JP2000513810A - アッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 サンプル中の検体を定量するための動力学的アッセイ法。

Description

【発明の詳細な説明】 アッセイ法 本発明は、サンプル中の検体の定量のアッセイ法、特に、アッセイ系の成分が 少なくとも部分的に、直接、又は間接的に固体表面へ結合する過程の間の動的ア ッセイ法に関する。 本発明の方法は、特に、イムノアッセイの分野での応用があり、特にイムノア ッセイに関して本明細書に記載する。しかし、本方法は、アッセイされる種（以 後「リガンド」という）とリガンドの特異的結合パートナー（以後「特異的結合 パートナー」という）の間の親和性に依存する他のアッセイにも使用可能である 。 このような系におけるリガンドの濃度は、複合体形成の程度又は複合体形成を 生じる速度をモニターすることによって決定することができる。これを行うのに 好ましい方法の一つは、リガンド又はその特異的結合パートナーのいずれかに対 する測定可能なパラメーターを有する追加の成分を結合させることによる。この 追加の成分は、標識として当技術分野に周知であり、種々の化学又は生化学標識 、例えば、放射同位体、又は生化学的発光、スピン標識、蛍光体、発色団などが 周知である。このようなアッセイの過程において、事実上標識は、少なくとも間 接的に固体表面へ結合する。 従来は、上記のタイプのイムノアッセイ系のほとんどは、結合した標識を溶液 中の残りの標識から分離するために、アッセイのプロトコル中での洗浄及び／又 は分離工程があることを計算に入れていた。もしそうでなければ、後者は、遊離 して結合した標識との干渉を起こし、不正確な結果を導く。一旦分離が生じると 、既知の種々の技術は、結合した標識の定量のために使用され、従って、観察下 のサンプル中に存在するリガンドの濃度の測定をもたらす。このような系におい ては、分離工程は、測定を行うことが所望される各時点（ｔ）において繰り返さ れなければならず、全体として骨が折れ、時間がかかる。これらの問題に加え、 このアッセイのインキュベーション開始の設定にはある程度の不正確さが存在し 、これは全体のタイミングにおいてエラーを導く。 アッセイの読み取りの能率促進及び／又は従来のアッセイ系の感度の増大のた めには、動的な測定法が望ましい。上記のような制約は、従来のアッセイ系が、 信頼性のある動的測定を行なえないことを意味し、また、アッセイ系の特徴がこ れを可能とする非常に少ない場合のみに行われている。例えば、酵素が選択され た標識であり、酵素触媒された反応の生成物の生成速度が測定されるパラメータ ーであるイムノアッセイ系で動的測定を行うことは周知である。この場合、酵素 標識の測定は、信号発生工程の時間のみを短縮し、抗体：抗原結合の測定にかか る時間には影響しない、すなわち、動的測定はアッセイの最終工程に適用し、重 要な抗体反応には用いられない。 動的測定は、特定の免疫センサーにおいても使用される。ここにおいて、未知 の量の抗原を含むサンプルの信号の変化の速度が測定され、既知の濃度の抗原を 含む標準の同一のパラメーターと比較する。これを行うのに最も簡便な方法は、 標準中の既知の濃度の抗原に対する、信号の変化速度の曲線（単位時間当たりの 測定物（ｍｅａｓｕｒａｎｄｓ）中のｄＩ／ｄｔ）を組み立てることである。こ の方法では、対象となるサンプルのｄＩ／ｄｔの、未知の抗原の濃度は標準曲線 から単純に読み取られ得る。このような技法は、アッセイが、任意に決定される 平衡に達するようにし、その時点で信号の測定を行わなければならないという欠 点を有する。平衡に到達する速度は、非常に遅いことがあり、これ自体、測定条 件（例えば、温度、粘度）により大いに影響を受ける信号の変化速度の測定値に エラーを生じさせる。このような系においては、リガンド濃度の迅速で正確な測 定を得ることが不可能であることは明らかである。 本発明は、アッセイ法において、アッセイ系の成分が直接又は間接的に固体表 面に結合するか、又は吸着する過程の間、前記結合又は吸着成分の信頼性のある （すなわち、溶液中の遊離成分から妨害されない）測定が、前記成分の直接及び 連続したモニタリングによって得られるという発見に基づく。 本発明の方法は、直接法及び間接法の両方のアッセイ系に関し、アッセイ系の 成分が固体表面に結合することを含むことのみが要求されることを強調しなけれ ばならない。直接アッセイ法は、前記光学構造及び／又は発生された信号の光学 特性が、前記光学構造に結合するリガンドと特異性結合パラメーターとの生化学 的複合体（例えば、抗原／抗体複合体）によりどの程度（又はどのような速度で ）変化するかを決定するために、典型的には、発光した固体光学構造（例えば、 導波管）内での反射及び／又は発生した信号をモニターすることを含むことがで きる。直接アッセイ法は、典型的には、アッセイに存在する一つ以上の成分と結 合し、直接又は間接的に固体へ結合する標識（例えば、蛍光体）をモニターする ことを含むことができる。このような方法は、例えば、とりわけ国際公開第８８ ／０７２０２号及び国際公開第９０／０１１６６号（Ａｒｅｓ Ｓｅｒｏｎｏ） に記載されている。本発明は、抗体：抗原相互作用の結果として固体表面から標 識された成分を除去する置換アッセイへ等しく適用可能である。 本発明の新規なアッセイ法は、平衡のような任意に決定される終点を待つこと なく、インキュベーション期間の非常に早期の段階で未知のリガンド濃度を知る ことが可能であるという利点を有する。さらに、操作者は、連続的に結果を観察 することが可能であり、結果の正確さを高めるためにさらに読取りを行う価値が あるか否か判断することができる。加えて、連続モニタリングは、例えば、装置 に関する問題により生じるランダムエラーを容易に同定し得る。見せかけの結果 は、いずれも、簡単に単離され、無視され得る。 従って、最も広い範囲において、本発明は、成分が、例えば、固体光学導波管 、電極、又は圧電性結晶の表面のような、固体表面に少なくとも部分的に直接又 は間接的に結合するアッセイ系において未知のサンプルを定量的に決定する動的 測定法の使用を提供する。 「動的測定」とは、アッセイが実質的に定常状態、すなわち、平衡に達する前 の時間に、前記結合成分に関する測定可能な特性又は効果（以後「検体に依存す るパラメーター」という）を直接及び連続的に測定することを意味する。 さらなる観点から、本発明は、成分が、例えば、固体光学導波管、電極、又は 圧電性結晶の表面のような、固体表面に少なくとも部分的に直接又は間接的に結 合するアッセイ法であって、前記固体での前記成分に関する検体に依存するパラ メーターを直接及び連続的に測定すること、及び、前記検体に依存するパラメー ターを、未知のサンプルを定量的に決定するために処理することを特徴とする、 アッセイ法を提供する。一つの態様においては、検体に依存するパラメーターは 、 検体に依存する光学的パラメーター（すなわち、測定可能な光学的特性又は効果 ）であるが、電気化学又は圧電性の特性／効果に関するパラメーターも使用でき る。 さらなる態様において、本発明の使用又は方法は、較正の目的のために既知の 濃度の検体に適用できる。 特に好ましい態様においては、前記方法は、以下の工程を含む： （ａ）インキュベーションの開始後、複数の時点（ｔｘ）において、各サンプ ルについて独立して検体に依存するパラメーターの値（Ｐｘ）を連続的に測定す ることによって、各々既知の検体濃度（Ｃｘ）であるｘ個のサンプルのためのア ッセイ系を較正する工程、 （ｂ）未知の濃度の検体（Ｃｎ）のために、インキュベーションの開始後、各 時点ｔｎにおいて、検体に依存するパラメーターの独立するｎ個の値（Ｐｎ）を 連続的に測定する工程、及び （ｃ）時点ｔｎにおける検体の未知の濃度（Ｃｎ）を計算するために、工程（ ｂ）のデータ（Ｐｎ，ｔｎ）を、工程（ａ）の較正データ（Ｐｘ，ｔｘ，Ｃｘ） と組み合わせる工程。 上記の検体に依存するパラメーターは、便利なことに、適用される放射線（ラ ジエーション）と関連する結合アッセイ成分との間の相互作用に関するどのパラ メーターであってもよく、光吸収、散乱、蛍光の放出、燐光の放出、ルミネセン スの放出（化学ルミネセンス、生物ルミネセンス、及び電気化学ルミネセンスを 含む）又は着色放出特性を含むが、これらに限定されない。また、この用語（検 体に依存するパラメーター）は、結合した成分が有し得る、例えば、光学表面の 屈折率、又は透過性、光学固体内の全内反射又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ） 、又は固体表面での消失性波との相互作用に関する、測定可能な効果を包含する ことを意図する。このような検体に依存する光学的パラメーターの測定、又は上 記の効果の処理のための装置及び技術は、当技術分野に周知である。 本発明は、電気化学及び他のセンサー装置（例えば、圧電性結晶）のような非 光学装置の使用に及ぶ。 本明細書に使用するように、「固体」という語は、リガンド及び／又は特異的 結合パートナー成分と有用に結合し得る、あらゆる既知の表面を意図し、例えば 、 米国特許第５，３５６，７８０号に記載されている電気化学的、光学、圧電、又 は、繊維光学バイオセンサー、又は、ＳＰＲ効果を示すことが可能な光学構造（ 例えば、回折格子）、又は欧州特許公開第１７１，１４８号（ユニリーバ（Ｕｎ ｉｌｅｖｅｒ））及び国際公開第９５／２４６３２号（アプライド・リサーチ・ システムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ））に開示さ れるタイプの透過性光学体（例えば、欧州特許公開第１７０，３７６号に記載さ れているような導波管として作用するプリズム、シート又は繊維）の形のもので ある。固体が電極である電気化学アッセイ装置においては、電極で生じる磁場に 引きつけられる磁気を帯びたビーズ又は粒子に結合させる成分を使用することが 知られている。これらの装置も又、本発明の方法において有用であり、例えば、 欧州特許公開第１７０，４４６号（セロノ・ダイアグノスティックス・リミテッ ド（Ｓｅｒｏｎｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ））に記載されて いる。 本発明の態様の一つにおいて、固体は、対象となる検体への特異的結合パート ナーで覆われ得る。例えば、特異的結合パートナーは欧州特許公開第１７１，１ ４８号に記載されている既知の方法で、固体表面上を覆い得る。 本発明は、特に、標識として作用し、光吸収、光透過、光散乱、蛍光、燐光、 ルミネセンス、又は着色特性を有する成分が、少なくとも部分的に（直接又は間 接的に）透過性固体（例えば、光学導波管）の表面に結合するようにして行われ るアッセイ法、特に、例えば、欧州特許公開第１７０，３７６号及び欧州特許公 開第１７１，１４８号に記載されているような方法に適する。 間接アッセイ技術に関する本発明の態様において、標識を一つ又は他のリガン ド又はその特異的結合パートナーに直接又は間接的に結合させることは、当業者 に周知の方法によって実施され得る。このような標識の同定は、当業者に同様に 周知であり、上記の方法を含む。 本発明の方法は、特定の態様においては、化学、生化学、又は治療上のテスト 法、特にイムノアッセイ法において、特定の結合アッセイ法において使用するこ とを意図する。このような方法の例は、とりわけ、欧州特許公開第０，１７１， １４８号、国際公開第９２／０９８９２号、国際公開第 ９３／２５８９２号及び国際公開第９３／２５９０８号に記載されている。 本発明の方法は、ディップ−スティック（ｄｉｐ−ｓｔｉｃｋ）、又は、テス ト−ストリップ・センサー（ｔｅｓｔ−ｓｔｒｉｐ ｓｅｎｓｏｒｓ）を含む固 体表面へ結合する成分を使用するタイプの装置、「サンプルの流出（ｓａｍｐｌ ｅ ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）」構成を使用する装置、又はサンプルの封じ込 めを使用する装置など、広範の装置を使用することが可能である。サンプルの封 じ込め装置は、本発明の方法を実行するのに好ましく、より好ましい装置は、キ ャピラリー充填装置、特に、蛍光キャピラリー装置、例えば、欧州特許公開第１ ７１，１４８号、国際公開第９０／１２５９０号、又は国際特許出願第ＰＣＴ／ ＧＢ９５／０２２３６号（アプライド・リサーチ・システムズ、ＡＲＳ Ｈｏｌ ｄｉｎｇ ＮＶ）に記載されているようなタイプの装置が好ましい。このような キャピラリー充填装置は、単独で、又は国際公開第９０／１８３０号に記載され ているような適切なホルダー中で使用することができる。 本発明の、未知のサンプルを測定する方法の実施においては、第一に、既知の 濃度の検体を含む一連の溶液を使用して、機器を較正する必要がある（すなわち 、上記の工程（ａ））。この工程に採用されるプロトコルは、操作者によって適 宜選択され、本発明の範囲を制限することを意図しない。このような、操作者に より決定される変数は、典型的には３以上である標準の数（ｘとして上述）、装 置の数、読取りの数、読取りの間の時間間隔、及び較正が実施される全体の期間 を含む。 装置を特定の標準で充填した後、検体に依存するパラメーターの測定（より一 般的にはＰｘとして上述）は、毎５秒のような、適する長さである一定の間隔で 行われる。この方法は、さらなる装置で任意に繰り返され、全ての標準検体につ いての各時点（ｔｘとして上述）での反応データを生じる。従って、各時点ｔｘ において、（適切な時刻ｔｘにおける）Ｃｘに対するＰｘの標準曲線を作成する ことが可能である。一つの態様においては、（Ｐｘ，Ｃｘ）データは、最小二乗 法のようないずれかの従来のフィッティング法を使用して、ｎ個のパラメーター ロジスティック等式、又は適するアルゴリズムのような標準等式へ適合され 得る。 本発明の方法の工程（ｂ）においては、未知の検体に依存するパラメーター（ Ｐｎとして上述）は、いずれかの時点（ｔｎとして上述）において測定され、そ の時点における標準曲線から内挿することによって、濃度（Ｐｘ，Ｃｘ）を決定 するために使用され得る。適当な平滑化用（スムージング）ソフトウェアは、サ ンプル中の検体の濃度の見積りの正確さを改良するために使用することができる 。典型的には、この段階で得られる（ｔｎ，Ｃｎ）データを操作して、例えば、 図２に示された例のような時間に対する濃度のプロファイルをもたらす。 先に強調したように、本発明の方法は、動的方法であり、工程（ｂ）において 、読取りの間隔は、操作者が決め、典型的には６０秒未満、とりわけ３０秒未満 、特に１０秒未満、及びより特に５秒以下の長さである。 実際には、本発明の方法の工程（ａ）から得られる較正データは、各バッチの 試薬について製造者によって準備され、一連の標準動的曲線として提供されるこ とが考えられる。次に、これらの曲線を、各バッチの試薬のソフトウェア、バー コード又は磁気ストリップのような、機械での読取りが可能な暗号化されたデー タを保存するための簡便な方法により、消費者へ供給することができる。従って 、例えば、未知のサンプルを操作する場合、適当な装置は、そのソフトウェア内 に較正曲線を有し、これを、テストに供されているサンプル中の検体の濃度を算 出するために「自動照合表」として使用するであろう。 従って、さらなる観点において、本発明は、上記のような工程（ａ）及びさら に、任意に、（時刻ｔｘに適する）標準等式に（Ｐｘ，Ｃｘ）データを適合させ ることを含むアッセイ法を較正する方法を提供する。先に定義された較正データ Ｐｘ，ｔｘ，Ｃｘを含み、未知の検体を定量的に測定するための読取装置へ組み 込まれる、機械で読取り可能な暗号化されたデータを保存する手段とともに、ア ッセイ装置を含むキットは、本発明のさらなる観点を形成する。 近年、著しい開発が行われた技術分野の一つは、いわゆる「ポイント−オブ− ケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）」アッセイ系である。これらは、非常に正 確で、感度がよく、かつ迅速なアッセイ法により、患者の側でテストを行うこと を可能にした。したがって、本発明は、記述した利点を有するので、かかる技術 に用い得ることは明らかである。 本発明の方法は、特に、抗原又は抗体のアッセイ、すなわち、イムノアッセイ に適用され、本発明の態様の一つにおいて、アッセイにおけるリガンドは、抗原 であり、特定の結合パートナーは、前記の抗原に対する抗体を含む。しかし、上 記のように、本発明は、抗原又は抗体のアッセイに限定されるものではない。本 発明の改良されたアッセイ法によってアッセイされ得るリガンドの例を、各場合 における適する特異的結合パートナーの表示とともに、以下の表１に示す。 表１ リガンド 特異的結合パートナー 抗原 特異的抗体 抗体 抗原 ホルモン ホルモン受容体 ホルモン受容体 ホルモン ポリヌクレオチドストランド 相補的ポリヌクレオチドストランド アビジン ビオチン ビオチン アビジン タンパクＡ 免疫グロブリン 免疫グロブリン タンパクＡ 酵素 酵素補因子 （基質）又は阻害剤 酵素補因子 酵素 （基質）又は阻害剤 レクチン 特異的炭水化物 レクチンの特異的炭水化物 レクチン 本発明の方法は、非常に広範な適用を有するが、特に、以下のためのアッセイ に使用され得る：ペプチドホルモン（例えば、甲状腺刺激ホルモン （ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インシュリン及びプロラクチン）又は非ペプ チドホルモン（例えば、コルチゾール、エストラジオール、プロゲステロン、及 びテストステロンのようなステロイドホルモン、又は、チロキシン（Ｔ４）及び トリヨードチロニンのような甲状腺ホルモン）を含むホルモン、タンパク（例え ば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及び抗体、α−フェトプロテイン（ＡＦＴ）及び前 立腺特異的抗体（ＰＳＡ））、薬物（例えば、ジゴキシン、薬物乱用）、糖類、 毒素、ビタミン、インフルエンザ、パラ−インフルエンザ、アデノ−インフルエ ンザ、肝炎、呼吸器ウィルス及びエイズ（ＡＩＤＳ）ウィルスのようなウィルス 、ウィルス様分子又は微生物。 本明細書で使用される「抗体」という語は、以下の範囲内で含むと理解され得 る。 （ａ）従来より使用されているいずれかの動物、例えば、ヒツジ、ウサギ、ヤギ 、又はマウスに由来する免疫グロブリンの種々のクラス又はサブクラス、例えば 、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥのいずれか、 （ｂ）モノクローナル抗体、 （ｃ）抗体（モノクローナル又はポリクローナル）の完全な分子又は「フラグメ ント」であって、フラグメントは、抗体の結合領域、すなわち、Ｆｃ部分が欠け ているフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂）であって、 合成法によって得られる完全な抗体又はフラグメント中の重鎖成分を結合するジ スルフィド結合の還元分裂によって得られる、いわゆる「半分子」フラグメント 、（ｄ）「ヒト化された抗体」を含む、組換えＤＮＡ技術によって製造又は修飾 された抗体。 抗体フラグメントの製造方法は、当技術分野に周知であり、本明細書には記載 しない。 本明細書で使用される「抗原」という語は、完全抗原性種（例えば、タンパク 質、ペプチド、バクテリア、バクテリアのフラグメント、細胞、細胞フラグメン ト、及びウィルス）及び適する条件下で抗原性になり得るハプテンの両方を含む と理解され得る。 本発明の方法は、例えば、尿、血清を基にしたサンプル及び全血サンプル、水 サンプル及びミルクサンプルのような食品サンプルなど、通常の範囲のサンプル 、及び、例えば、とりわけ直接抗原アッセイ、競合抗原アッセイ、直接抗体アッ セイ、サンドイッチ抗体アッセイ、結合抗体アッセイ、競合抗体アッセイなどを 含む、競合又はサンドイッチアッセイのような既知の範囲のアッセイのタイプに 適用される。 本発明の方法の範囲内のアッセイ装置の詳細な調製、及びデータを回収するの に使用されるアッセイ法は、当業者に熟知されている。 本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これに限定されるもの ではない。実施例 実施例Ａ １．出発物質の調製 １．１ 抗体で被覆された光学導波管の作成 抗ＰＳＡモノクローナル抗体は、コインシンス（Ｃｏｉｎｓｉｎｓ、スイス） のセロノ・ダイアグノスティック・ＳＡから供給された。約１ｍｍの厚さを有す る、パーマブロック（Ｐｅｒｍａｂｌｏｃ）グラス（セント・ヘレンズ（英国） のピルキングトン・グラス・リミテッド（Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎ Ｇｌａｓｓ Ｌｔｄ．）のシートを、超高純度水において、洗浄剤（例えば、トゥイーン（Ｔ ｗｅｅｎ）２０）で、超音波撹拌をして洗浄した。ガラスの表面を、アミノプロ ピルトリメトキシシランの２％水溶液（ｐＨ３乃至４）で、７５℃で２時間イン キュベーションすることによって活性化させた。水ですすいだ後、ガラスシート を１１５℃において少なくとも４時間乾燥させた。次にガラスを、０．０５Ｍリ ン酸緩衝液（ｐＨ７）中の２．５％グルタルアルデヒド溶液において６０分間イ ンキュベートし、次に蒸留水で完全に洗浄した。リン酸緩衝液（ｐＨ７）中の１ ％の抗体溶液をガラスの上に分離して乗せることにより、抗ＰＳＡ抗体をガラス の上にかたどり、２乃至４時間インキュベートして、緩衝溶液でガラスシートを 洗浄した。除去すべき吸着されたタンパク質は、周知の方法 で、６Ｍの尿素溶液に浸すことによって取り除いた。最終的に、ショ糖／乳糖の 層を、ガラスシートの表面にスピンコーティングによって形成した。これは、Ｆ ＣＦＤテスト装置のプレート４を形成した。 １．２ アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）と抱合された ＰＳＡの調製 第二の抗ＰＳＡモノクローナル抗体（上記の１．１で使用されたものとは異な るＰＳＡ分子上のエピトープを認識する）を、オレゴン州ユージン（Ｅｕｇｅｎ ｅ）（米国）のモレキュラー・プローブス・インク（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ ｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）のアロフィコシアニン（λｅｘ＝６５０ｎｍ、λｅｍ＝６ ６０ｎｍ）と抱合させ、供給されたまま使用した。 １．３ 抗ＰＳＡ抗体の分離帯を覆う特異性試薬の微量添加（マイクロドージン グ、ｍｉｃｒｏｄｏｓｉｎｇ） 英国特許出願第８９１１４６２．３号に記載されているように、不透明なコー ティングを、清浄なパーマブロック・ガラス・シートにスクリーン印刷した。装 置の測定帯は、帯を覆ってガラス上の３×７ｍｍの領域に、ポリビニルアルコー ルを含む緩衝液中に懸濁された抗ＰＳＡ／アロフィコシアニン抗体抱合体の層を 微量添加することによって製造された。抱合体を空気乾燥した後、ポリビニルア ルコール（緩衝液中４％）の層を抱合体を覆って微量添加した。最終的に、ガラ ス・シート全体は、スプレー・コーティングによってショ糖／乳糖の層で覆われ た。これは、ＦＣＦＤテスト装置のプレート２を形成する。 １．４ ＦＣＦＤテスト装置の製造 英国特許公開第０，１７１，１４８号に記載されているようなＦＤＦＣテスト 装置を、上記の１．１で得られた導波管上にスクリーン印刷することによって製 造し、キャピラリーセル装置の長い末端を定義する格子中に、直径１００μｍの ガラスの微小球（ｍｉｓｒｏｓｐｈｅｒｅ）（英国のジェンコンス・リミテッド （Ｊｅｎｃｏｎｓ Ｌｔｄ．））を含む紫外線で硬化される接着剤 （ＵＶＳ９１、米国のノーランド・インク（Ｎｏｒｌａｎｄ Ｉｎｃ．））の軌 跡を結合した。次に、上記１．３に定義されたガラスのシートを、導波管を覆っ て配置し、真空を積層物へ適用した。真空の結果として、ガラス・シートの上部 は、接着剤の上に圧迫され、ガラスの微小球のためにガラス・シートの間隔が１ ００μｍとなった。次に積層物を紫外光線に晒して、接着剤を硬化させた。最終 的に、欧州特許公開第０，１７１，１４８号に記載されているように、積層物を 個々のテスト装置用に分割した。 １．５ ＰＳＡアッセイの測定で使用される装置 簡素な蛍光測定装置は、連続光線源（アロフィコシアニンの蛍光を励起するの に適する波長で光を放出する発光ダイオードによってもたらされる）及び光電子 倍増管（ＰＭＴ）を含む。ＦＣＦＤの光学末端から発生する光は、ポンピングさ れた迷光を除去するために濾過され、結合した蛍光を読み取るために要求された 離れた角度の範囲を、開口を通してＰＭＴの上に光の焦点を当てることによって 測定する。 ２．ＰＳＡのアッセイ法 検体濃度を示す信号を、以下の方法によるＦＣＦＤ装置から得た。アッセイす るサンプルを含む装置に、テスト試薬内に含まれる蛍光体を刺激するのに適した 光を大量に照らした。この投入光は連続し、その強度は要求される各測定時刻に おいて繰り返し可能である。 未知のサンプルの濃度を見積もるに当たって、まず、既知の濃度の検体を含む 一連の溶液を使用して機器を較正することが必要である。ここに提供されたデー タとして、７つの標準濃度を使用した。各濃度は、二重の装置で測定された。装 置を特定の標準濃度で充填した後、蛍光のレベルの測定を、一定の間隔（存在す るデータについて５秒毎に）で行った。このようにして、反応の動的変化は、第 １図に示したようにモニターすることができた。測定は、２０分間にわたって行 った。全ての装置に関する動的測定を完了した後、全ての特定の標準検体濃度へ の対応に関して、データが使用可能であった（全ての時点において）。したがっ て、各時点に対応する「標準曲線」をつくることができた。このデータでは、使 用した標準等式が従来の最小二乗法で適合させた、４つのパラメーター理論であ った。 この較正法の次に、未知の濃度のサンプルを、同じ動的様式において処理した 。各時点での蛍光レベルを標準曲線に内挿することによって、濃度レベルを確か めることができた。適切な標準曲線から内挿されたアッセイ時刻における測定量 の依存性の結果を、図２に示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年６月１５日（１９９８．６．１５） 【補正内容】 から単純に読み取られ得る。このような技法は、アッセイが、任意に決定される 平衡に達するようにし、その時点で信号の測定を行わなければならないという欠 点を有する。平衡に到達する速度は、非常に遅いことがあり、これ自体、測定条 件（例えば、温度、粘度）により大いに影響を受ける信号の変化速度の測定値に エラーを生じさせる。このような系においては、リガンド濃度の迅速で正確な測 定を得ることが不可能であることは明らかである。 動的測定は、欧州特許公開第６６７，５２８号（ダイキン・インダストリー・ リミテッド（Ｄａｉｋｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔｅｄ））に開示 されているように、イムノアッセイにおいて未知の濃度を測定するためにも使用 されている。しかし、このようなアッセイは、未知の濃度を連続してモニターす ることを含まない。 他のアッセイ系においては、例えば、欧州特許公開第１８４，６００号（バッ テレ・メモリアル・インダストリー（Ｂａｔｔｅｌｌｅ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉ ｎｓｔｉｔｕｔｅ））に開示されているように動的測定がなされ得るが、この点 において一つの最終的な測定を使用するのであって、サンプル中の未知の濃度を 測定するためには使用されていない。 本発明は、アッセイ法において、アッセイ系の成分が直接又は間接的に固体表 面に結合するか、又は吸着する過程の間、前記結合又は吸着成分の信頼性のある （すなわち、溶液中の遊離成分から妨害されない）測定が、前記成分の直接及び 連続したモニタリングによって得られるという発見に基づく。 本発明の方法は、直接法及び間接法の両方のアッセイ系に関し、アッセイ系の 成分が固体表面に結合することを含むことのみが要求されることを強調しなけれ ばならない。直接アッセイ法は、前記光学構造及び／又は発生された信号の光学 特性が、前記光学構造に結合するリガンドと特異性結合パラメーターとの生化学 的複合体（例えば、抗原／抗体複合体）によりどの程度（又はどのような速度で ）変化するかを決定するために、典型的には、発光した固体光学構造（例えば、 導波管）内での反射及び／又は発生した信号をモニターすることを含むことがで き る。直接アッセイ法は、典型的には、アッセイに存在する一つ以上の成分と結合 し、直接又は間接的に固体へ結合する標識（例えば、蛍光体）をモニターするこ とを含むことができる。このような方法は、例えば、とりわけ国際公開第 アッセイ法を提供する。一つの態様においては、検体に依存するパラメーターは 、検体に依存する光学的パラメーター（すなわち、測定可能な光学的特性又は効 果）であるが、電気化学又は圧電性の特性／効果に関するパラメーターも使用で きる。 さらなる態様において、本発明の使用又は方法は、較正の目的のために既知の 濃度の検体に適用できる。 特に好ましい態様においては、前記方法は、以下の工程を含む： （ａ）インキュベーションの開始後、複数の時点（ｔｙ）において、各サンプ ルについて独立して検体に依存するパラメーターの値（Ｐｚ）を連続的に測定す ることによって、各々既知の検体濃度（Ｃａ）であるｘ個のサンプルのためのア ッセイ系を較正する工程、 （ｂ）未知の濃度の検体（Ｃｂ）のために、インキュベーションの開始後、各 時点ｔｅにおいて、検体に依存するパラメーターの独立するｎ個の値（Ｐｄ）を 連続的に測定する工程、及び （ｃ）時点ｔｅにおける検体の未知の濃度（Ｃｂ）を計算するために、工程（ ｂ）のデータ（Ｐｄ，ｔｅ）を、工程（ａ）の較正データ（Ｐｚ，ｔｙ，Ｃａ） と組み合わせる工程。 上記の検体に依存するパラメーターは、便利なことに、適用される放射線（ラ ジエーション）と関連する結合アッセイ成分との間の相互作用に関するどのパラ メーターであってもよく、光吸収、散乱、蛍光の放出、燐光の放出、ルミネセン スの放出（化学ルミネセンス、生物ルミネセンス、及び電気化学ルミネセンスを 含む）又は着色放出特性を含むが、これらに限定されない。また、この用語（検 体に依存するパラメーター）は、結合した成分が有し得る、例えば、光学表面の 屈折率、又は透過性、光学固体内の全内反射又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ） 、又は固体表面での消失性波との相互作用に関する、測定可能な効果を包含する ことを意図する。このような検体に依存する光学パラメーターの測定、又は上記 の効果の処理のための装置及び技術は、当技術分野に周知である。 り決定される変数は、典型的には３以上である標準の数（ｘとして上述）、装置 の数、読取りの数、読取りの間の時間間隔、及び較正が実施される全体の期間を 含む。 装置を特定の標準で充填した後、検体に依存するパラメーターの測定（より一 般的にはＰｚとして上述）は、毎５秒のような、適する長さである一定の間隔で 行われる。この方法は、さらなる装置で任意に繰り返され、全ての標準検体につ いての各時点（ｔｙとして上述）での反応データを生じる。従って、各時点ｔｙ において、（適切な時刻ｔｙにおける）Ｃａに対するＰｚの標準曲線を作成する ことが可能である。一つの態様においては、（Ｐｚ，Ｃａ）データは、最小二乗 法のようないずれかの従来のフィッティング法を使用して、ｎ個のパラメーター ロジスティック等式、又は適するアルゴリズムのような標準等式へ適合され得る 。 本発明の方法の工程（ｂ）においては、未知の検体に依存するパラメーター（ Ｐｄとして上述）は、いずれかの時点（ｔｅとして上述）において測定され、そ の時点における標準曲線から内挿することによって、濃度（Ｐｚ，Ｃａ）を決定 するために使用され得る。適当な平滑化用（スムージング）ソフトウェアは、サ ンプル中の検体の濃度の見積りの正確さを改良するために使用することができる 。典型的には、この段階で得られる（ｔｅ，Ｃｂ）データを操作して、例えば、 図２に示された例のような時間に対する濃度のプロファイルをもたらす。 先に強調したように、本発明の方法は、動的方法であり、工程（ｂ）において 、読取りの間隔は、操作者が決め、典型的には６０秒未満、とりわけ３０秒未満 、特に１０秒未満、及びより特に５秒以下の長さである。 とが考えられる。次に、これらの曲線を、各バッチの試薬のソフトウェア、バー コード又は磁気ストリップのような、機械での読取りが可能な暗号化されたデー タを保存するための簡便な方法により、消費者へ供給することができる。従って 、例えば、未知のサンプルを操作する場合、適当な装置は、そのソフトウェア内 に較正曲線を有し、これを、テストに供されているサンプル中の検体の濃度を算 出するために「自動照合表」として使用するであろう。 従って、さらなる観点において、本発明は、上記のような工程（ａ）及びさら に、任意に、（時刻ｔｙに適する）標準等式に（Ｐｚ，Ｃａ）データを適合させ ることを含むアッセイ法を較正する方法を提供する。先に定義された較正データ Ｐｚ，ｔｙ，Ｃａを含み、未知の検体を定量的に測定するための読取装置へ組み 込まれる、機械で読取り可能な暗号化されたデータを保存する手段とともに、ア ッセイ装置を含むキットは、本発明のさらなる観点を形成する。 近年、著しい開発が行われた技術分野の一つは、いわゆる「ポイント−オブ− ケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）」アッセイ系である。これらは、非常に正 確で、感度がよく、かつ迅速なアッセイ法により、患者の側でテストを行うこと を可能にした。したがって、本発明は、記述した利点を有するので、かかる技術 に用い得ることは明らかである。 本発明の方法は、特に、抗原又は抗体のアッセイ、すなわち、イムノアッセイ に適用され、本発明の態様の一つにおいて、アッセイにおけるリガンドは、抗原 であり、特定の結合パートナーは、前記の抗原に対する抗体を含む。しかし、上 記のように、本発明は、抗原又は抗体のアッセイに限定されるものではない。本 請求の範囲 １．少なくとも部分的に固体に成分が結合するアッセイの方法であって、前記成 分に関する検体に依存するパラメーターが、直接及び連続的に測定されること、 前記測定された検体に依存するパラメーターを処理して未知のサンプルを定量す ること、及び、測定結果を連続的にモニターすることを特徴とする方法。 ２．前記固体が光学導波管である、請求項１の方法。 ３．前記検体に依存するパラメーターが、光学的パラメーターである、請求項１ 又は２の方法。 ４．前記光学的パラメーターが、蛍光の放出である、請求項１乃至３のいずれか １請求項の方法。 ５．前記固体が、サンプルの封じ込め装置の形である、請求項１乃至４のいずれ か１請求項の方法。 ６．前記装置が、キャピラリー充填装置である、請求項５の方法。 ７．請求項１乃至６のいずれか１請求項に記載された方法であって、以下の工程 、 （ａ）インキュベーション開始後、複数の時点（ｔｙ）において、各サンプルを 独立して検体に依存するパラメーターの値（Ｐｚ）を連続的に測定することによ って、各々の検体が既知濃度（Ｃａ）であるｘ個のサンプルのためのアッセイ系 を較正する工程、 （ｂ）未知の検体濃度（Ｃｂ）のために、インキュベーションの開始後各時刻ｔ ｅにおいて、検体に依存するパラメーターの独立するｎ個の値（Ｐｄ）を連続的 に測定する工程、 （ｃ）時点ｔｎにおける未知の検体濃度（Ｃｂ）を計算するために、工程（ｂ） のデータ（Ｐｄ，ｔｅ）を、工程（ａ）の較正データ（Ｐｚ，ｔｙ，Ｃａ）と組 み合わせる工程、 を含む方法。 ８．各々既知の検体濃度（Ｃａ）のＸ個のサンプルのためのアッセイ法を較正す る方法であって、以下の工程、 （ａ）インキュベーション開始後複数の時点（ｔｙ）において、各サンプルを独 立して検体に依存するパラメーターの値（Ｐｚ）を連続的に測定する工程、及び 任意に、 （ｂ）較正データを標準等式へ適合させる工程、 を含む方法。 ９．さらに、前記較正データを機械で読み取り可能な暗号化されたデータに保存 する手段で保存する工程を含む、請求項８の方法。 １０．請求項７の較正データＰｚ，Ｃａ，ｔｙを含み、未知の検体を定量する目 的のための読取り装置と組み合わせ可能である、機械で読み取り可能な暗号化さ れたデータに保存する装置とともにアッセイ装置を含む、キット。 １１．データ保存装置が、装置上に記されたバーコードを含むことを特徴とする 、請求項１０のキット。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも部分的に固体に成分が結合するアッセイの方法であって、前記成 分に関する検体に依存するパラメーターが、直接及び連続的に測定されること、 及び、前記測定された検体に依存するパラメーターを処理して未知のサンプルを 定量することを特徴とする方法。 ２．前記固体が光学導波管である、請求項１の方法。 ３．前記検体に依存するパラメーターが、光学的パラメーターである、請求項１ 又は２の方法。 ４．前記光学的パラメーターが、蛍光の放出である、請求項１乃至３のいずれか １請求項の方法。 ５．前記固体が、サンプルの封じ込め装置の形である、請求項１乃至４のいずれ か１請求項の方法。 ６．前記装置が、キャピラリー充填装置である、請求項５の方法。 ７．請求項１乃至６のいずれか１請求項に記載された方法であって、以下の工程 、 （ａ）インキュベーション開始後、複数の時点（ｔｘ）において、各サンプルを 独立して検体に依存するパラメーターの値（Ｐｘ）を連続的に測定することによ って、各々の検体が既知濃度（Ｃｘ）であるｘ個のサンプルのためのアッセイ系 を較正する工程、 （ｂ）未知の検体濃度（Ｃｎ）のために、インキュベーションの開始後各時刻ｔ ｎにおいて、検体に依存するパラメーターの独立するｎ個の値（Ｐｎ）を連続的 に測定する工程、 （ｃ）時点ｔｎにおける未知の検体濃度（Ｃｎ）を計算するために、工程（ｂ） のデータ（Ｐｎ，ｔｎ）を、工程（ａ）の較正データ（Ｐｘ，ｔｘ，Ｃｘ）と組 み合わせる工程、 を含む方法。 ８．アッセイ法での未知のサンプルを定量するための動的測定の使用であって、 その成分は、少なくとも部分的に固体表面に結合する、動的測定の使用。 ９．前記固体表面が光学導波管である、請求項８の使用。 １０．前記固体が、サンプルの封じ込め装置の形である、請求項８又は９の使用 。 １１．前記装置が、キャピラリー充填装置である、請求項１０の使用。 １２．各々既知の検体濃度（Ｃｘ）のＸ個のサンプルのためのアッセイ法を較正 する方法であって、以下の工程、 （ａ）インキュベーション開始後複数の時点（ｔｘ）において、各サンプルを独 立して検体に依存するパラメーターの値（Ｐｘ）を連続的に測定する工程、及び 任意に、 （ｂ）較正データを標準等式へ適合させる工程、 を含む方法。 １３．さらに、前記較正データを機械で読み取り可能な暗号化されたデータに保 存する手段で保存する工程を含む、請求項１２の方法。 １４．請求項７の較正データＰｘ，ｔｘ，Ｃｘを含み、未知の検体を定量する目 的のための読取り装置と組み合わせ可能である、機械で読み取り可能な暗号化さ れたデータに保存する装置とともにアッセイ装置を含む、キット。 １５．データ保存装置が、装置上に記されたバーコードを含むことを特徴とする 、請求項１４のキット。