JP2000514040A - アドレノメヅリンによる骨の障害の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 治療的に首効量のアドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを患者に投与する工程を含む、患者（例えば、ヒトのような哺乳動物）の骨の成長を促進する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 アドレノメヅリンによる骨の障害の治療 発明の背景 アドレノメヅリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）は、１９９３年に最初に 記載された５２アミノ酸のペプチドである（Kitamura、et al.、Biochem.Bioph ys.Res.Commun.192:553-560(1993)）。それは本来ヒト褐色細胞腫において同定 され、それ以来、正常の副腎髄質において見出され、そして心房、心室、内皮細 胞、肺、脳および腎臓を包含する多数の他の組織において見出された （Kitamura、K.、et al.、Biochem.Biophys.Res.Commun.192:553-560(1993);Ki tamura、K.、et al.、Biochem.Biophys.Res.Commun.192:720-725(1993);Ichiki 、Y.、et al.、FEBS Lett.338:6-10(1994);Katoh、F.、et al.、FEBS Lett. 348:61-64(1994);Sakata、J.、et al.、Biochem.Biophys.Res.Commun.195:921- 927(1993);Sugo、S.、et al.、Biochem.Biophys.Res.Commun.201:1160-1166(19 94);Sugo、S.、et al.、Biochem. Biophys.Res.Commun.203:719-726(1994);Jougasaki、M.、et al.、Am.J.Physio l.268:F657-F663(1995);Satoh、F.、et al.、J.Clin.Endocrinol.Metab.80:175 0-1752(1995);およびJougasaki、M.、et al.、Circulation 92:286-289(1995) ）。アドレノメヅリンはラットおよび人間の双方においてピコモル濃度で循環す る（Kitamura、K.、et al.、FEBS Lett.341:288-290(1994);Sakata、J.、et al.、FEBS Lett.352:105-108(1994);Sato、K.、et al.、Life Sci.57:189-19 4(1995)）。アドレノメヅリンは腎臓、小脳、腸間膜、肺、および全身の循環に 直接的に作用する有効な血管拡張薬であり、そしてその投与により血圧が降下す る（Seguchi、H.、et al.、Biochem.Biophys.Res.Commun.215:619-625(1995);N uki、C.、et al.、Biochem. Biophys.Res.Commun.196:245-251(1993);Berthiaume、N.、et al.、Can.J.Phys iol.Pharmacol.73:1080-1083(1995);Nakamura、K.、et al、Jpn.J.Pharmacol.6 7:259-262(1995);Feng.CJ、et al.、Life Sci.55:PL433-PL438(1994);およびD eWitt、BJ、et al、Eur.J.Pharmacol.257:303-306(1994)。その血流力学的作用 は、多分、血管系平滑筋細胞および多分内皮細胞上のレセプターを介して伝達さ れる （Ishizaka,Y.、et al、Biochem．Biophys.Res.Commun.200:642-646(1994);Egu chi、S.、et al.、FEBS Lett.340:226-230（1994）；およびShimekake、Y.、e t al.、J.Biol.Chem.270:4412-4417(1995)）。腎尿細管膜への結合が観察され 、そしてナトリウム、カリウム、および水の排出はアドレノメヅリンにより増加 される（Hirata、Y.、et al.、Hypertension 25:790-795(1995);およびEbara 、T.、et al.、Eur.J.Pharmacol.263:69-73)）。アドレノメヅリンは気管支拡 張剤であり、そしてそれは下垂体および血管作用性ホルモンの放出を調節する（ Tian、Q.、et al.、Can.J.Physiol.Pharmacol.73:1065-1069(1995);Kohno、M. 、et al.、Hypertension25:1185-1190(1995);およびYamaguchi、T.、et al.、 Life Sci.56:379-387(1994)）。 発明の要約 本発明は、患者（例えば、ヒトのような哺乳動物）の骨の成長を促進する方法 に関する。この方法は、治療的に有効量のアドレノメヅリンまたはアドレノメヅ リンアゴニストをこの患者に投与する工程を含む。アドレノメヅリンまたはアド レノメヅリンアゴニストは非経口的に、例えば、静脈内、皮下に投与するか、あ るいは徐放性処方物の皮下植込みにより投与することができる。患者は骨組織の 過度の吸収または破壊、例えば、骨粗鬆症またはパジェット病、に関連する疾患 を患っていることがある。また、患者は固定、骨折、悪性疾患、内分泌障害、自 己免疫性関節炎、または薬剤の使用の結果として、骨の損失を患うことがある。 患者は、また、骨の損失を生ずることが知られている治療（例えば、コルチコス テロイドの治療、骨髄移植、または卵巣摘出）を受けていることがある。 「アドレノメヅリンアゴニスト」は下記において定義される。治療的に有効量 は、治療される症状、選択された投与の経路、および使用する化合物の特定の活 性に依存し、そして最終的に主治医または獣医により決定されるであろう。１つ の態様において、患者の骨の質量が正常のレベルに回復するまで、アドレノメヅ リンアゴニストを患者に投与する。こうして、投与期間は患者の骨の損失の程度 に依存する。 アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストは、治療されている被検 体の血流の中に非経口的に、例えば、静脈内に、投与することができる。しかし ながら、経路、例えば、静脈内、皮下、経筋肉、腹腔内、腸内、経皮、経粘膜、 徐放性ポリマー組成物（例えば、ラクチドポリマーまたはコポリマーの微小粒子 または移植片）、灌流（profusion）、肺（例えば、吸入）、経鼻、経口、およ びその他により、治療すべき症状および使用されるアドレノメヅリンまたはアド レノメヅリンアゴニストの活性および生物学的利用能が変化することを、当業者 は容易に理解するであろう。 アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを純粋なまたは実質的に 純粋な化合物として投与することができるが、また、医薬処方物または医薬製剤 として提供することができる。ヒトおよび動物について、本発明において使用す べき処方物は、後述するアドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストの いずれかと、その１または２以上の薬学上許容される担体と、必要に応じて他の 治療成分とを含んでなる。 担体は、処方物の１または２以上の活性成分と適合性でありかつ治療すべき被 検体に対して有害でないという意味において「許容され」なくてはならない。望 ましくは、処方物は酸化剤、あるいはペプチドと不適合性であることが知られて いる他の物質を含むべきではない。例えば、環状化された形態（例えば、内部の システインジスルフィイド結合）のアドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンア ゴニストは酸化されており、したがって、賦形剤として還元剤の存在はシステイ ンジスルフィイド架橋を開くことがある。他方において、高度に酸化的な条件は システインジスルフィイドの形成およびトリプトファンの酸化を招くことがある 。結局、賦形剤を注意して選択することが重要である。ｐＨは他の主要な因子で あり、そしてわずかに酸性の条件（ｐＨ５〜６）下に生成物を緩衝剤で処理する ことが必要であることがある。 処方物は好都合に単位投与形態で提供することができ、そしてこの薬学分野に おいてよく知られている任意の方法により製造することができる。すべての方法 は、１または２以上の活性成分を１または２以上の補助成分を構成する担体と結 合させる工程を含む。 一般に、錠剤または粉剤の処方物は、活性成分を微細な固体状担体と均一にか つ均質に配合し、次いで、必要に応じて、錠剤の場合におけるように、生成物を 所望の形状および大きさにすることによって製造される。 他方において、非経口（例えば、静脈内）投与に適当な処方物は、好都合には １または２以上の成分の無菌水溶液を含んでなる。好ましくは、この溶液は治療 すべき被検体の血液と等張である。このような処方物は、好都合なことに、１ま たは２以上の固体状活性成分を水中に溶解させて水溶液を形成させ、この水溶液 を無菌とすることによって製造することができる。処方物は単一または多投与の 容器、例えば、密閉したアンプルまたはバイアルの形態で提供することができる 。 徐放性非経口投与に適当な処方物（生物分解性ポリマー処方物）は、また、当 該技術分野において周知である。例えば、米国特許第３，７７３，９１９号およ び米国特許第４，７６７，６２８号およびＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９４／１５５８ ７号の各明細書を参照のこと。 アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストは、また、骨の抗吸収剤 （bone anti-resorptive agent）または他の骨の同化剤（bone anabolic agent ）とともに投与することができる。骨の吸収剤の例は、カルシトニン、ビスホス ホネート（例えば、エチドロネート、アレンドロネート、またはパミドロネート ）、エストロゲン、およびそれらの類似体である。骨の同化剤の例は、副甲状腺 ホルモン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、サイトカイン（例えば、ＴＧＦ− β、ＩＧＦ−１）、成長ホルモン、イプリフラボン、およびそれらの類似体であ る。 他の態様において、本発明は、３０〜２６アミノ酸から成りかつアドレノメヅ リン配列（２７−５２）（ここでカルボキシ末端は遊離酸であるか、あるいはア ミド化されている）を含んでなるペプチドを包含する。このようなペプチドの例 は、アドレノメヅリン（２７−５２）、アドレノメヅリン（２６−５２）、アド レノメヅリン（２５−５２）、アドレノメヅリン（２４−５２）、またはアドレ ノメヅリン（２３−５２）であり、ここでカルボキシ末端はアミド化されている 。本発明のペプチドは、例えば、下記のフォーマットにより、本明細書において 記載される。アドレノメヅリン（１３−５２）。括弧内の数字は、アドレノメヅ リンのペプチドの中に存在するアミノ酸の数、例えば、アドレノメヅリンの位置 １３におけるセリン残基と、位置５２におけるアミド化チロシン残基との間の４ ０アミノ酸のフラグメント、を意味する。アドレノメヅリンの配列は、欧州特許 出願第６２２，４５８Ａ２号の第１図に記載されている。 本発明の他の特徴および利点は、好ましい態様の下記の説明および請求の範囲 から明らかであろう。 発明の詳細な説明 当業者は、本明細書における説明に基づいて、本発明をその完全な程度に利用 することができると考えられる。したがって、下記の特定の態様は単に例示であ り、いかなる方法おいても開示のそれ以外の部分を限定しない。 特記しない限り、本明細書おいて使用されるすべての技術用語および科学用語 は、本発明が属する当業者により普通に理解されるのと同一の意味を有する。ま た、本明細書に記載されているすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参 考文献は、引用することによって本明細書の一部とされる。アドレノメヅリンおよびアドレノメヅリンアゴニスト アドレノメヅリンは、アミド化Ｃ−末端を有する５２アミノ酸である。多数の 類似体、例えば、下記のようなカルボキシ末端のフラグメント、が製造されてい る。例えば、アドレノメヅリン（１５−５２）、アドレノメヅリン（１−５０） 、アドレノメヅリン（１１−５０）、アドレノメヅリン（２２−５２）、アドレ ノメヅリン（４０−５２）、アドレノメヅリン（１３−５２）、アドレノメヅリ ン（４７−５２）、およびアドレノメヅリン（４５−５２）。下記の文献を参照 のこと。欧州特許出願第６２２，４５８Ａ２号；Lin、et al.、Eur.J.Pharmaco l.260:1-4(1990)；およびSantiago、J.A.、et al.、Eur.J．of Pharmacology． 272:115-118(1995)。アドレノメヅリンアゴニストが意味するものは下記の特性 を有する化合物である。（１）アドレノメヅリンレセプターに対して高いアフィ ニティー（例えば、１μＭより低いＫｉ）を有し(Owji、et al.、Endocrinolog y 136(5):2128(1995)に記載されているレセプター結合アッセイにより定義され るように）、そして（２）骨芽細胞の増殖を促進する（骨芽細胞増殖アッセイに おいて下記において定義するように）。合成 短いアミノ酸配列の合成はペプチド技術においてよく確立されている。例えば 、Stewart、et al.、Solid Phase Peptide Synthesis（第２版、１９８４） を参照のこと。下記はアドレノメヅリン（２７−５２）の合成である。他のこの よう なアドレノメヅリンアゴニストは、本明細書において記載する合成法の分野にお ける当業者の能力の範囲内において、適当な変更を行うことによって製造するこ とができる。 塩化物イオンの形態のベンズヒドリルアミン−ポリスチレン樹脂（AdvancedCh emTech,Inc.、ケンタッキー州ルイスビル）(０．６ｇ、０．２５ミリモル）を、 下記の反応サイクルを実行するようにプログラムされたアドバンスド・ケムテク （Advanced ChemTech）ペプチド合成装置の反応容器の中に入れた。（ａ）塩化 メチレン、（ｂ）塩化メチレン中の３３％のトリフルオロ酢酸（各々１および１ ５分間２回）、（ｃ）塩化メチレン、（ｄ）エタノール、（ｅ）塩化メチレン、 および（ｆ）塩化メチレン中の１０％のジイソプロピルエチルアミン。 中和した樹脂を塩化メチレン中でＢｏｃ−Ｔｙｒ（２，６−ジクロロベンジル ）およびジイソプロピルカーボジイミド（各々０．７５ミリモル）とともに１時 間撹拌し、次いで生ずるアミノ酸樹脂を上記洗浄プログラムの工程（ａ）〜（ｆ ）を通してサイクルした。次いで下記のアミノ酸（０．７５ミリモル）を同一手 順により連続的にカップリングした：Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ −Ｐｒｏ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ベンジル）、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ −クロロ−ＣＢＺ）、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ベンジル）、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（ｐ−トシ ル）、 Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ− Ａｓｎ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（シクロヘキシル）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−クロロ−Ｃ ＢＺ）、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（シクロヘキシル）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−クロロ−Ｃ ＢＺ）、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（シクロヘキシル）、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（ベンジル）、Ｂ ｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（２，６−ジクロロベンジル） 、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ベンジルオキシメチル） 、およびＢｏｃ−Ａｌａ。最後のＢｏｃ基を除去し、洗浄し、乾燥させた後、完 成 した樹脂は１．１１ｇであった。すべてのアミノ酸はベイケム・カリフォルニア （Bachem California）（カリフォルニア州トレンス）から購入した。 前述の樹脂（１．１１ｇ、０．２５ミリモル）を、アニソール（５ｍｌ）、ジ チオスレイトール（１００ｍｇ）および無水フッ化水素（３５ｍｌ）と０℃にお いて混合し、４５分間撹拌した。過剰のフッ化水素を乾燥窒素流下で蒸発させ、 遊離ペプチドを沈澱させ、エーテルで洗浄した。次いで粗製ペプチドを最小体積 の２Ｍの酢酸中に溶解させ、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０のカ ラム（２．５×１００ｃｍ）（ファルマシア、ニュージャージー州ピスカタウェ イ）上で同一溶媒を使用して溶離した。紫外線吸収および薄層クロマトグラフィ ーにより検出された、主要な成分を含有する画分をプールし、小さい体積に蒸発 させ、そしてバイダック（Ｖｙｄａｃ）オクタデシルシランシリカ（１０〜１５ μ；Ｒａｉｎｉｎ、カリフォルニア州エメリービル）のカラム（２．５×５０ｃ ｍ）に適用した。このカラムを水中の０．１％のトリフルオロ酢酸中の１０〜４ ５％のアセトニトリルの直線勾配で溶離した。画分を薄層クロマトグラフィー（ ｔｌｃ）および分析用高性能液体クロマトグラフィー（ｈｐｌｃ）により検査し 、プールして最大純度を得た。水からの溶液の反復した凍結乾燥により、生成物 がアミドとしてかつ白色の毛羽状粉末として得られた。生成物はｈｐｌｃおよび ｔｌｃにより均質であることが見出された。酸加水分解物のアミノ酸分析により 、ペプチドの組成を確認した。レーザー脱着質量スペクトルにより、期待した分 子量が得られた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究 骨芽細胞の培養 ２０日齢の胎児ラットの頭蓋冠からコラゲナーゼ消化により、骨芽細胞を単離 した。次いで、浸盪水浴中で３７℃において、３ｍＭのエチレンジアミン−酢酸 （EDTA;Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス）を含有するリン酸緩 衝生理食塩水（PBS;Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド）で頭蓋冠を２ 回１５分間処理した。ＰＢＳ中で１回洗浄した後、３ｍｌの１ｍｇ／ｍｌのコラ ゲナーゼ（Sigma Chemical Co.）を頭蓋冠に３７℃において１０分間添加した 。上清を廃棄した後、頭蓋冠を２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼで２回処理した（３ ０分、３７℃）。次いで上清を遠心分離し、細胞を１０％のウシ胎児血清（ＦＣ Ｓ）を含むダルベッコの変性イーグル培地（DMEM;Gibco Labs、ニューヨーク州 グランドアイランド）中で洗い、さらにＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳの中に懸濁させ 、そして７５ｃｍ³のフラスコの中に入れた。細胞を５％ＣＯ₂および９５％空気 下に３７℃においてインキュベートした。 アルカリ性ホスファターゼおよびオステオカルシンが高いレベルを示すこと、 および副甲状腺ホルモンおよびプロスタグランジンに対する感受性アデニレート シクラーゼの応答により、これらの細胞の骨芽細胞様特性は確立された。５〜６ 日までにコンフルエンスに達し、この時において細胞を継代培養した。トリプシ ン−ＥＤＴＡ（０．０５％／０．５３ｎＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｓ、ニューヨー ク州グランドアイランド）を使用するトリプシン処理後、細胞を５％のＦＣＳを 含む最小必須培地（MEM;Gibco Labs）中ですすぎ、ＭＥＭ／５％ＦＣＳの中に 再懸濁させ、次いで２４ウェルのプレート（０．５ｍｌの懸濁液／ウェル、すな わち、５×１０⁴細胞／ウェル）の中に接種した（１０⁵細胞／ｍｌ）。増殖アッセイ 細胞増殖の研究（すなわち、細胞の計数およびチミジンの取込み）を、活発に 増殖する細胞集団および増殖阻止した細胞集団の双方において実施した。活発に 増殖する細胞を生産するために、サブコンフルエントの集団（継代培養後２４時 間）を１％ＦＣＳおよび被験化合物を含有する新鮮なＭＥＭに移した。増殖阻止 した細胞を生産するために、サブコンフルエントの集団を０．１％のウシ血清ア ルブミンおよび被験化合物を含有する無血清培地に移した。 Ａ． 細胞の計数 まず細胞数を測定することによって、胎児ラットの骨芽細胞様細胞の増殖に対 するアドレノメヅリンの作用を評価した。被験化合物またはビヒクルの添加後、 ６、２４、および４８時間において、細胞計数を分析した。３７℃においてトリ プシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．５３ｍＭ）に５分間暴露することによって ウェルから細胞を取り出した後、細胞数を測定した。血球計チャンバー中で、計 数を実施した。ウェルにつき結果を表した。１％ＦＣＳを含有する培地中で増殖 させた培養物において、２４時間アドレノメヅリンで処理すると、活発に増殖す る骨芽細胞は投与量依存的に増加した。１０^-12Ｍおよびそれより高いアドレノ メヅリン濃度において、有意な増加が観測された。この刺激は少なくとも４８時 間維持された。 アドレノメヅリンに対して応答する増殖が細胞の基礎増殖速度に依存したかど うかを決定するために、これらの実験を増殖阻止した骨芽細胞の調製物において 反復した。これらの細胞におけるアドレノメヅリン（１０^-10Ｍ）に対して応答 する細胞数の増加の時間経過は、活動的に増殖する細胞において見られたものに 類似した。 被験化合物のアドレノメヅリン（１５−５２）、アドレノメヅリン（２２−５ ２）、およびアドレノメヅリン（２７−５２）を使用する２４時間の処理におい て、全長のアドレノメヅリンのそれに対して同程度の増殖が起こった。 Ｂ． ＤＮＡ合成 次いで、単離された胎児ラットの骨芽細胞様細胞の中への［³Ｈ］−チミジン の組込みの測定により、骨芽細胞におけるＤＮＡ合成に対するアドレノメヅリン の作用を評価した。実験のインキュベーションの終わりの２時間前に、活発に増 殖する細胞および増殖阻止した細胞を［³Ｈ]−チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）（Am ersham、イリノイ州アーリントンハイツ）でパルスすることによって、これらの 細胞の中への［³Ｈ］−チミジンの組込みを評価した。６、２４、または４８時 間において非放射性チミジンを含有するＭＥＭ中で、次いで１０％のトリクロロ 酢酸中で、細胞を洗浄することによって実験を停止した。沈澱をエタノール：エ ーテル（３：１）で２回洗浄し、ウェルを室温において乾燥させた。残留物を０ ．５ＭのＫＯＨの中に８５℃において３分間溶解させ、１ＭのＨＣｌで中和し、 そしてアリコートを放射能について計数した。結果をｃｐｍ／ウェルで表した。 ２４時間のアドレノメヅリン（１０^-10Ｍ）を使用する処理は、活発に増殖す る細胞および増殖阻止した細胞の双方の中への［³Ｈ］−チミジンの組込みを大 きく刺激した。骨器官培養 骨の吸収の研究を以前に記載されているように（Reid、et al.、Endocrinolo gy126:1416-1420(1990)）新生児のマウスの頭蓋冠において実施した。２日齢の マウスに５μＣｉの⁴⁵Ｃａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を皮下注射し、４日後に半頭蓋 冠を解剖した。０．１％のウシ血清アルブミンを含む培地１９９（Gibco BRL、 ニューヨーク州グランドアイランド）中で２４時間、半頭蓋冠をプレインキュベ ートし、次いでアドレノメヅリンまたは対照のビヒクルを含有する新鮮な培地に 移した。さらに４８時間インキュベーションを続けた。インキュベーションの最 後の４時間において、以前に記載されているように（Lowe、et al.、Calif.Tis sueInt.49:394-397(1991)）器官培養細胞の中に［³Ｈ］−チミジンが取込まれた 。各グループに５〜７つの頭蓋冠が存在した。 １０^-7Ｍ〜１０^-10Ｍの濃度のアドレノメヅリンで４８時間処理した前標識化 頭蓋冠からの⁴⁵Ｃａの放出に大きな変化は存在せず、アドレノメヅリンは骨の吸 収を刺激しないことが示された。対照的に、同一実験において［³Ｈ］−チミジ ンの組込みは大きく増加し、アドレノメヅリンが骨の成長を刺激することが示さ れた。ｉｎ ｖｉｖｏ研究 以前に記載されたモデル（Cornish et al.、Endocrinology 132:1359-1366 、1993）を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏにおける骨の組織に対するアドレノメヅリ ンの局所的作用を成体のマウスにおいて評価した。日齢４０〜５０および体重２ ５〜３５ｇの性的に成熟した雄のＡＲＣ Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに 、右の半頭蓋冠の骨膜の上に５日間連続して注射（２５μｌ）した。色素の注射 を使用する前の研究において、注射された物質は注射された半頭蓋冠の大部分に わたって広がるが、正中線を交差しないことが示された。最初の注射の５日前か ら、動物を低カルシウム食事（０．１％）で飼育した。マウスの２グループ（各 においてｎ＝２）に、それぞれ、４×１０^-10Ｍおよび４×１０^-9Ｍの投与量で アドレノメヅリンを毎日注射した。このモデルにおいて、他の骨活性ペプチドを 使用する経験に基づいて、これらの投与量を選択した。対照グループの動物（ｎ ＝１６）に、ビヒクル（水）のみを注射した。最後の注射後１週間に、すべての 動物を殺した。この研究は、地方の学会の検査委員会（local institutional review board）の承認を得た。 頭蓋冠から軟質組織を解剖除去し、そして解剖顕微鏡下で無傷の頭蓋冠を検査 することによって、全体の形態を評価した。骨の組織を１０％のリン酸塩緩衝ホ ルマリン中で固定し、等級づけた系列のエタノール溶液中で脱水し、メチルアク リレート樹脂の中に非脱カルシウム状態で埋め込んだ。ライツ（Ｌｅｉｔｚ）回 転ミクロトーム（Leica Instruments、ドイツ国ヌスロッホ）で炭化タングステ ンのナイフを使用して切片（厚さ４μｍ）に切り、次いで切片をゼラチン被覆し たスライド上にマウントし、空気乾燥させた。切片をゴールドナー（Ｇｏｌｄｎ ｅｒ）トリークローム染色により染色し、オステオメジャー画像分析器 （Osteomeasure Image Analyzer）（Osteometrics Inc.、ジョージア州アト ランタ）に取り付けられたオリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＢＸ５０顕微鏡（オリ ンパス光学株式会社、日本国東京）で検査した。各半頭蓋冠において３つの隣接 する視野（２０×対物レンズを使用して）について、組織形態測定分析を実施し た。これにより、各半頭蓋冠の長さの＞９０％にわたって測定値が得られる。 評価したパラメーターは、米国骨およびミネラル研究学会（American Societ ｙ for Bone and Research）により規定される通りである（Parfitt et a l.、J.Bone Miner.Res.2:595-610(1987)、そして頭蓋冠の長さのｍｍにつき表 わす。骨芽細胞を頬骨に直接隣接する細胞として定義した。溶骨細胞の数は多核 細胞のみを含んだ。種々の表面の評価は、骨膜と膜内の双方の表面の測定値に基 づいた。溶骨細胞により浸蝕された表面（浸蝕された周界）、溶骨細胞に直接隣 接する表面（溶骨細胞の周界）、および骨芽細胞に直接隣接する表面（骨芽細胞 の周界）。これらの研究におけるこれらの組織形態学的測定値（対となったの測 定値の変動係数として表した）の精度は次の通りである。ミネラル化された骨の 区域１．３％、頬骨の区域６．９％、骨芽細胞の周界６．８％、骨芽細胞の数１ ．７％、浸蝕された周界６．７％、溶骨細胞の周界７．９％、溶骨細胞の数＜１ ．０％、および頭蓋冠の長さ０．２％。すべての測定は、各骨の処理グループに 対してブラインドであった１人のオペレーターにより行われた。 ｉｎ ｖｉｖｏ実験において、各組織形態学的測定指数についての主な目的は 、それが注射した右の半頭蓋冠において、同一の動物の反対側の非注射の骨と異 なるかどうかを決定することであった。処理したグループによる、注射した半頭 蓋 冠および非注射の半頭蓋冠について、各組織形態学的測定指数の絶対値を表１〜 ３に表す。次の３つのグループの各々からの非注射の半頭蓋冠および注射した半 頭蓋冠における組織形態学的測定指数をこれらの表に記載する。ビヒクルを注射 したマウス（表１）、４×１０^-10Ｍのアドレノメヅリンを注射したマウス（表 ２）、または４×１０^-9Ｍのアドレノメヅリンを注射したマウス（表３）。各頭 蓋冠の注射した半分／非注射の半分における各指数の比について実施した統計学 的解析は、いずれかの投与量のアドレノメヅリンに暴露された骨における骨芽細 胞の活性の指数の２〜３倍の増加を明らかにした。吸収指数は、アドレノメヅリ ンの存在においてわずかの上向きの傾向を示したが、浸蝕された周界についての み、これは有意であった。より高い投与量のアドレノメヅリンを使用して、ミネ ラル化された骨の区域は１３．６％だけ増加した。骨膜区域は変化しなかった（ Ｐ＝０．５４）。 他の態様 本発明をその詳細な説明により記載したが、上記の説明は例示を意図し、添付 した請求の範囲の範囲により規定される本発明の範囲を限定しないことを理解す べきである。他の態様、利点、および変更は請求の範囲の範囲内である。 表１〜３。成体マウスの頭蓋冠におけるｉｎ ｖｉｖｏ組織形態学的測定指数に 対するアドレノメヅリンの効果＊ ＊データは平均である（ｓｅ）。Ｏｂ、骨芽細胞。Ｐｍ、周界。Ｏｃ、溶骨細胞 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 デイビッド、エイチ．コイ アメリカ合衆国ルイジアナ州、ニューオー リンズ、フォース、ストリート、1529 (72)発明者 ジリアン、コーニシュ ニュージーランド国オークランド、ミッシ ョン、ベイ、ゴーデン、クレセント、22エ イ (72)発明者 イアン、レジナルド、リード ニュージーランド国オークランド、マウン ト、アルバート、メイベック、ロード、７ (72)発明者 ガース、ジェイムズ、スミス、クーパー ニュージーランド国オークランド、ハー ン、ベイ、マリーン、パレイド、７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 患者にアドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを投与する ことを含む、患者の骨の成長を促進する方法。 ２． アドレノメヅリンアゴニストを投与することを含む、請求項１に記載の 方法。 ３． 前記アドレノメヅリンアゴニストがアドレノメヅリンのフラグメントで ある、請求項２に記載の方法。 ４． 前記患者が骨粗鬆症を患っている、請求項１に記載の方法。 ５． 前記患者が骨粗鬆症を患っている、請求項２に記載の方法。 ６． 前記患者が骨粗鬆症を患っている、請求項３に記載の方法。 ７． 前記アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを鼻または肺 に投与する、請求項１に記載の方法。 ８． 前記アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを非経口的に 投与する、請求項１に記載の方法。 ９． 前記アドレノメヅリンが徐放性処方物の形態である、請求項７に記載の 方法。 １０． 前記アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを鼻または 肺に投与する、請求項２に記載の方法。 １１． 前記アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを非経口的 に投与する、請求項２に記載の方法。 １２． 前記アドレノメヅリンが徐放性処方物の形態である、請求項１１に記 載の方法。 １３． 前記アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを鼻または 肺に投与する、請求項３に記載の方法。 １４． 前記アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを非経口的 に投与する、請求項３に記載の方法。 １５． 前記アドレノメヅリンが徐放性処方物の形態である、請求項１４に記 載の方法。 １６． 前記アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを鼻または 肺に投与する、請求項４に記載の方法。 １７． 前記アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを非経口的 に投与する、請求項４に記載の方法。 １８． 前記アドレノメヅリンが徐放性処方物の形態である、請求項１７に記 載の方法。 １９． 前記アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを鼻または 肺に投与する、請求項７に記載の方法。 ２０． 前記アドレノメヅリンまたはアドレノメヅリンアゴニストを非経口的 に投与する、請求項７に記載の方法。 ２１． 前記アドレノメヅリンが徐放性処方物の形態である、請求項２０に記 載の方法。 ２２． ３０〜２６アミノ酸から成り、かつアドレノメヅリン配列（２７−５ ２）（ここでそのカルボキシ末端は遊離酸であるか、あるいはアミド化されてい る）を含んでなるる、ペプチド。 ２３． 前記ペプチドがアドレノメヅリン（２７−５２）、アドレノメヅリン （２６−５２）、アドレノメヅリン（２５−５２）、アドレノメヅリン（２４− ５２）、またはアドレノメヅリン（２３−５２）であり、ここでカルボキシ末端 がアミド化されている、請求項２２に記載のペプチド。