JP2000513584A

JP2000513584A - トランスジェニックマウス

Info

Publication number: JP2000513584A
Application number: JP10543750A
Authority: JP
Inventors: 新一郎澤田
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1997-04-17
Filing date: 1998-04-17
Publication date: 2000-10-17
Also published as: US6255555B1; EP0975746A1; AU6853298A; WO1998046734A1

Abstract

(57)【要約】この発明は、少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質を発現することが可能なトランスジェニックマウス、このトランスジェニックマウスの作出に使用するトランスジーン、およびこのトランスジーンを用いたトランスジェニックマウスの作出方法を提供する。ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質は、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に関与するものであり、好ましくはヒトＣＤ４およびフーシン（CXCR4）である。このトランスジェニックマウスはヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質を発現する形質を子孫に遺伝することができ、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの動物モデルとして有用である。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニックマウス発明の背景 1. 発明の分野本発明は、ヒト疾患用モデル動物に関し、より詳細には、ヒト後天性免疫不全症候群（AIDS）用モデル動物として使用できるトランスジェニックマウスに関する。 2. 関連技術の開示ＨＩＶ（Human immunodeficiency virus）感染は、1981年アメリカで最初の感染患者が報告されて以来急速に世界に広がり、現在では2,000万人以上の感染者がいると推定される。ＨＩＶは、主にヒトのＣＤ４陽性血球系細胞（ヘルパーＴ細胞とマクロファージ）に感染する。ＨＩＶ感染症は潜伏期の後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の減少を特徴とするAIDS（エイズ）を引き起こし死に至るきわめて予後の悪い疾患である。現在でも、この疾患に対する有効な予防法（例えばワクチン）や治療法は確立されていない。さらに、ＨＩＶが免疫不全を引き起こす機構もまだ解明されていない。これらの問題の解決を遅らせている要因の一つは、適切な小型のＨＩＶ感染モデル動物がないことである。チンパンジーや猿といった類人猿はＨＩＶ感染モデル動物として利用されているが、管理コストの高さや施設の限定等の問題により小動物のＨＩＶ感染モデル動物が待望されていた。一方、最近、遺伝性免疫不全マウス（SCID マウス）にヒトの血球系細胞を移植し、移植されたヒト由来の血球にＨＩＶを感染させるマウスが感染モデル動物として開発され、一部の研究者に利用されている（J．M．McCuneら，Science，2 47：564-566，1990）。しかし、このマウスをＨＩＶ感染モデル動物として使用する場合、各個体ごとにヒトの血球系細胞を移植し、数週間経過して移植した血球系細胞が定着した後にＨＩＶを感染させなければならない。移植後のＧＶＨ（移植片対宿主反応）を防止するために、スキッドマウスを使用してはいるが、移植したヒトの血球系細胞の定着が不十分であったり、定着しない場合も生じ得る。このため、このマウスをＨＩＶ感染モデル動物の作出に利用する場合には、作出に熟練した技術を要すること、個々のマウスの形質が移植効率を反映して一定でないこと、ＨＩＶはマウス自体のリンパ球系細胞には感染しないのでＨＩＶによる免疫不全は引き起こされないこと等の問題があった。このため、遺伝的にＨＩＶに感染し、形質が一定で、ＨＩＶ感染患者にみられる免疫不全を発症する、小型のＨＩＶ感染モデル動物が待ち望まれていた。一方、1996年には、ＨＩＶ（Ｔ細胞親和性ＨＩＶ株、T cell line tropic HIV strain）がＴ細胞に侵入する際には、Ｔリンパ球細胞表面膜タンパク質であるＣＤ４とともに、別のＴ細胞細胞表面タンパク質であるフーシン（fusin/CXCR4 ）が必要であるということが明らかにされている（Y．C．Fengら，Science(Wash ．DC)，272：872-877，1996およびJ．F．Bersonら，J．Virol.，70：6288-6295 ，1996）。本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、少なくとも２種類のヒトＴ細胞表面タンパク質を、同時にマウスのＴリンパ球細胞表面に発現させたトランスジェニックマウスを作出することに成功した。発明の概要本発明は、少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質を発現することが可能なトランスジェニックマウスを提供する。本発明の実施態様により、ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質はＨＩＶ感染に関与するものであり、好ましくはＣＤ４およびフーシン（ＣＸＣＲ４）である。また、ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質をコードする遺伝子はマウスの同一の染色体、好ましくは生殖細胞および体細胞の両方の染色体に組み込まれ、マウスＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞表面に同時に発現していることを特徴とする。さらに、ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質を発現する形質は該トランスジェニックマウスから子孫に遺伝することが可能である。本発明の好適実施態様により、本発明はまた、マウスＣＤ４陽性Ｔリンパ球にヒト由来のＣＤ４とフーシンとを同時に発現しているトランスジェニックマウスを提供する。本発明はさらに、ヒトフーシン遺伝子およびヒトＣＤ４遺伝子を含むトランスジーンを提供する。トランスジーンの１つは、５’→３’方向に、マウスＣＤ４転写制御領域、ヒトフーシンｃＤＮＡ、およびポリＡ付加シグナルをこの順番で含むトランスジーンである。転写制御領域は、たとえばマウスＣＤ４エンハンサー、プロモーター、エキソンＩ、イントロンＩ、エキソンＩＩの一部、を含むことができ、特に図１ａに示されるコンストラクトａである。もう１つのトランスジーンは、５’→３’方向に、マウスＣＤ４エンハンサー、改変ヒトＣＤ４イントロンＩＩＩを有するヒトゲノムＣＤ４遺伝子改変体をこの順番で含むトランスジーンである。ヒトゲノムＣＤ４遺伝子改変体は、好ましくは、ヒトゲノムＣＤ４遺伝子の約３ｋｂ上流域および約３ｋｂの下流域を含む。改変ヒトＣＤ４イントロンＩＩＩは、イントロンＩＩＩの５‘側約１．５ｋｂの領域およびイントロンＩＩＩの３’側約３ｋｂ領域から構成されのが好ましい。本発明の実施態様により、トランスジーンは図１ｂに示されるものである。本発明はさらにまた、少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質をコードする遺伝子を含む少なくとも２種類の異なるトランスジーンを一緒に混合しマウスの受精卵にインジェクトし、得られた受精卵を仮親雌マウスに移植し、マウスを出産させ、少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質を発現することが可能な仔マウスを選択することを含む、トランスジェニックマウスの作出方法を提供する。この方法では、ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質およびトランスジーンはともに上記に定義したとおりであり、ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質は特にＨＩＶ感染に関与するものであり、本発明の実施態様によりヒトＣＤ４およびフーシンである。以下では、添付した図面に例示した具体例を参照しながら、さらに具体的に説明する。図面の簡単な説明図1a、1bは、ヒトゲノムＣＤ４遺伝子（改変型）またはヒトフーシンｃＤＮＡを含むトランスジーン（それぞれコンストラクトａ、コンストラクトｂ）の構築を示す。図２は、ヒトＣＤ４遺伝子およびヒトフーシン遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの末梢血リンパ球におけるヒトＣＤ４およびヒトフーシンの発現についてのフローサイトメトリーの結果を示す。図３は、ヒトＣＤ４遺伝子およびヒトフーシン遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの胸腺リンパ球におけるヒトＣＤ４およびヒトフーシンの発現についてのフローサイトメトリー分析の結果を示す。好適実施態様の説明本発明においてマウスのＴリンパ球細胞表面に発現させ得るＴリンパ球細胞表面膜タンパク質としては、ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４４、フーシン（fusin，CXCR4）などを挙げることができる（A.N．Barclay，“The Leukocyte Antigen Facts，Book”Academic Press）。これらはいずれもヒト由来のものであり、したがってＨＩＶのようなヒトウイルスの感染モデル動物を作製する上で好適である。フーシンは、ＣＸＣ−ケモカインＳＤＦ−１のレセプターであることが知られており（E．Oberlinら，Nature,382:833-835,1996）、フーシン等の膜貫通ケモカインレセプター類は造血系細胞の走化性因子として機能する（C．R ．Mackay，J．Exp．Med.,184:799-802,1996）。また、ＨＩＶにはマクロファージ親和性株とＴ細胞親和性株があり、マクロファージ親和性株は感染後の潜伏期に、一方Ｔ細胞親和性株はＡＩＤＳ発症期に関与するが、これらのＨＩＶ株はヒト細胞侵入時に互いに異なるケモカインレセプターを利用することが知られている（P.M．Murphy,Annu．Rev．Immunol.,12:593-633、D．Unutmazら，Proc． Natl．Acad．Sci．USA，94:1615-1618，1997およびJ.F．Bersonら,上掲）。本願発明のトランスジェニックマウスは、ＨＩＶ感染、特にそのＴ細胞親和性株感染に関与する少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質を発現することができる。ヒトＣＤ４とヒトフーシンは、ＨＩＶがヒトＴ細胞に侵入するために必要なＴリンパ球細胞表面膜タンパク質であるため、これらがマウスＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞表面に同時に発現されていることが好適である。上記のような細胞表面膜タンパク質をマウスのＴリンパ球細胞に適切に発現させることにより、多様なウイルス感染のモデル動物として使用可能なトランスジェニックマウスを作出することができる。本発明においては、少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質をコードする遺伝子は生殖細胞および体細胞の双方の染色体に導入することができる。これによって、ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質をマウスのリンパ球上に発現させ、かつ、安定して遺伝的に子孫に伝達される。本明細書中、「生殖細胞」とは個体にあって生殖の目的に分化した細胞をいい、「体細胞」とは個体を形成する細胞のうち生殖細胞以外のものの総称である。リンパ球は、体細胞の分化を介して形成される。少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質をコードする遺伝子は、胚形成期に導入することが好ましく、これらの遺伝子を細胞分裂期の受精卵細胞染色体に導入すると、メンデルの法則にしたがって導入遺伝子に由来する形質が子孫に遺伝し、これによってマウスの形質改変を行うことができる。ここで、胚形成期とは多細胞動物の個体発生初期をいう。少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質をコードする遺伝子は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４４、フーシンなどの膜タンパク質をコードするｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを特異的プローブまたは抗体を用いてスクリーニングし、これをＰＣＲなどの公知の方法を用いて増幅することによって得ることができる。あるいは、GenBank Accession No．M35160（GenBank）などのデータベースの情報をもとに、ＤＮＡシンセサイザーを用いて化学的に合成して得ることもできる。このようにして得た少なくとも２種類のＤＮＡを受精卵の核内に、インジェクションニードルを用いて同時に注入することにより、胚形成期にあるマウス胚に導入する。その場合、目的の遺伝子を受精卵の核内(特に前核内)に直接注入してもよく、または、適当な転写制御領域（たとえば、エンハンサー、プロモーター、サイレンサー等を含む）、ポリＡ付加シグナルなどの配列であってマウスゲノム上で目的遺伝子が適正に発現させるのに必要な該配列を含むトランスジーンを作製し、これを受精卵の核内に注入してもよい。このとき、マイクロインジェクター、マイクロマニピュレーターなどを用いてインジェクションすることができ、遺伝子導入効率の良さや作業の速さの理由から、マイクロインジェクターを使用することが好ましい。目的の遺伝子は別々にまたは同時に受精卵に導入することができるが、たった１回の導入操作のため導入に要する時間が短いこと、および受精卵が受けるダメージが少なくてすむことから同時に導入することが好ましい。本明細書中、トランスジーンとは、導入しようとする目的遺伝子のＤＮＡ配列を含む、トランスジェニックマウスを作出するためにマウスゲノムに導入するコンストラクトをいう。トランスジーンは、上記のＣＤ４やフーシンなどの少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質をコードするＤＮＡ配列の他に、これらのＴリンパ球細胞表面膜タンパク質遺伝子を適切に発現させるための転写制御領域（たとえばエンハンサー、プロモーター、サイレンサーを含む）を含むことができる。マウス体内で上記遺伝子を特異的に発現（転写）させるために、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーを含むマウス由来の転写制御領域をヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質をコードする塩基配列の上流に含むことが好ましい。しかしながら、転写制御領域がマウスの正常リンパ球の核クロマチン中で転写を適切に促進することを前もって確認する必要がある。本発明におけるトランスジーンは直鎖状、環状のいずれでもよいが、マウス染色体上への組み込み（すなわち、インテグレーション）の効率から、直鎖状のものとすることが好ましい。少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質を発現させるためのトランスジーンを構築する場合には、少なくとも２種類の異なる該膜タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に一緒に含むトランスジーンを作製してもよく、これらの異なる遺伝子を別個に含むトランスジーンを作製してもよい。以下に、ヒトＣＤ４をコードする遺伝子とフーシンをコードする遺伝子を別個に含む２つのトランスジーンを作製する場合を例にとって、本発明をさらに詳しく説明する。ヒトフーシンｃＤＮＡを含むトランスジーン（コンストラクトａ（図１ａ））の作製は次のようにして行うことができる。ＣＤ４エンハンサー、ＣＤ４プロモーター、およびＣＤ４サイレンサーを含むマウスＣＤ４転写制御領域と、ＳＶ４０由来のポリＡ付加シグナルをそれぞれ、マウスＣＤ４遺伝子を含むコスミド（S．Sawadaら，Mol．Cell Biol.，11:5506- 5515，1991）およびＳＶ４０遺伝子を含むプラスミド(例えばpSV2 ベクター；C ．Gorman，DNA Cloning，Vol．II，p.144，IRL Press)から適当な制限酵素を用いて目的の領域を切り出して調製する。ヒトフーシンｃＤＮＡを、このｃＤＮＡの上流および下流の配列をもとに作製した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ヒト末梢血リンパ球由来のｃＤＮＡライブラリー（たとえば、Human Peripheral Blood Leukocyte Qui ck−Clone^TM，Clontech）からＰＣＲにて増幅して調製する。ＰＣＲ法は通常、T aqポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で変性(９４℃、約30秒〜1分)、アニーリング（３０〜６０℃、約30秒〜1分）および伸長反応（６５〜７５℃、2〜5分）を１サイクルとして約20サイクル以上繰り返して実施される(J ．D．Watosonら，“Recombinant DNA”，second edition，pp.79-95，1992，Sci entific American Books)。ヒトフーシンｃＤＮＡの５'末端にマウスＣＤ４転写制御領域を、またその３' 末端にＳＶ４０ｐｏｌｙＡシグナルを、定法(T．Maniatisら，Mole cular Cloning A Laboratory Mannual (1989)，second edition，Cold Spring H abor Laboratory Press)によって連結し、適切なベクターにクローン化して図１ａに示されるようなコンストラクトａを作製する。ヒトＣＤ４遺伝子を含む別のトランスジーン（コンストラクトｂ（図１ｂ））の作製を以下に説明する。ヒトＣＤ４遺伝子を、市販のヒトゲノムライブラリー（例えばヒトゲノムライブラリー，Clontech社）からN．Killeenら，EMBO J．12:1547-1553，1993に記載されるヒトＣＤ４遺伝子の公知の核酸配列を基にして上記と同様にして調製した。このようにして得たヒトＣＤ４遺伝子を適当な制限酵素を用いてイントロンＩＩＩの５'側約１．５ｋｂの領域と、イントロンＩＩＩの３’側約３ｋｂの領域に切り分け、別々のプラスミドにクローニングした後、それらを結合させてイントロンＩＩＩ改変体を得た。ヒトＣＤ４遺伝子改変体は、ヒトＣＤ４プロモーターおよびヒトＣＤ４サイレンサーとを含む転写制御領域(ＣＤ４サイレンサーは実際にはヒトＣＤ４イントロンＩに含まれている。)と、ヒトＣＤ４遺伝子のすべてのエキソンと、イントロンＩＩＩの一部を除くすべてのヒトＣＤ４イントロンと、ＣＤ４遺伝子の下流領域(約３ｋｂ)とを含むことができる。イントロンＩＩＩは２０kb以上の大きさを有するため、イントロンＩＩＩの全体を含むトランスジーンを作製すると、インジェクションの効率または導入効率が下がることから、その一部を除くことが好ましい。また、マウスＣＤ４エンハンサーは、その公知の核酸配列（S．Sawadaら，Mol ．Cell Biol.，11:5506-5515，1991）を基にして上記と同様にして調製することができる。エンハンサーは約４．５ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片に含まれている(図１ｂ参照)。上記のヒトＣＤ４遺伝子の改変体の５’末端に、マウスＣＤ４遺伝子のエンハンサーを定法に従って連結し、適切なベクターにクローン化して図１ｂに示されるようなコンストラクトｂを作製する。上記のようにして作製した２つのコンストラクトを用いてトランスジェニックマウスを作出するためには、以下のようにして行うことができる。すなわち、各クローン化コンストラクトを適当な制限酵素で処理してベクター部分を切り離した後、アガロースゲル電気泳動により各ベクター部分とインサート部分を分離し、インサート部分をゲルから抽出する。上記のコンストラクトをそれぞれ精製し、１〜10μｇ/mlの濃度の溶液とする。ついで、上記コンストラクトを含有するこれらの溶液を混合し、マウスの受精卵に１〜２plをマイクロインジェクターを用いて注入する。トランスジェニックマウスの作出に使用するマウスは特に限定されず、例えば、BDF1、CDF1、DBA/2、C57BL/6(B6)などを例示することができる。BDF1が、排卵数、交尾率等の面から好ましい。また、トランスジェニックマウスが有する形質が安定して子孫に伝えられていくかどうかを調べるためのマウスとしては、例えば、C57BL/6、DBA/2、BDF1などを使用することができ、C57BL/6を使用することが解析のしやすさの面から好ましい。リンパ球には液性免疫を司るＢリンパ球と細胞性免疫を司るＴリンパ球とがあるが、上記の少なくとも２種類のヒト細胞表面膜タンパク質をマウスのＴリンパ球細胞上で発現させることにより、Ｔ細胞親和性株（Ｔ cell line tropic HIV strain）であるＨＩＶ（La、IIIB BH8などの株）の感染モデル動物としてトランスジェニックマウスを作出することができる。上記のようにして２つのコンストラクトを用いて処理したマウスの中から、ヒトＣＤ４とヒトフーシンの遺伝子またはｃＤＮＡが同一の染色体に組み込まれたものを選択する。上記２つの遺伝子がトランスジェニックマウスの同一の染色体に組み込まれていると、それらの遺伝子は同じ子孫に同時に伝違され、その形質はメンデルの法則に従って子孫に安定に遺伝する。したがって、子孫マウスが親と同じ形質を獲得でき、一定の形質を有するマウスを作出することができる。さらに、このようにして得たトランスジェニックマウスを使用すると、極めて再現性の高い研究を施行することができる。トランスジェニックマウスまたはその子孫マウスの胚に導入されたヒト遺伝子の検出は、各マウスの尾からＤＮＡを採取し、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識された³²Ｐ−ＤＮＡを用いるサザンハイブリダイゼーションにより分析することができる(M．Kriegler，“Gene Transfer and Expressi on，A Laboratory Manual，Freeman and Company)。また、ヒトＣＤ４とフーシンとが組織特異的に発現しているかどうかについては、蛍光抗体フローサイトメトリー法、in-situ RT-PCR、in-situ抗体染色法、ノーザンブロッティング法などによって調べることができる(M．Kriegler，上掲)。これらのヒト細胞表面タンパク質が末梢Ｔリンパ球および胸腺Ｔリンパ球で発現しているかどうかを、マウス末梢血および胸腺からＴリンパ球を分離して確認することができる。この確認は、例えば、Ｔ細胞からのＲＮＡの抽出や蛍光標識したモノクローナル抗体を用いた蛍光抗体法などによって行うことができ、蛍光抗体法を用いることが、簡便な操作で正確な結果を得られることから好ましい。蛍光抗体法を使用する場合には、市販の抗ヒトＣＤ４抗体を利用してもよいが、ヒトＣＤ４抗原を用いて常法に従って動物を免疫し、抗ヒトＣＤ４ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を得てもよい（例えばG．KohlerとG．Milstein， Nature 256:495，1975; T．Iwasakiら，Monoclonal A ntibody，Hybridoma and ELISA(1987)，Kodan-sha Scientific，日本）。抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体はＤＡＫＯ社（デンマーク、MT310）から市販されている。抗フーシンモノクローナル抗体もPharmingen社（San Diego，CA;12G5）から市販されている。これらの抗体は、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)、ＰＥ（フィコエリトリン(phycoerythrin)）、TRICOLOR^TM（TCとも称される；Caltag Laboratory，CA）などで標識することができる。抗ヒトＣＤ４および抗ヒトフーシン抗体は単独で使用してもよく、それぞれを任意の他の抗体と組み合わせて使用してもよい。蛍光標識したモノクローナル抗体と、トランスジェニックマウスまたはその子孫のＴリンパ球とを反応させて、ヒトＣＤ４およびヒトフーシンがＴリンパ球に発現されているかどうかを、フローサイトメトリー（例えばBecton Dickinson I mmunocytometry Systems，CAのFACS^TMを使用）を用いて調べることができる。抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体または抗ヒトフーシンモノクローナル抗体のいずれのモノクローナル抗体においても、対照と比較して蛍光強度が増大すれば、上記のＴリンパ球表面膜タンパク質が発現されていることを示している。抗マウスＣＤ４抗体と抗マウスＣＤ８抗体(ともにPharmin gen，CAから入手可能)を同時に上記反応に加えれば、三色フローサイトメトリーにより、ヒトＣＤ４およびヒトフーシンを発現しているＴリンパ球サブセットを確定することができる。このような抗体の組合わせとしては、抗ヒトＣＤ４−FI TC、抗マウスＣＤ４−ＰＥ、抗マウスＣＤ８−TRICOLORや、抗ヒトフーシン＋抗マウスIgG2a-FITC、抗マウスＣＤ４−ＰＥ、抗マウスＣＤ８−TRICOLORなどを挙げることができる。ヒトＣＤ４およびフーシンと同様にして、ＣＤ８，ＣＤ２５，ＣＤ４４等の他のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質をコードする遺伝子類をマウス染色体上に組み込むための同じかまたは異なるトランスジーンに導入し、マウス受精卵にインジェクションすることができる。ＣＤ８，ＣＤ２５，ＣＤ４４のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、A.N．Barclayら，“The Leukocyte Antigen Facts，Book ”，Academic Pressに記載されている。本発明のトランスジェニックマウスにおいては、後述の実施例で示されるようにヒトＣＤ４とヒトフーシンはともにマウスＣＤ４陽性Ｔリンパ球に特異的に発現しており、したがってＨＩＶがこのＣＤ４陽性Ｔリンパ球に感染することが可能であるり、ヒトＣＤ４陽性Ｔリンパ球が標的とするヒトＨＩＶと極めて類似した状態を提供することができる。このトランスジェニックマウスを用いることによりＨＩＶ感染の動物モデルをつくることができ、ＨＩＶ感染の仕組やＡＩＤＳの発症機構の研究、または様々な治療法や予防法の開発、特に抗ウイルス薬、遺伝子治療、ワクチン等の開発などに利用することが可能となる。さらに、このマウスはＨＩＶ−１に感染していなくても末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数が減少していることも判明し、したがってヒトにおいてＨＩＶ−１感染後期にみられるＡＩＤＳの症状と類似する表現型を呈する。それゆえ、このマウスはＡＩＤＳ発症機構の解明に役立つことが期待される。以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は単に説明のための例示であって、本発明を限定する意図はないことが理解されるべきである。実施例実施例１：トランスジーン（コンストラクトａおよびｂ）の作製図１に示す２つのコンストラクト（トランスジーン）を構築した。ヒトのフーシン遺伝子（CXCR4）は以下のようにして得た。（１）ヒトフーシン遺伝子（CXCR4）の調製ヒトcDNA遺伝子の上流および下流の配列(H．Nomuraら，Int．Immunol．5:1239 -1249，1993)をもとに合成した下記のプライマー：を用いて、ヒト末梢血リンパ球由来のcDNAライブラリー(Human Peripheral Bloo d Leukocyte Quick−Clone^TM，Clonetech，Palo Alto，CA)からＰＣＲにて増幅して調製した。ＰＣＲ条件は、94℃１分、55℃１分、72℃３分を１サイクルとして30サイクル繰り返した後、72℃15分とした。ＰＣＲに用いた酵素およびバッファーは、クローンドPfuＤＮＡポリメラーゼ(cloned Pfu DNA polymerase，Strat agene，La Jolla，CA)および付随のバッファーを用いた。（２）コンストラクトａの作製図１ａに、マウスＣＤ４遺伝子とトランスジーン（コンストラクトａ）を示す。マウスＣＤ４のエキソンIIとエキソンIIIとを含むHindIIIゲノムフラグメントをマウスのコスミドクローン（コスミド６：S．Sawadaら，Mol．Cell Biol.，11 :5506-5515，1991）から切り出し、pBluescript KS(-)中にサブクローニングした。エキソンIIからの翻訳開始コドンを部位特異的突然変異誘発により除き、その残部にSalI部位とNotI部位とを導入した。その結果できたNotIフラグメントは、イントロンＩの一部とエキソンIIの非翻訳領域とを含む。このNotIフラグメントをpNN03ベクター（S．Sawadaら，上掲）のNotI部位にサブクローニングした。このpNN03ベクターは、ポリリンカーが改変されたpUC18ベクターで、ポリリンカーの両端がNotI部位となっているものである。ＳＶ４０遺伝子を含むプラスミドpDD2（S．Sawadaら，Cell，77:917-929，199 4）から、ClaIとNotIとにより、ＳＶ４０のポリアデニル化部位を含むClaI-NotI フラグメントを得た。このフラグメントをクレノウＤＮＡポリメラーゼＩ（Klen ow DNA polymerase I）を用いて平滑末端化し、その後、同一の酵素で前もって平滑末端化されたpNN03のSalI部位に挿入した。これにより、SalI部位は再構成された。ついで、上記（１）のようにして作製したhCXCR4のｃＤＮＡを含むSalIフラグメントを、このようにして再構成されたpNN03のSalI部位に挿入しプラスミドを得た。次に、コスミド６をHindIIIで処理して、すべてマウスＣＤ４に由来する５'フランキング領域、エキソンＩ、およびイントロンＩの一部を含むフラグメントを分離し、そのフラグメントを上記のようにして得たプラスミドのHindIII部位に挿入した。この後、プラスミドのHindIII部位に挿入したエキソンＩのKpnI部位の上流の５'フランキング領域を、最小のプロモーターを含むマウスＣＤ４のXba I-KpnIフラグメント（487bp）で置き換えた。 339bpのマウスＣＤ４の最小のエンハンサーを、EcoRIで切断した上記最終産物プラスミドの５'末端のEcoRI部位に挿入し、コンストラクトａを得た。上記の遺伝子のすべてのライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて行われた。図１ａに示したマウスＣＤ４遺伝子は、エンハンサー、プロモーター、エキソンＩ〜エキソンII上流部分を含む。ここで、ATGは翻訳開始部位を示す。図１中に示すコンストラクトａは、５’→３’方向に、マウスＣＤ４転写制御領域（すなわち、ＣＤ４エンハンサーとＣＤ４プロモーターを含むマウスＣＤ４遺伝子上流域）、エキソンＩ、イントロンＩ、エキソンIIの一部、およびヒトフーシン（human CXCR4）ｃＤＮＡをこの順序でつなげてある連結産物である。フーシンcDNAの３’末端には、ＳＶ４０由来のポリＡ付加シグナルが結合されている（図１ａ）。図１ａ中、Ｉ、II、IIIはエキソンを表し、Ｐ、Ｓ、Ｘ、ＳｐおよびＨはそれぞれ、制限酵素PstI、SacI、XbaI、SphI、およびHindIIIの認識部位である。なお、PstIおよびSacIに関しては、全部位は示していない。（２）コンストラクトｂの作製コンストラクトｂを作製するために、ヒトＣＤ４遺伝子をヒトゲノムライブラリー（λファージライブラリー；Clontech）から特異的プローブを用いてスクリーニングした。コンストラクトｂの作製には、ヒトＣＤ４遺伝子がEcoRI部位に挿入されている２種類のプラスミド（pUCl3）、すなわちPuc/hg１およびPuc/hg６を使用した（図１ｂ）。Puc/hg１には、ヒトＣＤ４遺伝子の５’末端の約３kb上流域、エキソンＩ、イントロンＩ、エキソンII、イントロンII、エキソンIII、イントロンI IIの５’側約1.5kbの領域が含まれている。Puc/hg６には、ヒトＣＤ４イントロンIIIの３’側約3kbの領域、ヒトＣＤ４エキソンIV、イントロンIVからエキソンＸ、およびヒトＣＤ４遺伝子下流域約３kbが含まれている。 Puc/hg１およびPuc/hg６から、EcoRI消化を用いて図１に示す２つのフラグメントを得た。ここで得られた２つのフラグメントをＴ４リガーゼでライゲーションし、別のプラスミドpNN03(S．Sawadaら，Cell，77:917-929，1994)にクローニングして改変した。これにより大部分のイントロンIIIの領域を天然型ヒトＣＤ４遺伝子から除いた（図１ｂ）。この改変ヒトＣＤ４遺伝子は、ヒトＣＤ４遺伝子の転写制御領域（すなわち、ＣＤ４プロモーターを含む約３ｋｂ）、ヒトＣＤ４遺伝子のすべてのエキソンと、イントロンIIIの一部分を除くすべてのイントロンと、ヒトＣＤ４遺伝子の下流領域(約３ｋｂ)とを含んでいた。また、マウスＣＤ４遺伝子のエンハンサーをマウスコスミドクローン（コスミド６）からBaIIIおよびEcoRIにより切り出して得た。このエンハンサーは4.5kb のサイズを有し、レポーターアッセイにより決定されるエンハンサー活性を有していた（M.C.B.，vol．11，No.11，p5506-5516，1991）。この後、上記のようにして得た改変ヒトＣＤ４遺伝子の５’末端に、上記のようにして得たマウス由来のＣＤ４遺伝子エンハンサーを、Ｔ４リガーゼを用いてライゲーションした（図１ｂ）。（３）コンストラクトａおよびｂの精製実施例１および２で作製したコンストラクトａおよびコンストラクトｂを制限酵素（NotI）で処理してベクター部分とインサートを切り離した後、アガロースゲル電気泳動にて分離・精製し、10μｇ/mlの濃度の溶液に調製した。実施例２：トランスジェニックマウスの作出（１）受精卵の採取とマニュピレーション BDFlマウス（雌、４〜６週齢）に５単位のPMSG（pregnant mare serum gonado tropin）を投与し、その４８時間後に５単位のＨＣＧ（human chorionic gonado tropin）をさらに投与し、過剰排卵を誘発させ、雄マウスと交尾させた。翌日、交尾を確認したのちに、この雌マウスから卵管と子宮の一部をつけたまま取り出し、そのものから、1ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含む培養培地中で受精卵を得た。ついで、このコンストラクトａおよびコンストラクトｂを含む溶液をマイクロインジェクターを用いて、上記のようにして得たマウスの受精卵の核小体にインジェクションした。（２）トランスジェニックマウスの作出上記（1）に記載のようにしてコンストラクトａおよびコンストラクトｂを導入した受精卵を、仮親（BDF1、６〜15週齢）の卵管内に注入し、環境を制御した施設で妊娠期間の終了まで飼育して、生まれてきた仔マウスのゲノムに２つのコンストラクトが組み込まれているかどうかを調べた。（３）マウスへの遺伝子の導入の確認この仮親から生まれた仔マウス（４週齢）について、上記２つのコンストラクトが組み込まれているか否かを、以下のようにして調べた。すなわち、この仔マウスから尾を採取してＤＮＡを得た。このＤＮＡを、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識した³²Ｐ−ＤＮＡプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションで分析した。このプローブはヒトＣＤ４ｃＤＮＡ(T.W．Ho dgeら，Hum．Immunol.，30:99-104，1991)およびヒトフーシンｃＤＮＡ(H．Homu raら，Int．Immunol.，5:1239-1249，1993)より調製したものであり、以下のものである：ヒトＣＤ４およびヒトフーシンの発現は、トランスジェニックマウスから得たＴリンパ球を蛍光標識したモノクローナル抗体を用いて調べた。このとき、ヒトＣＤ４に対するモノクローナル抗体（MT310）はDAKO社(Glostrup，Denmark)より FITCラベルされたものを購入し、ヒトフーシンに対するモノクローナル抗体（12 G5）は、James A．Hoxie博士（Pensylvania University）より恵与された。なお、12G5抗体はPharmingen社(Sab Diego，CA)から市販されている。上記の２つの標識抗体を、上記の仔マウスから得たリンパ球と４℃で30分程度反応させ、12G5にはさらに抗マウスIgG2a-FITC(Pharmingen)を反応させた。これらの抗体との結合による蛍光強度のプロファイルの変化を、フローサイトメトリー法で調べて、対照マウスからの結果と比較した。フローサイトメトリーの結果より、上記のコンストラクトａおよびｂの両方が導入されていることが示された仔マウスを、ダブルトランスジェニックマウスとして選択した。さらに、蛍光強度の測定値に基づき、これら２つのタンパクの発現量の最も多いマウス＃12（雄）を得た(表１)。表１マウスＣＤ４陽性Ｔリンパ球中のトランスジーンの発現 1）創始マウス（BDGF1）とB6マウスとを交配させて生まれた仔マウスのリンパ球をフローサイトメトリー法で分析した。 2）仔マウス＃２０におけるヒトフーシンの発現は末梢ＣＤ４陽性リンパ球では認められないが胸腺ＣＤ４陽性Ｔリンパ球で認められた。実施例３：トランスジーンによって導入された形質の安定性の確認マウス＃１２をC57BL/6J雌マウスと交配し、出生したマウスの尾を採取してＤＮＡを得た。このＤＮＡを上記実施例２と同様にして分析した。ヒトＣＤ４とヒトフーシンの発現を、実施例２と同様にフローサイトメトリーでタンパクレベルで解析した。このとき、ヒトＣＤ４に対するモノクローナル抗体としてMT3310を用い、ヒトフーシンに対するモノクローナル抗体として12G5をそれぞれ用いた。トランスジーンの発現を図２および図３に示した。図２および図３ともに、上段に非トランスジェニックマウス（対照、non-TGと示す）についてのヒトＣＤ４（ｈＣＤ４）とヒトフーシン（ｈＣＸＣＲ４）のフローサイトメトリーの結果を、また、下段にトランスジェニックマウス（ＴＧ）についての結果をそれぞれ示した。図２はマウス末梢血リンパ球における発現を調べたものであり、図３はマウス胸腺リンパ球における発現示す。これらの細胞は三色フローサイトメトリーで調べたものであり、このとき、抗ヒトＣＤ４−FI TC(DAKO社)、抗マウスＣＤ４−ＰＥ（Pharmingen社）および抗マウスＣＤ８−TR ICOLOR^TM（Caltag社，Burlingame，CA）からなる組；または抗ヒトフーシン＋抗マウスIgG2a-FITC(Pharmingen社)、抗マウスＣＤ４−ＰＥおよび抗マウスＣＤ８ −TRICOLOR^TMからなる別の組を用いた。図２および図３に示すように、トランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスとのリンパ球におけるヒトＣＤ４とヒトフーシンの発現についてのフローサイトメトリーの分析の結果、トランスジェニックマウスにおいて、ヒトＣＤ４とフーシンとがともに発現していることが示された。しかも、図２および図３の三色フローサイトメトリー分析が示すように、それらのヒトタンパク質の発現はマウス末梢ＣＤ４陽性Ｔリンパ球およびマウス胸腺ＣＤ４陽性Ｔリンパ球に限定されており、この発現は組織特異的であり、またコンストラクトａおよびｂに含まれるＣＤ４転写制御領域の作用によるものであることを示した。このような作用は、マウス末梢リンパ球（図２）でも胸腺リンパ球（図３）でも観察された。すなわち、トランスジェニックマウスのＣＤ４陽性Ｔリンパ球はヒトＣＤ４およびヒトフーシン両分子をリンパ球細胞表面に発現していることが示された。なお、ここには示さないが、これら２つの分子の発現量は、ヒトＣＤ４陽性Ｔリンパ球における発現量に比べて多かった。以上より、トランスジェニックマウス＃12およびその仔マウスのＣＤ４陽性Ｔリンパ球においては、ヒトＣＤ４とフーシンとが同時に発現されていた。したがって、トランスジェニックマウスでは、例外なく両方のコンストラクトａおよびｂが導入されていること、および上記コンストラクトａおよびｂは同じ染色体中に組み込まれていた。この形質は、メンデルの法則に従って同時に子孫に伝わっていくものと考えられる。本発明において、開示される全ての変形または変更が文言的には添付の請求の範囲の範囲内に包含され得ない程度であっても、それらの変形または変更が均等論下に本発明の一部であると考えられる、と理解されるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年５月４日（１９９９．５．４）【補正内容】請求の範囲１．マウスのＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞表面上にヒトＣＤ４およびヒトフーシン（ＣＸＣＲ４）を同時発現することが可能なトランスジェニツクマウス。２．前記同時発現が、同一染色体中への前記ＣＤ４およびフーシンをコードする遺伝子の組み込みによるものである、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。３．前記ＣＤ４およびフーシンを同時発現する形質がマウスの子孫に遺伝する、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。４．下記の順序で５’→３’方向に、マウスＣＤ４エンハンサーと、マウスＣＤ４プロモーターと、マウスＣＤ４エキソンＩと、マウスＣＤ４イントロンＩと、マウスＣＤ４エキソンＩＩの一部とを含むマウスＣＤ４転写制御領域、ヒトフーシンｃＤＮＡ、およびポリＡ付加シグナルを含むトランスジーン。５．図１ａに示されるコンストラクトａである、請求項４に記載のトランスジーン。６．図１ｂに示されるコンストラクトｂであるトランスジーン。７．トランスジェニックマウスの作出方法であって、（i）請求項４または５に記載のトランスジーンと請求項６に記載のトランスジーンを一緒に混合し、（ii）該混合物をマウスの受精卵にインジェクトし、（iii）得られた受精卵を仮親雌マウスに移植し、（iv）該移植マウスを出産させ、（ｖ）マウスのＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞表面上にヒトＣＤ４およびヒトフーシンを同時発現することが可能な仔マウスを選択することを含む、前記方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1. 少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質を発現することが可能なトランスジェニックマウス。 2. ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に関与するものであることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニックマウス。 3. ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質が、ＣＤ４およびフーシン（CXCR4）であることを特徴とする請求項２に記載のトランスジェニックマウス。 4. 発現が、ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質をコードする遺伝子の同一染色体中への組み込みによるものであることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニックマウス。 5. ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質を発現する形質がマウス子孫に遺伝することを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニックマウス。 6. ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質がマウスＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞表面に同時に発現していることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニックマウス。 7. マウスＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞表面にヒト由来のＣＤ４とフーシンとを同時に発現することが可能なトランスジェニックマウス。 8. ５’→３’方向に、マウスＣＤ４転写制御領域、ヒトフーシンｃＤＮＡ、およびポリＡ付加シグナルをこの順番で含むトランスジーン。 9. 転写制御領域がマウスＣＤ４のエンハンサー、プロモーター、エキソンＩ、イントロンＩ、エキソンＩＩの一部、を含むことを特徴とする請求項８に記載のトランスジーン。 10. 図１ａに示されるコンストラクトａであることを特徴とする請求項９に記載のトランスジーン。 11. ５’→３’方向に、マウスＣＤ４エンハンサー、改変ヒトＣＤ４イントロンＩＩＩを有するヒトゲノムＣＤ４遺伝子改変体をこの順番で含むトランスジーン。 12. 改変ヒトＣＤ４イントロンＩＩＩが、ヒトＣＤ４イントロンＩＩＩの５’ 側約１．５ｋｂの領域およびヒトＣＤ４イントロンＩＩＩの３’側約３ｋｂの領域から構成されることを特徴とする請求項11に記載のトランスジーン。 13. ヒトゲノムＣＤ４遺伝子改変体が、ヒトゲノムＣＤ４遺伝子の約３ｋｂ上流域および約３ｋｂの下流域を含むことを特徴とする請求項11に記載のトランスジーン。 14. 図１ｂに示されるコンストラクトｂであることを特徴とする請求項11に記載のトランスジーン。 15. 少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質をコードする遺伝子を含む少なくとも２種類の異なるトランスジーンを一緒に混合し；その混合物をマウスの受精卵にインジェクトし；得られた受精卵を仮親雌マウスに移植し；移植マウスを出産させ；少なくとも２種類のヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質を発現する仔マウスを選択することを含む、トランスジェニックマウスの作出方法。 16. ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質がＨＩＶ感染に関与するものであることを特徴とする請求項15に記載の方法。 17. ヒトＴリンパ球細胞表面膜タンパク質がヒトＣＤ４およびフーシン(CXCR4) であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。 18. トランスジーンが、５’→３’方向に、マウスＣＤ４転写制御領域、ヒトフーシンｃＤＮＡ、およびポリＡ付加シグナルをこの順番で含むものであることを特徴とする請求項15に記載の方法。 19. トランスジーンが図１ａに示されるコンストラクトａであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。 20. トランスジーンが、５’→３’方向に、マウスＣＤ４エンハンサー、改変ヒトＣＤ４イントロンＩＩＩを有するヒトゲノムＣＤ４遺伝子改変体をこの順番で含むものであることを特徴とする請求項15に記載の方法。 21. トランスジーンが図１ｂに示されるコンストラクトｂであることを特徴とする請求項20に記載の方法。