JP2000513703A

JP2000513703A - 過形成および関連疾患の治療におけるブレフェルジンａおよびその誘導体の使用

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Publication number: JP2000513703A
Application number: JP09501472A
Authority: JP
Inventors: ハート，チャールズ，イー．; コネル，オリバー，ジェイ．エムシー; マルティネツ，テレサ; ウエスト，ロバート，アール．
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 2000-10-17
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: EP0831807A1; DK0831807T3; WO1996040112A1; ATE313324T1; DE69635614D1; EP0831807B1; US5618837A; DE69635614T2; AU6048396A; JP3190684B2; ES2253750T3

Abstract

(57)【要約】霊長類を含む哺乳類の血管系において内膜過形成を抑制する方法が開示される。該方法は、有効量のブレフェルジンＡまたはブレフェルジンＡの誘導体を哺乳類に投与することを含んで成る。この方法は、例えば、血管形成術、動脈内膜切除術、整腹アテローム切除術または血管移植片の吻合に起因する血管損傷による、内膜過形成を抑制するのに有用である。ブレフェルジンＡおよびその誘導体を所望によりヘパリンと協同して投与することができ、よって非ペプチド性PDGFアンタゴニストとヘパリンの協同投与は併用すると内膜過形成を抑制するのに有効である。

Description

【発明の詳細な説明】過形成および関連疾患の治療におけるブレフェルジンＡおよびその誘導体の使用発明の背景血管壁中の平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖は、アテローム硬化症によるか、血管再建後かまたは他の血管損傷に関連した血管病変の形成にかかわる重要な現象である。例えば、アテローム硬化症の治療はしばしば、アテローム硬化斑をカテーテル挿入によって圧迫もしくは除去し（血管形成術）、切開によって動脈壁から取り除き（動脈内膜切除術）、または自然もしくは人工移植片を使ってバイパス形成するという外科的手法である、血管形成術、動脈内膜切除術、整腹アテローム切除術またはバイパス移植術による、閉塞血管の清浄化を含む。これらの手法は、血管内皮を除去し、その下にある内膜層を破壊し、そして内側のＳＭＣを致死せしめる。この損傷の後に、内側のＳＭＣの増殖と内膜への移動が起こり、それに細胞外マトリックスの過剰な沈着が付随する。この病変発生は、特徴的には外傷後最初の数週間以内で且つ６カ月まで起こり、そして上に内皮層が再形成されると止まる。ヒトの場合、それらの病変は細胞約20％と細胞外基質約80％から成る。血管形成術、動脈内膜切除術またはバイパス移植術により処置した患者の約30 ％またはそれ以上において、血栓症および／または内膜中のＳＭＣ増殖が血管の再閉塞を引き起こし、その結果として再形成術が失敗に終わる。この手術後の血管の閉塞は再狭窄として知られている。同様なＳＭＣ増殖過程が臓器移植片においても観察されており、これは移植片アテローム硬化症および臓器機能不全の一因となり得る。この過程の内膜肥厚は、移植した臓器のみが関係する。血小板分裂促進因子（マイトジェン）、例えば血小板由来増殖因子（PDGF）はアテローム硬化斑の発生に何らかの役割を果たすと推測されている（Ross他，Ce ll 46:155-169，1986；Harker，Am ．J．Cardiol． 60:20B-28B，1987）。硬化斑形成の１つの提唱された機序は、内皮露出部位における、ＳＭＣ増殖を刺激する増殖因子の血小板による放出である（RossおよびGlomset，N ．Eng．J．Med． 295 :369-377，420-425，1976；Ross，Arteriosclerosis 1: 293-311，1981）。M oore他（Thrombos ．Haemostas．（Stuttg.）35:70，1976）とFriedman他（J ．Cl in．Invest． 60:1191-1201，1977）は、内在カテーテル損傷モデルを使って、抗血小板血清の投与により誘導された長期血小板減少による、ウサギ動脈における実験的に導入した内膜損傷発生の抑制を報告した。ＳＭＣがオートクリン機構を通して損傷形成を刺激するPDGFを自己生産し得るとも仮定されている（Ross他，前掲；Walker他，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 83:7311-7315，1986）。Fing erle他（Proc ．Natl．Acad．Scl．USA 86:8412-8416，1989）は血小板減少症ラットにおいて内膜損傷形成を研究し、そして血小板がバルーン損傷後の内膜ＳＭＣ増殖に役割を果たすのではなくて内膜中へのＳＭＣの移動を調節することができると結論づけた。血小板は現在、PDGF、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子αおよひβ（ＴＧＦαおよびＴＧＦβ）、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）および血小板由来内皮細胞増殖因子をはじめとする多数の増殖因子、並びに幾つかの化学誘引分子を放出することが知られている。ある実験はPDGFを損傷発生に伴う過程に関係づけたけれども、霊長類の内膜過形成の病因は不明のままである。血管形成術または動脈内膜切除術によるアテローム硬化斑の除去は限定された効果を有し、処置した血管の再狭窄またはバイパス移植片の狭窄の効果的な治療法はまだ開発されていない。従って、血管壁における高ＳＭＣ損傷（バルーンカテーテル挿入、動脈内膜切除、血管内ステント据付、整腹アテローム切除術、並びに血管移植、臓器移植およびカテーテル挿入による損傷のような血管損傷後の血管の狭窄を含む）の発生を削減または防止する方法が当業界で要望されている。本発明はそういった方法を提供し、且つ別の関連した要望を満たす。発明の要約本発明は、非ペプチド性PDGFアンタゴニストとしてブレフェルジンＡ（１，６，７，８，９，11ａ，12，13，14，14ａ−デカヒドロ−１，13−ジヒドロキシ− ６−メチル−４Ｈ−シクロペンタ〔ｆ〕オキサシクロトリデシン−４−オン）およびその誘導体を使用する方法を提供する。本発明は、式Ｉ，IIまたはIIIの化合物の抗過形成性有効量を投与することを含んで成る、哺乳類の血管系における内膜過形成を抑制する方法を提供する：構造Ｉ，IIおよびIIIにおいて、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁およびＲ₂は同一であり、そして単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとＯＨ、ＨとＯＲ、またはＨとOCORであり；Ｒ₃は単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとＯＨ、ＨとＯＲとまたはＨとOCORであり；Ｒ₄はCOOH、COOHの医薬上許容される塩、またはC H₂ORであり；Ｒ₅とＲ₆は両方とも酸素であるか、またはＲ₅とＲ₆の一方がＯでありそして他方が二重結合を含み；そしてＲはＣ_1-5アルキル、フェニルまたはベンジルである。本発明の範囲内での使用に好ましい化合物は、点線が単結合または二重結合を表し、Ｒ₁およびＲ₂が単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨであるもの；点線が単結合または二重結合を表し、そしてＲ₁およびＲ₂ がＨとＯＲ、またはＨとOCORであり、ＲがＣ_1-5アルキル、フェニルまたはベンジルであるもの；Ｒ₁およびＲ₂が単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨであり、Ｒ₅がＯでありそしてＲ₆が単結合または二重結合であるもの；Ｒ₁およびＲ₂が単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨであり、Ｒ₅が単結合または二重結合であり、そしてＲ₆がＯであるもの；点線が単結合または二重結合を表し、Ｒ₁，Ｒ₂およびＲ₃が単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨであり、そしてＲ₄がCOOHまたは COOHの医薬上許容される塩であるもの；点線が単結合または二重結合を表し、Ｒ₁ ，Ｒ₂およびＲ₃がＨとＯＲ、またはＨとOCORであり、Ｒ₄がCH₂ORであり、そしてＲがＣ_1-5アルキル、フェニルまたはベンジルであるものである。好ましい態様では、本発明は、ブレフェルジンＡの抗過形成性有効量を投与することにより哺乳類の内膜過形成を抑制する方法を提供する。本発明は更に、哺乳類の内膜過形成を抑制する方法であって、前記内膜過形成が急性血管損傷、血管移植片または移植臓器の据付に起因する方法を提供する。本発明はまた、哺乳類の血管損傷部位における内膜過形成を抑制する方法を提供する。本発明の特定の態様では、前記血管損傷が、血管形成術、動脈内膜切除術、整腹アテローム切除術、血管内レーザー剥離または血管移植片の吻合のような血管再建によるものである。本発明は、哺乳類の急性血管損傷の前、同時または後の抗過形成性有効期間内での式Ｉ，IIまたはIIIの化合物の投与方法も提供する。関連した態様では、哺乳類の急性血管損傷と同時またはその前の抗過形成性有効期間内で前記化合物が投与される。本発明は更に、ヘパリンと式Ｉ，IIまたはIIIの化合物の協同投与（coordinat e administration）により哺乳類の内膜過形成を抑制する方法を提供する。本発明はまた、例えば哺乳類においてPDGF活性を抑制するために、PDGFアンタゴニストとして式Ｉ，IIまたはIIIの化合物を使用する方法も提供する。発明の詳細な説明上述したように、血管の再狭窄は血管形成術、動脈内膜切除術またはバイパス移植術を受けた患者に共通の問題である。再狭窄は、細胞外マトリックスの生成（付着）はもちろん、外科手術によっても、損傷を受けた部位への血管平滑筋細胞の増殖（有糸分裂）と移動の両方を含む過程により進行すると思われる、内膜過形成の一例である。一般的には、Harker，Am ．J．Cardiol． 60:20B-28B，19 87；およびDeFeudis，Drug News and Perspectives 5:49-51，1992を参照のこと。この増殖過程は、血管移植片（自系または同種異系を含む天然移植片、および合成移植片の両方）および移植された臓器の閉塞の形でも現れる。この増殖過程は平滑筋細胞に富む病変の発生を引き起こすので、本明細書中では内膜過形成と呼ぶことにする。本発明は、式Ｉ，IIまたはIIIの化合物の抗過形成性有効量の使用を通して高ＳＭＣ病変〔内膜の肥厚（過形成）による血管の一部または完全遮断〕の発生を抑制する方法を提供する。それらの化合物は非ペプチド性PDGFアンタゴニストであることが判明した。この化合物は単独にまたは抗過形成性有効量のヘパリンと組み合わせて使用することができる。本発明はまた、非ペプチド性PDGFアンタゴニストとしてブレフェルジンＡおよびその誘導体を使用する方法も提供する。非ペプチド性PDGFアンタゴニストは、強皮症、肺過形成、腎線維症、慢性関節リウマチの治療法において、または骨肉腫、線維肉腫、神経膠腫もしくは他の増殖性細胞疾患を含むがそれに限定されない固形癌の治療において治療薬として有用である。本発明の化合物を製造するのに使われる誘導体化方法は当業界で周知である。 R.C．Larock，Comprehensive Organic Transformat-ions，VCH Publishers，Inc .，New York，1989；H.O．House，Modern Synthetic Reactions，W.A．Benjamin ，Inc.，Menlo Park，CA．1972；L.F．FieserおよびM．Fieser，Reagents for O rganic Synthesis ，John Wiley and Sons，Inc.，New York，Vol．1，1967；J． March，Advanced Organic Chemistry ：Reactions，Mechanisms，and Structure ， McGraw-Hill Book Company，New York，1968；I.T．HarrisonおよびS．Harri son，Compendium of Organic Synthetic Methods，Wiley-Interscience，New Yo rk，Vol．1，1971；P.N．Rylander，Hydrogenation Methods，Academic Press， New York，1985；D.J．PastoおよびC.R．Johnson，Organic Structure Determin ation ，Prentice-Hall，Inc．Englewood Cliffs，N.J.，1969。式IVのブレフェルジンＡ誘導体は、α，β−不飽和ケトンの一部であるオレフィンを、低温のもしくはピリジン中の水素化ホウ素ナトリウムで、アンモニア−エーテル中のリチウムで、または酢酸中の亜鉛で選択的に還元することにより調製することができる。水素と触媒（好ましくは炭素上のパラジウム）を使った水素化は、２つの二重結合を還元する。カルボニルへのヒドロキシル官能基の酸化は、クロム試薬、例えば三酸化クロムと硫酸（ジョーンズ試薬）もしくはクロロクロム酸ピリジニウムを使って、またはジメチルスルホキシドと無水酢酸を使って達成することができる。還元と酸化は選択的に行うことができる。式ＶのブレフェルジンＡ誘導体は、適当な酸クロリドまたは酸無水物と塩基（好ましくはピリジン）を使って、ヒドロキシルをアシル化することにより調製される。ヒドロキシルからエーテルへの変換は、塩基または酸化銀と、適当なハロゲン化アルキルまたはハロゲン化ベンジルとを使って行うことができる。二重結合の還元は上述した通りである。式VIのブレフェルジンＡ誘導体は、ハロゲン化溶媒（例えばジクロロメタン）中の４−クロロペルオキシ安息香酸を使って、孤立した二重結合をエポキシド化することにより調製される。ヒドロキシルの酸化および共役二重結合の還元は上述した通りである。式VIIのブレフェルジンＡ誘導体は、エステルのカルボニルと共役したオレフィンを、塩基性条件下で過酸化水素を使ってエポキシド化することにより調製される。ヒドロキシルの酸化および二重結合の還元は上述した通りである。式VIIIのブレフェルジンＡ誘導体は、上記と同様な二重結合の還元とヒドロキシルの酸化により調製される。ラクトン基の加水分解はアルコール（例えばメタノール）中の水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを使って行われる。式IXのブレフェルジンＡ誘導体は、二重結合の（選択的）還元および上述したようなヒドロキシル官能基のアシルまたはアルキル誘導体の形成により調製される。テトラヒドロキシ誘導体の形成は、金属水素化物還元剤、好ましくは水素化リチウムアルミニウムを使って行われる。本明細書中で用いる「非ペプチド性PDGFアンタゴニスト」なる語は、PDGFで誘導される応答経路の刺激を抑制する、ペプチド性化合物以外の化合物を言う。「応答経路」は、必ずしも常にではないが一般的に、膜結合型レセプターに直接関連づけられる外部刺激に応じて活性化される生化学経路である。応答経路は一般に、応答性細胞系からの細胞外マトリックス分泌、ホルモン分泌、化学走性、分化、または応答性細胞の細胞分裂の刺激、といった細胞性応答を誘導する。 PDGFレセプターは、通常その発現が中胚葉由来の細胞に限定される膜貫通型の一体型糖タンパク質である。２つのPDGFレセプターポリペプチドが記載されている。それらは「αレセプター」（Kelly他，WO 90/14425；Kelly他，米国特許第5 ,371,205号；Claesson-Welsh他，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86:4917-4921， 1989）および「βレセプター」(Claesson-Welsh他，Mol ．Cell．Blol． 8:3476 -3486，1988；Gronwald他，Proc ．Natl．Acad．Scl．USA 85: 3435-3439，1988）と呼ばれる。PDGFリガンドの存在下で、レセプターポリペプチドは二量化する。よって３種のレセプターサブタイプが考えられる：αα、α βおよびββ。βレセプターはPDGFのＢ鎖に特異的であり、一方αレセプターはＡ鎖とＢ鎖に結合する。従って、PDGFへの細胞の増殖調節応答性は、PPDFのＡＡ、ＡＢおよびＢＢリガンドイソ型タンパク質の利用可能性にだけでなく、異なる PDGFレセプターサブタイプの発現および利用可能性にも依存する（Heldin他，Ce ll Regul ．1:555-566，1990）。ヒト平滑筋細胞はαレセプターとβレセプターの両サブタイプを発現する（Heldin他，Cell Regul．1:555-566，1990）が、単一のレセプターサブタイプのみを発現する他の細胞型が知られている（Gronwald 他，J ．Biol．Chem． 264:8120-8125，1989）。本発明は、抗過形成性有効量の非ペプチド性PDGFアンタゴニストと抗過形成性有効量のヘパリンを協同して投与することにより、内膜過形成を抑制する方法も提供する。本明細書で用いる「ヘパリン」という語は、グルコサミンおよびグルクロン酸糖残基の反復構造により一般に特徴付けられる、構造的に複雑な硫酸化グリコサミノグリカンの化合物群のいずれかの構成員を指す（Casu，Adv ．Carbo -hyd．Chem．and Biochem． 47:578-583，1985）。最も広く知られているヘパリンは、ウシ肺またはブタ腸から調製された「未分画の」または「市販の」ヘパリンであって、それらは約8,000〜20,000ダルトンの分子量に及ぶヘパリン分子の不均一混合物を包含する（Wolinsky他，J ．Am．Coll．Cardiol． 15:475-481，1 990）。しかしながら、ヘパリンという語は広範囲のより均一なヘパリン調製物、並びに硫酸ヘパランのようなヘパリン様分子も包含する。それらの特定のヘパリン例の中で、より具体的なヘパリンサプタイプも知られている。例えば、報告によれば、平滑筋細胞の増殖を阻害することに関して未分画ヘパリンよりも40倍まで活性である、内皮細胞（Castello t他，J ．Cell．Biol． 90:372-379，1981）および平滑筋細胞（Fritze他，J ．Ce ll．Biol． 100:1041-1049，1985）により生産される硫酸ヘパラン成分が単離されている。その上、天然に存在するヘパリンサイズ変異体の中で、抗凝固活性または抗増殖活性のいずれかを主として示す分画ヘパリン種が単離されている（Wo linsky他，J ．Am．Coll．Cardiol． 15:475-481，1990）。後者の活性は低分子量ヘパリン種、例えば五（ペンタ）〜十（デカ）糖類の範囲内のヘパリンに存在する傾向があり、それらの種はより大きな生体適合性とより長い半減期も与えることが報告されており（Id，Bacher他，Thrombosis Res．70:295-306，1993）、従って本発明の特定態様において特に有用かもしれない。本発明を説明する目的でのヘパリンの定義の中には合成ヘパリンおよびヘパリン誘導体も含まれ、多種多様なヘパリンが常用の化学合成、修飾および分解技術を使って製造されている〔例えばRoden，L．The Biochem-istry of Glycoproteins and Proteoglycans（ Lennarz，W.J．編）267-371頁，Plenum Publishing Corp.，New York，1980を参照のこと。その内容は参考として本明細書中に組み込まれる〕。化合物の「抗過形成性有効量」は、血管、血管移植片または移植臓器の血管成分において内膜過形成を測定可能なほどに減少または防止するのに十分な化合物の量として定義される。より詳しくは、「内膜過形成の抑制」は、技術の現状において説明されている内膜過形成過程、例えば血管平滑筋細胞（VSMC）移動、VS MC増殖、および細胞外マトリックスの新生内膜沈着、のうちの１つまたは複数の測定可能な抑制を含むものとして本明細書中では定義される。この状況下では、内膜過形成のまたは内膜過形成に含まれる過形成過程の減少または防止は、当業界で周知の試験管内、生体内および生体外アッセイ方法を使って、特に霊長類のアッセイ方法（例えば、非ヒトもしくはヒト霊長類のVSMC培養物もしくは血管組織外植片、または非ヒト霊長類の生体内試験）を使って、容易に評価することができる。PDGFがそれの刺激作用を及ぼさないようにすることにより、SMC増殖およびその後のマトリックス沈着を減らすことができる。内膜過形成の減少は、急性血管損傷後の管腔容積の低下の有意な減少として臨床的に表れる。そのような減少は一般的に、初期損傷部位における再血管形成手術（例えば繰り返し血管形成術）の必要性の減少をもたらすだろう。本発明の方法は、急性血管損傷による内膜過形成の治療に特に有用である。急性血管損傷は、生涯に渡って発達する慢性血管損傷（例えばアテローム硬化症）とは対照的に、迅速に（即ち数日から数カ月の間に）起こる損傷である。急性血管損傷はしばしば、血管形成術、動脈内膜切除術、整腹アテローム切除術、血管内レーザー剥離、血管内ステント据付、血管移植片の吻合などの技術を使用する、血管再建のような外科的処置から生じる。過形成は、例えば血管移植片の据付または臓器移植に応答して、遅延反応として起こることもある。式Ｉ，IIおよびIIIの化合物は、PDGFの過形成過程または他の生物学的作用を抑制するのに有効な量で、内膜過形成の危険性があるかまたは他の形でPDGFアンタゴニスト療法を必要とする哺乳類に投与される。一般に、該化合物は、特定化合物の比活性、患者の年齢、体重および一般状態、並びに治療しようとする症状の重さといった要因に応じて、１日あたり受容者の体重１kgあたり化合物１μｇ〜10mgの量で、より普通には１mg／kg／日未満の量で投与されるだろう。致命的症状は、一般に他の場合では許容されないような多量で治療されるだろう。特定化合物の用量は、実験動物を使った研究と組み合わせた試験管内または生体外研究から決定することができる。試験管内または生体外で有効であると認められた化合物の濃度は動物実験のための指針を与え、その実験において作用部位に同様な濃度を与えるように用量が算定される。動物実験において有効であると決定された用量は通常、１オーダーの範囲内でヒトの用量の予測値となる。用量決定は当業者の技術水準の範囲内であり、特定の状況において使用する最終用量は臨床医により決定されるだろう。単独でまたはヘパリンと併用して、非ペプチド性PDGFアンタゴニスト療法で治療されるヒトの場合、該アンタゴニストは広範囲の条件のもとで投与され得る。アンタゴニストは血管再生術の前とそのような手術後の複数回、ボーラス注射によって投与することができる。アンタゴニストは、手術前に（一般に手術前の24 時間以内に）ボーラス注射（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）としておよび手術後の連続した輸液（埋込式ポンプを通した輸液を含む）として与えることができる。多くの場合、入院中は一日量を投与し（輸液による投与を含む）、その後で１〜２週間またはそれ以上の外来患者治療の期間の間、より少頻度のボーラス注射を与えることが好ましいだろう。処置は最初の損傷後６カ月まで続けることができる。アンタゴニストは静脈内、筋肉内または皮下注射を含む複数のルートで投与することができる。加えて、灌流バルーンカテーテル、ステント上へのコーティング、またはゲルコーティングされたバルーンへの設置を使って、アンタゴニストを血管損傷部位に局所的に投与することもできる。後者の場合、アンタゴニストの用量は全身投与される時に必要であるものよりも実質的に少ないだろうと期待される。アンタゴニストは徐放性デリバリーシステム、例えば血管移植片もしくはステント中に組み込んだそのようなシステムにより、または灌流もしくは二重バルーンカテーテルによって送達せしめることもできる。ポンプおよび他の既知のデリバリーシステムを使ってもよい。本発明の別の態様では、非ペプチド性PDGFアンタゴニストは、哺乳類の血管系での内膜過形成を協同して抑制するのに十分なアンタゴニストとヘパリンの各々の単位用量で、哺乳類にヘパリンと協同投与される。本明細書の「協同投与（co ordinate administration）」は、アンタゴニストとヘパリンの同時の、別々のまたは連続した投与を含むつもりである。この場合、アンタゴニストとヘパリンの両者は互いに関して限定された併用有効期間の中で投与される。「併用有効期間」とは、２つの剤が併用すると過形成を抑制するのに有効であるようなアンタゴニストの投与とヘパリンの投与の間に入る最大期間として定義される。「併用すると有効である」という語は、他の点では同等の条件および用量の下で単独で投与した抗体またはヘパリンのいずれかにより独立に与えられる最大抑制レベルを上回る、内膜の肥厚もしくは損傷形成のまたは過形成過程の測定可能な抑制をもたらすものとして定義される。通常、ヘパリンの用量は約１μｇ〜100mg／kg／日であろう。好ましくは、ヘパリンの用量は20μｇ〜10mg／kg／日であり、より好ましくは約１mg／kg／日未満であろう。当業者が知るように、実際の用量は患者のパラメーターや投与される抗体の特性（例えば、特異性、比活性、循環半減期）およびヘパリンの特性（例えば血栓崩壊活性）をはじめとする、特定の状況を考慮しながら決定されるだろう。過形成の抑制は患者の臨床的事象の減少をもたらすと期待されるだろう。それらとしては、心筋梗塞、狭心症、血管再生術の必要性および死亡のうちの１つまたは複数の減少が挙げられる。次の実施例は例示目的で与えられるのであって限定目的ではない。実施例１アンタゴニストアッセイ SWISS3T3細胞中で発現される血清応答要素（ＳＲＥ）−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を阻止することができる物質を同定するＳＲＥ−ルシフェラーゼ高処理量アッセイ系を通して、非ペプチド性PDGFアンタゴニストとしてのブレフェルジンＡの初期特徴づけが可能になった。ＳＲＥ−ルシフェラーゼ構成物であるpKZ67は、−360から＋30までのヒトc-fos配列を含む合成セグメント（van S traaten他，Proc ．Natl．Acad．Sci USA 80:3183-3187，1983）（ＴＡＴＡ、ＳＲＥおよびＳＩＥプロモーター要素を含む）、ルシフェラーゼ配列（Delegeane 他，Mol ．Cell Biol． 7:3994-4002，1987；deWet他，Mol ．Cell Blol． 7:725- 737，1987）およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーターを含有するルシフェラーゼ発現単位を含んで成るpUC18由来の哺乳類細胞発現ベクターである。この発現単位は、SV40プロモーター配列とターミネーター配列によって隣接されたネオマイシン耐性マーカーを含む第二の発現単位に対して反対の転写方向にある。 SWISS3T3細胞は、PDGF−AA，−ABおよび−BB；bFGF並びにEGFの内因性増殖因子レセプターを発現する。それらの増殖因子のいずれかによる該レセプターの刺激は、ルシフェラーゼの誘導に至るシグナルカスケードを開始させる。ＰＭＡ（ホルボール12−ミリステート13−アセテート）は、プロテインキナーゼＣを刺激することにより該レセプターを迂回しそして内部シグナルカスケードを開始させてルシフェラーゼの誘導をもたらす。アンタゴニスト特異性の程度は、３つの増殖因子（PDGF，bFGFおよび EGF）についての生成シグナルを比較することにより決定することができる。対照に比べて50倍のシグナル低下をもたらす化合物を更なる分析に使った。 SWISS3T3/KZ67-G1-6細胞（ＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトされたもの）を、維持培地〔10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２mMＬ− グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mg／mlのG418が補足されたＤＭＥＭ(G IBCO BRL，Gaithersburg，MD）〕中での連続継代により維持した。アッセイの２日前に、細胞をトリプシン処理し、増殖培地（１％ＦＢＳ、２mMＬ−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムが補足されたＤＭＥＭ）中で５×10⁴細胞／ウエルに調整し、透明な白い96ウエルマイクロタイタープレートに200μｌ／ウエル（1× 10⁴細胞／ウエル）を接種し、そして37℃，５％CO₂で48時間増殖させた。試験物質は４％DMSO中に調製した。ウエルから弱った培地を除去し、50μｌ／ウエルのアッセイ培地〔0.5％第Ｖ画分ＢＳＡ(Sigma，St．Louis，Mo.）、２m MＬ−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、20mM Hepesが補足されたハムF12 培地（GIBCO BRL）〕を添加することにより、誘導を開始した。アッセイ培地中の試験試料25μｌを添加した。アッセイ培地中に調製した次の対照を各プレートに含めた：未処理のウエル（基底）、12.5ng／ml、より好ましくは6.25ng／mlの PDGF−BB〔血小板由来増殖因子、原液10μｇ/ml、10mM酢酸，0.25％ RSA／PBS〕、2.0ng/mlのbFGF〔塩基性繊維芽細胞増殖因子（Genzyme Diagnostics，Cambri- dge，MA）〕、4.5ng／mlのEGF〔表皮増殖因子（Sigma）〕または50ng／mlのPMA （Sigma）。DMSOの最終アッセイ濃度は１％以下であった。プレートを37℃，５％CO₂で５時間インキュベートした。誘導後、プロメガ社製ルシフェラーゼアッセイキット（E1500；Promega Corp. ，Madison，WI）を使ってアッセイキットプロトコールに従ってルシフェラーゼ活性を測定した。簡単に言えば、プレートからアッセイ培地を除去し、そして無菌水で１：５希釈した25μ ｌ／ウエルの細胞溶解緩衝液をプレートに添加した。プレートを15分間インキュベートした。プレートをLumiskan（商標）マイクロタイタールミノメーター（IC N Biomedical，Cleveland，OH）に移し、そこに40μｌ／ウエルのルシフェラーゼアッセイ基質（Promega Corp．）を添加した。１秒間の混合と１〜３のシグナル積分の後、発光の量（相対光単位、ＲＬＵ）を測定した。全ての測定値から基底の（未誘導の）ルシフェラーゼシグナルを差し引き、そして試験試料により誘導されたルシフェラーゼシグナルを、対照からのシグナルに対する百分率（％）として表した。基底レベルを超えるシグナルを誘導する試料を、更なる特徴づけのために選択した。表１に与えるデータは、対照活性の50％を阻害するのに必要なブレフェルジンＡのおよその有効量（ＩＣ₅₀）を示す。表１ PDGF bFGF EGF PMA EC₅₀ （μＭ） EC₅₀ （μＭ） EC₅₀ （μＭ） EC₅₀ （μＭ） 0.4 無活性無活性 0.4 実施例２ラット平滑筋細胞（ＳＭＣ）への¹²⁵I−PDGF−BB結合の阻害ラットＳＭＣの単層培養物への¹²⁵DGF−BB結合を阻害する能力についてブレフェルジンＡを分析した。ＳＭＣを約20,000細胞／ウエルの密度で24ウエル培養皿に接種した。接種後２〜７日目に細胞をアッセイに使った。試験化合物を結合培地〔500mlのハムＦ-12(Gibco BRL)，12mlの1M Hepes，pH7.4，5mlの100×PSN、1 gmのウサギ血清アルブミン（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）〕中で表２に示す濃度に希釈し、次いで三重反復試験においてＳＭＣ（１ml／ウエル）に添加した。次いでそれらのウエルに50μｌの¹²⁵Ｉ−PDGF−BB結合原液を添加した。結合培地のみを陰性対照として使用し、¹²⁵Ｉ−PDGF−BBに対する非特異的結合を測定するのに200ng/m lのPDGF−BBの添加を使った。４℃で約1.5時間細胞をインキュベートし、次いで結合培地で洗浄して未結合のリガンドを除去した。次いで細胞を抽出緩衝液（20 mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA，0.5％デオキシコール酸ナトリウム，10mM NaI，１％ウシ血清アルブミン）と共にインキュベートし、抽出液を収集し、γカウンター中でカウントした。結合研究の結果を表２に示す。データは¹²⁵Ｉ−PDGF−BBについての結合した比放射能（cpm）として与えられる。200ng／mlの未標識のPDGF−BBの添加により測定された非特異的結合は853cpmであり、与えられるデータからこの値が差し引かれている。表２ラットＳＭＣへの¹²⁵Ｉ−PDGF−BB結合の阻害実施例３ヒヒ平滑筋細胞に対するPDGF−BB有糸分裂促進活性の阻害ヒヒ平滑筋細胞に対するPDGFの有糸分裂促進活性を阻害する能力についてブレフェルジンＡを分析した。ヒヒ血管平滑筋細胞（BVSMC）に対して行った全ての有糸分裂アッセイは、13〜20継代培養した細胞の初代培養物に関して実施した。出発培養物は大動脈性組織外植片の派生物から確立された。ヒヒ平滑筋細胞を、 10％ウシ胎児血清が補足されたDMEM中、ウエルあたり約20,000細胞の密度で24ウエルの培養皿に接種した。使用する１日前に培地を除去し、1mlのMito Media（表３）を各ウエルに添加して、細胞を静止状態にした。実験開始時点で、細胞をPDGF−BBで刺激した。1，0.5，0.25，0.062および0ng／mlの濃度を使ってPDGF−BBについて標準曲線を作成した。0.25％アルブミンを含む10mM酢酸中への希釈により各PDGF濃度について20×原液を作り、そして50μｌのPDGFまたは希釈賦形剤のみを培養ウエルに添加した。表３ Mito Media 500ml溶液に対して： 250ml DMEM（GIBCO BRL） 250ml ハムF-12（GIBCO BRL） 0.25ml 10mg／mlインスリン原液（GIBCO BRL）で５μｌ／mlの最終濃度を与える１ml 10mg／mlトランスフェリン原液（Collaborative Research，Bedford，M A）で20μｌ／mlの最終濃度を与える２ml ４μｇ／mlセレニウム原液（Aldrich Chemical，Milwaukee，WI）で5nM の最終濃度を与える５ml 10％ウシ血清アルブミン原液（GIBCO BRL）で0.1％の最終濃度を与える PDGF−BB有糸分裂促進活性を中和するブレフェルジンＡの活性を分析するために、１ng／mlのPDGFをブレフェルジンＡの様々な希釈液と一緒にウエルに添加した。細胞を試験試料と共に37℃で約20時間インキュベートした。次いで各ウエルに50μｌの20×原液を添加して１μCi／mlの最終濃度を与えた。細胞を37℃で４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いでトリプシンを使って収穫し、 Wallac（Turku，Finland）Betaplate（商標）液体シンチレーションカウンター中で〔³Ｈ〕チミジンの取込みについてカウントした。表３に与える結果は、PDG F−BB有糸分裂促進活性が用量依存形式でブレフェルジンＡにより阻害されることを証明する。この阻害のED₅₀はブレフェルジンＡの場合約25nMであった。表４ヒヒ平滑筋細胞に対するPDGF−BB有糸分裂促進活性の阻害これらのデータは、ラットＳＭＣへのPDGF結合を阻害するのに必要とされる用量の1/1000であるブレフェルジンＡの用量がヒヒ平滑筋細胞に対するPDGF−BB有糸分裂促進活性を有意に阻害できることを証明する。これと同じ実験の一部として、ヘパリンの存在下でブレフェルジンＡの阻害活性を分析し、ヘパリンがブレフェルジンＡと協同形式でPDGF−BB有糸分裂促進活性を阻害する作用をすることができるかどうかを調べた。ヒヒ平滑筋細胞を0.5U /mlの未分画ヘパリンの存在下でブレフェルジンＡを1ng/mlのPDGF−BBと共にインキュベートした。細胞を上記と同様に〔³Ｈ〕チミジンでパルス標識し、〔³Ｈ〕チミジン取込みのレベルを測定した。表３に与える結果は、ブレフェルジンＡへのヘパリンの添加がブレフェルジンＡのみにより達成されるものを超える大きな〔³Ｈ〕チミジン取込みの阻害をもたらしたことを証明する。

【手続補正書】【提出日】平成１０年１月１３日（１９９８．１．１３）【補正内容】請求の範囲 1. 哺乳類の血管系における内膜過形成を抑制するための剤であって、式Ｉ， IIまたはIII：（上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁およびＲ₂は同一であり、そして単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとＯＨ、ＨとＯＲ、またはＨとOCORであり；Ｒ₃は単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとＯＨ、ＨとＯＲ、またはＨとOCORであり；Ｒ₄はCOOH、COOHの医薬上許容される塩、またはCH₂ORであり；Ｒ₅とＲ₆は両方とも酸素であるか、またはＲ₅とＲ₆の一方がＯでありそして他方が二重結合を含み；そしてＲはＣ_1-5アルキル、フェニルまたはベンジルである）により表される化合物の抗過形成性有効量を含んで成る剤。 2. 前記化合物が、式IV （上式中、点線は単結合または二重結合を表し；そしてＲ₁およびＲ₂は単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨである）により表される化合物である、請求項１に記載の剤。 3. 前記化合物が、式Ｖ（上式中、点線は単結合または二重結合を表し；そしてＲ₁およびＲ₂はＨとＯＲ、またはＨとOCORであり、ＲはＣ_1-5アルキル、フェニルまたはベンジルである）により表される化合物である、請求項１に記載の剤。 4. 前記化合物が、式VI （上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁およびＲ₂は単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨであり；そしてＲ₅はＯである）により表される化合物である、請求項１に記載の剤。 5. 前記化合物が、式VII （上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁およびＲ₂は単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨであり；そしてＲ₆はＯである）により表される化合物である、請求項１に記載の剤。 6. 前記化合物が、式VIII （上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁，Ｒ₂およびＲ₃は単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨであり；そしてＲ₄はCOOHまたはCOOHの医薬上許容される塩である）により表される化合物である、請求項１に記載の剤。 7. 前記化合物が、式IX （上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁，Ｒ₂およびＲ₃はＨとＯＲ、またはＨとOCORであり、ここでＲはＣ_1-5アルキル、フェニルまたはベンジルであり；そしてＲ₄はCH₂ORである）により表される化合物である、請求項１に記載の剤。 8. 前記化合物がブレフェルジンＡ：である、請求項１に記載の剤。 9. 前記哺乳類が霊長類である、請求項１に記載の剤。 10．前記化合物が、前記哺乳類における急性血管損傷と同時に、またはその前の抗過形成性有効期間内に投与される、請求項１に記載の剤。 11．前記損傷が血管再建によるものである、請求項10に記載の剤。 12．前記血管再建が、血管形成術、動脈内膜切除術、整腹アテローム切除術、血管内レーザー剥離、血管内ステント据付または血管移植片の吻合を含んで成る、請求項11に記載の剤。 13．前記化合物が、前記哺乳類における急性血管損傷後の抗過形成性有効期間内に投与される、請求項１に記載の剤。 14．前記損傷が血管再建によるものである、請求項13に記載の剤。 15．前記血管再建が、血管形成術、動脈内膜切除術、整腹アテローム切除術、血管内レーザー剥離、血管内ステント据付または血管移植片の吻合を含んで成る、請求項14に記載の剤。 16．前記化合物が、血管移植片または移植臓器の据付と同時に、またはその前の抗過形成性有効期間内に投与される、請求項１に記載の剤。 17．前記化合物が、血管移植片または移植臓器の据付の後の抗過形成性有効期間内に投与される、請求項１に記載の剤。 18．前記哺乳類に協同投与される式Ｉ，IIまたはIIIの非ペプチド性PDGFアンタゴニストの抗過形成性有効量とヘパリンの抗過形成性有効量とを含んで成る剤であって、ここで前記協同投与される抗原とヘパリンは併用すると前記過形成を抑制するのに有効である、請求項１に記載の剤。 19．前記非ペプチド性PDGFアンタゴニストおよびヘパリンが、経口、静脈内、脈管周囲、経皮および直腸投与方法から成る群より選ばれた投与方法により前記哺乳類に投与される、請求項18に記載の剤。 20．哺乳類においてPDGF活性を抑制するための剤であって、式Ｉ，IIまたはII I：（上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁およびＲ₂は同一であり、そして単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとＯＨ、ＨとＯＲ、またはＨとOCORであり；Ｒ₃は単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとＯＨ、ＨとＯＲ、またはＨとOCORであり；Ｒ₄はCOOH、COOHの医薬上許容される塩、またはCH₂ORであり；Ｒ₅とＲ₆は両方とも酸素であるか、またはＲ₅とＲ₆の一方がＯでありそして他方が二重結合を含み；そしてＲはＣ_1-5アルキル、フェニルまたはベンジルである）により表される化合物のPDGF抑制量を含んで成る剤。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者エムシーコネル，オリバー，ジェイ. アメリカ合衆国，ワシントン 98199，シアトル，フォーティースアベニュウエスト 2642 (72)発明者マルティネツ，テレサアメリカ合衆国，ワシントン 98277，オークハーバー，ノースベントンプレイス 2722 (72)発明者ウエスト，ロバート，アール. アメリカ合衆国，ワシントン 98117，シアトル，シックスティースアベニュノースウエスト 7737

Claims

【特許請求の範囲】 1. 哺乳類の血管系における内膜過形成を抑制する方法であって、式Ｉ，IIまたはIII：（上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁およびＲ₂は同一であり、そして単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとＯＨ、ＨとＯＲ、またはＨとOCORであり；Ｒ₃は単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとＯＨ、ＨとＯＲ、またはＨとOCORであり；Ｒ₄はCOOH、COOHの医薬上許容される塩、またはCH₂ORであり；Ｒ₅とＲ₆は両方とも酸素であるか、またはＲ₅とＲ₆の一方がＯでありそして他方が二重結合を含み；そしてＲはＣ_1-5アルキル、フェニルまたはベンジルである）により表される化合物の抗過形成性有効量を前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。 2. 前記化合物が、式IV （上式中、点線は単結合または二重結合を表し；そしてＲ₁およびＲ₂は単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨである）により表される化合物である、請求項１に記載の方法。 3. 前記化合物が、式Ｖ（上式中、点線は単結合または二重結合を表し；そしてＲ₁およびＲ₂はＨとＯＲ、またはＨとOCORであり、ＲはＣ_1-5アルキル、フェニルまたはベンジルである）により表される化合物である、請求項１に記載の方法。 4. 前記化合物が、式VI （上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁およびＲ₂は単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨであり；そしてＲ₅はＯである）により表される化合物である、請求項１に記載の方法。 5. 前記化合物が、式VII （上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁およびＲ₂は単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨであり；そしてＲ₆はＯである）により表される化合物である、請求項１に記載の方法。 6. 前記化合物が、式VIII（上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁，Ｒ₂およびＲ₃は単一基＝Ｏであるか、またはＨとＯＨであり；そしてＲ₄はCOOHまたはCOOHの医薬上許容される塩である）により表される化合物である、請求項１に記載の方法。 7. 前記化合物が、式IX （上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁，Ｒ₂およびＲ₃はＨとＯＲ、またはＨとOCORであり；ＲはＣ_1-5アルキル、フェニルまたはベンジルであり；そしてＲ₄はCH₂ORである）により表される化合物である、請求項１に記載の方法。 8. 前記化合物がブレフェルジンＡ：である、請求項１に記載の方法。 9. 前記哺乳類が霊長類である、請求項１に記載の方法。 10．前記化合物が、前記哺乳類における急性血管損傷と同時に、またはその前の抗過形成性有効期間内に投与される、請求項１に記載の方法。 11．前記損傷が血管再建によるものである、請求項10に記載の方法。 12．前記血管再形成が、血管形成術、動脈内膜切除術、整腹アテローム切除術、血管内レーザー剥離、血管内ステント据付または血管移植片の吻合を含んで成る、請求項11に記載の方法。 13．前記化合物が、前記哺乳類における急性血管損傷後の抗過形成性有効期間内に投与される、請求項１に記載の方法。 14．前記損傷が血管再建によるものである、請求項13に記載の方法。 15．前記血管再建が、血管形成術、動脈内膜切除術、整腹アテローム切除術、血管内レーザー剥離、血管内ステント据付または血管移植片の吻合を含んで成る、請求項14に記載の方法。 16．前記化合物が、血管移植片または移植臓器の据付と同時に、またはその前の抗過形成性有効期間内に投与される、請求項１に記載の方法。 17．前記化合物が、血管移植片または移植臓器の据付の後の抗過形成性有効期間内に投与される、請求項１に記載の方法。 18．哺乳類の血管系における内膜過形成を抑制する方法であって、非ペプチド性PDGFアンタゴニストの抗過形成性有効量とヘパリンの抗過形成性有効量とを協同投与することを含んで成り、ここで前記協同投与される抗原とヘパリンが、併用すると前記過形成を抑制するのに有効である方法。 19．前記非ペプチド性PDGFアンタゴニストおよびヘパリンが、経口、静脈内、脈管周囲、経皮および直腸投与方法から成る群より選ばれた投与方法により前記哺乳類に投与される、請求項18に記載の方法。 20．哺乳類においてPDGF活性を抑制する方法であって、式Ｉ，IIまたはIII：（上式中、点線は単結合または二重結合を表し；Ｒ₁およびＲ₂は同一であり、そして単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとＯＨ、Ｈと−ＯＲ）またはＨとOCORであり；Ｒ₃は単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとＯＨ、ＨとＯＲ、またはＨとOCORであり；Ｒ₄はCOOH、COOHの医薬上許容される塩、またはCH₂ORであり；Ｒ₅とＲ₆は両方とも酸素であるか、またはＲ₅とＲ₆の一方がＯでありそして他方が二重結合を含み；そしてＲはＣ_1-5アルキル、フェニルまたは、ベンジルである）により表される化合物のPDGF抑制量を前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。