JP2000514421A - 脂肪細胞におけるアデノウイルスを介した遺伝子導入および関連のインプラント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アデノウイルスを介した脂肪細胞への遺伝子導入、特に、肥満症を軽減する手段としての毒性遺伝子の導入および新しい血管の増殖を誘発する血管形成誘導物質をコードする遺伝子の導入、並びに脂肪組織インプラントに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 脂肪細胞におけるアデノウイルスを介した遺伝子導入および関連のインプラント 発明の技術分野 本発明は、改変された脂肪細胞および脂肪細胞へのアデノウイルスを介した遺 伝子導入に有用なベクターに関する。また、本発明は、血管形成誘導因子および ／または他の治療的因子で脂肪組織を処理することにより改変された脂肪組織か ら作られるインプラントに関する。 発明の背景 遺伝子治療は、遺伝情報を薬理剤として使用することを必要とする。遺伝子治 療は当初、遺伝病治療の一手段と理解されていたが、現在では、局所的および／ または全身的使用のために治療的なｍＲＮＡもしくは蛋白質を送達する強力な道 具として認識されている（例えば、Friedmann，Science，244，1275-1281(1989) ;Miller，Nature，357，455-460(1992)を参照）。一般に、遺伝子治療には２つ のアプローチ、すなわち、生体外（ex vivo）および生体内（インビボ）アプロ ーチがある。ex vivoアプローチでは、宿主から除去した細胞を、宿主に戻す前 に試験管内（インビトロ）で遺伝的に改変する（例えば、米国特許第5,399,346 号（Andersonら）を参照）。インビボアプローチでは、導入のためのビークルと していかなる細胞も使用することなく、遺伝情報自体を直接宿主に導入する。 どちらのアプローチもいわゆる「治療」遺伝子を宿主に導入するために使用さ れている。広く考えれば、治療遺伝子とは、特定の病状、状態、障害もしくは症 候群において、根元的な蛋白質欠損を修正するか補填する遺伝子、あるいは別の 遺伝子を調節するか別の遺伝子にコードされる産物の負の効果を打ち消し得る遺 伝子である。例えば、ex vivoアプローチは、アデノシンデアミナーゼ欠損症の 治療におけるＴリンパ球の改変、家族性高コレステロール血症の治療における肝 細胞の改変、および腫瘍性疾患の治療における腫瘍浸潤性リンパ球の改変に使用 されている（Setoguchiら，J ．Investig．Dermatol.，102，415-421（1994）に 総説）。インビボアプローチは、特に、嚢胞性線維症および腫瘍性疾患の治療に 使用されている（Setoguchiら，上述）。これらの適用の大部分において、発現 させるべき治療遺伝子のコーディング配列は、異種プロモーター（特に、構成的 もしくは誘導性プロモーター）の制御下に置かれ、組換え治療遺伝子が作られて いる。 広く行われている遺伝子治療へのアプローチでは、遺伝子導入のためのビーク ルとしてレトロウイルスを使用してきた。しかしながら、レトロウイルスは、そ れらの適用、特にインビボでの適用を、大きく制限する数多くの欠点を有する（ Mastrangeliら，J ．Clin．Invest.，91，225-34(1993);Burnsら，Proc ．Natl．A cad．Sci. ，90，8033-37(1993)）。したがって、多くの研究者は、遺伝子治療の ためのベクターとしてアデノウイルスに頼っている（Horwitz，「ウイルス学」(Virology )，第２版，Fieldsら編(NY:Raven Press，1990)，1679-1721;Berkner，BioTechniques ，6，606-629(1988);Ginsberg（編），「アデノウイルス」(The A denoviruses )(NY:PlenumPress，1984);Horwitz，上述;Rosenfeldら，Science，2 52 ，431-434(1991);Rosenfeldら，Cell，68，143-155(1992);Quantinら，Proc ． Natl．Acad．Sci. ，89，2581-2584(1992);Crystalら，Nucleic Acids Res.，21 ，1607-12(1993)）。複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、インビトロお よびインビボで遺伝子を導入するのに非常に効率的であり、現在、広く多様な応 用に使用されている（例えば、Rosenfeldら(1991),上述;Rosenfeldら(1992),上 述;Crystalら，Nat ．Genet.，8，42-51(1994);Lemarchandら，Circ ．Res.，72， 1132-1138(1993);Guzmanら，Circ ．Res.，73，1202-1207(1993);Bajocchiら，Na t ．Genet. ，3，229-234(1993);Mastrangeliら，上述，を参照）。 アデノウイルスは、エンベロープのない二本鎖ＤＮＡウイルスとして存在する (Horwitz,上述)。アデノウイルスは、標的細胞に生物材料を導入する効率的な手 段を提供する（Oteroら，Virology，160，75-80(1987);FitzGeraldら，Ce 11 ，32，607-617(1983);Sethら，Mol ．Cell Biol.，4，1528-1533(1984);Yoshim ura，Cell Struct ．Funct.，10，391-404(1985);Deferら，J ．Virol.，64，3661 -3673(1990);Rosenfeldら(1991),上述;Curielら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，88 ，8850-8854(1991);Rosenfeldら(1992),上述;Quantinら，上述;Curielら，Hum ． Gene Therapy ，3，147-154(1992)）。アデノウイルスは受容体を介したエンドサ イトーシス経路によって細胞に入る。最初のウイルスー受容体相互作用において 、アデノウイルスは、その外表面上のファイバーにより細胞表面上に存在する特 異的受容体と結合する（Ginsberg，上述;Horwitz,上述;Sethら，「ウイルスの接 着と細胞への侵入」（In:Virus Attachment and Entry into Cells)，Colwellら 編，(DC:American Society for Microbiology，1986)，１91-195）。接着した後 、アデノウイルスが結合した受容体は被覆された窪みに密集し、ウイルスはクラ スリン被覆小胞内に、その後、エンドソームもしくはレセプトソームと呼ばれる エンドソーム小胞内に内部移行する（FitzGeraldら，上述）。アデノウイルスは 最終的に核に輸送され、そこで初期核酸合成を指示する（FitzGeraldら，上述;S ethら(1984),上述;Sethら(1986),上述;Sethら，J ．Virol.，51，650-655(1984a) ;Sethら，J ．Biol．Chem.，259，14350-14353(1984b)；Sethら，J ．Biol．Chem. ，260，9598-9602(1985);Sethら，J ．Biol．Chem.，260，14431-14434(1985);Bl umenthalら，Biochemistry，25，2231-2237(1986);Sethら，J ．Virol.，61，883 -888（1987））。 アデノウイルスが容易に細胞に侵入する能力は、巨大分子を細胞内に輸送する 手段として利用されている（Oteroら，上述;FitzGeraldら，上述;Sethら（1984) ,上述;Yoshimura,上述;Deferら，上述;Rosenfeldら(1991),上述;Curielら(1991) ,上述;Rosenfeldら(1992),上述;Quantinら，上述;Curielら(1992),上述）。この ような導入を行う２つの手段がある。第一手段で、アデノウイルスが、通常のア デノウイルス構成成分の代わりに、あるいはそれに加えて、該アデノウイルス内 部にパッケージングされた非ウイルス性の巨大分子を導入するのに使用されてい る（Rosenfeldら(1991),上述;Rosenfeldら(1992),上述; Quantinら，上述;Berkner,上述）。第二の手段で、アデノウイルスが、（例えば 、ポリリジン残基を通じてアデノウイルスキャプシド蛋白に対する抗体に核酸を 結合させることによって（Curielら(1992),上述））アデノウイルスの表面に連 結された非ウイルス性巨大分子、あるいは一緒に内部移行されて、アデノウイル ス受容体−エンドソーム複合体（Oteroら，上述;FitzGeraldら，上述;Sethら(19 84),上述;Yoshimura,上述;Oteroら，上述;Deferら，上述）中で積荷として一緒 に持って行かれる「傍観者」プロセスにおける非ウイルス性巨大分子、の導入を 仲介するのに使用されている。このような傍観者プロセスは、リガンドに連結さ れたプラスミドＤＮＡ（Curielら(1991),上述;Curielら(1992),上述;Cottenら，Proc ．Natl．Acad．Sci. ，89，6094-098(1992));Rosenfeldら（1992),上述;Quan tinら，上述;Cottenら，J ．Virology，67，3777-3785(1993);Wagnerら，Proc ．N atl．Acad．Sci. ，78，144-145(1981)）、および非特異的リンカーもしくはリン カー−リガンド複合体により修飾されていないプラスミドＤＮＡ(Yoshimuraら，J ．Biolog．Chem. ，268，2300-303(1993);ＰＣＴ出願WO 95/21259（Sethら）） を含む、種々の非ウイルス性巨大分子の導入を増大させるのに使用されている。 最近、Setoguchiら（Setoguchiら，上述）は、プロモーターとしてのラウス肉 腫ウイルスロングターミナルリピートの制御下にあるβ−ガラクトシダーゼリポ ーター遺伝子コーディング配列を担持する複製欠損組換えアデノウイルスベクタ ーの、脂肪細胞へのインビボでのアデノウイルスを介した遺伝子導入を開示した 。同様に、Claymanら（Claymanら，Cancer Gene Therapy，2，105-111（1995)） は、β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子を担持する組換えアデノウイルスベ クターをマウスに粘膜下注射すると、針痕に沿った脂肪細胞のまばらな染色が生 じることを開示した。 アデノウイルス以外のベクターおよび送達手段を用いて研究している他の研究 者らは、リポーター遺伝子以外の遺伝子を脂肪細胞にインビボで導入している。 特に、Rossら（Rossら，Genes Devel.，1318-1324(1993)）は、脂肪細胞特異的 な脂肪細胞Ｐ２（ａＰ２）プロモーターの制御下にある弱毒化されたジフテリア 毒素Ａ鎖を脂肪組織に遺伝子導入することにより、肥満が減少することを開示し た。Yamaizumiら（Yamaizumiら，Cell，15，245-50（1978））は、ジフテリア毒 素Ａフラグメントの導入による殺細胞を開示し、Gregoryら（Gregoryら，ＰＣＴ 出願WO 95/11984）は、条件付きの自殺遺伝子であるチミジンキナーゼを使用す るなどの、細胞死を誘発する手段を開示した。同様に、Gravesら（Gravesら，Ge nes & Development ，5，428-37(1991))およびRossら（Rossら，Proc ．Natl．Aca d．Sci. ，89，7561-65(1992);Rossら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，87，9590-94(1 990)）はそれぞれ、ａＰ２遺伝子の５’−調節領域に位置する脂肪細胞特異的エ ンハンサーを開示した。 同様に、毒素遺伝子の細胞特異的な発現によって特異的な細胞系列を削除する 方法（Palmiterら，Cell，50，435-43(1987);Bernsteinら，Mol ．Biol．Med.，6 ，523-30(1989);Behringerら，Genes & Development，2，453-61(1988);Hughes ら，ＰＣＴ出願WO 92/09616））を開示している文献もある。使用される方法は 、通常、細胞特異的エンハンサー／プロモーターが毒性の遺伝子産物の発現を駆 動するのに用いられるキメラ遺伝子を、受精卵にマイクロインジェクションする ことを必要とする。このアプローチの変法において、Hughesら（Hughesら，上述 ）は、筋原性の分化を誘発するニワトリのｃ−ｓｋｉ蛋白をコードするベクター を導入することによって、宿主の脂肪組織の量が減少することを開示した。 遺伝子導入の手段としてアデノウイルスを含まない文献は、特異的な治療目的 を達成するためにインビボで脂肪細胞を改変し得る、さらなる方法を示唆してい る。特に、Spiegelmanら（Spiegelmanら，J ．Biol．Chem.，268(10)，6823-26（ 1993））は、脂肪細胞の遺伝子発現制御を再検討し、「脂肪生成遺伝子の発現を 制御することにより代謝に影響を与えること」および細胞分化または肥満に関連 する「これらのキー・レギュレーターを標的化することにより脂肪生成および全 身的代謝を妨害すること」を開示した。Gravesら（Gravesら，上述）は、「いく つかの肥満／糖尿病マウスモデルにおける肥満と糖尿病の関係は・・・毒素もし くは脂質の蓄積に影響する種々の受容体の送達を通じて、脂肪細胞の形成および ／または脂質の蓄積を直接抑制することによって究明し得るだろう」と開示した 。Rossら（Rossら(1990),上述）は、組織特異的発現をモニターする手段として 、リポーター遺伝子のコーディング配列に連結された脂肪細胞特異的なａＰ２遺 伝子調節領域を含むトランスジェニックマウスの産生を開示し、「外因性遺伝子 の脂肪指向的な発現は、脂肪の貯蔵を変化させ、そうしてトランスジェニック動 物の肥満度を直接的に操作する有効な方法かもしれない」と示唆している。Ross ら(Rossら(1992),上述)はさらに、オンコジーンのような、連結された外因性遺 伝子の発現を脂肪組織に指向させる手段として、シミアンウイルス４０（ＳＶ４ ０）トランスフォーミング遺伝子に連結された脂肪細胞特異的なａＰ２遺伝子調 節領域を含むトランスジェニックマウスの産生を開示した。 他にも脂肪細胞の改変と関連性を有する文献がある。特に、合衆国特許第5,26 8,295号（Serrero）は、分化後の脂肪細胞株において大量に発現する、ｐ１５４ と呼れる哺乳類脂肪細胞特異的ポリペプチドに関する。’295号特許はネズミお よびヒトのｐ１５４ポリペプチド、それをコードするＤＮＡおよびＲＮＡ分子、 その調製方法、並びに該ポリペプチドに特異的な抗体を開示している。Flierら( Flierら，Science，237，405-8(1987)）は、肥満症においてアジプシン遺伝子の 発現と、それに応じてセリンプロテアーゼホモログの循環レベルが減少すること を開示している。より最近では、マウスの肥満遺伝子の蛋白産物（Ｏｂ）を動物 に注射すると、それによって体重が減少し、また体重の減少が維持されることを 、研究者らは実証した（例えば、Barinaga，Science，269，475-76(1995)に総説 ）。 したがって、脂肪細胞に遺伝子を導入することによりそれを改変するより良い 手段が必要である。さらに、改変された脂肪細胞および脂肪組織インプラントが 必要である。本発明の目的はそれらを提供することである。本発明のこれらの、 そして他の目的および本発明の利点、並びに本発明の付加的な特徴は、後記する 発明の説明から明確になるだろう。発明の簡単な要約 本発明は、アデノウイルスを介した遺伝子導入および他の手段を含めて、イン ビボおよびex vivoで脂肪細胞を改変する方法およびベクターを提供する。本発 明はまた、脂肪細胞組織の局所的な環境において使用されるか、あるいは分泌さ れて全身で使用される蛋白質のソースを提供するための、脂肪細胞へのインビボ 遺伝子導入を提供する。特に、本発明は、肥満症を軽減する手段としての脂肪細 胞への毒性遺伝子のインビボ導入、および血管新生を誘発する血管形成誘導物質 をコードする遺伝子の導入を提供する。さらに、本発明は脂肪細胞の改変および 宿主内の他の部位への脂肪細胞の導入を提供するが、それは改善された脂肪細胞 の移植、治療または診断用の生物分子の移植可能なソースおよび他の利点を提供 する。 図面の簡単な説明 図１は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）変換（ ％変換）に対するラット腹膜後方脂肪組織に送達されたAdCMVCATの用量（総ｐｆ ｕ）のグラフである。 図２は、相対的ＣＡＴ活性（％変換／ｍｇ蛋白）に対するラット腹膜後方脂肪 組織へのベクター(AdCMVCAT)投与後の時間（日）のグラフである。矢印はベクタ ー投与の時刻を示している。 図３は、ラット腹膜後方組織へのAdCMV.VEGF（●）またはAdCMV.Null（○）投 与後の、ＶＥＧＦレベル（ｎｇ／ｍｇ蛋白）に対する時問（日）のグラフである 。矢印はベクター投与の時刻を示している。 図４は、ラット腹膜後方組織へのAdCMV.VEGF（●）、AdCMV.Null（〇）、sham のグラフである。矢印はベクター投与の時刻を示している。 図５は、ラット腹膜後方組織へのAdCMV.VEGF（●）またはAdCMV.Null（○）投 与（１０⁹ｐｆｕ）後の、毛細血管数／ｍｍ²に対する時間（日）のグラフである 。矢印はベクター投与の時刻を示している。 発明の詳細な説明 本発明は、プロモーターと、それに機能的に連結した、治療蛋白もしくは治療 ｍＲＮＡ、すなわち治療効果を発揮し得る蛋白もしくはｍＲＮＡ、をコードする 核酸配列を含有するアデノウイルスベクターを、脂肪細胞に接触させることを含 む、脂肪細胞の改変方法を提供する。該接触は、脂肪細胞へのアデノウイルスベ クターの侵入が成され、該核酸配列が発現し、それによって治療蛋白もしくはｍ ＲＮＡの効果がもたらされるような条件下、特にインビボで行われるのが望まし い。 いかなる適切なアデノウイルスベクターも脂肪細胞への遺伝子導入に利用する ことができるが、本発明がさらに提供する以下のベクターを使用することが好ま しい。例えば、脂肪細胞の遺伝子導入は、脂肪細胞特異的プロモーターと、それ に機能的に連結した、治療蛋白もしくは治療ｍＲＮＡをコードする核酸配列を含 有するアデノウイルスベクターを用いて実施することができる。遺伝子導入は、 構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）と、それに機能的に連結し た、（i）全身に作用する分泌蛋白質、(ii)脂肪細胞上もしくはその付近で作用 する蛋白質、（iii）毒素（特に、ジフテリア毒素Ａ）、(iv)血管形成誘導増殖 因子（特に、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₈₉ を含むＶＥＧＦ））、（v）アジプシン（特に、セリンプロテアーゼホモログで あるアジプシン）および(vi)肥満遺伝子の蛋白産物、すなわちＯｂ蛋白もしくは レプチン（特に、マウスもしくはヒト由来Ｏｂ蛋白）からなる群より選択される 蛋白質をコードする核酸配列を含有するアデノウイルスベクターを用いて行うこ とができる。本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞、特に、脂肪組織 の細胞を提供する。 アデノウイルスが細胞に侵入する能力を最適化するために、遺伝子導入は宿主 内に導入される特定のアデノウイルスに指向性の中和抗体の非存在下で行うこと が好ましい。このような抗体の非存在下では、アデノウイルスが細胞に結合し、 および／または侵入するのを該抗体が妨げる可能性がない。中和抗体の存在を調 べることは当業者には容易である。このような中和抗体の存在がアデノウイルス の細胞内送達の障害となる場合、別のアデノウイルスベクター、例えば別の血清 型のアデノウイルスベクター（Cromptonら，J ．Gen．Virol.，75，133-139(1994 )）または該抗体が指向するエピトープを欠く別のアデノウイルスベクターを用 いることができる。 本発明はまた、脂肪組織（例えば、宿主に移植するためにドナーから単離され る）および該脂肪組織に関連する血管形成誘導物質を含む脂肪組織インプラント を提供する。該脂肪組織インプラントは、インビボもしくはex vivoのいずれか において、ドナー動物（ヒトを含む）の脂肪組織を、該インプラントを形成する のに使用される脂肪組織の血管新生を増大させる血管形成誘導因子もしくは組成 物で改変することによって製造することができる。該インプラント（すなわち、 脂肪組織インプラント）が同一動物内の第二の部位に、あるいは免疫学的に適合 する宿主（すなわち、第二の動物）内に移入される（移植される）と、該血管形 成誘導因子もしくは組成物は、血管形成誘導因子もしくは組成物で改変もしくは 処理されていない移植組織に比べて血管新生の増大を引き起こす。血管新生が増 大すると、結果としてインプラントへの栄養および酸素の供給がよくなり、また 第二の部位もしくは動物内のインプラントが産生する老廃物がよりよく除去され る。このように栄養および老廃物の交換が改善されると、結果的に脂肪組織イン プラントの移植後の脂肪細胞の消失が低レベルになる。免疫学的に適合するとは 、インプラントを実質的に排除するように、該インプラントを形成する細胞を、 免疫系が攻撃して破壊しないか、あるいはできない宿主を意味する。 本発明はまた、脂肪組織インプラントを製造するための、血管形成誘導蛋白お よび血管形成誘導ＤＮＡを用いる方法、並びにそれらを含む医薬組成物を提供す る。定義 「治療遺伝子」は、プロモーターと、治療蛋白もしくは治療ｍＲＮＡをコード する核酸配列を含む。以下にさらに記載するように、このような治療遺伝子は、 治療上の利益を提供するために、宿主細胞に導入すると細胞内環境に識別できる 変化（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ぺプチドも しくは蛋白質のレベルの増加、あるいはそれらの産生もしくは分解速度の変化） が起こるように本発明においてベクター中にサブクローニングすることができる 。「遺伝子産物」は、所定の核酸配列から転写されたまだ未翻訳のＲＮＡ分子（ 例えば、ｍＲＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡ）または前記核酸配列から転写さ れたｍＲＮＡ分子から翻訳されたポリペプチド鎖（すなわち、蛋白質またはぺプ チド）のいずれかである。核酸配列または遺伝子は、該分子に沿う塩基配列が、 該核酸配列または遺伝子が天然に通常見出される配列から変化していれば、すな わち、該塩基配列が天然に通常見出されなければ、「組換え体」である。本発明 によれば、治療遺伝子は、全部もしくは一部が合成により作られたものであって よく、ゲノミックもしくは相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含んでもよく、また、 ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれの形態で提供されてもよい。 治療遺伝子としては、ＶＥＧＦ蛋白の１つ、特にＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅ま たはＶＥＧＦ₁₈₉をコードするＤＮＡに機能的に連結したプロモーターを含む「 血管形成誘導遺伝子」が挙げられるが、それに制限されない。ＶＥＧＦ蛋白に加 えて、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦおよび上皮増殖因子もまた、本発明の方法における使 用に適した他の血管形成誘導蛋白の例である。血管形成誘導遺伝子は「血管形成 誘導ｍＲＮＡ」および、血管の形成（血管新生）を仲介し得るいかなる蛋白も意 味する「血管形成誘導蛋白」をコードする。 同様に、リンパ形成誘導ＤＮＡは、「リンパ形成誘導蛋白」または「リンパ形 成誘導ｍＲＮＡ」をコードする核酸配列に機能的に連結したプロモーターを含む 。ＶＥＧＦ−Ｃはリンパ形成誘導蛋白の好適な例である。 「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってＲＮ Ａ合成を促進するＤＮＡ配列である。「エンハンサー」は、近傍の遺伝子の転写 を刺激または阻害する、シス作用性のＤＮＡエレメントである。転写を阻害する エンハンサーは「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、エンハンサー がいずれの方向にも、数キロ塩基対に及ぶ距離を越えて、転写領域の下流の位置 からでさえ機能し得るという点で、プロモーター中にのみ見られる、配列特異的 ＤＮＡ結合蛋白に対するＤＮＡ結合部位（「プロモーターエレメント」とも呼ば れる）とは異なる。本発明によれば、治療蛋白または治療ｍＲＮＡをコードする 核酸配列は、プロモーターがその核酸配列の転写を指示し得る場合に、該プロモ ーターに「機能的に連結している」（例えば、核酸配列とプロモーターの両方が １つの治療遺伝子を構成する場合）。ベクター 「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を導入するのに役立つ分子（例えば、 アデノウイルスのようなウイルス）である。いかなる好適なアデノウイルスベク ターも本発明の方法において利用することができる。すなわち、本発明に従って 利用されるアデノウイルスベクターは、真核細胞への核酸の導入に適当であり、 当業者がベクターという用語を理解しているその通りにベクターとして機能し得 るいかなるアデノウイルスベクターも包含し得る。本発明におけるアデノウイル スベクターは、１または２以上の異種および／または組換え配列、例えば、プロ モーターおよび治療蛋白または治療ｍＲＮＡをコードする核酸配列を含む治療遺 伝子、ことによると１または２以上のエンハンサーまたはサイレンサー等を含有 する。配列は、それが通常見出されるのとは異なるゲノム内に存在していれば、 「異種」である。 アデノウイルスはいかなる血清型のアデノウイルスであってもよく（例えば、 「フィールズ ウイルス学」(Fields Virology)，Fieldsら（編），第３版，N Y:Raven Press，1996，2111-2171）、好ましくはヒト細胞に形質導入および／ま た は感染し得る血清型である。望ましくは、アデノウイルスは、核酸のコアと蛋白 質キャプシドからなる完全なアデノウイルスのウイルス粒子（すなわち、ビリオ ン）を含むか、治療遺伝子を含むＤＮＡが付随する蛋白質キャプシドを含むか、 裸のアデノウイルスゲノムを含むか、あるいは当該技術分野で記載されるような 、治療遺伝子の導入に使用し得る他のいずれかのアデノウイルスの具現物である 。本発明においては、いかなる適当なアデノウイルスゲノムもアデノウイルスベ クターとして働くか、もしくはその一部となり得る。好ましいアデノウイルスゲ ノムとしては、Ａｄ５およびＡｄ２由来のゲノムが挙げられ、それらは感染細胞 から容易に単離されるか、市販されているか（例えば、Sigma Chemical Co.，St ．Louis，MOより）、あるいはこれらのウイルス保存株を定常的に維持している 当業者から一般に入手できるものである。 本発明の目的からすれば、治療遺伝子の導入に用いられるアデノウイルスは野 生型（すなわち、複製能力がある）であってよい。しかしながら、使用されるア デノウイルスのゲノムがインタクトである必要はない。実際、ウイルスが宿主細 胞の機能を奪い、最終的に該細胞を破壊するのを防ぐために、使用に先立って、 例えばＵＶ照射によりアデノウイルスを不活化することもできる。あるいは、ア デノウイルスは、ウイルスを複製欠損にし得る少なくとも１つの改変をその中に 有する遺伝的材料を含んでいてもよい。また、アデノウイルスはアデノウイルス キャプシドに連結した治療遺伝子からなっていてもよく、したがって、アデノウ イルスゲノムを持たなくてもよい。さらに、該ウイルスは、当該技術分野で記載 されているように（例えば、Wagnerら，上述）、哺乳動物細胞に対するリガンド （例えば、トランスフェリン）を含むＤＮＡ−ポリリジン複合体にカップリング していてもよい。 アデノウイルスゲノムの改変としては、ＤＮＡセグメントの付加、ＤＮＡセグ メントのリアレンジメント、ＤＮＡセグメントの欠失、ＤＮＡセグメントの置換 、未メチル化ＤＮＡのメチル化、メチル化ＤＮＡの脱メチル化およびＤＮＡ損傷 の導入が挙げられるが、それらに限定されない。本発明の目的からすれば、ＤＮ Ａ セグメントは小さいもので１ヌクレオチド、大きいもので３６キロ塩基対（ｋｂ ）（すなわち、アデノウイルスゲノムのサイズ）であればよく、あるいは、アデ ノウイルスビリオン中にパッケージングされ得る最大量（すなわち、約３８ｋｂ ）と等しければよい。 アデノウイルスゲノムのこのような改変は、アデノウイルスを複製欠損にする ことができる。しかしながら、該改変は、アデノウイルスが適当な細胞表面受容 体に結合する能力を変化させないことが好ましい。アデノウイルスゲノムの好ま しい改変としては、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４領域における改変が挙 げられる。 本発明において利用されるベクターは、いかなるタイプの適切なベクターをも 構成するような配列を含んでもよい。例えば、該ベクターは、哺乳類の発現ベク ター、サブクローニングされた治療遺伝子のコーディング配列がそれ自身のシス 作用性制御エレメントの制御下にあるベクター、あるいは宿主細胞内での遺伝子 組込みまたは遺伝子置換を容易にするように設計されたベクターを包含し得る。 好ましくは、該ベクターは、哺乳類（最適には、ヒト）の細胞内での治療遺伝子 の発現に適切な発現ベクターを包含する。 本発明のベクターはまた、アデノウイルスベクター以外のベクター（例えば、 プラスミド、ファージ、リポソームまたは他のウイルスベクター）、あるいはア デノウイルス配列と他のベクター配列との連結を包含し得る。しかしながら、例 えば、アデノウイルスベクターの構築においては、これらの他のベクターを使用 することができるが、脂肪細胞に、特にインビボで、遺伝子を導入するにはアデ ノウイルスベクターを使用することが好ましい（すなわち、ファージ、プラスミ ドまたは他のベクターと比較すると）。 ベクターの同定および／または選択は、当業者に公知の多様なアプローチを用 いて達成することができる。例えば、特定の核酸配列を含むベクターは、ハイブ リダイゼーション、ベクター上に存在するマーカー遺伝子にコードされるいわゆ る「マーカー」遺伝子機能の有無、および／または特定の配列の発現によって同 定することができる。第一のアプローチでは、ベクター中の特定の配列の存在は を、当該配列と相同な配列を含むプローブを用いて、ハイブリダイゼーション（ 例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション）により検出することができる 。第二のアプローチでは、組換えベクター／宿主系は、抗生物質耐性、チミジン キナーゼ活性等のような、ある特定のマーカー遺伝子機能−これらの機能はベク ター上に存在する該機能をコードする特定の遺伝子により引き起こされるーの有 無に基づいて、同定し選択することができる。第三のアプローチでは、ベクター は、該ベクターにコードされる特定の遺伝子産物をアッセイすることによって同 定することができる。このようなアッセイは遺伝子産物の物理学的、免疫学的ま たは機能的特徴に基づけばよい。治療遺伝子 本発明において使用されるベクターは、１または２以上の治療遺伝子を含んで もよい。ベクターが内部移行した細胞内で治療遺伝子が転写され得る限り、いか なる適切な治療遺伝子も本発明にしたがって使用することができる。 導入される治療遺伝子は、小さいもので１繰り返し単位（例えば、１ヌクレオ チド）、大きいもので、単離し、合成し、または本発明の方法を用い、且つウイ ルスベクターのパッケージングの制限を考慮して、宿主細胞に導入することがで きる相応なものであり得るＤＮＡを含むことができる。治療遺伝子は、治療蛋白 もしくは治療ｍＲＮＡをコードする核酸配列だけでなく、（プロモーターのよう な）非コーディング配列を含む。治療遺伝子の「核酸配列」は、リボザイム、す なわち、当該分野で記載されるような触媒的ＲＮＡ種（Hampelら，Nucleic Acid s Research ，18，299-304(1990);Cechら，Annual Rev ．Biochem.，55，599-629( 1986)）を含めた、センスまたはアンチセンス配列、並びに操作された配列、す なわち、インビボで通常存在しない配列を含有することが好ましい。 治療遺伝子の核酸配列はベクター中でいずれの配向であってもよい。該治療遺 伝子核酸配列は、天然の形態において通常コーディング配列（例えば、センスま たはアンチセンスｍＲＮＡ配列）を制御するか、あるいは制御しない５’および ／または３’制御配列（例えば、プロモーター）の制御下に置く（すなわち、「 機能的に連結する」）ことができる。特に、いかなるプロモーターも、組換え治 療遺伝子を作り出すために、核酸配列の天然のプロモーターと置換することがで きる。さらに、治療遺伝子は、塩基の欠失もしくは塩基の変化（例えば、塩基の アルキル化）、シクロブチルダイマー、鎖の切断および核酸鎖の架橋形成を含む 損傷を含んでいてもよいが、これらに制限されない。 疾患もしくは病態を治療するために、治療遺伝子は通常、ＲＮＡもしくは蛋白 質レベルでその効果を発揮するだろう。例えば、スプライシングもしくは３’プ ロセッシング（例えば、ポリアデニル化）に影響を与える、アンチセンスメッセ ージのような治療ｍＲＮＡもしくはリボザイムもしくは蛋白質をコードする核酸 配列を含むことによって、治療遺伝子はＲＮＡレベルでその効果を発揮すること ができる。あるいは、治療遺伝子の核酸配列は、細胞内で別の遺伝子の発現レベ ルに影響を与える（すなわち、ここで遺伝子発現とは、転写開始からプロセッシ ングされた蛋白質の産生までを通じてのすべての工程を含むものと広くみなされ る）ことにより、とりわけ、ｍＲＮＡ蓄積速度の変化、ｍＲＮＡ輸送の変化およ び／または転写後調節における変化を介することにより作用する治療蛋白をコー ドすることができる。 また、導入された治療遺伝子の核酸配列によりコードされる蛋白質は、嚢胞性 線維症の治療のための嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子ｃＤＮＡのよ うに、遺伝病の治療に使用することができる。治療遺伝子の核酸配列にコードさ れる蛋白質は、結果的に細胞を殺すことによってその治療効果を発揮することが できる。例えば、ジフテリア毒素Ａ遺伝子の発現のように、遺伝子発現そのもの が殺細胞を導くか、あるいは、遺伝子発現により、細胞をある特定の薬剤の殺作 用に選択的に感受性となるようにすることができる（例えば、ＨＳＶチミジンキ ナーゼ遺伝子の発現により、細胞はアシクロビル、ガンシクロビル、およびＦＩ ＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオローβ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５ ーヨードウラシル）を含む抗ウイルス化合物に感受性となる）。導入遺伝子によ って脂肪細胞を殺すという、本発明による肥満症の軽減において、このことは特 に価値がある。同様に、治療遺伝子の核酸配列は血管形成誘導物質をコードする ので、遺伝子発現の結果、新しい血管の増殖が起こり得る。 したがって、好ましくは、治療遺伝子の核酸配列は、全身に作用する分泌蛋白 質および脂肪細胞上もしくはその付近で作用する蛋白質からなる群より選択され る蛋白質をコードする。より好ましくは、治療遺伝子の核酸配列は、毒素、特に ジフテリア毒素Ａまたは毒素をコードする類似の遺伝子（Yamaizumiら，上述;Ro ssら(1993),上述;Palmiterら，上述;Bernsteinら，上述:Behringerら，上述;Hug hesら，上述）、ｐ１５４ポリペプチド、特にヒトもしくはマウス遺伝子から得 られるｐ１５４ポリペプチド（Serrero,上述）、アジプシン、特にセリンプロテ アーゼホモログであるアジプシン（Flierら，上述）、レプチンのようなＯｂ蛋 白質、特にヒトもしくはマウスの肥満遺伝子から得られるＯｂ蛋白質（Zhangら ，Nature，372，425(1994);Murakamlら，Biochem ．Biophys．Res．Commun.，209 ，944(1995);Considineら，J ．Clin．Invest.，95，2986(1995)）または当該分 野で記載されているようなＯＢポリペプチド（例えば、英国特許出願第2,292,38 2号）、および増殖因子、特にＶＥＧＦ、就中、ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅（Muh lhauserら，J ．Cell Biochem.，18A，DZ315(1994)）またはＶＥＧＦ₁₈₉、当該分 野で記載され（Cidら，上述）、以下でさらに述べるような他の血管形成誘導増 殖因子からなる群より選択される蛋白質をコードする。プロモーター 本発明においては、いかなるプロモーターも（すなわち、天然から単離された ものであれ、組換えＤＮＡもしくは合成技術により製造されたものであれ）、遺 伝子の転写を提供するために使用することができる。好ましくは、プロモーター は真核（望ましくは哺乳動物）細胞内での転写を指示し得るものである。プロモ ーターの機能の仕方は、ベクター上にある１または２以上のエンハンサーおよび ／またはサイレンサーの存在によって変化し得る。真核細胞内での発現に適当な ＤＮＡ配列（すなわち、「真核プロモーター」）は原核細胞内での発現に適当な ＤＮＡ配列とは異なる。一般に、真核プロモーターおよび付随する遺伝的シグナ ルは原核の系では認識されないか、もしくは機能しないし、原核プロモーターは 真核細胞内では認識されないか、もしくは機能しない。 真核細胞内で機能するプロモーター配列の比較から、保存された配列エレメン トが明らかとなっている。一般に、ＲＮＡポリメラーゼIIによって転写される真 核プロモーターは、転写開始を正確に位置づけるのに不可欠であるらしい−２５ 位付近に集中する「ＴＡＴＡボックス」によって特徴づけられる。ＴＡＴＡボッ クスは、哺乳動物の系ではＲＮＡポリメラーゼが約３０塩基対（ｂｐ）下流から 転写を始めるように指示する。ＴＡＴＡボックスは、転写開始点の上流約４０ｂ ｐおよび１１０ｂｐに位置する少なくとも２つの他の上流配列と連携して機能す る。通常、いわゆる「ＣＣＡＡＴボックス」が２つの上流配列の１つとして働き 、もう一方はしばしばＧＣに富んだセグメント（例えば、「ＧＣボックス」（例 えば、配列GGGCGGを含む）、または配列GCCACACCCおよびATGCAAAT）である。Ｃ ＣＡＡＴの相同性はＤＮＡの異なる鎖にも存在し得る。上流のプロモーターエレ メントもまた、当該分野で記載され、遺伝子のある特定のサブセットを特徴づけ るらしいシグナルのうちの１つのような、特殊化したシグナルであるかもしれな い。 転写を開始するためには、ＴＡＴＡボックスと上流の配列はそれぞれこれらの 部位に結合する調節タンパク質によって認識され、ＲＮＡポリメラーゼIIが該Ｄ ＮＡ部分に結合して正しく転写を開始できるようにすることによって転写を活性 化する。ＴＡＴＡボックスおよび上流配列外部の塩基変化は転写レベルにほとん ど影響しないが、これらのエレメントのいずれかの中での塩基変化により、転写 速度が実質的に低下する（例えば、Myersら，Science，229，2342-7(1985)；McK mightら，Science，217，316-324(1982)）。お互いの、および転写開始点に対す るこれらのエレメントの相対的な位置および配向が、すべてではないがいくつか のコーディング配列の効率よい転写に重要である。例えば、いかなるＴＡＴ Ａボックスも存在しなくても、よく機能するプロモーターもある。同様に、ＲＮ ＡポリメラーゼＩまたはIIIまたは他のＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプ ロモーターにとっての、これらのまたは他の配列の必要性は異なるかもしれない 。 したがって、プロモーター領域は長さおよび配列が変化し、配列特異的ＤＮＡ 結合蛋白に対する１または２以上のＤＮＡ結合部位および／またはエンハンサー もしくはサイレンサーをさらに包含することができる。エンハンサーおよび／ま たはサイレンサーは、同様に、プロモーター自体の外側のベクター上に存在して もよい。本発明では、目的のコーディング配列を調節するために、治療遺伝子内 で、構成的プロモーター、特にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを 優先的に用いる。このようなプロモーターおよびその変異体は当該分野で知られ 、また記載されている（例えば、Boshartら，Cell，41，521-530(1985)）。しか しながら、Ａｄ２またはＡｄ５の主要後期プロモーターおよび３つに分かれたリ ーダー、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ロングターミナルリピート並び、に文献 に記載されているような他の構成的プロモーターのような、他のプロモーターも また使用することができる。例えば、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ Wagnerら，上述）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら，Nature，296 ，39-42(1982)）、Ｇａ１４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロ モーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、およびアルカリホスファ ターゼプロモーターのような酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント を用いることができる。同様に、哺乳動物細胞のゲノムまたはこれらの細胞で増 殖するウイルス（例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス等 ）から単離されたプロモーターを使用することができる。 構成的プロモーターの代わりに、プロモーターは、適当なシグナルに応答して 上向きおよび／または下向きに調節されるプロモーターであってもよい。例えば 、ＴＮＦや別のサイトカインに応答するＩＬ−８プロモーターのような誘導プロ モーターを用いることができる。適切な誘導プロモーター系の他の例としては、 メタロチオナイン誘導プロモーター系、細菌のlacZYA発現系、テトラサイクリン 発 現系およびＴ７ポリメラーゼ系が挙げられるが、それらに限定されない。さらに 、異なる発生段階で選択的に活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝 子は胚と成体で特異的に転写される）を用いることができる。 さらに、組織特異的プロモーター、すなわち、所定の組織内で優先的に活性化 され、結果的に活性化された組織内で遺伝子産物を発現するプロモーター、特に 脂肪細胞特異的プロモーターを用いることができる。本発明の好ましい脂肪細胞 特異的プロモーターとしては、ａＰ２遺伝子の調節領域（Rossら（1990，1992お よび1993),上述）およびｐ１５４ポリペプチド遺伝子の調節領域（Serrero,上述 ）が挙げられる。脂肪細胞へのアデノウイルスを介した遺伝子導入 アデノウイルスを介した遺伝子導入において、１または２以上のアデノウイル スベクターが宿主細胞（これは好ましくは真核宿主細胞であり、最適には脂肪細 胞である）に導入される。真核宿主細胞はインビトロまたはインビボで存在し得 る。本発明によれば、細胞と本発明のアデノウイルスベクターとの「接触」は、 いかなる手段によってなされてもよく、それによってベクターは細胞に形質導入 される。このような形質導入は、いかなる適切な方法によってなされてもよい。 好ましくは、アデノウイルスベクターは、感染または形質導入により、すなわち 、ウイルスが細胞に入り込み、傍観者である高分子の取り込みを仲介する自然の 能力（例えば、アデノウイルスが受容体を介してエンドサイトーシスされる能力 ）を用いて、導入される。しかし、ベクターは、他のいかなる適切な手段（例え ば、トランスフェクション、リン酸カルシウムを介した形質転換、マイクロイン ジェクション、エレクトロポーレーション、浸透圧ショックなど）によって導入 されてもよい。 遺伝子は、広範な種々の異なるタイプの脂肪細胞に効果的に形質導入され得る 。例えば、遺伝子は、アデノウイルス受容体の数、およびアデノウイルスに対す る細胞表面受容体の親和性の両方において異なる細胞に導入され得る。本発明に お いて、インビトロまたはインビボでの遺伝子の送達が意図される細胞の種類とし ては、鳥類細胞、魚類細胞、および限定はされないが、齧歯類、サル、チンパン ジー、ネコ、イヌ、有蹄類（例えば反芻動物またはブタ）、そして好ましくはヒ ト細胞を含む哺乳類細胞が挙げられる。医薬組成物 遺伝子導入ベクターは、適切な（例えば、医薬上許容される）、担体、アジュ バント、ビヒクル、または希釈剤のような賦形剤を用いて、細胞との接触に適切 な組成物に製造され得る。このような組成物を製造する手段および投与手段は、 当該分野において記載されている（例えば、「レーミントン 薬科学」(Remingt on's Pharmaceutical Sciences) ,第１６版，Mack編（1980）参照）。適切には、 該ベクターは、各々の投与経路について通常の方法で、錠剤、カプセル剤、散剤 、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルのような、固 形、半固形、液状またはガス状の形態に製剤化することができる。該組成物が標 的器官に到達するまでに放出され、吸収されるのを防ぐために、すなわち、該組 成物の予定時の放出を確実にするために、当該分野で知られている手段を利用す ることができる。本発明の組成物の効力を失わせることがない医薬上許容される 形態を用いるべきである。医薬の剤形において、該組成物は、単独でまたは他の 医薬上有効な化合物と適当に結合させて、また組み合わせて用いることができる 。例えば、血管形成誘導刺激が必要な細胞へのＶＥＧＦポリペプチドをコードす る核酸の送達に本発明の方法を適用する際（例えば、血管閉塞もしくは狭窄があ る、すなわち血管新生もしくは循環の増大の必要がある場所での側副循環の増強 において）、このような送達は、例えば、他の血管形成誘導増殖因子による処理 、またはマトリゲル（腫瘍基底膜成分と増殖因子との複雑な混合物）（Muhlhaus erら，Circ ．Res.，77，1077-86(1995)）と組み合わせた使用等の、血管新生を 刺激する他の手段と組み合わせて用いることができる。 したがって、本発明の医薬組成物は、種々の経路によって動物体内の種々の部 位に送達され特定の効果を達成することができる（例えば、Rosenfeldら(1991) ，上述;Rosenfeldら，Clin ．Res.，39(2)，311A(1991a);Jaffeら，上述;Berkner ,上述を参照）。２つ以上の経路を投与に使用することができるが、ある特定の 経路が別の経路よりも迅速かつ有効な反応を提供し得ることを、当業者は理解す るであろう。局所または全身への送達は、体腔への製剤の外用もしくは滴下を含 む投与、エアロゾルの吸入もしくは噴射、または筋肉内、静脈内、腹膜、皮下、 内皮および局所投与を含む非経口投与により達成することができる。 本発明の組成物は、単位投与量形態で提供することができる。ここで各投与量 単位、例えば、茶匙一杯量、錠剤、液剤、または坐剤は、予め決められた量の該 組成物を単独で、または他の有効な薬剤と適当に組み合わせて含む。ここで使用 する「単位投与量形態」という語は、ヒトおよび動物の対象にとって単位投与量 としてふさわしい、物理的には別個の単位であり、各単位は、所望の効果を生じ る十分な量と計算される、予め決められた量の本発明の組成物を、単独または他 の有効な薬剤と組み合わせて、適切には、医薬上許容される希釈剤、担体または ビヒクルと共に含む。本発明の単位投与量形態の詳細は、達成されるべき特定の 効果および特定の宿主における該医薬組成物に付随する特定の薬動力学に依存す る。 したがって、本発明はまた、本発明のベクターを、好ましくは組成物の一部と して、前記の投与経路のいずれかまたは当業者に知られ且つ特定の適用にとって 適当な代替の経路を用いて投与することを含む、宿主への治療遺伝子の導入方法 を提供する。該組成物の「有効量」は、宿主内で所望の効果を生じる量であり、 それは当業者に公知の幾つかの終点を用いてモニターすることができる。宿主細 胞への本発明による宿主細胞へのベクターの効果的な遺伝子導入は、治療効果（ 例えば、治療下の特定の疾患に付随するある症状の緩和）に基づいて、または、 さらには、導入された遺伝子または宿主内での該遺伝子の発現を実証することに よって（例えば、宿主細胞内の核酸を検出するための、シークエンシングと組み 合わせたポリメラーゼ連鎖反応、ノーザンもしくはサザンハイブリダイゼーショ ン、または転写アッセイを用いるか、あるいは、導入した核酸にコードされるか 、このような導入のためにレベルもしくは機能において影響を受けた蛋白質もし くはポリペプチドを検出するための、イムノブロット分析、抗体を介した検出、 ｍＲＮＡもしくは蛋白質の半減期研究、または特殊化されたアッセイを用いて） モニターすることができる。後記実施例に記載される１つの特殊化されたアッセ イとしては、ＶＥＧＦ遺伝子にコードされた蛋白質の検出のためのウエスタンイ ムノアッセイが挙げられる。 ここに記載されるこれらの方法が決してすべてではなく、特定の適用に合った さらなる方法は、当業者には明らかであろう。さらに、該組成物の有効量は、所 望の効果を発揮することが知られている化合物との類似性を通じてさらに概算す ることができる（例えば、血管新生を刺激するために従来より用いられる化合物 は、宿主に投与されるべきＶＥＧＦ核酸の量に関する指標を提供し得る）。 さらに、本発明の組成物中に含まれる各有効薬剤の好ましい量（例えば、接触 する各細胞当たりでは、好ましくは約１〜少なくとも約１，０００アデノウイル スプラーク形成単位（ＰＦＵ）、より好ましくは約１〜少なくとも約１００アデ ノウイルスＰＦＵであるが、上記より上、すなわち、約１，０００アデノウイル スＰＦＵを超えるか、あるいは上記より下、すなわち、約１アデノウイルスＰＦ Ｕ未満のいずれかの、いかなる適当な量も利用することができる）は、インビト ロまたはインビボのいずれかでの実施のために本発明の方法を最適化した上で、 実務者によって利用される各成分の範囲の一般的指針を提供する。アデノウイル スベクターは、いかなる適当な容量の希釈剤または担体中に担持されてもよい。 しかしながら、アデノウイルスベクター濃度は、通常２×１０⁷〜２×１０¹⁴ｐ ｆｕ／ｍｌの範囲内であることが好ましく、より好ましくは約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍ ｌである。さらに、このような範囲は、特定の適用においては正当である、より 高いまたはより低い量もしくは濃度の成分の使用を妨げるものではない。例えば 、実際の用量およびスケジュールは、該組成物が他の医薬組成物と組み合わせて 投与されるかどうかによって、あるいは薬物動態、薬物性向および代謝における 個 体間差によって変動し得る。同様に、インビトロでの適用においては、その量は 、利用する特定の細胞株によって（例えば、細胞表面上に存在するアデノウイル ス受容体の数、または遺伝子導入に用いられる特定のベクターがその細胞株内で 複製する能力に基づいて）変動し得る。さらに、細胞当たりに添加されるベクタ ーの量は、ベクターに挿入される治療遺伝子の長さおよび安定性、並びにその配 列の性質によってもおそらく変動するだろう。このように、細胞当たりに添加さ れるベクターのアライバント（arrivant）は、特に、経験的に決定する必要のあ るパラメーターであり、本発明の方法に固有ではない因子（例えば、合成に関わ る費用）によって変化し得る。当業者は、特別な状況における必要性に応じて、 いかなる必要な調整も容易に行うことができる。 また、これらの実施態様に関し、１または２以上の異なるベクター（すなわち 、１または２以上の異なる治療遺伝子を各々コードする）がここに記載される方 法において用いられる場合、細胞と本発明の種々の成分との接触は、いかなる順 序で起こっても、あるいは同時に起こってもよい。好ましくは接触は同時に起こ るだろう。好ましい態様において、本発明の成分ベクターは、細胞への接触の前 に一緒に混合し、予備インキュベーションすることができる。多数のベクターを 投与する場合、好ましくは、細胞に別のベクターを接触させる前後約６週間内に 、第一のベクターを細胞に接触させる。いっそう好ましくは、細胞に別のベクタ ーを接触させる前後約２週間内に、第一のベクターを細胞に接触させる。 本発明に従ってインビボで感染した脂肪細胞は、導入した遺伝子にコードされ る蛋白質を別の解剖学的局所に送達するためのビークルとして、宿主内の別の部 位に移すことができる。このような移送は、当該分野で知られているようないか なる適当な技術（例えば、Zhangら，Microsurgery，15，269-73(1994);Boyceら ，Otolaryngol ．Clin．North Am.，27，39-68(1994)；Mosconaら，Ann ．Plast． Surg. ，33，500-6(1994);Krabatschら，J ．Card．Surg.，10，46-51(1995)を参 照）によって成されてもよい。そのように導入される脂肪細胞は、同一の宿主由 来である必要はなく、あるいは同一種の宿主由来である必要すらない。しか しながら、好ましくは、脂肪細胞は同一の宿主内に導入される。脂肪組織インプラント 本発明の脂肪組織インプラントは、ドナーの体内の第二の部位または免疫学的 に適合する宿主に移植されると、該脂肪組織インプラントの血管分布を増大させ るように処理された、該ドナーから除去された脂肪組織である。該インプラント は、脂肪細胞を含む脂肪組織に、プロモーターと、それに機能的に連結した、血 管形成誘導蛋白またはｍＲＮＡをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベク ターを、インビボで接触させること（すなわち、上記の本発明の方法）によって 、並びに他の手段によって製造することができる。 アデノウイルスベクターは、該インプラントの脂肪細胞に、血管形成誘導蛋白 およびｍＲＮＡをインビボで送達するのに適当であるが、それらはex vivoでも 用いることができる。すなわち、脂肪組織を宿主から除去し、これに血管形成誘 導遺伝子を含むアデノウイルスベクターを接触させて該インプラントを製造する ことができる。次いで、それを、（もし適切または必要であれば）成形して、該 脂肪組織を元々除去した宿主または免疫学的に適合する第二の宿主に移植するこ とができる。 １または２以上の血管形成誘導遺伝子をインビトロまたはインビボで脂肪組織 へ導入してインプラントを形成するいかなる適当な手段も、本発明の脂肪組織イ ンプラントを形成するのに用いることができる。血管形成誘導ＤＮＡは、ポリリ シン結合物と複合体を形成させ、インプラント中に組み込まれるべき脂肪組織に 接触させることができる。あるいは、該ＤＮＡをリン酸カルシウム中で共沈澱さ せ、脂肪組織に接触させることができる。別の代替手段は、脂肪細胞または脂肪 組織中の他の細胞に形質導入する能力を有する、アデノウイルスベクター以外の ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはヘルペス ウイルスベクターに、血管形成誘導遺伝子を組込み、そのベクターを脂肪組織に 接触させるというものである。さらに、血管形成誘導ＤＮＡは、リポソーム、脂 質小胞、または陽イオン性もしくは両性イオン性脂質導入剤（例えば、リポフェ クタミン（登録商標），Gibco BRL，Bethesda，MD）を介して脂肪組織に導入す ることができる。これらの遺伝子導入法のインビボおよびインビトロでの利用性 および制限は、当業者には周知である。 血管形成誘導遺伝子を脂肪組織の細胞に導入するのではなく、あるいはそれに 加えて、宿主内に移植された時に脂肪組織の血管分布を増大させる他のいかなる 適当な仕方によっても脂肪組織を処理することができる。 したがって、血管形成誘導蛋白、特にＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、またはＶＥ ＧＦ₁₈₉を発現する血管形成誘導遺伝子が、本発明のインプラントを形成するの に有用に用いられ得るが、血管形成誘導蛋白それ自体もまた、有用に用いること ができる。ＶＥＧＦ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦおよび上皮増殖因子は、本発明 における使用に適当な血管形成誘導蛋白の例である。好ましくは、血管新生を刺 激するのに十分な量の血管形成誘導蛋白を含有する溶液を、脂肪組織に灌流する 。約１０^-18〜約１０^-6グラム活性蛋白／細胞、好ましくは約１０^-15〜約１０^{-1 2} グラム活性蛋白／細胞を、インプラントを形成するために脂肪組織に投与する のが望ましい。 脂肪組織に血管形成誘導遺伝子または蛋白を接触させるのに加えて、本発明の インプラントは、リンパ形成誘導遺伝子または蛋白（例えば、ＶＥＧＦ−Ｃ）で 任意に処理される。いかなる特定の理論によっても縛られたくはないが、リンパ 新生は、インプラントからの細胞の損失（すなわち、縮小化）を防ぐのを助ける 移植部位から溢出した血液成分およびリンパが、鬱滞するのを防ぐのに有用であ ると信じられている。 有利なことに、血管形成誘導遺伝子または蛋白と接触させた移植脂肪組織は、 宿主内に移植されると血管新生を向上させ、および／または移植後の縮小化の外 見という形で現れる細胞の損失をより受けにくい。さらに、脂肪組織の脂肪細胞 が改変されて血管形成誘導蛋白に加えて第二の治療蛋白質を含むなら、血管形成 誘導蛋白によって生じる血管新生の増大は、脂肪組織外の部位への該第二の治療 蛋白質のより効率的な送達を提供する。他の考慮すべき事柄 本発明による治療遺伝子の導入および発現に関しては、当業者は、例えば、転 写、ｍＲＮＡの翻訳、および転写後プロセッシングのような、さまざまな遺伝的 シグナルおよびプロセッシングが、細胞内の核酸および蛋白質／ペプチドのレベ ルを制御しているのを承知している。ＤＮＡのＲＮＡへの転写は、前述のように 機能的プロモーターを必要とする。転写量は、ＲＮＡポリメラーゼが特定のシグ ナルを認識して、そこで転写を開始し、そして終結することができる効率によっ て調節される。これらの工程、ならびに初期ｍＲＮＡの伸長および他の工程はす べて、細胞内にさらに存在する種々の他の成分により、例えば、転写プロセスの 一部となり得る他の蛋白質、細胞内に存在するリボヌクレオチドの濃度、などに よって影響を受けやすい。 蛋白質の発現もまた、ＤＮＡシグナルによって調節されるＲＮＡ転写レベル、 およびＤＮＡ鋳型のレベルに依存する。同様に、ｍＲＮＡの翻訳には、最低でも 、通常メッセージの５’末端の１０〜１００ヌクレオチドの範囲内に位置するＡ ＵＧ開始コドンが必要である。至適な翻訳を生じる完全なコザックのコンセンサ ス配列に相似の、ＡＵＧ開始コドンの横にある配列が、真核リボソームによるＡ ＵＧ開始コドンの認識に影響を与えることが分かっている（例えば、Kozak，J ． Molec．Biol. ，196，947-950 1987）を参照）。また、細胞内での治療遺伝子の 首尾よい発現には、得られる蛋白質／ペプチドの翻訳後の修飾が必要である。し たがって、組換え蛋白質またはペプチドの産生は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）がｍ ＲＮＡに転写される効率、ｍＲＮＡが蛋白質に翻訳される効率、および翻訳後の 修飾を実施する細胞の能力によって影響され得る。これらは全て、当業者が承知 し、且つ所望の最終結果を達成するために、標準的手段を用いて操作し得る要素 である。 このような考えに沿うと、組換えに続く蛋白質産生を最適化するには、治療遺 伝子の導入に用いられるベクターは、治療遺伝子のコーディング領域の後にポリ アデニル化部位をさらに含むことが好ましい。また、適切な転写シグナルはすべ て（妥当であれば翻訳シグナルも）、治療遺伝子がそれが導入された細胞内で正 しく発現するように、組換えベクター上に正確に配列されることが好ましい。所 望であれば、該ベクターはまた、ｍＲＮＡの産生を容易にするためにスプライス 部位（すなわち、スプライス受容体およびスプライス供与体部位）を組込むこと もできる。さらに、導入される治療遺伝子が、プロセッシングもしくは分泌され る蛋白質であるか、あるいは、例えば、ミトコンドリアや小胞体のような細胞内 オルガネラ内で機能する蛋白質をコードするならば、該ベクターは、プロセッシ ング、分泌、細胞内局在化などのための適切な配列をさらに含むことが好ましい 。 本発明のベクター上に位置するプロモーター、コーディング配列、治療遺伝子 、マーカー遺伝子などに関し、このようなエレメントは前述の通りであり、独立 に、あるいは結合して、カセットの一部として存在し得る。本発明において、「 カセット」は、核酸配列のサブクローニングおよび回収を容易にするか（例えば 、１または２以上の制限部位）、あるいは特定の核酸配列の発現を容易にする（ 例えば、ポリアデニル化部位またはスプライス部位）機能を有する特定の塩基配 列である。他の用途 本発明は、脂肪細胞への遺伝子導入によって直接的に治療し得る疾患あるいは 病態について特段の有用性を有する、脂肪細胞への遺伝子導入の為の方法並びに ベクターを提供するものである。脂肪細胞は宿主の代謝に広範な影響を及ぼすの で、アデノウイルスによって仲介される遺伝子導入は、肥満症、糖尿病、体脂肪 蓄積亢進、高血糖、高インスリン症、低温症、高血圧症、高コレステロール血症 、高脂血症等からなる群より選択される障害のようなエネルー貯蔵障害の治療に 好適に用いられる。 本発明の方法はまた、他の疾患や病態の治療についても有用である。特に、本 発明によれば、脂肪細胞に遺伝子を導入するためにアデノウイルスを使用するこ とができ、且つ、脂肪組織内で限られた感染を少なくとも確立させ、続いて、該 感染脂肪細胞が宿主内の別の部位へ移り、その部位で、該導入された遺伝子によ ってコードされた蛋白質がその効果を発揮することができる。遺伝子導入のため のビークルとして使用し得る他のある組織移植片とは異なり、脂肪細胞は通常、 非免疫原性であるので、このような様式で脂肪細胞を遺伝子導入のためのビーク ルとして使用することは有利である。 特に、本発明のこの方法は、血管形成誘導物質あるいは増殖因子等の蛋白質を 、心臓または筋肉のような虚血領域に送達するために、あるいはより広く虚血疾 患の治療において使用することができる。血管新生は、それにより新しい血管が 現存する毛細血管から形成されるそのプロセスをいう。したがって、血管新生の プロセスならびにそのプロセスを調節する血管形成誘導因子は、胚発生、炎症お よび創傷治癒に関連しており、また糖尿病性の網膜障害、慢性関節リウマチ、癌 や慢性の炎症性疾患のような病的状態に対しても寄与する（例えば、合衆国特許 第5,318,957号（Cidら）；Brooksら，Science，264，569-571(1994)を参照）。 従って、創傷治癒を容易にする、および癌あるいは炎症（特に血管の炎症あるい は全身性の脈管炎）を治療する為の手段として血管新生を刺激すべく、血管形成 誘導増殖因子を宿主または宿主の特定の部位に送達する為に、本発明のアプロー チをさらに使用することができる。特に、該アプローチは、冠状バイパス手術の ようなより侵襲性の手法を用いる代わりに、血管形成誘導遺伝子を含有するベク ターを注入し、遮断された領域の周りに新しい血管が増殖するのを誘導するとい う方法に使用することができる。本発明によれば、以下の、当該分野で記載され ている血管形成誘導増殖因子をコードする遺伝子を、さらに血管形成誘導物質と 共に使用することができる：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、特にＶＥＧＦ₁₂₁ 、ＶＥＧＦ₁₆₅あるいはＶＥＧＦ₁₈₉、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩 基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子、アルフ ァおよびベータ腫瘍壊死因子、血小板由来増殖因子およびアンギオゲニン。 さらに、脂肪細胞組織の領域内で局所的に、あるいは、脂肪細胞内での産生に 続いて血流中へ拡散する分泌蛋白質をコードする遺伝子の場合には、全身的に、 その効果を発揮する蛋白質をコードする遺伝子を導入するための部位として、脂 肪細胞をインビボで使用することができる。したがって、本発明の方法およびベ クターはまた、脂肪細胞および／またはそれによって影響を受ける代謝プロセス に直接関連していない疾患や病態の治療にも使用することができる。 例えば、該方法をＶＥＧＦ（特に、ＶＥＧＦ₁₂₁またはＶＥＧＦ₁₆₅）、ａＦＧ ＦおよびｂＦＧＦ、ならびに組織虚血を起こしたところで血管新生を刺激する為 に局所的に作用することができる他の血管形成誘導増殖因子をコードする遺伝子 を導入する為に好適に使用することができる。血管形成誘導物質をコードしてい る遺伝子のアデノウイスルベクターによる導入は、ある一定の持続期間、高濃度 のこのような物質を局所的な様式で提供する為に使用することができる。すなわ ち、局所的な環境で血管新生を誘導し、しかも標的組織内での慢性的な血管新生 の過剰誘導のリスク、および網膜や滑膜のように敏感な非罹患器官、あるいは不 顕性の腫瘍内での無差別な血管新生誘導のリスクを最小限に抑えるのである（Fo lkmanら，J ．Biol．Chem.，267，10931-34(1992)）。同様に、該方法は、好まし くは、癌細胞の治療に関して細胞障害効果を刺激するように作用し得る、５−フ ルオロウラシル（５−ＦＵ）、シスプラチンおよびその他の化学療法剤に対する 感受性を局所的に増大させるのに使用することができる。 全身で作用する分泌蛋白質については、種々の治療遺伝子をコードするベクタ ーを用いて本発明の方法を使用することができる。例えば、該治療遺伝子は、限 定されるわけではないが、遺伝的欠損症の治療の為のα１−アンチトリプシンま たはアデノシンデアミナーゼ、血友病の為の第VIII因子、出血性障害の為の他の 血液凝固因子、慢性腎不全および骨髄抑制性障害の為のエリスロポエチン、宿主 防御反応を増強する為の蛋白質（例えば、抗ウイルス蛋白質または免疫調節剤） および抗腫瘍剤（例えば、腫瘍抑制蛋白質およびインターフェロン類）の遺伝子 を包含し得る。さらに、本発明の方法およびベクターは、抗高血圧薬や抗血液凝 固薬、あるいは受容体アゴニストやアンタゴニストのような薬理剤を、これらの 薬剤を生産する手段としてトランスフェクトあるいは感染させた脂肪細胞を用い て送達するのに使用することができる。 治療的血管新生を誘導する為のＶＥＧＦ蛋白質の使用に関して、虚血が起こっ ているところへにＶＥＧＦ蛋白質を投与することにより、インビボでの新しい血 管のネットワークの発生を誘導できることがいくつかの研究で証明されている。 ウサギ下肢の虚血モデルでは、ＶＥＧＦの単回ボーラスまたは反復投与により血 管分布および血流の増進が引き起こされ、血行動力学的ならびに臨床的機能の両 方ともが改善された（Ferraraら，Ann ．N.Y．Acad．Sci.，752，246-256(1995); Takeshitaら，Circulation，90，II228-II234(1994);Takeshitaら，J ．Clin．In vest. ，93，662-670(1994a);Bautersら，Am ．J．Physiol.，267，H1263-H1271(1 994)）。インビボでの血管新生に関して、ＶＥＧＦとｂＦＧＦとの相乗効果が同 様のモデルを使用して証明されている（Asaharaら，Circu1ation，92，II-365-I I-371(1995)）。左回旋冠状動脈（ＬＣｘ）にアメロイド圧迫器（ameroid const rictor）を用いたイヌの心筋虚血モデルにおいては、ＶＥＧＦを留置カテーテル によって末梢ＬＣｘ内に２８日間毎日投与した結果、虚血心筋層への側副血流が 増加し、また心筋内の血管分布密度が増加した（Banaiら，Circulation，89，21 83-2189(1994)）。また、アメロイド圧迫器を用いたブタの慢性虚血モデルにお いては、ＶＥＧＦの心筋層への６週間にわたる連続投与の結果、虚血領域の減少 、低コントラスト到達遅延（less contrast arrival delay）および駆出率の改 善と心筋壁の肥厚を示す磁気共鳴映像法によって実証されるように、心筋の血管 新生が生じた（Pearlmanら，Nature Med.，1，1085-1089(1995)）。 遺伝子導入はある一定の持続期間、治療用蛋白質を高濃度に供給する「持続性 放出力プセル」に相当するものを提供するので、ベクターによって仲介される手 法を用いたＶＥＧＦ遺伝子（および他の遺伝子）の送達は有利である。対照的に 、ＶＥＧＦ蛋白質およびある種の他の蛋白質は、極めて短い生物学的半減期（例 えば、ＶＥＧＦについては６分間）を有する（Takeshitaら(1994a)，上述）。後 肢虚血の動物モデルが、ＶＥＧＦ蛋白質の動脈内への単回ボーラスにより血管新 生の誘導を示す一方で（Takeshitaら(1994a)，上述）、心筋虚血への冠状動脈内 投与がそうであるように（Banaiら，上述；Pearlmanら，上述）、肢虚血への筋 肉内投与は数日間にわたる反復投与を必要とする（Takeshitaら(1994),上述）。 対照的に、AdCMV.VEGFベクターは少なくとも５日間はＶＥＧＦ蛋白質の持続的発 現を提供することができる。また、遺伝子導入は虚血肢あるいは虚血心筋層への 高濃度のＶＥＧＦの局所的な送達を提供するための戦略として用いることができ る。対照的に、血管形成誘導因子の全身投与には、血管が乱れている部位あるい は網膜や滑膜、不顕性の腫瘍等の、血管新生が重大な悪い結果をもたらすような 部位で、不適切な血管新生を誘導するという理論上のリスクがある（Folkmanら ，J ．Biol．Chem.，267，10931-10934(1992)）。最後に、ＶＥＧＦの全身投与は 、ラットにおいて低血圧を引き起こすことが報告されている（Yangら，Circulat ion ，92，I-713(要約)(1995)）。ＶＥＧＦまたはその他の遺伝子（特に血管形成 誘導物質をコードしている遺伝子）のアデノウイルスを介した送達が有用である かもしれない臨床応用としては、バイパス不可能な虚血性心臓疾患あるいは末梢 の血管疾患、虚血吻合の増強、および創傷治癒の促進が挙げられる。 脂肪細胞への遺伝子送達の為のアデノウイルスの使用と比較すると、理論的に は、現在臨床試験中の他の遺伝子導入システム（例えばレトロウイルス、アデノ 随伴ウイルス、プラスミド−リポソーム複合体、および裸のプラスミドＤＮＡの 使用）（Crystalら，Science，270，404-410(1995)に総説）も、その代わりとし て使用することができる。近位動脈へ送達された裸のプラスミドは、ウサギ後肢 虚血モデル（Takeshitaら，「ウサギ後肢虚血モデルにおける血管内皮増殖因子 の動脈遺伝子導入に続く治療的血管新生」（Therapeutic Angiogenesis Followi ng Arterial Gene Transfer of Vascular Endothelial Growth Factor in a Rab bit Model of Hind Limb Ischemia)，Proc ．Natl．Acad．Sci.，(1995)）におい て血管新生を誘導するのに十分なＶＥＧＦを供給するようであり、臨床試験にお いて評価中ではあるが(Isner，「再狭窄における動脈遺伝子導入」（Arterial Gene Transfer for Restenosis)，Recombinant DNA Advisory Committee(RAC)Re port No．9508-118（Office of Recombinant DNA Activities，NIH:Bethesda,MD (1995)）、インビボで送達された裸のプラスミドからの発現は、アデノウイルス ベクター系を用いて観察されるよりも数オーダーの規模で少ない（Crystalら(19 95),上述;Nabelら，Cardiovasc ．Res.，28，445-455(1994)）。インビボでの遺 伝子導入では、レトロウイルスベクターは、インビボでの不活性化に対する感受 性および新しい遺伝子を導入するのに標的細胞の増殖を必要とするということで 制限される（Crystalら(1995),上述）。プラスミド−リポソーム複合体は、イン ビボでの心血管関連遺伝子の導入に関しては、比較的効率が悪い(Crystalら(199 5),上述;Nabelら，上述）。対照的に、アデノウイルスベクターは、ここに記載 される脂肪組織への遺伝子の送達、特に、治療上の血管新生の為のＶＥＧＦ関連 遺伝子の送達に自らを理想的なものとする上述の特性を有する。例えば、アデノ ウイルスベクターは少なくとも１週間該遺伝子を高レベルで発現し、心血管組織 に遺伝子を導入するのに有効である。このことは、ＶＥＧＦ蛋白質の短い半減期 を考慮すると特に有利である。さらに、アデノウイルスを介した遺伝子発現の自 己限定的性質は、標的組織内で過剰に血管新生を起こすリスクが減少すること（ および時経時的に減少し続けること）を意味する。外来遺伝子を標的細胞の染色 体内に組み込み、そのために、必要とされる後も長く血管形成誘導刺激を不適切 に送達するリスク、および外来遺伝子の調節／発現による妨害のリスクを有して いるアデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターとは対照的に、アデノウ イルスベクターによって導入された新しい遺伝子は染色体外の位置で機能する。 さらに、アデノウイルスベクターは分裂中の細胞および分裂していない細胞の両 方に、高レベルな効率で遺伝子導入を達成し、脂肪組織同様、骨格筋、心筋層、 ならびに血管内皮のような多くの心血管関連部位での局所的且つ持続的なレベル の蛋白質発現を生じさせる。 前述の用途に加えて、本発明の脂肪組織インプラントは、美容整形あるいは再 構築外科手術に特に有用である。例えば、そのようなインプラントは乳房または 陰茎の増大化に使用することができる。 本発明のさらなる用途や利益については当業者には明白であろう。実施例 以下の実施例にさらに本発明を説明するが、勿論、何らその範囲を限定して解 釈されるべきではない。 実施例１ 本実施例に、さらにここに記載され、且つMagovernらの「血管内皮増殖因子を 発現しているアデノウイルスベクターによって非虚血性組織内で誘導される局所 的血管新生」（Regional Angiogenesis induced in Non-Ischemic Tissue by an Adenovirus Vector expressing Vascular Endothelial Growth Factor）（Huma n Gene Therapy ，8，215-227(1997)）に記載された実験で使用されるアデノウイ ルスベクターの構築について述べる。 インビボでの脂肪細胞への遺伝子導入を評価する為に、幾つかの複製欠損組換 えアデノウイルスベクターを用いた。これらのベクターにはAd.RSVβgal、AdCMV CATおよびAdCMV.VEGFが含まれる。Ad.RSVβgalは、前に記載（Setoguchiら，上 述）されているように、Ｅｌ−Ｅ３−の、Ａｄ５をベースにしたベクターであっ て、プロモーターとしてのラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートの制 御下にある大腸菌βガラクトシダーゼコーディング配列、およびそれに続くＳＶ ４０の核移行シグナルを含有している。AdCMV.VEGF(すなわちAdCMV.VEGF₁₆₅)は Ｅ１ａ−、部分Ｅ１ｂ−、部分Ｅ３−のアデノウイルスベクターであって、１６ ５アミノ酸型のヒトＶＥＧＦのｃＤＮＡ（すなわち、ＶＥＧＦ₁₆₅、Muhlhauser ら，Circ ．Res.，77，1077-1086(1995)）を駆動するサイトメガロウイルス（Ｃ ＭＶ）の前初期プロモーター／エンハンサーを有する発現カセットをＥ１位に含 有している。AdCMVCATはAdCMV.VEGFと似てはいるが、ＶＥＧＦの配列の代わりに クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のコーディング配 列を含有している（Kass-Eislerら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，90，11498-50 2(1993)）。AdCMV.Null（AdCMV.VEGFと似てはいるが、発現カセット内に遺伝子 を含まない）をコントロールのベクターとして用いた（Williamsら，J ．Vasc．S urg. ，19，916-923(1994)）。 AdCMV.VEGFの構築については、分泌の為のシグナル配列を含むＶＥＧＦ₁₆₅の ｃＤＮＡ（Connら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，87，2628-32(1990)）を、構成的 なＣＭＶ前初期プロモーター／エンハンサーの制御下に該ｃＤＮＡが置かれるよ うに、発現プラスミド（Muhlhauserら(1995),上述）内へ挿入した。該発現プラ スミドはまた、相同組換え配列として働くヌクレオチド３３８４からヌクレオチ ド５７７８（すなわち、９．２４から１６．０５マップ単位）のＡｄ５配列を含 有している。ＶＥＧＦ₁₆₅のｃＤＮＡを担持するプラスミドをプラスミドpJM17（ F．Grahamより）と共に２９３細胞（ATCC CRL1573;ヒト胚の腎細胞株であってＡ ｄ５によってトランスフォームされ、Ｅ１領域をトランスに発現する）に共トラ ンスフェクションした。該プラスミドpJM17は全長のＡｄ５ ＤＮＡ（３６ｋｂ ）とpBRX、Ｅ１領域内に置かれた４．３ｋｂのインサートを含有し、したがって アデノウイルスのキャプシドへの最大のパッケージング限界（McGroryら，Virol ogy ，163，614-17(1988)）をおよそ２ｋｂ程超えている。２９３細胞内での発現 プラスミドとpJM17との間の相同組換えの結果、Ｅ１領域とpBRXインサートが発 現プラスミド由来の発現カセットで置換された。Ad.RSVβgalおよびAdCMVCATを 同様にして調製した。 これらのＥ１欠損アデノウイルスの増殖は２９３細胞に限られている。これら の実験の為に、種々のベクターで形質導入された２９３細胞を、１０％熱非働化 胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および ５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべて、Biofluids，Rockville，MDから） を加えた改良最少必須培地（ＩＭＥＭ）中で増殖させた。共トランスフェクショ ンに続いて、個々のウイルスプラークを単離し、２９３細胞内で増幅させ、前に 記載された（Rosenfeldら，上述）ＣｓＣｌ密度精製によって精製した。続いて 、該調製物を１０％グリセロールを加えた透析バッファー（１０ｍＭトリス−塩 酸， １ｍＭ ＭｇＣｌ₂，ｐＨ７．４）中、−７０℃で透析、保存した。各ウイルス ストックの力価を以前に記載されたようにして、２９３細胞中でプラークアッセ イにて測定した；力価は常に５×１０⁹〜２×１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌの範囲であっ た。 実施例２ 本実施例では、インビボでの脂肪細胞組織へのアデノウイルスを介した遺伝子 導入について説明する。 全ての研究に雄性Sprague-Dawleyラット（２５０から３００ｇｍ）を使用した 。全ての手順と動物の飼育は規格化されたガイドラインに従った。動物をケタミ ン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内投与により 麻酔し、滅菌条件下で正中開腹術を行った。腸を腹部の反対側に移動させ、腹膜 後方の脂肪を確認した。ベクターを投与する側（右対左）を術前に無作為に決定 した。一本の６−０非吸収性単繊維縫合糸を脂肪組織の中心に置き、注射する側 に印をつけた。５０μｌの容量のアデノウイルスベクターを３０ゲージ針をつけ た０．５ｍｌシリンジを用いて投与した。均一に送達されるように針の先端を脂 肪の表面から５ｍｍの深さに置き、これは小さな膨疹が現れることにより確認さ れた。擬（sham）処理した動物には確認用の縫合糸を置いたが、ベクターの投与 は行わなかった。腸を正常な位置に戻し、腹部を非吸収性縫合糸で単層に縫合し た。 ラットに２．２×１０⁹ｐｆｕのAd.RSVβgalを感染させ、４８時間後、この動 物を屠殺した。ラット腹膜後方脂肪組織の切片を取り出し、４％ホルマリン中、 ４℃で３時間固定した。遺伝子導入、特にβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝 子によりコードされるｌａｃＺ遺伝子産物の存在を、以前に報告されているよう に（Setoguchiら，上述;Mastrangeliら，上述）、Ｘ−ｇａｌ試薬（５−ブロモ −４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド，Boehringer Man nheim Corp.，Indianapolis，IN）を用いて細胞を染色することにより決定した 。細胞（特に核の領域）が青色に染色されるとき、ｌａｃＺ遺伝子産物の発現 は陽性と考えられる。Ad.RSVβgalに感染後、脂肪細胞は青色に染色され、視覚 化され（１００×）、組織サンプルの暗部領域として顕微鏡写真に撮影された。 対照的に、非感染細胞は青色に染色されず、AdCMV.Null処理した動物および実験 を受けていない（非処理）動物ではβ−ガラクトシダーゼは確認されなかった。 これらの結果から、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の導入、およびそれ に続くこの遺伝子の発現がインビボで脂肪細胞において起こったことが確認され る。 同様の実験で、AdCMVCATもまたインビボでラット腹膜後方脂肪組織に送達され た。詳細には、総容量１００μｌのAdCMVCATを、０、１０⁴、１０⁵、１０⁶、１ ０⁷、１０⁸および１０⁹ｐｆｕの投与量でラット脂肪組織に注射した（各投与量 につきｎ＝３の動物）。組織を４８時間後採取し、クロラムフェニコールアセチ ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のレベルを薄層クロマトグラフィーおよび蛍光 画像装置分析（Kass-Eislerら，上述）により定量した。相対ＣＡＴ活性は、ク ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼによるクロラムフェニコールの そのアセチル化対応物への変換率として記録した。 これらの結果（図１に示す）は、より高い投与量のAdCMVCATを注射すると変換 率が高くなることを示す。これはおそらく、感染多重度が高くなることにより遺 伝子導入が増加するためと考えられる。さらにこれらの結果から、インビボでの クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼレポーター遺伝子の脂肪細胞 への導入が確認される。１０⁷の投与量でグラフがピークに達するという事実は 、アッセイの機能がこの投与量で飽和になることを示す。この飽和がなければ、 より高い投与量でさらに高いレベルのＣＡＴ産生が検出されると思われる。 さらに、経時的な実験により、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ ーゼ活性は遺伝子導入後７日間まで高いレベルで検出することができ、遺伝子導 入後１０日間までより低いレベルで検出することができることが示された（図２ ）。この実験で約１０⁹ｐｆｕ／５０μｌのAdCMVCATがラット腹膜後方脂肪に送 達された。所定の時間で動物を屠殺し、ＣＡＴアッセイを行った。値はＣＡＴ変 換率 として決定し、これはｍｇ蛋白質に換算するか、または換算しなかった。各時間 点の条件につき３匹の動物を屠殺した。 AdCMV.VEGFベクターによりコードされるＶＥＧＦ遺伝子もまたインビボでラッ トに送達された。詳細には、ラット脂肪組織に１０¹¹ｐｆｕのAdCMV.VEGFまたは 陽性コントロールとして５０ｎｇの組換えヒトＶＥＧＦを注射した。またラット 脂肪組織に陰性コントロールとして１０¹¹ｐｆｕのAd.RSVβgalを注射した。遺 伝子導入後２４時間以内にラット脂肪組織を切除し、細切し、ダルベッコ改変イ ーグル培地（２ｍｌ／ｇ組織）に３７℃で６時間浸漬した。細胞を培養した培地 のアリコート（２５μｌ）を還元条件下、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分 離し、ニトロセルロース膜に転写し、成熟ヒトＶＥＧＦのＮ末端の最初の２０個 のアミノ酸に対するポリクローナル抗体（Tischerら，J ．Biol．Chem.，266，11 947-54（1991））を、０．２％グルタルアルデヒドを用いてキャリアー蛋白質で あるキーホールリンペットヘモシアニンに結合させた、１：５００の希釈率の該 ペプチド、およびストレプトアビジン・アルカリホスファターゼ複合体と共に用 いるためにビオチニル化された、１：１００００の希釈率の二次抗体（ヤギ抗ウ サギＩｇＧ Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA）とともに用いて、標 準的なウエスタンイムノアッセイの手順によりアッセイした。ウエスタンアッセ イの結果から、AdCMV.VEGFベクターによりコードされるＶＥＧＦ遺伝子のインビ ボでのラット脂肪細胞への導入、および宿主脂肪細胞によるＶＥＧＦ₁₆₅蛋白質 の産生が確認される。すなわち、適当な大きさのＶＥＧＦ蛋白質のバンドが、陽 性コントロール組換えＶＥＧＦを用いたとき、およびAdCMV.VEGFを導入したとき は観察されるが、Ad.RSVβgalを導入したときは観察されないことが確認される 。 ＶＥＧＦ蛋白質の産生量は、ヒトＶＥＧＦ蛋白質を検出する酵素結合性免疫測 定法（ＥＬＩＳＡ）(Cytokit Red VEGF enzyme immunoassay，CytImmune Scienc es，College Park，MD)を用いて定量した。ラット腹膜後方脂肪にコントロール 陰性ベクターAdNull（１０¹¹粒子／５０μｌ）またはAdCMV.VEGF（１０¹¹粒子／ ５０μｌ）のいずれかを注射した。この動物を直ちに、またはベクター投与の１ 、２、５、１０もしくは２０日後に屠殺した。脂肪を切除し、細切し、ダルベッ コ改変イーグル培地（２ｍｌ／ｇｍ組織）に３７℃で６時間浸漬し、分泌蛋白質 を組織から培地に放出させた。組織培養培地のアリコート（２５μｌ）をＥＬＩ ＳＡの準備のために９６穴プレートに入れた。製造業者の説明書に従ってアッセ イを行い、ＶＥＧＦ濃度をｍｇ蛋白質に換算した。各時点で、条件あたり２匹の 動物を屠殺した。ＣＡＴアッセイを３回ずつ行った。 図３に示すように、脂肪組織におけるＶＥＧＦ発現の経時的な定量から、AdCM V.Nullの投与は、試験したどの時点においてもベースラインを越える有意に増加 したレベルのＶＥＧＦをもたらさなかったことが確認された。対照的に、AdCMV. VEGFの投与は、ベースラインのＶＥＧＦ発現を越える６倍以上の増加をもたらし 、ベクター投与の約５日後に発現のピークが現れた。１０日目までにＶＥＧＦレ ベルはベースラインに戻った。AdCMV.VEGF投与の１、２および５日後のこれらの 組織におけるＶＥＧＦのレベルは、AdCMV.Null投与後の組織におけるＶＥＧＦレ ベルに比べて有意に高かった（ｐ＜０．０５、各時点）。ベクター投与直後に得 た０日目のＶＥＧＦのレベルは、実験を受けていない動物におけるレベルと同様 であり、このことから、ウイルス製剤にＶＥＧＦ蛋白質が混入していなかったこ とが確認される（ｐ＞０．８）。処理した動物の血清中に、ＶＥＧＦのベースラ インレベルを越える増加は検出されなかった。これはアデノウイルスベクター送 達が局在化した遺伝子導入ストラテジーを提供するという観察と一致する。 AdCMV.VEGFの投与の４８時間後、ＶＥＧＦ蛋白質の存在を確認するために脂肪 組織の免疫組織化学的染色を行った。これらの実験で、非特異的結合を防ぐため にスライド上のパラフィン切片を１．５％ヤギ血清で２０分間ブロッキングし、 次いで１μｇ／ｍｌの濃度の一次抗体（ウサギ抗ヒトＶＥＧＦ;Santa Cruz Biot echnology）に１時間暴露した。陰性コントール抗体であるウサギポリクローナ ル抗クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(５’→３’，Boulder， CO)を、各組織の反復実験切片に同じ濃度で適用した。試験抗体およびコントロ ール抗体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。アッセイコントロールとし て、パラレルに行ったスライドからは一次抗体を除いた。これらのスライドを、 ビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ラット血清蛋白質に対してアフィニティー精 製したもの）、ＡＢＣ試薬（Vector Laboratories，Burlingame，CO）(それぞれ ３０分間)、およびペルオキシダーゼ反応の基質としてジアミノベンジジン（４ 分間）に順次暴露し、次いでヘマトキシリンで対比染色した。 脂肪組織の免疫組織化学的染色から、AdCMV.VEGF処理した組織の脂肪細胞およ び内皮細胞の細胞質にＶＥＧＦが存在し、AdCMV.Null処理した組織にはＶＥＧＦ が存在しないことが確認された。 コードされたＶＥＧＦ遺伝子産物が血管分布に何らかの影響を及ぼすかを調べ るためにインビボでの遺伝子導入の１０日後、組織切片を検査した。腹膜後方脂 肪組織へのAdCMV.VEGFの投与が脂肪組織に血管新生を引き起こすかどうかを調べ るために２つのストラテジーを用いた。（１）生組織中のインビボでの顕微鏡レ ベル（倍率３０×）で評価した血管数の定量、および（２）組織学による２０μ ｍ未満の血管数の定量。全ての研究は１０⁹ｐｆｕのベクター投与量を用いて行 われた。コントロール群には次のものが含まれる：注射直後の注射された腹膜後 方脂肪組織；反対側の（非処理側の）腹膜後方脂肪組織；擬注射した脂肪組織； およびAdCMV.Nullコントールベクターを注射した腹膜後方脂肪組織。 生組織中の顕微鏡下の血管数の定量は、前記のように腹膜後方脂肪組織にAdCM V.VEGF（各時点につき最低３匹の動物）またはAdCMV.Null（各時点につき最低３ 匹の動物）を注射することにより行った。その直後、およびベクター投与の５、 １０、２０および３０日後に動物を麻酔し、腹膜後方脂肪組織を露出させ、注射 した（同側の）組織および注射していない（対側の）組織をそのままの位置（in situ）で解剖顕微鏡下(Nikon SMZ-U，Morrell Instrument Co.，Inc.，Melville ，NY)、１５ｃｍ（×３０）の距離で検査した。写真スライドを用意し（Ektachr ome 64T;Kodak，Rochester，NY）、このスライドを３ｍの距離でスクリーン上に 映写した。中心として確認用の縫合糸を用い、この縫合糸の周囲にin situ で１ｃｍの距離に対応する直径の円をスクリーン上に描いた。この円を横断する 血管数を３人の盲検観察者により数えてもらい、１人の観察者、１つのスライド につき最低３つの血管を数えた。これらの３つの計数結果の平均を、各時点にお ける各動物について脂肪組織の直径１ｃｍの円中の顕微鏡下の血管数として記録 した。 脂肪組織中の２０μｍ未満の血管数を定量するために、総血管数の定量に用い たのと同じ群の動物から、確認用の縫合糸の周りを中心とする同じ側の（処理し た）腹膜後方脂肪組織および反対側の（非処理）脂肪組織の両方から１ｃｍ³の サンプルを採取した。組織をＰＢＳ中ですすぎ、４％ホルマリン中４℃で保存し た。サンプルをパラフィンに埋め込み、組織の表面に対して平行な面にある連続 した５μｍの横断面切片を５０μｍの間隔で得た。３つの切片をヘマトキシリン およびエオシンで対比染色し、３つの切片をマッソンの三色染料で対比染色した 。コンピューターで無作為に領域を抽出し、切片を本研究と関係のない病理学者 によって倍率×４００で盲検法で検査した。１つのスライドにつき５つの領域を 、１つの領域につき最低４つの２０μｍ未満の血管を数えた。１匹の動物につき ６つのスライドを評価した。計数結果を平均化し、ｍｍ²当たりの血管数として 記録した。結果を平均±平均の標準誤差として記録した。不対両側スチューデン トｔ検定により統計学的分析を行った。 １０¹¹ｐｆｕのAdCMV.VEGFのラット腹膜後方脂肪組織への送達後、増加した血 管分布像が観察されたが（倍率１００×および６００×）、１０¹¹ｐｆｕのAd.R SVβgalの送達後は観察されなかった。同様に、インビボで撮影した腹膜後方脂 肪組織の顕微鏡写真は、AdCMV.VEGFの投与後、長期間にわたり顕著に増加した血 管分布像を示した。特に、AdCMV.VEGF投与の３０日後の評価では、実験を受けて いない動物、コントロールAdCMV.Nullベクターを投与した動物の脂肪組織、およ びAdCMV.VEGFベクターを反対側に投与した動物の反対側の（非処理）脂肪組織と 比べて数倍多い血管が脂肪組織中に認められた。血管数の定量的評価から、AdCM V.VEGF投与の１０日後における脂肪組織中の血管数が、同じ動物の注射していな い反対側のコントロール脂肪組織の血管数の６６７％、擬処理およびAdCMV.Null コントロール脂肪組織の血管数のそれぞれ３１０％および２５６％に増加してい ることが示された（ｐ＜０．０１、全ての比較、図４）。重要なことに、AdCMV. VEGF投与後１０日目には脂肪組織中にＶＥＧＦが検出されなかったという事実に もかかわらず、インビボで定量した血管数の増加はベクター投与の２０日後およ び３０日後の脂肪組織においても維持されていた（ｐ＜０．００４、全ての比較 ）。 毛細血管数の組織学的評価はインビボでの血管数定量の結果と一致していた。 これらの実験で、全てのサンプルは倍率４００×で検査し、α−アクチンで対比 染色した。AdCMV.VEGFを注射した組織において、組織学的評価は、ベクター投与 の３０日後、実験を受けていないコントロールおよびAdCMV.Nullを注射したコン トロール、ならびにAdCMV.VEGFベクターを注射した動物の反対側の（非処理）脂 肪組織と比べてより多くの毛細血管を示した。組織学的サンプルの定量的評価（ 図５）では、AdCMV.VEGFを注射した脂肪組織中の毛細血管数は、５、１０、２０ および３０日目においてAdCMV.Nullコントールと比べて２１〜３９％の増加を示 した（ｐ＜０．０００２、全ての比較）。即ち、倍率３０×で観察した脈管のイ ンビボでの血管数定量と同様に、１０日目以降はＶＥＧＦが検出されなかったと いう事実にもかかわらず、増加した毛細血管数は持続した。 これらの結果から、インビボでの脂肪細胞へのアデノウイルスを介した遺伝子 導入を、治療的効果を得るために用いることができることが確認される。特に、 これらの結果は、ＶＥＧＦ ｃＤＮＡを担持するアデノウイルスベクターが、相 対的に無血管の正常な組織に局所的な方法で新しい血管の増殖を誘導できること を実証する。これはインビボでのアデノウイルス媒介遺伝子導入を、特に、脂肪 細胞に関する治療的な血管新生に用いることができることを示す。 本明細書で引用した全ての参考文献（特許、特許出願および刊行物を含む）は 言及したことで、その全体が本明細書に組み入れられるものである。本明細書の 種々の部分の前に書かれた欄の表題または見出しは本明細書に見出しをつけるま たは分けるために用いられているのであり、本発明の範囲を限定することを示す または意味すると解釈すべきではない。 好適な実施態様を強調して本発明を説明したが、当業者には好適な態様を変更 し得ること（当分野における改良による変更を含む）、および本明細書で詳細に 説明した以外でも本発明を実施できることは自明であろう。従って、以下に示す 請求の範囲で定義される本発明の精神および範囲内に包含される全ての変形を本 発明は含む。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１０月１２日（１９９８．１０．１２） 【補正内容】 与（１０⁹ｐｆｕ）後の、毛細血管数／ｍｍ²に対する時間（日）のグラフである 。矢印はベクター投与の時刻を示している。 発明の詳細な説明 本発明は、プロモーターと、それに機能的に連結した、治療蛋白もしくは治療 ｍＲＮＡ、すなわち治療効果を発揮し得る蛋白もしくはｍＲＮＡ、をコードする 核酸配列を含有するアデノウイルスベクターを、脂肪細胞に接触させることを含 む、脂肪細胞の改変方法を提供する。該接触は、脂肪細胞へのアデノウイルスベ クターの侵入が成され、該核酸配列が発現し、それによって治療蛋白もしくはｍ ＲＮＡの効果がもたらされるような条件下、特にインビボで行われるのが望まし い。 上記の点を考慮すると、本発明は、脂肪組織の血管分布増進用医薬組成物の調 製のための、プロモーターと、それに機能的に連結した、血管形成誘導蛋白をコ ードするＤＮＡ配列とを含むウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターの ような、遺伝子導入ベクターの使用を提供する。脂肪組織にベクターを接触させ ると、該ベクターは該脂肪組織に侵入し、その中で血管形成誘導蛋白を生産し、 それによって該脂肪組織の血管分布を増大させる。好ましくは、該アデノウイル スベクターは複製欠損である。プロモーターは、脂肪細胞Ｐ２（ａＰ２）遺伝子 もしくはｐ１５４ポリペプチド遺伝子のいずれかの調節領域由来のプロモーター のように、脂肪細胞特異的であることが好ましい。あるいは、該プロモーターは また、構成的であっても好ましい。該脂肪組織を宿主内のある部位から別の部位 に移すことができる。好ましくは、該血管形成誘導蛋白は血管内皮増殖因子（Ｖ ＥＧＦ）である。 いかなる適切なアデノウイルスベクターも脂肪細胞への遺伝子導入に利用する ことができるが、本発明がさらに提供する以下のベクターを使用することが好ま しい。例えば、脂肪細胞の遺伝子導入は、脂肪細胞特異的プロモーターと、それ に機能的に連結した、治療蛋白もしくは治療ｍＲＮＡをコードする核酸配列を含 有するアデノウイルスベクターを用いて実施することができる。遺伝子導入は、 構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）と、それに機能的に連結し た、（i）全身に作用する分泌蛋白質、(ii)脂肪細胞上もしくはその付近で作用 する蛋白質、（iii）毒素（特に、ジフテリア毒素Ａ）、(iv)血管形成誘導増殖 因子（特に、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₈₉ を含むＶＥＧＦ））、（v）アジプシン（特に、セリンプロテアーゼホモログで あるアジプシン）および(vi)肥満遺伝子の蛋白産物、すなわちＯｂ蛋白もしくは レプチン（特に、マウスもしくはヒト由来Ｏｂ蛋白）からなる群より選択される 蛋白質をコードする核酸配列を含有するアデノウイルスベクターを用いて行うこ とができる。本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞、特に、脂肪組織 の細胞を提供する。 アデノウイルスが細胞に侵入する能力を最適化するために、遺伝子導入は宿主 内に導入される特定のアデノウイルスに指向性の中和抗体の非存在下で行うこと が好ましい。このような抗体の非存在下では、アデノウイルスが細胞に結合し、 および／または侵入するのを該抗体が妨げる可能性がない。中和抗体の存在を調 べることは当業者には容易である。このような中和抗体の存在がアデノウイルス の細胞内送達の障害となる場合、別のアデノウイルスベクター、例えば別の血清 型のアデノウイルスベクター（Cromptonら，J ．Gen．Virol.，75，133-139(1994 )）または該抗体が指向するエピトープを欠く別のアデノウイルスベクターを用 いることができる。 上記の点を考慮すると、本発明は、アデノウイルスベクターを含有する単離さ れた脂肪組織を提供する。該アデノウイルスベクターは、プロモーターと、それ に機能的に連結した、血管形成誘導蛋白をコードするＤＮＡ配列を含み、該脂肪 組織をインビボで移植すると、該ベクターは発現して該脂肪組織の血管分布を増 大させる。好ましくは、該アデノウイルスベクターは複製欠損である。好ましく は、該血管形成誘導蛋白はＶＥＧＦである。 本発明はまた、脂肪組織（例えば、宿主に移植するためにドナーから単離され る）および該脂肪組織に関連する血管形成誘導物質を含む脂肪組織インプラント を提供する。該脂肪組織インプラントは、インビボもしくはex vivoのいずれか において、ドナー動物（ヒトを含む）の脂肪組織を、該インプラントを形成する のに使用される脂肪組織の血管新生を増大させる血管形成誘導因子もしくは組成 物で改変することによって製造することができる。該インプラント（すなわち、 脂肪組織インプラント）が同一動物内の第二の部位に、あるいは免疫学的に適合 する宿主（すなわち、第二の動物）内に移入される（移植される）と、該血管形 成誘導因子もしくは組成物は、血管形成誘導因子もしくは組成物で改変もしくは 処理されていない移植組織に比べて血管新生の増大を引き起こす。血管新生が増 大すると、結果としてインプラントへの栄養および酸素の供給がよくなり、また 第二の部位もしくは動物内のインプラントが産生する老廃物がよりよく除去され る。このように栄養および老廃物の交換が改善されると、結果的に脂肪組織イン プラントの移植後の脂肪細胞の消失が低レベルになる。免疫学的に適合するとは 、インプラントを実質的に排除するように、該インプラントを形成する細胞を、 免疫系が攻撃して破壊しないか、あるいはできない宿主を意味する。 上記の点を考慮すると、本発明は、（a）宿主内への移植のためにドナーから 単離された脂肪組織および(b)血管形成誘導遺伝子を含む遺伝子導入ベクターを 含有し、該宿主内への該脂肪組織の移植後、該血管形成誘導遺伝子が発現して該 脂肪組織の血管分布を増大させる、脂肪組織インプラントを提供する。該脂肪組 織インプラントは、リンパ形成誘導蛋白またはリンパ形成誘導遺伝子を含む遺伝 子導入ベクターをさらに含有してもよい。該脂肪組織インプラントのドナーおよ び宿主は同一であってもよい。該遺伝子導入ベクターは、好ましくはＶＥＧＦを コードする遺伝子を含む。 本発明はまた、脂肪組織インプラントを製造するための、血管形成誘導蛋白お よび血管形成誘導ＤＮＡを用いる方法、並びにそれらを含む医薬組成物を提供す る。請求の範囲 ： １．脂肪組織の血管分布増進用医薬組成物の調製のための、プロモーターと、そ れに機能的に連結した、血管形成誘導蛋白をコードするＤＮＡ配列とを含む遺伝 子導入ベクターの使用。 ２．該遺伝子導入ベクターがウイルスベクターである請求の範囲１の使用。 ３．該ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求の範囲２の使用。 ４．該アデノウイルスベクターが複製欠損である請求の範囲３の使用。 ５．該プロモーターが脂肪細胞特異的である請求の範囲１〜４のいずれかの使用 。 ６．該プロモーターが、脂肪細胞Ｐ２（ａＰ２）遺伝子もしくはｐ１５４ポリペ プチド遺伝子のいずれかの調節領域由来である、請求の範囲５の使用。 ７．該プロモーターが構成的である請求の範囲１〜４のいずれかの使用。 ８．該脂肪組織が、宿主内のある部位から別の部位に移される請求の範囲１〜７ のいずれかの使用。 ９．該血管形成誘導蛋白が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である請求の範囲１〜 ８のいずれかの使用。 １０．プロモーターと、それに機能的に連結した、血管形成誘導蛋白をコードす るＤＮＡ配列を含み、且つインビボで該脂肪組織を移植すると発現して該脂肪組 織の血管分布を増大させるアデノウイルスベクター、を含有する単離された脂肪 組織。 １１．該アデノウイルスベクターが複製欠損である請求の範囲１０の単離された 脂肪組織。 １２．該血管形成誘導蛋白がＶＥＧＦである、請求の範囲１０または１１のいず れかの単離された脂肪組織。 １３．（a）宿主内への移植のためにドナーから単離された脂肪組織、および(b) 血管形成誘導遺伝子を含み、該宿主内への該脂肪組織の移植後、該血管形成誘導 遺伝子が発現して該脂肪組織の血管分布を増大させる遺伝子導入ベクター、を含 有する脂肪組織インプラント。 １４．該脂肪組織インプラントが、リンパ形成誘導蛋白またはリンパ形成誘導遺 伝子を含む遺伝子導入ベクターをさらに含有するものである、請求の範囲１３の 脂肪組織インプラント。 １５．該ドナーと該宿主が同一である請求の範囲１３または１４のいずれかの脂 肪組織インプラント。 １６．該遺伝子導入ベクターがＶＥＧＦをコードする遺伝子を含む請求の範囲１ ３〜１５のいずれかの脂肪組織インプラント。 【手続補正書】 【提出日】平成１１年４月２１日（１９９９．４．２１） 【補正内容】 （1）明細書第４頁下から第１行の「Genes Devel.,」を「Genes Devel.，7,」に 補正する。 （2）請求の範囲を別紙の通り補正する。 ［別紙］請求の範囲 ： １．プロモーターと、それに機能的に連結した、血管形成誘導蛋白をコードする ＤＮＡ配列とを含む遺伝子導入ベクターを有効成分として含有する、 脂肪組織の 血管分布増進用医薬組成物。２．プロモーターと、それに機能的に連結した、アジプシン蛋白またはＯＢ蛋白 をコードするＤＮＡ配列とを含む遺伝子導入ベクターを有効成分として含有する 、脂肪組織の疾患治療用医薬組成物。 ３．プロモーターと、それに機能的に連結した、分泌蛋白をコードするＤＮＡ配 列とを含む遺伝子導入ベクターを有効成分として含有する、脂肪組織における該 分泌蛋白の発現および脂肪組織による該分泌蛋白の分泌用である医薬組成物。 ４ ．該遺伝子導入ベクターがウイルスベクターである請求の範囲１〜３のいずれ かの医薬組成物 。５ ．該ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求の範囲４の医薬組 成物。 ６ ．該アデノウイルスベクターが複製欠損である請求の範囲５の医薬組成物。 ７ ．該プロモーターが脂肪細胞特異的である請求の範囲１〜６のいずれかの医薬 組成物。 ８ ．該プロモーターが、脂肪細胞Ｐ２遺伝子もしくはｐ１５４ポリペプチド遺伝 子のいずれかの調節領域由来である、請求の範囲７の医薬組成物。 ９ ．該プロモーターが構成的である請求の範囲１〜６のいずれかの医薬組成物。 １０．該蛋白が分泌蛋白である請求の範囲１、２および４〜９のいずれかの医薬 組成物。 １１ ．該血管形成誘導蛋白が血管内皮増殖因子である請求の範囲１および４〜１ ０ のいずれかの医薬組成物。 １２ ．プロモーターと、それに機能的に連結した、血管形成誘導蛋白、アジプシ ン蛋白、ＯＢ蛋白または分泌蛋白 をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子導入ベク ター を含有する単離された脂肪組織（ここで該脂肪組織はインプラントの形態で あってもよい）。 １３．該遺伝子導入ベクターがウイルスベクターである請求の範囲１２の単離さ れた脂肪組織。 １４．該ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求の範囲１３の単 離された脂肪組織。 １５ ．該アデノウイルスベクターが複製欠損である請求の範囲１４の単離された 脂肪組織。１６．該血管形成誘導蛋白が分泌蛋白である請求の範囲１２〜１５のいずれかの 単離された脂肪組織。 １７ ．該血管形成誘導蛋白が血管内皮増殖因子である、請求の範囲１２〜１６の いずれかの単離された脂肪組織。１８．インプラントの形態であり、且つリンパ形成誘導蛋白、またはリンパ形成 誘導遺伝子を含む遺伝子導入ベクターをさらに含有する請求の範囲１２〜１７の いずれかの単離された脂肪組織。 １９．単離された脂肪組織内で血管形成誘導蛋白、アジプシン蛋白、ＯＢ蛋白ま たは分泌蛋白を発現させる方法であって、プロモーターと、それに機能的に連結 した、該蛋白をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子導入ベクターを単離された脂 肪組織に接触させることにより、該遺伝子導入ベクターが該単離された脂肪組織 内に入り、該脂肪組織内で該蛋白を発現するようにすることを含む方法。 ２０．該遺伝子導入ベクターがウイルスベクターである請求の範囲１９の方法。 ２１．該ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求の範囲２０の方 法。 ２２．該アデノウイルスベクターが複製欠損である請求の範囲２１の方法。 ２３．該プロモーターが脂肪細胞特異的である請求の範囲１９〜２２のいずれか の方法。 ２４．該プロモーターが脂肪細胞Ｐ２遺伝子もしくはｐ１５４ポリペプチド遺伝 子のいずれかの調節領域由来である請求の範囲２３の方法。 ２５．該プロモーターが構成的である請求の範囲１９〜２２のいずれかの方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/48 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/04 9/10 3/06 9/12 3/10 17/02 9/10 27/06 9/12 29/00 17/02 35/00 27/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 29/00 5/00 Ｂ 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/24 15/09 ＺＮＡ 37/547 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＫＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マガヴァン、クリストファー ジェイ. アメリカ合衆国、ニュー ヨーク州 10021、ニュー ヨーク、イースト セヴ ンティエス ストリート、435、アパート メント 33エフ (72)発明者 ローゼンガート、トッド アメリカ合衆国、ニュー ジャージー州 07670、テナフライ、ドッグウッド レイ ン、２ (72)発明者 ホフマン、ロイド アメリカ合衆国、ニュー ヨーク州 11021、グレイト ネック、リンカーン ロード、11 (72)発明者 タルマー、ミア アメリカ合衆国、ニュー ヨーク州 10021、ニュー ヨーク、ヨーク アヴェ ニュー、1320、アパートメント 29エイ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プロモーターと、それに機能的に連結した、治療蛋白質または治療ｍＲＮＡ をコードする核酸配列とを含むアデノウイルスベクターを、該アデノウイルスベ クターの脂肪細胞内への侵入、該核酸配列の発現および該蛋白質またはｍＲＮＡ の産生をもたらすべく、該脂肪細胞に接触させることを含む、インビボでの脂肪 細胞の改変方法。 ２．該アデノウイルスベクターが複製欠損である請求の範囲１の方法。 ３．該蛋白質が、全身で作用する分泌蛋白質および該脂肪細胞上もしくはその付 近で作用する蛋白質からなる群より選択される、請求の範囲１または２の方法。 ４．該蛋白質が、毒素、血管形成誘導増殖因子、アジプシンおよびＯｂ蛋白質か らなる群より選択される請求の範囲１または２の方法。 ５．該プロモーターが脂肪細胞特異的プロモーターである請求の範囲１〜４のい ずれかの方法。 ６．該プロモーターが、ａＰ２遺伝子調節領域およびｐ１５４ポリペプチド遺伝 子調節領域からなる群より選択される請求の範囲５の方法。 ７．該プロモーターが構成的プロモーターである請求の範囲１〜５のいずれかの 方法。 ８．該方法が、宿主内の別の部位への該脂肪細胞の移入をさらに含むものである 請求の範囲１〜７のいずれかの方法。 ９．該方法が、肥満症、糖尿病、体脂肪蓄積亢進、高血糖、高インスリン症、低 温症、高血圧症、高コレステロール血症および高脂血症からなる群より選択され るエネルギー貯蔵障害の治療に用いられるものである、請求の範囲１〜８のいず れかの方法。 １０．該方法が血管新生を刺激するのに用いられるものである請求の範囲１〜８ のいずれかの方法。 １１．脂肪細胞特異的プロモーターと、それに機能的に連結した、治療蛋白質ま たは治療ｍＲＮＡをコードする核酸配列とを含むアデノウイルスベクター。 １２．該ベクターが複製欠損である請求の範囲１１のベクター。 １３．該プロモーターが、ａＰ２遺伝子調節領域およびｐ１５４ポリペプチド遺 伝子調節領域からなる群より選択される請求の範囲１１または１２のベクター。 １４．該蛋白質が、全身で作用する分泌蛋白質および該脂肪細胞上もしくはその 付近で作用する蛋白質からなる群より選択される、請求の範囲１１〜１３のいず れかのベクター。 １５．該蛋白質が、毒素、血管形成誘導増殖因子、アジプシンおよびＯｂ蛋白質 からなる群より選択される請求の範囲１１〜１４のいずれかのベクター。 １６．請求の範囲１１〜１５のいずれかのベクターを含有する宿主細胞。 １７．構成的プロモーターと、それに機能的に連結した、全身で作用する分泌蛋 白質および該脂肪細胞上もしくはその付近で作用する蛋白質からなる群より選択 される蛋白質をコードする核酸配列とを含むアデノウイルスベクターを含有する 脂肪細胞。 １８．該ベクターが複製欠損である請求の範囲１７のベクター。 １９．プロモーターと、それに機能的に連結した、毒素、血管形成誘導増殖因子 、アジプシンおよびＯｂ蛋白質からなる群より選択される蛋白質をコードする核 酸配列とを含むアデノウイルスベクターを含有する脂肪細胞。 ２０．該ベクターが複製欠損である請求の範囲１９のベクター。 ２１．（ａ）宿主内への移植のためにドナーから単離された脂肪組織および(b) 該脂肪組織に関連する血管形成誘導物質を含む脂肪組織インプラント。 ２２．該血管形成誘導物質が、単離された血管形成誘導蛋白、または血管形成誘 導蛋白および医薬上許容される担体を含む血管形成誘導組成物である、請求の範 囲２１の脂肪組織インプラント。 ２３．該血管形成誘導物質が、血管形成誘導遺伝子を含む遺伝子導入ベクターで ある請求の範囲２１の脂肪組織インプラント。 ２４．該脂肪組織が、血管形成誘導遺伝子を含む遺伝子導入ベクターと血管形成 誘導蛋白の両方と接触する、請求の範囲２１の脂肪組織インプラント。 ２５．該脂肪組織インプラントが、該脂肪組織に関連するリンパ形成誘導蛋白ま たはリンパ形成誘導遺伝子を含む遺伝子導入ベクターをさらに含有する、請求の 範囲２１〜２４のいずれかの脂肪組織インプラント。 ２６．該ドナーおよび該宿主が同一である請求の範囲２１〜２５のいずれかの脂 肪組織インプラント。 ２７．該血管形成誘導物質がＶＥＧＦ蛋白である請求の範囲２１〜２６のいずれ かの脂肪組織インプラント。 ２８．該血管形成誘導物質が、ＶＥＧＦ蛋白をコードする遺伝子を含む遺伝子導 入ベクターである、請求の範囲２１〜２６のいずれかの脂肪組織インプラント。