JP2000514309A - バイオマスまたは細胞からの所望の生成物の改良製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞中の共役していないＡＴＰａｓｅ活性を発現し、細胞を適切な基質とインキュベートしてバイオマスまたは生成物を製造することにより達成される、他の細胞代謝物または機能に大きな影響を与えずＡＴＰからＡＤＰへの変換を誘導することにより、バイオマスまたは細胞からの所望の生成物の製造が改良される。これは、該細胞中で膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺ −ＡＴＰａｓｅの可溶性部分（Ｆ１）またはＡＴＰａｓｅ活性を示すＦ１の一部を発現することにより行うことが便利である。Ｆ１ ＡＴＰａｓｅまたはその一部が得られる生物、またはＦ１ＡＴＰａｓｅまたはその一部が発現される生物は、原核生物および真核生物から選択される。特にＦ１またはその一部をコードするＤＮＡは、細菌、および酵母や他の真菌のような真核微生物、および高等動物の細胞株から得られ、かつＦ１サブユニットβまたはその一部をコードする遺伝子、および該遺伝子もしくはその一部と他のＦ１サブユニットもしくはその一部をコードする遺伝子との種々の組合せよりなる群から選択される。この方法は特に、異なるレベルの共役していないＡＴＰａｓｅ活性を細胞中で発現させ、適切な基質上で細胞をインキュベートし、各レベルのＡＴＰａｓｅ発現でバイオマスまたは所望の生成物への基質の変換速度を測定し、そして変換速度が最適化されるＡＴＰａｓｅ発現のレベルを選択することにより、細胞によるバイオマスまたは所望の生成物の生成を最適化するのに使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 バイオマスまたは細胞からの所望の生成物の改良製造法 本発明は、他の細胞代謝物または機能に大きな影響を与えずＡＴＰをＡＤＰに 変換することによる、バイオマスまたは細胞からの所望の生成物の改良製造法に 関する。本発明はまた、この方法を使用してバイオマスまたは細胞からの所望の 生成物の製造を最適化する方法に関する。所望の生成物は、例えば乳酸菌により 産生される乳酸および酵母により産生されるエタノールまたは二酸化炭素である 。 発明の背景 種々の有機化合物および異種タンパク質の製造に、広範囲の微生物が使用され ている。その１つの例は、乳酸菌群の細菌による乳酸および他の有機化合物の製 造であり、これはチーズやヨーグルトの製造でよく知られているように、乳製品 を酸性化しこれに風味を与える。 微生物の観点からは、細胞から排出される有機化合物は、単に細胞に必須のプ ロセスの副産物であることが多い（ＡＴＰ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、膜電位などのよう に、自由エネルギーの種々の型の産生）。従って、これらのプロセスで使用され ている多くの微生物は、当然これらの目的によく適しているが、バイオリアクタ ーの観点から見ると、これらの微生物の生産性を最適化する余地は大きい。同様 に、微生物による異種タンパク質の産生は、その微生物に適しているものではな く、従ってここでも最適化の余地がある。 工業的製造プロセスを最適化するために微生物を操作する時、所望の生成物に 至る反応は、細胞のエネルギー代謝に関与する補助因子の微妙なバランスに影響 を与えることがしばしばある。例えば砂糖から乳酸を産生する解糖系の反応が少 し増強される（例えば、解糖系酵素の過剰発現）と、これは自動的にＡＤＰから ＡＴＰへの変換につながる。ＡＴＰとＡＤＰの濃度比は、普通、増殖している細 胞では非常に高く（［ＡＴＰ］／［ＡＤＰ］＞１０）、［ＡＴＰ］／［ＡＤＰ］ 比が変化しても、［ＡＴＰ］と［ＡＤＰ］の合計はほとんど一定である。従って 上記の例で、ＡＴＰの産生増強により［ＡＴＰ］／［ＡＤＰ］比が１０から例え ば３０まで変化しても、ＡＴＰの濃度はほとんど影響を受けない。しかしＡＤＰ 濃度は、３倍変化する。従って細胞はＡＴＰの過剰はほとんど感じないが、細胞 中のＡＤＰプールは、ＡＤＰが補助因子またはアロステリックレギュレーターで ある反応が、ＡＤＰの欠如のために抑制される程度まで枯渇することもある。そ の結果、経路（ここでは解糖系）中の全フラックスがほんのわずかに増加する。 将来は、他の手段によりバイオリアクターの生産性が最適化されると、この状況 がより頻繁に発生することとなり、この場合、生産性をさらにあげるために、Ａ ＴＰからＡＤＰを再生することがより重要となるであろう（正常細胞と比較して ）。 これまで、無益回路（futile cycles）を形成する反応セットを利用して、酵 母中の細胞内ＡＴＰ濃度を低下させる試みが行われてきた（ＥＰ特許第２４５４ ８１号を参照）。無益回路の最初の反応が、細胞の正規の代謝ネットワークの一 部であることがしばしばある（例えば、ＡＴＰの消費に共役した解糖系中間体の リン酸化）。次に、これも時に代謝ネットワークの一部であることがある第２の 反応は、第１のプロセスで消費されたＡＴＰを再生することなく解糖系中間体を 脱リン酸化し、全体的作用として、高エネルギーリン酸結合が消費される。この 方策がこれまであまりうまく成功していないのは、おそらくリン酸化中間体の濃 度を低下させることなく重要な無益回路を得ることが不可能であり、その結果細 胞機能が破壊され最終的に増殖が破壊されるためであろう。さらに、このアプロ ーチが解糖系中間体の濃度を低下させることが目的である場合、これは解糖系の 残存部分の基質を有効に除去し、これがしばしば、所望のフラックスの増加では なく、この経路のフラックスの低下を引き起こすであろう。 他の方策は、ジニトロリン酸のような化学物質を使用して、膜電位の脱共役剤 を添加して原形質膜Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの活性を刺激するか、または細胞質中の 酵素である酸性ホスファターゼ（有機代謝物およびタンパク質からリン酸基を除 去する酵素）を遺伝子的に発現することである。しかしこれらのアプローチのい ずれも、同じ本質的問題を有する：これらは非特異的であり、広範囲の細胞反応 ／濃度が影響を受ける。例えば、酸性ホスファターゼは、必須の代謝物およびタ ンパク質からリン酸基を除去し、こうして種々の代謝フラックスおよび代謝制御 を攪乱するであろう。原形質膜Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの脱共役は、細胞質膜を介す る多くのイオンの濃度勾配に加えて、細胞内ｐＨを攪乱するであろう。さらに、 ジニトロリン酸のような化学物質の添加は、多くの目的において好ましくない。 発明の要約 本発明の目的は、前記の制限を受けない、ＡＤＰの細胞内レベルを増加させる ための特異性が非常に高くきれいな方法を使用すること、すなわち、生きた細胞 中のＡＴＰ加水分解活性を有する酵素を、他の生成物を産生することなくかつこ の活性をエネルギー保存に共役することなく、充分に管理された方法で発現させ ることである。そのような酵素活性は、細胞からその必須のエネルギー貯蔵場所 の一部を失わせるであろうから、正常細胞中には存在しないであろう。 従って本発明は、バイオマスまたは細胞からの所望の生成物の改良製造法であ って、他の細胞代謝物または機能に大きな影響を与えることなく、ＡＴＰからＡ ＤＰへの変換を誘導するために、該細胞中で共役していないＡＴＰアーゼ活性を 発現し、適切な基質とともに細胞をインキュベートして該バイオマスまたは生成 物を製造することを特徴とする、上記方法を提供する。 理想的なＡＴＰ加水分解酵素に最も近い正常な酵素の１つは、膜結合Ｈ⁺−Ａ ＴＰアーゼである。この大きな酵素複合体は、膜の必須部分（Ｆ０）と細胞質部 分（Ｆ１）の２つの部分からなる。この２つの部分は一緒に、ＡＴＰからＡＤＰ と無機リン酸（Ｐｉ）への加水分解、細胞質膜を介するプロトンの移動に共役し ているか、またはＡＤＰとＰｉからＡＴＰを合成させるプロトンの濃度勾配を利 用してその逆に共役している。 本発明の方法は、膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ １）またはＡＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部を、細胞中で発現することにより 便利に実施される。 膜結合Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼ複合体は、原核生物ならびに真核生物中で同様の型 で存在し、従ってＡＴＰａｓｅ活性を発現する部分は、原核生物および真核生物 の両方で発現される。 Ｆ１ ＡＴＰアーゼまたはその一部が得られる生物、またはＦ１ ＡＴＰアー ゼまたはその一部が発現される生物は、原核生物および真核生物から選択され、 特に細菌、および酵母や他の真菌のような真核微生物および高等生物の細胞株、 特にパン酵母およびビール酵母から選択される。 本発明の方法が実施される（特に、酪農業）特に興味深い原核生物の群は、ラ クトコッカス属（Lactococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、エ ンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトバシルス属（Lactobacillus）およ びロイコノストック属（Leuconostoc）の乳酸菌、特にラクトバシルス・ラクチ ス（Lactobacillus lactis）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Stre ptococcus thermophilus）の株である。他の興味深い原核生物は、エシェリチア 属（Escherichia）、チモモナス属（Zymomonas）、バシルス属（Bacillus）およ びシュードモナス属（Pseudomonas）であり、特に大腸菌（E．coli）、チモモナ ス・モビリス（Zymomonas mobilis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、およびシ ュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）である。 本発明を実施するための便利な方法において、細胞は、細胞中で機能するプロ モーターの制御下でＡＴＰアーゼ活性を示すＦ１またはその一部をコードするＤ ＮＡを含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされ、ＤＮＡが 細胞中で発現される。Ｆ１またはその一部をコードするＤＮＡは、原核生物また は真核生物から得られ、該細胞に対して同種または異種であってよい。 細菌のＨ⁺−ＡＴＰアーゼ複合体のＦ１部分は、全体でＡＴＰの加水分解に関 与する数個のサブユニットからなる：β−サブユニットは、ＡＴＰ加水分解の実 際の加水分解部位を有すると考えられているが、インビトロのＡＴＰａｓｅ活性 は、β−サブユニットがα−およびγ−サブユニットとともに複合体（α３γβ ３）を形成することを必要とする。この複合体の活性は、ε−サブユニットによ り調節され、その結果、α３γβ３ε複合体のインビトロ活性は、α３γβ３複 合体の活性より５倍低い。 本発明の具体的実施態様において、Ｆ１またはその触媒活性のある部分をコー ドするＤＮＡは、大腸菌（E．coll）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S treptococcus thermophilus）、またはラクトバシルス・ラクチス（Lactobacill us lactis）から得られ、かつＦ１サブユニットβまたはその触媒活性のある部 分をコードする遺伝子、および該遺伝子もしくはその一部とＦ１サブユニットδ 、 α、γおよびεまたはその触媒活性のある部分をコードする遺伝子との組合せの 種々の組合せよりなる群から選択される。 特に、Ｆ１またはその一部をコードするＤＮＡは、大腸菌（E．coli）、スト レプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、およびラク トバシルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）遺伝子ａｔｐＨＡＤＧＣ（サブ ユニットδ、α、γ、β、εをコードする）、ａｔｐＡＧＤＣ（サブユニットα 、γ、β、εをコードする）、ａｔｐＡＧＤ（サブユニットα、γ、βをコード する）、ａｔｐＤＣ（サブユニットβ、εをコードする）およびａｔｐＤ（サブ ユニットβのみをコードする）よりなる群から選択されてよい。 特に興味深い真核生物は、酵母サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyce s cerevisiae）、ファフィア・ロドジマ（Phaffiar hodozyma）またはトリコデ ルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）であり、Ｆ１またはその一部をコードす るＤＮＡは、このような生物から得られてよく、Ｆ１サブユニットβまたはその 一部をコードする遺伝子、および該遺伝子もしくはその一部と、他のＦ１サブユ ニットもしくはその一部をコードする遺伝子との種々の組合せよりなる群から選 択される。 乳酸菌ラクトバシルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）およびストレプト コッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、および酵母サッカ ロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、ファフィア・ロドジマ （Phaffia rhodozyma）、またはトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei ）から得られる、膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰａｓｅの可溶性部分（Ｆ１ ）またはＡＴＰａｓｅ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡを含むベクター はまた、本発明に包含され、原核生物または真核生物細胞中で該ＤＮＡの発現を 指令することができるプロモーターの制御下にそのようなＤＮＡを含む発現ベク ターも本発明に包含される。 本発明の具体的なベクターは、膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可 溶性部分（Ｆ１）またはＡＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡ を含むプラスミドであり、該ＤＮＡは、ラクトバシルス・ラクチス（Lactobacil lus lactis）亜腫クレモリス（cremoris）（配列番号１）、ラクトバシルス・ラ クチス（Lactobacillus lactis）亜腫ラクチス（labtis）（配列番号６）、スト レプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（配列番号１ ０）、ファフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma）（配列番号１４）、および トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）（配列番号１６）から得られる 。 さらに本発明は、細胞によるバイオマスまたは所望の生成物の生成を最適化す る方法であって、細胞内の異なるレベルの共役していないＡＴＰアーゼ活性を発 現し、適切な基質上で細胞をインキュベートし、ＡＴＰアーゼ発現の各レベルで バイオマスまたは所望の生成物への基質の変換速度を測定し、そして変換速度が 最適化されるＡＴＰアーゼ発現のレベルを選択する、ことを特徴とする上記方法 を提供する。 しばしば（しかしいつもではない）、細胞により産生されるある生成物のフラ ックスの最適化は、基質の最大のまたは最小の変換速度の達成を包含するであろ う。 本発明の方法の便利な実施方法において、該細胞の多くの試料は、各々が全Ｆ １までとかつこれを含む膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの細胞質部分 （Ｆ１）の異なる部分（各部分は、ＡＴＰアーゼ活性を示す）をコードするＤＮ Ａを含む各発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされ、各発現ベ クター中の該ＤＮＡは、該細胞中で機能するプロモーターの制御下にあり、各細 胞試料を適切な基質上でインキュベートし、各試料中のバイオマスまたは所望の 生成物への基質の変換速度を測定し、そして最適の変換速度を与える試料を選択 する。科学的研究に特に適したこの方法の具体的実施態様において、各発現ベク ター中のプロモーターは、誘導性プロモーターであり、各試料は、最適変換速度 を微調整するために、異なる濃度のインデューサーで増殖される。 細胞の性能を最適化する上記方法を実施するための好適な方法において、該細 胞の多くの試料は、各々が全Ｆ１までとかつこれを含む膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺ −ＡＴＰアーゼの細胞質部分（Ｆ１）の一部（この部分は、ＡＴＰアーゼ活性 を示す）をコードするＤＮＡを含む各発現ベクターで形質転換またはトランスフ ェクションされ、各発現ベクター中の該ＤＮＡは、広範囲のプロモーター活性を カバーし該細胞中で機能する一連の各プロモーターの制御下にあり、各細胞試料 を適切な基質上でインキュベートし、各試料によるバイオマスまたは所望の生成 物への基質の変換速度を測定し、そして最適な変換速度を与える試料を選択する 。最適な産生株を樹立するのによく適した、この方法のさらに好適な実施態様に おいて、各発現ベクターは、全Ｆ１までとかつこれを含むＦ１のそのような部分 をコードするＤＮＡを含み、各発現ベクター中の各ＤＮＡは、広範囲のプロモー ター活性をカバーし該細胞中で機能する一連の各プロモーターの制御下にある。 また本発明のこの方法において、全Ｆ１までとかつこれを含むＦ１の一部をコ ードするＤＮＡは、原核生物または真核生物から得られ、かつ該生物に対してれ は同種または異種でもよい。上記の具体的なＤＮＡは、またこの方法において便 利に使用される。 図面の簡単な説明 図１。大腸菌（E．coli）中の細胞性［ＡＴＰ］／［ＡＤＰ］比を調節するた めに作成されたプラスミドの線状表示（サイズの拡大比率は一定ではない）。 図２。バッチ培養の大腸菌（E．coli）の増殖に及ぼすＦ１−ＡＴＰアーゼ活 性の誘導の影響。細胞は、グルコース（０．４ｇ／ｌ）、アンピシリン（０．１ ｇ／ｌ）、および記載の濃度のインデューサーＩＰＴＧを補足した最小培地中で １０世代を超えて増殖させた。 図３。ＡＴＰとＡＤＰの細胞内濃度（任意の単位で表した濃度）、および［Ａ ＴＰ］／［ＡＤＰ］比に及ぼすＡＴＰアーゼ発現の影響。 図４。解糖系フラックスに及ぼすＡＴＰアーゼ発現の増加の影響。 発明の詳細な説明 生きている細胞の多くの生合成反応（同化）は、自由エネルギー（ＡＴＰ）の 供給を必要とし、これは一連の分解反応（異化）を通して生成される。好気性細 胞では、ＡＴＰ合成に２つの経路がある：１）基質レベルのリン酸化では、エネ ルギーリッチなホスホリル基が、高エネルギー中間体から直接ＡＤＰに転移する 、そして２）酸化的リン酸化では、エネルギー源を酸化することにより自由エネ ルギーがまず酸化還元自由エネルギーに変換され、次に呼吸によりプロトン濃度 勾配に変換され、最後にプロトン濃度勾配はＨ⁺−ＡＴＰアーゼにより使用され て、ＡＤＰと無機リン酸からＡＴＰ合成が開始される。他の場合（例えば、嫌気 性増殖）では、第１の経路（基質レベルのリン酸化）しかなく、これがＡＴＰ合 成に使用される。この１つの例は、ホモ乳酸ＬＡＢであり、乳糖が解糖系を介し て乳酸に変換され、これが細胞から排出され、増殖培地（通常、乳製品）のｐＨ を低下させる。ＡＴＰ生成については、ホモ乳酸発酵は非常に非効率的なプロセ スであり、基質レベルのリン酸化を介して１モルの乳糖から４モルのＡＴＰしか 産生されない。 同化性（ＡＴＰ消費性）および異化性（ＡＴＰ産生性）フラックスは、生きて いる細胞では通常よくバランスしており、従って正常な増殖条件下の野生型細胞 では、異化性フラックスは、同化性フラックスと釣り合っている。例えば細胞内 でＡＴＰを加水分解する反応が導入され、細胞のエネルギー状態（すなわち、［ ＡＴＰ］／［ＡＤＰ］比）が低下すると、異化が増加するかまたは同化（増殖） が低下して、消費速度を産生速度と等しくなるようになる。これらの２つのどち らの場合が起きるかは、まず、細胞の増殖速度が同化により制限されるかまたは 異化により制限されるか（すなわち、まず細胞内でエネルギーが過剰にあるかま たは不足しているか）に依存する。エネルギーが不足している場合は、同化反応 の速度は異化により制限され、これらの反応は細胞内のエネルギー状態の変化に 感受性になるであろう。従ってＡＴＰ加水分解反応を導入すると、細胞の増殖速 度に影響を与える可能性が高い。一方、もしエネルギーが過剰な場合は、増殖速 度は主に同化反応により制限され、同化速度はエネルギー状態の低下に非感受性 となるが、低い［ＡＴＰ］／［ＡＤＰ］比では生成物阻害が低下するため、異化 速度は上昇するかも知れない。 インビトロでは、Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼ複合体のＦ１部分が、ＡＴＰアーゼ活性 を有することが証明されている（前記参照）。しかしこれまで誰も、Ｆ１複合体 を使用して解糖系フラックスを刺激することはせず、またはＦ１複合体が完全な 細胞中でＡＴＰを加水分解できることを証明していない。確かに我々が最初に、 サブユニットα、γ、βおよびεの遺伝子からなるＦ１複合体の過剰発現を試み た時は、最大に誘導したｔａｃプロモーターからかつ非常に高コピー数のベクタ ー（ｐＵＣ１８由来）で転写した時でさえ、大腸菌（E．coli）の増殖に対して 実質的に何の影響もなかった。大腸菌（E．coli）中の遺伝子の発現についての 当業者は、この組合せはこの細菌について存在する最も効率的な発現系の１つで あることは理解できるであろう。 次に我々は、サブユニットの他の組合せがより強力であるかどうかを調べるた めに、Ｆ１複合体のサブユニットの異なる組合せを発現させることにした。大腸 菌（E．coli）からの細菌性Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰアーゼ複合体のＦ１部分をコード する遺伝子の種々の組合せを含有するプラスミドを作成した。種々の濃度のイン デューサーで誘導性（ｌａｃ−型）プロモーターから、または異なるプロモータ ー活性の一連の構成性プロモーターから、遺伝子を発現させた。これらのプラス ミドは、細菌細胞に導入されると、種々のレベルのＡＴＰアーゼを発現するはず である。プラスミド上にどこにＦ１遺伝子が存在するかおよび発現を指令するプ ロモーターの強度に依存して、我々は、これらのプラスミドを有する細胞の増殖 の種々の程度の阻害を観察した。驚くべきことに、ベータサブユニット単独およ びイプシロンサブユニットと組合せた時には、完全なＦ１複合体よりインビボで はるかに活性が高かった。 この研究の目的は、［ＡＴＰ］／［ＡＤＰ］比に反映される細胞のエネルギー 状態に影響を与えることである。従って我々は、種々の活性のＦ１−ＡＴＰａｓ ｅを発現する増殖している細胞中のＡＴＰとＡＤＰの細胞内濃度を測定した。Ａ ＴＰ濃度は確かに、ＡＴＰアーゼ活性の上昇とともにわずかに低下し、ＡＤＰ濃 度は上昇し、従って［ＡＴＰ］／［ＡＤＰ］比は低下した（予測されるように、 ＡＴＰ濃度への影響は、ＡＤＰ濃度に対する影響より小さい、前記参照）。我々 はまた、種々のレベルＡＴＰアーゼ活性を有する細胞を介する解糖系フラックス を計算した。我々は、最大の解糖系フラックスを与える一定の（最適の）ＡＴＰ アーゼ活性になるまで、まずＡＴＰアーゼ活性の発現の増加とともに解糖系経路 を介するフラックスが刺激されることを見いだした。ＡＴＰアーゼ発現をさらに 増加させると、細胞の増殖に対するＡＴＰアーゼ活性の二次的影響のために、解 糖系フラックスが低下した。これは、遺伝子を単に過剰発現するだけでなく、遺 伝子発現の最適化が必要であることを強調している。 例１ 誘導性プロモーターを使用する大腸菌（E．coli）中のＡＴＰ加水分解と解糖系 フラックスの増強 制限酵素であるＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、ウシ小腸ホスファターゼ（ＣＩＰ） はファルマシア（Pharmacia）から得た。 ＤＮＡ単離、制限酵素による切断、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴ ＴＰの存在下でのＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる粘性ＤＮＡ末端の充填、５’Ｄ ＮＡ末端からリン酸基を除去するためのウシ小腸ホスファターゼによる処理、お よびＤＮＡ断片の結合は、マニアティス（Maniatis）ら（１９８２）が記載した 標準的方法により行う。 ＡＴＰとＡＤＰの抽出と測定 ０．９mlの細胞培養物を０．９mlの（８０℃）フェノール（１０mMトリス、１ mM ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８で平衡化した）を混合し、直ちに１０秒間激しくボルテ ックス混合した。室温で１時間後、試料を再度１０秒間ボルテックス混合し、２ つの相を、１４０００ｒｐｍで１５分遠心して分離し、次に水相中の残存フェノ ールを、１部のクロロホルムで抽出して除去した。次にルシフェリン−ルシフェ ラーゼＡＴＰモニタリングキット（エルケービー（ＬＫＢ）から得られ、その薦 めるように使用したが、３mMのホスホエノールピルビン酸を加えた）を使用して 、ＡＴＰとＡＤＰ濃度を測定した。［ＡＴＰ］をまず測定した。次に同じ試料中 のＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼを加えてＡＴＰに変換し、［ＡＤＰ］を発光の 同時増加として記録した。 大腸菌（E．coli）ａｔｐ遺伝子の組合せを有するプラスミドの作成 大腸菌（E．coli）中でＡＴＰアーゼ活性を発現するために、Ｆ１サブユニッ トをコードする大腸菌（E．coli）遺伝子の以下の組合せを選択した：１．ａｔ ｐＡＧＤＣ（サブユニットα、γ、β、ε）、２．ａｔｐＡＧＤ（サブユニット α、γ、β）、３．ａｔｐＤＣ（サブユニットβ、ε）、および４．ａｔｐＤ（ サブユニットβのみ）。 ｐＵＣ１９へのａｔｐ遺伝子を有する断片のクローニング 全ａｔｐオペレロンを有するプラスミドｐＢＪＣ９１７（フォン・メエンブル グ・ケー（von Meyenburg，K）ら、１９８４）を、 １）制限酵素ＤｒａIIIで切断し、ａｔｐＡＧＤＣ遺伝子を含有する５００９塩 基対のＤＮＡ断片を単離した； ２）制限酵素ＤｒａIIIとＴｔｈ１１１Ｉで切断し、ａｔｐＡＧＤ遺伝子を含有 する４１０６塩基対のＤＮＡ断片を単離した； ３）制限酵素ＤｒａIIIとＳａｃIIで切断し、ａｔｐＤＣ遺伝子を含有する２３ ６４塩基対のＤＮＡ断片を単離した； ４）制限酵素ＡｖａＩとＴｔｈ１１１Ｉで切断し、ａｔｐＤ遺伝子を含有する１ ４７２塩基対のＤＮＡ断片を単離した。 ４つのすべての場合で、次に断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末 端を作成し、次に断片を、ＳｍａＩで切断しＣＩＰで処理したクローニングベク ターｐＵＣ１９（ヤニッシュ−ペロン（Yanisch-Perron）ら、１９８５）中に結 合させた。 ４つの結合混合物を大腸菌（E．coli）ＪＭ１０５株（ヤニッシュ−ペロン（Y anisch-Perron）ら、１９８５）中に形質転換し、形質転換混合物を、１００μ ｇ/mlのアンピシリンおよび７５μｇ/mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−インド リル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含有するＬＢ（ルリア−ベルタニ （Luria-Bertani）ブロス；マニアティス（Maniatis）ら、１９８２）プレート 上に広げた。この株のバックグランド（ＪＭ１０５）で、ｐＵＣ１９を再結合し て形成されるプラスミドは青いコロニーを与え、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に挿 入された外来ＤＮＡ断片を有するプラスミドは、白色コロニーを与える。従って ４つの形質転換からの多くの白色コロニーを、取り上げてさらに分析した：プラ スミドＤＮＡを単離し、種々の制限酵素で切断して分析した。ｐＵＣ１９のＳｍ ａＩ部位に挿入された所望の断片を有する４つのシリーズのそれぞれからクロー ンを正しい配向で同定した。これらの４つのプラスミドを、プラスミドが運搬す る特異的なａｔｐ遺伝子を参照して、それぞれ以下のように命名した：ｐＡＴＰ −ＡＧＤＣ、ｐＡＴＰ−ＡＧＤ、ｐＡＴＰ−ＤＣおよびｐＡＴＰ−Ｄ。 誘導性（ｔａｃ）プロモーターの制御下のａｔｐ遺伝子の組合せのクローニング ＡＴＰアーゼ活性の発現を制御することができるように、我々は、発現ベクタ ーｐＴＴＱ１８（スタルク（Starck）、１９８７）を選択した。このベクターは 、ｐＵＣ１８（ヤニッシュ−ペロン（Yanisch-Perron）ら、１９８５）の誘導体 であり、ｔａｃプロモーターと乳糖レプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）を有する。 ｔａｃプロモーターのすぐ下流に、ｔａｃプロモーターから発現されるように遺 伝子を挿入することができる複クローニング部位（ＭＣＳ；ｐＵＣ１８からのポ リリンカー）がある。ｔａｃプロモーターは、ｌａｃ型、すなわち、乳糖レプレ ッサーにより抑制され、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ） により誘導することができる。 ４つのプラスミドｐＡＴＰ−ＡＧＤＣ、ｐＡＴＰ−ＡＧＤ、ｐＡＴＰ−ＤＣお よびｐＡＴＰ−ＤをＫｐｎＩとＸｂａＩで切断すると、それぞれ４つのＤＮＡ断 片、５０２３、４１２０、２３７８、および１４８６が得られた。精製後、断片 を、ＫｐｎＩとＸｂａＩで切断したクローニングベクターｐＴＴＱ１８（図１を 参照）に結合させた。結合混合物を大腸菌（E．coli）Ｋ−１２ ＭＣ１０００ （カサバダンとコーエン（Casabadan and Cohen）、１９８０）中に形質転換し 、形質転換混合物を、１００μｇ/mlのアンピシリンを含有するＬＢプレートに 広げた。従って４つの形質転換体から多くのコロニーを取り上げてさらに分析し た：プラスミドＤＮＡを単離し、種々の制限酵素で切断して分析した。正しい配 向にｐＴＴＱ１８のＭＣＳ中に挿入された所望の断片を有する４つのシリーズの それぞれからクローンを単離した。これらの４つのプラスミドは、プラスミドが 運搬する特異的なａｔｐ遺伝子およびその発現に使用されるｔａｃプロモーター を参照して、それぞれ以下のように命名した：ｐＴＡＣ−ＡＧＤＣ、ｐＴＡＣ− ＡＧＤ、ｐＴＡＣ−ＤＣおよびｐＴＡＣ−Ｄ。以後の生理学的試験のために、プ ラスミドを大腸菌（E．coli）Ｋ−１２株中に形質転換し、本研究室での生理学 的実験のために日常的に使用した。これらの４つのプラスミドを有するＬＭ３１ １８株の対応する名前は、それぞれＰＪ４３３２、ＰＪ４３３３、ＰＪ４３３５ およびＰＪ４３３４である。 プレート上の大腸菌（E．coli）の増殖に及ぼすＡＴＰａｓｅ活性の誘導の影響 ４つのプラスミドを含有する株を、ｔａｃプロモーターから最大の発現を与え る、アンピシリン（１００μｇ/ml）と１mMのＩＰＴＧを含有するＬＢプレート 上に画線した。表１は、４つの株の応答の仕方を示す：プラスミドｐＡＴＰ−Ａ Ｇ ＤＣを含有する株（これは、４つのサブユニット、α、γ、βおよびεの遺伝子 を含有する）は、１mMのＩＰＴＧの存在下でも増殖はわずかしか影響されなかっ た。他の３つのプラスミド（ｐＴＡＣ−ＡＧＤ、ｐＴＡＣ−ＤＣおよびｐＴＡＣ −Ｄ）は、１mMＩＰＴＧの存在下で大きな増殖阻害を引き起こし、コロニーは見 えなかった。ＩＰＴＧの中問的濃度（０．０１mMと０．１mM）では、プラスミド は、宿主細胞の増殖を異なる程度に影響を与えた：ｐＴＡＣ−ＡＧＤは最も活性 が強く、０．０１mMのＩＰＴＧ（プラスミドｐＴＡＣ−ＤＣではほんのわずかに 阻害し、ｐＴＡＣ−Ｄでは株の阻害はなかった濃度）ですでに強い増殖阻害が発 生した。０．１ｍＭのＩＰＴＧでは、ｐＴＡＣ−ＡＧＤを有する株についてはコ ロニーはほとんど見えず、プラスミドｐＴＡＣ−ＤＣは、強い増殖阻害を引き起 こし、ｐＴＡＣ−Ｄの影響は有意であったが小さかった。 表１ ++++＝正常なコロニーサイズ；+++＝わずかに阻害；++＝正常なサイズの１／２ ；+＝正常なサイズの１／１０；-＝増殖無し 上記４つのプラスミドからのＡＴＰアーゼ発現の影響も、大腸菌（E．coli） 変異体ＬＭ３１１５で試験し、ここでは染色体上の全ａｔｐオペロンが欠失して いるが、ＬＢ培地上でほとんど野生型の増殖速度で増殖する。この株を４つのプ ラスミドで形質転換して、我々は、ＩＰＴＧ濃度の関数としてＬＢプレート上で 同様の増殖阻害パターンを観察した。これは、ＡＴＰアーゼ発現の影響は、正常 なａｔｐオペロンの存在とは無関係であることを示す。 液体培養の大腸菌（E．coli）の増殖に及ぼすＡＴＰアーゼ活性の誘導の影響 液体培養で増殖させた細胞を用いて、ＡＴＰアーゼの誘導の影響も調べた。この ために我々は、プラスミドｐＴＡＣ−ＡＧＤは、大腸菌（E．coli）の増殖に 対する阻害作用に関して最も活性が強いようなので、このプラスミドを有するＰ Ｊ４３３３株を選択した。図２は、限界濃度のグルコース（０．４g/l）とアン ピシリン（０．１g/l）で補足した最小培地中の、ＩＰＴＧ無しおよび増加する 濃度のＩＰＴＧの存在下でのＰＪ４３３３の増殖を示す。我々は、ＩＰＴＧの量 を約３０μＭまで増加させても、この株の増殖速度は実質的に一定（約１０％以 内）であることを観察した。４０μＭのＩＰＴＧを超える高い濃度では、プレー ト上での実験と一致して（前記）細胞の増殖はわずかに阻害された。 しかし、影響を受けたのは、各培養物中に含有されたグルコースの限定量から 得られる細胞の最終密度であった：細胞中で発現されるＡＴＰアーゼが多いほど 、細胞の収率は低かった。明らかにグルコースをバイオマスに変換することに関 して細胞は非経済的になっており、すなわち細胞を合成するのに細胞はより多く のグルコースを消費している。もしこれがＡＴＰアーゼ活性の発現のせいである なら、細胞のエネルギー状態への影響が予想される。従って我々は、ＡＴＰアー ゼ活性の異なる発現レベルで増殖している細胞中のＡＴＰとＡＤＰの濃度を測定 した。 ＡＴＰアーゼの発現が増加すると、確かに細胞内ＡＴＰ濃度は徐々に低下しＡ ＤＰ濃度は上昇した；従って、ＡＴＰアーゼの発現増加に伴い［ＡＴＰ］／［Ａ ＤＰ】比は低下し、これはグルコース消費の増加が、ＡＴＰからＡＤＰへの変換 の増加の結果であることを意味している（図３を参照）。細胞を介するグルコー スの実際のフラックス（Ｊgluc、mmolグルコース／ｇ細胞乾燥重量／時間）の値 は、ＡＴＰアーゼ活性の増加とともに細胞の性能が上昇するかどうかを示すため 、この値もまた興味がある。Ｊglucは、収率Ｙ（ｇ細胞乾燥重量／molグルコー ス）と培養物の比増殖速度μ（１／時間）から計算することができる： Ｊgluc＝μ／Ｙ 図４は、ＡＴＰアーゼの活性の上昇とともにいかにグルコースのフラックスが 変化したかを示す：最大値（３０μＭ ＩＰＴＧ）に達するまで、ＡＴＰアーゼ 発現の増加とともに、解糖系フラックスは徐々に増加した。ＡＴＰアーゼ発現が さらにその増加すると、グルコースフラックスにわずかに陰性の影響があった。 ４０μＭのＩＰＴＧの存在下で増殖させた培養物では増殖速度は低かったため、 これはおそらく、細胞のエネルギー状態が低くなり、その結果一部の同化反応に 陰性の影響を及ぼしたのであろう。 細菌のＨ⁺−ＡＴＰアーゼのＦ１部分のサブユニットの発現は、細菌細胞のエ ネルギー状態を低下させる。これは、ＡＴＰからＡＤＰとＰｉへの加水分解のた めである。ＡＴＰアーゼ活性の発現は、低レベルの発現では大腸菌（E．coli） の増殖速度にあまり影響を与えないが、基質がバイオマスに変換される効率は大 きく低下した。ここで使用したセットの条件下では、ＡＴＰａｓｅ活性の発現は 、細胞が外因性グルコースを消費する速度に刺激作用を有する。 例２ 大腸菌（E．coli）中の構成性プロモーターからのＦ１−ＡＴＰアーゼ活性の発 現 例１で我々は、大腸菌（E．coli）中のＦ１ ＡＴＰアーゼサブユニットの発 現を調節するためにｌａｃ型プロモーター系を使用した。しかし、例えば工業的 バイオリアクター中の遺伝子発現の最適化または発酵食品での使用のためには、 ｌａｃ型プロモーターの使用は必ずしも現実的ではない。この例では我々は、大 腸菌（E．coli）に由来するａｔｐＡＧＤ遺伝子の発現を制御するために、一連 の異なる強度の構成性プロモーターを使用して、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ発現の最適 化を例示する。構成性プロモーター（ＣＰプロモーター）は、我々の同時係属Ｐ ＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＤＫ９７／００３４２に記載のように、大腸菌（E．coli ）とエル・ラクチス（L．lactis）のシャトルベクターｐＡＫ８０（イスラエル セン（Israelsen）ら、１９９５）上ですでにクローン化されている人工プロモ ーターのライブラリーから選択した。ｐＡＫ８０の選択されたプラスミド誘導体 は、ｐＣＰ３４、ｐＣＰ４１およびＣＰ４４（ＣＰＸクローニングベクター）で ある。まず２つのＢａｍＨＩ部位がａｔｐＡＧＤ断片の両側に位置するように、 ｐＴＡＣ−ＡＧＤ（例１から）のａｔｐＡＧＤ断片を、ポリリンカー中にサブク ローニングした。次にこのＢａｍＨＩ断片を、プラスミドｐＣＰ３４、ｐＣＰ４ １、およびＣｐ４４のＣＰプロモーターの下流のユニークなＢａｍＨＩ部位にク ローン化して、プラスミドｐＣＰ３４：：ａｔｐＡＧＤ、ｐＣＰ３４：：２ａｔ ｐＡＧＤ、ｐＣＰ４１：：ａｔｐＡＧＤ、およびＣＰ４４：：ａｔｐＡＧＤ（こ こで、ｐＣＰ３４：：２ａｔｐＡＧＤは、２つのａｔｐＡＧＤを縦に含有する） を得た。 次に株を、基本的に例１に記載したように２００μｇ/mlのエリスロマイシン を補足したグルコース最小培地中での増殖速度、増殖収率、および解糖系フラッ クスに関して性状解析した（表２を参照）。 発現レベルが上昇すると、Ｆ１−ＡＴＰアーゼサブユニットの発現は、増殖速 度に対してわずかに陰性の影響を与えた。増殖収率に対する影響はさらに強く、 発現レベルが最大の時、増殖収率は初期値の４０％まで低下した。ＡＴＰアーゼ の最大の発現レベルで解糖系フラックスは７０％刺激され、この発現レベルで増 殖速度は３０％低下した。 表２．大腸菌（E．coli）中の共役していないＦ１−ＡＴＰアーゼ活性（大腸菌 （E．coli）α、γ、βサブユニット）の発現の影響例３ エル・ラクチス（L．lactis）中の構成性プロモーターからの大腸菌（E．coli） Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ活性の発現 大腸菌（E．coli）Ｆ１−ＡＴＰアーゼサブユニットを種々の程度に発現する 例２からのプラスミドはまた、エル・ラクチス（L．Iactis）中で複製すること ができ、従って大腸菌（E．coli）Ｆ１−ＡＴＰアーゼサブユニットがエル・ラ クチス（L．lactis）中のＡＴＰを加水分解するために使用することができるか どうかを試験するために使用することができる。 プラスミドｐＣＰ３４：：ａｔｐＡＧＤ、ｐＣＰ３４：：２ａｔｐＡＧＤ、お よびｐＣＰ４１：：ａｔｐＡＧＤを、本研究室で生理学的実験で日常的に使用し ているエル・ラクチス（L．lactis）亜腫クレモリス（cremoris）株中に形質転 換した。さらに我々は、正しい制御株を得るために、各ベクターｐＣＰ３４とｐ ＣＰ４１を形質転換した。次に、得られた形質転換体を、各ベクターｐＣＰ３４ とｐＣＰ４１と比較して、制限濃度のグルコース（０．１％）を補足した規定培 地（ＳＡ培地）中で種々の培養物を増殖させて、増殖速度、増殖収率および解糖 系フラックスについて性状解析した。 表３．エル・ラクチス（L．lactis）中の大腸菌（E．coli）Ｆ１−ＡＴＰアーゼ 活性の発現 結果は、プラスミドｐＣＰ３４：：ａｔｐＡＧＤとｐＣＰ３４：：２ａｔｐＡ ＧＤは、増殖収率と解糖系フラックスに少し影響を与えたが、これらのプラスミ ドは、大腸菌（E．coli）と比較してエル・ラクチス（L．lactis）中でははるか に効率が悪かった。これはおそらく、エル・ラクチス（L．lactis）（５−１０ ）中でのｐＡＫ８０ベクターの低コピー数のため、および大腸菌（E．coli）由 来の３つの個別のａｔｐ遺伝子の翻訳効率の差のために、エル・ラクチス（L．l actis）中の大腸菌（E．coli）ＡＴＰアーゼサブユニットまたはこれらの一部の 低発現の結果である。プラスミドｐＣＰ４１：：ａｔｐＡＧＤはまた、増殖収率 が低く、この場合も非共役ＡＴＰ加水分解が起きていることを示していた。しか し、ｐＣＰ４１：：ａｔｐＡＧＤプラスミドは、増殖速度に対して比較的強 い阻害作用があり、従って解糖系フラックスはこのプラスミドでは増加しなかっ た。大腸菌（E．coli）ＡＴＰａｓｅサブユニットの異種発現は、ＡＴＰ加水分 解以外の作用（例えば、エル・ラクチス（L．lactis）Ｆ１Ｆ０ Ｈ⁺−ＡＴＰア ーゼ複合体の機能の妨害）により増殖阻害を起こすことが可能である。 例４ エル・ラクチス（L．lactis）中のエル・ラクチス（L．lactis）Ｆ１−ＡＴＰａ ｓｅサブユニットβとεの発現 上記例において我々は、エル・ラクチス（L．lactis）中の大腸菌（E．coli） からのＦｉ−ＡＴＰアーゼの発現は、解糖系フラックスをわずかしか刺激しない ことを証明した。大腸菌（E．coli）ＡＴＰアーゼサブユニットの異種発現が、 ＡＴＰ加水分解以外の影響、例えばエル・ラクチス（L．lactis）Ｆ１Ｆ０Ｈ⁺− ＡＴＰアーゼ複合体の機能を妨害することにより、増殖を阻害した可能性がある 。本例において我々は、大腸菌（E．coli）中で発現した時サブユニットの有効 な組合せと思われたため、エル・ラクチス（L．lactis）中でラクチス（lactis ）Ｆｉ−ＡＴＰアーゼサブユニットβとεを発現した（例１を参照）。エル・ラ クチス（L．lactis）亜腫クレモリス（cremoris）のａｔｐＤＣ_L1c遺伝子（配列 番号１）を、２．５kbのＨｉｎｄIII断片上で、大腸菌（E．coli）Ｋ−１２ Ｂ ＯＥ２７０株中に標準的クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ上のＨｉ ｎｄIII制限部位にクローン化した。次にａｔｐＤＣ_L1c遺伝子を２．５kｂのＨ ｉｎｄIII断片上で切断し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化した５つの発現ベクタ ー、ｐＣＰ３２、ｐＣＰ３４、ｐＣＰ３７、ｐＣＰ４１およびｐＣＰ４４にクロ ーン化して、それぞれプラスミドｐＣＰ３２：：ａｔｐＤＣ_L1c、ｐＣＰ３４： ：ａｔｐＤＣ_L1c、ｐＣＰ３７：：ａｔｐＤＣ_L1c、ｐＣＰ４１：：ａｔｐＤＣ_{L1 c} およびｐＣＰ４４：：ａｔｐＤＣ_L1cが得られ、ここでＣＰプロモーターの下流 のｌａｃＬＭ遺伝子はａｔｐＤＣ_L1c遺伝子で置換されている。これらのプラス ミドは、エル・ラクチス（L．lactis）Ｆｉ−ＡＴＰアーゼサブユニットβとε を種々の程度に発現するはずである。次にこのプラスミドを、これらのベクター の有するエリスロマイシン耐性について選択してＭＧ１３６３に形質転換した。 次に、作成体がエル・ラクチス（L．lactis）中でＡＴＰをＡＤＰ に変換したがどうかを試験するために実験を行なった。異なる作成体を有する株 を、５μｇ/mlのエリスロマイシンを補足したＧＭ１７培地で増殖させた。プラ スミドは、培養物の増殖速度に大きな影響を与えず、各ベクター対照プラスミド とほぼ同じ増殖速度を維持した。しかしバイオマスの収率は、すべての培養物に ついて最大１７％低下し、これは培養物が非共役ＡＴＰアーゼ活性を発現したこ とを証明している（表４を参照）。 表４．３０℃および初期ｐＨ６．７でエル・ラクチス（L．lactis）による酸産 生に及ぼすエル・ラクチス（L．lactis）βとεサブユニットの発現の影響*各値は、３〜４つの独立の培養物の平均である。酸産生は、ｐＨの変化から計 算し、産生されたバイオマスにより標準化した。 これらの実験で使用したＧＭ１７増殖培地は、過剰のグルコース（１％）を含 有し、増殖培地のｐＨが約ｐＨ４．３より低くなった時にのみ増殖は停止する。 これはある程度、乳酸菌がチーズおよびヨーグルト製造時に経験する状態を模倣 している。この培地で、培養物の最終細胞マスで表示した増殖収率は、これらの 培養物による酸産生を反映する。 これらの培養物において、Ｆｉ−ＡＴＰアーゼサブユニットの発現は、１．５ に等しい約ＯＤ６００で３倍増加する。これは、増殖曲線のこの時点で起きるこ とが証明されている、プラスミドコピー数の３倍の増幅の結果である。従って実 際は、Ｆｉ−ＡＴＰアーゼサブユニットを発現する影響は大きくなるかも知れな い。 この仮説を検定するために、我々は、ｐＨ５．９に調整したＧＭ１７培地のバ ッチ培養物中で、エル・ラクチス（L．lactis）Ｆｉ−ＡＴＰアーゼサブユニッ トβとεを発現する株の一部を増殖させた（表５を参照）。さらに増殖培地の温 度は、プラスミドコピー数に影響を与え、従ってＦｉ−ＡＴＰアーゼサブユニッ トの発現に影響を与えるかも知れない。従って実験は３７℃で行なった。 表５．３７℃および初期ｐＨ５．９でエル・ラクチス（L．lactis）による酸産 生に及ぼすエル・ラクチス（L．lactis）βとεサブユニットの発現の影響 明らかに、これらの増殖条件下でＦｉ−ＡＴＰアーゼ活性の影響ははるかに大 きかった：産生される酸の量は、プラスミドｐＣＰ３７：：ａｔｐＤＣ₁₁cを有 する株についてほとんど２倍増加した。 例５ エル・ラクチス（L．lactis）亜腫クレモリス（cremoris）中のエル・ラクチス （L．lactis）亜腫クレモリス（cremoris）からのＦｉ−ＡＴＰアーゼサブユニ ットα、γ、およびβの発現 例４において、エル・ラクチス（L．lactis）Ｆｉ−ＡＴＰアーゼのβおよび εサブユニットのみが、エル・ラクチス（L．lactis）中で発現された。しかし 大腸菌（E．coli）を用いる実験から（例１）、我々はサブユニットα、γ、お よびβの同時発現がより強力な組合せであることを知っており、これはエル・ラ クチス（L．lactis）の場合も同じであろう。ラクチス（lactis）中の解糖系フ ラックスと酸産生の同じ強い刺激を得るために、例４に記載のベクターと類似の １セットのベクターを作成し、ここでサブユニットα、γ、およびβ（配列番号 １）をコードするエル・ラクチス（L．lactis）から得られるａｔｐＡＧＤ_L1c遺 伝子を、異なる活性を有するＣＰプロモーターから発現した。エル・ラクチス（ L．lactis）からのａｔｐＡＧＤ_L1c遺伝子を、２．５kbのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ 断片上で、５つのベクター、ｐＣＰ３２、ｐＣＰ３４、ｐＣＰ３７、ｐＣＰ４１ およびｐＣＰ４４にクローン化して、それぞれプラスミドｐＣＰ３２：：ａｔＰ ＡＧＤ_L1c、ｐＣＰ３４：：ａｔｐＡＧＤ_L1c、ｐＣＰ３７：：ａｔｐＡＧＤ_L1c 、ｐＣＰ４１：：ａｔｐＡＧＤ_L1cおよびｐＣＰ４４：：ａｔｐＡＧＤ_L1cが得ら れ、ここでＣＰプロモーターの下流のｌａｃＬＭ遺伝子はａｔｐＡＧＤ_L1c遺伝 子で置換されている。これらのプラスミドは、エル・ラクチス（L．lactis）Ｆ ｉ−ＡＴＰａｓｅサブユニットα、γ、およびβを種々の程度に発現するはずで ある。このプラスミドを、これらのベクターの有するエリスロマイシン耐性につ いて選択してＭＧ１３６３に形質転換した。次に、作成体がエル・ラクチス（L ．lactis）中でＡＴＰ加水分解に有効であるかどうか、そして解糖系フラックス がどの程度増強されるかを証明するために、エリスロマイシンを補足したＧＭ１ ７培地中で５つの異なる作成体を増殖させ、増殖速度、ＡＴＰとＡＤＰ濃度、バ イオマス収率および酸産生速度を測定して実験を行なった。 例６ エル・ラクチス（L．lactis）亜腫ラクチス（lactis）中のエル・ラクチス（L.l actis）亜腫ラクチス（lactis）からのＦｉ−ＡＴＰアーゼサブユニットの発現 前記例３〜５において、我々は、エル・ラクチス（L．lactis）亜腫クレモリ ス（cremoris）ＭＧ１３６３を使用した。この株はプラスミドを含まず、我々の 生理学的研究の単純なモデル生物として日常的に使用される。しかし亜腫ラクチ ス（lactis）に属する株は、チーズ生産において重要である。従って我々は、エ ル・ラクチス（L．lactis）亜腫ラクチス（lactis）からａｔｐＡＧＤ_L11遺伝子 をクローン化し配列決定した（配列番号６）。次にａｔｐＡＧＤ_L11遺伝子を有 する４．２kbの断片を、５つのベクター、ｐＣＰ３２、ｐＣＰ３４、ｐＣＰ３７ 、ｐＣＰ４１およびｐＣＰ４４にクローン化して、それぞれプラスミドｐＣＰ３ ２：：ａｔｐＡＧＤ_L11 、ｐＣＰ３４：：ａｔｐＡＧＤ_L11、ｐＣＰ３ ７：：ａｔＰＡＧＤ_L11、ｐＣＰ４１：：ａｔｐＡＧＤ_L11およびｐＣＰ４４：： ａｔｐＡＧＤ_L11が得られた。これらのプラスミドを次に、例３に記載のように エル・ラクチス（L．lactis）亜腫ラクチス（lactis）中に形質転換した。Ｆｉ −ＡＴＰアーゼサブユニットα、ν、およびβの異なる発現レベルを有する得ら れた株を使用して、例１〜５に記載したように、エル・ラクチス（L．lactis） 亜腫ラクチス（lactis）の増殖収率、増殖速度、解糖系フラックス、および細胞 エネルギー状態に及ぼすその影響を性状解析した。 例７ エス・サーモフィルス（S．thermophilus）ＳＴ３中のエス・サーモフィルス（S ．thermophilus）ＳＴ３からのＦｉ−ＡＴＰアーゼサブユニットの発現 前記例３〜６において、我々は、ラクトコッカス属（Lactococcus）の株を使 用した。これらの株はチーズ生産において重要である。ヨーグルト生産のスター ター培養物として、酪農産業ではしばしばエス・サーモフィルス（S．thermophi lus）の株を使用する。従って我々は、エス・サーモフィルス（S．thermophilus ）ＳＴ３株からのａｔｐＡＧＤ_st遺伝子をクローン化し配列決定した（配列番号 １０）。次にａｔｐＡＧＤ_st遺伝子を有する４．２kbの断片を、５つのベクター 、ｐＣＰ３２、ｐＣＰ３４、ｐＣＰ３７、ｐＣＰ４１およびｐＣＰ４４にクロー ン化して、それぞれプラスミドｐＣＰ３２：：ａｔｐＡＧＤ_st、ｐＣＰ３４：： ａｔｐＡＧＤ_st、ｐＣＰ３７：：ａｔｐＡＧＤ_st、ｐＣＰ４１：：ａｔｐＡＧＤ ｓ_tおよびｐＣＰ４４：：ａｔｐＡＧＤ_stが得られた。これらのプラスミドを次 に、例３に記載のようにエス・サーモフィルス（S．thermophilus）ＳＴ３株中 に形質転換した。Ｆｉ−ＡＴＰａｓｅサブユニットα、ν、およびβの異なる発 現レベルを有する得られた株を使用して、前記例に記載したように、エス・サー モフィルス（S．thermophilus）の増殖収率、増殖速度、解糖系フラックス、お よび細胞エネルギー状態に及ぼすその影響を性状解析した。 例８ サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）中のファフィア・ ロドジマ（Phaffia rhodozyma）からの端を切り取ったＦｉ−ＡＴＰアーゼβサ ブユニットの発現 本例において我々は、共役していないＦｉ−ＡＴＰアーゼ発現は、サッカロミ セス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）の酵母細胞中でＡＴＰを加水 分解するのに使用することができることを証明する。 ｃＤＮＡ断片を発現ベクターｐＹＥＳ２．０中にクローン化することにより、 ファフィア・ロドジマ（Phaffiar hodozyma）から単離した総ＲＮＡから、ｃＤ ＮＡ遺伝子ライブラリーを調製した。得られるプラスミドの１つであるｐＡＴＰ ｂｅｔａは、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）Ｗ３ ０１株中でａｄｅ⁺表現型を与え、これはＡＤＥ２遺伝子中に突然変異を有する 。クローンを配列決定すると、０．９kbの挿入体があり、これは２５４アミノ酸 のタンパク質（配列番号１４）をコードした。コードされたタンパク質は、エス ・セレビッシェ（S．cerevisiae）からのβサブユニットを含む他の生物（原核 生物および真核生物）からのＦｉ−ＡＴＰａｓｅβサブユニットのＣ−末端部分 に対して非常に高い相同性を有した（８６％の同一性）。 ＡＤＥ２の突然変異は、さらに下流のプリン代謝の中間体ＡＩＣＡＲ（これは 、通常はこの経路の２工程下流のＡＤＥ３により産生される）の欠乏を引き起こ す。ＡＩＣＡＲは、ＡＭＰとＧＭＰの新規生合成に必須であり、従ってＡＤＥ２ 変異体は、増殖培地中で別のプリン源を必要とする。しかし、ＡＩＣＡＲの合成 には別の経路があり、ヒスチジン生合成に関与する遺伝子の一部が関与する。こ れらの遺伝子は通常、補完のために使用される条件下では抑制されているが、Ｈ ＩＳ３遺伝子がプラスミドで導入される時、細胞がＡＩＣＡＲを産生し始めるた め、ＡＤＥ２突然変異を補完する。ＡＩＣＡＲはＡＴＰの前駆体であるため、Ａ ＴＰ（またはＡＤＰとＡＭＰのレベルの上昇）の欠如は、ＨＩＳ３遺伝子を脱抑 制するようにシグナルを与え、ＡＩＣＡＲを生成する（これは次にＡＴＰとなる ）。プリン生合成とヒスチジン生合成の問の交差経路制御が酵母で見つかってお り、転写因子ＢＡＳＩとＢＡＳ２が関与する。従ってプラスミドにより付与され るａｄｅ⁺表現型の妥当な説明は、プラスミドが細胞質中でＡＴＰの加水分解を 引き起こし、こうして細胞質中のアデニンヌクレオチドの濃度に影響を与える。 重要なことは、ｐＡＴＰｂｅｔａ上にコードされたファフィア・ロドジマ（Ph affia rhodozyma）からのこの端を切り取ったβサブユニットは、ＡＴＰ加水分 解の触媒部位をコードすると考えられるβサブユニットの領域を含有することで ある。βサブユニットのＮ−末端部分の端を切り取ることは、おそらくこのタン パク質がミトコンドリアには排出されなくなり、酵母細胞質内にとどまることを 意味する。 端を切り取ったβサブユニットｐＡＴＰｂｅｔａはｇａｌプロモーターから発 現され、すなわち、これはガラクトースで誘導することができる。このクローン によりコードされる端を切り取ったβサブユニットがＡＴＰ加水分解において活 性であるなら、増殖収率が低下するはずであり、かつ充分に高い発現レベルで増 殖阻害が観察されるはずである。端を切り取ったβサブユニットを発現する株お よび対照株（これは、ファフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma）からのＨＩ Ｓ３遺伝子を含有するプラスミドｐＨＩＳ３を含有した）を、エネルギー源とし てガラクトースを含有するプレート上に画線したが、これは端を切り取ったβサ ブユニットの最大の発現を与えるであろう。端を切り取ったβサブユニットを発 現する株の増殖は、ガラクトースの存在により強く阻害され、一方対照株は正常 に増殖した。対照として、２つの株の増殖を、βサブユニットの発現が抑制され る条件下で、エネルギー源としてグルコースを含有するプレートトでも比較する と、これらのプレート上で２つの株の増殖にほとんど差はなかった（表６を参照 ）。 次に生理学的研究のために、臭化エチジウムを用いる標準的処理により、２つ の株をＲｈｏ^-株（小さい突然変異、酸化的リン酸化に欠陥）に変換した。ガラ クトースで誘導すると、Ｒｈｏ^-バックグランド中の増殖阻害はより強くなり、 これは、増殖阻害の原因は、細胞質中の共役していないＡＴＰ加水分解であるこ とをさらに示している。 表６．ＳＣプレートトのエス・セレビッシェ（S．cerevisiae）中のファフィア ・ロドジマ（Phaffia rhodozyma）からの端を切り取ったＦｉ−ＡＴＰａｓｅβ サブユニットの発現の影響 ＡＴＰ／ＡＤＰ比および解糖系フラックスの刺激の程度およびエタノール生成 の変化を（実質的に前記例で記載のように）測定するために、かつファフィア・ ロドジマ（Phaffia rhodozyma）からの端を切り取ったβサブユニットが、酵母 細胞中でのＡＴＰからＡＤＰへの変換に関して活性であることを証明するために 、増殖実験を行なった。 例９． サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）中のトリコデルマ ・リーセイ（Trichoderma reesei）からのＦｉ−ＡＴＰａｓｅβサブユニットの 発現 本例で我々は、糸状菌トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）からの Ｆｉ−ＡＴＰａｓｅβサブユニットの発現が、サッカロミセス・セレビッシェ(S accharomyces cerevisiae)の生成物の生成を改良するのに使用できることを証明 する。 トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）からのＦｉ−ＡＴＰａｓｅβ サブユニット同族体をコードする遺伝子を、ｃＤＮＡライブラリーから単離し、 複数コピー発現ベクターｐＡＪ４０１中に挿入した。ＤＮＡ配列決定（配列番号 １６）により、クローン化した遺伝子は、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）（９１％の同一性）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces la ctis）（６０％）、およびサッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cere visiae）（６８％）からのβサブユニットと高い相同性を有することが明らかに なった。重要なことは、このβサブユニット中の最初の４３アミノ酸（これは、 タンパク質をミトコンドリアに排出するシグナルをコードする）は、ノイロスポ ラ・クラッサ（Neurospora crassa）のβサブユニットのＮ−末端部分と相同的 （５８％の同一性）であるが、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）のそれとは相同的ではなかった。従って、トリコデルマ・リーセイ （Trichoderma reesei）のβサブユニットは、サッカロミセス・セレビッシェ （Saccharomyces cerevisiae）中で発現される時、細胞質内にとどまっている可 能性がある。もしＡＴＰ加水分解が細胞質中で起きるなら、これらの場合に最も 効率的であるため、これは発酵が嫌気的に起きる場合には重要である。あるいは 、βサブユニットがミトコンドリア中に輸送される場合は、細胞質内にとどまる ようにβサブユニットを遺伝的に修飾することが有用かも知れない。 トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）のＦｉ−ＡＴＰａｓｅβサブ ユニット同族体をコードする遺伝子を、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccha romyces cerevisiae）株ＶＷ１ｂ（ＭＡＴ アルファ、ｌｅｕ２−３／１１２、 ｕｒａ３−５２、ｔｒｐｌ−２８９、ｈｉｓ３Ｄ１、ＭＡＬ２−８ｃ、ＳＵＣ２ ）中で発現した。トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）のβサブユニ ットの存在が、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）宿 主細胞の細胞質中でのＡＴＰの加水分解を引き起こしたがどうかを試験するため に、我々は、βサブユニットを発現する２つの株（ｐＡＴＰβ３４とｐＡＴＰβ ４４）の培養物およびベクタープラスミドｐＦＬ６０を有する株の培養物中の種 々の増殖条件下で、ＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰの細胞内濃度を測定した（表７ を参照）。 表７．エス・セレビッシェ（S．cerevisiae）中のＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ 濃度*に及ぼすティー・リーセイ（T．reesei）βサブユニットの発現の影響 *バーグマイヤー（Bergmeyer）に従う（１９８５） βサブユニットは、グルコースで増殖している指数増殖期の細胞中のＡＴＰ、 ＡＤＰおよびＡＭＰの濃度にはあまり影響を与えないようであった。この理由は おそらく、ＡＴＰ合成のホメオスタシス制御は、βサブユニットＦｉ−ＡＴＰア ーゼ活性により付与されるＡＴＰに対する余分の排出に追いつくことができるか らである。これらの培養物の増殖速度は、確かにＦｉ−ＡＴＰａｓｅ活性の存在 に影響を受けなかった（表７を参照）。しかし静止期培養では、βサブユニット を発現している培養物では対照に比較して、ＡＴＰの濃度は大きく低下した。こ の作用は嫌気的に増殖している培養物で最も強く、ＡＴＰは２〜３倍低下した。 これらの培養物において、ＡＴＰは酸化的リン酸化により形成されなければなら ず（嫌気的培養物の場合はこの可能性はない）、従ってこれらの細胞では非共役 ＡＴＰ加水分解の影響はより強くなる。 サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）中のＦｉ−ＡＴＰ ａｓｅβサブユニット同族体を発現する培養物の振盪フラスコ培養 容量比１／１．２５かつ攪拌無しで；５００mlの三角フラスコ中の４００mlの 増殖培地で磁気撹拌して、ミクロ好気的／嫌気的条件下で、振盪フラスコ培養を 行なった。増殖培地は、合成完全培地（ＳＣ−ｕｒａ＋０．５％Ｇ）に従って５ g/lのグルコースおよびアミノ酸および塩基を含有した。培養の間ＯＤ₆₀₀を追跡 した（ＯＤ６００＝１．０は、０．３g/l乾燥重量に等しい）。エタノールとグ ルコースをＨＰＬＣ（ウォーターズ（Waters）、シュガー−パック（Sugar-Pak ）またはアイシー−パック（IC-Pak）カラム）で測定した。エタノールの産生（ 細胞乾燥重量１ｇ当たりのエタノールのｇ数）を、表８に示す。 表８．エス・セレビッシェ（S．cerevisiae）中のエタノールとグルコースのフ ラックスに及ぼすティー・リーセイ（T．reesei）βサブユニットの発現の影響 これらのデータは、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisi ae）宿主細胞中で、ティー・リーセイ（T．reesei）Ｆｉ−ＡＴＰアーゼβサブ ユニットの存在により、グルコースならびにエタノールのフラックスの増加が起 きたことを示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１２年４月２１日（２０００．４．２１） 【補正内容】 本願明細書第４頁第２７〜２８行目、第５頁第４〜５行目、同頁第１７行目、 同頁第２８〜２９行目、同頁第２９行〜第６頁第１行目、第２９頁第４行目、第 ３１頁第２行目、及び第４５頁第１１行目に記載の「ラクトバシルス・ラクチス （Lactobacillus lactis）」を『ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lact is）』に補正すると共に、特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 『 請求の範囲 １．バイオマスまたは細胞からの所望の生成物の製造の改良法であって、他 の細胞代謝物または機能に大きな影響を与えることなく、ＡＴＰからＡＤＰへの 変換を誘導するために、該細胞中で共役していないＡＴＰアーゼ活性を発現し、 適切な基質とともに細胞をインキュベートして該バイオマスまたは生成物を製造 することを特徴とする、上記方法。 ２．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）、また はＡＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部を、細胞中で発現することを特徴とする、 請求の範囲第１項記載の方法。 ３．細胞は原核生物細胞である、請求の範囲第１項または第２項記載の方法 。 ４．細胞は、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ストレプトコッカス属（S treptococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトバシルス属（La ctobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、エシェリチア属（Escher ichia）、チモモナス属（Zymomonas）、バシルス属（Bacillus）およびシュード モナス属（Pseudomonas）に属する細菌からなる群から選択される、請求の範囲 第３項記載の方法。 ５．細胞は真核生物細胞である、請求の範囲第１項または第２項記載の方法 。 ６．細胞は酵母細胞である、請求の範囲第５項記載の方法。 ７．細胞は、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae） またはトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）に属する、請求の範囲第 ６項記載の方法。 ８．請求の範囲第１〜７項までのいずれか１項に記載の方法であって、細胞 は、Ｆ１または該細胞内で機能するプロモーターの制御下でＡＴＰアーゼ活性を 示すその一部をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換またはトラ ンスフェクションされ、該ＤＮＡは細胞内で発現される、上記方法。 ９．Ｆ１またはその一部をコードするＤＮＡは、細胞と同種である、請求の 範囲第８項記載の方法。 １０．Ｆ１またはその一部をコードするＤＮＡは、細胞と異種である、請求 の範囲第８項記載の方法。 １１．Ｆ１またはその一部をコードするＤＮＡは、原核生物から得られる、請 求の範囲第８〜１０項までのいずれか１項に記載の方法。 １２．請求の範囲第１１項記載の方法であって、Ｆ１またはその一部をコード するＤＮＡは、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトコッカス・ラクチス（Lact ococcus lactis）、またはストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcu s thermophilus）から得られ、かつＦ１サブユニットβまたはその一部をコード する遺伝子、並びに該遺伝子もしくはその一部とＦ１サブユニットδ、α、γ、 およびεもしくはそれらの一部をコードする遺伝子との種種の組合せよりなる群 から選択される、上記方法。 １３．請求の範囲第１２項記載の方法であって、Ｆ１またはその一部をコード するＤＮＡは、大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトコッカス・サーモフィ ルス（Streptococcus thermophilus）、およびラクトコッカス・ラクチス（Lact ococcus lactis）遺伝子ａｔｐＨＡＧＤＣ（サブユニットδ、α、γ、β、εを コードする）、ａｔｐＡＧＤＣ（サブユニットα、γ、β、εをコードする）、 ａｔｐＡＧＤ（サブユニットα、γ、βをコードする）、ａｔｐＤＣ（サブユニ ットβ、εをコードする）、およびａｔｐＤ（サブユニットβのみをコードする ）よりなる群から選択される、上記方法。 １４．Ｆ１またはその一部をコードするＤＮＡは真核生物から得られる、請求 の範囲第８〜１０項までのいずれか１項に記載の方法。 １５．請求の範囲第１４項記載の方法であって、Ｆ１またはその一部をコード するＤＮＡは、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、 ファフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma）、またはトリコデルマ・リーセイ （Trichoderma reesei）から得られ、かつＦ１サブユニットβまたはその一部を コードする遺伝子、および該遺伝子もしくはその一部と他のＦ１サブユニットも しくはその一部をコードする遺伝子との種々の組合せよりなる群から選択される 、上記方法。 １６．乳酸菌ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）若しくはスト レプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）から、酵母フ ァフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozvma）から、又は真菌類トリコデル マ・リーセイ（Trichoderma reesei）から得られる、膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺ −ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）またはＡＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部 をコードするＤＮＡを含むベクター。 １７．配列番号２〜５，７〜９，１１〜１３，１５又は１７により同定される ＡＴＰアーゼサブユニット又はそれらの部分の、一又は二以上をコードするＤＮ Ａを含む、請求の範囲第１６項記載のベクター。 １８．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性郊分（Ｆ１）または ＡＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡを含む請求の範囲第１６ 項記載の ベクターであって、該ＤＮＡはラクトコッカス・ラクチス（Lactococcu s lactis）亜種クレモリス（cremoris）から得られ、配列番号１に示す配列又は その一部 を含有する、上記ベクター。 １９．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）または ＡＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡを含む請求の範囲第１６ 項記載の ベクターであって、該ＤＮＡはラクトコッカス・ラクチス（Lactococcu s lactis）亜種ラクチス（lactis）から得られ、配列番号６に示す配列又はその 一部 を含有する、上記ベクター。２０．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）または ＡＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡを含む請求の範囲第１６ 項記載の ベクターであって、該ＤＮＡはストレプトコッカス・サーモフィルス（ Streptococcus thermophilus）から得られ、配列番号１０に示す配列又はその一 部 を含有する、上記ベクター。 ２１．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）または ＡＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡを含む請求の範囲第１６ 項記載の ベクターであって、ＤＮＡはファフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozym a）から得られ、配列番号１４に示す配列又はその一部を含有する、上記ベクタ ー。 ２２．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）または ＡＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡを含む請求の範囲第１６ 項記載の ベクターであって、ＤＮＡはトリコデルマ・リーセイ （Trichoderma reesei）から得られ、配列番号１６に示す配列又はその一部を含 有する、上記ベクター。 ２３．原核生物または真核生物細胞中でＤＮＡの発現を指令することができる プロモーターの制御下にある、請求の範囲第１６〜２２項のいずれか１項に記載 のＤＮＡを含む発現ベクター。 ２４．バイオマスまたは細胞による所望の生成物の生成を最適化する方法であ って、細胞中で異なるレベルの共役していないＡＴＰアーゼ活性を発現し、適切 な基質上で細胞をインキュベートし、ＡＴＰアーゼ発現の各レベルでバイオマス または所望の生成物への基質の変換速度を測定し、変換速度が最適化されるＡＴ Ｐアーゼ発現のレベルを選択することを特徴とする、上記方法。 ２５．請求の範囲第２４記載の方法であって、細胞の多くの試料は、各々が全 Ｆ１までとかつこれを含む膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの細胞質部 分（Ｆ１）の異なる部分（各部分は、ＡＴＰアーゼ活性を示す）をコードするＤ ＮＡを含む各発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされ、各発現 ベクター中の該ＤＮＡは、該細胞中で機能するプロモーターの制御下にあり、各 細胞試料を適切な基質上でインキュベートし、各試料中のバイオマスまたは所望 の生成物への基質の変換速度を測定し、そして最適の変換速度を与える試料を選 択する、上記方法。 ２６．請求の範囲第２４記載の方法であって、該細胞の多くの試料は、全Ｆ１ までとかつこれを含む膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの細胞質部分（ Ｆ１）の一部（この部分は、ＡＴＰアーゼ活性を示す）をコードするＤＮＡを含 む各発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされ、各発現ベクター 中の該ＤＮＡは、広範囲のプロモーター活性をカバーし該細胞中で機能する一連 の各プロモーターの制御下にあり、各細胞試料を適切な基質上でインキュベート し、各試料によるバイオマスまたは所望の生成物への基質の変換速度を測定し、 そして最適な変換速度を与える試料を選択する、上記方法。 ２７．請求の範囲第２６項記載の方法であって、各発現ベクターは、全Ｆ１ま でとかつこれを含むF1のそのような部分をコードするＤＮＡを含み、各発現ベク ター中の各ＤＮＡは、広範囲のプロモーター活性をカバーし該細胞中で 機能する一連の各プロモーターの制御下にある、上記方法。 ２８．各発現ベクター中のプロモーターは誘導性プロモーターであり、各細胞 試料は異なる濃度のインデューサーで増殖される、請求の範囲第２５〜２７項の いずれか１項に記載の方法。 ２９．全Ｆ１までとかつこれを含むＦ１の一部をコードするＤＮＡは、該細胞 と同種である、請求の範囲第２５〜２８項のいずれか１項に記載の方法。 ３０．全Ｆ１までとかつこれを含むＦ１の一部をコードするＤＮＡは、該細胞 と異種である、請求の範囲第２５〜２８項のいずれか１項に記載の方法。 ３１．全Ｆ１までとかつこれを含むＦ１の一部をコードするＤＮＡは、原核生 物から得られる、請求の範囲第２５〜３０項のいずれか１項に記載の方法。 ３２．請求の範囲第３１項記載の方法であって、全Ｆ１までとかつこれを含む Ｆ１の一部をコードするＤＮＡは、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトコッカ ス・ラクチス（Lactococcus lactis）、またはストレプトコッカス・サーモフィ ルス（Streptococcus thermophilus）から得られ、かつＦ１サブユニットβまた はその一部をコードする遺伝子、並びに該遺伝子もしくはその一部とＦ１サブユ ニットδ、α、γ、およびεもしくはそれらの一部をコードする遺伝子との種々 の組合せよりなる群から選択される、上記方法。 ３３．請求の範囲第３２項記載の方法であって、全Ｆ１までとかつこれを含む Ｆ１の一部をコードするＤＮＡは、大腸菌（E．coli）遺伝子ａｔｐＡＧＤＣ（ サブユニットα、γ、β、εをコードする）、ａｔｐＡＧＤ（サブユニットα、 γ、βをコードする）、ａｔｐＤＣ（サブユニットβ、εをコードする）、およ びａｔｐＤ（サブユニットβのみをコードする）よりなる群から選択される、上 記方法。 ３４．全Ｆ１までとかつこれを含むＦ１の一部をコードするＤＮＡは真核生物 から得られる、請求の範囲第２５〜３０項までのいずれか１項に記載の方法。 ３５．請求の範囲第３４項記載の方法であって、Ｆ１またはその一部をコード するＤＮＡは、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、 ファフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma）、またはトリコデルマ・リーセイ （Trichoderma reesei）から得られ、かつＦ１サブユニット βまたはその一部をコードする遺伝子、および該遺伝子もしくはその一部と他の Ｆ１サブユニットもしくはその一部をコードする遺伝子との種々の組合せよりな る群から選択される、上記方法。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヴエステルホッフ，ハンス，ビクトール オランダ国エヌエル―1066 シーエックス アムステルダム，チャーリー パーカー シュトラート 25

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．バイオマスまたは細胞からの所望の生成物の改良製造法であって、他の細胞 代謝物または機能に大きな影響を与えることなく、ＡＴＰからＡＤＰへの変換を 誘導するために、該細胞中で共役していないＡＴＰアーゼ活性を発現し、適切な 基質とともに細胞をインキュベートして該バイオマスまたは生成物を製造するこ とを特徴とする、上記方法。 ２．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）、またはＡ ＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部を、細胞中で発現することを特徴とする、請求 の範囲第１項記載の方法。 ３．細胞は原核生物細胞である、請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４．細胞は、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ストレプトコッカス属（Strep tococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトバシルス属（Lactob acillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、エシェリチア属（Escherichi a）、チモモナス属（Zymomonas）、バシルス属（Bacillus）およびシュードモナ ス属（Pseudomonas）よりなる群から選択される、請求の範囲第３項記載の方法 。 ５．細胞は真核生物細胞である、請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ６．細胞は酵母細胞である、請求の範囲第５項記載の方法。 ７．細胞は、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）また はトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）に属する、請求の範囲第６項 記載の方法。 ８．請求の範囲第１〜７項までのいずれか１項に記載の方法であって、細胞は、 Ｆ１または該細胞内で機能するプロモーターの存在下でＡＴＰアーゼ活性を示す その一部をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換またはトランス フェクションされ、該ＤＮＡは細胞内で発現される、上記方法。 ９．Ｆ１またはその一部をコードするＤＮＡは、細胞と同種である、請求の範囲 第８項記載の方法。 １０．Ｆ１またはその一部をコードするＤＮＡは、細胞と異種である、請求の範 囲第８項記載の方法。 １１．Ｆ１またはその一部をコードするＤＮＡは、原核生物から得られる、請求 の範囲第８〜１０項までのいずれか１項に記載の方法。 １２．請求の範囲第１１項記載の方法であって、Ｆ１またはその一部をコードす るＤＮＡは、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバシルス・ラクチス（Lactob acillus lactis）、またはストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcu s thermophilus）から得られ、かつＦ１サブユニットβまたはその一部をコード する遺伝子、および該遺伝子もしくはその一部とＦ１サブユニットδ、α、γ、 およびεもしくはその一部をコードする遺伝子との種々の組合せよりなる群から 選択される、上記方法。 １３．請求の範囲第１２項記載の方法であって、Ｆ１またはその一部をコードす るＤＮＡは、大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトコッカス・サーモフィル ス（Streptococcus thermophilus）、およびラクトバシルス・ラクチス（Lactob acillus lactis）遺伝子ａｔｐＨＡＧＤＣ（サブユニットδ、α、γ、β、εを コードする）、ａｔｐＡＧＤＣ（サブユニットα、γ、β、εをコードする）、 ａｔｐＡＧＤ（サブユニットα、γ、βをコードする）、ａｔｐＤＣ（サブユニ ットβ、εをコードする）、およびａｔｐＤ（サブユニットβのみをコードする ）よりなる群から選択される、上記方法。 １４．Ｆ１またはその一部をコードするＤＮＡは真核生物から得られる、請求の 範囲第８〜１０項までのいずれか１項に記載の方法。 １５．請求の範囲第１４項記載の方法であって、Ｆ１またはその一部をコードす るＤＮＡは、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、フ ァフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma）、またはトリコデルマ・リーセイ（T richoderma reesei）から得られ、かつＦ１サブユニットβまたはその一部をコ ードする遺伝子、および該遺伝子もしくはその一部と他のＦ１サブユニットもし くはその一部をコードする遺伝子との種々の組合せよりなる群から選択される、 上記方法。 １６．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）またはＡ ＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡを含むベクターであって、 ＤＮＡはラクトバシルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）亜腫クレモリス（ c remoris）から得られ、配列番号１に示す配列を有する、上記ベクター。 １７．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）またはＡ ＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡを含むベクターであって、 ＤＮＡはラクトバシルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）亜腫ラクチス（la ctis）から得られ、配列番号６に示す配列を有する、上記ベクター。 １８．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）またはＡ ＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡを含むベクターであって、 ＤＮＡはストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus） から得られ、配列番号１０に示す配列を有する、上記ベクター。 １９．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）またはＡ ＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡを含むベクターであって、 ＤＮＡはファフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma）から得られ、配列番号１ ４に示す配列を有する、上記ベクター。 ２０．膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの可溶性部分（Ｆ１）またはＡ ＴＰアーゼ活性を示すＦ１の一部をコードするＤＮＡを含むベクターであって、 ＤＮＡはトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）から得られ、配列番号 １６に示す配列を有する、上記ベクター。 ２１．原核生物または真核生物細胞中でＤＮＡの発現を指令することができるプ ロモーターの制御下にある、請求の範囲第１６〜２０項のいずれか１項に記載の ＤＮＡを含む発現ベクター。 ２２．バイオマスまたは細胞による所望の生成物の生成を最適化する方法であっ て、細胞中で異なるレベルの共役していないＡＴＰアーゼ活性を発現し、適切な 基質上で細胞をインキュベートし、ＡＴＰアーゼ発現の各レベルでバイオマスま たは所望の生成物への基質の変換速度を測定し、変換速度が最適化されるＡＴＰ アーゼ発現のレベルを選択することを特徴とする、上記方法。 ２３．請求の範囲第２２記載の方法であって、細胞の多くの試料は、各々が全Ｆ １までとかつこれを含む膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの細胞質部分 （Ｆ１）の異なる部分（各部分は、ＡＴＰアーゼ活性を示す）をコードするＤＮ Ａを含む各発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされ、各発現ベ クター中の該ＤＮＡは、該細胞中で機能するプロモーターの制御下にあり、各細 胞試料を適切な基質上でインキュベートし、各試料中のバイオマスまたは所望の 生成物への基質の変換速度を測定し、そして最適の変換速度を与える試料を選択 する、上記方法。 ２４．請求の範囲第２２記載の方法であって、該細胞の多くの試料は、全Ｆ１ま でとかつこれを含む膜結合（Ｆ０Ｆ１型）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼの細胞質部分（Ｆ １）の一部（この部分は、ＡＴＰアーゼ活性を示す）をコードするＤＮＡを含む 各発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされ、各発現ベクター中 の該ＤＮＡは、広範囲のプロモーター活性をカバーし該細胞中で機能する一連の 各プロモーターの制御下にあり、各細胞試料を適切な基質上でインキュベートし 、各試料によるバイオマスまたは所望の生成物への基質の変換速度を測定し、そ して最適な変換速度を与える試料を選択する、上記方法。 ２５．請求の範囲第２４項記載の方法であって、各発現ベクターは、全Ｆ１まで とかつこれを含むＦ１のそのような部分をコードするＤＮＡを含み、各発現ベク ター中の各ＤＮＡは、広範囲のプロモーター活性をカバーし該細胞中で機能する 一連の各プロモーターの制御下にある、上記方法。 ２６．各発現ベクター中のプロモーターは誘導性プロモーターであり、各細胞試 料は異なる濃度のインデューサーで増殖される、請求の範囲第２３〜２５項のい ずれか１項に記載の方法。 ２７．全Ｆ１までとかつこれを含むＦ１の一部をコードするＤＮＡは、該細胞と 同種である、請求の範囲第２３〜２６項のいずれか１項に記載の方法。 ２８．全Ｆ１までとかつこれを含むＦ１の一部をコードするＤＮＡは、該細胞と 異種である、請求の範囲第２３〜２６項のいずれか１項に記載の方法。 ２９．全Ｆ１までとかつこれを含むＦ１の一部をコードするＤＮＡは、原核生物 から得られる、請求の範囲第２３〜２８項のいずれか１項に記載の方法。 ３０．請求の範囲第２９項記載の方法であって、全Ｆ１までとかつこれを含むＦ １の一部をコードするＤＮＡは、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトコッカス ・ラクチス（Lactococcus lactis）、またはストレプトコッカス・サーモフィ ルス（Streptococcus thermophilus）から得られ、かつＦ１サブユニットβまた はその一部をコードする遺伝子、および該遺伝子もしくはその一部とＦ１サブユ ニットδ、α、γ、およびεもしくはその一部をコードする遺伝子との種々の組 合せよりなる群から選択される、上記方法。 ３１．請求の範囲第３０項記載の方法であって、全Ｆ１までとかつこれを含むＦ １の一部をコードするＤＮＡは、大腸菌（E．coli）遺伝子ａｔｐＡＧＤＣ（サ ブユニットα、γ、β、εをコードする）、ａｔｐＡＧＤ（サブユニットα、γ 、βをコードする）、ａｔｐＤＣ（サブユニットβ、εをコードする）、および ａｔｐＤ（サブユニットβのみをコードする）よりなる群から選択される、上記 方法。 ３２．全Ｆ１までとかつこれを含むＦ１の一部をコードするＤＮＡは真核生物か ら得られる、請求の範囲第２３〜２８項までのいずれか１項に記載の方法。 ３３．請求の範囲第３２項記載の方法であって、Ｆ１またはその一部をコードす るＤＮＡは、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、フ ァフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma）、またはトリコデルマ・リーセイ（T richoderma reesei）から得られ、かつＦ１サブユニットβまたはその一部をコ ードする遺伝子、および該遺伝子もしくはその一部と他のＦ１サブユニットもし くはその一部をコードする遺伝子との種々の組合せよりなる群から選択される、 上記方法。