JP2000513215A - 抗ｈｂｖ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBVsAg）に結合できるヒト抗体産生するハイブリドーマ細胞系を得る方法，ならびにハイブリドーマ細胞系，およびその細胞系によって産生される抗体が開示される．また，ＨＢＶ感染の予防および処置における上記抗体の様々な使用が開示される．抗HBVsAg抗体の高力価を有するヒトドナーから得られる末梢血リンパ球を致死的に放射線を照射されＳＣＩＤ骨髄で保護された正常株マウスに移植する．このようなキメラマウスをHBVsAgで免疫したのち，そのマウス脾臓からヒト細胞を得て，異種骨髄腫細胞とインビトロ融合させ，HBVsAgに対して高い親和性および特異性を有するヒト抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を発生させる．

Description

【発明の詳細な説明】 抗ＨＢＶ抗体 発明の分野 本発明は，Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に結合できるヒト抗体を産生するハイブ リドーマ細胞系を得る方法，それらのハイブリドーマ細胞系，それらの細胞系に よって産生される抗体，およびそれらの様々な使用に関する． 発明の背景 Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は大きな世界的な健康上の問題である．世界 の人口の約５％がＨＢＶに感染していて，慢性的感染患者は肝硬変および肝臓細 胞癌発症の高いリスクを有する（Progress in Hepatitis Research:Hepatitis B virus(HBV)，Hepatitis C virus（HCV）and Hepatitis Delta virus(HDV)，O.C rivelli編，Sorin Biomedica，1991）． ＨＢＶ-コード抗原に対する免疫応答には，ＨＢＶ感染細胞の排除に活性な細 胞性免疫，ならびに循環ウイルス粒子のクリアランスに寄与するウイルスエンベ ロープ抗原に対する体液性免疫の両者が包含される．ＨＢＶ感染時のウイルスの 持続に有力な原因は弱い抗ウイルス免疫応答の発生である． 組換えＨＢＶワクチンはＨＢＶに対する能動免疫のための安全かつ有効な手段 を提供するが，それらは十分かつ迅速な抗体応答を常に誘導するとは限らない． インターフェロン-αがＢ型肝炎感染の治療に使用されてきたが，高度に選択さ れた患者でも有効率は30〜40％にすぎないことが示されている． さらに，ヒトポリクローナル抗Ｂ型肝炎抗血清による受動免疫は，ＨＢＶ感染 の再発の遅延に有効であって，それを防止する場合さえあることが示されている （Wright,T.L．& Lau,J.Y.N．The Lancet 342:1340-1344，1933）．このような ヒトポリクローナル抗血清は，免疫処置されたドナーのプール血漿から調製され る．これらのプレパレーションはきわめて高価につき，比較的少量しか利用でき ない．さらにプールされた血漿には汚染された血液サンプルが含まれる可能性が あり，このような抗血清による処置は，結局，患者が他のウイルス感染たとえば Ｃ型肝炎またはＨＩＶに接触する危険を増大させる． ＨＢＶ感染の処置のための他のアプローチにはモノクローナル抗体（MoAb）の 使用がある． ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ/ＮＬ94/00102には，ハイブリドーマ細胞系Mab 4-7Ｂお よびMab 9Ｈ9によって分泌されるＢ型肝炎表面抗原に対するヒトモノクローナル 抗体が開示されている．細胞系Mab 4-7Ｂによって分泌されるモノクローナル抗 体はHBVsAgの線状エピトープを認識し，コンフォーメーショナルエピトープを認 識するMab 9Ｈ9とは異なっている．慢性Ｂ型肝炎感染の処置におけるこれらの抗 体の同時使用が請求されている． ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ/ＵＳ92/09749には，ハイブリドーマ細胞系ＰＥ 1-1， ＺＭ 1-1，ＺＭ 1-2，ＭＤ 3-4およびＬＯ 3-3により分泌されるHBVsAgに対する ヒトモノクローナル抗体が開示されている．これらの抗体は異なるＨＢＶエピト ープに結合し，循環HBVsAgレベルを低下させるために使用される． 日本特許出願ＪＰ 93066104にはヒトリンパ球細胞株ＴＡＷ-925とエブスタイ ン-バールウイルスでトランスフォームされたヒトリンパ球のハイブリドーマが 開示されている．このハイブリドーマはHBVsAgに対するヒトモノクローナル抗体 を産生する． 米国特許出願4,883,752には，ヒトへのHBVsAgワクチンの投与，彼らのリンパ 球の回収，非特異的刺激物質によるリンパ球のインビトロにおける刺激，上記細 胞の骨髄腫細胞との融合，および抗HBVsAg抗体を分泌するハイブリドーマの選択 によるHBVsAgに対するヒト由来のモノクローナル抗体の製造が開示されている． Ichimoriら，Biochem．and Biophysic．Research Communications 129(1):26- 33，1985にはHBVsAgのa-決定基を認識するヒト抗HBVsAgモノクローナル抗体を分 泌するハイブリドーマが開示されている．その後，Ichimoriらは，同誌142(3):8 05-812，1987に，HBVsAgに対するヒトモノクローナル抗体を安定に分泌する他の ハイブリドーマを開示している． 上述の抗体はすべて，抗ＨＢＶ抗体陽性の個体からの抗体産生細胞のインビト ロ不死化によって発生させたものである． 重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）骨髄で放射線保護された致死的放射線照射マウ ス正常株へのヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）の適応トランスファーを可能にす る新しいアプローチが最近報告された（Lubin I.ら，Blood 83:2368，1994）． このようなヒト／マウスキメラにおいては，各種想起抗原に対する二次体液性応 答ならびに他の抗原に対する一次体液性応答が効果的に発生することが示されて いる（Marcus H.ら，Blood 86:398-406,1995）． 発明の概要 本発明によれば，Ｂ型肝炎表面抗原（HBVsAg）に結合できるヒト抗体を分泌す るハイブリドーマ細胞系が上述のヒト／マウスキメラを使用して得られることが 見出された．本発明によれば，抗HBVsAg抗体陽性のヒトドナーからのヒト末梢血 リンパ球（ＰＢＬ）を，致死的に放射線照射されＳＣＩＤ骨髄で放射線保護され たマウスの正常株に移植する．このようなキメラマウスをHBVsAgで免疫したのち ，マウス脾臓からヒト細胞を得て，インビボにおいて異種骨髄細胞と融合させ， HBVsAgに高い親和性および特異性を有するヒト抗体を分泌するハイブリドーマを 発生させる． 本発明はしたがって，Ｂ型肝炎表面抗原（HBVsAg）に結合できるヒトモノクロ ーナル抗体（hMoAb）を得る方法において， （ａ）異種造血細胞を有するキメラ齧歯類Ｍ４をＢ型肝炎表面抗原（HBVsAg） で免疫して異種抗体産生細胞を上記齧歯類に作成させ，この場合，齧歯類Ｍ４は その造血細胞が実質的に破壊された齧歯類Ｍ１であり，上記齧歯類Ｍ１は造血不 全を有するマウスＭ２に由来する異種造血細胞を移植され，その異種造血細胞は ヒトＭ３に由来し， （ｂ）上記抗体産生細胞を分離して不死化し， （ｃ）HBVsAgに結合できる抗体を産生する不死化抗体産生細胞を選択してクロ ーニングし，ついで （ｄ）選択されたクローン化不死化抗体産生細胞により産生される抗体を単離 することからなる方法を提供する． 本発明によれば，免疫処置されたキメラ齧歯類Ｍ４の脾臓をヒトＰＢＬの移植 後12〜20日，好ましくはその移植後14日に摘出する．この脾臓から細胞懸濁液を 調製し，免疫処置されたキメラ齧歯類Ｍ４から得られる抗体産生細胞を好ましく はヒト-マウス融合パートナーたとえば異種骨髄腫と本技術分野でよく知られた 技術（たとえば，Kohler & Milstein，Nature，256:495-497，1975）によって融 合する．本発明により選択されたハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体 を単離するためには，ハイブリドーマ細胞系を適当な培地中インビトロで培養し てその上清から所望のモノクローナル抗体を回収するか，または別法として，ハ イブリドーマ細胞系をマウスの腹腔内に注射し，抗体をこれらのマウスの悪性腹 水または血清から収穫する．ハイブリドーマ細胞系の上清を最初，本技術分野で 周知の任意の方法たとえば，固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイ ムノアッセイ（ＲＩＡ）によってヒトＩｇＧ抗体の産生についてスクリーニング する．ヒトＩｇＧに陽性を示すハイブリドーマをさらに，それらのHBVsAgへの結 合能によって抗HBVsAg抗体の産生についてスクリーニングする． 本発明における齧歯類Ｍ１は，好ましくは実験動物として慣用される齧歯類で あり，最も好ましくはラットまたはマウスである． マウスＭ２は，遺伝性造血不全ならびに誘導性造血不全を包含する任意の造血 不全を有する．造血不全の非限定的な例には，ＳＣＩＤ，Ｂｇ，Ｎｕ，Ｘｉｄま たは上述の造血不全の合併を有するマウスが包含される．さらに，造血不全は遺 伝子の欠失の結果でもよく，またトランスジェニックマウスも使用できる． ドナーマウスＭ２に由来する造血細胞は非処置またはＴ細胞の枯渇による骨髄 細胞のいずれかが好ましい．使用できる造血細胞の他の起源には，たとえば脾臓 細胞，胎児肝細胞またはリンパ球がある． ヒトＭ３に由来する異種造血細胞は好ましくはＰＢＬ細胞であるが，ヒト造血 細胞たとえば骨髄細胞，臍帯血細胞，胸腺脾臓または類リンパ球等の任意適当な 起源に由来するものであってもよい． 最も好ましい実施態様によれば，齧歯類Ｍ１は，マウスまたはラットであり， マウスＭ２はＳＣＩＤマウスであり，ヒトＭ３に由来する異種造血細胞は以前の 感染の結果として自然にまたはワクチン接種により誘導されてHBVsAgに既に暴露 されているヒトＭ３からのＰＢＬである．このようなヒトは，ＨＢＶに感染した ことがない個体に比較して比較的高力価の抗HBVsAg抗体を有し，したが って，このようなドナーからのＰＢＬを本発明のＭ３ドナー細胞として使用した 場合には，HBVsAgによるＭ４キメラマウスの免疫処置は，Ｍ４キメラマウスにお いて移植されたヒトＰＢＬの二次免疫応答を誘発する．最も好ましいヒトドナー Ｍ３は，ＨＢウイルス試験陰性であるが，HBVsAgに対する抗体は高力価を示すよ うなドナーである．ヒトＭ３ドナーからのこのようなＰＢＬは，献血全血からま たは白血球泳動によって得ることができる． 本発明においてキメラ齧歯類Ｍ４の免疫処置に用いられるHBVsAgは，組換えＤ ＮＡ技術によって調製されたウイルスの精製主要表面抗原［Engerix(登録商標)- Ｂ，SIB Biological，Rixensart，Belgiuum］を含有するＢ型肝炎ウイルスワク チンとすることが好ましくい． 本発明はまた，HBVsAgに結合可能なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブ リドーマ細胞系，ならびにHBVsAgに結合可能なヒトモノクローナル抗体および全 抗体の抗原結合特性を実質的に維持するそのフラグメントを意図する．このよう なフラグメントは，全抗体を本技術分野において既知の広く記述されている様々 な酵素で消化して得られるたとえばFabまたはF(ab)₂フラグメントとすることが できる．抗体の抗原特性は標準アッセイたとえばＲＩＡ，ＥＬＩＳＡまたはＦＡ ＣＳ分析を用いてある抗原決定基に対する抗体の結合を試験することによって決 定される． 本発明の方法で得られるヒトモノクローナル抗体は，通常，競合的ＥＬＩＳＡ アッセイで測定して約10^-9Ｍ〜約10^-10Ｍの範囲の比較的高いHBVsAgに対する親 和性を有する． 本発明の特異的な実施態様によれば，本明細書においては「18.5.1013」およ び「19.79.5」と命名され，それぞれ1996年5月22日付にて欧州培養細胞収集機関 （European Collection of Cell Cultures，ＥＣＡＣＣ，ＣＡＭＲ，Salisbury ，Wiltshire，SP40JG，UK）に受入番号906052170および96052168として寄託され たハイブリドーマ細胞系が提供される．上記ハイブリドーマ細胞系によって分泌 され，本明細書ではそれぞれ「Ab18.5.1013」および「Ab19.79.5」と命名された 抗HBVsAgヒトモノクローナル抗体，ならびにその抗体の抗原結合特性を維持する それらのフラグメント，および「Ab18.5.1013」および「Ab19.79.5」 によって結合される抗原エピトープに結合できる抗体も提供される． 上に定義した抗体によって結合される抗原もまた本発明の態様を構成する． 本発明のさらに他の態様には，ヒト抗HBVsAgモノクローナル抗体およびそれら によって結合されるＡｇの様々な診断的，予防的および治療的使用が包含される ．本発明のこの態様においては，ヒト抗HBVsAgモノクローナル抗体からなる医薬 組成物は，Ｂ型肝炎患者の処置のために，このような患者にモノクローナル抗体 または抗HBVsAgに結合できるその部分の治療有効量，ＨＢＶ感染の症状を緩和す るかまたは個体における循環ウイルス粒子を低下させるのに有効な量を投与する ことにより使用される． このような組成物は本発明の１種または２種以上の抗体から構成される．本発 明の抗体に加えてさらに，医薬的組成物には所望により，本技術分野において既 知の任意の担体から選択される担体を含有してもよい．このような担体の一例に はリポソームがある．本発明の医薬組成物にはさらに，それ自体既知の各種希釈 剤および補助剤を添加することができる． 本発明の組成物は，非経口投与，経口投与等を包含する各種の投与様式によっ て投与することができる． 上述のように本発明の抗体からなる組成物は，他の抗ウイルス剤と併用して投 与することもできる．このような薬剤には，非限定的な例として，インターフェ ロン，抗ＨＢモノクローナル抗体，抗ＨＢポリクローナル抗体，ヌクレオシド類 縁体，およびＤＮＡポリメラーゼの阻害剤が包含される．このような併用療法の 場合には，抗体は抗ウイルス剤と同時にまたは抗ウイルス剤処置の前もしくは後 に順次投与してもよい． 本発明の医薬組成物はまた，たとえば，ＨＢＶ感染に対する新生児の免疫処置 に，または肝移植患者におけるＨＢＶ感染再発の可能性を排除するための免疫処 置に使用される． さらに他の実施態様によれば，本発明の抗体は，試験個体から血液サンプル， リンパ液サンプルまたは他の任意の体液サンプルであってよい体液サンプルを取 得し，体液サンプルを本発明の抗HBVsAg抗体と抗原-抗体複合体が形成される条 件下に接触させることによって，個体のＨＢＶ感染を診断する方法に使用す ることもできる．このような複合体のレベルをついで本技術分野で周知の方法に よって測定する．対照サンプルで形成されるよりも有意に高いレベルは試験個体 におけるＨＶ感染を指示する．同様にして，本発明の抗体によって結合される特 異的抗原も診断に使用することができる．同様にして，本発明の特異的抗原も， 体液サンプルをＡｇと接触させ，上述のサンプル中のＡｇ-Ａｂ複合体の存在を 測定することによって個体におけるＨＢＶ感染の診断に使用できる．さらに，本 発明のＡｇは個体を免疫処置してＨＢＶに対する体液性応答を誘発させるために 使用することもできる． 本発明はさらに，本発明の抗体，本発明の抗体によって結合された抗原および 試験サンプル中のこのような抗体または抗原を検出するために必要な他の試薬か らなる，ＨＢＶ感染の治療またはこのような感染の診断に使用するためのキット を提供する． 図面の簡単な説明 図１は，ＳＣＩＤ骨髄で放射線保護された放射線照射マウス（キメラマウス） の血清中の総ヒトＩｇの量（mg/ml）および特異的抗ＨＢｓ抗体の量（mU/ml）を 示すグラフ表示である． ＰＢＬ＋Engerix：キメラマウスはさらに抗ＨＢｓ抗体陽性のドナーからのヒ トＰＢＬを移植され水酸化アルミニウムアジュバント（Alum）中Engerix Ｂでワ クチン接種された．ＰＢＬ＋Alum：キメラマウスは，さらに抗ＨＢｓ抗体陽性の ドナーからのヒトＰＢＬを移植され，Alum単独（Engerix Ｂを含まない）をワク チン接種された．ＳＣＩＤ-ＢＭ＋Engerix：キメラマウスはEngerix Ｂをワクチ ン接種された（ヒトＰＢＬの移植は行われていない）．ＳＣＩＤ-ＢＭ＋Alum： キメラマウスには，Alumをワクチン接種された（ヒトＰＢＬ移植およびEngerix Ｂのワクチン接種は行われていない）．黒い線は，ヒトＰＢＬドナーの血清中に おける抗ＨＢｓ抗体の初期レベルを表す． 図２は，比活性すなわちヒトドナー（Ａ〜Ｄ，黒色カラム）の血清中における ヒトＩｇ１mgあたりの抗ＨＢＶｓ抗体のレベル，および上記ドナー（Ａ〜Ｄ，斜 線カラム）のヒトＰＢＬをそれぞれ移植されたキメラマウスの血清中の比活性を 示すグラフ表示である． 図３はキメラマウスの血清中における抗ＨＢｓ抗体の特異的活性（mU/mg）の 時間反応曲線を示すグラフ表示である（点線）．黒いカラムは総ヒトＩｇのレベ ル（mg/ml），斜線カラムは特異的抗ＨＢｓ抗体のレベル（mU/ml）を表す． 図４はＨＢｓ粒子に対する抗ＨＢｓ抗体の結合の競合的阻害を示すグラフ表示 である．結合の程度は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体を 用いるＥＬＩＳＡによって測定した．抗ＨＢｓ抗体はグラフ中に指示したように 培地中（白四角）または0.5μｇ/mlのＨＢｓ粒子（黒四角）中に希釈した． 図５は抗ＨＢＶｓ抗体で染色したＢ型肝炎感染肝切片を示す写真である．切片 はすべて「二次抗体」すなわちビオチンに接合したヤギ抗ヒトＩｇで染色した． Ａ−陰性対照．一次抗体なし． Ｂ−陽性対照．一次抗体−マウス抗ＨＢ抗体，二次抗体−抗−マウスＩｇ． Ｃ−抗ＨＢＶｓ抗体No.19.79.5で染色． Ｄ−抗ＨＢＶｓ抗体No.18.5.1013で染色． 例示のために提供され本発明を限定する意図はない以下の実施例に詳細が記述 される． 図６は15セットの特徴が明瞭に定義されているHBVsAg型へのAb 19.79.5の結合 の模式的に示した図である． 図７は，非処置群およびAb 18.5.1013処置群（阻害モデル）での日11および18 におけるＨＢＶ感染動物の百分率のグラフ表示である． 図８は，非処置群およびAb 19.79.5処置群（予防／阻害複合モデル）での日10 および17におけるＨＢＶ感染動物の百分率のグラフ表示である． 図９は，非処置群およびAb 19.79.5処置群（阻害／処置複合モデル）での日11 および19におけるＨＢＶ感染動物の百分率のグラフ表示である． 図10は，Ab 19.79.5の可変ドメインの軽鎖の核酸配列および相当するアミノ酸 配列である． 図11は，Ab 19.79.5の可変ドメインの重鎖の核酸配列および相当するアミノ酸 配列である． 実施例 材料および方法 マウス： 用いた動物は６〜10週齢であった．ＢＡＬＢ／ｃマウスはHarlan（Weizmann I nstitute Animal Breeding Center，Rehovot，Israel）から，ＳＣＩＤ／ＮＯＤ マウスはWeizmann Institute Animal Breeding Center，Rehovot，Israelから入 手した．マウスはすべて，滅菌飼料およびシプロプロフロキサシン（20μｇ/ml ，Bayer，Leverkusen，Germany）含有酸性水を供給した．必要な場合には常にマ ウスに，ＢＭＴ（Glaxo Operations UK，Greenland，England）後５日間毎日， １mgのFortumを腹腔内注射した． 条件付け基準： ＢＡＬＢ／ｃマウスはガンマ線150-A 60Co光源（Atomic Energy of Canada，K anata，Ontario製）からF.S.D.75cm，線量速度0.7Gy/分，４Gyついで３日後10〜 11Gy（分割線量）の全身照射（ＴＢＩ）に暴露した． 骨髄細胞の調製および移植： マウスから大腿骨および脛骨を摘出して，滅菌50ml Omni-Mixerステンレス鋼 チャンバー（Omni-Mixer Homogenize，Model No.17106，Omni International，W aterburg，CT，USA）中でホモジナイズした． レシピエントマウスには照射後直ちに，４〜６×10⁶ＳＣＩＤ／ＮＯＤ骨髄細 胞（0.2ml ＰＢＳ中）を静脈内注射した． 末梢血リンパ球の移植： 末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は，ＨＢｓ抗体陽性およびＨＢＶ陰性ドナーから， インフォームドコンセント後に白血球泳動によって得た．ＰＢＬは２回洗浄し， 計数し，ＰＢＳ中に所望の濃度に再懸濁した． 100×10⁶ヒトＰＢＬを，上述のように条件付けしたレシピエントマウスに腹腔 内注射した．対照マウスにはヒトＰＢＬを注射しなかった． キメラ動物の免疫処置： マウスには，ＰＢＬとともにＢ型肝炎ワクチン［Engerix(登録商標)-Ｂ；SBBi ological Rixensart，Belgiuum］を腹腔内投与して１回免疫処置した． ヒトマウスキメラからの細胞および血漿の収集： 動物の眼窩後部の血管からヘパリン被覆を施したガラス毛細管を用いて採血し た．血漿はヒト-Ｉｇの測定のために保存した．頸椎脱臼によって動物を屠殺し たのち，脾臓を摘出し，細片に切断し，ステンレス鋼の篩を通過させてＰＢＳ中 の細胞懸濁液を調製した． 細胞融合： 細胞をヒト-マウス異種骨髄腫ＨＭＭＡ2.11ＴＧ/0（Posnerら，Hybridoma，6: 611-625，1987）と3:1の比率で混合した．融合は，50％（w/v）のＰＥＧ1500（B oehringer Manheim GmbH）により標準操作で行った．融合細胞は，ＨＡＴ-補充 栄養（１×）含有完全培地（Biological Industries，Beit Haemek，Israel）中 96-ウエルのＵ底マイクロタイタープレート（Nunc，Denmark）に3000細胞／ウエ ルの濃度に接種した．細胞には１週後に新鮮なＨＡＴ培地を供給した．融合２週 後に，上清をＥＬＩＳＡ用に収穫し，培地は新鮮なＨＡＴ培地によって置換した ． 特異的な抗HBs Igを分泌する培養ハイブリドーマを96-ウエルのＵ底マイクロ タイタープレート中0.5細胞／ウエルでクローン化した． ヒト免疫グロブリンの測定： 血清を抗原特異的および総ヒトＩｇについて試験した．総ヒトＩｇは，捕獲剤 としてヤギF(ab)2-精製抗-ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ（Zymed Laboratories， San Francisco，CA）および検出試薬としてペルオキシダーゼ接合精製ヤギ抗-ヒ ト（Zymed Laboratories）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した． 免疫グロブリン濃度が既知のヒト血清を標準として使用した（Sigma，Rehovot， Israel）．捕獲剤で予め被覆し（2.5μｇ/ml，50μｌ/ウエル），10％ＢＳＡに よってブロックしたマイクロプレート（Nunc，Roskilde，Denmark）を，1:20000 〜1:640000の血漿希釈液，または0.2〜0.06μｇ/mlの標準と４℃で一夜インキュ ベートし，ついでＢＳＡ-Tween溶液で５回洗浄した．検出試薬を加え，プレート を37℃で１時間インキュベートし，ついで再び３回洗浄した．新鮮な基質溶液（ ＴＭＢ，Sigma）を加え，ペルオキシダーゼ触媒発色後10％硫酸を添加して反応 を停止させた．450nmにおける吸収をＥＬＩＳＡリーダー（Dynatech，Port Guer nsey，Channal Islands，UK）上で定量した． マウス血清中の抗原特異的ヒト抗体の濃度は，HBsAb ＥＩＡキット（ZER， Jerusalem，Israel）によって測定した． ハイブリドーマ上清中のヒト抗体は，ヤギ抗-ヒトＩｇＧ＋Ｍ＋Ａ（Zymed）被 覆プレート上，上清を二次試薬として接合させたヤギ抗-ヒトＩｇＧ-ペルオキシ ダーゼと一夜インキュベートすることにより測定した． ハイブリドーマ上清中の抗原特異的抗体は，HBs抗原被覆プレートを用いて上 述のように測定した． ヒトＩｇＧサブクラスの決定： ヒトＩｇＧサブクラスは，ヤギF(ab)2-精製抗-ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ（ Zymed Laboratories，San Francisco，CA）被覆プレートおよびHBs抗原被覆プレ ートを用いて，サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した．二次抗体としてマウ ス抗-ヒトＩｇＧサブクラス（Sigma），検出試薬としてペルオキシダーゼ接合精 製ヤギ抗-ヒト（Zymed Laboratories）を使用した． 統計解析： 統計解析に際しては，Mackintosh Quadra 605上でStat View IIプログラム（A bacus Concepts，Inc.，Barkley，CA）または486 DX2 PCコンパチブル上でMicro soft Excel 5.0（Microsoft）を使用した．Studentのt-検定，Anovaの相関およ び回帰分析は確率（ｐ）および相関係数（ｒ）値の計算に使用した．結果は平均 ±標準誤差として示す． 親和性定数の測定： ad抗原（Chemicon Cat.No．AG 850）に対する様々な抗-HBs抗体の溶液中での 親和性定数（Ｋ_D）の決定は，Friguetらの方法（Journal of Immunological Met hods，77:305-319，1985）に従って実施した．様々な濃度（3.5×10^-10Ｍ〜1.4 ×10^-9Ｍ）の抗原を，２ｍＭ ＥＤＴＡおよび10mg/mlのＢＳＡを含有する0.1Ｍ リン酸ナトリウム，ｐＨ7.8（メジウム緩衝液）中，一定量の抗体（3.4×10^-11 Ｍ）と溶液中で最初にインキュベートした．20℃でo.n.インキュベートしたのち ，遊離の抗体を直接ＥＬＩＳＡで測定した．各混合物300μｌ容量を，予めＡｄ で被覆（0.1Ｍ ＮａＨ ＣＯ₃緩衝液，ｐＨ9.6中1μｇ/ml，50μｌ/ウエル，37 ℃２時間）したマイクロタイタープレート（Nunc）のウエルに移し，20℃で２時 間インキュベートした．0.04％Tween20含有ＰＢＳで洗浄したのちＨＲＰ- F(ab')₂ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Zymed）をメジウム緩衝液で1:3000に希釈して50μｌ /ウエル，20℃で２時間添加して結合した抗体を検出した．プレートをＴＭＢ色 素源（Sigma T-3405錠）50μｌ/ウエルで発色させ，10％Ｈ₂ＳＯ₄50μｌ/ウエル で反応を停止させ，プレートをＥＬＩＳＡリーダーによって450nmで読み取った ．条件は得られるｆ値（Friguetら参照）がほぼ0.1になるように選択された．用 いた抗体濃度は同じプレート上で実施したＥＬＩＳＡ検量から推定した．親和性 定数Ｋ_Dは関連するスキャッチャードプロットから計算した． 阻害アッセイ： 阻害アッセイはHBs粒子（ＰＢＳ中2μｇ/ml）で被覆したマイクロタイタープ レート内で行った．プレートはＰＢＳ中３％ＢＳＡでブロックした．抗-HBs抗体 を含有するハイブリドーマ上清を系列希釈した．各希釈液50μｌを，被覆したマ イクロタイターウエルに加えた．ついで50μｌのHBs粒子（ad/ay，ＰＢＳ中0.5 μｇ/ml）またはＰＢＳ単独を各ウエルに添加した．プレートを加湿チャンバー 内において室温で一夜インキュベートし，ＰＢＳ-Tweenで５回洗浄した．次に， ＨＲＰに接合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＰＢＳ中に1:5000に希釈）50μｌを各ウエ ルに加えた．加湿チャンバー内において室温で４時間インキュベートしたのち， プレートをＰＢＳ-Tweenで５回洗浄し，各ウエルにＴＭＢを加えた．結果はＥＬ ＩＳＡリーダーを用いて波長450mnで読み取った． 免疫組織学的染色： ＨＢＶ陽性肝臓フラグメントを，４％中性緩衝化ホルムアルデヒド中に24時間 固定し，ついで定常的な操作を用いてパラフィン中に包埋した．パラフィン塊か ら４μｍ厚の切片を切り出し，ポリリジン被覆スライドに載せた．脱パラフィン 後に，本発明のモノクローナルヒト抗-HBsプロテインＡ-精製抗体を使用してペ ルオキシダーゼ消光染色を実施し，ついでHistostain-SPTMキット（Zymed，San Francisco，CA）を製造業者の指示に従って使用してビオチン化ヤギ抗-ヒトＩｇ Ｇ（Ｈ＋Ｌ）（Zymed）染色を行った．第１のヒト抗-HBs抗体を使用しない対照 スライドも平行して染色した． 配列決定： 総ＲＮＡを，RNAsol B試薬（TEL-TEX，Inc.，Friendswood，Texas）により10 ×10⁶ハイブリドーマ細胞から単離した．ｃＤＮＡを標準操作に従い，逆転写酵 素およびオリゴdT（Promega，Madison，WI）により総ＲＮＡ10μｇから調製した ．ＰＣＲはＶ_H，Ｖ_λまたはＶ_K5'リーダープライマーおよびヒト不変領域に相当 する3'プライマーによって1/50ＲＴ反応混合物で実施した．ＰＣＲフラグメント は，ｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）にクローン化した．挿入体の配列をＡＢＩ 377配列決定装置を用いて決定した．配列は，Genebankとの比較およびKabat配列 （Kabatら,1991，Sequence of proteins of Immunological interest．(5th Ed. )，U．S．Dept．of Health and Human Services，National Institutes of Heal th，Bethesda，MD）とのアラインメントにより解析した． 実施例１：キメラマウスにおけるヒトヒト抗-HBs抗体の産生 抗-HBs抗体陽性のドナーからのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を，ＳＣＩＤマ ウスからの骨髄の移植によって放射線保護された放射線照射ＢＡＬＢ/Ｃマウス の腹腔内に移植した．キメラマウスをＢ型肝炎ワクチン（Engerix Ｂ）で免疫し て二次免疫応答を誘発させた．総ヒトＩｇ分泌とともに特異的な抗-HBs抗体の産 生をマウス血清中で測定した．図１は，ヒトＰＢＬの移植後14日のマウス血清に おける総ヒトＩｇおよび抗-HBs抗体のレベルを示す．ヒトＩｇ分泌のレベルは免 疫処置および対照マウスで類似していたが，Ｂ型肝炎ワクチンを接種したマウス では対照群に比べて強力な免疫応答が発生する．免疫処置マウスにおいて抗原に 応答して産生された特異的ヒト抗体のドナー血清中のそれらのレベルに対する比 較では，５〜10倍の増加が指示される．しかも，マウス血清中に測定される特異 的活性，すなわち分泌されるヒトＩｇ１mgあたりの抗HBs特異的抗体のレベルは ドナー中に認められる特異的活性よりも102〜104倍高い．この増加は，キメラマ ウスにおける抗原に応答した抗HBs抗体産生のきわめて高い増幅を示している（ 図２）．ヒト抗体の産生は免疫処置後10日で検出可能になり，３週後にプラトー に達する．特異的活性は免疫処置後13日に高く，以後低下する（総ヒトＩｇ分泌 の増加による）（図３）． 実施例２：HBsに対するヒトモノクローナル抗体の調製およびその特性 免疫処置２週後にマウス脾臓から収穫したヒトＢ細胞をヒト-マウス異種骨髄 腫細胞（Posnerら，前出）に融合した．ハイブリドーマ細胞は，それらの成長速 度，総Ｉｇ分泌および特異的抗体産生について試験した．対照融合実験はインビ トロにおいてＰＷＭおよびHBVsAgで活性化したドナーＰＢＬについて行った．様 々な実験における融合頻度は0.9-5×10-5の範囲である．増殖しているハイブリ ドーマクローンの大部分はヒトＩｇを分泌し，その0.1〜4％は特異的ヒト抗-HBs 抗体を産生する．キメラマウスの脾臓に由来する抗-HBs分泌ハイブリドーマ細胞 を，インビトロにおいて活性化したドナーＰＢＬの融合から得られたハイブリド ーマ細胞と，Ｉｇ型および安定性について以下の表１に示すように比較した．キ メラマウスからのハイブリドーマの大部分はＩｇＧ型であることが見出され，す べてが12カ月以上安定であった．これに反し，ドナーＰＢＬから誘導されたハイ ブリドーマは大部分が不安定で，１個のクローンのみが12カ月以上安定であった ．特異的ヒト抗-HBsモノクローナル抗体を分泌する２つの安定なハイブリドーマ クローンの特性を調べた．以下の表２に示すように，これらの抗体はプロテイン Ａカラムならびに抗ヒトＩｇ-アガロースカラム上で精製し，両者ともにＩｇＧ １サブクラスであることが見出された．親和性係数は，競合的ＥＬＩＳＡで試験 して1.3×10^-9Ｍ〜6×10^-9Ｍの範囲である．特異性はad-ay（1:1）サブタイプの ＨＢ表面抗原を用いた競合的阻害アッセイによって試験した（図４）．図５は， ＨＢＶに対する本発明のヒトMoAbsの特異的結合をＨＢＶ感染ヒト肝臓フラグメ ントの染色によって示す． Ab 19.79.5の可変領域をコードする遺伝子を単離し，全配列を決定し，そのサ ブクラスおよびＣＤＲを決定した．この抗体は，Genebank配列およびKabatタン パク質配列とのアラインメントにより決定して完全なヒトＩｇ遺伝子配列を有す る．図10には，Ab 19.79.5の可変領域の軽鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチ ド配列およびその相当するアミノ酸配列を示す（配列番号１および３）．図11に は，Ab 19.79.5の可変領域の重鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列およ びその相当するアミノ酸配列を示す（配列番号２および４）．配列決定データか ら，Ab 19.79.5の可変領域は，サブグループＶ_H3，Ｊ_H2，Ｖ_λ3およびＪ_λ3から 構成されることが明らかになった． ＨＢＶゲノムは，それらのヌクレオチド配列の類似の程度に基づいて６つの群 Ａ〜Ｆに分類される．ＨＢＶの遺伝子の多様性はHBVsAgの異なる血清型の存在を 反映する．共通の決定基’a’と２対の互いに排他的な決定基’d/y’および’w/ r’がHBsAgの主要な４種のサブタイプ：adw，adr，ayWおよびayrの識別を可能に する．サブ決定基と呼ばれるｗの付加的な決定基（w1〜w4）はarwの４種のサブ タイプ（ayw1〜4），およびadwの２種のサブタイプ，すなわち，adw２およびadw ４の定義を可能にする．付加的サブタイプの変種がほとんどすべてのサブタイプ に存在するｑ決定基により付加される．その不存在は’q-’の標識によってマー クされる． Ab 19.79.5により認識される種類のＨＢＶ血清型を15種類の異なるHBsAgのセ ット（Norderら，1992，Journal of General Virology，73:3141;Magnius & No rder，1995，Intervirology，38:24-34）を用いて調べた．図６から明らかなよ うに，Ab 19.79.5は，異なるHBsAg血清型の複雑な認識パターンを有する． 実施例３：HBsに対するヒトモノクローナル抗体の生物活性 Ab 19.79.5およびAb 18.5.1013の生物活性の特徴を以下のＨＢＶ動物モデルを 用いて調べた．すなわちマウスをヒト肝臓フラグメントの安定な移植が可能なよ うに処置した．処置には，強度の放射線照射ついでＳＣＩＤ（重症複合免疫不全 ）マウス骨髄の移植が包含される．ヒト肝臓フラグメントのウイルス感染はＨＢ Ｖ陽性ヒト血清（ＥＰ 699 235）を用いてエキソビボで実施した．動物モデルは 抗体の様々な使用の可能性を示す３種の異なる様式で使用した．すなわち，感染 の阻害様式，予防／阻害複合様式および阻害／処置複合様式である． １．阻害様式−このモデルは，ＨＢＶによる肝臓の感染を阻害する抗体の能力 を証明する．ＨＢＶ陽性ヒト血清をAb 18.5.1013と予めインキュベートし，つい で標準エキソビボ肝臓感染を行った．マウス血清中のＨＢＶ-ＤＮＡを移植後日1 1および18に試験した．図７から明らかなように，抗体処置群における感染動物 の百分率は非処置群に比較して有意に低下した． ２．予防／阻害複合様式−このモデルは肝臓移植を表す．このモデルでは，マ ウスを肝臓移植の３日前にAb 19.79.5（10 I.U./マウス）で処置し，ついでAb19 .79.5（10 I.U.）の存在下にＨＢＶでエキソビボ感染させたヒト肝臓フラ グメントを移植した．マウス血清中のＨＢＶ ＤＮＡは移植後日10および17に試 験した．図８から明らかなように，処置群における感染動物の百分率は対照群に 比較して有意に低下した． ３．阻害／処置複合様式−ａ）ＨＢＶ陽性ヒト血清をAb 19.79.5と予めインキ ュベートし，ついで標準エキソビボ肝臓感染を行った．ｂ）マウスは移植後日０ および７にAb 19.79.5で処置した．マウス血清中のＨＢＶ ＤＮＡは移植後日11 および19に試験した．図９から明らかなように，Ab 19.79.5処置群における感染 動物の百分率は有意に低下したが，処置を中止したのち約２週でリバウンドが認 められた． 実施例４：HBsに対するヒトモノクローナル抗体および抗ウイルス剤の併用療 法 上述のＨＢＶモデルを用い，マウスを移植後日17〜20に抗ウイルス剤（ヌクレ オシド類縁体，0.5mg/マウス/日）で処置する．１群のマウスはさらに日19およ び20に本発明のヒトモノクローナル抗体によって処置する．マウス血清中におけ るＨＢＶ ＤＮＡの存在を日21および27に試験した． 表１ 表２

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年６月２５日（１９９８．６．２５） 【補正内容】 請求の範囲 １．Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBVsAg）に結合できるヒトモノクローナル抗 体を得る方法において， （ａ）異種造血細胞を有するキメラ齧歯類Ｍ４をＢ型肝炎表面抗原（HBVsAg） を免疫して異種抗体産生細胞を上記齧歯類に作成させ，この場合上記齧歯類Ｍ４ はその造血細胞が実質的に破壊された齧歯類Ｍ１であり，上記齧歯類Ｍ１は造血 不全を有するマウスＭ２に由来する異種造血細胞を移植され，その異種造血細胞 はヒトＭ３に由来し， （ｂ）上記抗体産生細胞を分離して不死化し， （ｃ）HBVsAgに結合できる抗体を産生する不死化抗体産生細胞を選択してクロ ーニングし，ついで （ｄ）選択されたクローン化不死化抗体産生細胞により産生される抗体を単離 することからなる方法． ２．齧歯類Ｍ１はＢＡＬＢ/Ｃマウスであり，マウスＭ２はＳＣＩＤマウスで ある「請求項１」記載の方法． ３．ヒトＭ３は高レベルの抗HBVsAg抗体を有しヒトＭ３に由来する異種造血細 胞は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である「請求項１または２」記載の方法． ４．Ｂ型肝炎表面抗原はEngetrix(登録商標)-Ｂワクチンである「請求項１〜３ 」記載の方法． ５．（ａ）欧州培養細胞収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受付番号第96052170号とし て寄託されたハイブリドーマ細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体18.5 .1013；（ｂ）全抗体の抗原結合特性を実質的に維持する（ａ）の抗体のフラグ メントからなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体． ６．（ａ）欧州培養細胞収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受付番号第96052168号とし て寄託されたハイブリドーマ細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体19.7 9.5；（ｂ）全抗体の抗原結合特性を実質的に維持する（ａ）の抗体のフラグメ ントからなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体． ７．1996年5月22日付にてＥＣＡＣＣに受付番号第96052170号として寄託され たハイブリドーマ細胞系． ８．1996年5月22日付にてＥＣＡＣＣに受付番号第96052168号として寄託され たハイブリドーマ細胞系． ９．活性成分としての「請求項５および／または６」に記載の抗体と医薬的に 許容される担体からなるＨＢＶ感染の予防および／または処置用の医薬組成物． 10．「請求項５および／または６」に記載の抗体の治療有効量をそれを必要と する個体に投与することからなるＨＢＶ感染の処置方法． 11．「請求項５および／または６」に記載の抗体を処置個体のＨＢＶによる更 なる感染を予防するために個体に投与することからなるＨＢＶ感染の予防方法． 12．体液サンプル中のＨＢＶ感染の診断方法において， （ａ）サンプルを「請求項５および／または６」に記載の抗体と抗体-抗原複 合体の形成が可能な条件下に接触させ， （ｂ）形成した抗体-抗原複合体のレベルを測定することからなり， 対照サンプルにおいて形成されたより試験した体液サンプルにおける有意に高い レベルはＨＢＶ感染を指示するものとする方法． 13．「請求項５および／または６」に記載の抗体の抗ウイルス剤との併用によ るＨＢＶ感染の予防および／または処置のための使用． 14．抗ウイルス剤はインターフェロン，抗ＨＢポリクローナル抗体，ヌクレオ シド類縁体およびＤＮＡポリメラーゼの阻害剤からなる群より選択される「請求 項13」記載の抗体の使用． 15．活性成分として「請求項５および／または６」記載の抗体の少なくとも１ 種を少なくとも１種の他の活性成分としての抗ウイルス剤と併用するＨＢＶ感染 の予防および／または処置用の医薬組成物． 16．抗ウイルス剤はインターフェロン，抗ＨＢポリクローナル抗体，ヌクレオ シド類縁体およびＤＮＡポリメラーゼの阻害剤からなる群より選択される「請求 項15」記載の医薬組成物． 17．「請求項９，15または16」のいずれかに記載の医薬組成物の治療有効量を それを必要とする個体に投与することからなるＨＢＶ感染の予防および／または 処置方法． 18．ＨＢＶ感染の予防および／または処置用の医薬組成物の製造のための「請 求項５または６」記載の抗体の使用．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｇ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 レイスナー，ヤイル イスラエル国68037 オールド ヤッファ, マサル カシャト ４ (72)発明者 ダガン，シュロモ イスラエル国76289 レホボト，ブステナ イ 12

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBVsAg）に結合できるヒトモノクローナル抗 体を得る方法において， （ａ）異種造血細胞を有するキメラ齧歯類Ｍ４をＢ型肝炎表面抗原（HBVsAg） で免疫して異種抗体産生細胞を上記齧歯類に作成させ，この場合上記齧歯類Ｍ４ はその造血細胞が実質的に破壊された齧歯類Ｍ１であり，上記齧歯類Ｍ１は造血 不全を有するマウスＭ２に由来する異種造血細胞を移植され，その異種造血細胞 はヒトＭ３に由来し， （ｂ）上記抗体産生細胞を分離して不死化し， （ｃ）HBVsAgに結合できる抗体を産生する不死化抗体産生細胞を選択してクロ ーニングし，ついで （ｄ）選択されたクローン化不死化抗体産生細胞により産生される抗体を単離 することからなる方法． ２．齧歯類Ｍ１はＢＡＬＢ/Ｃマウスであり，マウスＭ２はＳＣＩＤマウスで ある「請求項１」記載の方法． ３．ヒトＭ３は高レベルの抗HBVsAg抗体を有しヒトＭ３に由来する異種造血細 胞は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である「請求項１または２」記載の方法． ４．Ｂ型肝炎表面抗原はEngetrix(登録商標)-Ｂワクチンである「請求項１〜３ 」記載の方法． ５．「請求項１」記載の方法によって得られたヒトモノクローナル抗体および それらの抗体の抗原結合特性を実質的に維持しているそれらのフラグメント． ６．「請求項５」記載のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細 胞系． ７．（ａ）欧州培養細胞収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受付番号第96052170号とし て寄託されたハイブリドーマ細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体18.5 .1013；（ｂ）18.5.1013によって結合される抗原に結合できる抗体；ならびに（ ｃ）全抗体の抗原結合特性を実質的に維持する（ａ）または（ｂ）の抗体のフラ グメントからなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体． ８．（ａ）欧州培養細胞収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受付番号第96052168号とし て寄託されたハイブリドーマ細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体19.7 9.5；（ｂ）19.79.5によって結合される抗原に結合できる抗体；および（ｃ）全 抗体の抗原結合特性を実質的に維持する（ａ）または（ｂ）の抗体のフラグメン トからなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体． ９．1996年5月22日付にてＥＣＡＣＣに受付番号第96052170号として寄託され たハイブリドーマ細胞系． 10．1996年5月22日付にてＥＣＡＣＣに受付番号第96052168号として寄託され たハイブリドーマ細胞系． 11．「請求項７または８」記載の抗体によって結合される抗原． 12．活性成分としての「請求項５，７または８」記載の抗体と医薬的に許容さ れる担体からなるＨＢＶ感染処置用の医薬組成物． 13．「請求項５，７または８」記載の抗体の治療有効量をそれを必要とする個 体に投与することからなるＨＢＶ感染の処置方法． 14．「請求項５，７または８」記載の抗体を，処置個体のＨＢＶによる更なる 感染を予防するために個体に投与することからなるＨＢＶ感染の予防方法． 15．「請求項11」記載の抗原で個体を免疫することからなるＨＢＶ感染の予防 方法． 16．体液サンプル中のＨＢＶ感染の診断方法において， （ａ）サンプルを「請求項５，７または８」記載の抗体と抗体-抗原複合体の 形成が可能な条件下に接触させ， （ｂ）形成した抗体-抗原複合体のレベルを測定することからなり， 対照サンプルにおいて形成されたより試験した体液サンプルにおける有意に高い レベルはＨＢＶ感染を指示するものとする方法． 17．体液サンプル中のＨＢＶ感染の診断方法において， （ａ）サンプルを「請求項11」記載の抗原と抗体−抗原複合体の形成が可能な 条件下に接触させ， （ｂ）形成した抗体-抗原複合体のレベルを測定し， （ｃ）試験した体液サンプルにおけるＨＢＶ抗原の存在を指示することからな る方法． 18．「請求項16」記載の方法に使用するキット． 19．「請求項17」記載の方法に使用するキット． 20．「請求項５，７または８」記載の抗体の，ＨＢＶ感染の処置のために，抗 ウイルス剤との併用による使用． 21．抗ウイルス剤はインターフェロン，抗ＨＢモノクローナル抗体，抗ＨＢポ リクローナル抗体，ヌクレオシド類縁体およびＤＮＡポリメラーゼの阻害剤から なる群より選択される「請求項20」記載の抗体の使用． 22．活性成分としてる「請求項５，７または８」記載の抗体の少なくとも１種 を少なくとも１種の他の活性成分としての抗ウイルス剤との併用に選択してなる ＨＢＶ感染処置用の医薬組成物． 23．抗ウイルス剤はインターフェロン，抗ＨＢモノクローナル抗体，抗ＨＢポ リクローナル抗体，ヌクレオシド類縁体およびＤＮＡポリメラーゼの阻害剤から なる群より選択される「請求項22」記載の組成物． 24．「請求項22または23」記載の医薬組成物の有効量をそれを必要とする個体 に投与することからなるＨＢＶ感染の処置方法．