する。この溶液に、標識-NHSエステル(DMSO中)が添加され、そして撹拌し ながら、一晩反応される。完結すると、この反応混合物は、イオン交換および逆 相HPLCにより精製されて、標識した置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシ ドが得られる。IV ．プロパルギルエトキシアミド化合物を使用する方法 本発明のプロパルギルエトキシアミド化合物は、以下の工程を包含するタイプ のテンプレート媒介プライマー伸長反応を含めた方法での使用によく適合する： (i)テンプレート核酸を提供する工程；(ii)このテンプレート核酸の一部に、オ リゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし、それにより、プライマー−テン プレートハイブリッドを形成する工程；および(iii)このプライマーを伸長する ために、このプライマー−テンプレートハイブリッドに、プライマー伸長試薬を 添加する工程。特に、本発明の化合物は、プライマー伸長生成物に標識を直接含 入させる手段を提供する。 プライマー伸長反応を使用する第一の好ましい種類の方法では、この伸長生成 物は、本発明の標識した置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドを、プラ イマー伸長反応物に含有させ、それにより、この伸長生成物全体にわたって、標 識をランダムに含入させることにより、標識される([F]dNTP試薬プロトコル)。 このような方法は、PCR単位複製配列、および単一のプライマー誘導伸長生成物 を標識するのに使用できる。このようにして伸長生成物を標識するために、プラ イマー伸長反応は、確立したプロトコルを用いて行われるが、この反応系には、 標識した置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドが添加される。一般に、 PCRの状況で、プライマー伸長反応を行うためには、テンプレート核酸は、各プ ライマ−20pmolと、プライマー伸長試薬(これは、20mMの緩衝液(pH８)、1.5mMの MgCl₂、50mMの各デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)、および２単位のTaqポリ メラーゼまたは他の適切な熱安定性ポリメラーゼを含有する)と混合される。次 いで、反応混合物を熱サイクルにかけるが、典型的な熱サイクルプロフィールは 、変性工程(例えば、96℃で15秒間)、プライマーアニーリング工程（例えば、55 ℃で30秒間)、およびプライマー伸長工程(例えば、72℃で90秒間)を包含する。 典型的には、この熱サイクルは、約10〜40サイクル繰り返される。PCR増幅のた めには、標識デオキシヌクレオチド三リン酸と非標識デオキシヌクレオチド三リ ン酸との典型的な比は、所望のシグナル量に依存して、100：１〜1000：１の間 である。増幅効率に悪影響を起こすことなくPCR反応混合物中にて使用できる標 識デオキシヌクレオチド三リン酸と非標識デオキシヌクレオチド三リン酸との最 大比は、およそ１：４である。 プライマー伸長反応を使用する第二の好ましい種類の方法では、この伸長生成 物は、プライマー伸長反応物に本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレ オチドを含有させて、それにより、伸長生成物の3'-末端ヌクレオチドにて、検 出可能な標識をランダムに含入させることにより標識される(例えば、Sanger型D NA配列決定)。一般に、本発明の標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸を用いたS anger型DNA配列決定の状況でプライマー伸長反応を行うためには、１μｌのテン プレート溶液(水５μｌで希釈したPCR反応物１μｌ)および２μｌのプライマー( 0.4pmol/μｌ)は、プライマー伸長試薬にれは、２μｌの緩衝液(400mM Tris-HCl 、10mM MgCl₂、pH9.0)、２μｌのデオキシヌクレオチド/標識ジデオキシヌクレ オチド混合物(T-終止反応、1250μＭ ddTTP、250μＭ dATP、250μＭ dCTP、180 μＭ7-デアザ-dGTP、および250μＭ dTTP)、および２μｌのポリメラーゼ酵素( ５単位/μｌであって、この場合、１単位は、Lawyerのように定義される)を含有 する)と混合される。次いで、反応物は、以下の代表的なプログラムを用いて、 熱サイクルにかけられる：98℃で５秒間の変性に続いて、96℃で５秒間；55℃で 40秒間；60℃で１分間のサイクルの繰り返し、このサイクルは、およそ15回繰り 返される。 本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド化合物はまた、プライ マー伸長生成物の塩基特異的な開裂に依存したSanger型配列決定の変形法（例え ば、標識ヌクレオチド使用する方法）の状況にて、よく適合する(Eckstein 1988 ；Shaw)。Ｖ．実施例 本発明は、以下の実施例を考慮することにより、さらに明らかにされるが、こ れらの実施例は、本発明の純粋な例示とすることを意図しており、いずれの様式 でも、その範囲を限定することを意図していない。 実施例１ 配列決定反応に必要なターミネーター過剰を決定するためのターミネーター滴定 アッセイ 完全な配列決定ラダー(ladder)(すなわち、約20ヌクレオチドと約600ヌクレオ チドの間の長さを有する特定の塩基で終止する全てのフラグメントを含有する配 列決定ラダー)を作るのに必要な最小量の色素標識ターミネーターを決定するた めに、ターミネーター滴定アッセイを使用した。このターミネーター滴定アッセ イの不可欠な成分は、(i)第一色素で標識したプライマー、および(ii)この第一 色素とスペクトル分解可能な第二色素で標識したターミネーターであった。この アッセイでは、この配列決定反応物に、不充分な濃度の色素ターミネーターを添 加したとき、ジデオキシ終止フラグメントは形成されず、配列決定ゲル上では、 第一色素のみで標識した「偽スポット」により形成された生成物だけが見られた 。本明細書中で使用する「偽スポット」との用語は、ジデオキシターミネーター で終止していないプライマー伸長生成物を意味し、このような生成物は、おそら く、ポリメラーゼ酵素がテンプレート核酸鎖から自発的に分離するときに形成さ れる。多すぎるターミネーターを使用したときには、短い終止生成物(すなわち 、長さが約50個未満のヌクレオチド)しか形成されず、このような生成物は、第 一色素および第二色素の両方を含有していた。適切な量のターミネーターを使用 したとき、完全な配列決定ラダーが生成し、ラダーの各フラグメントは、第一色 素および第二色素の両方で標識されていた。 色素−ターミネーター反応は、ABI PRISM^TM Dye Terminator Cycle Sequencin g Core Kit Manual(PE Applied Biosystems p/n 402116)で提供されたプロトコ ルに従ったAmpliTaq DNA Polymerase,FSを用いて、行った。(このFS酵素は、２ 点変異--G46DおよひF667Yを有する組み換えThermus水生DNAポリメラーゼである) 。dNTPミックス、色素標識プライマーおよび色素標識ターミネーター以外の全て の試薬は、ABI PRISM^TM Dye Terminator Core Kit(PE Applied Biosystems p/n 402117)から得た。dNTPミックスは、各２mMのdATP、dCTP、7-デアザ-dGTPおよび dTTPからなっていた。反応成分のプレミックスを、以下の表に示すように調製し 、ここで、全ての量は、反応ベースあたりで示されている： 反応物を、Perkin-Elmer 480 DNA Thermal Cycler(PE Applied Biosystems p/ n N801-100)に適合した0.5ml微量遠心分離管に組み込んだ。反応物の容量は20μ Ｌであり、これには、上記反応プレミックス15μＬ、可変量の色素標識ターミネ ーター、および全反応容量を20μＬにするのに充分な量の水を含む。各反応物に 、１〜500pmolの色素標識ターミネーターを添加した。蒸発を防止するために、 各反応物の頂部に、鉱油30μＬを添加した。これらの反応物を、以下のようにし て熱サイクルにかけた：96℃で30秒間、50℃で15秒間、および60℃で４分間を25 サイクルに続いて、４℃で保持するサイクル。 全ての反応物を、製造業者の指示(Princeton Separations p/n CS-901)に従っ て、Centri-Sepスピンカラム上のスピン-カラム精製により精製した。このカラ ム内のゲル物質は、室温で少なくとも30分間にわたり、脱イオン水0.8mLで水和 させた。カラムが水和され、ゲル物質に気泡が取り込まれていないことを確認し た後、カラムの上部および下部の末端キャップを取り除き、カラムを、重力によ り排水した。次いで、カラムを、キットに備え付けた洗浄管に挿入し、そして可 変速度微量遠心分離機で、1300xgで２分間にわたり遠心分離し、洗浄管を取り除 き、そして試料収集管に挿入した。この反応混合物を、オイルの下部から注意深 く取り出し、そしてゲル物質上に充填した。カラムを、可変速度微量遠心分離で 、1300xgで２分間遠心分離した。次いで、溶出した試料を、真空遠心分離で乾燥 した。 配列決定ゲル上に充填する前に、乾燥した試料を、25μＬのTemplate Suppres sion Reagent(PE Applied Biosystems p/n 401674)中に再懸濁させ、ポルテック スし、２分間にわたって95℃まで加熱し、氷上で冷却し、再びボルテックスし、 そして遠心分離した(13,000xg)。再懸濁した試料10μＬを、PE ABI PRISM^TM 310 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems p/n 310-00-100/120)に適合させた試 料バイアル(PE Applied Biosystems p/n 401957)に等分した。310 Genetic Anal yzerでの電気泳動は、DNA配列決定分析に特別に適合させたふるい分けポリマー および毛細管(PE Applied Biosystems p/n 402837(ポリマー)およびp/n 402840( 毛細管))を用いて行った。各場合では、ふるい分けポリマーは、核酸変性物を含 んでいた。試料は、2.5kVで30秒間、毛細管に動電的に注入し、そしてこの毛細 管の外壁を50℃に維持しつつ、12.2kVで２時間走査した。 図1A〜Cは、Terminator Titration Assayから得た典型的な結果を示し、この 場合、プライマーはTAMRA色素で標識され、ddATPターミネーターは、6-FAM色素 で標識され、TAMRA色素をこのジデオキシヌクレオチドターミネーターに連結す るために、伝統的なプロパルギルアミドリンカーを使用した。これらのトレース は、ヌクレオチド71〜175に対する電気泳動走査時間の関数として、一定波長で の蛍光強度を示す。プライマー伸長反応物に添加した色素−ターミネーターの量 は、可変であった：図1Aでは、１pmolのターミネーターを使用し、図1Bでは、４ pmolのターミネーターを使用し、そして図1Cでは、150pmolのターミネーターを 使用した。各パネルの上のトレースは、色素標識ターミネーターで発光し、535 〜545nmで集めた蛍光であり、各パネルの下のトレースは、色素標識プライマー で発光し、575〜585nmで集めた蛍光である。色素プライマートレース(下)は、適 切に終止したフラグメントでけでなく、偽ストップ(false stop)(すなわち、色 素標識ターミネーターで終止していないフラグメント)も示している。色素ター ミネータートレース(上)は、色素標識ターミネーターの特異的な取り込 みを示している。 図1Aは、１pmolの6-FAM-ddATPターミネーターを用いる反応についてのデータ を示す。この色素ターミネータートレースでは、小さなピークにより明らかなよ うに、極く僅かな特異的混入が検出された。この色素−プライマートレースで示 された偽ストップは、任意の特異的に終止したピークとも実質的に同じ大きさで あった。このパターンから、この色素−ターミネーター濃度が非常に低いことが 明らかとなった。図1Bは、４pmolの6-FAM-ddATPターミネーターを用いた反応に ついてのデータを示す。このターミネータートレースでは、この配列決定ラダー 全体を通じて、比較的に一定のピーク高さで、良好な特異的ターミネーター混入 が認められた。この色素プライマートレースでは、偽ストップノイズの上部に容 易に識別できるピークが存在しており、これらのピークは、色素ターミネーター トレースのピークと共に移動していた。このパターンは、この色素ターミネータ ー濃度は、使用可能な範囲内であったことを示す。図1Cは、150pmolの6-FAM-ddA TPターミネーターを用いた反応についてのデータを示す。「トップヘビー（toph eavy）」パターンが見られ、色素ターミネータートレースの初期のピークが、非 常に高レベルの色素ターミネーター混入を示し、その後のピークは、ずっと低い レベルの混入を示していた。このパターンは、この色素−ターミネーター濃度が 高すぎたことを示している。 実施例２ リンカー型の関数として、完全配列決定ラダーを形成するのに必要なHEX-1-標識 したC-ターミネーターの量 以下の表は、実施例１にて上で記述のターミネーター滴定アッセイに従って、 完全配列決定ラダーを形成するのに必要な色素標識したC-ターミネーターの相対 モル過剰（molar excess）を示す。この相対モル過剰は、完全配列決定ラダーを 形成するのに必要な非標識ジデオキシターミネーターの量が１の値となるように 、定義される。各場合では、C-ターミネーターは、HEX-1色素に連結した。 ａ この相対モル過剰は、完全配列決定ラダーを形成するのに必要な非標識ジ デオキシターミネーターの量が1.0の値となるように定義される。 実施例３ 5-{3-(2-アミノエトキシ)プロピン-1-イル}-2',3'-ジデオキシシチジン三リン酸 (13)の合成 Ａ．物質および方法 薄層クロマトグラフィー(TLC)を、250μｍ層のシリカゲル60-F₂₅₄で予め塗装 したガラス板上で行った。蛍光のクエンチおよび/または５％硫酸での炭化によ り展開した後、化合物をTLC板上に配置した。SIPブランドシリカゲル60Å、230 〜400 Mesh ASTM(Baxter Scientific p/n C4582-87)上で、フラッシュカラムク ロマトグラフィーを行った。以下のようにして、NMRスペクトルを得た：¹H NMR スペクトルを、室温で、CDCl₃(内部Me₄Si、δ0)またはD₂O(外部Me₄Si、δ0)に溶 解した溶液で300MHzにて記録した；¹³C NMRスペクトルを、CDCl₃(内部Me₄Si、δ 0)に溶解した溶液で、75.5MHzにて記録した；¹⁹F NMRスペクトルを、CDCl₃また はD₂O(外部CFCl₃、δ0)に溶解した溶液で、282.23MHzにて記録した；そして³¹P NMRスペクトルを、D₂O中の溶液で、121.44MHzにて記録した。全ての場合におい て、NMRデータは、提案した構造に一致していた。他に指示がなければ、全ての 反応は室温で行い、後処理において、有機溶媒の溶液を、等容量の水溶液 で洗浄した。有機溶液を、40〜50℃の浴温を用いた真空下でのロータリーエバポ レーターでの濃縮の前に、無水Na₂SO₄で一般的に乾燥した。分析および分取目的 で使用したHPLC系は以下の通りであった： 分析用逆相HPLC：カラム：Spheri-5 RP-C18、５μｍの粒子サイズ、220×4.6m m(PE Applied Biosystems p/n 0711-0017)；勾配：０〜50％アセトニトリルで1. 5ml/分にて20分間に続いて、50％アセトニトリル〜100％アセトニトリルで1.5ml /分にて10分間。 分析用イオン対HPLC：カラム：Aquapore^TM 0D-300、７μｍの粒子サイズ、220 ×4.6mm(PE Applied Biosystems p/n 0711-0331)；勾配：０〜40％アセトニトリ ルで1.5ml/分にて30分間に続いて、40％アセトニトリル〜60％アセトニトリルで 1.5ml/分にて５分間。 分取アニオン交換HPLC：カラム：Aquapore^TM Anion、20μｍの粒子サイズ、25 0×10mm(PE Applied Biosystems p/n 0711-0172)；勾配：40％アセトニトリル： 60％100mM TEAB、pH7.0〜40％アセトニトリル：60％1.5mM TEAB pH８で4.5ml/分 にて20分間に続いて、アイソクラチック（isocratic）溶出。 分取逆相HPLC：カラム：Prep Nova Pak HR-C18、６μｍの粒子サイズ、60Åの 細孔サイズ、300×40mm(Waters Division of the Millipore Corporation p/n W AT037704)；勾配(モノホスフェートおよびトリホスフェートについて)：100％10 0mM TEAB、pH７〜20％アセトニトリル：80％ 100mM TEAB pH７で50ml/分にて30 分間に続いて、20％アセトニトリル：80％ 100mM TEAB pH７〜50％アセトニトリ ル：50％ 100mM TEAB pH７で10分間；勾配(色素標識三リン酸について)：100％ 100mM TEAB pH７〜10％ 100mM TEAB pH７：90％アセトニトリル。 Ｂ．2-フタルイミドエタノール(３)の合成 フタルイミドカリウム２(2.7ｇ．14.6mmol)を、ブロモエタノール１のN,N-ジ メチルホルムアミド溶液(12mL、14.1mmol)に添加した。70℃で12時間撹拌した後 、この混合物を濃縮し、次いで、ジクロロメタン(100mL)で希釈した。濾過によ り固形分を除去した後、その有機層を水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮した。こ の濃縮物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(３：２〜２：３ヘキサン−酢 酸エチル)により精製して、0.22のR_F(３：２のヘキサン−酢酸エチル)を有す る白色固形分(1.19ｇ、44.12％)として、化合物３を得た。図２を参照せよ。 Ｃ．3-(2-フタルイミドエトキシ)プロピン(５)の合成 化合物３(1.14ｇ、5.96mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド(20・L)撹拌溶液に 、NaH(0.36ｇ、80％)を滴下した。NaHを完全に添加した後、撹拌を室温で0.5時 間継続し、その反応系を０℃まで冷却した。プロパルギルブロマイド４(1.5mL、 １3.47mmol)を添加し、この撹拌を、０℃でさらに0.5時間、次いで、室温で２時 間継続した。メタノールを注意深く添加して過剰のNaHを分解した後、溶媒を蒸 発させ、その粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(３：２〜１：１ 〜２：３ヘキサン−酢酸エチル)により精製して、0.22のR_F(３：２のヘキサン− 酢酸エチル)を有する固形物(495mg、36.2％)として、化合物５を得た。図２を参 照せよ。 Ｄ．5-{3-(2-フタルアミドエトキシ)-プロピン-1-イル}-2',3'-ジデオキシシ チジン(７)の合成 5-ヨード-2',3'-ジデオキシシチジン６(100mg、0.3mmol)を、N,N-ジメチルホ ルムアミド(１mL)中、ヨウ化第一銅(11.4mg、0.06mmol)、テトラキス(トリフェ ニルホスフィン)パラジウム(69mg、0.06mmol)、およびトリエチルアミン(84μＬ 、0.6mmol)の存在下にて、アルゴン雰囲気下にて、室温で12時間にわたり、化合 物５(158mg、0.69mmol)と反応させた。次いで、この反応物を、メタノール中の 重炭酸塩形態のDowex-1アニオン交換樹脂２ｇで希釈した。室温で１時間撹拌し た後、この反応混合物を濾過し、そして濃縮した。この生成物を、フラッシュカ ラムクロマトグラフィー(13：１のジクロロメタン−メタノール)により精製して 、0.23のR_F（溶媒は９：１のジクロロメタン−メタノール）を有する化合物７(7 5mg、57.66％)を得た。図３を参照せよ。 Ｅ．5-{3-(2-トリフルオロアセトアミドエトキシ)-プロピン-1-イル}-2',3'- ジデオキシシチジン(８)の合成 化合物７(73mg、0.17mmol)およびエチレンジアミン(400μＬ)の混合物を、エ タノール(４mL)中にて、80℃で１時間加熱した。次いで、この反応系を乾燥状態 までエバポレートし、その残留物を、N,N-ジメチルホルムアミド(２mL)に溶解し 、トリフルオロ酢酸メチル(6.5mL)を添加した。80℃で１時間撹拌した後、 この溶媒をエバポレートし、その残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ ー(溶媒は９：１のジクロロメタン−メタノール)により精製して、0.24のR_F(９ ：１のジクロロメタン−メタノール)を有する化合物８(36mg、50.7％)を得た。 図３を参照せよ。 Ｆ．5-{3-(2-トリフルオロアセトアミドエトキシ)-プロピン-1-イル}-2',3'- ジデオキシシチジン一リン酸(10)の合成 新たに蒸留したオキシ塩化リン(16.2μＬ、0.17mmol)を、−30℃で、リン酸ト リメチル(150μＬ)中のヌクレオシド８(18.8mg、0.046mmol)に添加して、対応す るジクロロモノホスフェート９を形成した。この反応混合物を、80分間にわたっ て−５℃まで暖めて、撹拌を、室温でさらに１時間継続した。この反応物を、２ M TEAB緩衝液(pH8.0)でクエンチし、そして上記のような分取逆相HPLCにより精 製した。生成物に対応する画分を濃縮して、モノホスフェート10(12.3mg、54.56 ％)を得た。図４を参照せよ。 Ｇ．5-{3-(2-トリフルオロアセトアミドエトキシ)-プロピン-1-イル}-2',3'- ジデオキシシチジン三リン酸(12)の合成 N,N-ジメチルホルムアミド(200μｌ)に溶解したモノホスフェート10(7.4mg、 １5.3mmol)を、室温で１時間にわたって、カルボニルジイミダゾール(CDI)(4.2m g、25.9mmol)と共に撹拌した。過剰のCDIを、乾燥メタノール(40μＬ)の添加に よりクエンチした。活性化モノホスフェート11を、室温で24時間にわたって、n- トリブチルアミン(16μＬ)を含有するN,N-ジメチルホルムアミド(160μＬ)中の ピロリン酸トリブチルアンモニウムの溶液と共に撹拌した。この反応物を、２M TEAB(pH8.0)でクエンチし、そして上記のような分取逆相HPLCにより精製した。 生成物に対応する画分を濃縮して、トリホスフェート12を得た。図５を参照せよ 。 Ｈ．5-{3-(2-アミノエトキシ)-プロピン-1-イル}-2',3'-ジデオキシシチジン 三リン酸(13)の合成 精製し保護したトリホスフェート12を、濃NH₄OH水(４mL)に取り出し、そして 室温で2.5時間撹拌した。この反応混合物を濃縮して、プロパルギルエトキシア ミドヌクレオチド13を得た。次いで、この濃縮した化合物を、2.6mMの濃度まで 、0.1M TEAB(pH7.0)で、バルクとして調合した。調合したバルクの濃度およ び純度は、それぞれ、UV/Vis分光分析および上記の分析用イオン対HPLCにより、 確認した。図５を参照せよ。 実施例４ 5-[3-{2-[N-(2-アミノアセチル)]アミノエトキシ}プロピン-1-イル]-2',3'-ジデ オキシシチジン三リン酸(23)[グリシン置換プロパルギルエトキシアミドヌクレ オチド]の合成 Ａ．トリフルオロアセトアミドグリシンNHSエステル(15)の合成--図6A トリフルオロアセトアミドグリシン14(0.96ｇ、5.6mmoles)を、室温で１時間 にわたって、乾燥DMF(10mL)中にて、N-ヒドロキシスクシンイミド(0.65ｇ、5.7m moles)および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドメチオジ ド(methiodide)(1.68g、5.7mmoles)と反応させた。この反応溶液を酢酸エチル(2 00mL)で希釈し、そして0.1N HCl(２×100mL)で洗浄した。次いで、この酢酸エチ ル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮して、このトリフルオロアセト アミドグリシンNHSエステル15(1.43ｇ、100％)を得た。 Ｂ．5-[3-{2-[N-(2-アミノアセチル)]アミノエトキシ}プロピン-1-イル]-2',3 '-ジデオキシシチジン三リン酸(23)の合成-−図７ 100mM TEA-重炭酸塩(pH7.0)中のプロパルギルエトキシアミドヌクレオチド13( 200μｌ、15.2mM)を、乾燥状態までエバポレートした。次いで、それを、250mM の重炭酸塩緩衝液(pH9.0)100μｌに再懸濁させた。このトリフルオロアセトアミ ドグリシンNHSエステル15の溶液(50μｌ、DMSO中で23％ w/w)を添加し、そして 室温で一晩撹拌した。次いで、この反応混合物を、以下のようにして、分取逆相 HPLC(C-18逆相)により精製した：カラム：Aquapore 0DS、20μｍの粒子サイズ、 250×10mm(PE Applied Biosystems p/n 0711-0163)；勾配：０〜50％アセトニト リルで4.5ml/分にて20分間に続いて、40％アセトニトリル〜100％アセトニトリ ルで、4.5ml/分にて10分間。生成物に対応する画分をプールし、そして等容量の 100mM TEA-重炭酸塩(pH7.0)で希釈し、次いで、真空中で濃縮して、精製し保護 したトリホスフェート22を得た。 精製し保護したトリホスフェート22を、濃NH₄OH水(２mL)に取り出し、そして 室温で一晩撹拌した。この反応混合物を濃縮して、グリシン置換プロパルギル アミノヌクレオチド23を得た。このグリシン置換プロパルギルアミノヌクレオチ ド23のバルクを、4.84mMの濃度まで、0.1M TEAB(pH7.0)中へのこの反応混合物の 溶解により調合した。調合したバルク溶液の濃度および純度は、UV/Vis分光分析 および上記実施例３の分析用逆相HPLCにより、確認した。 実施例５ 5-[3-{2-[N-(4-アミノメチルベンゾイル)]アミノエトキシ}プロピン-1-イル]-2' ,3'-ジデオキシシチジン三リン酸(25)[メチルアミノ安息香酸(パラ)置換プロパ ルギルエトキシアミドヌクレオチド]の合成 Ａ．4-(トリフルオロアセトアミドメチル)安息香酸NHSエステル(18)の合成-- 図6B 4-アミノメチル安息香酸16(4ｇ、26.5mmol)を、DMSO(60mL)およびトリフルオ ロ酢酸メチル(３mL)に溶解し、この溶液に、トリエチルアミン(３mL)を添加した 。60℃で５時間撹拌した後、この反応溶液を酢酸エチル(500mL)で希釈し、そし て水(6×200mL)で洗浄した。次いで、この酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで 乾燥し、そして濃縮して、白色の固形物として、トリフルオロアセトアミドメチ ル安息香酸17(4.6ｇ、70.3％)を得た。 このトリフルオロアセトアミドメチル安息香酸17(4.49ｇ、18.2mmol)を、室温 で２時間にわたり、酢酸エチル100ml中にて、N-ヒドロキシスクシンイミド(2.09 ｇ，18.2mmol)および1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(3.74g、18.2mmol)と 反応させた。この反応溶液を濾過して、白色沈殿物を除去し、その有機層を１N HCl(100mL)で洗浄した。次いで、この酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥 し、そして濃縮した。この濃縮物を、以下のステップ勾配を用いるシリカゲル固 定相を用いた順相カラムクロマトグラフィーにより、クロマトグラフにかけて、 白色の固形物(3.5ｇ、56％)として、4-(トリフルオロアセトアミドメチル)安息 香酸NHSエステル18を得た：40：１のジクロロメタン：酢酸エチルに続いて、10 ：１のジクロロメタン：酢酸エチル。Ｂ．5-[3-{2-[N-(4-アミノメチルベンゾイル)]アミノエトキシ}プロピン-1-イ ル]-2',3'-ジデオキシシチジン三リン酸(25)の合成--図８ 100mM TEA-重炭酸塩(pH7.0)中のプロパルギルエトキシアミドヌクレオシド1 3(200μｌ、15.2mM)を、乾燥状態までエバポレートした。次いで、それを、250m M重炭酸塩緩衝液(pH9.0)150μｌに再懸濁させた。4-(トリフルオロアセトアミド メチル)安息香酸NHSエステル18の溶液(100μｌ、100μｌのDMSO中で25mg)を添加 し、そして室温で一晩撹拌した。この反応混合物を、実施例４にて上で記述した 分取逆相HPLCにより精製した。生成物に対応する画分をプールし、そして等容量 の100mM TEA-重炭酸塩(pH7.0)で希釈し、次いで、真空中で濃縮して、精製し保 護したトリホスフェート22を得た。 この精製し保護したトリホスフェート22を、濃NH₄OH水(２mL)に取り出し、そ して室温で一晩撹拌した。この反応混合物を濃縮して、メチルアミノ安息香酸( パラ)置換プロパルギルアミノヌクレオチド25を得た。次いで、この置換プロパ ルギルアミノヌクレオチド25のバルク溶液を、0.1M TEAB(pH7.0)へのこの反応混 合物の溶解により調合した。調合したバルク溶液の濃度および純度は、それぞれ 、UV/Vis分光分析および上記実施例３の分析用逆相HPLCにより確認した。 実施例６ 置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドへの色素の結合 100mM TEA-重炭酸塩(pH7.0)中の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチ ドを、乾燥状態まで蒸発させた。次いで、それを、250mM重炭酸塩緩衝液(pH9.0) に再懸濁させた。所望の色素-NHS溶液(DMSO中)を添加し、そして暗所中にて、室 温で一晩撹拌した。この反応混合物を、上記の分取アニオン交換HPLCにより精製 した。生成物に対応する画分を濃縮し、そして上記の分取逆相HPLCにより再精製 した。最終生成物を真空中で乾燥し、そして１mMの濃度まで、50mM CAPSO(pH9.6 )で希釈した。調合したバルクの濃度および純度は、それぞれ、UV/VIS分光分析 および上記の分析用イオン対HPLCにより確認した。 実施例７ 本発明の置換プロパルギルエトキシアミドジデオキシヌクレオチドを用いて改良 したピーク高さ均等性 図10は、HEX-1-標識ddCTPを用いた単色配列決定反応の電気泳動図であり、こ の場合、このHEX-1色素は、３個の異なるタイプのリンカーのそれぞれを用いて 、ターミネーターに結合している。上記ターミネーター滴定アッセイに基づき、 各 リンカータイプについて、その最適なターミネーター濃度を使用した。上のパネ ルは、50pmでのプロパルギルエトキシアミドリンカーを用いた結果を示し、中央 のパネルは、25pmでのメチルアミノ安息香酸(パラ)置換プロパルギルエトキシア ミドリンカーを用いた結果を示し、下のパネルは、250pmでのグリシン置換プロ パルギルエトキシアミドリンカーを用いた結果を示す。図10の上の電気泳動図に おける番号により示されるように、図10で示した配列決定ラダー部分は、-2１M1 3配列決定プライマー(前方)を用いたpGEM-3Zf(+)の配列の塩基63から塩基104ま でに及んでいる。各実験の相対誤差は、以下のようであり、この場合、本明細書 中で使用する用語「相対誤差」は、この図で示した電気泳動図部分にわたるピー ク高さの比または標準偏差および中間ピーク高さ（mean peak height）を意味す る。 全ての文献および特許出願の内容は、個々の文献または特許出願のそれぞれの 内容が具体的かつ個別的に本明細書中で参考として援用されているかのように、 本明細書中で参考として援用されている。 少数の実施態様だけを上で詳細に記述しているものの、化学分野の当業者は、 その好ましい実施態様において、それらの教示から逸脱することなく、多くの改 良が可能であることを、充分に理解している。このような改良の全ては、以下の 請求の範囲の範囲内に包含されることを意図している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ローゼンブラム，バーネット ビー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 95118, サン ホセ，エステリャ アベニュー 1521

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の構造を有するヌクレオシド化合物： ここで、Xは、 ここで、ｎは、１〜５の範囲である、 ここで、ｎは、１〜５の範囲である、 および からなる群から選択される； R₁およびR₂は、別個に、−H、低級アルキル、保護基、および標識からなる群 から選択される； R₃は、−Hおよび低級アルキルからなる群から選択される； Bは、7-デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である； ここで、Bがプリンまたは7-デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンま たはデアザプリンのN⁹位にて結合しており、Bがピリミジンのとき、その糖部分 は、該ピリミジンのN¹位にて結合している；そして ここで、Bがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの8位に結 合しており、Bが7-デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該7-デ アザプリンの7位に結合しており、Bがピリミジンのとき、その隣接する三重結合 炭素は、該ピリミジンの5位に結合している； W₁は、−Hおよび−OHからなる群から選択される； W₂は、−OH、または該ヌクレオシドがその3'位でホスホジエステル結合を形成 できなくする部分である；そして W₃は、−PO₄、−P₂O₇、-P₃O₁₀、ホスフェートアナログ、および−OHからなる 群から選択される。 ２．R₁およびR₂の１個が、標識である、請求項１に記載のヌクレオシド化合物 。 ３．前記標識が、フルオレセイン型色素である、請求項２に記載のヌクレオシ ド化合物。 ４．前記標識が、ローダミン型色素およびFLAN型色素からなる群から選択され る、請求項２に記載のヌクレオシド化合物。 ５．W₁が、−Hであり； W₂が、−OH、または前記ヌクレオシドがその3'位でホスホジエステル結合を形 成できなくする部分であり；そして W₃が、−P₃O₁₀である、 請求項１に記載のヌクレオシド化合物。 ６．W₂が、−OH、−H、アジド、アミノ、ハロ、およびメトキシからなる群か ら選択される、請求項１に記載のヌクレオシド化合物。 ７．W₂が、−Hおよびフルオロからなる群から選択される、請求項１に記載の ヌクレオシド化合物。 ８．Bが、ウラシル、シトシン、7-デアザアデニン、および7-デアザグアノシ ンからなる群から選択される、請求項１に記載のヌクレオシド。 ９．Xが、パラ立体配置を有するアルキルアミノ安息香酸であり、そしてｎ＝ １である、請求項１に記載のヌクレオシド化合物。 １０．プライマー伸長反応を行う方法であって、該方法は、以下の工程を包含 する： テンプレート核酸を提供すること； 該テンプレート核酸の一部にオリゴヌクレオチドプライマーをアニールするこ と；および 該プライマーを伸長するために、該プライマー−テンプレートハイブリッドに 、プライマー伸長試薬を添加することであって、該プライマー伸長試薬は、以下 の構造を有するヌクレオシド化合物を含有する： ここで、Xは、 ここで、ｎは、１〜５の範囲である、 ここで、ｎは、１〜５の範囲である、 および からなる群から選択される； R₁およびR₂は、別個に、−H、低級アルキル、保護基、および標識からなる群 から選択される； R₃は、−Hおよび低級アルキルからなる群から選択される； Bは、7-デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である； ここで、Bがプリンまたは7-デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンま たはデアザプリンのN⁹位にて結合しており、Bがピリミジンのとき、その糖部分 は、該ピリミジンのN¹位にて結合している；そして ここで、Bがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの8位に結 合しており、Bが7-デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該7-デ アザプリンの7位に結合しており、Bがピリミジンのとき、その隣接する三重結合 炭素は、該ピリミジンの5位に結合している； W₁は、−Hおよび−OHからなる群から選択される； W₂は、−OH、または該ヌクレオシドがその3'位でホスホジエステル結合を形成 できなくする部分である；そして W₃は、−PO₄、−P₂O₇、−P₃O₁₀、ホスフェートアナログ、および−OHからなる 群から選択される。 １１．R₁およびR₂が、標識であり、そして他が、−Hである、請求項10に記載 の方法。 １２．以下の構造を有するヌクレオチド化合物を含有するポリヌクレオチド： ここで、Xは、 ここで、ｎは、１〜５の範囲である、 ここで、ｎは、１〜５の範囲である、 および からなる群から選択される； R₁およびR₂は、別個に、−H、低級アルキル、保護基、および標識からなる群 から選択される； R₃は、−Hおよび低級アルキルからなる群から選択される； Bは、7-デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である； ここで、Bがプリンまたは7-デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンま たはデアザプリンのN⁹位にて結合しており、Bがピリミジンのとき、その糖部分 は、該ピリミジンのN¹位にて結合している；そして ここで、Bがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの8位に結 合しており、Bが7-デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該7-デ アザプリンの7位に結合しており、Bがピリミジンのとき、その隣接する三重結合 炭素は、該ピリミジンの5位に結合している； W₁は、−Hおよび−OHからなる群から選択される； W₂は、−OH、または該ヌクレオシドがその3'位でホスホジエステル結合を形成 できなくする部分である；そして W₃は、−PO₄、ホスフェートアナログ、および−OHからなる群から選択される 。