JP2000513945A

JP2000513945A - プロセスにおける使用のためにアポリポタンパク質および組成物を精製するためのプロセス

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Publication number: JP2000513945A
Application number: JP10513556A
Authority: JP
Inventors: アーゲランド，ハンス; ニューストローム，レーナ; パーション，ヨセフィーン; シャーネルド，フォルケ
Original assignee: エスペリオンセラピューティクスインコーポレイテッド
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1997-09-08
Publication date: 2000-10-24
Also published as: EP0942935A1; WO1998011140A1; CA2277199A1; AU4142997A

Abstract

(57)【要約】本発明は、アポリポタンパク質Ａ（Apo A）またはアポリポタンパク質Ｅ（ApoE）の精製における使用のための組成物であって、この組成物が、第一の重合性物質および第二の重合性物質を含み、第一の重合性物質および第二の重合性物質が一次水性溶液に混和性でなく、そして第二の重合性物質が両親媒性かつ水溶性である、組成物に関する。本発明はさらに、Apo AまたはApo E、第一の重合性物質および第二の重合性物質を含有する組成物、および水をまず混合することによって、Apo AまたはApo E、あるいはそれらの改変体または混合物を精製するためのプロセスに関する。得られた一次水性溶液を、形成された相を本質的に分離するために十分な時間、維持し、第二の重合性物質とApo AまたはApo Eの大部分とを含有する相を取り出す。続いて、第二の重合性物質をApo AまたはApo Eから分離する。このように生成されたApo AまたはApo Eは、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患、敗血症、または末梢アテローム性動脈硬化症の処置における医薬品の製造のため、ならびに治療的有効量で投与された場合のアテローム性動脈硬化症および心血管疾患、敗血症、または末梢アテローム性動脈硬化症の処置のためのプロセスにおいて用いられ得る。

Description

【発明の詳細な説明】プロセスにおける使用のためにアポリポタンパク質および組成物を精製するためのプロセス発明の分野本発明は、血漿における高密度リポタンパク質および低密度リポタンパク質の重要な成分である、アポリポタンパク質Ａまたはアポリポタンパク質Ｅを精製するための組成物およびプロセスに関する。より詳細には、本発明は、プロセスにおける使用のための第１の重合性物質および第２の重合性物質を含む組成物に関し、このプロセスは、一次水性２相分離工程、続いてApoAまたはApoEに対して選択性を示す第２の重合性物質からのApoAまたはApoEの分離を含む。発明の背景血漿におけるリポタンパク質の主な機能は、脂質（例えば、コレステロールおよびトリグリセリド）を輸送することである。血漿における輸送のために、コレステロール（通常、コレステリルルエステルとして）およびトリグリセリドは、リポタンパク質粒子中に含まれ、ここで、それらは疎水性コアを形成する。コアは、リン脂質、非エステル化コレステロール、およびアポリポタンパク質と呼ばれるタンパク質を含む表面コートによって囲まれる。後者は脂質輸送を担い、そしてさらに、いくつかは脂質代謝に関与する多くの酵素と相互作用し得る。今日まで、少なくとも９つのアポリポタンパク質が同定されている：A-I、A-II、A-I V、Ｂ、C-I、C-II、C-III、Ｄ、およびＥ。リポタンパク質の４つの主なクラスが存在する：カイロミクロン（CM）、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、および高密度リポタンパク質(HDL)。もちろん、HDLは、末梢組織からのコレステロールの除去に直接的に関与する。これは、「逆コレステロール輸送」（RCT）として公知の機構によって、肝臓または他のリポタンパク質のいずれかへコレステロールを運び返す。 HDLの「保護的」役割が、多くの研究で確認されている。HDLの保護的機構に関する最近の研究は、HDLの主な成分である、アポリポタンパク質A-I（ApoA-I）に集中している。ApoA-Iの高血漿レベルは、CHDの低減した危険性および冠性動脈病変の存在と関連する。アポリポタンパク質A-IMilano（ApoA-IM）は、ヒトApoA-Iの最初に記載された分子変異体である（Franceschiniら（1980）J．Clin．Invest．66:892-900）。それは、Arg173のCys173との置換によって特徴づけられる（Weisgraberら（1983 ）J．Blol.Chem．258:2508-2513）。変異アポリポタンパク質は、常染色体優性形質として子孫へ伝えられ、そしてキャリアの８つの世代が同定されている（Gu alandriら（1984）Am．J．Hum．Genet．37:1083-1097）。ApoA-IMキャリア個体の状態は、HDL-コレステロールレベルの顕著な減少によって特徴づけられる。これにもかかわらず、罹患した被験体は、動脈性疾患のいかなる増大した危険性も明らかに示さない。確かに、系統樹の調査によると、これらの被験体はアテローム性動脈硬化症から「保護」され得るようである。一般に、十分な量のApoA-I（より詳細には、ApoA-IM）を出来る限り産生するために、組換えDNA技術の使用が、例えば、E．coliにおいてなされる。従って、 ApoA-IM、モノマーならびにタイマーの組換え調製物および使用は、W0-A-88/031 66（Farmitalia Carlo Erba（FICE）に譲渡された）、W0-A-90/12879（Sirtori らに譲渡された）、ならびにW0-A-93/12143およびW0-A-94/13819（両方ともPhar macia AB（以前は、Kabi Pharmacia AB）の特許明細書に開示される。 ApoA-IMは、少なくとも６つの主なα-ヘリックスセグメントを含むタンパク質であり、そして極めて高密度な構造を有するタンパク質である。いくつかのα- ヘリックスは、両親媒性であり、一方の表面が疎水性であり、そして他方の表面が親水性である両親媒性タンパク質を生じる（D．Eisenbergら、Nature、第299 巻（1982）371〜374頁）。ApoA-IMおよび他のApoAの両親媒性特性は、水溶液中で他のタンパク質および脂質とミセル構造を形成する傾向がある。アポリポタンパク質Ｅ（ApoE）は、LDLレセプターのリガンドである。結果として、ApoEは、コレステロール代謝において重要な役割を果たす。さらに、ApoE は、カイロミクロンレムナントの肝臓クリアランスに関与する。血漿からのApoAおよびApoE、または組換えDNA技術によって生成されたApoAおよびApoEのいずれかを精製するためのいくつかの方法が提案されきた。実験室スケールにおいて、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル濾過、および高速液体クロマトグラフイー（HPLC）の使用が通常なされる（Methods in Enzymology、128巻、Academic Press，San Diego，CA，USA(1986)を参照のこと）。しかし、特に工業的スケールまたは試験工場スケールでは、ApoAおよびApoEの精製に適切なさらなる方法の必要性がある。このような方法は、ApoAおよびApoEの全精製を最適化するために利用可能なプロセス技術の数を増大させる。水性２相系は、生物学的物質（例えば、細胞、タンパク質、核酸、およびステロイド）の精製について、生化学および生物工学における使用を普及させた（例えば、P.-Å．Albertsson，Partition of cell particles and macromolecules 、第３版、Wiley，New York City，NY，USA（1986）およびH.Walterら、Partiti oning in Aqueous Two-Phase Systems，Academic Press，Orlando，FL，USA（19 85）を参照のこと）。この系は、生物学的物質に適切である。なぜならば、各相は水の約70重量％〜90重量％を含み、それによって生体分子（例えば、タンパク質）の変性の危険性を実質的に低減するからである（H．Walterら、Aqueous two -phase systems，Methods in Enzymology、228巻、Academic Press，San Diego, CA，USA（1994））。水性２相系は、２つの混合することのできない重合性物質、または高塩濃度で組み合わせた１つの重合性物質から構成される。特定の臨界値を越えて濃度を上昇させることは、２つの混合することのできない水相を生じ、ここで重合性物質（単数または複数）および塩は分配される。水性２相系におけるタンパク質の分配は、主に、タンパク質疎水性、電荷、およびサイズに依存する。分配は、重合性物質の変化、重合性物質の分子量、pH、によって、および系に塩を添加することによって影響され得る（G．Johansson、 Acta Chem．Scand.，B28（1974）873〜882頁）。水性２相系は、容易に拡大され得る。なぜならば、生物学的物質（例えば、タンパク質）の分配は、本質的に、系のサイズに非依存性であるからである。しかし、相分離の時間は、例えば、分離容器の幾何学的条件に依存して大規模な系では延長され得る。実験室規模では、混合することのできない重合性物質として、デキストランおよびポリエチレングリコール（PEG）の使用が、通常、なされる。しかし、デキストランは、相対的に高価な重合性物質であり、大規模な精製（例えば、工業的規模の酵素抽出）のためには、PEGと塩の種々の組み合わせがより頻繁である（K ． A，(1994)，627〜640頁）。 Perstorp ABへのUS-A-4,740,304は、生物学的物質の抽出、精製、濃縮、および／または分離のための２以上の相を有する系における使用のためのヒドロキシアルキルデンプンを含む組成物に関する。１つの好ましい実施態様において、ヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシプロピルデンプン（HPS）である。別の好ましい実施態様において、ヒドロキシアルキルデンプンは、別のポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（PEG）またはポリプロピレングリコール）と組み合わされる。US-A-4,740,304の実施例において、種々の酵素の使用がなされる。しかし、生体分子を精製するための水性２相系の使用は制限される。なぜならば、標的生成物は相系ポリマーで夾雑され、従ってさらなる複雑な精製工程を必要とするからである。従って、今までに、精製されるべき標的生成物は、塩溶液に分配されるか、または相系ポリマーと一緒に溶解したままである。この問題を軽減するために、水性２相系に熱分離重合性物質の使用が導入される。これは、温度誘導相分離を行うことを可能にし、それによって標的生体分子が、極めて効率的な方法で重合性物質から分離され得る。この技術は、種々の酵素を精製するために実験室規模で利用された。従って、温度誘導相分離は、パン酵母ホモジネートから3-ホスホグリセリン酸キナーゼおよびヘキソキナーゼを精製するために使用された。（P.A．Harrisら、Bioseparation、２巻（1991）237〜246頁）。さらに、温度誘導相分離は、２つのエクジステロイドおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを精製するために使用された（それぞれ、P.A．Alredら、J．C hromatogr．628巻（1993）205〜214頁、およびP.A．Alredら、Bioseparation, ２巻（1992）363〜373頁）。P.A．Alredら、J．Chromatogr．A、659巻（1994）2 89〜298頁はまた、パン酵母から、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、および3-ホスホグリセリン酸キナーゼを精製するための温度誘導相分離を開示する。 Union CarbideへのEP-A-262651は、逆転した溶解性特徴を示す少なくとも１つの重合性物質を含む水溶液から酵素を回収するための方法に関する。この方法は、重合性物質の沈澱の温度を越えて溶液の温度を上昇させる工程、および酵素含有溶液から重合性沈澱を分離する工程を包含する。好ましくは、重合性物質は、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール）、ポリ（オキシアルキレン）ポリマーまたはポリ（オキシアルキレン）コポリマー、エトキシル化界面活性剤、シリコーン修飾ポリエーテル、およびポリビニルピロリドンから選択される。温度は、約90℃未満、好ましくは約50℃と約75℃の間の温度まで適切に上昇される。EP-A-262651の実施例において、λ-アミラーゼの使用がなされる。 Wiegelらは、２相系における高密度リポタンパク質（HDL）の分配に関する（J ．Chromatogr．B，661（1994）159〜164頁）。ここで、HDL粒子を分離するためにデキストランおよびPEGの使用がなされる。デキストランリッチでより親水性の下部相におけるHDL粒子の好ましい富化は、デキストラン粒子とHDL粒子を構成する分子（HDLのアポタンパク質）との間の水素結合に起因する。 ApoAおよびApoEの精製について公知のいくつかの方法が現在存在する。しかし、試験的工場および工業的規模でのApoAおよびApoEの調製のための、さらに、迅速で、感度が良く、そして信頼出来る方法の必要性がある。本発明の目的は、このような方法を提供することである。発明の要旨本発明は、アポリポタンパク質Ａ（ApoA）またはアポリポタンパク質Ｅ（ApoE ）の精製における使用のための組成物に関する。この組成物は第１の重合性物質および第２の重合性物質を含む。ここで、第１の重合性物質および第２の重合性物質は、一次水溶液で混合することができず、そしてここで第２の重合性物質は、両親媒性であり、そして水に可溶である。本発明はさらに、ApoAまたはApoE を最初に混合することによって、ApoAもしくはApoE、またはそれらの改変体もしくは混合物を精製するためのプロセスに関し、組成物は、第１の重合性物質および第２の重合性物質ならびに水を含む。得られた一次水溶液は、形成された相を本質的に分離し、そして第２の重合性物質およびApoAまたはApoEの主要な部分を含む相を取り除くに十分な時間維持される。続いて、第２の重合物質は、ApoAまたはApoEから分離される。このように生成されたApoAまたはApoEは、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患、敗血症、または末梢アテローム性動脈硬化症の処置における医薬の製造のために、ならびに治療的有効量で投与される場合、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患、敗血症または末梢アテローム性動脈硬化症の処置ための方法において使用され得る。発明の詳細な説明本発明の目的は、さらなる精製工程の必要性をなくすほど、十分に少ない量の不純物を有するApoAまたはApoEを産生するための、効果的な精製プロセスを提供することである。本発明のさらなる目的は、高収率のApoAまたはApoEを提供するプロセス（すなわち、生成物の最小の損失を伴うプロセス）である。本発明の別の目的は、ApoAまたはApoEの生物学的活性が本質的に保持される、効果的なプロセスを提供することである。上記の目的は本発明によって満たされ、本発明は、アポリポタンパク質Ａ（Ap oA）またはアポリポタンパク質Ｅ（ApoE）、もしくはそれらの改変体または混合物を精製するための一次水性溶液における使用のための組成物に関し、上記組成物は第１および第２の重合性物質を含み、上記第１および第２の重合性物質は一次水性溶液中で混合されず；そして上記第２の重合性物質は両親媒性および水溶性である。本発明はさらにアポリポタンパク質Ａ（ApoA）もしくはアポリポタンパク質Ｅ（ApoE）、またはそれらの改変体もしくは混合物を、任意の順序で、ApoAまたは ApoE、本発明の組成物および水を混合し、得られた一次水性溶液を、形成した相を本質的に分離するのに十分な期間維持し、第２の重合性物質およびApoAまたは ApoEの主要部分を含む相を取り出し、そしてその後、第２の重合性物質をApoAまたはApoEから分離することにより精製するプロセスに関する。本発明の好ましい実施態様は、アポリポタンパク質Ａ（ApoA）もしくはアポリポタンパク質Ｅ（ApoE）、またはそれらの改変体もしくは混合物を、ApoAまたは ApoEを水ならびに第１および第２の重合性物質（第２の重合性物質はApoAまたは ApoEの基準および逆転した溶解性の特徴を示す）と混和しそして得られた一次水性溶液を、形成された相を本質的に分離する時間の期間維持し、そして第２の重合性物質およびApoAまたはApoEの主要部分を含む相を除去することによって精製するプロセスに関する。続いて、ApoAまたはApoEは、除去した相をある温度（Ap oAまたはApoEの分解が起こる温度の下であるが、第２の重合性物質を沈澱させるために、第２の重合性物質の曇り点よりも上）まで加熱し、そしてその後ApoAまたはApoEを含む相から沈澱した第２の重合性物質を含む相を分離することにより第２の重合性物質から分離される。水性二相分離、続いてApoAまたはApoEからの第２の重合性物質の分離は、ApoA およびApoEを精製するための別の広がりを提供する。なぜなら、さらなる分離基準が、既に使用された基準と比較して利用されるからである。従って、非常に驚いたことに、かなりの量の不純物は、一次二相分離工程において沈澱するが、Ap oAまたはApoEは本質的に溶解状態で残存する。特に、本発明の発明者らは、水性二相分離が、温度誘導相分離との組み合わせで、AopAおよびApoEのようなリポタンパク質を精製するために効率的に使用され得ることを見い出した。本発明はまた、アポリポタンパク質Ａ（ApoA）もしくはアポリポタンパク質Ｅ（ApoE）、またはそれらの改変体もしくは混合物を、一次水性溶液中で精製するための組成物の使用に関し、ここで、この組成物は第１および第２の重合性物質を含み、この第１および第２の重合性物質は一次水性溶液中で混合できず、そしてこの第２の重合性物質は両親媒性および水溶解性である。本発明は、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患、敗血症または末梢性動脈硬化症の処置における、ApoAまたはApoEを含む医薬品の製造のための本発明のプロセスにより生成されたApoAまたはApoEの使用にさらに関する。本発明は、本発明のプロセスによって生成されたAopAまたはApoEを治療的有効量で投与することによる、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患、敗血症または末梢性動脈硬化症の処置の方法にさらに関する。一次水性二相分離において使用される２つの重合性物質は、混合されてははらない。それゆえ、一方の重合性物質は本質的に親水性であり、そして他方はより疎水性であるがなお水溶性（すなわち、両親媒性）であるべきである。また、第１および第２の重合性物質の濃度は、少なくとも２つの相に相分離をもたらすのに十分に高いべきである。本発明における使用に適する親水性の第１の重合性物質の例には、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、デンプン、デキストラン、プルラン、ならびにそれらの誘導体および混合物が挙げられる。プルランは、水性二相系中の酵素の精製について以前に使用された微生物ポリサッカライドである（Nguyenら、Appl.Microbiol.Biotethnol．第27巻（1 988）341-346頁）。ヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシメチルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、およびヒドロキシブチルデンプン、ならびにそれらの混合物からなる群から適切に選択される。親水性の第１の重合性物質の分子量は、約10,000〜約5,000,000Daの範囲、適切には40,000〜5000,000Daの範囲、そして好ましくは100,000〜300,000Daの範囲であり得る。本発明における使用に適切なヒドロキシアルキルデンプンの特定の例には、Reppal PES 100およびReppal PES 200が挙げられ、これらは両方とも、Carb amyl AB of Kristianstad、スウェーデンにより販売されるヒドロキシプロピルデンプンである。Reppal PES 100およびReppal PES 200の平均分子量は、それぞれ100,000Daおよび200,000Daである。前の段落に記載されるように、第２の重合性物質は両親媒性および水溶性であるべきである。本発明において、両親媒性の第２の重合性物質は、標的タンパク質ApoAまたはApoEと相互作用するべきである。このようにして、ApoAまたはApoE は、より疎水性の相に抽出され、それにより、血漿、および組換えDNAプロセスからの粗精製または部分精製された溶液/細胞培地中で通常遭遇する、大きなタンパク質のようなより親水性の夾雑物から分離される。このような夾雑物の例は、E．coli.からのタンパク質である。本願中の実施例１に開示される実験において、両親媒性コポリマーは、主に上の相に分配された。それゆえ、これらの実験において、ApoAまたはApoEの主要部分はコポリマーリッチの上の相に分配された。本発明において、第２の重合性物質は、好ましくは逆転した溶解性を示す。用語「逆転した溶解性」は、重合性物質の溶解性が溶液の温度とともに逆転的に変化することを意味する。これは、重合性物質の溶解性が、溶液温度の上昇とともに減少することを意味する。それゆえ、逆転した溶解性は、ほとんどの溶質により示される温度効果と直接的に反対である。３つ以上の重合性物質を含む組成物はまた、本発明の範囲内である。従って、多相分離は、一次水性溶液における３つ以上の重合性物質と十分に高い濃度のそれらとの適切な組み合わせを選択することによって得られ得る。重合性物質は、 ApoAまたはApoEの溶解性が、一方のポリマー相において、他方のポリマー相よりも非常に高いように選択されるべきである。本発明において、用語「一次水性溶液」は、他に言及されなければ、少なくとも二相に分離する前の最初の分離工程に関する。一次溶液は、水性（すなわち、溶媒の主要部分は水である）である。水は、一次分離工程に必要な任意の成分と別々に、または一緒に添加され得る。従って、 ApoAまたはApoEを含有する１つ以上の水性溶液、第１または第２の重合性物質は、一次水性溶液を作成するのに必要とされる水と同様にそれ自体が成分を誘導するために使用され得る。一次水性溶液中の標的タンパク質の濃度は、一次水性溶液の約0.1g/lから約50 g/lまでの範囲、適切には0.5から20g/lまでの範囲内、そして好ましくは1から10 g/lまでの範囲内にあり得る。一次水性溶液中の親水性の第１の重合性物質の濃度は、一次水性溶液の全重量の約1から約30重量％までの範囲、適切には3から20重量％の範囲内、そして好ましくは5がら15重量％の範囲内にあり得る。一次水性溶液において、両親媒性の第２の重合性物質は、水性溶液の全重量の約0.5から約30重量％の範囲、適切には3から20重量％の範囲、そして好ましくは 5から15重量％の範囲内であり得る。一次水性溶液において、標的タンパク質と両親媒性の第２の重合性物質との間の濃度の比は、重量で計算した約3：1〜約1：2,500の範囲であり得る。適切には重量で2：3から1：400の範囲内、そして好ましくは重量で1：3から1：150の範囲内であり得る。一次水性溶液において、親水性の第１の重合性物質と両親媒性の第２の重合性物質の間の濃度の比は、重量で計算した約20：1から約1：10の範囲内、適切には重量の10：1から1：5の範囲内、そして好ましくは重量の5：1から1：2の範囲内であり得る。 ApoAまたはApoEと第１および第２の重合性物質との混合の後、一次水性溶液は、形成された少なくとも２つの相を基本的に分離するのに十分な時間維持される。この時間は、約2分から約5時間までの範囲、適切には5分から2時間までの範囲、そして好ましくは10分から1時間の範囲にあり得る。しかし、相分離に必要とされる時間は、一次水性溶液を少なくとも二相に分離することを許容する前に、例えば、遠心性分離、遠心性遠心分離、または遠心性注入を使用することにより減少され得る。このような手段が使用される場合、少なくとも二相への分離の時間は、約5秒から約60分の範囲、そして適切には10秒から30分の範囲であり得る。一次水性溶液の温度は、適切には約5から約40℃の範囲、そして好ましくは15 から30℃の範囲にある。本発明の好ましい実施態様において、炭素原子に結合した２または３の窒素原子を含有する化合物は、一次水性溶液中に存在する。このようにして、タンパク質がより疎水性相に、より容易に分配されるので、改良された精製および収量が得られ得る。このような窒素含有化合物で得られる好都合な効果は、非常に驚きである。なぜなら、尿素のような化合物は、タンパク質を変性するために慣習的に使用されるからである。このような窒素含有化合物の適切な例には、尿素、アルギニン、塩酸グアニジン、ベンズアミジン、およびそれらの混合物が挙げられる。ApoAまたはApoEの増大した溶解性およびApoAまたはApoEの凝集物の形成の減少により、尿素の使用が特に好ましい。使用する場合、炭素原子に結合した２または３の窒素原子を含有する化合物の濃度は、約0.5Mから飽和までの範囲、適切には1Mから8Mまでの範囲、そして好ましくは1.5Mから6Mまでの範囲にあるべきである。一次水性溶液において、標的タンパク質と窒素含有化合物との間の比は、重量で計算された約1：1から約1：5,000の範囲、適切には重量で1：4から1：700の範囲内、そして好ましくは重量の1：6から1：250の範囲内であり得る。疎水性相へのApoAおよびAopEの分配は、疎水性カチオンを有する化合物を一次水性溶液に添加することにより増強され得る。適切な化合物には、カチオン（例えば、直鎖または分枝のトリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、およびテトラブチルアンモニウム）、ならびにアニオン（例えば、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、および炭酸水素塩）を含む無機塩が挙げられる。特定の例は、リン酸アンモニウムトリエチルである。疎水性カチオンを有する化合物の濃度は、増強した分配効果を与えるように選択されるべきであるが、同時にApoAまたはApoEの沈澱を回避する。各々の特定の化合物に適切な濃度の範囲の決定は、等業者の能力内にある。二相系の相間の分子の分配は、分配係数Ｋによって記載される。これは K＝C_T／C_B （１）として定義され、ここで、 C_T＝目的の分子の上の相における濃度 C_B＝目的の分子の下の相における濃度。二相系の相間の分子の分配は、相の図により示され得る。ここで、１相と二相との間の境界線は、バイノードの曲線と呼ばれる。互いに平衡における２つの相のポリマー濃度は、相の図における結合線（tie line）により記載される。ポリマー濃度の増加、すなわち、結合線強度の増加は、二相系における、より過度の分配を導く（G．Johansson，Methods in Enzymology,第228巻、28-42頁)。二相間の適切な分配の条件に辿り着くために実験を行うことは、当業者の能力内にある。本発明における使用のための、親水性の第１の重合性物質と両親媒性の第２の重合性物質との２つの適切な組み合わせは、UC0N 50-HB-5100との組み合わせにおけるRepppal PES 200、およびEO₃₀PO₇₀との組み合わせにおけるReppal PES 20 0である。これらの系における二相間の分配を示す相の図は、それぞれ、P.A．Al redら、Journal of Chromatography，659（1994）289-298頁、およびR.F．Modli nら、Journal of Chromatography，668（1994）229-236頁で与えられる。一次二相分離の後、第２の重合性物質およびApoAまたはApoEの主要部分を含む水相を取り出す。第２の重合性物質は、その後、例えばアフィニティクロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーによるか、または溶媒抽出によってApoAまたはApoEから分離される。ApoAまたはAp oEから第２の重合性物質を分離するための、第３の重合性物質または塩（適切には無機塩）を含むなお別の二相系を使用することもまた考えられ得る。しかし、特に好ましい実施態様において、第２の重合性物質は逆転した溶解性特性を示し、そして第２の重合性物質およびApoAまたはApoEの主要部分を含む水相は、さらに処理するために分離容器に入れられる。種々の方法が、先の章から明白なように、ApoAまたはApoEからの第２の重合性物質の分離に利用可能であるが、本発明は、逆転した溶解性特性を示す第２の重合性物質を用いる温度誘導相分離を参照して以下により詳細に記載される。特に好ましい実施態様において、温度誘導相分離は、ApoAまたはApoEの主要部分を含む相を、逆転した溶解性を示す第２の重合性物質の曇り点を超えるが、Ap oAまたはApoEの分解が生じる温度未満の温度まで加熱することによって実施される。曇り点または相分離温度は、逆転した溶解性を示す重合性物質の特徴的な特色である。従って、このような重合性物質を含む溶液の温度を曇り点を超えて上昇させることによって、溶液が曇り、それは逆転した溶解性を示す重合性物質の二相への分離および沈殿に負っている。第２の相分離がそれによって得られ、ここで高分子が豊富な相および水が豊富な相が形成される。水が豊富な相はほとんど高分子を有さない（すなわち、通常１％未満の重合体を含む）。慣習的には高分子が豊富な相はまた、加熱後、下部相を形成する。なぜなら、高分子が豊富な相の密度は、通常水が豊富な相の密度より高いからである。しかし、密度はまた、種々の操作（例えば、充分量の尿素のような化学物質の添加）によって逆転し得る。本発明において、ApoAまたはApoEは、水が豊富な相へほとんど独占的に分画され、それによって問題のタンパク質のさらなる精製の必要性を減じる。逆転した溶解性を示す重合性物質の可能な技術および経済的な使用を行うために、曇り点は、溶液の凝固点より上、および100℃より下でなければならない。本発明において、逆転した溶解性を示す第２の重合性物質の曇り点は、約５〜約 90℃までの範囲であり、適切には10〜75℃までの範囲であり得る。好ましくは、逆転した溶解性を示す第２の重合性物質の曇り点は、15〜60℃までの範囲であり、より好ましくは20〜40℃の範囲にある。第２の重合性物質を含む相が、温度誘導相分離において上昇されなければならない温度は、先の章から明らかなように、適切な低い曇り点を有する第２の重合性物質を選択することによって低下され得る。しかし、第２の重合性物質を含む相が、第２の重合性物質の沈殿を生じるまで上昇させなければならない温度は、その相に少量の有機物またはより通常の無機塩を添加することによってまた低下され得る。従って、塩の非存在下で50℃であるUCON 50-HB-5100の曇り点は、例えば塩の添加によって37℃へ低下し得る。しかし、温度誘導相分離が塩の本質的に非存在下で実施されることが好ましい。なぜならこれはApoAまたはApoEの次の精製を容易にするからである。逆転した溶解性を示し、かつ第２の重合性物質として本発明の使用に適切な重合性物質は、I.Y.Galaevら，Enzyme Microb.Tech.,第15巻(1993),354-366頁（これは、本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。詳細には、逆転した溶解性を示し、かつ第２の重合性物質として本発明の使用に適切な重合性物質としては、ポリアルキレングリコール、ポリ（オキシアルキレン）重合体、ポリ（オキシアルキレン）共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシル化界面活性剤、アルコキシル化デンプン、アルコキシル化セルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、シリコン修飾ポリエチレン、ならびにそれらの誘導体および混合物が挙げられる。適切なポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびその誘導体（例えば、アクリル置換およびメタクリル置換されたポリエチレングリコールならびにポリプロピレングリコール）が挙げられる。適切なアルコキシル化界面活性剤、デンプン、およびセルロースは、メトキシル化ならびにエトキシル化された界面活性剤、デンプン、およびセルロースを含む。適切なアルキルヒドロキシアルキルセルロースとしては、アルキル基が１〜４個までの炭素原子を有するこれらのセルロースが挙げられる。好ましいアルキルヒドロキシアルキルセルロースは、エチルヒドロキシエチルセルロース(EHCH)である。適切なポリ（オキシアルキレン）共重合体としては、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのランダム共重合体ならびにブロック共重合体が挙げられる。エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの共重合体の疎水性は、増加するプロピレングリコール含量とともに増加する。エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの共重合体におけるプロピレンオキシドの含量は、適切には共重合体の総重量の約30〜90重量％までの範囲にあり、好ましくは約40〜80重量％までの範囲にある。本発明の使用に適したエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの共重合体の具体的な例は、Union Carbide，Corp.,New York City,NY，USAにより市販されているUCON 50-HB-5100 である。UCON 50-HB-5100は、エチレンオキシドの50重量％およびプロピレンオキシドの50重量％からなり、4,000Daの分子量(M_r)および50℃の曇り点を有するランダム直鎖非イオン性共重合体である。エチレンオキシドの50重量％およびプロピレンオキシドの50重量％からなるランダム共重合体の別の特定の例は、Inte rnational Speciality Chemicals Ltd．of Southampton，Englandによって市販されているBreox PAG 50A 1000である。Breox PAG 50A1000は、3,900Daの分子量 (M_r)および50℃の曇り点を有する。本発明の使用に適したエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの共重合体の別の例はEO₃₀PO₇₀であり、これはエチレンオキシドの30重量％およびプロピレンオキシドの70重量％からなり、3,200Daの分子量(M_r)および38℃の曇り点を有するランダム共重合体である。さらに別の適切な例は、EO₂₀P0₈₀であり、これはエチレンオキシドの20重量％およびプロピレンオキシドの80重量％からなり、3,300Daの分子量(M_r)および10重量％の共重合体を含む水溶液中で25℃の曇り点を有するランダム共重合体である。EO₃₀PO₇₀およびEO₂₀PO₈₀は、Shearwater Polymers，Inc.,Huntsville,AL，USAによって市販されている。. Hidetoshi Tsuchidaの公開番号JP 1994-228319の日本国特許明細書は、逆転した溶解性を示すさらなる重合性物質を開示している。この重合性物質は、プロピレンオキシドと30,000Daを超える分子量を有する別の水溶性重合体とのブロック共重合体を含む。JP 1994-228319の全体の内容は、本出願中に参考として援用される。第２の水溶液中での標的タンパク質の濃度は、第２の水溶液の約0.1〜約50g/l の範囲内であり、適切には0.5〜20g/lまでの範囲内であり、そして好ましくは１〜10g/lの範囲内であり得る。温度誘導相分離工程において、第１の水性分離工程からの疎水性相は、第２の重合性物質からのApoAまたはApoEの分離に本質的に充分な期間維持される。この期間は、約60秒間〜５時間までの範囲内であり、適切には５分間〜１時間の範囲内であり、そして好ましくは、10分間〜30分間の範囲内であり得る。しかし、相分離に必要とされる期間は、第２の重合性物質からApoAまたはApoEを分離される前に、例えば、遠心分離、遠心的遠心分離、または遠心的デカントを用いることによって減少され得る。このような手段が使用される場合、分離のための期間は、約５秒間〜約60分間までの範囲であり、そして適切には10秒間〜30分間の範囲内であり得る。本プロセスは、例えばカラム上、またはバッチ式で連続的に実施され得る。本発明は、任意のアポリポタンパク質Ａ(ApoA)もしくはアポリポタンパク質Ｅ (ApoE)、あるいはその改変体または混合物を精製するために有利に使用される。本発明は、血漿、適切にはヒト血漿から得られたか、または組換えDNA技術、適切にはグラム陰性細菌、および好ましくはE.coliによって産生されたApoAもしくはApoEに適用され得る。ApoAもしくApoEは、未精製、または本質的に未精製であり得るか、あるいは本発明に適用する前に前処理され得る。前処理の例は、ダイアフィルトレーションおよび限外濾過である。本発明において、用語ApoAおよびApoEとしては、任意のプレ形態またはフラグメント、すなわち短縮、拡大、もしくは変異形態、あるいは任意のこれらの形態またはフラグメントの任意の混合物が挙げられる。プレ形態は、例えばSirtori らに譲渡されたWO-A-88/03166に開示されるApoA-Iの249アミノ酸Met形態に関する。他のプレ形態は、UCBのUS-A-5059528、ならびに全てMitsubishi Chem.Ind. のEP-A-308336、JP 216988/1984、およびJP 252048/1987に開示されるプロアポリポタンパク質A-I'である。フラグメントは、例えば、ベルギーのInnogenetics S.A.に譲渡されたWO-A-93/25581に開示されるように、少なくとも１つのαヘリックスを含むApoAまたはApoEの一部に関する。短縮型および伸長型は、その分子のＮ末端および／またはＣ末端で、１つ以上のアミノ酸がそれぞれ欠失しているかまたは付加されたApoAおよびApoB分子に関する。適切には、２〜８のアミノ酸、好ましくは３〜６アミノ酸が欠失しているかまたは付加されている。変異形態は、１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されているApoAおよびApoE 分子（例えば、WO-A-93/12143およびWO-A-94/13819に開示されるApoA-IM）に関する。他の変異形態は、ApoA-ISeattle(Deebら(1991)J.Bio.Chem．266:13654-13 660)、ApoA-IYame(Takadaら(1991)J.Lipid Res．32:1275ff)、およびまだ命名されていないApoA-Iの変異形態(Matsunagaら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:27 93-2797)である。ヒトApoEおよびその変異体は、「Human Apolipoprotein Mutants III」、C.R. Sirtoriら編(1993)NatoA SI Series，Springer Verlag，Berlin，II 73:81-96に開示されている。本発明を、ApoAおよびApoEを精製するために有利に使用し得る。しかし、以下の記載において、本発明のさらなる記述のためにApoAの使用を実施する。既知のApoAは、例えばApoA-I、ApoA-II、およびApoA-IVである。本発明において、適切には、ApoAはApoA-I、またはその改変体もしくは混合物である。天然の血漿ApoA-Iは、243アミノ酸の単一のポリペプチド鎖であり、その一次配列は公知である（Brewerら(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun．80:623-630)。より適切には、ApoAは、少なくとも１つのCys残基がアミノ酸残基、好ましくはジスルフィド結合ダイマーを形成させることが可能なArg残基で置換されているApoA-I の変異形態である。天然のヒトApoA-Iのアミノ酸配列は、Arg残基が、10、27、6 1、83、116、123、131、149、151、153、160、171、 173、177、および188位に位置する。これらのうち、置換は、好ましくは160、171、173、177、188、および215位（すなわち同じαヘリックス内の位置で）の少なくとも１つ以上においてである。より好ましくは、Arg残基は、171および／または173位で置換される。最も好ましく；は、ApoA-IはApoA-IMである。ヒトアポリポタンパク質A-IMilano(ApoA-IM)は、正常ApoA-Iの天然に存在する変異形態である(Weisgraberら(1980)J.Clin.Invest．66:901-907)。ApoA-IMにおいて、アミノ酸アルギニンの１残基(Arg173)が、アミノ酸システインの残基(Cys 173)に置換されている。ApoA-IMは、ポリペプチド鎖あたり１つのシステインを含むので、モノマーとしてかまたはジスルフィド結合ダイマーとして存在し得る。モノマーの分子量は約28,000Daであり、およびダイマーは約56,000Daである。これらの２つの形態は化学的に交換可能であり、そして用語ApoA-IMは、本状況において、２つの形態の間で区別されない。以下の実施例は、例示のみの目的で提供され、そして添付される請求の範囲に規定される本発明の範囲を限定するいかなる方法としても構成されない。百分率および割合は、別に規定されない限り重量あたりである。実験材料組換えアポリポタンパク質A-IMを、E.coliにおいて、Pharmacia AB、Stockhol m、Swedenによって産生した。細胞を分離し、濾液を10,000Daカットオフを有する膜を用いる限外濾過により10倍濃縮した。限外濾過後のApo A-IMの濃度は2.8m g/mlであった。20mMリン酸緩衝液（pH7.0）中の部分精製Apo A-IMを、行った全ての試験において出発物質として用いた。ヒドロキシプロピルデンプンポリマーであった。Reppal PES 100は、100,000の分子量（M_r）を有し、そしてReppal PES 200は、200,000の分子量（M_r）を有した。上部相ポリマーは、ShearwaterPolymers，Inc.，Huntsville，AL，USAから入手したEO₃₀PO₇₀（M_r3,200）およびEO₂₀PO₈₀（M_r3,300）であった。全ての化学物質は、分析試薬級であった。分析法および計算総タンパク質含量を、Bradford、Anal．Biochem．vol.72(1976)pp.248-254に従って、クマシーブリリアントブルーＧを用いて決定した。吸光度を、595nmおよび465nmで測定し、次いで、465nmで得られた吸光度を595nmで得られた吸光度から差し引いた。ウシ血清アルブミンを標準として用いた。収率を以下のように計算した：収率＝（Ｃ^t _Apo×Ｖ^t）／（Ｃ_Apo×Ｖ）×１００（２）ここで、Ｃ^t _Apo＝上部相中のApo A-1_Mの濃度Ｃ_Apo＝出発物質中のApo A-1_Mの濃度Ｖ^t＝上部相の体積、およびＶ＝系に投入した材料の体積。系におけるApo A-1Mの精製度を以下のように計算した：精製度＝（Ｃ^t _Apo／Ｃ^t）／（Ｃ_Apo／Ｃ）（３）ここで、Ｃ^t _Apo＝上部相中のApo A-1_Mの濃度Ｃ_Apo＝出発物質中のApo A-1_Mの濃度Ｃ^t＝上部相の総タンパク質濃度、およびＣ＝出発物質中の総タンパク質濃度。ポリマー濃度を％重量／重量（w/w）として計算した。本実験は二連で行い、示した実験データは平均値である。実施例１本発明の一次水性二相分離に続く温度誘導相分離の精製および収率における効果を、標的タンパク質としてApo A-IMを用いて研究した。細胞除去後、Apo A-IM を含有するE.coli発酵溶液を、Reppal PES 100、EO₃₀PO₇₀および尿素を含有する水性溶液に添加した。17％Reppal PES 100、12％EO₃₀PO₇₀、および3.5Ｍ尿素を含有する得られた一次水性溶液をマグネチックスターラーで混合した。一次水性溶液の温度は20℃であった。二相への分離を、1,360gで10分間遠心分離することによって増強した。一次水性系における相分離後、温度誘導相分離を、単離された上部相を50℃で30分間維持することにより実施した。 SDS-PAGEでポリマー相を分析し、ゲルを硝酸銀で染色したとき、タンパク質バンドは観察されなかった。一次上部相および温度誘導上部相におけるApo A-IMの精製度および収率は、表Ｉから明らかである。精製度および収率をELISAの結果に基づいて式（２）および（３）に従って計算した。表Ｉ本発明に従うApo A-1Mの精製表Ｉから明らかなように、一次工程後の収率は82％であり、精製度は2.7であった。続く温熱分離工程において、Apo A-IMの損失は観察されず、この工程において精製はわずかに増大した。温度誘導相分離における体積減少に起因して、タンパク質の濃縮が得られた。実施例２実施例１に記載のプロセスを繰り返した。但し、ここでは、発酵溶液を細胞除去後に濃縮し、Reppal PES 200を第一の重合性物質として使用した。一次水性溶液は、21％Reppal PES 200、10％EO₃₀PO₇₀、および3.0M 尿素を含有した。結果を表IIに示す。表II 本発明に従うApo A-1Mの精製実施例３実施例２に記載のプロセスを繰り返した。但し、ここでは、EO₂₀PO₈₀を第二の重合性物質として使用した。結果を表IIIに示す。表III 本発明に従うApo A-1Mの精製表IIおよびIIIから明らかなように、一次工程後の収率は、60％以上であり、精製度は2.7以上であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者パーション，ヨセフィーンスウェーデン国エス―226 42 ルンド, シャルプシュッテベーゲン 10 エイ (72)発明者シャーネルド，フォルケスウェーデン国エス―216 17 マルメ, ステンスヒューブズガータン 29

Claims

【特許請求の範囲】１．アポリポタンパク質Ａ（Apo A）またはアポリポタンパク質Ｅ（Apo E）、あるいはそれらの改変体または混合物を精製するための一次水性溶液における使用のための組成物であって、該組成物が、第一の重合性物質および第二の重合性物質を含み、該第一の重合性物質および第二の重合性物質が該一次水性溶液に混和性でなく、そして該第二の重合性物質が両親媒性かつ水溶性である、組成物。２．前記第一の重合性物質が、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、デンプン、デキストラン、プルラン、ならびにそれらの誘導体および混合物からなる群から選択されることで特徴づけられる、請求項１に記載の組成物。３．前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシメチルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、およびヒドロキシブチルデンプン、ならびにそれらの混合物からなる群から選択されることで特徴づけられる、請求項２に記載の組成物。４．前記第一の重合性物質の分子量が約10,000〜約5,000,000Daの範囲、適切には、40,000〜500,000Daの範囲にあることで特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。５．前記第二の重合性物質が逆転した溶解特性を示すことで特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。６．前記第二の重合性物質が、約５〜約90℃の範囲、好ましくは15〜60℃の範囲の曇り点を有することで特徴づけられる、請求項５に記載の組成物。７．前記第二の重合性物質が、ポリアルキレングリコール、ポリ（オキシアルキレン）ポリマー、ポリ（オキシアルキレン）コポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシル化界面活性剤、アルコキシル化デンプン、アルコキシル化セルロース、アルギルヒドロキシアルキルセルロース、シリコーン修飾ポリエーテル、ならびにそれらの誘導体および混合物からなる群から選択されることで特徴づけられる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。８．前記ポリ（オキシアルキレン）コポリマーが、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのランダムまたはブロックコポリマーであることで特徴づけられる、請求項７に記載の組成物。９．前記コポリマーの前記プロピレンオキシドの含量が、該コポリマーの総重量の約30〜約90重量％の範囲、好ましくは40〜80重量％の範囲にあることで特徴づけられる、請求項８に記載の組成物。１０．アポリポタンパク質Ａ（Apo A）またはアポリポタンパク質Ｅ（Apo E）、あるいはそれらの改変体または混合物を精製するためのプロセスであって、該Ap o AまたはApo E、前記請求項のいずれかに記載の組成物、および水を任意の順序で混合する工程、形成された相を本質的に分離するために十分な時間、得られた一次水性溶液を維持する工程、該第二の重合性物質と該Apo AまたはApo Eの大部分とを含有する相を取り出す工程、およびその後該Apo AまたはApo Eから該第二の重合性物質を分離する工程により特徴づけられる、プロセス。１１．前記一次水性溶液中の前記第一の重合性物質の濃度が、該一次水性溶液の総重量の約１〜約30重量％の範囲にあり、適切には３〜20重量％の範囲内であることにより特徴づけられる、請求項１０に記載のプロセス。１２．前記一次水性溶液中の前記第二の重合性物質の濃度が、該一次水性溶液の総重量の約0.5〜約30重量％の範囲にあり、適切には３〜20重量％の範囲内であることで特徴づけられる、請求項１０または１１に記載のプロセス。１３．前記一次水性溶液中の前記Apo AまたはApo Eの濃度が、該一次水性溶液の約0.1〜約50g/lの範囲にあり、好ましくは１〜10g/lの範囲内であることで特徴づけられる、請求項１０〜１２のいずれかに記載のプロセス。１４．前記第二の重合性物質が逆転した溶解特性を示し、前記Apo AまたはApo E が、該第二の重合性物質を沈降させるために、取り出される相を、該Apo AまたはApo Eの分解が生じる温度を下回るが、該第二の重合性物質の曇り点を上回る温度に加熱し、続いて該沈降した第二の重合性物質を含有する相を、該ApoAまたはApo Eを含有する相から分離することによって、該第二の重合性物質から分離されることで特徴づけられる、請求項１０〜１３のいずれかに記載のプロセス。１５．炭素原子に結合された２つまたは３つの窒素原子を含有する化合物が、前記一次水性溶液中に存在することで特徴づけられる、請求項１０〜１４のいずれかに記載のプロセス。１６．炭素原子に結合された２つまたは３つの窒素原子を含有する前記化合物が、尿素、アルギニン、グアニジンヒドロクロライド、ベンズアミジンおよびそれらの混合物からなる群から選択されることで特徴づけられる、請求項１５に記載のプロセス。１７．炭素原子に結合された２つまたは３つの窒素原子を含有する前記化合物の濃度が、約0.5Ｍから飽和までの範囲、適切には１Ｍから８Ｍまでの範囲にあることで特徴づけられる、請求項１５または１６に記載のプロセス。１８．前記Apo AまたはApo Eが、組換えDNA技術によって生成されることで特徴づけられる、請求項１０〜１７のいずれかに記載のプロセス。１９．前記Apo AまたはApo Eが、ヒト血漿から得られることで特徴づけられる、請求項１０〜１７のいずれかに記載のプロセス。２０．前記Apo Aが、Apo A-I、またはその改変体もしくは混合物であることで特徴づけられる、請求項１０〜１９のいずれかに記載のプロセス。２１．前記Apo A-Iが、Apo A-IMilanoであることで特徴づけられる、請求項２０に記載のプロセス。２２．一次水性溶液における、アポリポタンパク質Ａ（Apo A）またはアポリポタンパク質Ｅ（Apo E）、あるいはそれらの改変体または混合物を精製するための組成物の使用であって、該組成物が、第一の重合性物質および第二の重合性物質を含み、該第一の重合性物質および第二の重合性物質が該一次水性溶液に混和性でなく、そして該第二の重合性物質が両親媒性かつ水溶性である、使用。２３．請求項１０〜２１のいずれかに従って生成されたApo AまたはApo Eの使用であって、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患、敗血症、または末梢アテローム性動脈硬化症の処置における該Apo AまたはApo Eを含む医薬品の製造のための、使用。２４．アテローム性動脈硬化症および心血管疾患、敗血症、または末梢アテローム性動脈硬化症の処置のための方法であって、請求項１０〜２１のいずれかに従って生成されるApo AまたはApo Eを治療的有効量で投与することによって特徴づけられる、方法。