JP2000513329A

JP2000513329A - 幹細胞の分化を阻害させるためのデルタ様蛋白質の使用

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Publication number: JP2000513329A
Application number: JP09531219A
Authority: JP
Inventors: ウィッテ，ローリー; ペイトースキー，ブロニスロー; モーア，カテリ，エー．; レミシュカ，アイオー，アール．
Original assignee: ImClone Systems Inc
Current assignee: ImClone LLC
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-03-03
Publication date: 2000-10-10
Also published as: EP0938332A1; US6613565B1; EP0938332A4; AU2197897A; CA2247926A1; WO1997031647A1

Abstract

(57)【要約】幹細胞の分化を阻害する方法が開示されている。幹細胞の分化は幹細胞に十分な量のヒト・デルタ様蛋白質（ｄｌｋ）を接触させることにより阻害される。

Description

【発明の詳細な説明】幹細胞の分化を阻害させるためのデルタ様蛋白質の使用発明の分野本発明は幹細胞の分化速度を阻害させるためのデルタ様蛋白質（ｄｌｋ）の使用に関する。発明の背景ある種の生物学的システムの分化した細胞は、通常幹細胞と呼ばれる共通の前駆細胞から段階を経て成熟する。そのような細胞としては、たとえば、造血、神経、上皮、内皮および中胚葉細胞などがある。幹細胞はこれらのシステム中の一において成熟細胞に分化することができる。分化は非委任性または委任性(uncommitted or committed)前駆細胞中間体を通して起こる。幹細胞が分化すると１個の成熟細胞となる。あるいは、１個の幹細胞は一生物学的システム中で複数の成熟系列に分化するが、そのような場合この幹細胞は多分化能（pluripotent）を有するという。ある場合には一幹細胞の分化は全生物学的システムのすべての成熟系列になることがあり、この場合にはこの幹細胞は全能性（totipotent）を有するという。幹細胞はまた自己再生することができる。自己再生は幹細胞の健全なレベルを維持するために、分化によって微妙にバランスが取られなければならない。たとえば、造血幹細胞は成人骨髄中の細胞の約０．０１％を占める。ＣＤ３４抗原の存在で確認することができるこれらの幹細胞は、ストロマ細胞と関連した微小環境中に認められる。造血幹細胞はｃ−ｋｉｔおよびｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３リガンドなどの種々のサイトカイン類により誘発され、一段と系列系譜が委任された前駆細胞に分化が進む。これらの前駆細胞はさらに種々の成熟した白血球細胞、赤血球細胞、および造血系の血小板に分化してゆく。幹細胞の自己再生にはそれらの細胞が未分化状態を維持することが必要である。幹細胞集団が生体内（ｉｎｖｉｖｏ）および生体外（ｅｘｖｉｖｏ）において未分化状態にある時間を長引かせる方法はさまざまに応用できる。そうした応用分野としては、たとえば遺伝子治療ならびに幹細胞集団の濃縮などがある。幹細胞を未分化状態に維持する他の応用例としては、動物間の細胞および組織の移植が挙げられる。造血細胞の場合、この用途の一例は骨髄移植である。幹細胞、特に造血幹細胞をさまざまなサイトカイン類やサイトカイン混合物を使用して維持および拡大する試みはこれまで不成功に終わっていた。本発明の目的の１つは、幹細胞を未分化の状態に保つための方法を提供することにある。さらに具体的な目的としては、造血幹細胞を未分化状態に保つための方法を提供することである。他の目的は、幹細胞と非幹細胞の混合物における幹細胞集団を富化する方法を提供することである。発明の要旨当業者には自明のこれらおよびその他の目的は、造血幹細胞などの幹細胞の分化を阻害する方法を提供すること；ならびに幹細胞と非幹細胞の混合物中の幹細胞の集団を富化する方法を提供することにより達成された。これらの方法は、幹細胞または幹細胞と非幹細胞の混合物に十分な量のヒトデルタ様蛋白質（ｄｌｋ）を接触させることを特徴とするものである。発明の詳細な説明本発明は幹細胞の分化を阻害するための方法に関する。本出願の目的において、幹細胞の分化の阻害とは、幹細胞の分化の防止、または分化の速度を抑制することを意味する。幹細胞とは、自己再生能力かあり、かつ一生物学的システムの一群の細胞中の一以上の系列をとるよう委任された前駆細胞に分化する能力を持つ細胞すべてを意味する。そのような細胞としては、たとえば、造血、神経、上皮、内皮および中胚葉細胞などがある。好ましくは、これら幹細胞は少なくとも１つの系列系譜、好ましくは複数の系列系譜、そしてさらに好ましくは切除した哺乳類における細胞の生物学的システムのすべての系列系譜、を再集団化する能力のあるものである。本法は幹細胞をｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏにおいて十分な量のデルタ様蛋白質（ｄｌｋ）に接触させることを特徴とする。ｄｌｋ蛋白質および遺伝子はラボーダ[Laborda]ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２６８、３８１７−３８２０（１９９３）；リー［Lee］ら、ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ１２６１、２２３−２３２（１９９５）；およびラボーダの国際ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１３７０１に記述されている。ｄｌｋ遺伝子および蛋白質は、ラボーダら、およびリーらの文献ならびにラボーダの特許出願に記載されているように単離および精製することができる。ｄｌｋ遺伝子および蛋白質はいかなる哺乳類からのものでもよいが、ヒトの遺伝子および蛋白質が好ましい。マウスおよびヒトのｄｌｋアミノ酸配列はそれぞれラボーダの特許出願の図１Ａおよび１Ｂに示されており；マウスおよびヒトのｄｌｋヌクレオチド配列はラボーダ特許出願のそれぞれ図３および２に示されており；またヒトｄｌｋのアミノ酸およびヌクレオチド配列はリーらの文献の図６に示されている。これらの配列を本明細書の一部としてここに援用する。本発明において有用なｄｌｋ遺伝子および蛋白質は、上記のような配列の突然変異体および多形体も含むものとする。好ましくは、これらのｄｌｋ遺伝子および蛋白質は上記マウスおよびヒト配列などの哺乳類の生（native）ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と、少なくとも約７５％の同一性、好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有するものである。ラボーダらの文献の図２に示されているように、ｄｌｋは、６つのＥＧＦ様反復を膜貫通ドメインにより隔てられたＮ末端細胞外ドメインと短いＣ末端細胞内ドメインに含む膜貫通蛋白質である。ラボーダらの文献の図２を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。本発明に有用なｄｌｋ蛋白質は全長の蛋白質であることができる。あるいはこのｄｌｋは溶解型（ｓｄｌｋ）のものでもよい。この溶解性蛋白質は細胞外ドメイン全体を包含するもの、または少なくともその分子か生物学的活性を維持するために十分な細胞外ドメインを有するものであればよい。この細胞外ドメインは少なくとも３つのＥＧＦ反復（たとえば、１−３、２−５、または３−６のＥＧＦ反復）を含むものであって、好ましくは少なくとも４つのＥＧＦ反復（たとえば１−４、２−５、または３−６のＥＧＦ反復）；さらに好ましくは５つのＥＧＦ反復（たとえば、１−５、または２−６のＥＧＦ反復）；そして最も好ましくは６つのＥＧＦ反復すべてを含む。これらのＥＧＦ反復はラボーダらの文献の図２に示されており、これを本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。溶解性ｄｌｋ蛋白質は好ましくは膜貫通ドメインと細胞内ドメインの両方が欠失したものである。あるいはこの溶解性ｄｌｋ蛋白質は膜貫通ドメインのすべてまたは一部を含み、かつ細胞内ドメインをまったく含まないものか、あるいはｄｌｋ蛋白質が室温で水への溶解性を維持するに足るだけの細胞内ドメインを含むものでもよい。溶解性形態のｄｌｋは当分野で周知の方法により調製することができる。たとえば、適当なＤＮＡ配列を適切な発現ベクター中にクローニングすることにより溶解性ｄｌｋ蛋白質を産生させることができる。ＤＮＡを、たとえばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３などの適切な宿主細胞中にトランスフェクトして発現させる。溶解性ｄｌｋ蛋白質を融合蛋白質として発現させてもよい。ｄｌｋ蛋白質と連携して発現させる融合蛋白質の相手の例としては、ＩｇＧ蛋白質、メタロチオネイン、ヒスチジン反復、アルカリホスファターゼおよびＦＬＡＧ蛋白質などがあるが、これらに限定されるものではない。次にｄｌｋ蛋白質を発現させるか、好ましくは細胞培地中に直接分泌させる。安定した発現細胞系統から蛋白質を採集するが、好ましくは無血清培地中で採集する。溶解性蛋白質は当分野で周知の方法により精製することができる。好適な精製法はアフィニティ・クロマトグラフィである。精製した蛋白質は本明細書に記載のいかなる用途にも利用できる。この蛋白質はまた抗ｄｌｋモノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生のために動物を免疫するのに使用することもできる。それらの抗体は、ストロマ細胞などｄｌｋ蛋白質を発現するｄｌｋ含有細胞を同定または単離するために使用することかできる。ｓｄｌｋは溶液で使用することもできる。あるいは、ｓｄｌｋをたとえば熱、ｐＨなどの物理的手段により、または当分野で周知の化学架橋などの化学的手段により集合させることもできる。そうした“多機能性”のｓｄｌｋは幹細胞表面上の適当な標的分子とよく架橋することができ、また適当な生物学的信号を提供することができる。ｓｄｌｋ分子はまたたとえばラテックス・ビーズなどの小さな不活性ビーズ上に被覆したり、培養皿などの容器表面上に被覆することもできる。もし本発明の方法に使用するｄｌｋ蛋白質が膜貫通領域を含むものである場合、このｄｌｋ蛋白質は細胞表面に付着させることもでき、あるいは細胞と独立したものとすることもできる。ある種のストロマ細胞のような細胞は表面ｄｌｋを本来含有している。そうした細胞の一例はＡＦＴ０２４として知られているストロマ細胞系統である。あるいはまた、これらの細胞は本来的には表面ｄｌｋを含まないか、一以上の表面ｄｌｋ蛋白質を発現できるようにｄｌｋ遺伝子をトランスフェクトしたものでもよい。ｄｌｋ遺伝子をトランスフェクトするのに好適な細胞の例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＢＦＣ０１２などがある。ｄｌｋ蛋白質およびそのバリアントは上記のように造血幹細胞の分化を防止したり、あるいは少なくとも分化の速度を抑制する。この目的のために、ｄｌｋ蛋白質をストロマ細胞の表面に付着させることもできる。あるいはｄｌｋ蛋白質を非ストロマ細胞の表面に付着させたり、細胞と独立したものとさせることもできるが、この場合にはストロマ細胞またはストロマ細胞上に存在するその他の因子でｄｌｋと一緒になって造血幹細胞の分化を防止したり、または少なくとも分化の速度を抑制するものとともに使用するのが好ましい。ｄｌｋ蛋白質およびそのバリアントは、上記のように成長因子の混合物とともに使用することもできる。下記の造血混合物などのカクテルを５−フルオロウラシルの代わりに、または一緒に使用することもできる。カクテル中に含める成長因子の選択は、未分化状態に維持する幹細胞の種類に特異的になるように行う。このカクテルは分化の阻害を強化し、また幹細胞の増殖を誘発して自己再生につながる効果を有する。たとえば、造血幹細胞用の成長因子のカクテルは、ＩＬ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３リガンドの一以上の混合物を包含する。そうしたカクテルについてはムーア[Moore]らの“ＣＤ３４造血前駆細胞の生体外拡大”、グロス[Gross]編“骨髄排除と処理における進歩”、骨髄排除と処理に関する第４回国際シンポジウム、フロリダ州オーランド、ウイリー・リス刊（１９９４）に記載されている。カクテルの成分である５−フルオロウラシルとｄｌｋはそれらが有効であるいかなる濃度でも使用することができる。カクテルの成分および５−フルオロウラシルは、たとえば０．１−１００ｎｇ／ml、好ましくは１−５０ｎｇ／ml、そしてさらに好ましくは５−２０ｎｇ／mlの濃度で好適に使用することができる。ｄｌｋはたとえば、１ｎｇ−１００ｕｇ／ml、好ましくは０．１−１００ｕｇ／ml 、さらに好ましくは１−５０ｕｇ／ml、そして最も好ましくは５−２０ｕｇ／mf lの濃度で好適に使用することができる。上記のようなｄｌｋ蛋白質およびそのバリアントはそれ自体で、または造血成長因子のカクテルなどの成長因子カクテルとともに、および／または５−フルオロウラシルとともに使用して、ｅｘｖｉｖｏでの分化を防止したり、または少なくともその速度を抑制するために使用することができる。幹細胞は幹細胞と非幹細胞の混合物中に求めることができる。たとえば、造血幹細胞およびさらに成熟した非幹細胞の混合物は、末梢血液、骨髄または臍帯血中に見られる。混合物中の幹細胞がｄｌｋによって未分化状態に長時間保たれる間に、その他のより成熟した非幹細胞は分化を続け、そして終局的には死亡する。このようにして、造血幹細胞が多くなり、幹細胞および非幹細胞混合物中に濃縮されることになる。たとえば、造血幹細胞の混合物、好ましくは骨髄からの混合物は化学療法または放射線治療を受けている患者から取り除くことができる。特に恩恵を受ける患者は、白血細胞などのガン治療を受けている患者、すなわち白血病の患者である。たとえば、患者の骨髄を患者から取り出す。骨髄からすべての悪性細胞を取り除き、患者は化学療法または放射線治療を受ける。この化学療法または放射治療が患者の造血細胞を減少させる。造血幹細胞は上記のように、ｄｌｋにより生体外で未分化状態に保たれる。幹細胞集団はこの段階で拡大される。あるいはまた、幹細胞はネガティブまたはポジティブ選択法のいずれかを使用して単離することもできる。ポジティブ選択の一例は、幹細胞をＣＤ３４などの幹細胞抗原に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体に結合させることにより、大きな細胞画分から幹細胞画分を分離するものである。それらの抗体は幹細胞の単離を容易にするためにマイクロ・ビーズまたはカラム・マトリックスに結合させることができる。ネガティブ選択法の一例としては、細胞画分を成熟細胞抗原に向けられた一連の抗体を使用したカラムを通過させて多くの成熟細胞を結合させ、これらの抗原か欠失している幹細胞を特定の画分に分離させる方法がある。これらの抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。治療後に、この幹細胞は患者の造血システムを自己再生させるために患者体内に再注入される。幹細胞は化学療法または放射線治療を受けている患者から取り出されたものが望ましい。もし必要であれば、幹細胞は化学療法または放射線治療を受けている患者以外の患者から取り出されたものとすることもできる。この患者とは哺乳類、好ましくはヒトである。あるいはまた、幹細胞を患者から取り出し、上記のようにｄｌｋ蛋白質またはそのバリアントにより細胞が未分化の状態に保たれている間に遺伝子治療を行うこともできる。ｄｌｋの存在が遺伝子治療に必要な幹細胞を得られる時間を長くするのである。生体内において、ｄｌｋ、好ましくはｓｄｌｋを必要な造血幹細胞を増やすために使用することもできる。そうした治療はさまざまな悪性疾患に対する化学療法または放射線治療の実施前に利点がある。増加した幹細胞集団は、そのような治療中に典型的に減少することになる白血球および血小板などのすべての血液細胞の急速な再生を可能とすることになる。ｄｌｋは当分野で周知の方法により患者に投与することができる。好ましくは、ｓｄｌｋを静脈注射、または骨髄空洞中に直接注入して投与する。実施例実施例１溶解性ｄｌｋ１．ヒトｄｌｋ（ｈｄｌｋ）の全長ｃＤＮＡクローンを前記のようにして得た。溶解性ｄｌｋ（ｓｄｌｋ）発現構築物をＰＣＲにより、予測される膜貫通ドメインの第１コドンの前でｃＤＮＡを切形して調製した。ポジティブ（５’）プライマー（プライマー１）は、ＡＴＧコドンの最初の８つのヌクレオチド５’に存在し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をコードしている。ネガティブ（３’）プライマー（プライマー２）は、ヒトｄｌｋの細胞外ドメインの最終アラニンのための停止コドンとそのコドンのすぐ後ろにＮｏｔｌ部位を導入した。これらプライマーの配列を以下に示す。得られたＰＣＲフラグメントを真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社[Invitrogen Inc.]）にクローニングした。蛋白質の発現は、発現プラスミドをＮＩＨ３Ｔ３およびＣＨＯ細胞中に導入し、発現細胞の永続的な系統を確立することにより行った。平行して、ｓｄｌｋを発現させる構築物を、アルカリホスファターゼとヒトＩｇＧｌのＦｃ領域をコードする領域を発現する配列に結合させた。得られた融合蛋白質（ｓｄｌｋ−ＡＰとｓＤｌｋ− Ｉｇ）は前述のｓｄｌｋで示したように発現された。これらの融合蛋白質は容易に精製することができ、また幾種類かの結合および機能検定に使用することができる。プライマー１：５’−ＧＡＧ．ＧＧＴ．ＡＣＣ．ＡＡＧ．ＣＴＴ．ＣＣＡ．ＧＡＧ．ＡＴＧ．ＡＣＣ．ＧＣＧ．ＡＣＣ．ＧＡ（配列番号１）プライマー２：５’ＧＣＡ．ＴＣＴ．ＡＧＡ．ＧＣＧ．ＧＣＣ．ＧＣＴ．ＣＡＧ．ＧＣＣ．ＴＧＴ．ＣＣＣ．ＴＣＧ．ＧＴＧ．ＡＧＧ．ＡＧ（配列番号２）実施例２．細胞系統および培養ＡＦＴ０２４およびＢＦＣ０１２ストロマ細胞系統を、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ検定の両方を利用することにより、それらが高度に濃縮された胎児肝および成人骨髄幹細胞を支持する能力があることで特定した。細胞は常法により１０％胎児子ウシ血清（ＦＢＳ）と５０ｍＭｂ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含むダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３１°− ３３℃、５％ＣＯ₂に維持して培養した。造血幹細胞との長期の同時培養については、融合単層を照射（２０Ｇｙ）し、変性デクスター培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清、５０ｍＭＢＭＥ、０．１ｍＭヒドロコルチゾン）中で、３７℃、５％ＣＯ₂に維持し、毎週培地を変えて培養した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＡＴＣＣから入手した。実施例３ｄｌｋ発現分析ストロマ細胞系統からの全ＲＮＡをポリＡ選択、ノーザンブロット、そして標準プロトコルに基づいて³²Ｐ−標識プローブにハイブリダイズした。ＡＦＴ０２４のサブトラクト・ライブラリーからの６００ｂｐｄｌｋｃＤＮＡクローンをプローブとして使用した。ＲＴ−ＰＣＲ用のｃＤＮＡテンプレートは、製造者（ギブコＢＲＬ[GibcoBRL]）のプロトコルに従ってスーパースクリブト・リバース・トランススクリプターゼを使用して調製した。ｄｌｋＰＣＲ反応用のオリゴヌクレオチド・プライマーは次の通り：センス５’−ＧＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣ−３’（配列番号３）およびアンチセンス５’−ＧＧＴＡＣＴＣＴＴＧＴＴＧＡＧ−３’（配列番号４）。蛋白質レベルでのｄｌｋ発現の分析用として、ウサギにＦｌａｇ−ｄｌｋ融合蛋白質（下記）を免疫することによりｄｌｋに特異的な抗血清を作り出した。得られた抗体を、ｄｌｋ−Ｉｇ（下記）を製造者（ファルマシア・バイオテック社[Pharmacia Biotech Inc.]）の指示に従って結合させたセファロースＣ１−４Ｂでアフィニティ・クロマトグラフィにより精製した。溶離および中和後に、アフィニティ精製ｄｌｋ抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析し、蛋白質濃度をＢＣＡ法（ピアース[Pierce]）により求めた。生およびトランスフェクトした（下記参照）ストロマ細胞系統のｄｌｋ細胞表面発現は、アフィニティ精製ｄｌｋ抗体を使用したフロー・サイトメトリーにより行った。活発な成長相のストロマ細胞系統をＰＢＳ／０．５ｍＭＥＤＴＡで１回洗浄し、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ中に摩砕することにより採集した。２回洗浄（ＰＢＳ／３％ＦＢＳ）細胞をｄｌｋ抗体および同様に調製した無関係の対照抗体とともにインキュベートした。特異的な標識をロバ抗ウサギ−ＦＩＴＣ（ジャクソン・イムノリサーチ[Jackson Immunoresearch]）により開発した。染色した細胞をセル・クエスト・ソフトウェア[Cell Quest Software]を使用したべクトン・ディキンソン[Becton Dickinson]ＦＡＣＳｃａｎで分析した。実施例４ｄｌｋ融合蛋白質の調製発現プラスミドｐＣＤ４−Ｉｇはヒトイムノグロビン重鎖のゲノム配列に融合したヒトＣＤ４の細胞外ドメインのｃＤＮＡを含む。このｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社）のＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ部位にクローニングし、プラスミドＫＢ５２．３．２を得た。ｄｌｋの細胞外ドメインをコードしたｃＤＮＡを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の全ＲＮＡをテンプレートとして使用して、プライマーＢＰ１５１とＢＰ１５２によるＲＴ−ＰＣＲにより得た。このプライマーＢＰ１５２はｄｌｋ細胞外ドメインの最終コドンとＫＢ５２．３．２のフレーム中にあるＥｃｏＲＩ部位を含む。得られたＰＣＲフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を経由してＫＢ５２．３．２にクローニングし、溶解性ｄｌｋ−Ｉｇ発現プラスミドを得た。ｐｄｌｋ−ＩｇまたはｐＣＤ４−Ｉｇを、ｐＳＶＮｅｏとともにＮＩＨ３Ｔ３細胞中にトランスフェクトし、安定したクローンをＤＭＥＭに溶解した４００ｍｇ／mlＧ４１８（活性重量；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、１０％ＦＢＳで選択して単離した。プライマー：センスＢＰ１５１：５’ＧＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＧＧＴＣＣＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５）；アンチセンスＢＰ１５２：５’−ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＧＧＴＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号６）。ＣＤ４−Ｉｇおよびｄｌｋ−Ｉｇ蛋白質を安定した発現細胞系統から無血清培地に採集した。溶解性融合蛋白質を、０．１Ｍトリス−ＨＣｌで平衡化、ｐＨ７．６、０．５ＭＮａＣｌのＨｉＴｒａｐ蛋白質Ｇ−セファロース（ファルマシア・バイオテック社）上にアフィニティ・クロマトグラフィにより精製し、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．８、０．５ＭＮａＣｌにより溶離した。溶離した蛋白質をＰＢＳで透析した。蛋白質濃度をＢＣＡ法（ピアース社）により測定した。Ｆｌａｇ−ｄｌｋ融合蛋白質をウサギに免疫してｄｌｋ抗血清を産生させるために使用した。蛋白質発現プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＦｌａｇはプラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社）をモディファイしたものであり、５’非翻訳配列の２２塩基対、プレプロトリプシノーゲン信号配列、およびＦｌａｇペプチドのコード領域（ＤＹＫＤＤＤＤＫＩ）ならびにＢｇＩＩＩ制限部位を含む。ｄｌｋの細胞外ドメインをコードしたｃＤＮＡフラグメントはＮＩＨ３Ｔ３細胞のＲＮＡを使用したＲＴ−ＰＣＲにより得た。５’プライマー（ＢＰ１５５）は予想される成熟ｄｌｋ蛋白質コード配列の５’末端のフレーム内ＢｇＩＩＩ部位を導入するように設計した。３’プライマー（ＢＰ１５４）は予想されるｄｌｋ細胞外ドメインの最終アミノ酸に隣接する停止コドンの下流のＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位を含む。プライマー：センスＢＰ１５５：５’−ＧＡＣＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＧＣＧＡＣＣＣＡＣＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号７）；アンチセンスＢＰ１５４：５’−ＧＣＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＧＧＴＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号８）。このＰＣＲフラグメントをＢｇＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ中に連結し、ｐＦ１ａｇ−ｄｌｋを得た。ｐＦｌａｇ−ｄｌｋをＤＥＡＥ−デクストランを使用してＣＯＳ細胞中にトランスフェクトした。ＣＯＳ調整培地からのＦｌａｇ−ｄｌｋ蛋白質のアフィニティ精製は、Ｆｌａｇモノクローナル抗体、アガロース上に固定化したＭ１（インターナショナル・バイオテクノロジーズ[Inter national Biotechnologies]社）を使用し、製造者の指示に従って実施した。実施例５プラスミド構築物および安定トランスフェクション全長マウスｄｌｋｃＤＮＡを、プライマーＢＰ１５１（配列番号５、上記）およびアンチセンスＢＰ２００：５’ＧＣＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＣＧＣＴＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＣＴ−３’（配列番号９）によるＲＴ−ＰＣＲにより、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の全ＲＮＡをテンプレートして使用して得た。配列決定により得られた製品は公表されているｄｌｋ配列と同一であることが確認された。この製品をベクターｐＣＲＩＩ（インビトロゲン社）にサブクローニングし、次いでＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ部位をコードしたプライマーを経由してレトロウイルス発現ベクターにクローニングした。超らせんのプラスミドを、製造者のプロトコル（ギブコＢＲＬ社）に従い、ｐＺｅｏ（インビトロゲン社）選択マーカーを使用して、リン酸カルシウム法によりＢＦＣ０１２ストロマ細胞にトランスフェクトし、５０ｍｇ／mlのゼオシン（Zeocin；インビトロゲン社）中で選択した。また、ＢＦＣ０１２細胞をｐＺｅｏにも単独でトランスフェクトし、上記のようにして選択した。選択した母集団からのクローンを単離し、残ったすべてのコロニー（１００−２００／皿）を集め、母集団として拡大した。実施例６造血幹細胞およびｉｎｖｉｔｒｏ造血検定造血幹細胞母集団を、野生型のＬｙ５．２−Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ（ジャクソン・ラボラトリーズ）、１４日目胎児肝、イムノパンニングおよび蛍光活性化細胞選別によりＡＡ４．１、Ｓｃａ−１^-、ｃ−ｋｉｔおよびｌｉｎ^lo-表現型（フェノタイプ）を富化したものから得た。成人骨髄（ＢＭ）は、密度勾配遠心分離および免疫磁気ビーズ・ディプリーション法または前述のようにフロー・サイトメトリーにより、ＳＣＡ−１^-、ｃ−ｋｉｔ、ｌｉｎ^lo-細胞を富化した直後に使用した。細胞選別およびデータ解析は、セル・クエスト・ソフトウェアを使用したベクトン・ディキンソンＦＡＣＳバンテージ[Becton Dickinson Vantage]により実施した。ストロマ細胞／幹細胞の共同培養は、１ウェル当たり幹細胞を３００− １０００個に増やした１２穴トレーで行なった。玉石(cobblestone)領域を上記のように逆相顕微鏡により定量した。クローン原性前駆細胞検定は新たに精製した幹細胞またはストロマ共培養から採集した細胞のいずれかを用いて実施した。これらの細胞は製造者（ステム・セル・テクノロジーズ[Stem Cell Technologies]社）の勧奨に従い、サイトカイン含有の半固体培地中で培養した。確立されている基準に基づいて、前駆コロニーを８−１２日後に採点した。溶解性ｄｌｋおよび対照融合蛋白質は、半固体前駆検定では濃度０．１、０．５および１．０ｍｇ／ml、ならびにＢＦＣ０１２ストロマ共同培養には濃度０．１ｍｇ／mlで加えた。融合蛋白質は毎週ストロマ共同培養中に補給した。実施例７競合再集団化移植検定培養細胞を採集し、類遺伝子性のＣ５７ＢＩ／６Ｌｙ５．１マウス（国立がん研究所[National Cancer Institute]）に致死照射（１０Ｇｙ、¹³⁷Ｃｓ源から３時間あけて分割照射、１Ｇｙ／分）したＬｙ５．１マウスに移植して得た新鮮な未分画ＢＭと混合した。それぞれのマウスは２×１０⁵個の競合ＢＭ細胞と、共培養した幹細胞の１分画を受けた。マウスは眼窩静脈叢への毛細管穿刺で飼育し、１００mlをヘパリン含有（１０Ｕ／ml）ＤＭＥＭ中に採取し；赤血球はＮＨ₄ Ｃｌ溶離により除去した。Ｌｙ５．２（ＣＤ４５．２）対立遺伝子マーカ一の識別のために、ＦＩＴＣ標識の直接接合Ｌｙ５．２モノクローナル抗体またはテキサス・レッドにストレプトアビジンを接合したビオチニル化抗体のいずれかを使用して、凝集した有核細胞を染色した。これらの細胞はまた、系統マーカーに直接接合した抗体でも染色された。すべての抗体およびクロモゲン（色原体）はファーミンゲン[Pharmingen]から入手した。フロー・サイトメトリー分析は、セル・クエスト・ソフトウェアを使用したベクトン・ディキンソンＦＡＣＳバンテージにより行なった。実施可能性に関する補足本出願で請求した本発明は、本明細書および容易に入手できる参照文献と出発材料に基づいて実施することができる。しかしながら、出願人は１９９７年３月３日に、ｄｌｋトランスフェクト細胞系ＢＦＣ０１２を米国基準培養株収集機関（ＡＴＣＣ）に寄託した。この寄託は、特許手続きおよびそれに付随する規則（ブダペスト条約）の目的のための微生物寄託の国際承認に関わるブダペスト条約の条項に従って行なった。これによりこの生存培養物は寄託日から３０年間確実に維持される。これらの微生物はブダペスト条約の規定に基づき、また米国特許が発行された場合には無制限に入手できることとするという出願人とＡＴＣＣの合意に基づいて、ＡＴＣＣから入手することができる。ただし寄託基準株を入手できるということは、いかなる国においてもその特許法に基づいて付与される権利に違反して本発明を実施するライセンスを与える、ということを意味するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウィッテ，ローリーアメリカ合衆国 12582 ニューヨーク州, ストームヴィレ，ウィリアムズクロスロードアール．ディー．２ボックス 740 (72)発明者ペイトースキー，ブロニスローアメリカ合衆国 10034 ニューヨーク州, ニューヨーク，ウェスト 215スストリート 583，アパートメントエフ２ (72)発明者モーア，カテリ，エー. アメリカ合衆国 08540 ニュージャージー州，プリンストン，ハウトームアヴェニュー 248 (72)発明者レミシュカ，アイオー，アール. アメリカ合衆国 08540 ニュージャージー州，プリンストン，ファイヤーストーンコート＃４

Claims

【特許請求の範囲】１．幹細胞と十分な量のｄｌｋ蛋白質とを接触させることを特徴とする、幹細胞の分化を阻害するための方法。２．前記幹細胞が全能細胞である請求項１に記載の方法。３．前記幹細胞が多分化能細胞である請求項１に記載の方法。４．前記幹細胞が神経、上皮、内皮または中胚葉の幹細胞である請求項１に記載の方法。５．前記幹細胞が造血幹細胞である請求項１に記載の方法。６．前記ｄｌｋ蛋白質がヒトｄｌｋ蛋白質である請求項１に記載の方法。７．生体外において行う請求項１に記載の方法。８．前記幹細胞が造血幹細胞である請求項７に記載の方法。９．前記造血幹細胞がヒトの末梢血液、骨髄または臍帯血の中にある請求項８に記載の方法。１０．前記ｄｌｋが成長因子のカクテルと共に使用される請求項１に記載の方法。１１．前記ｄｌｋが造血幹細胞用の成長因子のカクテルと共に使用される請求項５に記載の方法。１２．前記ｄｌｋが５−フルオロウラシルと共に使用される請求項１に記載の方法。１３．前記ｄｌｋが５−フルオロウラシルと共に使用される請求項５に記載の方法。１４．前記ｄｌｋ蛋白質が細胞と独立している請求項１に記載の方法。１５．前記ｄｌｋ蛋白質が溶解性ｄｌｋ蛋白質である請求項１４に記載の方法。１６．前記ｄｌｋ蛋白質が細胞の表面に付着されている請求項１に記載の方法。１７．前記細胞かストロマ細胞である請求項１６に記載の方法。１８．前記ストロマ細胞が、ｄｌｋ遺伝子をトランスフェクトしたＢＦＣ０１２である請求項１７に記載の方法。１９．前記ストロマ細胞がＡＦＴ０２４である請求項１７に記載の方法。２０．幹細胞と非幹細胞との混合物に十分な量のヒトｄｌｋ蛋白質を接触させることを特徴とする、幹細胞と非幹細胞との混合物中の幹細胞の集団を増やすための方法。２１．前記幹細胞が造血幹細胞である請求項２０に記載の方法。２２．前記ｄｌｋが造血幹細胞用の成長因子のカクテルと共に使用される請求項２１に記載の方法。