JPH09500025A

JPH09500025A - 敗血症モデル

Info

Publication number: JPH09500025A
Application number: JP7514946A
Authority: JP
Inventors: ラエスク−マンユーン、; タクダブリュー．マク、
Original assignee: アムジェンカナダインコーポレイテッド
Priority date: 1993-11-29
Filing date: 1994-11-28
Publication date: 1997-01-07
Also published as: EP0734201A1; CA2175250A1; WO1995014377A3; WO1995014377A2; AU1075895A

Abstract

(57)【要約】ダブルノックアウトダブルトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。この哺乳動物は、敗血症を治療もしくは予防するための療法を評価するモデルとして有用である。

Description

【発明の詳細な説明】敗血症モデル発明の背景発明の技術分野本発明は、組換ＤＮＡ技術により生産される非ヒト哺乳動物に関する。より詳細には本発明は、敗血症および他の病気に対し感受性であると共に有効な治療化合物をスクリーニングするのに有用である非ヒト哺乳動物に関するものである。関連技術の説明インビボスクリーニング系化合物をそのヒト治療剤としての能力について評価するには、インビボ系における化合物の効能に関するデータおよび情報を必要とする。理想的には、データ収集に用いるインビボ系は人間がよい。しかしながら倫理的および実用的な理由から、人間でない実験動物が薬物開発のためのインビボスクリーニングの系として典型的に用いられる。実験動物は有力な治療剤の効能を評価すると共に治療剤の生じうる副作用を確認するモデル系として使用するのに役立つが、この種のモデルは限界を有している。１つの重要な限界は、病気の抵抗性および感受性における実験動物と人間との間の相違である。これら相違は、しばしば免疫系の構造および機能における種間の相違に基づいている。したがって、化合物をヒトにおけるその治療価値につき評価するには、ヒト免疫系に類似する免疫系を持った動物モデルを得ることが有用である。トランスジェニックおよびノックアウト技術組換ＤＮＡ技術における最近の進歩は、研究者がたとえばマウスのような動物を遺伝子的に操作することを可能にした。トランスジェニック哺乳動物の発生およびノックアウト哺乳動物の発生の技術は、内生の遺伝子を発現しない動物（ノックアウト動物）を生産すべく或いは１個もしくはそれ以上の外因性もしくは非相同性の遺伝子を有する動物（トランスジェニック動物）を生産すべく研究者により用いられている。トランスジェニック哺乳動物の生産は、しばしばトランスジーン（transgene ）と呼ばれる新規な核酸配列を哺乳動物の１個もしくはそれ以上の染色体に挿入することを含む。典型的にはＤＮＡで構成されるトランスジーンは特定のポリペプチドをコードする。トランスジーンは典型的にはマイクロインジェクションにより卵子の前核（pronucleus）に挿入され、ここで発育中の胚のＤＮＡに組込まれる。次いで、この胚は妊娠継続のため「代理宿主」に移植される。代理宿主の子孫を新規なＤＮＡの存在について評価する。トランスジーンの発現、すなわちトランスジーンＤＮＡ配列によりコードされる蛋白質の産生は哺乳動物に新規な表現型を付与することができる。哺乳動物に挿入するトランスジーン、用いる制御要素（たとえばプロモータおよびエンハンサー／サイレンサー）、並びにトランスジーンの発現パターンおよび発現レベルに応じ、哺乳動物は多かれ少なかれ特定の病気または一連の病気に対し感受性となりうる。この種のトランスジェニック哺乳動物は、病気を治療もしくは予防するのに有用である化合物ををスクリーニングすると共に試験し、かつ／または病気の治療もしくは診断に有用な方法を開発するのに価値がある。ノックアウト哺乳動物の生産は、「ノックアウト」すべき遺伝子の発現を抑制するよう設計された核酸配列（一般にＤＮＡ）を胚性幹細胞（すなわちＥＳ細胞）と呼ばれる未分化細胞ラインに挿入することを必要とする。核酸配列がＥＳ細胞に挿入された後、このＥＳ細胞を発育中の哺乳動物胚に注入し、ここで望ましくは発育中に胚に組込まれて胚の１部となる。次いで胚を妊娠継続のため代理宿主に移植する。免疫系成分全ゆる哺乳動物種の免疫系は、極めて複雑に共同作用して哺乳動物をたとえば各種の病原体、毒素などの危険な外来物質から保護する多くの特異的細胞で構成されている。免疫系における多くの細胞タイプはその作用を発揮して、ＭＨＣ（主要組織適合性遺伝子複合体）として知られる一連の蛋白質を介し外来物質の一部を認識する。マウスのＭＨＣはＨ−２複合体（「Ｈ−２」）として知らていれる。ヒトのＭＨＣはＨＬＡ複合体（「ＨＬＡ」）と呼ばれる。ＨＬＡ複合体は１００個以上の遺伝子で構成されている［クライン（Klein）等、Sci．Am.、第２６９巻、第７８〜８３頁（１９９３）］。ＭＨＣの顕著な特徴は、ＭＨＣ座（座は遺伝子の染色体位置として規定される）の多くがヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列において、異常なほど多くの対立遺伝子もしくは変異体を有している点である。ＭＨＣ蛋白は一般にＭＨＣクラスＩ（「ＭＨＣＩ」）およびＭＨＣクラスII（「ＭＨＣ II」）と呼ばれる２種類に分類される。ＭＨＣクラスＩ蛋白は膜結合性蛋白質であって、ほとんど全ての有核細胞の表面で発現されている。ＭＨＣクラスII蛋白も膜結合性蛋白質であるが、或る種の免疫系細胞（すなわち樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞）の表面でのみ発現されている。ＭＨＣクラスII蛋白は免疫系での外来物質の認識および攻撃に対し重要な役割を演ずる。大抵の外来物質が体内に浸入すると先ず最初にたとえばマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）により認識され、マクロファージはこの物質に結合すると共にこれを摂取し、処理する。処理された物質の各部分はマクロファージの表面上のＭＨＣクラスII蛋白に結合することができる。マクロファージの表面でＭＨＣに結合した物質の「誇示」に関するこの提示は、免疫系の他の細胞（たとえば或る種のＴ細胞）が外来物質を認識してこれに反応することを可能にする。Ｔ細胞は「活性化」状態となり、増殖すると共に外来物質に対し有害な化合物を放出するよう誘発される。さらに、Ｔ細胞の活性化は免疫系の他の細胞を活性化させて物質に対する攻撃を開始させるのに役立つ。Ｔ細胞（すなわち免疫系細胞の１つのタイプ）はその細胞表面に各種の蛋白質を発現する。これら蛋白質の多くは細胞外の物質の認識および結合および／または細胞シグナリングに関与する。２つの重要なＴ細胞表面分子はＣＤ４およびＣＤ８である。ＣＤ４は分子量約５５ｋＤの糖蛋白モノマーである。ネズミＣＤ４はＬ３Ｔ４にコードされ、約２６ｋｂのおおきさである。ＣＤ８はジスルフィド結合したヘテロダイマーである。ヒトにおいては、２個のＣＤ８モノマーをコードする遺伝子はＣＤ８αおよびＣＤ８βと呼ばれる。マウスにおいては、ＣＤ８ヘテロダイマーを構成するモノマーは遺伝子Ｌｙｔ−２およびＬｙｔ−３にコードされている。Ｌｙｔ−２は約４．４ｋｂのおおきさであって５個のエクソンを有している。未成熟Ｔ細胞はその細胞表面にてＣＤ４とＣＤ８との両者を発現する。細胞が成熟すると、これらはＣＤ４もしくはＣＤ８のいずれかの発現を停止する。すなわち成熟Ｔ細胞は、これらがＣＤ４もしくはＣＤ８を発現するかどうかに基づいて分類される。一般に、ＣＤ４のみを発現する成熟Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞と呼ばれ、ＭＨＣクラスII分子に結合した抗原を認識してこれと反応する。一般に、ＣＤ８のみを発現する成熟Ｔ細胞は細胞障害Ｔ細胞と呼ばれ、ＭＨＣクラスＩ分子に結合した抗原を認識してこれと反応する。ＭＨＣ、ＣＤ４およびＣＤ８の各分子は種の間でアミノ酸配列が相違している。すなわち、１つの種は病原体もしくは物質を外来物として認識すると共にこれに対する反応を開始する一方、他の種はそのようには作用しない。さらに、いずれかの毒素もしくは病原体に対する反応は種内の間の差も存在する（すなわち、異なる種および同一種の異なるメンバーは特定の毒素もしくは病原体に対し極めて感受性であるのに対し、他の種は体内におけるその存在に対して寛容性が高い）。これはＭＨＣ座の多くの異なる対立遺伝子の変化に起因する（上記した通り）。各々の種の個々のメンバーは各ＭＨＣ座にてこれら対立遺伝子型の１個のみ或いは多くとも２個を発現し、異なる対立遺伝子型は異なる病原体を提示もしくは結合する能力において相違する。免疫系の分子の活性および認識における種間の差を理解する試みにおいて、研究者等は（１）免疫系の蛋白質をコードするヒトのトランスジーンを有し、かつ／または（２）免疫系の蛋白質をコードする１個もしくはそれ以上の内生の遺伝子を発現しないような実験動物を作り上げた。ニシムラ（Nishimura）等、［J．Immunol.、第１４５巻、第３５３〜３６０頁（１９９０）］は、ヒトのＨＬＡ−ＤＱｗ６蛋白（すなわちＭＨＣクラスII蛋白ファミリーの１員）のαおよびβ鎖をコードするトランスジーンを持ったマウスについて記載している。バザガ−ギルバート（Barzaga-Gilbert）等、［J．Exp．Med．、第１７５巻、第１７０７〜１７１５頁（１９９２）］は、ヒトのＣＤ４をコードするトランスジーンを持ったマウスについて記載している。得られたトランスジェニックマウスの数種の系統はＴ細胞上にヒトおよびネズミの両ＣＤ４分子を発現しているが、それらは異なるレベルであった。キリーン（Killeen）等、［EMBO J.、第１２巻、第１５４７〜１５５３頁（１９９３）］は、内生のＣＤ４の発現を欠くが、ヒトのＣＤ４をコードするトランスジーンを持ったマウスについて記載している。ロベイ（Robey）等、［Cell、第６４巻、第９９〜１０７頁（１９９１）］は、ヒトのＣＤ２調節配列の制御下でネズミのＣＤ８を発現するトランスジェニックマウスについて記載している。テー（Teh）等、［Nature、第３４９巻、第２４１〜２４３頁（１９９１）］は、ネズミのｌｃｋプロモータの制御下でネズミのＣＤ４トランスジーンを有するマウスについて記載している。報告によれば、得られたトランスジェニックマウスは全ての胸腺細胞サブセットおよび全ての末梢Ｔ細胞にてＣＤ４を発現した。クリンペンフォルト（Krimpenfort）等、［１９９２年１２月２９日発行の米国特許第５，１７５，３８４号］は、成熟Ｔ細胞もしくは形質細胞を実質的に欠失したトランスジェニックマウスを記載している。１９９２年１２月２２日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／２２６４５号は、報告によれば免疫欠損性であって、野生型マウスと比較し他の種から一層容易に組織／器官移植体を維持しうるようなトランスジェニックマウスについて記載している。ラヘムツラ（Rahemtulla）等、［Nature、第３５３巻、第１８０〜１８４頁（１９９１）］は、内生のＣＤ４を発現しないマウスについて記載している。フング−ロイング（Fung-Leung）等、［Cell第６５巻、第４４３〜４４９頁（１９９１）］は、内生のＣＤ８分子の発現を欠くマウスについて記載している。シルハム（Schilham）等、［Eur．J．Immunol.、第２３巻、第１２９９〜１３０４頁（１９９３）］は、内生のＣＤ４およびＣＤ８の両者の発現を欠くマウスについて記載している。敗血症（sepsls）ヒトの血液もしくは組織内の生物体および／またはそれらの毒素を原因とする病気は、敗血症として知られる症状をもたらす。たとえば大腸菌（E coli）、肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、緑膿菌（Pseudomon as aeruginosa）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ）および髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）のような微生物により誘発される敗血症の徴候は発熱、下痢、血圧低下、血液漏洩および／または各種の器官における播種性の血液凝固を包含する。敗血症のよる死亡率は約３５％であり［アルドリッジ（Aldridge）、TIBTech、第１１巻、第３７３〜３７５頁（１９９３）］、敗血症ショックでは５０％に到ると推定されている。敗血症の１つの重大な形態は敗血症性ショックと呼ばれ、敗血症を有する個人は大きな血圧低下を体験する。敗血症ショックの治療は即座の血圧回復を必要とし、典型的には体液および／または変力剤、並びに広いスペクトルを有する抗生物質を投与して行われる。敗血症の原因として確認されている多数の毒素が存在する。これらにはエキソトキシン（侵襲生物により分泌される毒素）およびエンドトキシン（侵襲生物の細胞壁の成分である毒素、たとえばＬＰＳ、すなわちリポ多糖類）がある。鋭意検討された１群のエキソトキシンはブドウ球菌エンテロトキシン（Staphy lococcal enterotoxin）および関連のエンテロトキシンである。これらのエンテロトキシンは、各種の連鎖球菌（Streptococcus）およびブドウ球菌（Staphylococcus）により産生され、病原体に対する攻撃を開始するために生体の免疫系を活性化するのと同様なメカニズムで作用する蛋白質である。エンテロトキシンのこの群のメンバーは「スーパー抗原」として知られる。ＭＨＣII およびＴ細胞に結合するスーパー抗原のメカニズムは他の抗原のメカニズムとは異なる。スーパー抗原はＴ細胞リセプタとＭＨＣII分子とに同時に結合し、これによりＴ細胞の抗原結合特異性とは無関係に多数のＴ細胞を活性化する。この結果、多量のサイトカインが体内に放出され、最終的にショックをもたらす。通常の抗原に対する結合メカニズムは、特定のＭＨＣII分子における極めて明確なグルーブに結合することである。次いでこの抗原／ＭＨＣII複合体は極めて特異性の高いＴ細胞サブセット（すなわち特定の抗原／ＭＨＣII複合体に対し特異性であるリセプタをＴ細胞の表面に発現しているＴ細胞、１０⁷のＴ細胞で１個）によってのみ認識される。したがって典型的には、全Ｔ細胞集団の４０％までを作用させることができるスーパー抗原の反応に比べて、正常な抗原の結合により少数のＴ細胞が活性化されるにすぎないものである。広いスペクトルを有する抗生物質療法がしばしば敗血症の治療に使用されるが、必ずしも有効でなく、多くの悪い副作用を示す。敗血症の原因によっては、ステロイドも免疫系の活性を調整することが示されている。さらに、たとえば新鮮な凍結血漿のような血液製剤またはたとえばヘパリンのような抗凝固剤も、凝固をもたらす免疫系の補体カスケード活性の作用に対抗すべく使用することができる。たとえば敗血症のような或る種のヒトの疾病をインビボで評価するための哺乳動物モデルを開発することが当業界で必要とされ、このモデルは（１）病気に対し感受性であり、さらに（２）ヒトで生ずる際の病気の進行にきわめて近似したようなものである。発明の要点一面において本発明は内生のＣＤ４およびＣＤ８の発現を欠く非ヒト哺乳動物もしくはその後代を提供し、この哺乳動物はヒトのＣＤ４もしくはその生物学上活性な断片をコードするＤＮＡからなるヌクレオチド配列と、ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子もしくはその生物学上活性な断片をコードするＤＮＡからなるヌクレオチド配列とが挿入されている。他面において本発明は、哺乳動物にて内生のＣＤ８をコードするヌクレオチド配列の発現を抑制し；哺乳動物にて内生のＣＤ４をコードするヌクレオチド配列の発現を抑制し；ＨＬＡＤＱ座のαおよびβ鎖の対立遺伝子もしくはその生物学上活性な断片を哺乳動物に挿入し；さらにヒトのＣＤ４もしくはその生物学上活性な断片のためのヌクレオチド配列を哺乳動物に挿入することからなる哺乳動物もしくはその後代の作製方法をも提供する。さらに他面において本発明は抗敗血症作用のための化合物のスクリーニング方法をも提供し、この方法は内生のＣＤ４およびＣＤ８の発現を欠く哺乳動物（この哺乳動物はヒトのＣＤ４もしくはその生物学上活性な断片をコードするＤＮＡからなるヌクレオチド配列と、ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子もしくはその生物学上活性な断片をコードするＤＮＡからなるヌクレオチド配列とが挿入されている）を敗血症を誘発する能力を持った化合物もしくは生物体に露呈することからなり、この哺乳動物に治療上有効な量の化合物を投与し、敗血症または敗血症様症状について哺乳動物をスクリーニングすることを特徴とする。図面の簡単な説明第１図はＬｙｔ−２、すなわちマウスのＣＤ８遺伝子（ｍＣＤ８−／−）の発現を抑制すべく使用されるノックアウト構成物を示し、黒枠はＬｙｔ−２のエクソンを表し（ローマ数字で示す）、コード化領域を示す陰影領域と共に示してある。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子はハッチングで示され、選択した制限酵素も示している。第２図はマウスのＣＤ４遺伝子（ｍＣＤ４−／−）の発現を抑制すべく使用されるノックアウト構成物を示し、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子はハッチングで示されている。黒枠はｍＣＤ４遺伝子のエクソンを表し（ローマ数字で示す）、選択した制限酵素も示している。第３図は、ヒトのＣＤ４（ｈＣＤ４）トランスジェニックマウスを得るため使用するトランスジーン構成物を示している。ｈＣＤ２の５′プロモータ領域およびｈＣＤ２の３′調節領域を、ｈＣＤ４ｃＤＮＡ挿入体およびｈＣＤ２ミニジーン（このｈＣＤ２ミニジーンは、ｈＣＤ２エクソンＩゲノム配列ならびに遺伝子の残部に対するｈＣＤ２のｃＤＮＡコード化領域とで構成されている）と同じように示し、選択した制限酵素も示している。第４図はダブルノックアウトダブルトランスジェニックマウスを得るために用いる育種方式を示し、ｈＣＤ４はヒトのＣＤ４トランスジェニックマウスを示し、ＤＱｗ６はヒトのＤＱｗ６（αおよびβ鎖）トランスジェニックマウスを示し；ｍＣＤ４はマウスの内生のＣＤ４を示し；ｍＣＤ８はマウスの内生のＣＤ８（Ｌｙｔ−２遺伝子）を示している。記号「ｈＣＤ４＋／−」はｈＣＤ４トランスジーンに対するマウスの異型接合を意味し；記号「ｍＣＤ４／８−／−」および「ｍＣＤ４／８＋／−」はＣＤ４およびＣＤ８の異型接合ノックアウトであるマウスを意味する。第５図は新たに殺生したマウスの遺伝子型が異なる生体外（ex vivo）の細胞においてＳＥＢの量を減少させながら刺戟した際のＴ細胞の反応もしくは増殖（３Ｈチミジン取り込みにより示される）を測定した投与量−応答曲線を示し、ＳＥＢの濃度をＸ軸に示し、黒丸印はダブルノックアウトダブルトランスジェニックマウス（ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８ −／−、ＤＱｗ６＋、ｈＣＤ４＋）を示し、白丸印はｈＣＤ４トランスジーンを有するダブルノックアウト（ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）を示し、黒四角印はＣ５７ＢＬ／６野生型を示し、白五角形印はダブルノックアウトマウスを示している。発明の詳細な説明「ノックアウト」と言う用語は、哺乳動物の単一細胞、選択された細胞もしくは全ての細胞にて内生のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの少なくとも１部の発現を部分的または完全に減少させることを意味する。「ノックアウト構成物」という用語は、細胞内で内生のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの発現を減少もしくは抑制すべく設計されたヌクレオチド配列を意味する。ノックアウト構成物として使用されるヌクレオチド配列は典型的には（１）内生の遺伝子（エクソン配列、イントロン配列および／またはプロモータ配列）の抑制すべき部分からのＤＮＡ、および（２）細胞内でノックアウト構成物の存在を検出すべく使用されるマーカー配列である。ノックアウト構成物は細胞中に挿入されて、ネイティブなＤＮＡ配列の転写を妨げ或いは中断するような位置で細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。この種の挿入は一般に相同組換によって生ずる（すなわちノックアウト構成物を細胞中に挿入したとき、内生のＤＮＡ配列に対し相同性であるノックアウト構成物の領域が互いにハイブリダイズして、ノックアウト構成物が内生のＤＮＡの対応する位置に組み込まれるように組換が生ずる）。ノックアウト構成物のヌクレオチド配列は、（１）抑制すべき遺伝子の１個もしくはそれ以上のエクソンおよび／またはイントロンの全体もしくは部分配列、（２）抑制すべき遺伝子の全体もしくは部分プロモータ配列、または（３）それらの組合せで構成することができる。典型的には、ノックアウト構成物は、通常注入された発育中の胚と同じ種の胚から誘導された未分化細胞である胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に挿入され、一般に相同組換の方法によりＥＳ細胞のゲノムＤＮＡに組込まれる。次いで、このＥＳ細胞を発育中の胚に注入して一体化させる。「遺伝子の破壊」、「遺伝子破壊」、「発現の抑制」および「遺伝子抑制」という表現は、内生の遺伝子の１つの領域（一般に１個もしくはそれ以上のエクソン）および／または遺伝子のプロモータ領域にヌクレオチド配列を挿入して細胞におけるその遺伝子の発現を減少もしくは防止することを意味する。挿入は一般に相同組換により行われる。本発明における目的で「遺伝子」、「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」という用語は全て、ポリペプチドまたはポリペプチドの断片をコードするヌクレオチドもしくはコドンの配列を意味する。例として、ヌクレオチド配列ノックアウト構成物は、抗生物質耐性遺伝子からなるヌクレオチド配列を、破壊すべき内生のＤＮＡ配列（プロモータおよび／またはコード化領域）に対し相補性である分離したヌクレオチド配列の１部に挿入して作製することができる。抗生物質耐性配列構成物を含有するこの分離されたヌクレオチド配列が細胞内に挿入されると、構成物は典型的にはゲノムＤＮＡに組み込まれる。すなわち、細胞の多くの後代はもはや少なくとも幾つかの細胞で遺伝子を発現しないだろうし、または減少したレベルでしかこれを発現しないだろう。何故なら、遺伝子のヌクレオチド配列が抗生物質耐性遺伝子により破壊されているからである。「マーカー配列」という用語は、（１）興味の対象の遺伝子（たとえばＣＤ４および／またはＣＤ８）の発現を破壊するより大きなヌクレオチド配列構成物（すなわち「ノックアウト構成物」）の１部として使用されるヌクレオチド配列、および（２）ノックアウト構成物をゲノムに組込んだ細胞を識別する手段として使用されるヌクレオチド配列を意味する。マーカー配列はこれら目的に役立つ任意の配列としうるが、典型的には細胞に対し検出可能な形質を付与する蛋白をコードする配列、たとえば抗生物質耐性遺伝子または細胞には一般的に見出すことができない分析可能な酵素である。マーカー配列が蛋白をコードする場合、マーカー配列は典型的にはマーカーの発現を調節する相同性もしくは非相同性のプロモータのいずれかを含有している。「トランスジーン」という用語は、プロモータに作用的に結合していてもしていなくてもよいが、哺乳動物または哺乳動物の胚の１個もしくはそれ以上の細胞に挿入される分離されたヌクレオチド配列を意味する。トランスジーンは、哺乳動物の内生の遺伝子における特定ヌクレオチド配列に対し相同性もしくは非相同性のいづれかであるか、或いはハイブリッド配列であるヌクレオチド配列である。（すなわち、トランスジーンの１つもしくはそれ以上の部分は哺乳動物の遺伝子に対し相同性であり、１つもしくはそれ以上の部分は非相同性である）。トランスジーンヌクレオチド配列は哺乳動物に内因的に存在するポリペプチドもしくはポリペプチドの変異体をコードすることができ、哺乳動物に自然には存在しないポリペプチド（すなわち外生のポリペプチド）をコードすることができ、或いは内生および外生のポリペプチドのハイブリッドをコードすることができる。トランスジーンがプロモータと作用的に結合していれば、このプロモータは哺乳動物および／またはトランスジーンに対し相同性もしくは非相同性となりうる。或いは、プロモータは内生および外生のプロモータ要素（エンハンサ、サイレンサ、サップレッサなど）のハイブリッドとすることもできる。「ＣＤ４」という用語は哺乳動物種のヘルパーＴ細胞で主として発現されている細胞表面糖蛋白質を意味し、主として抗原を結合してＴ細胞リセプタにより認識されるＭＨＣII分子に対するコリセプタ（co-receptor）として、認識および結合を介して細胞のシグナリングに関与するものと信じられている。ここで用いるヒトのＣＤ４は野生型ヌクレオチド配列を有することができ、或いは挿入可能、欠失可能および／または置換可能な変異体とすることもできる。同様に、マウスのＣＤ４も野生型ヌクレオチド配列を有することができ、或いは挿入可能、欠失可能および／または置換可能な変異体とすることもできる。ここで用いる挿入可能、欠失可能およ／または置換可能な変異体は特に対立遺伝子型変異体を包含する。「ＣＤ８」という用語は、哺乳動物種で２つの非相同性のモノマーポリペプチドで構成された細胞表面糖蛋白質を意味する。ＣＤ８は主として細胞障害Ｔ細胞の表面で発現され、主として抗原を結合してＴ細胞リセプタにより認識されるＭＨＣＩ分子に対するコリセプタ（co-receptor）として、認識および結合を介して細胞のシグナリングに関与するものと信じられている。ここで用いるヒトのＣＤ８モノマーは野生型のαおよびβ鎖ヌクレオチド配列を有することができ、或いは挿入可能、欠失可能および／または置換可能なその変異体とすることもでき、特に対立遺伝子型変異体を包含する。マウスのＣＤ８モノマーはＬｙｔ−２およびＬｙｔ−３遺伝子の野生型ヌクレオチド配列を有することができ、或いは挿入可能、欠失可能および／または置換可能なその変異体とすることもでき、特に対立遺伝子型変異体を包含する。「ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子」という用語は、ヒト主要組織適合性遺伝子複合体クラスII（ＭＨＣII）ＤＱ座の任意の或いは全ての変異体を意味し、その座における全てのポリペプチドもしくはモノマー（すなわちαおよびβ鎖）を包含し、これらを組合せてＤＱ座の産物として知られた最終蛋白質を生じさせる。例として、ＤＱｗ６対立遺伝子はαおよびβモノマーで構成され、これらモノマーは一緒になってＤＱ座における１個の対立遺伝子産物を構成する。「作用的に結合」という用語は各種ヌクレオチド配列に関する配置を意味し、各要素は機能的に連結して互いに相互作用することができる。この種の要素は限定はしないが１種もしくはそれ以上のプロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化配列およびトランスジーンを包含する。ヌクレオチド配列要素は、適正に配置し或いは作用的に結合されると、一緒になって作用し、相互の活性を調整すると共に最終的にトランスジーンの発現レベルに影響を及ぼす。「調整」とは、特定の要素の活性レベルの増加、減少または維持を意味する。他の要素に対する各々の要素の位置は各々の要素の５′末端および３′末端によって現すことができ、特定ないずれの要素の間の距離は介在する要素間のヌクレオチドまたは塩基対の個数によって示すことができる。「生物学上活性な断片」という用語は、遺伝子もしくはトランスジーンの全長ゲノムもしくはｃＤＮＡヌクレオチド配列より短いヌクレオチド配列を意味するが、生物学上活性な断片の遺伝子（もしくはトランスジーン）の産物が全長配列の遺伝子産物が有する生物学的活性の少なくとも１部を有するのに十分な長さの全長ヌクレオチド配列中の一部を有することを意味する。「齧歯動物」は、系統発生的な齧歯類の全動物を意味し、それから将来発生する全ての後代を包含する。「ネズミ」と言う用語は、ネズミ科の全ての動物を意味し、ラットおよびマウスを包含する。「後代」という用語は、特定の哺乳動物（すなわちゲノムＤＮＡ中に挿入されたノックアウト構成物を有する哺乳動物）から発生し、或いは子孫となる将来の全ての世代を意味する。したがって継承の世代における任意の後代がここに含まれ、後代（すなわちＦ１、Ｆ２、Ｆ３……の世代）は無限にこの定義に含まれる。「哺乳動物」という用語はヒト以外の全哺乳動物を意味し、哺乳動物の後代をも包含する。「免疫調整する」および「免疫調整」という用語は、特定の種に対し、免疫系の或る特定成分の平均的な活性と対比してその成分の活性レベルの変化を意味する。すなわち、ここで用いる免疫調整とは活性の上昇もしくは低下を意味する。免疫調整はＢ細胞、いずれかのもしくは全ての種類のＴ細胞、抗原提示細胞および免疫機能に関与すると思われる他のすべての細胞のレベルもしくは機能を分析することによって検出できる。追加的に或いは代案として、免疫調整は（１）免疫系における役割を有すると思われる特定の遺伝子の発現レベル、（２）免疫系における役割を有するたとえばサイトカイン（インターロイキンなど）のような特定な化合物もしくは他の分子のレベル、および／または（３）免疫系の機能に関与する特定の酵素、蛋白質などのレベルを評価して検出することもできる。「敗血症」という用語は、哺乳動物の血液および／または組織内の生物体および／またはそれらの毒素が原因となる病気を意味する。「抗敗血症作用」という用語は、敗血症の徴候または敗血症の症状が減少もしくは無くなる状況を意味する。「治療処方」という用語は特定の効果（すなわち悪性症状もしくは病気を減少もしく無くすこと）を達成するよう計画された治療を意味する。この治療は１種もしくはそれ以上の化合物を同時にまたは異なる時において同一の量もしくは異なる量で投与することを包含する。代案として或いは追加的に、治療はたとえば放射線照射、特定のダイエット、物理療法など他の療法も行うことを包含する。ノックアウト技術１．ノックアウト遺伝子の選択本発明は、免疫系の少なくとも２個の遺伝子が破壊もしくはノックアウトされている哺乳動物を企図する。しかしながら、本発明の範囲内には２個より多い遺伝子がノックアウトされた哺乳動物も包含される。本発明において、ノックアウトもしくは破壊されるべき遺伝子はＣＤ４およびＣＤ８から選択される。破壊されるべき遺伝子に関して少なくとも幾つかの配列情報を、ノックアウト構成物およびスクリーニングプローブとの両者を作製するために入手しなければならない。配列情報は、ノックアウト構成物の挿入により遺伝子操作すべき動物以外の種からとすることもできるが、好適には各々の種からのヌクレオチド配列が実質的に相同性であると合理的に考えられる種から提供される。一般に、ノックアウト構成物を含むヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ配列からの１個もしくはそれ以上のエクソンおよび／またはイントロン領域、および／またはプロモータ領域で構成されている。しかしながら、使用されるＤＮＡは代案としてｃＤＮＡ配列とすることもできるが、ｃＤＮＡは充分に大きいものとする。一般に、ノックアウト構成物に使用するＤＮＡは少なくとも約１キロベース（ｋｂ）の長さであり、好ましくは３〜４ｋｂの長さであって、これによりノックアウト構成物をＥＳ細胞に導入した際にゲノムＤＮＡに対する相同組換もしくはハイブリッド化に充分な相補的配列が与えられる。典型的には、ダブルノックアウト哺乳動物の作製を容易にするため、同一種の２匹の哺乳動物のそれぞれから１個の遺伝子をノックアウトする。これら哺乳動物を次いで互いに交配し、次いで子孫を相互に交配させて、最終的にノックアウトされた両方の選択遺伝子を有する単一の哺乳動物を得る。或いは最初から１個以上のノックアウトされた遺伝子有するに単一の哺乳動物を得ることもできる（たとえば１個以上のノックアウト構成物を下記するようにＥＳ細胞に導入する）。２個以上の遺伝子をノックアウトする場合も上記手順にしたがうことができる。すなわちそれぞれ１個のノックアウト構成物を有する数匹の哺乳動物を作製し、これら哺乳動物を適切にもしくはノックアウト構成物の全部を有する１匹の哺乳動物を得られるように交配および戻し交配する。例として、遺伝子Ａのいずれのコピーをも発現しないマウス（すなわち、遺伝子Ａノックアウト；同型接合）と、遺伝子Ｂのいずれのコピーをも発現しないマウス（すなわち、遺伝子Ｂノックアウト；同型接合）とを交配し、子孫「Ｆ₁」を得、これは両変異につき異型接合である（すなわち両変異遺伝子の２つのコピー［Ａ＋／−、Ｂ＋／−］の一方を有する）。次いで子孫（Ｆ₁）を交配させ、遺伝子が分離（メンデル方式）すれば子孫（Ｆ₂）の１／１６が両変異につき同型接合となり、すなわちダブルノッタアウトとなる（すなわちＡ−／−、Ｂ−／ −）。これら遺伝子型を有するマウスを適する分析によりスタリーニングして、各遺伝子産物の発現がないことを確認することができる。ノックアウト構成物を構成するヌクレオチド配列は、たとえばサムブルック（ Sambrok）等［Molecular Cloning：A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８９）］により記載されたような当業界で周知された方法を用いて得ることができる。この種の方法は、たとえばゲノム配列に対しゲノムクローンが同定されるような適する相同性レベルを有するＣＤＮＡプローブによりゲノムライブラリーをスクリーニングすることを含む。或いは、ｃＤＮＡ配列をノックアウト構成物の１部として使用する場台は、ｃＤＮＡライブラリーをオリゴヌクレオチドプローブもしくは抗体でスクリーニングしてｃＤＮＡを得ることもできる（ライブラリーが発現ベクター中でクローン化される場合）。プロモータ配列をノックアウト構成物に使用する場合、合成ＤＮＡプローブをプロモータ配列を含むゲノムライブラリーをスクリーニングするよう設計することができ、或いは適する相同性プロモータをスクリーニング用プローブとして使用することもできる。ノックアウト構成物を含むヌクレオチド配列を得るための他の方法は、たとえばエンゲルス（Engels）等［Agnew Chem．Int．Ed．Eng.、第２８巻、第７１６〜７３４頁（１９８９）］に記載されたような方法を用いて、この配列を合成的に製造することである。これら方法は特に核酸合成のホスホトリエステル法、ホスホルアミダイト法およびＨ−ホスホネート法を包含する。ノックアウト構成物を含むヌクレオチド配列は、その後の遺伝子操作に充分な量を得なければならない。所望量を得るためのヌクレオチド配列の増幅は、（１）配列を適するベクターに挿入し、ベクターを急速に増幅しうる細菌もしくは他の細胞をトランスフォームさせることにより或いは（２）ＰＣＲ増幅により、或いは（３）エンゲルス（Engels）等（上記）により示された方法を用いる合成により行うことができる。２．ノックアウト構成物の調製ノックアウト構成物を含むヌクレオチド配列は典型的には、マーカー遺伝子をコードする新たなＤＮＡ配列をこのヌクレオチド配列内の適正な位置に挿入しうるような位置にて切断すベく選択された１種もしくはそれ以上の制限酵素で切断される。マーカー遺伝子挿入の適正な位置は、ネイティブ遺伝子の発現を防止もしくは減少させるよう作用する位置である。この位置は、たとえば切断すべき配列内における制限部位の位置、およびエクソン配列もしくはプロモータ配列またはその両者を中断するかどうか（すなわちプロモータ機能を抑制するか或いはネイティブなエクソンの合成を抑制するのに必要な正確な挿入位置）など種々の因子に依存する。好ましくは、ＤＮＡを切断すべく選択される酵素はより長いアームとより短いアームとを発生し、短い方のアームは少なくとも約３００塩基対（ｂＰ）の長さである。或る種の場合、抑制すべき遺伝子の１個もしくはそれ以上のエクソンの１部または全部を実際に除去して、マーカー遺伝子をノックアウト構成物に挿入した際に原ゲノム配列に匹敵しうるノックアウト構成物の長さを保持するようにすることが望ましい。これらの場合、ゲノムＤＮＡを適する制限エンドヌクレアーゼで切断して適正寸法の断片を除去することができる。残留片をマーカー配列と下記のように結合する。マーカー遺伝子は検出可能および／または分析可能な任意のヌクレオチド配列としうるが、典型的にはこれは抗生物質耐性遺伝または他の遺伝子であって、そのゲノムにおける発現もしくは存在を容易に検出することができるものである。マーカー遺伝子は、一般にそれ自身のプロモータまたは挿入した細胞で活性を示すか或いは容易に活性化しうるいずれのソースからの他の強力なプロモータに作用的に結合される。しかしながら、マーカー遺伝子は抑制すべき遺伝子のプロモータの制御下で転写されるように結合したそれ自身のプロモータを有する必要はない。さらに、マーカー遺伝子は一般にその３′末端に結合したポリアデニル化（ポリＡ）配列を有する。この配列は遺伝子の転写を停止させるよう作用する。好適なマーカー遺伝子は、たとえばｎｅｏ（ネオマイシン耐性遺伝子）のようないずれかの抗生物質耐性遺伝子およびβ−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）である。ノックアウト構成物を含むヌクレオチド配列が適する制限酵素で切断された後、マーカー遺伝子配列を当業者に周知された方法、たとえばサムブルック（Sambrook）等（上記）に記載により結合する。一緒に結合するＤＮＡ断片の各末端は互いに適合性でなければならない。これは、適合性末端を発生する酵素で断片を切断するか或いは結合前に各末端を平滑断端化とすることにより達成される。平滑断端化は当業界で周知された幾つかの方法、たとえば粘着末端を埋めるクレノウ断片（ＤＮＡポリメラーゼＩ）を使用して行われる。結合したノックアウト構成物は胚性幹細胞に直接挿入することができるし（下記に説明）、或いは挿入の前に適切なベクター中に挿入して増幅させた後に挿入することもできる。好適なベクターは、細菌細胞にて急速に増幅するようなもの、たとえばｐブルースクリプトII ＳＫベクター（pBluescript II SK、ストラタジーン（Stratagene）社、サンディエゴ、ＣＡ）またはｐＧＥＭ７（プロメガ・コーポレーション（Promega Corp．）社、マジソン、ＷＩ）である。３．胚性幹細胞のトランスフェクション本発明は、限定はしないがたとえばラット、ハムスターおよびマウスのような齧歯動物を包含する任意の種の非ヒト哺乳動物からノックアウト哺乳動物を生産することを企図する。好適な齧歯動物はネズミ科の動物、たとえばラットおよびマウスを包含する。一般にノックアウト哺乳動物を生産すべく使用する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、得られるノックアウト哺乳動物と同一の種である。たとえば、ノックアウトマウスを得るためには一般にマウスの胚性幹細胞が使用される。胚性幹細胞は、たとえばドエッチェマン（Doetschman）等［J．Embryol．Exp ．Morphol．、第８７巻、第２７〜４５頁（１９８５）］により記載されたような当業者に周知された方法を用いて得ることができかつ維持することができる。いずれのＥＳ細胞ラインも使用しうるが、選択する細胞ラインは典型的には発育中の胚の生殖（germ）ラインと一体化し、その１部となることによりノックアウト構成物の生殖ラインの伝播を行うことができる細胞の能力により選択される。すなわち、この能力を有すると思われるいずれのＥＳ細胞ラインもここで使用するのに適している。ＥＳ細胞の生産につき典型的に使用される１つのマウス株は１２９Ｊ株である。好適なＥＳ細胞ラインはネズミの細胞ラインＤ３［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ２０８５２、カタログＮｏ．ＣＲＬ１９３４］である。細胞はノックアウト構成物を挿入するために、たとえばロバートソン（Robertson）［Teratocarcinomas and Embryonic St em Cells：A Practical Approach、Ｅ．Ｊ．ロバートソン（Robertson）編、ＩＲＬプレス社、ワシントン、Ｄ．Ｃ．（１９８７）］或いはブラッドレー（Brad ley）等［Current Topics in Devel．Biol．、第２０巻、第３５７〜３７１頁（１９８６）］、或いはホーガン（Hogan）等［Manipulatingthe Mouse Embryo：A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８６）］により示されたような当業者に周知の方法で培養され、作製される。ＥＳ細胞中へのノックアウト構成物の挿入は、たとえばエレクトロポレーション（電気穿孔法）、マイクロインジェクション（微小注入法）およびリン酸カルシウム処理を包含する当業者に周知された各種の方法により行うことができる［ロベル・バッジ（Lovell-Badge）、ロバートソン（Robertson）編、上記参照］。挿入の好適方法はエレクトロポレーションである。細胞中に挿入すべき各ノックアウト構成物は最初に鎖状（linear）型でなければならない。したがって、ノックアウト構成物がベクター中に挿入されたならば、ＤＮＡをベクター配列内でのみ切断してノックアウト構成物配列内では切断しないように選択した適切な制限エンドヌクレアーゼで切断して鎖状化を行う。挿入するには、ノックアウト構成物をＥＳ細胞に当業者に知らているように選択した挿入法に対して適切な条件下で添加する。１個以上の構成物をＥＳ細胞に導入する場合は、各ノックアウト構成物を同時に或いは１個づつ別に導入することができる。ＥＳ細胞をエレクトロポレーションすべき場合は、ＥＳ細胞およびノックアウト構成物ＤＮＡを、エレクトロポレーション装置を用い、製造業者の使用指針にしたがい電気パルスをかける。エレクトロポレーションの後、典型的にはＥＳ細胞を適するインキュベーション条件下で回収する。次いで細胞をノックアウト構成物の存在についてスクリーニングする。スクリーニングは各種の方法を用いて行うことができる。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合には、ＥＳ細胞を致死濃度の抗生物質の存在下で培養することができる。生き残ったＥＳ細胞は恐らくノックアウト構成物が組込まれている。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子以外のものであれば、ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡのサウザン・ブロットによりマーカー配列のみにハイブリッドするよう設計されたＤＮＡの配列でプローブすることができる。或いは、ＰＣＲを使用することもできる。最後に、マーカー遺伝子が酵素活性を検出できる酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子であれば、酵素基質を適する条件下で細胞に添加し、酵素活性を分析することができる。当業者は他の有用なマーカーおよび所定の細胞におけるその存在の検出手段を熟知している。この種の全てのマーカーが本発明の範囲内に包含されることを意図する。ノックアウト構成物はＥＳ細胞ゲノムで数個の位置に組み込まれ、ランダムな挿入現象の発生により各ＥＳ細胞ゲノムにおける異なる位置に組み込まれるであろう。所望の挿入位置は、ノックアウトすべきＤＮＡ配列に対し相補的な位置である。典型的には、ノックアウト構成物を取り込んだＥＳ細胞の約１〜５％未満が実際にノックアウト構成物を所望位置に組み込んでいる。ノックアウト構成物の適正な組み込みを有するＥＳ細胞を同定するには、全ＤＮＡをＥＳ細胞から、たとえばサムブルック（Sambro ok）等（上記）により記載されたような標準的な方法を用いて抽出する。次いでＤＮＡを、特定の制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡに対して特異的なパターンでハイブリッドするよう設計されたプローブを用いてサウザン・ブロットによりプローブする。代案として或いは追加的に、ゲノムＤＮＡを、特定の大きさと配列のＤＮＡ断片を増幅させるよう格別に設計したプローブを用いてＰＣＲにより増幅させることもできる（すなわち、適正位置にノックアウト構成物を有するような細胞のみが適正な大きさのＤＮＡ断片を生じる）。４．胚の注入／移植正しい位置にノックアウト構成物を有する適切なＥＳ細胞が同定された後、これら細胞を胚中に挿入する。挿入は当業者に知られた各種の方法で行うことができるが、好適方法はマイクロインジェクション法である。マイクロインジェクションでは、約１０〜３０個の細胞をマイクロピペットに集め、これを適正な発育段階にある胚に注入して、ノックアウト構成物を有する外来のＥＳ細胞を発育中の胚と一体化する。ＥＳ細胞の挿入に用いられる胚の適切な発育段階は極めて種依存性であるが、マウスでは約３．５日である。胚は、妊娠した雌の子宮を灌流することにより得られる。これを行うのに適する方法は当業者に公知であり、ブラッドレー（Brad ley）により示されている［ロバートソン（Robertson）編、上記］。適齢／発育段階にあるいずれの胚も使用に適しているが、好適な胚は雄である。マウスにおいて、好適な胚はＥＳ細胞遺伝子によりコードされる毛色とは異なる毛色をコードする遺伝子も有することができる。この方法にて、子孫をモザイクの毛色の探索によりノックアウト構成物の存在につき容易にスクリーニングすることができる（これはＥＳ細胞が発育中の胚に組み込まれたことを示す）。たとえばＥＳ細胞ラインが白毛に関する遺伝子を有する場合、選択される胚は黒毛もしくは褐色毛の遺伝子を有する。ＥＳ細胞が胚中に導入された後、この胚を妊娠させるため偽妊娠仮親の子宮に移植することができる。任意の仮親を使用しうるが、典型的には仮親は良好に育て、増やすことができる能力、並びに子供の面倒をみる能力につき選択される。この種の仮親は典型的には同じ種の精管切除された雄と交配して作製される。偽妊娠仮親の状態が移植の成功に重要であり、これは種依存性である。マウスではこの段階は約２〜３日目の偽妊娠である。５．ノックアウト遺伝子の存在のスクリーニング仮親から生まれた子孫を先ず最初にモザイク毛色によりスクリーニングすることができ、（上記した）毛色選択技術を用いることができる。追加として或いは代案として、子孫の尾組織からのＤＮＡを上記したようなサウザン・ブロットおよび／またはＰＣＲによりノックアウト構成物の存在につきスクリーニングすることができる。モザイクとして出現する子孫がその生殖ラインにノックアウト構成物を有すると思われれば、これらを同型接合ノックアウト動物を得るために互いに交配させる。子孫が生殖ラインの伝播を有するかどうか不明瞭である場合は、これらを親株もしくは他の株と交配し、子孫を異型接合性についてスクリーニングすることができる。異型接合体は、上記したようにＤＮＡのサウザン・ブロットおよび／またはＰＣＲ増幅により確認される。次いで異型接合体を互いに交配させて同型接合ノックアウト子孫を得る。同型接合体は、この交配の結果であるマウスから、並びに既知の異型接合体および野生型マウスであるマウスからの相当量のゲノムＤＮＡをサウザン・ブロットして同定することができる。サウザン・ブロットをスクリーニングするプローブは上記したように設計することができる。ノックアウト子孫を同定し、特性化する他の手段も可能である。たとえばノーザン・ブロットを用いて、ノックアウト遺伝子、マーカー遺伝子またはその両者のいずれかをコードする転写体の存在もしくは不存在にいてｍＲＮＡをプローブすることができる。さらにウエスタン・ブロットを用いて、これら子孫の各種の組織にてノックアウト遺伝子の発現レベルを評価することもでき、その際ウエスタン・ブロットはノックアウト遺伝子によりコードされる蛋白質に対する抗体でプローブし或いはマーカー遺伝子が発現しているマーカー遺伝子産物に対する抗体でプローブする。最後に、その場での分析（in situ analysis）（たとえば細胞を固定し、抗体で標識する）および／または子孫からの各種の細胞のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析を適する抗体を用いて行い、ノックアウト構成物の遺伝子産物の存在もしくは不存在を探索することもできる。トランスジーン技術１．トランスジーンの選択典型的には本発明に有用なトランスジーンは免疫反応、造血、炎症、細胞増殖および増殖、細胞系列分化および／またはストレス反応に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。好適トランスジーンはヒトの免疫系のポリペプチド（たとえばＣＤ４）およびＨＬＡＤＱ座の全ゆる対立遺伝子型を含むものである。特に好適なトランスジーンはヒトのＣＤ４およびＨＬＡＤＱ座対立遺伝子ＤＱｗ６（αおよびβ鎖の両者）である。本発明の範囲内には、哺乳動物への２個もしくはそれ以上のトランスジーンの挿入も包含される。本発明に有用なトランスジーンは個々に調製し、挿入することができ、或いは挿入するための１個の構成物として一緒に得ることもできる。トランスジーンは各トランスジーンの発現を始動させるべく選択されるプロモータおよび／または哺乳動物の両者に対し相同性もしくは非相同性である。さらに、トランスジーンは全長のｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ配列でもよいし、または少なくとも幾つかの生物学的活性、すなわち野生型である同一の種の非トランスジェニック哺乳動物には容易に観察されないあるレベルの作用（生化学的、細胞学的および／または形態学的）を示すそれらのいずれかの断片、サブユニットもしくは変異体でもよい。必要に応じ、トランスジーンはハイブリッドヌクレオチド配列とすることもでき、すなわち相同性および／または非相同性のｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ断片から構成されるひとつのものとすることができる。さらにトランスジーンは、必要に応じ１種もしくはそれ以上の自然に生じたＣＤＮＡおよび／またはゲノム配列の変異体でもよいし、またはその対立遺伝子型変異体でもよい。各トランスジーンは、当業界で周知された１つもしくはそれ以上の方法を用いて適する量で分離し、入手することができる。トランスジーンを分離するのに有用なこれら方法および他の方法は、たとえばサムブルック（Sa mbrook）等［Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８９）］、並びにベルガー（Berger）およびキンメル（Kimmel）［Method s in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques、第１５２巻、アカデミック・プレス・インコーポレーション社、サンディエゴ、ＣＡ（１９８７）］に示されている。各トランスジーンのヌクレオチド配列が公知である場合、トランスジーンは全体的に或いは部分的に、たとえばエンゲルス（Engels）等に記載されたような化学的合成法［Angew．Chem．Int．Ed．Engl．、第２８巻、第７１６〜７３４頁（１９８９）］で合成することができる。これら方法は特に核酸合成のホスホトリエステル法、ホスホルアミダイト法およびＨ−ホスホネート法を包含する。或いはトランスジーンは、トランスジーンＤＮＡと選択的にハイブリッドする１種もしくはそれ以上の核酸プローブ（クローン化すべきトランスジーンに対し許容しうる相同性レベルを有するオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片など）を用いて、適切なｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。トランスジーンを得るための他の適する方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。しかしながら、この方法を使用して成功するためには、トランスジーンのヌクレオチド配列に関する充分な情報を、適するヌクレオチド配列の増幅に対して有用な適するオリゴヌクレオチドプライマーを設計するため入手することが必要である。選択される方法がオリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブの使用（たとえばＰＣＲ、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーのスクリーニング）を必要とする場合は、プローブもしくはプライマーとして選択されるオリゴヌクレオチド配列をライブラリースクリーニングもしくはＰＣＲの際に生ずる非特異性結合の量を最小化させるのに充分な長さと充分な明瞭性とを有するようにすべきである。プローブもしくはプライマーの実際の配列は一般に、他の生物からの同一もしくは類似した遺伝子の保存されているか或いは高度の相同性を有する配列もしくは領域に基づいている。必要に応じ、プローブもしくはプライマーを縮重（de generate）することもできる。トランスジーンのアミノ酸配列のみが公知である場合は、推定可能かつ機能的な核酸配列を各アミノ酸残基に対する既知の好適なコドンを用いトランスジーンについて推定することもできる。この配列を次いで化学的に合成することができる。本発明は突然変異したトランスジーン配列の使用をも含む。突然変異したトランスジーンは、野生型配列と対比して１個もしくはそれ以上のヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を有するトランスジーンである。ヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入は、野生型アミノ酸配列とはアミノ酸配列が相違する遺伝子産物（すなわち蛋白質）を生じうる。この種の突然変異体の作製は当業界で周知され、たとえばウエルス（Wells）等［Gene、第３４巻、第３１５頁（１９８５）］およびサムブルック（Sambrook）等（上記）に記載されている。２．調節要素の選択本発明のトランスジーンは典型的にはプロモータに作用的に結合され、プロモータは特定の方法で各トランスジーンの発現を調節するよう選択されている。各トランスジーンは同一または異なるプロモータにより調節することができる。選択されるプロモータは相同性（すなわちトランスジーンでトランスフェクトされる哺乳動物と同一種）または非相同性（すなわちトランスジーンでトランスフェクトされる哺乳動物の種とは異なる種）でもよい。たとえば各プロモータのソースはいずれの単細胞、すなわち原核性もしくは真核性生物からのもの、或いはいずれの脊椎動物もしくは非脊椎動物からのものとすることができる。本発明のより好適なプロモータは、たとえばヒトのＣＤ２プロモータ、ヒトのＣＤ４プロモータ、ＨＬＡＤＱｗ６のαおよびβプロモータ、マウスのＣＤ４プロモータ、マウスのｐ５６^lckプロモータ、マウスのＩ−ＥのαプロモータおよびマウスＨ−２^kプロモータのような免疫系の遺伝子の発現を調節するヒトやマウスのプロモータがあげられる。特に好適なプロモータはヒトのＣＤ２プロモータ、並びにＨＬＡＤＱｗ６のαおよび βプロモータである。本発明のプロモータは単独で用いることもできるが、一層厳密な発現の調節を可能とするように相同性および／または非相同性のエンハンサおよび／またはサイレンサと組合せて使用するができる。本発明におけるプロモータのヌクレオチド配列は当業界で周知された幾つかの方法により得ることができる。典型的には、本発明に有用なプロモータは予めマッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ切断により同定されており、したがって適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適正な組織ソースのゲノムＤＮＡから分離することができる。或る種の場合、プロモータは配列決定がなされていてもよい。ヌクレオチド配列が既知であるプロモータについては、このプロモータをトランスジーン合成について上記した方法により合成することができる。プロモータ配列の全部もしくは１部のみが既知である場合は、ＰＣＲを用いて或いはゲノムライブラリーを適するオリゴヌクレオチドおよび／または同一もしくは異なる種からのプロモータ配列断片でスクリーニングすることによりプロモータを得ることができる。プロモータ配列が不明であれば、プロモータを含有するＤＮＡの断片を、たとえばコード化配列または他の遺伝子を含有しているより大きなＤＮＡ片から分離することができる。分離は、適正なＤＮＡ断片を分離すべく慎重に選択された１種もしくはそれ以上の酵素を用いる制限エンドヌクレアーゼ切断により行うことができる。切断の後、所望の断片をアガロースゲル精製［キアゲン（Qiagen、登録商標）カラム（キアゲン・コーポレーション（Qiagen Corp.）社、チャットワース、ＣＡ）］または当業者に知られた他の方法により分離する。この目的を達成するのに適する酵素の選択は当業者には既に自明である。３．他のベクター成分の選択トランスジーンおよびプロモータの他に、本発明のトランスジーンを調製するのに有用なベクターは典型的には（１）トランスジーンを挿入する哺乳動物におけるトランスジーンの最適な発現、および（２）細菌もしくは哺乳動物の宿主細胞におけるベクターの増幅につき有用な１種もしくはそれ以上の他の要素をも含有する。これら要素のそれぞれは、それらの各々の活性を最大化させるように各要素に対しベクター内に適切に配置される。この種の配置は当業者に周知されている。以下の要素を必要に応じベクター中に含ませることができる。ｉ．シグナル配列要素トランスジーンによりコードされるポリペプチドを分泌させる本発明の実施形態の場合、しばしばシグナル配列と称する小型ポリペプチドを存在させて、トランスジーンによりコードされるポリペプチドをこれが合成される細胞から外へ向かわせるように指令する。典型的には、シグナル配列をトランスジーンのコード化領域にてコード化領域の５′末端の方向または５′末端の位置に配置する。多くのシグナル配列が同定されており、機能的でありかつトランスジェニック組織に対し適合性であるいずれのものでもトランスジーンと結合して使用することができる。したがって、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列はトランスジーンに対して相同性もしくは非相同性であり、さらにトランスジェニック哺乳動物に対しても相同性もしくは非相同性である。さらに、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は上記した各方法を用いて化学的に合成することもできる。しかしながら、本発明の目的で好適なシグナル配列はトランスジーンと共に自然に存在するものである（すなわちトランスジーンに対し相同性である）。ｉｉ．膜固定ドメイン要素或る種の場合、特定の細胞内膜の表面または形質膜上で発現されるトランスジーンを得ることが望ましい。自然に生じる膜蛋白質は、蛋白質を膜に固定するよう作用するアミノ酸の範囲をポリペプチドの１部として有する。しかしながら、膜上に自然には見いだされない蛋白質については、この種のアミノ酸の範囲を付加してこの特徴を付与することもできる。しばしば、固定ドメインはポリペプチド配列の内部にあり、したがってこれをコードするヌクレオチド配列を処理してトランスジーンヌクレオチド配列の内部領域に挿入する。しかしながら他の場合には、固定ドメインをコードするヌクレオチド配列をトランスジーンヌクレオチド配列の５′もしくは３′末端につけることもできる。この場合、固定ドメインをコードするヌクレオチド配列を先ず最初にトランスジーンをコードするヌクレオチド配列とは別の成分としてベクター中の適切な位置に挿入する。シグナル配列の場合と同様、固定ドメインはどのようなソースからのものでもよく、したがってトランスジーンおよびトランスジェニック哺乳動物の両者に対して相同性もしくは非相同性となる。或いは、固定ドメインは上記の方法を用いて化学的に合成することもできる。ｉｉｉ．複製要素のオリジン部この成分は典型的には購入した市販の原核性の発現ベクターの１部であって、宿主細胞におけるベクターの増幅を促進する。選択したベクターが複製部位のオリジン部を持たなければ、既知の配列に基づき化学的に合成し、ベクター中に結合することができる。ｉｖ．転写停止要素ポリアデニル化配列もしくはポリＡ配列としても知られるこの要素は典型的にはベクター中のトランスジーンヌクレオチド配列に対し３′に位置し、トランスジーンの転写を停止させるよう作用する。この要素をコードするヌクレオチド配列がライブラリーから容易にクローン化されるかまたはベクターの１部として市販されており購入することができるし、また、これはたとえば上記したようなヌクレオチド配列合成方法を用いて容易に合成することができる。ｖ．イントロン要素多くの場合、トランスジーンの転写はベクター上の１個もしくはそれ以上のイントロンの存在により増大する。イントロンは、特にトランスジーンがゲノムＤＮＡ配列の全長または断片である場合にトランスジーンヌクレオチド配列内に自然に生じているものである。イントロンがヌクレオチド配列内に自然に存在していなければ（大抵のｃＤＮＡの場合）、イントロンは他のソースから得ることもできる。イントロンはトランスジーンおよび／またはトランスジェニック哺乳動物に対し相同性もしくは非相同性である。プロモータおよびトランスジーンに対するイントロンの位置が重要である。何故なら、イントロンは有効になるように転写されなければならないからである。たとえばトランスジーンがｃＤＮＡ配列である場合、イントロンの好ましい位置は転写開始部位に対し３′であり、ポリＡ転写停止配列に対し５′である。好ましくはｃＤＮＡトランスジーンでは、イントロンはトランスジーンヌクレオチド配列の一方の側または他方の側（すなわち５′もしくは３′）に位置して、トランスジーンヌクレオチド配列を中断しないようにする。ウィルス、原核性および真核性（植物もしくは動物）生物を包含するいずれのソースからのどのようなイントロンを用いても本発明を実施することができるが、ただしこれはイントロンが挿入される宿主細胞に対し適合性でなければならない。さらに本発明には合成イントロンも包含される。必要に応じ、１個以上のイントロンをベクター中で使用することもできる。ｖｉ．選択可能なマーカー要素選択可能なマーカー遺伝子は、選択培地で増殖させたトランスフェクトされた細胞の生存および増殖に必要な蛋白質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、たとえば原核性宿主細胞についてはアンピシリン、テトラサイクリンもしくはカナマイシンおよび哺乳動物細胞についてはネオマイシン、ヒグロマイシンもしくはメトトレキセートに対し耐性を付与し；（ｂ）細胞の栄養素要求性欠損を補強し；または（ｃ）たとえばこの遺伝子はバチルス（Bacillus）の培養のためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のように複合培地からは得られない重要な栄養素を供給する蛋白質をコードしている。上記した全要素、並びに本発明に有用な他の要素は当業者に周知されており、たとえばサムブルック（Sambrook）等［Molecular Cloning: ALaboratory Manua l）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８９）］およびベルガー（Berger）等編、［Gu ide to MolecularCloning Techniques、アカデミック・プレス・インコーポレーション社、サンディエゴ、ＣＡ（１９８７）］に記載されている。４．ベクターの作製本発明によるトランスジェニック哺乳動物の作製に最も有用なベクターは、原核性細胞宿主に対し適合性であるベクターである。しかしながら、真核性宿主細胞およびこれら細胞に対し適合性であるベクターも本発明の範囲内である。或る種の場合、種々のベクター要素のいくつか、たとえばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭベクター（プロメガ・コーポレーション（Promeg a Corp.）社、マジソン、ＷＩ）、たとえばｐＢＩＩＳＫ＋／−のようなｐブルースクリプト（pBluescript、登録商標）ベクター、［ストラトジーン・コーポレーション（Stratagene Corp.）社、ラ・ヨラ、ＣＡ］などに既に市販され入手しうるベクターがあり、これらは全て原核性細胞宿主に適したものである。この場合、トランスジーンをベクター中へ挿入することのみが必要である。しかしながら、使用すべき１種もしくはそれ以上の要素がベクター内に既に存在していないときは、これらを個々に入手し、ベクター中に結合する。各要素を入手し、これらを結合する方法は当業者に周知されており、トランスジーンを得るための上記方法と同じものである（すなわちＤＮＡの合成、ライブラリーのスクリーニングなど）。トランスジーンヌクレオチド配列を増幅し、および／または哺乳動物の胚をトランスフェクトするのに使用するベクターは、当業界で周知された方法により作製される。この種の方法はたとえばＤＮＡおよび／またはＲＮＡの制限エンドヌクレアーゼによる切断、結合、アガロースおよびアクリルアミドゲルによる精製、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのカラムクロマトグラフィーによる精製、ＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出、ＤＮＡ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅などサムブルック（Sambrook）等（上記）に示された標準的な技術を包含する。本発明を実施すべく使用する最終ベクターは典型的には、たとえば入手しうる市販のベクターのような出発ベクターから作製される。このベクターは、完成ベクターに含まれるべきいくつかの要素を含有していても、していなくともよい。所望ないずれの要素も出発ベクターに存在しなければ、各要素を個々にベクター中に結合させることができ、これはベクター中に結合すべき要素の末端およびベクターの末端を結合に対して適合するようにベクターを適する制限エンドヌクレアーゼで切断することによって行うことができる。或る種の場合、満足すべき結合を得るために、一緒に結合すべき末端を「平滑断端化（blunt）」しておく必要がある。平滑断端化は、先ず最初に４種全てのヌクレオチドの存在下にクレノウＤＮＡポリメラーゼもしくはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて「粘着末端（sticy end）」を充填することにより行われる。この手法は当業界で周知されており、たとえばサムブルック（Sambrook）等（上記）に記載されている。代案として、ベクター中に挿入すべき２種もしくはそれ以上の要素を先ず最初に互いに結合し（これらが互いに隣接した配置の場合）、次いでベクター中に結合する。ベクターを作製する他の１つの方法は、種々の要素の全ての結合を１つの反応混合物にて同時に行うことである。この場合、各要素の不適切な結合もしくは挿入により多くのナンセンスもしくは機能しないベクターが得られるが、機能するベクターを制限エンドヌクレアーゼ切断により同定し、選択することができる。ベクターが作製された後、これを増幅するため原核性宿主細胞にトランスフェクトすることができる。増幅に典型的に使用される細胞はイー・コリ（E．coll ）ＤＨ５−α［ギブコ／ＢＲＬ（Gibco/BRL）社、グランド・アイランド、ＮＹ］およびＤＨ５−αと同様な特性を有する他のイー・コリ（Ｅ．coli）菌株である。哺乳動物宿主細胞を使用する場合は、たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞［ＣＨＯ細胞；ウルラブ（Urlab）等、Proc．Natl．Acad．Scl．USA、第７７巻、第４２１６頁（１９８０）］およびヒト胚性腎細胞ライン２９３［グラハム（Graham）等、J．Gen．Virol.、第３６巻、第５９頁（１９７７）］などの細胞ラインが適している。増幅させるため選択された宿主細胞ラインへのベクターのトランスフェクションは、たとえばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストランなどの方法を用いて行うことができる。選択される方法は部分的に、トランスフェクトすべき宿主細胞の種類に依存する。これら方法および他の適する方法は当業者に周知されており、サムブルック（Sambrook）等（上記）に示されている。ベクターを充分に増幅させるのに十分な時間（一般にイー・コリ（E．coli）細胞では１晩）細胞を培養した後、ベクター（しばしば、この段階にてプラスミドと呼ばれる）を細胞から分離し、精製する。典型的には、細胞を溶解し、プラスミドを他の細胞内容物から抽出する。プラスミド精製に適する方法は特にアルカリ溶解ミニ−プレプ（alkaline lysis mini-prep）法［サムブルック（Sambro ok）等、上記］を包含する。５．挿入用プラスミドの作製典型的にはトランスジーンを含有するプラスミドを、胚に挿入する前に選択された制限エンドヌクレアーゼにより鎖状にする。或る種の場合、トランスジーン、プロモータおよび調節要素とをベクターの他の部分から鎖状の断片として分離することによって、トランスジーン、プロモータ、イントロン（１個のみを使用する場合）、エンハンサ、ポリＡ配列および必要に応じシグナル配列もしくは膜固定ドメインとを含む鎖状ヌクレオチド配列のみを胚に注入することが好ましい。これは、これらの要素を含む核酸配列領域を取り出すようにプラスミドを切断し、この領域をアガロースゲル電気泳動または他の適する精製法により精製して行うことができる。６．トランスジェニック哺乳動物の作製本発明を実施すべく使用する哺乳動物の特定の系統を一般的に良好な健康状態、良好な胚収率、胚における良好な前核可視性および良好な繁殖適性により選択する。さらに、ハプロタイプが重要な因子である。たとえばトランスジェニックマウスを作製する場合、たとえばＣ５７ＢＬ／６またはＣ５７ＢＬ／６ × ＤＢＡ／２のＦ₁、もしくはＦＶＢ系統のような株がしばしば使用される［チャールス・リバー・ラブス（Charles River Labs）社、ボストン、ＭＡ、ジャクソン・ラボラトリース（The Jackson Laboratory）社、バー・ハーバー、ＭＥまたはタコニック・ラブス（Taconic Labs．）社から市販され入手できる］。好適な株はたとえばＣ５７ＢＬ／６もしくはＤＢＡ／１のようなＨ−２^b、Ｈ−２^dもしくはＨ−２^qハプロタイプを有するものである。本発明を実施すべく使用する系統自身もトランスジェニックとすることができ、および／またはノックアウト（すなわち、部分的または完全に抑制された１個もしくはそれ以上の遺伝子を有する哺乳動物）とすることができる。好ましくは、同一の系統を最初のノックアウト哺乳動物およびトランスジェニック哺乳動物の両者を作製するために使用する。これは、その後の交配および戻し交配をより効率的にする。胚を入手し、代理宿主として振る舞うように使用する哺乳動物の年齢は使用する動物種に依存するが、当業者により容易に決定される。たとえばマウスを使用する場合、青春期前の雌が好適である。何故なら、これらはより多くの胚を産生すると共にホルモン注射に対し良好に反応するからである。同様に、種動物として使用する雄の哺乳動物は、一般にいろいろな選択基準のうち性的成熟の年齢により選択される。卵子の生産、交配、および／または胚を再移植するために雌にホルモンまたは他の化合物を投与することが必要である。ホルモン／補助因子の種類および使用量、並びにホルモン投与のタイミングは哺乳動物の種により変化する。この種の考慮は当業者に容易に了解されよう。典型的には、前処理された雌（すなわち受精しうる卵子を生産する雌）を種雄と交配させ、次いで得られた受精胚をトランスジーンの導入のため取り出す。或いは、卵子および精子を適する雌および雄から得、インビトロで受精させ、トランスジーンの導入に適する胚を得ることもできる。一般に、受精した胚を適する培地で前核が出現するまでインキュベートする。ほぼこの時点にて、トランスジーンを含むヌクレオチド配列を雌または雄の前核に下記するように導入する。たとえばマウスのような或る種においては、雄の前核が好適である。胚へのトランスジーンヌクレオチド配列の導入は、当業界で知られた任意の手段、たとえばマイクロインジェクション、エレクトロポレーションもしくはリポフェクションによって行うことができる。胚中にトランスジーンヌクレオチド配列を導入した後、胚をインビトロで種々の時間にわたりインキュベートするか、或いは代理宿主に再移植するか、或いはその両者を行うことができる。成熟するまでのインビトロでのインキュベートも本発明の範囲内である。１つの一般的な方法は、胚を動物種に応じて約１〜７日間にわたりインビトロでインキュベートし、次いでこれらを代理宿主に再移植することである。再移植は標準的な方法を用いて行われる。一般に、代理宿主を麻酔し、次いで胚を卵管に挿入する。特定の宿主に移植される胚の個数は動物種により変化するが、一般にこの種が自然に生む子孫の数に匹敵する。代理宿主のトランスジェニック子孫は、いずれかの適する方法によりトランスジーンの存在および／または発現についてスクリーニングされる。スクリーニングはしばしばサウザン・ブロットもしくはノーザン・ブロット分析により、トランスジーンの少なくとも１部に対し相補的であるプローブを用いて行われる。トランスジーンによりコードされる蛋白質に対する抗体を用いるウエスタン・ブロット分析も、トランスジーン産物の存在につきスクリーニングするための代案法もしくは迫加法として用いることができる。典型的には、ＤＮＡを尾組織（尾の先端から約１ｃｍを除去する）から調製し、トランスジーンについてサウザン分析もしくはＰＣＲによって分析する。また、いずれの組織もしくは細胞もこの分析に用いることができるが、最高レベルでトランスジーンを発現すると思われる組織もしくは細胞をサウザン分析もしくはＰＣＲを用いてトランスジーンの存在および発現について試験する。トランスジーンの存在を評価する代案もしくは追加の方法は限定はしないが、たとえば酵素および／または免疫学的分析、特定のマーカーもしくは酵素活性に対する組織学的染色、フローサイトメトリー（流動細胞計測法）分析などのような適切な生化学的分析法を包含する。血液の分析も、血液におけるトランスジーン産物の存在を検出すると共に各タイプの血液細胞および他の血液成分のレベルに対するトランスジーンの作用を評価するのに有用である。トランスジェニック哺乳動物の後代は、トランスジェニック哺乳動物を適する相手と交配させるか、或いはトランスジェニック哺乳動物から得られた卵子および／または精子をインビトロで受精させることによって得ることができる。相手との交配を行う場合、この相手はトランスジェニックおよび／またはノックアウトであってもなくてもよい。トランスジェニックである場合、これは同一もしくは異なるトランスジーンまたはその両者を含有するだろう。或いは、相手は親系列であってもよい。インビトロでの受精を用いる場合、受精した胚を代理宿主に移植するか、或いはインビトロでインキュベートするか、或いはその両者を行うことができる。いずれの方法を用いても、後代を上記の方法或いは他の適する方法によりトランスジーンの存在について評価する。ノックアウト／トランスジェニック哺乳動物の作製１個以上のノックアウト構成物および／または１個以上のトランスジーンを含有する哺乳動物は、幾つかある方法の内いずれかの方法で作製される。好適な作製方法は、それぞれ所望のノックアウト構成物もしくはトランスジーンのうちひとつを含有する一連の哺乳動物を得ることである。このような哺乳動物を一連の交配、戻し交配および選別により互いに育種して、最終的に全ての所望のノックアウト構成物および／またはトランスジーンを含有する単一の哺乳動物を得る。この哺乳動物はノックアウト構成物および／またはトランスジーンが存在するという点を除いて野生型と他の点においてはコンジェニック（遺伝的に同一）となる。例として、第４図はＣＤ４、ＣＤ８ダブルノックアウト（ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）であり、２個のトランスジーン（ヒトのＤＱｗ６のαおよびβ 鎖［ＤＱｗ６］およびヒトのＣＤ４［ｈＣＤ４］）を有するマウスを得るための育種方式を示している。典型的には、交配および戻し交配は、育種法における各特定の段階の目標に応じて子孫と同胞株もしくは親株とを交配させて行われる。或る場合には、各々のノックアウト構成物および／またはトランスジーンが染色体中で適正な位置にある単一の子孫を得るために、多数の子孫を得ることが必要となるだろう。たとえばＣＤ４およびＣＤ８をコードするネズミの遺伝子は同じ染色体上に比較的近接して位置している。すなわち、ノックアウトされたＣＤ４およびＣＤ８の両者を有するマウスを得るには、実質的に２つの実用的な選択枝がある。第１に、単一のＥＳ細胞にＣＤ４およびＣＤ８ノックアウト構成物の両者を注入してダブルノックアウトを作製するように試み、各構成物が同じＥＳ細胞中で同じ染色体に組込まれ、次いでこのＥＳ細胞が胚中に適切に一体化され、その結果ＥＳ細胞が胚に挿入されるようになることを期待する。これら全ての現象が最終産物を得るのに必要なこととして生ずる確率は極めて低い。代案として、一方がＣＤ４ノックアウト構成物を含有し、他方がＣＤ８ノックアウト構成物を含有する２種のノックアウト哺乳動物を得ることができる。次いで、これら哺乳動物を最初に交配し、続いて、同じ染色体上に両者のノックアウト構成物を含有する子孫が得られるまで子孫を交配しスクリーニングを続ける（マウスにおいて、この結果は乗換え（cross over）現象が適正位置、すなわちＣＤ４遺伝子とＣＤ８遺伝子との間で生じなければ得ることができない。何故なら、ＣＤ４およびＣＤ８をコードする遺伝子は同じ染色体上に存在するからである）。いずれの場合にも、数回の交配からの１００もしくはそれ以上の子孫をスクリーニングして、ノックアウト構成物および／またはトランスジーンを適正な染色体の位置に含有する単一の哺乳動物を同定する必要がある。トランスジェニック／ノックアウト哺乳動物の使用本発明の哺乳動物およびその後代は、発現されるトランスジーンおよびこれらが含有するノックアウト構成物に応じて各種の用途を有する。哺乳動物を使用して、たとえば敗血症または他の免疫学的障害などの病気の予防もしくは治療に有用な薬物もしくは治療処方をスクリーニングすることができる。有用な薬物のスクリーニングは、先ず最初に哺乳動物に病気を誘発させ（すなわち哺乳動物に敗血症をもたらす病原体もしくは毒素に露呈する）、次いで候補となる薬物を広範囲の投与量で哺乳動物に投与し、種々の時点で評価している病気もしくは障害に対する薬物の作用を分析することを含む。代案として或いは追加的に、薬物を病気の誘発に露呈する前に或いはそれと同時に投与することもできる。病気もしくは症状を治療するのに使用する薬物をスクリーニングする他、本発明の哺乳動物は病気もしくは症状を予防もしくは治癒することを目的とした治療養生法を設計するにも有用である。たとえば哺乳動物を特定のダイエット、運動、放射線処置および／または１種もしくはそれ以上の化合物もしくは物質と組合せて、病気もしくは症状の発症前もしくはそれと同時にまたはその後に処方することができる。この種の全体的な療法もしくは養生法は、化合物単独での治療よりも病気もしくは症状を克服するのに一層効果的であるかもしれない。化合物および／または治療養生法の効能を評価する分析は、たとえばＴ細胞およびＢ細胞レベルの増加もしくは減少、免疫グロブリン産生の増加もしくは減少、たとえばサイトカイン（たとえば腫瘍壊死因子など）のような化学メッセンジャーのレベルの増加もしくは減少、および／または免疫反応に関与する特定遺伝子の発現レベルの増加もしくは減少を調べることを含む。さらに血圧、体温、体重、心拍、挙動、毛の外観（波打ち毛（ruffled fur））などのような基準も評価することができる。たとえば、敗血症の患者はしばしば血圧の低下、発熱、体重減少および／または血液凝固などを体験する。患者に対してこの種のことを予防もしくは減少させうる治療剤を投与することが望ましい。本発明の哺乳動物を用いて、種々の化合物を単独で或いは組合せてスクリーニングすることにより、このような病気の徴候の出現が減少するかまたは軽減するかどうかについて決定することができる。さらに本発明の哺乳動物は、免疫系の発生を評価し、特定遺伝子の突然変異の効果を検討するにも有用である。本発明のトランスジェニックノックアウト哺乳動物は、１種もしくはそれ以上の細胞ラインを得るためにも使用することができる。このような細胞ラインは、たとえば特定の組織もしくは器官に対するトランスジーンノックアウトの作用を評価し、組織におけるトランスジーンの活性レベルに影響を及ぼしうる化合物をスクリーニングするなど多くの用途を有する。この種の化合物は、トランスジーンの活性を調節するための治療剤として有用である。この種の細胞ラインの産出は当業者に知られた各種の方法により行うことができる。実際の培養条件は、培養すべき組織および細胞の種類に依存する。細胞に関して細胞の成長および増殖に対する最適条件を決定するために過度な実験をすることなしに、異なる濃度のマクロおよびミクロ栄養素、増殖因子、血清などを含有する各種の培地を試験することができる。同様に、たとえば細胞密度、培地温度およびインキュベーター中の二酸化炭素濃度などの他の培養条件も容易に評価することができる。この過程に影響を及ぼす化合物の改変および同定も可能である。本発明の他の用途は当業者に容易に明かとなるであろう。以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は本発明の範囲を決して限定するものでない。実施例実施例１：ＣＤ８ノックアウトマウスマウス株Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡを使用し、これらはジャクソン・ラボラトリース（Jackson Laboratories）社（バー・ハーバー、ＭＥ）から購入した。Ｌｙｔ−２遺伝子のエクソン１〜３を含有する約２．２ｋｂ（キロベース）のマウスのゲノムのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を分離して、ＣＤ８ノックアウト構成物の出発物質として使用した。断片をエクソン１の内側部位を切断するＥｃｏＲＩで切断した。細菌性ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）をこのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ｎｅｏＤＮＡ構成物は、プラスミドｐＭＣＩｎｅｏＰｏｌＡ［トーマス（thomas）等、Cell、第５１巻、第５０３頁（１９８７）］から前記プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで切断し、ｎｅｏＤＮＡを抽出し、精製することにより入手した。この構成物の略図を第１図に示す。構成物をベクター中に挿入し、イー・コリ（E．Coli）細胞で増幅させた後、ＤＮＡ構成プラスミドを標準的なアルカリ溶解およびＣｓＣｌ濃度勾配精製法によって精製した。プラスミドを精製した後、Ｌｙｔ−２／ｎｅｏ構成物を制限エンドヌクレアーゼ切断により鎖状となし、次いでエレクトロポレーションの手法を用いてＤ３ネズミ胚性幹細胞にエレクトロポレーションした［ドエチマン（Doetschman）等、J．Embryol．Exp．Morph．、第８７巻、第２７〜４５頁（１９８５）］。エレクトロポレーションには、約５ｎモルの鎖状化した構成物を約８００μｌの容積の培地中の約５×１０⁶のＥＳ細胞に添加した。これら細胞を約０．３４キロボルトおよび２５０μＦにてパルス処理し、次いで各バイアル（vial）における細胞を胚性繊維芽フィーダー細胞を含有する２枚の１０ｃｍ細胞培養プレートに載せた。これら培養プレートは１％ゼラチンでプレコートされ、これらのプレートは、１５％のウシ胎仔血清［ギブコ／ＢＲＬ（Gibco/BRL）社、グランド・アイランド、ＮＹまたはハイクローン・ラブス（Hyclone Labs）社、ローガン、ＵＴからの均等物］と白血病増殖阻止因子［フング・ロイング（Fung-Leung）等、Cell、第６５巻、第４４３〜４４９頁（１９９１）］とを添加した１０ｍｌのＤＭＥＭ培地［ギブコ／ＢＲＬ（Gibc o/BRL）社、グランド・アイランド、ＮＹ］を含有している。２日の後、約２５０〜３００μｇ／ｍｌの抗生物質Ｇ４１８を培養物に添加してｎｅｏ選択を開始し、培地はほぼ２日毎に交換した。Ｇ４１８の存在下で生存した細胞はほとんど、発現に対して適切な配置でｎｅｏ遺伝子を有するノックアウト構成物を含有している。次いで、これら細胞をスクリーニングして、ノックアウト構成物がＤＮＡに組込まれたことを確かめた。スクリーニングはＰＣＲを用いて行った。Ｌｙｔ−２／ｎｅｏノックアウト構成物を含有するＤ３細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に受託番号ＣＲＬ−１１１１６として寄託した。Ｌｙｔ−２／ｎｅｏ構成物を含有する細胞ラインを、ロバートソン（Robertso n）により記載された方法［Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell: A Pra ctical Approach、ＩＲＬプレス社、ワシントン、Ｄ．Ｃ．（１９８７）］にしたがい、トリプシン処理によってネズミ胚にマイクロインジェクションできるようにした。注入した胚は、雄マウスと交配させた雌マウスの子宮を灌流することにより得た３．５日齢の胚である。胚中へ胚性幹細胞を注入した後、これら胚を妊娠継続のため偽妊娠の雌に移植した。子孫をノックアウト構成物を有するマウスを検出しうるように互いに或いは適する毛色を有するマウスと交配した。これらマウスの子孫を、ｎｅｏ遺伝子を検出するように設計されたプローブを用いて尾組織から得られたＤＮＡのサウザン・ブロットをプローブし、ノックアウト構成物の存在について評価した。実施例２：ＣＤ４ノックアウトマウスイントロン４の１部とエクソン４、５および６の全長とに跨がるマウスのゲノムＣＤ４のｃＤＮＡ配列の約２．８ｋｂ断片を分離した。ポリＡ停止シグナルおよびチミジンキナーゼプロモータ（単純疱疹ウィルスから）を含有する約１．２ｋｂの細菌性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子構成物をＸｈｏＩおよびＳａｌＩによる切断を用いてプラスミドｐＭＣＩｎｅｏＰｏｌＡ［トーマス（Thomas ）等、Cell、第５１巻、第５０３〜５１２頁（１９８７）］から得た。ｎｅｏ− ポリＡ挿入物を分離し、次いで予めＫｐｎＩ、これはＣＤ４の転写方向に対しアンチセンス方向でエクソン５の内側部位を切断するものであるが、ＫｐｎＩで切断したＣＤ４構成物に結合した。得られたノックアウト構成物を第２図に示す。構成物をイー・コリ（E．coll）細胞で増幅させ、次いで構成物を含有するプラスミドを精製した。ノックアウト構成物を制限エンドヌクレアーゼ切断により鎖状とし、次いでＤＮＡを精製した。次いで約５ｎモルのこのＤＮＡをＤ３胚性幹細胞にエレクトロポレーションし、次いでエレクトロポレーションされた細胞を選択すると共に実施例１に記載したようにスクリーニングした。ＣＤ４ノックアウト構成物を含有するＤ３細胞ラインをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に受託番号ＣＲＬ−１１１１４として寄託した。ＣＤ４／ｎｅｏ構成物を含有するＥＳ細胞を同定した後、これら細胞を３．５日齢のネズミの胚にマイクロインジェクションした。この胚は雄と交配させた雌から得た。次いで胚を妊娠継続のため偽妊娠の仮親に移植した。これらマウスの子孫を、尾組織から得られたＤＮＡのサウザン・ブロットをプローブすることによりノックアウト構成物の存在について評価した。実施例３：ＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトマウス上記したＣＤ４およびＣＤ８ノックアウトマウスを用いて、ｍＣＤ４−／−／ｍＣＤ８−／−ダブルノックアウトマウスを得た。ｍＣＤ４＋／−ｍＣＤ８＋／＋マウスをｍＣＤ４＋／＋ｍＣＤ８−／−マウスと交配し、ｍＣＤ４＋／−ｍＣＤ８＋／−異型接合のＦ₁子孫を得た。異型接合の同胞を交配し、子孫を次のようにしてスクリーニングした。約２０μｌの血液を各マウスの尾静脈から得、ヘパリン処理された毛細管に集めた。血液を免疫蛍光染色緩衝液（「ＩＢＳ」、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸塩緩衝生理的食塩水［サムブルック（Sambrook）等、上記］と０．１％のナトリウムアジドと５％のウシ胎仔血清とで構成される）で１回洗浄した。ついで各血液試料を以下のモノクローナル抗体と共にインキュベートした（ＰＥはフィコエリトリンであり、ＦＩＴＣはフルオレセインイソチオシアネートである）：（１）ＰＥ−結合抗−ヒトＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ；ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Becton-Dickinson Co.）社）（２）ＦＩＴＣ−結合抗−ＨＬＡＤＱ（Ｌｅｕ１０；ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Becton-Dickinson Co.）社）（３）ＰＥ−結合抗−マウスＬ３Ｔ４（ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Be cton-Dickinson Co.）社）（４）ＦＩＴＣ−結合抗−マウスＬｙｔ−２（ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Becton-Dickinson Co.）社）。インキュベーションは全て４℃で２０分間行った。次いで赤血球をＦＡＣＳ溶解緩衝液（ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Becton-Dickinson Co.）社）を用いて２分間溶解させ、次いでＩＢＳで２回洗浄した。次いで細胞をＬｙｓｉｓIIソフトウェアー（ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Becton-Dickinson Co.）社）を用いるフローサイトメトリー（流動細胞計測法）分析により分析した。野生型および異型接合型のＣＤ４／ＣＤ８ノックアウト変異体を互いに染色の強度に基づき区別した。同型接合型のＣＤ４／ＣＤ８ノックアウト変異体をＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋細胞の完全な不存在下で同定した（抗体による免疫蛍光染色の欠如に基づいて）。両者の座における変異について子孫の同型接合の頻度は２％であった（２００個のうち４個）。これは、両遺伝子とも第６染色体にあるので、未連鎖遺伝子に対して予想される頻度（１／１６）よりも低い［パルネス（Parnes）、Adv．Imm unol.、第４４巻、第２６５頁（１９８９）］。実施例４：ヒトのＣＤ４トランスジェニックマウスヒトのＣＤ４（ｈＣＤ４）トランスジェニックマウスを次のように作製した：約２．８ｋｂのヒトのＣＤ４のｃＤＮＡ配列［マドン（Maddon）等、Cell、第４２巻、第９３〜１０４頁（１９８５）］を、人工的に作製されたヒトのＣＤ２プロモーターレギュレータカセットのＥｃｏＲＩ部位に挿入した［グリーブス（ Greaves）等、Cell、第５６巻、第９７９〜９８６頁（１９８９）］。このカセットは約４．８ｋｂのｈＣＤ２の５′配列と約５．５ｋｂのｈＣＤ２の３′配列とを含有する。ＣＤ２カセット中へのＣＤ４のｃＤＮＡの挿入はＣＤ２の第１エクソンを除去して、ＣＤ２の５′プロモータ配列とＣＤ２の３′調節イントロン配列とを完全に残すようにした。第３図に示す最終的な構成物はコピー数依存性であって、トランスジェニックマウスのゲノムにおける組込部位とは無関係にリンパ球で特異的に発現される。この構成物を上記の手順を用いてＣＢＡ／Ｃａ × Ｃ５７ＢＬ／１０の胚に注入した。子孫をトランスジーン構成物の存在についてスクリーニングし、この構成物を有する子孫を５世代にわたりＣ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配した。Ｆ５世代の子孫を次いでＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトマウスと交配させて、ヒトのＣＤ４トランスジーンを含有するＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトであるマウスを得た。実施例５：ヒトのＭＨＣII ＤＱｗ６トランスジェニクマウストランスジーンであるヒトのＨＬＡ−ＤＱｗ６のαとＨＬＡ−ＤＱｗ６のβとを有するＣ５７Ｂ４６マウスを次のようにして作製した。ＨＬＡ−ＤＱｗ６のα鎖をコードする遺伝子を、クローニングベクターとしてのλシャロン４Ａを用い、予めＥＢＶ（エプスタイン−バールウィルス）でトランスフォームされているヒトのＢリンパ芽球細胞ライン（ＥＢ−ＴＯＫ）から得られたＤＮＡのゲノムライブラリーから分離した。この細胞ラインはＨＬＡ− ＤＲ２−ＤＱｗ６−Ｄｗ１２ハプロタイプに関し同型接合型である。この遺伝子は、約０．８ｋｂの５′配列と全長のコード化領域と約６ｋｂの３ ′未翻訳配列とを含む約１３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片として得られた。ＤＱｗ６のβ鎖をコードする遺伝子をツカモト（Tsukamoto）等［Immunogenet ics、第２５巻、第３４３〜３４６頁（１９８７）］に記載されているようにして分離した。約１８ｋｂのＤＱｗ６のβ鎖ヌクレオチド配列のＥｃｏＲＩ断片を、ＤＱｗ６のβのエクソン６および幾つかの３′未翻訳配列とを含有するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩのｃＤＮＡ配列に結合させ、完全なＤＱｗ６のβ遺伝子を得た。ＤＱｗ６のαおよびβの両遺伝子をＥｃｏＲＩによる制限エンドヌクレアーゼ切断により鎖状とした。ＤＱｗ６のαおよびβ遺伝子の混合物を次いでＣ５７Ｂ４６マウスの胚にマイクロインジェクションした。この胚を妊娠継続のため仮親に移植した。子供をトランスジーンの存在について次のようにスクリーニングした。尾組織を各マウスから得、この組織からのＤＮＡをＳＤＳ−プロテイナーゼＫ法により調製した。ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、次いで０．９％のアガロースゲル上で電気泳動した。次いでサウザン・ブロット分析を行って、トランスジーンを含有する子供を確認した。次いでＭＨＣIIトランスジェニックマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと１０世代にわたり戻し交配を行った。Ｆ１０世代の子孫を次いで互いに交配し、同型接合のＤＱｗ６＋／＋トランスジェニックマウスを得た。次いで同型接合体をＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックマウスと交配させて、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトでありかつＤＱｗ６のαおよびβトランスジーンを含有するマウスを得た。実施例６：ＣＤ４−／−／ＣＤ８−／−ｈＤＱｗ６のｈＣＤ４マウスヒトのＣＤ４トランスジーンを含有するＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトマウスを、ＤＱｗ６トランスジーンを含有するＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトマウスと交配させて、ダブルノックアウトダブルトランスジェニックマウスである子孫を得た。これらマウスを上記の免疫蛍光染色法を用いてノックアウト構成物およびトランスジーンの存在についてそれらのタイプを決定した。この子孫を得るために使用した完全育種方式を第５図に示す。実施例７：敗血症感受性のスクリーニングＳＥＢ（（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Staphylococcus enterotoxin B）、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）社、セントルイス、ＭＯ）とＬＰＳ（リポ多糖類、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical C o.）社）と抗−ＣＤ３モノクローナル抗体（ファルミンゲン（Pharmingen）社、サンディエゴ、ＣＡ）との作用を野生型、トランスジェニック、ノックアウトおよびダブルノックアウトダブルトランスジェニックの各マウス、それらは全て６〜１２週齢のマウスであるが、それらのマウスについて評価した。特に、次のマウスについて評価した：（１）ヒトのＣＤ４＋、ＤＱｗ６＋、マウスのＣＤ４−／−、マウスのＣＤ８− ／−（ｈＣＤ４＋、ＤＱｗ６＋、ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）（２）ヒトのＣＤ４＋、マウスのＣＤ４−／−、マウスのＣＤ８−／−（ｈＣＤ４＋、ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）（３）ＤＱｗ６＋、マウスのＣＤ４−／−、マウスのＣＤ８−／−（ＤＱｗ６＋、ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）（４）マウスのＣＤ４−／−、マウスのＣＤ８−／−（ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）（５）ＤＱｗ６（６）野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）（７）野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）野生型の齧歯動物は一般にエンテロトキシンの作用に対し耐性である。したがって、感作剤であるＤ−ガラクトサミン（Ｄ−ｇａｌ）約２０ｍｇ（１００μｌのＰＢＳ中）を各マウスに対し試験物質の注入の約５〜１５分前に腹腔内投与した。各試験物質の投与は約１００μｌのＰＢＳ中で腹腔内に行った。投与した各試験物質の量を第１表に示す。ＳＥＢもしくはＬＰＳに露呈してから７２時間以内に死亡したマウスの個数を第１表に示す。驚くことに、ダブルノックアウトダブルトランスジェニックマウスは、他の全ての評価した遺伝子型と比較してこれらマウスにおける致死率が極めて高く、ＳＥＢに対する極めて高い感受性を示している。種々の遺伝子型のマウスからのＴ細胞のＳＥＢに対すインビトロでの投与反応性を評価するため、６〜１２週齢のマウスから収集された脾臓から、脾臓組織を針金網を通すことによって単一細胞懸濁物を作製した。次いで、これら細胞を９６穴マイクロタイタープレートに約１×１０⁶／穴の密度で入れ、１０％の熱で失活させたウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ハイクローン・ラブス（Hyclone Labs）社）と５０μＭのβ−メルカプトエタノールと０．０１％のペニシリンと０．０１％のストレプトマイシンとを補充した約２００μｌのイスコウブ（Iscove）改良ジュルベッコ（Dulbecco）培地（ＩＭＤＭ）に懸濁した。次いで第５図に示したように細胞をＳＥＢの濃度を減少させながら刺激した。３７℃および５％のＣＯ₂ 下で約７２時間インキュベートした後、細胞を約１６時間にわたり約１μＣｉの３Ｈ−チミジンを用いて脈動した。次いで細胞を放射能についてカウントした。結果を第５図に示す。黒丸印はダブルノックアウトダブルトランスジェニックを示し、白丸印はｈＣＤ４トランスジーンを有するダブルノックアウトを示し、黒四角印はＣ５７Ｂ４６野生型を示し、白五角形印はダブルノックアウトを示す。これから判るように、ダブルノックアウトダブルトランスジェニックマウスのＴ細胞は、野生型および他の変異遺伝子型と比較してＳＥＢの存在に対し反応性が大であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者マク、タクダブリュー. カナダ国エム４ダブリュー２ダブリュー３オンタリオ州トロントグレンロード 130

Claims

【特許請求の範囲】１．内生のＣＤ４およびＣＤ８の発現を欠く非ヒト哺乳動物またはその後代であって、前記哺乳動物は（ａ）ヒトのＣＤ４をコードするトランスジーンまたはその生物学上活性な断片と；（ｂ）ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子をコードするトランスジーンまたはその生物学上活性な断片とを備えることを特徴とする非ヒト哺乳動物またはその後代。２．ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子がＤＱｗ６である請求の請求項１に記載の哺乳動物。３．各トランスジーンがプロモータに作用的に結合している請求項１に記載の哺乳動物。４．プロモータがヒトのＣＤ２プロモータ、ヒトのＣＤ４プロモータ、ＨＬＡＤＱｗ６のαおよびβプロモータ、マウスのＣＤ４プロモータ、マウスのｐ５６１ｃｋプロモータ、マウスのＩＥ−αプロモータおよびマウスのＨ２ｋプロモータよりなる群から選択されるプロモータである請求項３に記載の哺乳動物。５．ヒトのＣＤ４をコードするトランスジーンがヒトのＣＤ２プロモータに作用的に結合し、ＨＬＡＤＱｗ６のαおよびβ鎖をコードするトランスジーンがその内生のＤＱｗ６のαおよびβプロモータにそれぞれ作用的に結合している請求項４に記載の哺乳動物。６．哺乳動物もしくはその後代を作製するに方法であって、（ａ）哺乳動物における内生のＣＤ８の発現を抑制し、（ｂ）哺乳動物における内生のＣＤ４の発現を抑制し、（ｃ）ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子をコードするトランスジーンまたはその生物学上活性な断片を哺乳動物に挿入し、（ｄ）ヒトのＣＤ４をコードするトランスジーンまたはその生物学上活性な断片を哺乳動物に挿入することを備える哺乳動物もしくはその後代の作製方法。７．ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子がＤＱｗ６である請求項６に記載の方法。８．敗血症防止作用について治療処方を評価する方法であって、（ａ）請求項１に記載の哺乳動物に治療処方物を投与する際、治療処方物の投与の前に、または投与と同時に、または投与の後に敗血症を誘発する能力を持った化合物および／または生物に露呈しながら治療処方物を投与し、（ｂ）哺乳動物を敗血症または敗血症様徴候につきスクリーニングすることを特徴とする治療処方物の評価方法。