JP2000514430A

JP2000514430A - Immunocontraceptive compositions containing sperm antigens and methods of using the same

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Publication number: JP2000514430A
Application number: JP10504505A
Authority: JP
Inventors: ブレイル、ジェフリー・ディー; ヘイン、ミック・ビー; ブックバインダー、ルイス・エイチ
Original assignee: ザイガム・インク
Priority date: 1996-07-03
Filing date: 1997-07-03
Publication date: 2000-10-31
Also published as: CA2259147A1; AU3594397A; WO1998000440A1; EP0923602A1; EP0923602A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳類ｓｐ５６精子タンパク抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドを含む免疫避妊ワクチン組成物に関する。抗原性ポリペプチドは、合成ポリペプチド、融合タンパクおよびキメラ分子であってもよい。ワクチンは、好ましくは野生の哺乳類に餌または飼料製剤中で投与する。ある態様では、ｓｐ５６の種特異的配列の用途を説明する。免疫避妊方法、ｓｐ５６抗原決定基と免疫反応性の抗体、および精子の受精能のスクリーニング方法も記載する。 (57) [Summary] The present invention relates to an immunocontraceptive vaccine composition comprising an antigenic polypeptide having a mammalian sp56 sperm protein antigenic determinant. Antigenic polypeptides may be synthetic polypeptides, fusion proteins and chimeric molecules. The vaccine is preferably administered to the wild mammal in a feed or feed formulation. In one aspect, the use of sp56 species-specific sequences is described. Also described are methods of immunocontraception, antibodies immunoreactive with sp56 antigenic determinants, and methods of screening for sperm fertility.

Description

【発明の詳細な説明】精子抗原を含む免疫避妊組成物およびその使用方法技術分野本発明は、一般的に免疫避妊タンパクをコードする哺乳類ｓｐ５６ｃＤＮＡ核酸の発見に関する。本発明は、さらに、免疫避妊に関連するスクリーニング方法、診断方法および治療方法に有用な免疫避妊ポリペプチドを記載する。背景経口避妊ワクチンの開発の可能性に対する近年の関心は、その潜在的なコストに対する有効性および副作用の欠如に起因する〔Alexanderand Baily，Reprod． Fertil．Devel.，6:273-280(1994年)〕。経口的に投与すると、配偶子特異的ワクチンは、生殖器官に限定された粘膜免疫攻撃を惹起し、一方または両方の配偶子を排除する〔Mestecky and McGhee，Adv．Immunol.，40:153-245(1987);McGhe e et al.，J．Clin．Immunol.，9:175-199(1989);Stern et al.，J．Reprod．Im munol.，22:73-85(1992);Meinertz et al.，Amer．J．Reprod．Immunol.，25:15 8-162(1991);McGhee et al.，Reprod．Fertil．Devel.，6:369-379(1994)〕。経口避妊ワクチンの開発は、精子−卵相互作用に必要な細胞特異性に基づいている。卵を受精させるためには、哺乳類精子は、まず、卵をとりまいている厚い細胞外糖タンパクのコートである透明帯に特異的に強固に結合しなければならない。結合は、精子の頭部原形質膜と透明帯の表面との間の接触に関連し、かなり種特異的である。例えば、マウスにおいては、精子は透明帯の３つの糖タンパクの１つであるＺＰ３を認識する。精子原形質膜によって認識されるＺＰ３のドメインは、３，９００ダルトンのＯ−結合オリゴ糖である。ＺＰ３のアミノ酸配列は種間でほとんど変化しないので、そして精子−卵認識におけるその偏在的な役割のため、ＺＰ３を標的とする免疫避妊剤の開発にはかなりの努力がなされてきた〔Spifano and Dean，Rep．Fertil．Devel.，6:319-330(1994)〕。この戦略は、理論的には有効である可能性があるが、最近の研究では、ＺＰ３由来Ｂ細胞エピトープで雌マウスを経口的に免疫することによって加速された濾胞の閉鎖（follicular atresia）および濾胞細胞の大量増殖を含む卵巣の病変が起こり得ること、そして免疫反応は必ずしも避妊をもたらさないことが示唆されている。卵巣の病変は、雌をＺＰ３で免疫した後に予期されうる。これは、免疫攻撃および濾胞からの生育卵母細胞の除去が、卵母細胞からの「生育停止」信号のない状態では、無制限の濾胞細胞の分裂および腫瘍の形成をもたらしうるためである。有効な免疫避妊剤の開発への別の戦略は、精子特異的抗原を標的にすることである。雄におけるそのような抗原の免疫攻撃は、それらの動物を不妊にさせる。抗原の抗体攻撃は、精子形成中に起こるとしても、精細管における初期の減数分裂の事象を妨害したり、それに影響を与えたりすることがないはずであり、したがって無制限な細胞増殖をもたらさないと考えられる。さらに、免疫された雌は、雌性生殖管における精子の免疫攻撃のため、不妊になる可能性が高い。精子ヒアルロニダーゼＰＨ−２０抗原〔Primakoff et al.，Nature，335:543-546(1988 );Fiszer-Szafarz et al.，Acta．Biochimica Polonica，42:31-33(1995);Lin e t al.，J．Cell．Biol.，125:157-163(1994);およびGmachl et al.，FEBS Lett. ，336:545-548(1993)〕、精子乳酸デヒドロゲナーゼアイソザイムＬＤＨ−Ｃ４〔Goldberg et al.，Fertil．Steril.，35:214-217(1981);Freemerman et al.， Mol．Reprod．Dev.，34:140-148(1993)〕、アクロソーム内タンパクｓｐ−１０〔Srinivasan et al.，Biology of Reprod.，53:462-471(1995)〕、およびｓｐ１７〔O'Rand et al.，J．Reprod．Immonol.，25:89-102(1993)〕を含む多数の精子タンパクが、動物を免疫し、および／または不妊を起こさせるために用いられてきた。ｓｐ５６と呼ばれるマウスの精子タンパクは、ＺＰ３の精子認識を媒介するタンパクに予期される特性の多くを有するものであり、最近になって同定されたものである〔Bleil and Wassarman，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，87:5563-5567 (1990);Cheng et al.，J．Cell Biol.，125:867-878(1994)〕。ｓｐ５６は、マウス精子のＺＰ３認識タンパクを同定するために設計された研究において最初に発見された。精製ＺＰ３を、光活性化可能な架橋剤で修飾して生きた精子で攻撃し、またはアフィニティカラムに架橋して可溶性全精子タンパクと反応させた。これら２つの独立の方法の各々で、唯一同定されたマウス精子タンパクがｓｐ５６である。ｓｐ５６は、ホモマルチマー状の末梢膜タンパクで、そのモノマーのサイズは５６，０００ダルトンであり、ＺＰ３結合部位が正確に位置しているアクロソーム（先体）の上を覆う精子頭部原形質膜のみに局在する。ｓｐ５６は、ＺＰ３、Ｚｐ３のＦＤオリゴ体、およびＦＤ−オリゴ体の精子認識に必要な末端糖であるａ−ガラクトースに対して特異的親和性を有するレクチンである。精子上のＺＰ３結合部位の数に基づいて、およそ２５，０００のｓｐ５６分子が精子表面に存在すると予測されている。最近、ｓｐ５６をコードするｃＤＮＡがクローニングされた〔Bookbinder et al.，Science，269:86-89(1995)〕。単離されたｃＤＮＡから導かれたｓｐ５６の一次配列は、それがＳｕｓｈｉドメインと呼ばれる一連の６０アミノ酸の長さのホモロジー反復の存在を特徴とするタンパクレセプターのスーパーファミリーの一員であることを示す。各Ｓｕｓｈｉドメインは、実質的に不変の１０個のアミノ酸を含む。そのスーパーファミリーの一員である資格と一致して、ｓｐ５６ｃＤＮＡは、そのタンパクに特有のカルボキシ末端近くの４４アミノ酸のストレッチをコードする。そのため、この特有のストレッチは、ｓｐ５６特異的配列ドメイン（ｓｓｓ）と呼ばれ、種限定的エピトープを定義すると考えられている。末梢膜タンパクをコードするｃＤＮＡに予測されるように、このｃＤＮＡ配列は、Ｓｐ５６アミノ末端の上流に位置するシグナルペプチドをコードする。ｓｐ５６ｃＤＮＡは、アミノ末端からｃＤＮＡオープンリーディングフレームの最後までで決定した６２，０００ダルトンのポリペプチドをコードする。この６２，０００ダルトンのポリペプチドは、「プロｓｐ５６」と呼ばれ、カルボキシ末端のおよそ６，０００ダルトンのタンパク分解的除去により、成熟型ｓｐ５６（５６，０００ダルトン）にプロセッシングされる。したがって、この分子は、精子５６，０００ダルトンに関連して、ｓｐ５６と呼ばれる。ｓｐ５６ｃＤＮＡから開発されたモノクローナル抗体および分子プローブは、ｓｐ５６の発現がマウスの精子形成細胞のみに限定されていること、そのタンパクもｍＲＮＡも、いずれも他のマウス組織には蓄積しないことを明らかにするために使用されてきた。しかし、上記の精子抗原とは対照的に、ｓｐ５６は以下の点において独特である。 1）ｓｐ５６発現は、精子のみに限定されており、密接に関連するタンパク（またはアイソザイム）が体組織において発現されていないため、全身性免疫の機会が最小である； 2）ｓｐ５６は精子表面に存在し、したがって雄および雌の両方の生殖管において免疫攻撃にさらされている；そして 3）ｓｐ５６の発現は、免疫系の成熟後に起こり、これは雄および雌の両方の免疫が「外来」抗原を提示することを意味する。したがって、ｓｐ５６の上述の特徴に照らして、ｓｐ５６抗原性ポリペプチドに基づく免疫避妊剤ワクチン組成物を設計することは望ましいことである。本発明の簡単な説明ｓｐ５６と名付けられた哺乳類精子タンパクが、げっ歯類からヒトまであらゆる哺乳類種のための免疫避妊ワクチンとして有用であることが発見された。したがって、本発明は、免疫避妊ワクチン組成物において有用なｓｐ５６抗原決定基を含む種々の抗原性ポリペプチドを記載する。また、上記抗原性ポリペプチドを含む餌（バイト）または飼料（フィード）製剤を用いる経口避妊を含め、上記ワクチン組成物を用いる免疫避妊方法も記載する。本発明は、試料中のｓｐ５６抗原の存在を検出するのに有用な抗ｓｐ５６抗体およびモノクローナル抗体も記載する。免疫学的方法は、ｓｐ５６抗原決定基および抗ｓｐ５６抗体を検出するための抗体および抗原性ポリペプチドを用いて企図される。これらの方法は、精子の受精能の評価、精子ｓｐ５６抗原の検出および免疫応答を誘導する本発明のワクチンの有効性の確認に有用である。組換えＤＮＡ発現ベクターおよびｓｐ５６抗原決定基を含む組換えタンパクの製造方法も記載する。本発明は、以下の利点を有する。免疫避妊剤の使用は、ｓｐ５６抗原決定基に対する反復的な暴露がない場合に循環抗体のレベルが低下する限りにおいて可逆的である。野生の有害動物制御のための餌として調剤する場合、この物質は、毒素を含まない限りにおいて非毒性であり、したがって、標的としていない動物またはヒトが偶然消費した場合に比較的安全である。さらに、免疫避妊剤は、避妊が標的とする動物においてのみ達成され、餌を偶然消費した他の動物またはヒトにおいては起こらないように、種限定的ｓｐ５６配列を含むように調剤することができる。他の利点は、当業者には容易に理解される。図面の簡単な説明図１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１７１０８であるマウスｓｐ５６ｃＤＮＡクローン７．１のアミノ酸残基配列を示す。シグナルペプチド（リーダー配列）は、−３２で始まり、下線で示す最初のＳｕｓｈｉドメインの２残基手前にあるグリシン（ｇｌｙ）で終わる。残りの６個のＳｕｓｈｉドメインも同様に示す。図２は、ｓｐ５６７．１ｃＤＮＡクローンを図示したものであり、塩基番号は「目盛り」の印で示す。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）およびポリＡシグナルを、実験的に決定したポリＡ部位とともに、目盛り上に示す。コードされたポリペプチド領域は、矢印で示す。Ｓｕｓｈｉドメイン１〜７、シグナルペプチド、ｓｐ５６特異的配列（ｓｓｓ）、およびプロｓｐ５６ポリペプチドの塩基性Ｃ末端テールの位置も示す。図３は、典型的なＳｕｓｈｉドメイン構造を模式的に示す。それにおいては、各ドメインが約６０アミノ酸で構成され、そのうち１０個の不連続なアミノ酸（アミノ酸末端からカルボキシ末端に向かって、一文字表記でＣ、Ｐ、Ｙ、Ｃ、Ｇ、Ｃ、Ｇ、Ｗ、ＰおよびＣを含む）が実質的に不変であり、配列内で特異的な位置に存在する。残りの約５０個のアミノ酸はかなりの多様性を示す。この一般的な構造は以下の特徴を有する。 1）Ｃ１−Ｃ３およびＣ２−Ｃ４の２つのジスルフィド結合がループドループ構造を形成する； 2）各ジスルフィド結合の付近に少なくとも１個のプロリンがあり、連続するＳｕｓｈｉドメインの接続に必要な鎖のターンを提供する；および 3）内部疎水性ループ中にＧおよびＷが存在する。図４は、ｓｐ５６ポリペプチド（この場合、ｓｐ５６特異的配列（ｓｓｓ）ドメイン）由来のもの）とともにＴＭＶコートタンパク（ｃｐ）を含むキメラポリペプチド分子をコードするキメラ遺伝子調製のための段階的方法の最初の部分を示す。この方法は、キメラプライマーの調製の工程を含め、実施例３においてより完全に記載する。図５は、完全ＴＭＶ遺伝子の相同領域中へのＴＭＶ／ｓｓｓ遺伝子のクローニングによる、ｓｐ５６ポリペプチドとともにＴＭＶコートタンパク（ｃｐ）を含むキメラポリペプチド分子をコードするキメラ遺伝子調製のための段階的方法の最終工程を示す。キメラポリペプチド分子の発現は、ウイルスコート上に露出されたｓｐ５６特異的ポリペプチド（ハプテン）を有するＴＭＶとともに示される。最終工程は、実施例３においてより完全に記載する。図６は、実施例３に記載するｐＲＬＣＴＡ−ｓｐ５６の模式的プラスミド地図である。図７は、実施例３に記載するｐＲＬＣＴｍ−ｓｐ５６の模式的プラスミド地図である。図８は、実施例３に記載するｐＲＬＣＴＢ−ｌｓｐ５６の模式的プラスミド地図である。図９は、実施例３に記載するｐＣＴＡ０２−ｌｓｐ５６の模式的プラスミド地図である。図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで非還元条件下での、免疫していないマウスからのマウス精子タンパクに対するＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐで免疫したマウスからの抗血清のウェスタンブロット解析を示す。ＣＴＢ−ＳＳＳと表示したＣＴ−Ｂ− ｓｓｓ３ｐｐ免疫マウスからの抗血清および陽性対照のモノクローナル抗体７Ｈ１２は、分子量４０，０００ダルトン（４０kDa）の非免疫精子タンパクと特異的に反応した。本発明の詳細な説明Ａ．定義アミノ酸残基：ポリペプチドをそのペプチド結合で化学的消化（加水分解）した際に形成されるアミノ酸。本明細書において記載するアミノ酸残基は、好ましくは「Ｌ」アイソマー形態のものである。しかし、「Ｄ」アイソマー形態の残基は、そのポリペプチドが所望の機能的特性を保持する限り、任意のＬ−アミノ酸残基を置換することができる。ＮＨ₂は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシル基を指す。標準的なポリペプチドの命名にしたがって〔J．Biol ．Chem.，243:3552-59(1969)に記載されており、３７ＣＦＲ９１．８２２（ｂ）（２）で採用されている〕、アミノ酸残基の略号は以下の対応表に示すとおりである。対応表表記アミノ酸一文字三文字Ｙ Tyr チロシンＧ Gly グリシンＦ Phe フェニルアラニンＭ Met メチオニンＡ Ala アラニンＳ Ser セリンＩ Ile イソロイシンＬ Leu ロイシンＴ Thr トレオニンＶ Val バリンＰ Pro プロリンＫ Lys リジンＨ His ヒスチジンＱ Gln グルタミンＥ Glu グルタミン酸Ｚ Glx Gluおよび/またはGln Ｗ Trp トリプトファンＲ Arg アルギニンＤ Asp アスパラギン酸Ｎ Asn アスパラギンＢ Asx Asnおよび/またはAsp Ｃ Cys システインＸ Xaa 不明または他のアミノ酸本明細書において式により表すすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向に、左から右への方向性を有することに注意されたい。さらに、「アミノ酸残基」という語句は、対応表に列記したアミノ酸、および３７ＣＦＲ１．８２２（ｂ）（４）に列記され、参照により本明細書に包含されるもののような改変および異常アミノ酸を含むように広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュは、１またはそれ以上のアミノ酸残基のさらなる配列とのペプチド結合またはＮＨ₂もしくはアセチル基のようなアミノ末端基もしくはＣＯＯＨのようなカルボキシ末端基との共有結合を示すことに注意されたい。組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子：作動可能に連結された２つのＤＮＡセグメントにより生成されるＤＮＡ分子。したがって、組換えＤＮＡ分子は、天然には通常は一緒に見出されない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡが共通の生物学的起源を有さないこと、すなわち進化的に異なることは、「非相同（ヘテロロガス）」と呼ばれる。ベクター：細胞内で自立的に複製可能なｒＤＮＡ分子であって、これに、ＤＮＡセグメント、例えば遺伝子またはポリヌクレオチドが、接続したセグメントの自律的複製をもたらすように作動可能に連結される。１またはそれ以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を指令することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。抗体：抗体という用語は、本明細書において免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗体結合部位またはパラトープを含む分子を指すために、種々の文法的形態で用いられる。例示的な抗体分子は、インタクトな（完全）免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の部分〔Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂およびＦ（ｖ）のような当業界で公知の部分を含む〕である。抗体結合部位：抗体結合部位は、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）重鎖および軽鎖可変および超可変領域から構成される抗体分子の構造的部分である。種々の形態の「免疫反応（する）」という用語は、抗原決定基を含む分子と、全抗体分子またはその部分のような抗体結合部位を含む分子との間での特異的結合を意味する。モノクローナル抗体：種々の文法的形態で、モノクローナル抗体は、特定のエピトープと免疫反応することができる１種の抗体結合部位のみを含む抗体分子の集団（ポピュレーション）を指す。したがって、モノクローナル抗体は、典型的には、それが免疫反応する任意のエピトープに対する単一の結合親和性を表す。そのため、モノクローナル抗体は、各々が異なるエピトープに対して免疫特異的である複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば二特異性抗体を含みうる。歴史的には、モノクローナル抗体はクローンとして純粋な免疫グロブリン分泌細胞株の不死化によって作成されたが、本発明の方法により作成することもできる。上流：ＤＮＡ転写の方向と逆であって、非コード鎖上で５'から３'へ、ｍＲＮＡ上で３'から５'へ向かう方向。下流：配列転写または読み取りの方向にＤＮＡ配列に沿うことであり、ＤＮＡの非コード鎖に沿って３'から５'方向へ、またはＲＮＡ転写物に沿って５'から３' 方向へ向かうことである。リーディングフレーム：遺伝子の構造タンパクコード部分または構造遺伝子を定義する、翻訳に使用される連続するヌクレオチドの３つ組（トリプレット、コドン）の特定の配列。リーディングフレームは、翻訳開始コドンの位置に依存する。ポリペプチド：連続するアミノ酸残基のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸残基の直線状の系列。タンパク：ポリペプチドにおけるように互いに連結された５０を超えるアミノ酸残基の直線状の系列。実質的に純粋な、または単離された：ポリペプチドまたはタンパクの文脈において使用される場合、これらの用語は、天然にそれらに付随する成分から分離された分子を意味する。典型的には、モノマータンパクは、少なくとも約６０％〜７５％の試料が単一のポリペプチド骨格を呈する場合、実質的に純粋である。重要でない変異体または化学修飾物は、典型的には同じポリペプチド配列を共有する。実質的に純粋なタンパクは、典型的には約８５％〜９０％を超える、より通常は約９５％の、そして好ましくは約９９％を超える純度のタンパク試料を含む。タンパクまたはポリペプチドの純度または均一性は、試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、続いて染色により可視化するような、当業界で周知の多数の手段により示すことができる。ある種の目的のためには、高い解像度が必要であり、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）または精製のための同様の手段が用いられる。合成ペプチド：天然タンパクまたはそのフラグメントを含まない、ペプチド結合により互いに連結された化学的に生成されたアミノ酸残基の鎖。融合タンパク：組換えＤＮＡ法により産生されたポリペプチドであって、単一の「融合された」ポリペプチドを発現させるための単一のオープンリーディングフレームの発現を通じて産生される、第一のポリペプチドドメインがペプチド結合により第二のポリペプチドドメインに作動可能に連結されているもの。キメラ分子：２つの別個のポリペプチドを架橋させるように、化学的連結を通じて２つの別個の分子を接続することによって形成される二機能性分子。Ｂ．免疫避妊ワクチン組成物本発明は、対象哺乳類において免疫反応を誘導する目的のための免疫原として哺乳類精子ｓｐ５６抗原決定基を用い、それによりインビボで精子上のｓｐ５６抗原決定基と免疫反応する抗体を産生させ、それによりその哺乳類での精子含量または受精能に影響を与えることを記載する。したがって、本発明の組成物は、対象において免疫反応を誘発する意図された目的のため、ワクチンと呼ばれ、その点において、本明細書においてさらに記載するように投与の経路にしたがってワクチンの典型的成分を含有するよう意図される。本発明の組成物は、本発明により実行される避妊のメカニズムが、処理を受けた哺乳類における免疫応答（精子の含量および質に影響する）の存在に基づいており、それによって受精能に影響し、避妊剤として作用するため、免疫避妊剤とも呼ばれる。この文脈において、精子受精能に対するあらゆる影響が避妊剤特性と認められ、絶対的な受精能は、本発明のほとんどの態様において典型的には好ましいものの、有効性には必要とされないことは認められるべきである。本発明は、哺乳類精子タンパクｓｐ５６が哺乳類における受精過程において卵との結合に主要な役割を果たしていることの発見に、主に基づいており、より具体的には、ｓｐ５６タンパクが免疫避妊応答を実行することにおいて免疫系の標的として非常に適していることの発見に基づいている。本発明はまた、治療的免疫応答のために有用な特有の異なる抗原決定基（標的）を提供するｓｐ５６内の種々の有用なエピトープ（抗原決定基）を同定することを特徴とする。したがって、抗原性ポリペプチドは、本明細書においては、そのアミノ酸残基配列中にｓｐ５６抗原決定基を定義するアミノ酸の配列を含むポリペプチドと定義される。ｓｐ５６抗原決定基は、本明細書において記載するようにｓｐ５６タンパクの任意の部分であることができ、これは、免疫すると、ｓｐ５６タンパクの免疫部分と免疫反応性である抗体を誘導することができる。抗体の技術分野で周知のように、抗原決定基は、化学的組成およびサイズの点で種々の物質のいずれてあってもよい。本発明の文脈においては、決定基は、ｓｐ５６配列を有する種々の長さのポリペプチドであることができ、典型的には少なくとも長さ約７アミノ酸から、長さ４００〜６００アミノ酸残基の大きな部分までである。決定基のサイズは、好ましい態様を特定する以外、制限的であることを意図するものではない。本発明は、本発明の組成物において単独でまたは組み合わせて使用することができるｓｐ５６タンパクの異なる部分に由来する、非常に多様なｓｐ５６決定基を記載する。ｓｐ５６のこれらの異なる部分からのポリペプチドに定義された決定基の使用は、当業者には明らかな異なる利点を提供する。例えば、ｓｐ５６のある領域は種特異的配列（ｓｓｓ）を含み、これらは特定の種のみに特異的な免疫応答を提供する。これらのｓｓｓｓｐ５６決定基に制限された組成物は、標的種のみにおいて不妊を起こさせ、他の種においては避妊剤とはならない。あるいは、ｓｐ５６の他の領域は、異なる哺乳類種において保存されている（相同な）配列を含み、したがって、普遍的な免疫避妊決定基として役立つ。さらに、単一の組成物中でのｓｐ５６決定基の組合わせの使用は、異なる免疫避妊剤の一群（バッテリー）の製造を提供し、本発明の免疫避妊ワクチン組成物にさらなる特徴を与える。免疫避妊ワクチン組成物は、ワクチンの目的を容易にするために多様な物質を含むことができる。抗原性ポリペプチドに加えて、組成物は、当業界で周知のように、医薬的に容認されうる賦形剤、キャリアー、免疫刺激剤、抗原性分子、アジュバント、安定剤等の物質を含むことができる。また、抗原性ポリペプチドは、種々の形態であることができ、ｓｐ５６抗原決定基を含む合成ポリペプチド、ハイブリッド分子、融合タンパク、組換えタンパク、キメラポリペプチド分子、単離タンパク等の形態が含まれる。合成ポリペプチドは、以下で詳述する。ハイブリッド分子は、２つのドメインを有する分子であって、第一のポリペプチドドメインはｓｐ５６抗原決定基を含み、第二のドメインはキャリアー、提示（representation）、デリバリー、免疫刺激剤または合成のためのベヒクルのような異なる機能を有する。第二のポリペプチドドメインは、本明細書で記載するように、種々の目的を有することができる。それは、組成物にかさを与えるためのキャリアータンパクであることができる。それは、ワクチン組成物に免疫原性を付加するために細菌またはウイルス抗原性タンパクであることができる。それは、発現および／または予め選択した製剤へのデリバリーを容易にするために細菌またはウイルス構造タンパクであることができる。例えば、融合タンパクにおけるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）コートタンパクの使用は、ＴＭＶ感染植物の組織中に発現されたｓｐ５６抗原決定基が広がるのを容易にし、それによって活性免疫避妊剤成分を含有する飼料の生産を容易にする。第二のポリペプチドは、免疫応答を刺激する活性を有するタンパクであることができる。他の機能を第二のポリペプチドに含有させることができ、それは当業者には明らかである。好ましい第二のポリペプチドドメインとしては、コレラ毒素サブユニットＡ、コレラ毒素サブユニットＢ、ジフテリア毒素、インフルエンザウイルスＨＡタンパク、マウス白血病ウイルスコートタンパク、サルモネラ表面タンパクおよびタバコモザイクウイルスコートタンパクが挙げられる。これらのタンパクは、組換えＤＮＡ技術の分野において十分に特徴づけされており、融合タンパクまたはキメラポリペプチド分子における使用について容易に利用可能である。例示的な使用を以下に記載する。ハイブリッド分子の第一および第二のポリペプチドドメインは、多様な手段により連結することかできる。単一ポリペプチドの組換えＤＮＡ発現によって産生させる場合、第一および第二のポリペプチドドメインは、単一の融合タンパクのようにペプチド結合によって作動可能に連結される。組換えＤＮＡ法による融合タンパクの産生は、後述する。別個のポリペプチドとして生産する場合、第一および第二のポリペプチドは、周知のように化学的架橋により作動可能に連結され、その生成物は本明細書においてキメラポリペプチド分子と呼ばれる。ポリペプチド間の化学的架橋の方法は、化学およびタンパクの技術の分野において周知である。本発明のワクチン組成物において有用な例示的なキメラポリペプチド分子を、本明細書において記載する。ｓｐ５６が精子から単離されうる限りにおいて、実質的に単離されたｓｐ５６タンパクを本発明のワクチン組成物において用いることができる。精巣上体組織、精子または精液からのネイティブな（天然の）ｓｐ５６タンパクの単離方法は、実施例において記載する。本発明のｓｐ５６抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドは、本発明にしたがった多様な用途を有する。したがって、本発明のポリペプチドは、ｓｐ５６により発現されるエピトープ（抗原決定基）を免疫学的に模倣するその能力を特徴とする。このようなポリペプチドは、免疫避妊ワクチン組成物中の成分、ネイティブなｓｐ５６と免疫反応する抗体を作成するための接種物中の成分として、および免疫学的方法における抗原として、有用である。本明細書において用いる場合、種々の文法的形態での「免疫学的に模倣する」という語句は、本明細書において定義するｓｐ５６のエピトープを認識する本発明の抗体と免疫反応する本発明の抗原性ポリペプチドの能力をいう。主題ポリペプチドは、それが必要な配列を含んでいる限りにおいて、ｓｐ５６のアミノ酸残基配列と同一である必要はないことは理解されるべきである。Ｃ．ｓｐ５６タンパクおよびポリペプチドマウス精子タンパクｓｐ５６をコードするｃＤＮＡは、以下に記載するように成熟型のプロセッシングされたタンパクに基づいたものとして引用するが、これは、Bookbinder et al.，Science，269:86-89(1995)（その開示は参照により本明細書に包含される）により記載されたようにクローニングされ、配列決定されたものである。既知の配列とコードされたｓｐ５６アミノ酸配列との比較によれば、ｓｐ５６は、Ｓｕｓｈｉドメインと呼ばれる長さ約６０アミノ酸の複数のコンセンサス反復配列（これについては以下に詳述する）を含むタンパクレセプターのスーパーファミリーの新規な一員と考えられる。したがって、ｓｐ５６は、機能に関して一般化することを可能にするように他のタンパクに十分に類似し、任意の哺乳類種でｓｐ５６遺伝子を同定し単離できることを確実にする。したがって、アミノ酸およびヌクレオチド配列レベルの両方での変異がｓｐ５６の哺乳類単離株に存在する可能性はあるが、そのような変異は、限定的なものとして解釈されるものではない。例えば、ある哺乳類種における対立遺伝子変異は、ｓｐ５６のあるタイプの単離株間で数パーセントの差異を許容することができ、その差異は、無害な変異アミノ酸残基からなる。したがって、開示されたｓｐ５６タンパクに対して約９５％の相同性、好ましくは少なくとも９８％の相同性のタンパクは、開示されたｓｐ５６タンパクの対立遺伝子変異体と考えられ、したがって、本発明のｓｐ５６タンパクと考えられる。マウスのプレ−プロｓｐ５６ｃＤＮＡの完全コードヌクレオチド配列は、クローン７．１と呼ばれ、配列番号１に記載するように長さ２０２６ヌクレオチドであり、受託番号Ｕ１７１０８としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。完全プレ−プロｓｐ５６をコードするｃＤＮＡクローンは、１７３７ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を表し、これは、３２アミノ酸のＮ末端側シグナルペプチドを有し、その切断部位はアミノ酸位置−１と＋１との間であって、ヌクレオチド位置１７５の後の切断部位に相当する（配列番号１）。このマウスｃＤＮＡ配列の翻訳物は、配列番号２の位置−３２〜＋５４７に示すように、５７９アミノ酸残基のプロセッシングされていないプレ−プロｓｐ５６タンパクをコードし、これはマウスプレ−プロｓｐ５６と呼ばれる。マウスプレ−プロｓｐ５６のアミノ酸配列は、コードするｃＤＮＡ配列とともに配列番号１にも記載されている。プレ−プロｓｐ５６からプロ−ｓｐ５６へのプロセッシングは、実施例に記載したとおりの実験的に決定したアミノ末端に基づくと、分子量６２，０００ダルトンの５４７アミノ酸のタンパクをもたらす。マウスプロｓｐ５６のアミノ酸残基配列は、図１および配列番号２（アミノ酸位置１で始まり、位置５４７で終わる）に示す。プロｓｐ５６種は、約６，０００ダルトン（７０アミノ酸）の非常に塩基性のカルボキシ末端テールの翻訳後切断（truncation）によりさらにプロセッシングを受けて、分子量５６kDaの成熟型ｓｐ５６タンパクとなる。翻訳後プロセッシング事象は、運動性の精子で天然に、または精巣上体精子を単離し非変性界面活性剤中で処理する間に、および／または「背景」で論じたように卵母細胞リガンドである透明帯３すなわちｚｐ３へのレセプター特異的結合の際に、起こると考えられている。４７７アミノ酸の成熟型ｓｐ５６アミノ酸残基配列は、配列番号２に記載するが、位置１のアスパラギン酸で始まり、位置４７７のシステイン残基で終わる。この配列は、図１にも示す。既に紹介したように、コードされるｓｐ５６アミノ酸配列をタンパクデータベースと比較すると、ｓｐ５６は、Ｓｕｓｈｉドメイン反復配列の存在に基づいて、タンパクレセプターのスーパーファミリーの一員であることが示される。プロｓｐ５６タンパクは、Ｃ４ＢＰ、Ｃ３ｂレセプター、ＣＲ１およびＣＲ２レセプターのような補体系のタンパクにかなりの相同性を有している。補体タンパクは、本発明のｓｐ５６のように、他のタンパクに結合するとエキソまたは自己タンパク分解的活性を示すことが知られている。分子の切断は、コンフォメーションの変化を引き起こし、それが後続する生物学的事象を活性化することが示されており、これは、ｓｐ５６の場合については、単一の精子アクロソームに媒介された卵母細胞リガンドとの特異的相互作用であり、結果として受精が起こる。スーパーファミリーの一員として、ｓｐ５６は、７個のＳｕｓｈｉドメインを有し、そのうち６個は連続しているが、一方、７番目のものはマウスｓｐ５６に独特の４４アミノ酸の介在領域に続いている。コードされる介在領域はマウスｓｐ５６ｃＤＮＡに独特であることが決定されたので、この領域は、ｓｐ５６種特異的配列と呼ばれ、「ｓｓｓ」とも表示される。７０アミノ酸の塩基性のカルボキシ末端ドメインで、コードされるプロｓｐ５６タンパクが完了する。７個のＳｕｓｈｉドメインは、図１においてアミノ酸領域に下線を付して示す。Ｓｕｓｈｉドメインならびにｓｐ５６種特異的配列のアミノ酸残基位置は、各領域をコードする配列番号１に記載する対応するｃＤＮＡ領域とともに表１に示す。表１は、実施例２において提示し、より詳細に論じる。Ｓｕｓｈｉドメインは、１０個の実質的に不変のアミノ酸を含む約６０アミノ酸のストレッチから構成される。図３は、典型的なＳｕｓｈｉドメインを示し、ここで、１０個の不連続なアミノ酸（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、一文字表記でＣ、Ｐ、Ｙ、Ｃ、Ｇ、Ｃ、Ｇ、Ｗ、ＰおよびＣを含む）は実質的に不変であり、配列内で特異的な位置に位置する。残りの約５０アミノ酸は、かなりの多様性を示す。この一般的構造は、以下の特徴を有する： 1）ループドループ構造を形成するＣ１−Ｃ３およびＣ２−Ｃ４の２つのジスルフィド結合； 2）各ジスルフィド結合の付近に少なくとも１個のプロリン、これは連続するＳｕｓｈｉドメインの接続に必要な鎖のターンを提供する；および 3）内部疎水性ループ上でのＧおよびＷの存在。ループドループ構造において、大きいループと小さいループの両方が存在し、その中に疎水性アミノ酸のストレッチが存在する。「大ループ」は、Ｃ１とＣ２との間の約２５〜３０個の最も電荷の高いアミノ酸のストレッチから構成され、スーパーファミリー内で相当異なっており、その荷電した性質のため、スーパーファミリーのメンバーのタンパクレセプター機能に多大な貢献をする〔Ichinose et al.，J．Biol．Chem.，265:13411-13416(1990)〕。大ループおよび小ループは、それぞれ「ｌｌ」および「ｓｌ」と呼ぶ。さらに、Ｓｕｓｈｉドメイン６は、さらなるシステイン残基を有し、したがって大ループ内に付加的なループを有することを特徴とする。そのようにして、大ループはシステイン残基により第一のループ（Ｓｈ６ｆｌ）および中ループ（Ｓｈ６ｍｌ）にさらに分離される。これらの各々の配列は、表１に示す。スーパーファミリーの一員としての資格に一致して、ｓｐ５６種特異的ドメインは、他の既知のあらゆるタンパクに対して検出可能な相同性を有さず、システイン残基を含まないため、ジスルフィド結合により決定される二次構造の可能性か排除される。ｓｐ５６種特異的ドメインは、高度に荷電したアミノ酸から構成され、それがタンパクの外部に存在し、Ｂ細胞エピトープである可能性が高いことを示す。コンピュータシミュレーションでは、ヘリックスまたはβシートの二次構造は解明されなかった。したがって、その独特の配列、おそらくｓｐ５６表面に位置すること、および二次構造の欠如のため、ｓｐ５６のこのドメインは、ｓｐ５６に特異的な種特異的免疫応答を誘導するために設計されるハプテンとして優れた候補を表す。上述した保存されたドメインおよび成熟型ｓｐ５６タンパクを生成するための切断部位から見て、類似の切断パターン、三次元構造および結果として生じるタンパク種は、ヒトを含む他の哺乳類において同定可能である。本明細書の開示が異なる哺乳類種からのｓｐ５６を同定する限りにおいて、本発明は、１または少数の哺乳類種に由来するｓｐ５６タンパクに制限されるべきではない。したがって、本発明は、無制限に、ｒＤＮＡまたは天然供給源からの生化学的精製によって、ヒトおよび他の霊長類、ウサギ、ラットおよびマウスを含むげっ歯類、イヌ、ネコ、ブタを含む有蹄類、有袋類、および他の哺乳類種を含め種々の種の任意のものから由来しうる哺乳類ｓｐ５６タンパクまたはホモログを企図する。したがって、「ホモログ」という用語は、アミノ酸残基配列に基づいて類似の三次元構造を有する任意の哺乳類ｓｐ５６タンパクまたはポリペプチドをいう。換言すれば、本発明のｓｐ５６種は、アミノ酸配列類似性、反復コンセンサスＳｕｓｈｉドメインの存在、種特異的配列の存在、分子の全体的二次および三次構造、および同様の物理的パラメータから見て、相同な分子である。ヒトおよび農業に関連する動物種は、マウスｓｐ５６の特に好ましいホモログである。本明細書において同定された例示的ｓｐ５６種は、マウス、ラット、リス、ウサギ、ウッドチャック、プレーリードッグ、アライグマ、シカおよび関連有蹄類、カンガルーおよびヒトｓｐ５６である。上述したように、ｓｐ５６は、まずインビボで前駆体形態で産生され、次いで本明細書において記載するような生物学的活性を有するより小さいポリペプチドへとプロセッシングされる。これらの異なるポリペプチド形態が有用として企図される限りにおいて、ｓｐ５６タンパクまたはポリペプチドという用語は、ｓｐ５６遺伝子から由来するアミノ酸残基配列を有するポリペプチドのすべての種を内包する。したがって、本発明のｓｐ５６タンパクは、本明細書において記載するように、その用途にしたがって種々の形態であることができる。したがって、本明細書において用いる場合、「ｓｐ５６タンパク」および「ｓｐ５６ポリペプチド」という語句は、本発明の哺乳類ｓｐ５６タンパクの部分に相当する、好ましくはそれと同一の、アミノ酸残基配列を含むアミノ酸残基配列を有するｓｐ５６分子を指す。したがって、本発明は、配列番号１に示すｓｐ５６タンパクの配列に相当するアミノ酸残基配列を有し、実施例２に記載するように、表１に示すポリペプチドよりなる群から選択される式によって表されるアミノ酸残基配列を含むｓｐ５６ポリペプチドをも企図する。この態様においては、ポリペプチドは、ｓｐ５６エピトープを模倣する能力を有し、それによって本明細書および背景において記載したようにｓｐ５６の生物学的活性を阻害することを、さらに特徴とする。ネイティブな折りたたまれたｓｐ５６分子の三次元構造のため、本発明は、ｓｐ５６の複数の領域がｓｐ５６レセプター機能に関与することを企図し、その複数の種々の領域は、上記の種々のｓｐ５６ポリペプチドにより定義される。レセプター−リガンド結合を阻害する上述のポリペプチドの能力は、実施例においてより十分に論じるように、不妊性についてのアッセイ、抗ｓｐ５６抗体の存在の検出および同様のものを含むインビボの方法とともに、免疫化学分析、精子−卵結合アッセイおよび同様のものを含むインビトロでの結合アッセイにおいて、容易に測定することができる。したがって、別の態様においては、本発明は、ｓｐ５６レセプターの複数接触部位の同時阻害を与えるように組合わせて混合されている、免疫避妊を促進することによってｓｐ５６レセプター機能を阻害する上述の異なるｓｐ５６ポリペプチドを１またはそれ以上含む、ｓｐ５６ポリペプチド組成物を企図する。免疫避妊ワクチン組成物中の抗原性ポリペプチドとしての使用に好ましいｓｐ５６タンパクおよびポリペプチドは、実施例２の表１に示す。好ましいｓｐ５６タンパクとしては、プレ−プロｓｐ５６、プロｓｐ５６および成熟型ｓｐ５６が挙げられる。好ましいｓｐ５６の部分としては、各完全Ｓｕｓｈｉドメインおよびその中の定義された大および小ループ（Ｓｕｓｈｉドメイン６の大ループ中に形成される代替的ループを含む）が挙げられる。特に好ましいｓｐ５６ポリペプチドとしては、表１に示すような種特異的配列およびそのフラグメントが挙げられる。本発明のｓｐ５６タンパクの種々の形態から見て、ｓｐ５６タンパクおよびポリペプチドは、多様な方法で入手することができる。１つの態様においては、ｓｐ５６は、精巣のような天然の組織から単離することができる。生化学的精製およびアフィニティ精製を含むｓｐ５６の単離のための例示的な方法は、実施例１に記載する。あるいは、本発明のｓｐ５６は、組換えタンパク、すなわち、ここで記載するような組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）法により生産されるものであることができる。組換え生産方法は、単離されたまたは実質的に純粋なレセプター組成物を得るためにさらに精製するための材料を生産する好ましい手段ではあるが、組換えｓｐ５６タンパクは、ある種の態様において有用であるためには、必ずしも実質的に純粋である必要はなく、あるいは単離されている必要さえない。組換えｓｐ５６タンパクは、哺乳類細胞株上もしくはその中、または哺乳類細胞株の粗抽出物中に存在しうる。他の態様においては、組換えｓｐ５６タンパクは、飼料または餌というデリバリー手段におけるその後の用途のために、植物または植物細胞株上またはその中に産生される。この文脈において本発明のｓｐ５６タンパクの生産のための好ましい発現ベクター系は、セクションＥにおいて記載する。１つの態様においては、ｓｐ５６タンパクは、ｓｐ５６試薬の純度および薬学的に異なるタンパクを含有しない度合いが、本明細書で記載する診断および治療方法における用途を与えるように、実質的に他のタンパクまたはペプチドを含まない。天然供給源からの生化学的精製法もまた既に記載したように企図することができるが、組換えによる生産方法は、理想的にはこの点において絶対的な純度を生じるために適している。この点に関して、ｓｐ５６タンパクは、リガンド結合または生物学的活性についての従来のスクリーニングアッセイにおいて薬学的交差反応性が検出されないように、他の分子が十分に存在しない場合、実質的に他のタンパク分子を含まない。単離されたおよび組換えｓｐ５６タンパクに加えて、本発明は、ｓｐ５６タンパクのアナログをも企図する。アナログは、免疫学的反応性、リガンド結合能または本発明のｓｐ５６タンパクの同様の機能的特性に関して本発明のｓｐ５６の性質を呈する人造変異体である。したがって、少数の変更例を挙げれば、アナログは、ｓｐ５６の切断生成物であることができ、ｓｐ５６の部分に相当するポリペプチドであることができ、膜アンカーが除去されたｓｐ５６ポリペプチドであることができ、そして、いくつかのアミノ酸残基が変更されている変異ｓｐ５６配列であることができる。ｓｐ５６ポリペプチドは、合成の容易さのため、長さ約２００アミノ酸残基を超えないことが好ましい。したがって、合成による生産法を用いる場合には、ｓｐ５６ポリペプチドは約１５０アミノ酸残基を超えないことがより好ましく、さらにより好ましくは約６５残基を超えず、そして最も好ましくは長さ３０アミノ酸未満である。主題ｓｐ５６ポリペプチドは、そのポリペプチドがｓｐ５６のエピトープを模倣することができる限りにおいて、アミノ酸配列が本明細書において示されているポリペプチドのあらゆるアナログ、フラグメントまたは化学的誘導体を含む。したがって、本発明のポリペプチドは、そのような変更がその用途においてある種の利点を提供するような、種々の変更、置換、挿入、および欠失の対象とすることができる。この点に関して、本発明のｓｐ５６ポリペプチドは、ｓｐ５６タンパクの配列と同一であるというよりも、それに相当するものであり、１またはそれ以上の変更がされ、本発明のｓｐ５６ポリペプチドと免疫反応する抗体を誘導する能力を保持する。したがって、「アナログ」という用語は、本明細書において具体的に示されている配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を有し、１またはそれ以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されており、本明細書において記載した抗体産生を誘導する能力を呈する、あらゆるポリペプチドを含む。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの非極性（疎水性）残基を別のもので置換すること、アルギニンとリシンの間、グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間でのように１つの極性（親水性）残基を別のもので置換すること、リシン、アルキニンまたはヒスチジンのような１つの塩基性残基を別のもので置換すること、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のような１つの酸性残基を別のもので置換すること、が挙げられる。「保存的置換」という語句は、そのようなポリペプチドが必要な結合活性を呈することを条件に、非誘導残基の代わりに化学的に誘導された残基を使用することをも含む。「化学的誘導体」は、側鎖官能基の反応により化学的に誘導された１またはそれ以上の残基を有する主題ポリペプチドを指す。このような誘導された分子としては、例えば、塩酸アミン、ｐ−トルエンスルフォニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するように遊離のアミノ基が誘導されている分子が挙げられる。遊離のカルボキシル基は、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステル、またはヒドラジドを形成するように誘導されていてもよい。遊離の水酸基は、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導されていてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−イム−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導されていてもよい。さらに化学的誘導体として含まれるものとしては、２０種の標準アミノ酸の１またはそれ以上の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドがある。例えば、４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換してもよく、５−ヒドロキシリシンでリシンを置換してもよく、３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換してもよく、ホモセリンでセリンを置換してもよく、また、オルニチンでリシンを置換してもよい。Ｄ−アミノ酸もまた、１またはそれ以上のＬ−アミノ酸の代わりに包含させてもよい。本発明のポリペプチドはまた、必要な活性が維持されている限りにおいて、配列を本明細書に示すポリペプチドの配列と比較して残基の１またはそれ以上の付加および／または欠失を有するあらゆるポリペプチドをも包含する。「フラグメント」という用語は、アミノ酸残基配列を本明細書において示すポリペプチドの配列よりも短いアミノ酸残基配列を有するあらゆる主題ポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドがｓｐ５６ポリペプチドの配列と同一ではない配列を有する場合、それは、典型的には１またはそれ以上の保存的または非保存的置換がなされており、通常約３０％（number percent）を超えない、より通常は２０％を超えない、そして好ましくは１０％を超えない数のアミノ酸残基が置換されている。付加的な残基もまた、「リンカー」を提供する目的でいずれかの末端に付加されていてもよく、これにより本発明のポリペプチドは、標識または固体マトリックス、またはキャリアーに好都合に固定することができる。好ましくは、リンカー残基は、ｓｐ５６エピトープを形成しない、すなわち、セクションＢおよびＤにおいて記載したように、構造においてｓｐ５６タンパクに類似しない。本発明のあらゆるペプチドは、医薬的に容認されうる塩の形態で用いてもよい。本発明のペプチドと塩を形成することができる好適な酸としては、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸のような無機酸、リン酢酸(phosp horic acetic acid)、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸等が挙げられる。本発明のペプチドと塩を形成することができる好適な塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等のような無機塩基;およびモノ、ジおよびトリアルキルおよびアリルアミン（例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン等）、場合により置換されているエタノールアミン（例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン等）のような有機塩基が挙げられる。本発明のｓｐ５６ポリペプチドは、本明細書において主題ポリペプチドとも呼ばれ、ポリペプチド技術の分野において当業者に公知のいかなる技術によって合成してもよく、これには上述のように組換えＤＮＡ技術も含まれる。固相メリフィールド合成法のような合成化学技術は、純度、抗原特異性、望ましくない副産物の不存在、生産の容易さ等の理由から、好ましい。利用可能な多くの技術の優れた要約は、固相ペプチド合成についてはJ．M．Steward and J．D．Young，“S olid Phase Peptide Synthesis”，W．H．Freeman Co.，San Francisco，1969;M ．Bodanszky，et al.，“Peptide Synthesis”，John Wiley ＆ Sons，Second e dition，1976;およびJ．Meienhofer，“Hormonal Proteins and Peptides”，Vo l．2，P.46， Academic Press(New York)1983、および古典的溶液合成についてはE．Schroder and K．Kubke，“The Peptides”，Vol．1，Academic Press(New York)，1965に見出すことができ、これらの各々は参照により本明細書に包含される。このような合成において使うことができる適切な保護基は、上述のテキストおよびJ．F． W．McOmie，“Protective Groups in Organic Chemistry”，Plenum Press，New York，1973（これは参照により本明細書に包含される）に記載されている。一般に、企図される固相合成法は、１またはそれ以上のアミノ酸残基または好適に保護されたアミノ酸残基を、伸長中のペプチド鎖に連続的に添加することを含む。通常、最初のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを好適な選択的に除去可能な保護基で保護する。リシンのような反応性側鎖基を含むアミノ酸については、選択的に除去可能な異なる保護基を用いる。例として固相合成を用いると、保護されたまたは誘導されたアミノ酸を、その保護されていないカルボキシル基またはアミノ基を通じて不活性固体支持体に付着させる。次いで、アミノ基またはカルボキシル基の保護基を、選択的に除去し、好適に保護された対応する（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸を混合し、固体支持体に既に付着している残基とアミド結合を形成するのに好適な条件下で反応させる。次いで、この新規に付加したアミノ酸残基からアミノ基またはカルボキシル基の保護基を除去し、次のアミノ酸（好適に保護されたもの）を添加し、同様に続ける。すべての所望のアミノ酸が正しい配列で連結された後、あらゆる残存する末端および側鎖基保護基（および固体支持体）を連続的にまたは同時に除去し、最終的なポリペプチドを得る。ｓｐ５６ポリペプチドは、特に、本発明の診断方法および系において身体試料中に存在するｓｐ５６レセプターまたはｓｐ５６それ自身を検出するために用いることができ、またはｓｐ５６上の保存されたエピトープと免疫反応する抗体の調製のための本明細書に記載された接種物を調製するために用いることができる。さらに、本発明のｓｐ５６ポリペプチドのあるものは、本発明の治療方法において、さらに本明細書で記載するようにｓｐ５６の機能を阻害するために用いることができる。本発明のポリペプチドとともに使用することができる標識、固体マトリックスおよびキャリアーは、以下に記載する。アミノ酸残基リンカーは、通常、少なくとも１個の残基であり、４０以上の残基であることができるが、より頻繁には１〜１０個の残基であり、ｓｐ５６エピトープを形成しない。連結のために用いられる典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸等である。さらに、主題ポリペプチドは、反対のことが指定されていない限り、末端ＮＨ₂のアシル化、例えばアセチル化、またはチオグリコール酸アミド化により、例えばアンモニア、メチルアミン等を用いる、末端カルボキシアミド化により、修飾された配列によって、ｓｐ５６タンパクの天然配列とは異なることができる。当業界においてキャリアーハプテンコンジュケート（接合体）として公知のものを形成するためにキャリアーにカップリングされている場合、本発明のｓｐ５６ポリペプチドは、ｓｐ５６と免疫反応する抗体を誘導することができる。したがって、免疫学的交差反応性の十分に確立された原理から見て、本発明は、本明細書に示すポリペプチドの抗原的に関連する変異体を企図する。「抗原的に関連する変異体」は、本明細書に記載されたポリペプチドおよび本発明のｓｐ５６タンパクと免疫反応する抗体分子を誘導することができる主題ポリペプチドである。Ｄ．ｓｐ５６融合タンパク１つの態様においては、本発明は、免疫避妊ワクチン組成物中での用途のための、および決定基が本明細書において開示されたように有用である他の方法における用途のための、本発明の抗原性ポリペプチドを含む融合タンパクを企図する。融合タンパクは、第二のポリペプチドドメインに作動可能に連結された第一のポリペプチドドメインを含み、ここで、第一のポリペプチドドメインは、本発明の抗原性ポリペプチドを含むアミノ酸残基配列、すなわちｓｐ５６抗原決定基を定義する配列を含むものである。第二のポリペプチドドメインは、いかなるポリペプチド配列であってもよいが、好ましくは融合タンパクにある機能および利点を提供する。例示的な機能としては、キャリアーとして、提示構造として、融合タンパクがアセンブリー（集合）をしたウイルス粒子のようなより大きい構造と関連するのを制御するための結合部分として、免疫応答を高めるタンパクのような免疫刺激剤として、（例えばより強力な免疫応答を促進するための）抗原性分子として、アジュバントとして、作用すること、および同様な機能が挙げられる。本発明は、第二のポリペプチドドメインの機能に関して制限的であると認定されるものではない。作動可能に連結するとは、融合タンパクに関しては、２つの別個の遺伝子を単一のオープンリーディングフレームへと融合する組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）法により作成された遺伝子からの単一のポリペプチドのｒＤＮＡ発現の特徴によって生じる、２つのポリペプチドが、順序にかかわらず、タンパク中で２個のアミノ酸間に見出される通常のポリペプチド結合によって、結合されていることを意味する。第一および第二のドメインの単一ポリペプチド中における順序は、ポリペプチドのアミノおよびカルボキシ末端に関して連続的である必要はなく、第一または第二のいずれかのドメインがアミノ末端であること、あるいはその逆であることができる。好ましい融合タンパクは、第二のポリペプチドドメインとして、コレラ毒素サブユニットＡ、コレラ毒素サブユニットＢ、ジフテリア毒素、インフルエンザウイルスＨＡタンパク、マウス白血病ウイルスコートタンパク、サルモネラ表面タンパク、およびタバコモザイクウイルスコートタンパクよりなる群から選択される配列を有する。例示的な融合タンパクは、実施例において記載する。融合タンパクは、組換え遺伝子産物の操作および発現のための周知のｒＤＮＡ法により産生される。融合タンパクの発現のための種々のベクターおよび宿主系の任意のものを用いてよく、それが、宿主発現系からの発現された融合タンパクの回収および精製の経路を決定する。細菌、酵母および植物発現系が好ましい。植物発現ベクターは、産生された融合タンパクを餌または飼料中に植物性物質とともに製剤化しようとする場合には、特に好ましい。これらは本明細書において記載する。Ｅ．ｓｐ５６タンパクおよび融合タンパクの発現のためのベクター本発明のｓｐ５６タンパクは、ｒＤＮＡ発現ベクターを用いる哺乳類細胞での発現が好ましいが、種々の手段によって調製することができる。組換えｓｐ５６についての例示的産生方法は、実施例において記載する。したがって、本発明は、インタクトなｓｐ５６タンパクとして、融合タンパクとして、またはｓｐ５６のより小さいポリペプチドフラグメントとしての、組換え単離ｓｐ５６タンパクの生産方法をも提供する。本発明の生産方法は、一般に、本発明のｓｐ５６タンパクを発現するよう細胞を誘導する工程、生じた細胞から発現されたｓｐ５６を回収する工程、および回収されたｓｐ５６を、生化学的分画法により、本発明の特異的抗体を用いて、または他の化学的手順により、精製する工程を包含する。組換えｓｐ５６タンパクの発現の誘導は、ｓｐ５６を発現することができるｒＤＮＡである本発明のｓｐ５６タンパクまたはそのフラグメントをコードするｒＤＮＡベクターを好適な宿主細胞中に挿入すること、およびベクターのｓｐ５６遺伝子を発現させることを含むことができる。したがって、本発明の組換えｓｐ５６タンパクまたは融合タンパクの発現を容易にするためには、ｓｐ５６またはその部分をコードするＤＮＡセグメントは、発現ベクターに挿入する。ＤＮＡセグメントは、本発明のｓｐ５６タンパクをコードするＤＮＡ配列を含むものとして特徴づけられる。すなわち、本発明のＤＮＡセグメントは、ｓｐ５６構造遺伝子の一部または全部の存在を特徴とする。好ましくは、上記遺伝子は、各コドンがｓｐ５６タンパクに見出されるアミノ酸残基をコードする中断されない直鎖状の一連のコドン、すなわち、イントロンを含まない遺伝子として存在する。好ましい態様の１つは、本明細書において定義するｓｐ５６タンパクを定義するアミノ酸残基配列をコードするＤＮＡセグメントであり、このＤＮＡセグメントは、本発明のｓｐ５６タンパクを発現することができる。好ましいＤＮＡセグメントは、配列番号２に示すアミノ酸残基配列またはその部分と実質的に同じ、そして好ましくは本質的にそれからなる、アミノ酸残基配列をコードする。特に好ましいＤＮＡセグメントは、配列番号１に示す配列に由来するヌクレオチド配列を有する。代表的な、かつ好ましいＤＮＡセグメントは、実施例においてさらに記載し、表１に列挙する。上述のｓｐ５６タンパクをコードする相同ＤＮＡおよびＲＮＡ配列もまた企図される。タンパクまたはポリペプチドのアミノ酸残基配列は、遺伝コードを介してそのタンパクをコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列と直接関連する。したがって、構造遺伝子またはＤＮＡセグメントは、それがコードするアミノ酸残基配列、すなわちタンパクまたはポリペプチドに関して定義することができる。遺伝コードの重要でよく知られた特徴は、その重複である。すなわち、タンパクを作るのに用いられるほとんどのアミノ酸について、２以上のコードヌクレオチドトリプレット（コドン）が特定のアミノ酸残基をコードする（すなわち指定する）ことができる。したがって、多数の異なるヌクレオチド配列が、ある特定のアミノ酸残基配列をコードする可能性がある。このようなヌクレオチド配列は、すべての生物において同じアミノ酸残基配列の産生をもたらすので、機能的に等価であると考えられる。しばしば、プリンまたはピリミジンのメチル化変異体が、ある所定のヌクレオチド配列に取り込まれうる。しかし、このようなメチル化は、いずれにせよコードの関係に影響を与えない。核酸は、それがポリリボヌクレオチドであるかポリデオキシリボヌクレオチドであるか、すなわちＲＮＡであるかＤＮＡであるか、またはそのアナログであるかどうかにかかわらず、あらゆるポリヌタレオチドまたは核酸フラグメントである。好ましい態様においては、核酸分子は、二本鎖ＤＮＡのセグメント、すなわちＤＮＡセグメントの形態である。しかし、ある種の分子生物学的方法論においては一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましい。ＤＮＡセグメントは、化学合成法および組換えによるアプローチを含め、多数の手段により製造することができるが、クローニングまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によることが好ましい。ｓｐ５６タンパクの部分をコードするＤＮＡセグメントは、化学的技術、例えばMatteucciら（J．Am．Chem．Soc.，103:31 85-3191，1981）のホスホトリエステル法または自動化合成法を用いて、容易に合成することができる。さらに、長いＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントを定義するオリゴヌタレオチドのグループの合成、およびそれに続くハイブリダイゼーションおよび完全セグメントを構築するための連結のような、周知の方法により、容易に調製することができる。別の方法としては、１対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによる好ましいＤＮＡセグメントの単離が挙げられる。もちろん、化学的に合成することによって、単に適切な塩基でネイティブなアミノ酸残基配列をコードする塩基を置換することにより、任意の所望の改変を作成することができる。さらに、ｓｐ５６タンパクをコードする構造遺伝子から実質的に構成されるＤＮＡセグメントは、本発明のｓｐ５６タンパクを定義する遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子から得ることができ、続いて、例えば位置特異的またはランダム突然変異生成により改変して、所望の置換を導入することができる。１．ｓｐ５６遺伝子のクローニング本発明のｓｐ５６遺伝子は、種々のクローニング法により、任意の哺乳類からクローン化することができる。クローニングによりｓｐ５６のホモログを得ることは、ｓｐ５６が、保存ドメインの存在により特徴づけられるタンパクレセプターのスーパーファミリーの１つであるという観察に基づいている。全ｓｐ５６遺伝子のクローニングは、核酸相同性の戦略を用いる実施例に記載した一般的方法により行うことができる。本発明のｓｐ５６タンパクをコードする核酸分子を単離するための好ましいクローニング法は、実施例に記載されており、目的のｓｐ５６遺伝子を含有すると考えられている核酸分子のライブラリーをスクリーニングするのに有用なポリヌクレオチドプローブの詳説を含む。ヒトのｓｐ５６遺伝子を単離するための特に好ましいプローブは、実施例６に記載する。本発明のｓｐ５６遺伝子をクローニングするためのライブラリー源は、本発明のｓｐ５６を発現すると考えられている組織からのｃＤＮＡライブラリーの形態のゲノムＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得る。好ましい組織は、精巣組織である。２．発現ベクター本発明は、本明細書に記載するように、ｓｐ５６タンパクをコードする本発明のＤＮＡセグメントを含有する組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を企図する。ｒＤＮＡは、ベクターを本発明のＤＮＡセグメントに作動可能に連結することにより生成できる。本明細書中で用いる場合、「ベクター」という用語は、細胞において自律的複製することができるＤＮＡ分子をいい、他のＤＮＡセグメントは、結合されたセグメントの複製をもたらすようにベクターに作動可能に連結される。遺伝子生成物の発現のために適合され、そしてｓｐ５６の発現を指令しうるベクターを、本明細書では、「発現ベクター」という。このように、組換えＤＮＡ分子は、通常、天然には一緒に見出されることはない、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。本発明のＤＮＡセグメントを作動可能に連結するベクターの選択は、本技術分野でよく知られているように、望ましい機能的性質、例えば、タンパク発現および形質転換される宿主細胞に直接依存し、これらは組換えＤＮＡ分子を構築する技術における固有の制限である。しかし、本発明により企図されるベクターは、少なくとも、そのベクターに作動可能に連結されるＤＮＡセグメントに含まれるｓｐ５６構造遺伝子の複製を、そして好ましくは発現も、指令することができる。原核発現ベクターおよび真核発現ベクターの両方とも、ベクター構築における当業者にはよく知られており、AusebelらによるIn Current Protocols in Molec ular Biology［Wiley and Sons（ニューヨーク）(1993年)］およびSambrookらによるMolecular Cloning:A Laboratory Manual［Cold Spring Harbor Laboratory (1989年)］に記載されている。１つの態様では、本発明により企図されたベクターには、原核レプリコン、すなわち、それにより形質転換された、細菌宿主細胞のような原核宿主細胞における染色体外での組換えＤＮＡ分子の維持および自律的複製を指令する能力を有するＤＮＡ配列が含まれる。そのようなレプリコンは、本技術分野でよく知られている。また、原核レプリコンを含む態様には、その発現が、それにより形質転換された細菌宿主に対して薬剤耐性を与える遺伝子が含まれる。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与える遺伝子である。原核レプリコンを含むベクターはまた、それにより形質転換された大腸菌のような細菌宿主細胞におけるｓｐ５６遺伝子の発現（転写および翻訳）を指令することができる原核プロモーターを含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こることを可能にさせるＤＮＡ配列により形成される発現制御要素である。細菌宿主と適合性のプロモーター配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメントの挿入のための便利な制限部位を含有するプラスミドベクター中に備えられている。典型的なそのようなベクタープラスミドは、バイオラッド・ラボラトリース（Biorad Laboratories）(カリフォルニア州、リッチモンド) から入手できるｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、インビトローゲン（Invitrogen）[カリフォルニア州、サンジエゴ)から入手できるｐＲＳＥＴならびにファルマシア（Pharmacia）[ニュージャージー州、ピスカタウェイ(Piscataway)]から入手できるｐＰＬおよびｐＫＫ２２３である。真核細胞と適合性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と適合性の発現ベクターも、本発明の組換えＤＮＡ分子を形成するのに用いることができる。真核細胞発現ベクターは、本技術分野でよく知られており、いくつかの商業的供給源から入手できる。典型的には、そのようなベクターは、望ましいＤＮＡセグメントの挿入のための便利な制限部位を含有する状態で提供される。典型的なそのようなベクターは、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（ファルマシア）、ｐＢＰＶ− １／ｐＭＬ２ｄ[インターナショナル・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッド(International Biotechnologies，Inc．)]、ｐＴＤＴ１(ＡＴＣＣ＃３１２５５)、ｐＲｃ／ＣＭＶ(インビトローゲン・インコーポレーテッド)、好ましいベクターである、実施例に記載されているｐｃＤＮＡ３(インビトローケン)、および同様の真核発現ベクターである。本発明のタンパクを発現させるのに用いることができる他の発現系は、昆虫系である。１つのそのような系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Autograp ha californica ）核多角体病ウイルス群（ＡｃＮＰＶ）が外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いられる。このウイルスは、スポンドプテラ・フルギペルダ（Spondoptera frugiperda）細胞において生育する。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ウイルスの非必須領域［スポンドプテラ・フルギペルダにおいては、例えばポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子］内にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下におかれる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の成功裡での挿入は、ポリヘドリン遺伝子および非閉鎖（non-occluded）組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパクのコートが欠損しているウイルス）の産生を不活性化する。それらの組換えウイルスは、次に、挿入された遺伝子が発現される細胞を感染させるのに用いられる。SmithらによるJ．Biol．Chem．46巻、584頁(1983年)、Smithによる米国特許第４，２１５，０５１号を参照されたい。組換えウイルスまたは発現を指令するためのウイルス要素を用いる哺乳類細胞系は、操作することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場合、ポリペプチドのコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび３文節系（tripatite）リーダー配列に連結しうる。次にこのキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入しうる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、感染した宿主において生存能力があり、ポリペプチドを発現することができる組換えウイルスをもたらす[例えば、Logan & ShenkによるProc．Natl．Acad．Sci．USA.，81:3655-3659（1984年）を参照されたい]。他には、ワクチニアウイルスの７．５Ｋプロモーターが用いられ得る[例えば、M ackettらによるProc．Natl．Acad．Sci.，USA，79:7415-7419(1982年);Mackett らによるJ．Virol.，49:857-864(1984年);PanicaliらによるProc．Natl.Acad．S ci．USA，79:4927-4931（1982年）を参照されたい]。特に興味がもたれるものは、染色体外要素として複製する能力を有するウシ乳頭腫ウイルスに基づくベクターである[SarverらによるMol．Cell．Biol.，1:486(1981年)]。マウス細胞へのこのＤＮＡの挿入のすぐ後に、プラスミドは、細胞当り約１００〜２００コピーまで複製される。挿入されたｃＤＮＡの転写は、宿主の染色体へのプラスミドの組込みを必要とせず、それにより高度の発現を生じる。それらのベクターは、プラスミド内に、ｎｅｏ遺伝子のような選択性マーカーを含有させることにより、安定な発現のために用いうる。他には、レトロウイルスゲノムを、宿主細胞内にポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入し、その発現を指令することができるベクターとしての使用のために改変しうる［Cone & Mulliganによる、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:6349-6353(1984年)]。高度の発現はまた、メタロチオネイン（metallothionine）IIＡプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含むがそれらに限定されない誘導可能なプロモーターを用いても達成されうる。長期の高収量の組換えタンパクの産生のためには、安定な発現が好ましい。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞を、適する発現制御要素（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）により制御されるｃＤＮＡおよび選択性マーカーで形質転換しうる。先に記載したように、組換えプラスミド中の選択性マーカーは、選択に対する抵抗性を付与し、細胞がその染色体中にプラスミドを安定に組込み、生育してフォーカスを形成するのを可能にし、次に、そのフォーカスは、クローン化され、細胞系へと拡張されうる。例えば、外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞を１〜２日間、強化培地（enriched medium）で生育させ、次に選択培地に換えることができる。多くの選択系を用いることができ、単純疱疹（ヘルペス）ウイルスチミジンキナーゼ[W iglerらによるCell，11:223（1977年)]、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ［SzybalskaおよびSzybalskiによるProc．Natl．Acad． Sci．USA，48:2026(1962年)］およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（LowyらによるCell,22:817(1980年)]遺伝子（それぞれｔｋ− 、ｈｇｐｒｔ − またはａｐｒｔ− 細胞に用いることができる）が含まれるが、それらに限定されない。また、代謝拮抗物質抵抗性付与遺伝子、例えばメソトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ遺伝子[WiglerらによるProc．Natl．Acad．Sci ．USA，77:3567（1980年）;O’HareらによるProc．Natl．Acad．Sci．USA，78:1 527(1981年)]；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ遺伝子[Mulli ganおよびBergによるProc．Natl．Acad．Sci．USA，78:2072(1981年)]；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ遺伝子[Colberre-Garapi nらよるJ．Mol．Biol．、150巻、１頁(1981年)]；およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子［SanterreらによるGene，30:147(1984年)］も、選択の基礎として用いることができる。近年、他の選択性遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを使うことを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを使うことを可能にするｈｉｓＤ［HartmanおよびMulliganによるProc．Natl．Acad．Sci ．USA，85:804(1988年)］;およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する抵抗性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）[McConlogue L.，In:Current Communica tions in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory編(1987年)]が記載されている。他の好ましい態様では、植物細胞とともに使用するのに適合性の発現ベクターを、植物においてｓｐ５６を発現させるのに用いる。植物は、そのものからそのタンパクを単離できるものであるかまたはその植物中で摂取できる、普遍的な接近での嵩高（バルク）のタンパクの多量の供給が植物から容易に行われる点で、有利な発現およびデリバリー面を提供する。このように、本発明の組換えｓｐ５６タンパクをコードするための発現ベクターを含有するトランスジェニック植物は、免疫避妊ワクチン組成物に使用するｓｐ５６抗原性ポリペプチドを製造するために有用である。植物における遺伝子の発現のために有用な典型的な発現ベクターは、本技術分野でよく知られている。ｓｐ５６をコードする遺伝子を発現ベクターを介して植物に導入する典型的な方法には、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ag robacterium tumefaciens）媒体形質転換、植物ウイルストランスフェクション、原形質体（プロトプラスト）形質転換、花粉への遺伝子導入、生殖器官への注入、未熟胚への注入、および「バイオリスチックス(biolystics)」という方法である直接挿入が含まれる。植物ウイルスによる感染の場合、ｓｐ５６タンパクは、高濃度で産生され、低コストで単離することができ、遺伝子ストックは、植物を経由することなく、長期間容易に維持される。そのような発現に好ましい植物には、その植物に適合性の発現ベクターが存在し、本発明のｓｐ５６免疫避妊性抗原ポリペプチドを哺乳類にデリバリーするのに用いられ得る植物が含まれる。植物の例には、双子葉植物および単子葉植物が含まれる。特に好ましい植物としては、アルファルファ、トマト、ペチュニア、大豆、タバコ、コーン、小麦、米、ホウレンソウ、アスパラガス等が挙げられる。本発明のｓｐ５６組換えタンパクの発現のための発現ベクター系の例には、米国特許第５，２０２，４２２号およびAnらによるPlant Molecular Biology Manu al，A3:1-19（1988年）に記載された、アグロバクテリウム・チュメファシエンスを用いるバイナリーベクター系のようなものが含まれ、それらの記載を引用により本明細書に援用する。他の好ましい植物ベクター系には、FreedおよびCarringtonによるJ．Virol.， 64:1590（1988年）に記載されたｐＲＴＬ２系列のベクターが含まれる。それらのベクターは、発現制御配列に作動可能に連結されたｓｐ５６インフレーム組換えＤＮＡセグメントを生成し、そのセグメントは次に単一フラグメントとして植物発現ベクターに移行され、その発現ベクターは次に選ばれた植物に導入されるために用いられるので、シャトルベクターと呼ばれる。ｐＲＴＬ２ベクターは、ｐＲＴＬ−ＧＵＳからＧＵＳコード配列を除去し、その代わりに、目的のコード配列と換えることにより、ｐＲＴＬ−ＧＵＳから誘導される。実施例に記載するように、ＧＵＳ配列は、コレラ毒素のαまたはβ鎖をコードする遺伝子に取り換えられており、本発明のｓｐ５６タンパクを含む融合タンパクの発現を提供する。ｐＲＴＬ２ベクターは、植物発現ベクターにおけるｓｐ５６の発現を媒介するためのシャトル化発現要素とて有用である下記の要素を有する：カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ転写物遺伝子から誘導される３５Ｓプロモーター、翻訳エンハンサーとして役立つタバコエッチ（tabacco etch）ウイルス非翻訳リーダー配列、およびトランス遺伝子転写物のポリアデニル化を指令するためのカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ転写物遺伝子の３’末端の３５Ｓポリアデニル化配列。それらの要素は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限消化により単離される単一カセット状に作成される。コレラ遺伝子系／ｓｐ５６コード領域を有する制御要素を含有するその単離されたフラグメントを、次にｐＧＡ４８２のような好ましい植物発現ベクターに挿入する[AnらによるPlant Molecular Biology Manual，A3：1-1 9(1988年)]。次に、組換え植物ベクターを、植物ウイルスを形質転換させるのに用いて、次にその植物ウイルスを用いて、タバコまたはアルファルファのような植物に感染させる。好ましい植物ウイルスは、アグロバクテリウム（Agrobact erium）株ＬＢＡ４４０４である。さらに好ましい植物デリバリー発現系は、改変されたタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に依存し、ＴＭＶの表面におけるＴＭＶコートタンパク−ｓｐ５６キメラポリペプチド分子の合成を指令する。免疫避妊を媒介するための自己抗体応答を誘発するためにこの系を用いる方法が、FitchenらによるVaccine、13巻、10 51-1057員（1995年）に記載されている。その著者は、非経口的にデリバリーされる免疫源として用いられる卵母細胞由来抗原を有するＴＭＶハイブリッド分子の産生を記載している。ＴＭＶは、桿状粒子へと集合し、次にその粒子がウイルスに感染した葉に蓄積する、自己集合ウイルスであることにおいて、好ましい抗原キャリアー分子である。集合した粒子のタンパク成分は、コートタンパク（ｃｐ）であり、そのカルボキシ末端部分に非ＴＭＶエピトープか挿入される。感染および発現の後に、ＴＭＶｃｐおよび集合したＴＭＶ粒子は、それ自体免疫原性である一方、抗原エピトープをデリバリーする抗原系を提供する。コートタンパクは容易に単離されて、粒状でまたは団粒形態で存在する。この状況は、本発明の方法において記載されたような抗原の高濃度の有効な非経口のまたは経口の免疫感作のために利点を与える。本発明の例示的なＴＭＶ-ｓｐ５６キメラポリペプチド分子の調製は、実施例３に記載する。他の好ましい植物発現ベクター系には、ｐＭＯＮ５３０[RogersらによるMetho ds in Enzymol.，153:253(1987年)]、ｐＫＬＹＸ５、６、７系列［SchardlらによるGene，61:1(1987年)、およびクロンテック（Clontech）(カリフォルニア州、パロアルト)から市販されているｐＢＩＮ１９が含まれる。Ｆ．免疫避妊の方法本発明は、精子ｓｐ５６タンパクに対する免疫応答を誘発することにより哺乳類に不妊性を誘導するのに有用な免疫避妊ワクチン組成物を企図する。本発明のそのワクチン組成物は、生理学的に許容できる賦形剤を、活性成分としてその中に溶解または分散された、本発明の抗原性ｓｐ５６を含む抗原性ポリペプチドとともに含有することができる。本明細書において用いる場合、「医薬（薬剤）的に容認できる」「生理学的に許容できる」という用語およびそれらの文法的語尾変化は、それらが組成物、キャリアー、希釈剤および作用剤に言及するにしたがって、互換的に用いられ、そして悪心、めまい、胃の不調のような望ましくない生理学的影響の発生がなくその物質を哺乳類に投与できることを表わす。医薬組成物中に溶解または分散された活性成分を含有する医薬組成物の調製は、本技術分野でよく知られている。典型的には、そのような組成物は、投与の企図される経路により製剤化される。経口免疫避妊剤として、典型的には、本発明の抗原性ポリペプチドは、餌または飼料に含有される。一方、目標物（直接、投与されるワクチン）としては、抗原性ポリペプチドは、液体溶液または葱濁液としての注射液として調製されるが、使用の前の液体溶液または懸濁液に適している固体形態も調製できる。その調製物はまた、乳化され得る。活性抗原性ポリペプチドを、本明細書に記載されている治療法における使用に適する量で、薬剤として容認でき、活性成分と適合性である賦形剤と混合しうる。適する賦形剤は、例えば、水、塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等およびそれらの組合わせである。また、望ましい場合は、その組成物は、少量の、活性成分の効果を増大する湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤等のような補助物質を含有することができる。本発明のワクチン組成物には、成分の薬剤的に容認できる塩を含有させることができる。薬剤的に容認される塩には、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデリン酸（mandelic acid）のような有機酸を用いて生成される酸添加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基で生成される）が含まれる。遊離カルボキシル基で生成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基からも誘導され得る。生理学的に許容できるキャリアーは、本技術分野でよく知られている。液体キャリアーの例は、活性成分および水の他には物質を含まないか、または生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理的塩類溶液またはその両方のような緩衝剤を含有する滅菌水性溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水である。なおさらに、水性キャリアーは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ブドウ糖、ポリエチレングリコールおよび他の溶質と同様に、２以上の緩衝塩を含有し得る。液体組成物はまた、水に加えて、または水なしで、液相も含有し得る。そのような付加的な液相の例には、グリセリン、綿実油のような植物油および水−油エマルジョンがある。免疫避妊組成物は、１回以上の免疫処理後、免疫処理された哺乳類において、抗ｓｐ５６抗体を含有する免疫応答を誘発するのに効果的であることについてのｓｐ５６抗原決定基を、ある量含有する。免疫処理の経路は、さらに本明細書に記載されているように、変わりうるが、免疫応答を誘発するのに有効であるために必要な量のｓｐ５６抗原決定基を含有する組成物の調製に影響を与える。したがって、有効量は、適するそして企図された経路による投与時に抗ｓｐ５６抗体の産生を誘発する量である。反復免疫処理を用いてもよく、これは、活性成分の低濃度化を可能にする。このように、１つの態様では、本発明は、処理される哺乳類の精子に存在するｓｐ５６抗原決定基を含有する、本明細書に記載された免疫避妊ワクチン組成物を、哺乳類に投与することを含む、哺乳類またはヒトの免疫避妊方法を提供する。抗原性ポリペプチドは、本明細書に記載したように変わりうる典型的な投与経過の後に、抗ｓｐ５６抗体応答を誘発するのに十分な量で、その組成物中に存在する。ワクチンの有効性は、処理された哺乳類の血清中の抗ｓｐ５６抗体の存在を観察することによって、または処理された哺乳類により産生された精子の受精能を測定することにより、決定できる。免疫避奸ワクチン組成物は、慣習的に、静脈、皮下、筋肉または腹膜内に投与されるが、多くの好ましい態様では、餌または飼料中に経口で投与される。本組成物は、調剤配合物（dosage formulation）と適合する様式で、免疫治療的に有効な量で投与される。投与される量は、処理される対象体、活性成分を用いるための対象体系の吸収力、および望ましい免疫応答の程度による。投与されることが必要な活性成分の正確な量は、医師または実施者の判断によることができ、そして各個体に特有である。しかし、全身投与に適する用量範囲は、本明細書に開示されており、そして投与の経路に依存する。初回投与および追加用量のための適する型も変わりうるが、典型的には、初回投与の後に、次の注射または他の投与方法による１時間以上の間隔での反復投与量、とされる。好ましくは、本発明の抗原性ポリペプチドは、分離された形態で、すなわち、全組成物の少なくとも約０．１重量％、好ましくは少なくとも１％、より好ましくは少なくとも約１０％で、組成物中に存在する。配合組成物における使用のために特に好ましいのは、抗原性ポリペプチドの実質的に純粋な調製物、すなわち、本発明の組成物へと混合する前に、最初に、少なくとも９０重量％、そしてより好ましくは少なくとも９９重量％の調製物である。ポリペプチドの化学的性質に基づく単離されたポリペプチドの濃縮および調製に有用な生化学的方法は、よく知られており、９９重量％よりも多く濃縮されたタンパクの製造のために慣例的に用いることができる。本発明の最も重要な用途は、げっ歯動物等のような野生の有害哺乳類個体群の制御であるので、餌または飼料の使用が本発明のワクチン組成物のための配合物として特に有用である。したがって、好ましい投与経路は、食物摂取による経口経路である。本組成物には、植物物質または他のキャリアーを含むことができ、したがって、好ましいキャリアーは非毒性の食することができるキャリアーである。ペレット、カプセル、錠剤、食物バー（food bar）等への餌および飼料の配合は、農業の技術分野で一般的によく知られており、本発明を制限するものとは考えない。特に好ましい製剤には、植物における抗原性ポリペプチドの産生のための組換えＤＮＡ発現ベクターの使用か含まれ、その使用により、飼料または餌中へのその植物の収穫を可能にし、それによって、ワクチン配合物が提供される。例示的な方法には、本発明の抗原性ポリペプチドをコードする発現性遺伝子を含有するトランスジェニック植物の調製が含まれる。その他に、植物は、抗原性ポリペプチドを含有し、そして発現するように操作されたウイルスベクターで感染され得る。本明細書中に記載された好ましい態様では、植物の感染、および餌または飼料を調製するために最終的に用いられる植物物質における抗原性ポリペプチドの呈示のためにＴＭＶが用いられる。Ｇ．抗ｓｐ５６抗体１つの態様において、本発明の抗体、すなわち、抗ｓｐ５６抗体は、本発明のｓｐ５６抗原決定基と免疫反応する抗体分子を含むものと特徴づけられる。このように、本発明は、本発明の抗原性ポリペプチドと免疫反応する、好ましくは天然のｓｐ５６タンパクとも免疫反応する、抗ｓｐ５６抗体を記載している。好ましくは、抗体は、実質的に、ｓｐ５６以外の精子タンパクとの免疫反応がない。免疫反応性を評価するために有用な免疫反応のためのアッセイは、本明細書に記載されている。１つの態様では、ｓｐ５６の予備選択されたドメインと免疫反応し、他のドメインとは免疫反応せず、それにより抗体に望ましい特異性を与える抗体分子が記載されている。例えば、本明細書に示すように、ｓｐ５６のドメインは、それが由来するｓｐ５６の種に対して特有の種特異的配列（ｓｓｓ）を有する。ｓｓｓドメインと免疫反応性の抗体は、異なる種からのｓｐ５６と免疫反応せず、したがって、ｓｐ５６種を分類化するのに有用である。一方、ｓｐ５６のドメインは、種間で保存され、したがって、それらの保存されたドメインと免疫反応性の抗体は、他のｓｐ５６種と免疫反応し、広範囲の種反応性の利点を有することが本明細書に示されている。本発明の抗体は、典型的には、哺乳類を、本発明の抗原性ポリペプチドを含有する接種物で免疫処理し、それにより、免疫処理するポリペプチド上の抗原決定基についておよびｓｐ５６についての免疫特異性を有する抗体分子を哺乳類中に誘発することにより産生される。次に抗体分子を哺乳類から回収し、例えば、ＤＥＡＥセファデックスによるような、よく知られた技術により、望ましい程度まで単離し、ＴｇＧフラクションを得る。免疫原中に抗原性ポリペプチドを用いる抗体調製法の例は、抗体の技術分野において広く知られている。その種々の文法的形態における「抗体」という用語は、本明細書において、免疫グロブリン分子、および／または免疫グロブリン分子の免疫的に活性な部分、すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子の集団をいう集合名詞として用いられている。「抗体結合部位」は、抗原を特異的に結合する重鎖および軽鎖可変および超可変部から成る抗体分子の構造部分である。本明細書において用いる場合、種々の文法的形態における「抗体分子」という用語は、インタクトな免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を企図する。本発明の診断法および系における使用のための抗体分子の例は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、および、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）₂およびＦ（ｖ）として本技術分野で知られている部分を含むパラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分である。抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ'）₂部分は、よく知られた方法により、実質的にインタクトな抗体の、それぞれパパインおよびペプシンのタンパク分解反応によって生成される。例えば、TheofilopolousおよびDixonに付与された米国特許第４，３４２，５６６号を参照されたい。Ｆａｂ’抗体部分もよく知られており、これは、Ｆ（ａｂ'）₂部分から生成され、続いてメルカプトエタノールを用いるような、２つの重鎖を連結するジスルフィド結合の還元、続いて得られるタンパクメルカプタンのヨードアセトアミドのような試薬でのアルキル化により製造される。インタクトな抗体分子を含有する抗体が好ましいが、本明細書ではこれを例示として用いている。ポリペプチドに対する抗体の製造は、本技術分野でよく知られている。Staudt らによるJ．Exp．Med.，157:687-704（1983年）または米国特許第４，９００，８１１号に記載されているSutcliffe，J．G.の教示を参照されたい。それらの教示を引用により本明細書に援用する。簡単に記載すると、本発明のペプチド抗体組成物を産生するために、実験哺乳類に、典型的には本発明のワクチンに存在するような、抗原性ポリペプチドの免疫的有効量を接種する。次に、それにより誘導された抗ｓｐ５６抗体を、その哺乳類から回収し、例えば、固相において免疫処理用ポリペプチドを用いる免疫アフィニティークロマトグラフィによるようなよく知られた技術により、相当する組換えｓｐ５６タンパクのような、免疫処理用ポリペプチドと天然のｓｐ５６タンパクの両方について免疫特異性のものを、望ましい程度まで単離する。抗体の特異性を増大するために、好ましくは、固相付着された免疫処理用ポリペプチドを用いる免疫アフィニティークロマトグラフィにより抗体を精製する。抗体を、固相付着された免疫処理用ポリペプチドと、ポリペプチドが抗体分子と免疫反応して固相付着された免疫複合体を形成するのに十分な時間、接触させる。その結合された抗体を、標準技術によりその複合体から分離する。その種々の文法的形態における「接種物」という用語は、本明細書において、ｓｐ５６決定基含有ポリペプチドに対する抗体の生成に用いられる活性成分として本発明の抗原性ポリペプチドを含有する組成物を記載するのに用いられている。ポリペプチドが、抗体を誘発するための接種物中に用いられる場合、ポリペプチドは、種々の態様で、例えば、単独でもしくは接合体(コンジュゲート;conjug ate)としてキャリアーに連結させて、またはポリペプチドポリマーとして、用いられると理解すべきである。しかし、表現を容易にするために、ポリペプチドの接種物の状況において、本発明のポリペプチドの種々の態様は、本明細書では、「ポリペプチド」およびその種々の文法的形態により、集合的に表わされる。約35より少ないアミノ酸残基を含有するポリペプチドでは、抗体の産生を誘発させるためにはキャリアーに結合されたペプチドを用いることが好ましい。ポリペプチドをキャリアーに結合させるのを補助するために、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、１つ以上の付加的なアミノ酸残基を付加させることができる。ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に付加されるシステイン残基は、ジスルフィド結合を介してコンジュゲートを形成するために特に有用であることが見出された。しかし、コンジュゲートを製造するための本技術分野でよく知られた他の方法も用いることができる。本技術分野で現在知られている活性化官能基を介してカップリングまたはポリペプチドを接合する技術も、特に適用できる。例えば、Aurameasらによる、Scan d．J．Immunol.，８:補遺７：7-23(1978年)、および米国特許第４，４９３，７９５号、３，７９１，９３２号および３，８３９，１５３号を参照されたい。また、カップリングの後に、ポリペプチド配向による活性の損失が最小になるように、部位特異的カップリング反応を行い得る。例えば、RodwellらによるBiotech.，3 :889-894（1985年）および米国特許第４，６７１，９５８号を参照されたい。連結操作のその他の例には、ミカエル（Michael）付加反応生成物、グルタルアルデヒドのようなジアルデヒドの使用、KlipsteinらによるJ．Infect．Dis.， 147:318-326（1983年）等、またはキャリアーへのアミド結合を形成するための水溶性カルボジイミドの使用におけるようなカルボジイミド技術の使用が含まれる。あるいは、カルボキシ末端システインが導入されているペプチドを結合させるために、ヘテロ二官能性架橋リンカー、ＳＰＤＰ［Ｎ−スクシンイミジル−３ −（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（n-succinimidyl-3-(2-pyridyldit hio)proprionate））］が用いられる。本発明の抗体の生成および本発明のワクチン組成物の生成の両方における本発明における使用のために有用なキャリアーは、本技術分野でよく知られており、一般的にそれ自体、タンパクである。そのようなキャリアーの例は、キーホールカサガイヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin(ＫＬＨ)、エデスチン、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のようなアルブミン、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）のような赤血球、ジフテリア毒素、テタヌス毒素、コレラ毒素サブユニットＡ、Ｂまたは両者、およびポリＤ−リジン：Ｄ−グルタミン酸のようなポリアミノ酸等である。キャリアーの選択は、接種物の最終的な使用に、より多く依存し、本発明において特に含まれない基準に基づいている。例えば、接種される特定の動物において都合の悪い反応を生じないキャリアーを選ばなくてはならない。本接種物は、典型的にはキャリアーに連結されたコンジュゲートとして、有効な免疫原性の量の本発明のポリペプチドを含有する。免疫処理用ポリペプチドに対する免疫応答を誘発するために十分な、単位用量当りのポリペプチドの有効量は、特に、接種される動物の種、動物の体重、および選ばれた接種様式に依存し、本技術分野でよく知られている。典型的には、接種物は、接種（用量）当り約１０μｇ〜約５００ｍｇ、好ましくは用量当り約５０μｇ〜約５０ｍｇのポリペプチド濃度を含有する。接種物に関する「単位用量」という用語は、動物に対する単位用量として適する物理的に別個の単位をいい、各単位は、必要な希釈剤、すなわち、キャリアーまたはビヒクルに関連して望ましい免疫原性効果を生じるように計算された活性物質の予め決定された量を含有する。本発明の接種物の新規な単位用量のための特定化は、本明細書に詳細に開示したように、（a）活性物質の特有の性質および達成すべき特定の免疫効果、および(b)動物における免疫用途のためのそのような活性物質を配合する技術における固有の制限により指示され、それらに直接依存し、それらは、本発明の特徴である。接種物は、典型的には、乾燥した固体のポリペプチド−コンジュゲートから、そのポリペプチドコンジュゲートを、水、塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水のような生理的に許容できる（容認できる）希釈剤中に分散させ、水性組成物を生成することにより調製する。接種物にはまた、希釈剤の一部として、アジュバントを含めることができる。完全フロイトアジュバント(ＣＦＡ)、不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）およびアルミニウム（ミョウバン）のようなアジュバントが、本技術分野でよく知られており、そして、いくつかの供給源から市販されている。そのように生成された抗体は、特に、組織切片または体液試料のような試料に存在するｓｐ５６を検出するための本発明の診断法および系において用いることができる。好ましい抗ｓｐ５６抗体は、モノクローナル抗体である。その種々の文法的形態における「モノクローナル抗体」という語句は、特定のエピトープと免疫反応することができる単一の抗体結合部位のみを含有する抗体分子の集団をいう。このように、モノクローナル抗体は、典型的には、免疫反応するエピトープに対して単一の結合親和性を示す。したかって、モノクローナル抗体は、各々が異なるエピトープに対して免疫特異性である複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば、二特異性モノクローナル抗体を含有していてもよい。本発明の好ましいモノクローナル抗体は、本発明の抗ｓｐ５６抗体について記載された本発明の抗原性ポリペプチドと免疫反応する抗体分子を含有する。より好ましくは、モノクローナル抗体はまた、組換えにより生成されたまたは天然の単離されたｓｐ５６タンパクとも免疫反応する。モノクローナル抗体は、典型的には、１種のみの抗体分子を分泌（産生）するハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンにより産生される抗体から成る。そのハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞とミエローマまたは他の無際限に継続できる細胞株とを融合することにより生成される。そのような抗体の生成は、最初に、KohlerおよびMilsteinによるNature，256:495-497（1975年）に記載された。その記載を引用により本明細書に援用する。そのように生成されたハイブリドーマ上清液は、免疫処理用ポリペプチドまたは全体のｓｐ５６タンパクと免疫反応する抗体分子の存在についてスクリーニングすることができる。簡単に記載すると、モノクローナル抗体組成物を産生するハイブリドーマを生成するために、ミエローマまたは他の無際限に継続できる細胞株を、本発明の好ましいポリペプチド中に存在するようなｓｐ５６抗原決定基を含有する抗原性ポリペプチドで高度免疫処理された哺乳類の脾臓から得られるリンパ球と融合させる。ポリペプチドで誘発されたハイブリドーマ技術は、NimanらによるProc.Natl ．Acad．Sci．USA，80:4949-4953（1983年）に記載されており、その記載を引用により本明細書に援用する。ハイブリドーマを生成するのに用いられるミエローマ細胞系は、リンパ球と同じ種からのものが好ましい。典型的には、１２９ＧＬＸ⁺株のマウスは、好ましい哺乳類である。本発明における使用のために適するマウスのミエローマには、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（ＨＡＴ）細胞株、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州、ロックビル）から、それぞれＣＲＬ１５８０およびＣＲＬ１５８１という表示で入手できるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳｐ２／０−Ａｇ１４がある。脾臓細胞は、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を用いてミエローマ細胞と融合される。融合されたハイブリッドは、ＨＡＴに対する感受性により選択される。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、実施例に記載された、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて同定される。本発明のモノクローナル抗体はまた、適するポリペプチド特異性の抗体分子を産生し分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することによっても生成し得る。その培養物を、ハイブリドーマが培地中に抗体分子を分泌するのに十分な条件下で十分な時間維持する。次に、抗体含有培地を回収する。次に、抗体分子をよく知られた技術により、さらに単離し得る。それらの組成物を調製するために有用な媒体は、本枝術分野でよく知られており、そして市販されており、これらには、合成培地、近交系マウス等が含まれる。合成培地の例は、４．５ｇ／ｌのグルコース、２０ｍＭのグルタミンおよび２０％のウシ胎児血清を補なったダルベッコの最少必須培地［ＤＭＥＭ、ダルベッコらによるVirol，8:396(1959年)］である。近交系マウスの例は、Ｂａｌｂ／ｃである。モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞またはハイブリドーマ細胞培養物を生成する他の方法もよく知られている。例えば、SastryらによるProd.Natl.Acad .Sci.USA,86:5728-5732(1989年)およびHuseらによるScience,246:1275-1281（19 89年）に記載された免疫学的レパートリーからモノクローナル抗体を単離する方法を参照されたい。本発明のモノクローナル抗体は、本発明の抗体について本明細書に開示されされたのと同じように用いられることができる。例えば、モノクローナル抗体は、ｓｐ５６との免疫反応が望ましい場合に本明細書中に開示された治療的方法、診断的方法またはインビトロの方法において用いることができる。また、本発明は、ハイブリドーマ細胞、および本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含有する培養物も企図する。Ｈ．診断法本発明は、組織の塊、組織の切片を含む組織試料または生物学的な液体試料のような身体試料中の、ｓｐ５６、ｓｐ５６抗原決定基または抗sｐ５６抗体の存在および好ましくは量を決定する種々のアッセイ法を企図し、この方法では、本発明のポリペプチド、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を免疫化学的な試薬として使用して免疫反応生成物を生成させ、その量が直接的または間接的に試料中のｓｐ５６抗原決定基または抗体の量に関連する。当業者は、本発明の免疫化学的試薬を、体の試料中の抗原または抗体の量に関連する量の免疫反応生成物を形成させるために使用することができる、数多くの周知の臨床診断の化学的方法が存在することを理解するであろう。したがって、本明細書に例としてのアッセイ法が記載されているが、本発明はこれらに限定されない。競合的または非競合的のいずれかの、種々の不均一（ヘテロジニアス）および均一（ホモジニアス）プロトコルを、本発明のアッセイ法を実施するのに使用することができる。ｓｐ５６を有する精子は、卵の透明帯との相互作用に有効であり、受精能があることが推定される。ｓｐ５６を欠く精子は、相互作用に無効であり、受精能は推測されない。したがって、本発明の態様の一つは、抗ｓｐ５６抗体を試料中のｓｐ５６タンパクと免疫反応させるのに使用する、精子含有試料中のｓｐ５６タンパクの量をアッセイする方法を企図する。この態様では、抗体は、ｓｐ５６と免疫反応して、ｓｐ５６−抗体免疫反応複合体を形成し、この複合体は検出され、試料中のｓｐ５６の存在を示す。したがって、このアッセイ形式は、哺乳類の精子のｓｐ５６の存在を検出することにより、哺乳類の受精能力を決定する方法を定義する。試料中のｓｐ５６の存在および好ましくはその量をアッセイするための抗ｓｐ５６抗体分子を使用する免疫測定法は、典型的には以下の工程を含む。（ａ）試料を、本発明の抗ｓｐ５６抗体、好ましくはモノクローナル抗体と混合する（接触させる）ことにより、免疫反応混合物を形成する。試料は、典型的には、免疫反応混合物が液相および固相の両方を有するように固相中の試料の形であり、抗体は、試料中のｓｐ５６の存在を検出する試薬として機能する。試料は、精液または精巣上体組織などの精子含有試料であり、周知の免疫組織学的染色で準備されていることが好ましいが、組織抽出物または体液を含む他の試料を固相上に吸着させてもよい。このような場合、固相への吸着は、周知のウエスタン・ブロットまたはＥＬＩＳＡ法に記載されているように行うことができる。（ｂ）免疫反応混合物を、約１０分間から約１６〜２０時間のような予定された時間、約４℃〜約４５℃で、時間は試料中に存在するｓｐ５６が抗体と免疫反応（免疫学的に結合）してｓｐ５６含有免疫反応生成物（免疫複合体）を形成するのに十分となるようにし、生物学的なアッセイ条件下で維持する。生物学的アッセイ条件は、本発明の免疫化学試薬およびアッセイされるｓｐ５６の生物学的活性を維持するものである。これらの条件は、約４℃〜約４５℃の温度範囲、約５〜約９のｐＨ値範囲、および蒸留水のイオン強度〜約１ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム溶液に等しいイオン強度の範囲を変動するイオン強度を含む。このような条件を最適化する方法は、当業者に周知である。（ｃ）工程（ｂ）で形成されたｓｐ５６含有免疫反応生成物の存在、および好ましくは量を測定（検出）し、試料中に存在するｓｐ５６の量を決定する。直接または間接的に免疫生成物の存在または量を測定することは、当業者に周知のアッセイ技術により成し遂げられ、典型的には使用される指示手段の種類による。好ましくは工程（ｃ）の決定は、以下の工程を含む。 (i) ｓｐ５６含有免疫反応生成物を、第二の抗体と混合し、第二の（検出）免疫反応混合物を形成させ、前記第二の抗体分子は、免疫反応生成物中の第一の（一次）抗体と免疫反応する能力を有する。第二の抗体として有用な抗体は、一次抗体に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を含む。 (ii) 前記第二の免疫反応混合物を、第二の抗体が、免疫反応生成物と複合体を形成し、第二の免疫反応生成物を形成するのに十分な時間維持し、そして、 (iii) 第二の免疫反応生成物中に存在する第二の抗体の量、したがって、工程（ｃ）で形成された免疫反応生成物の量を決定する。一つの態様では、標識が形成された第二の免疫反応生成物の存在を検出するための指示手段を提供するように、第二の抗体は、標識された抗体（すなわち、検出抗体）である。標識は、第二の免疫反応生成物中に測定され、したがって、固相中の第二の抗体の存在および好ましくは量を示す。代わりに、第二の抗体の量は、周知のように、第二の抗体と特異的に反応（結合）する指示手段を有する追加の反応混合物の調製によって決定することができる。例えば、第二の抗体に特異的な、標識された抗免疫グロブリン抗体分子との第三の免疫反応混合物である。第三の免疫反応の後、形成された第三の免疫反応生成物は、標識の存在を介して検出される。ｓｐ５６抗原決定基の量および存在を検出する方法は、試料中のｓｐ５６の種類、したがって、精子の種類を決定するのにも有用であり、使用する抗体は、例えば、ｓｓｓドメインなどのような種特異的な、特異的な形態のｓｐ５６ドメインである。したがって、本発明は、抗ｓｓｓ抗体とともに上記のアッセイを使用して精子提供者または試料の種を同定する方法もまた企図する。別の診断法の態様は、循環血液または精液中にいずれかの抗ｓｐ５６抗体が存在するかどうかを測定することによる、哺乳類の避妊状態の決定を含む。抗ｓｐ５６抗体が存在すると、哺乳類は受精しないか、または受精能は損なわれる。したがって、別の態様は、ｓｐ５６抗原決定基を試料中の抗ｓｐ５６抗体と免疫反応させるのに使用する、体の試料中の抗ｓｐ５６抗体の量をアッセイする方法を企図する。この態様では、試料中の抗体がｓｐ５６と免疫反応して、ｓｐ５６抗体免疫反応複合体を形成し、この複合体は、試料中の抗ｓｐ５６抗体の存在を示して検出される。したがって、このアッセイ形式は、哺乳類の免疫避妊性抗ｓｐ５６抗体の存在を検出することにより、哺乳類の受精不能性を決定するための方法を定義する。この方法は、本発明の免疫避妊法が効果的であるかを同定し、および不妊を引き起こす自己免疫反応を経験している哺乳類を同定するのに有用である。試料中の抗ｓｐ５６抗体の存在および好ましくは量をアッセイするためのｓｐ５６抗原決定基を使用する免疫測定法は、典型的には以下の工程を含む。（ａ）試料を、本発明のｓｐ５６抗原決定基を含む抗原性ポリペプチドと混合（接触）して、免疫反応混合物を形成する。この試料は、典型的には、免疫反応混合物が液相および固相の両方を有するように、固相中に固定された試料の形であり、抗原性ポリペプチドは、試料中の抗ｓｐ５６抗体の存在を検出する試薬として機能する。好ましくは、試料は、血液、血清または血漿試料であり、例えば、精液または精巣上体組織であり、周知の免疫組織学的染色で準備されていることが好ましいが、組織抽出物または体液を含む他の試料も固相上に吸着され得る。このような場合、固相上への吸着は、周知のウエスタン・ブロット法について記載されているように行うことができる。（ｂ）免疫反応混合物を、約１０分間から約１６〜２０時間のような予定された時問、約４℃〜約４５℃で、時間は試料中に存在するｓｐ５６が抗体と免疫反応（免疫学的に結合）してｓｐ５６含有免疫反応生成物（免疫複合体）を形成するのに十分となるようにし、生物学的なアッセイ条件下で維持する。生物学的アッセイ条件は、本発明の免疫化学試薬およびアッセイされるｓｐ５６の生物学的活性を維持するものである。これらの条件は、約４℃〜約４５℃の温度範囲、約５〜約９のｐＨ値範囲、および蒸留水のイオン強度〜約１ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム溶液に等しいイオン強度の範囲を変動するイオン強度を含む。このような条件を最適化する方法は、当業者に周知である。（ｃ）工程（ｂ）で形成されたｓｐ５６含有免疫反応生成物の存在、および好ましくは量を測定（検出）し、試料中に存在する抗ｓｐ５６抗体の量を決定する。直接または間接的に免疫反応生成物の存在または量を測定することは、当業者に周知の、そして本明細書に記載するようなアッセイ技術により成し遂げられ、典型的には使用される指示手段の種類による。本明細書で使用している「複合体」という語は、抗体−抗原またはレセプター −リガンド反応のような特異的結合反応の生成物をいう。複合体の例は、免疫反応生成物である。本明細書において、種々の文法的な形の「標識」または「指示手段」という語は、複合体の存在を示す検出可能な信号の生成に直接または間接的に関与する一種類の原子または分子をいう。あらゆる標識または指示手段は、本発明の抗体またはモノクローナル抗体組成物の一部である、抗体分子、発現されたタンパク、またはポリペプチドと結合するか、または組み込まれるか、別々に使用されることができ、これらの原子または分子は、単独で、または追加の試薬とともに使用することができる。このような標識は、臨床診断の化学において周知であり、それ以外は新規なタンパク、方法、および／またはシステムを使用する範囲内では本発明の一部を構成する。標識手段は、抗体または抗原を変性することなく、これらに化学的に結合して有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識剤であることができる。適する蛍光標識剤は、フルオレセインイソシアネート(ＦＩＣ)、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルフォニルクロライド(ＤＡＮＳＣ)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(ＴＲＩＴＣ)、リッサミン、ローダミン８２００スルフォニルクロライド（ＲＢ２００ＳＣ）などの蛍光色素である。免疫蛍光分析技術の記載は、「免疫蛍光分析(Immunofluorescence Analysis)」、Antibody As a Tool、Marchalo nisら編集、John Wiley&Sons,Ltd、１８９〜２３１頁（１９８２）に記載されており、本明細書に援用する。好ましい態様では、指示基は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ) 、グルコースオキシダーゼなどのような酵素である。主要な指示基がＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼのような酵素である場合、追加の試薬により、レセプター−リガンド複合体（免疫反応体）が形成されているという事実を明視化することか要求される。ＨＲＰのためのこのような追加の試薬は、過酸化水素、およびジアミノベンジジンのような酸化染料前駆体を含む。グルコースオキシダーゼとともに有用な追加の試薬は２，２’−アミノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）(ＡＢＴＳ)である。放射性元素もまた、有用な標識剤であり、本明細書において例として使用する。放射性標識剤の例は、γ線を放出する放射性元素である。¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹²⁸ Ｉ、¹³²Ｉ、および⁵¹Ｃｒなどの、自らγ線を放出する元素は、γ線放出して放射性元素指示基を生成する一つのクラスを意味する。特に好ましいのは¹²⁵Ｉである。有用な標識手段の他の群は、自ら陽電子を放出する¹¹Ｃ、¹⁸Ｆ、¹⁵Ｏおよび¹³Ｎのような元素である。放出された陽電子は、動物の体内に存在する電子と遭遇すると、γ線を生じる。また、¹¹¹インジウムまたは³Ｈのようなβエミッターも有用である。標識の結合、すなわち、ポリペプチドおよびタンパクの標識は、当技術分野に周知である。例えば、ハイブリドーマにより産生された抗体分子は、培地中の成分として付与された放射性同位体含有アミノ酸を代謝的に組み込むことによって標識することができる。例えば、GalfreらのMeth.Enzymol.，７３：３〜４６頁（１９８１年）を参照されたい。活性化された官能基を介してのタンパクの共役 (コンジュゲート化)またはカップリング技術は特に好ましい。例えば、Aurameas ら、Scand.J.Immunol.Vol.8.Suppl.７：７〜２３頁(１９７８年)、Rodwellら、B iotech、３：８８９〜８９４頁（１９８４年）および、米国特許第４，４９３，７９５号を参照されたい。この診断法は、免疫反応生成物の検出のために、特異的結合剤を使用することもまた可能である。「特異的結合剤」は、本発明の試薬種に選択的に結合することのできる分子の実体、またはこのような種を含む複合体であるが、本発明のポリペプチドまた抗体分子組成物自体ではない。特異的結合剤の例は、第二の抗体分子、補体タンパク、またはそれらのフラグメント、エス・アウレウス(S.aureu s )プロテインＡなどである。その種が複合体の一部として存在する場合、特異的結合剤が試薬種に結合することが好ましい。好ましい態様では、特異的結合剤は標識されている。しかし、診断法で、標識されていない特異的結合剤を使用する場合、試薬は、典型的には増幅手段または試薬として使用される。これらの態様では、増幅手段が試薬種を含有する複合体と結合する場合に、標識された特異的結合剤は、増幅手段に特異的に結合する能力を有する。本発明の診断法は、試料中のｓｐ５６抗原決定基の量を検出するために「ＥＬＩＳＡ」形式で実施することができる。「ＥＬＩＳＡ」は、固相に結合する抗体または抗原、および酵素−抗原または酵素−抗体接合体を使用して、試料中に存在する抗原を検出および定量する、酵素結合免疫吸着法である。ＥＬＩＳＡ技術の説明は、D.P.Sitesら著、Basic and Clinical Immunologyの第４版の第２２章 (ロスアルトス(Los Altos)(カリフォルニア州)のLange Medical Publications発行)、および米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号、第４，０１６，０４３号に見受けられ、これらを本明細書に援用する。したがって、ある態様においては、目的の診断法で使用する固体支持体を形成するために、本発明のポリペプチド、抗体またはモノクローナル抗体を、固体のマトリックスに固定することができる。試薬は、典型的には水性媒体から吸着されて固体マトリックスに固定されるが、当業者に周知のタンパクおよびポリペプチドに適用できる他の様式の固定法を使用することもできる。吸着法の例は本明細書に記載されている。有用な固体マトリックスもまた当業者に周知である。このような物質は、水に不溶性であり、架橋されたデキストラン〔ピスカタウエイ（Piscataway）(ニュージャージー州)のファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chem icals)）からセファデックス（SEPHADEX）の商品名で入手可能〕、アガロース、直径約１ミクロン（μｍ）〜約５ミリメートル（ｍｍ）のポリスチレン・ビーズ〔ノース・シカゴ（North Chicago）(イリノイ州)のアボット・ラボラトリーズ（Abbott Laboratories）から入手可能〕、塩化ポリビニル、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド、シート、細長い片(ストリップ)、またはへら（パドル）のような、ニトロセルロースまたはナイロンをベースにする繊維、またはポリスチレンまたは塩化ポリビニルから作られたチューブ、フルートまたはマイクロ滴定プレートのウェルを含む。実施例以下の実施例は説明を意図するものであって、明細書および請求の範囲をこのように制限するものではない。１．精製されたｓｐ５６タンパク免疫原の調製マウスｓｐ５６タンパクを、雄のマウスから二つの異なる方法で精製した。生殖能力の衰えた雄のマウス〔ＨＳＤ：ＩＣＲ種、インディアナポリス（インディアナ州）のハーラン・スプラージ・ダウレイ・インク(Harlan Sprague Dawley I nc.)〕(８〜１８週令)を殺し、副睾丸尾部および輸精管を、５ｍＭＥＧＴＡを含む、予め暖められた（３７℃）Ｍ１１９Ｍ培地〔BleilおよびWassarman、J.Ce ll.Biol、１０２：１３６３〜１３６９頁(１９８６年)〕へ移した。組織をマイクロ鋏で切開し、精子を１０分間遊泳させて出した。精子を９倍量のＭ１１９Ｍに移し、３０分間３７℃で受精能を獲得させた。受精能を獲得した精子を、ソーバル（Sorvall）ＳＳ−３４ローテーター〔ウィリントン（デラウエア州）のデュポン・インストロメンツ(Du Pont Instruments)〕で７分間５，０００ｒｐｍでパーコール（Parcoll）グラジエントを介して２５℃で遠心分離することにより精製した。このグラジエントは、７０％のパーコール、２５ｍＭトリス −ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌの３９ｍｌをソーバルＳＳ−３４ローテーターで１時間１９,０００ｒｐｍで遠心分離することにより調製された。次に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌおよび１ｍＭＥＤＴＡを含有するパーコール・グラジエント、およびこれに続いて、３５，０００ｇ、７分間、２５℃で遠心分離したグラジエントから、アクロソームがそのままの精子、およびアクロソームが反応した受精能を獲得した精子を別々に回収した。懸濁液中の分離された精子の集まりをグラジエントから除去し、次に８倍量の培地で希釈し、続いて卓上遠心器で５，０００ｒｐｍでペレット化した。後に続く実験での処理のために、ペレットを緩衝液または培地で再懸濁した。この方法で精製された精子は、十分に運動能力があり、受精可能である。平行実験において、受精能を獲得した精子、および受精能を獲得し、パーコール精製された精子は、１０中８個のマウスの卵を受精させた。平均４×１０⁷の精製された精子を各雄から分離した。全ての実験のための水は、ナノピュア・システム(Nanopure system)〔デュブキュー（Dubuque）(アイオワ州)のバーンステッド(Barnstead)〕で精製された。ｓｐ５６の精製方法の一つは、本質的に前記されている〔BleilおよびWassarm an、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、８７：５５６３〜５５６７頁(１９９０年)〕ようなＺＰ３−アフィニティークロマトグラフィーによるものであった。２０匹の雄からの、パーコール精製され、アクロソームがそのままである精子を、２ｍｇ／ｍｌのシチメンチョウ卵白トリプシン阻害剤を含む、２ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＫＣｌ、および０．２％の水素添加されたトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ −１００）で抽出した。本明細書に記載した条件下で、ＵＶ透過性の、水素添加されたトリトンＸ−１００〔サンディエゴ（San Diego）(カリフォルニア州)のカルバイオケム・コーポ(Calbiochem Corp.)〕は、１００％のｓｐ５６を抽出したが、これらの精子タンパクの１２％しか等モルのトリトンＸ−１００により溶解されなかった。不溶性の物質を、１４，０００ｇで５分間遠心分離して除去した。試料を０．２２μＭフィルターを通して濾過し、前記〔BleilおよびWassarman、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、８７：５５６３〜５５６７頁(１９９０年)〕のように構成されているＺＰ３アフィニティーカラム〔ライニン（Rai nin）ＥＰカラム、１０μＭＺＰ３、ウォーバーン（Woburn）(マサチューセッツ州)のライニン・インストロメンツ(Instruments)〕にかけた。カラムを２０倍量の緩衝液Ａで洗浄し、結合したタンパクを０〜８Ｍの尿素および０.２％の水素添加されたトリトンＸ−１００のグラジエントで溶出させた。画分（０．１ｍｌ）を回収し、２−ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。多くの細胞外タンパク、ｓｐ５６は、典型的に、強い変性条件下でＺＰ３アフィニティー・カラムから溶出されるが、細胞内ジスルフィド結合を含む。このタンパクは、２−ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥにさらされると、非還元条件下で４０，０００Ｄ(４０ｋＤａ)、還元条件下で５６ｋＤａのコーディネートを有する二重線（ダブレット）として移動した。このようなゲルの濃度分析は、ｓｐ５６が、水素添加されたトリトンＸ−１００で抽出された精子タンパクの０．２％（〜２．３ｐｇまたは２５，０００ｍｏｌｓｐ５６／精子）のみを示していることを意味する。これに対し、パーコール精製され、アクロソーム反応した精子からトリトン生成されたタンパクの２− ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、ｓｐ５６は検出されなかった。この結果は、先行する観察、すなわち、ｓｐ５６はアクロソーム反応された精子には存在しないことを示したもの〔BleilおよびWassarman、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、８７：５５６３〜５５６７頁(１９９０年)〕と合致する。上記のように、タンパク配列を得るために、パーコール精製されたマウス精子に由来する、ＺＰ３アフィニティー精製されたｓｐ５６、生化学的に精製されたｓｐ５６(以下を参照されたい)、または総トリトン抽出されたタンパクを含むタンパク試料を、初めに２−ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルは１５分間移動緩衝液〔１０％メタノール、１μＭＤＴＴ、１００ｍＭＣＡＰＳ(Ｎａ−［３ −（シクロヘキシルアミノ）−プロパン］−スルホン酸)、ｐＨ１０〕で平衡させ、タンパクは、電気泳動装置中で、４℃で１時間、３００ｍＡの緩衝液で処理されたポリビニルジフルオライド・タンパク・シークエンシング・メンブラン〔バイオーラド・ラボラトリイズ(Bio-Rad Laboratories)〕中で泳動させた。メンブランを１μＭＤＴＴを含む水で全体を洗浄し、タンパクを１μＭＤＴＴを含むポンソー（Ponceau）染色により検出した。ｓｐ５６に相当する所（非還元条件下で４０ｋＤａ、還元条件下で５６ｋＤａ）に位置した染色されたタンパクは、メンブランから薄く切り取られ、全体を５０％のメタノールおよび１μＭＤＴＴを含む５０％の水で洗浄し、トリプシンで分解して抽出するか、または直接固相アミノ酸シークエンシングにかけた。逆相ＨＰＬＣにより分離されたｓｐ５６のトリプシン性フラグメントを分離し、固相アミノ酸シークエンシングにかけた。トリプシンでの分解、逆相ＨＰＬＣ、およびアミノ酸シークエンシングは、 The Scripps Research Institute Protein Sequencing Core Facilityにより実施した。アミノ酸シークエンスに供されたタンパク（〜３０ｐｍｏｌ）は一つのＮＨ₂ −末端配列を有することが分かり、その最初の１２のアミノ酸は、ＤＣＧＰＰＰＬＬＰＦＡＳ（配列番号２の位置１〜１２）である。精子からｓｐ５６を精製する代わりの方法は、生化学的精製に基づいた。４０〜５０の雄の、パーコール精製され、アクロソームはそのままの精子を２ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．５％の水素添加されたトリトンＸ− １００で抽出し、抽出物を１ｍＭのＰＭＳＦで処理してプロテアーゼを不活性化させた。抽出物を１４，０００ｇで５分間遠心し、不溶性物質を除去した。上清を濾過し(０．２２μＭフィルター)、７５×７．５ｍｍＤＥＡＥ−５ＰＷカラム〔リッチモンド（Richmond）(カリフォルニア州)のバイオーラド・ラボラトリイズ〕にかけた。タンパクをカラム緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１％の水素添加されたトリトンＸ−１００）中、０−０．５ＭＮａＣｌグラジエントで、２０分に渡り０．５ｍｌ／分の速度で溶出させた。溶出物を２８０ｎｍで分析した。０．５ｍｌの画分を回収し、２−ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ｓｐ５６の位置〔４０ｋＤａ(非還元)、５６ｋＤａ（還元）に相当〕を同定するためにケルを銀染色した。ｓｐ５６を含む画分をプールし、フィルター〔セントリコン（Centricon）３０、ベットフォード（Bedford）(マサチューセッツ州)のミリポア・コーポ(Millipore Corp.)〕で濃縮し、２００μｌを３００×７．８ｍｍバイオーシル（ＢＩＯ−ＳＩＬ）ＳＥＣ２５０カラム（バイオーラド・ラボラトリイズ）にかけた。カラムを平衡させ、０．２ｍｌ／分で５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．１ＭＮａＣｌ、０．１％の水素添加されたトリトンＸ−１００を流した。溶出物を２８０ｎｍで分析した。０．２ｍｌの画分を回収し、ｓｐ５６の位置を同定するために２−ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ｓｐ５６を含む画分をプールし、濃縮し、さらなる研究のために使用した。サイズ除去カラムでの分子の大きさの測定は、＞３００、１５０、４４、１７、および＜１０ｋＤの標準タンパクに基づいた。変性されたタンパクを分離する場合(カラム緩衝液中の０．１％トリトンを０．１％ＳＤＳに置き換える)、２００、６０および３０ｋＤの標準を使用した。生化学的に精製されたｓｐ５６は、サイズ除去カラムから溶出され、１１０ｋＤａ（範囲＝９０〜１３０ｋＤａ、サイズ標準を基にする）の分子量と見積もられた。総トリトン抽出された精子タンパクは、非変性条件下（０．１％トリトン）でサイズ除去クロマトグラフィーにかける場合、ｓｐ５６タンパクを含む画分 (２−ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルによって決定)を１１０ｋＤａで溶出した。精子タンパクが、変性条件（０．１％ＳＤＳ）にさらされる場合、ｓｐ５６を含む画分（２−ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルによって決定）を４６ｋＤａで溶出した。さらに、この二つのラインは、アフィニティー精製されたｓｐ５６および生化学的に精製されたタンパクが同等であることを示す。第一に、生化学的に精製されたタンパクのＮＨ₂末端アミノ酸配列は、上記のようにアフィニティー精製されたｓｐ５６と同一であった。第二に、生化学的に精製されたタンパクに対するモノクローナル抗体は、生化学的に精製されたタンパクおよびアフィニティー精製されたｓｐ５６の両方を認識した。これらに加えて、生化学的に精製されたｓｐ５６は、２−ＤＳＤＳゲル上でアフィニティー精製されたｓｐ５６とともに移動した。２．マウスｓｐ５６ｃＤＮＡの分離上記の実施例１で調製された、生化学的に精製されたｓｐ５６をエンド・アルグ（Endo Arg）Ｃ、トリプシン、およびキモトリプシンでタンパク質分解的に分解し、固相自動エドマン分解（Edman-degradation）ペプチドシークエンスによりアミノ酸シークエンスのための最初のフラグメントを生成させた。最初の物質および放出されたアミノ酸の定量により、ｓｐ５６配列のみが得られたことを確認した。ｓｐ５６ペプチドフラグメントから、変性されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーを、ｓｐ５６ｃＤＮＡフラグメントの増幅に使用するために、 Bookbinderら、Science、２６９：８６〜８８頁（１９９５）に記載されているように設計した。簡潔には、プライマーは、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory ManuaL Cold Spring Harbor Laboratory、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）(ニューヨーク州)(１９８９年)、およびＬｅｅら、BioTechniques、１４：１９１頁（１９９３年）に記載された方法にしたがって設計された。オリゴ（ｄＴ）−プライマー化された常磁性粒子を、プライマ −Ｎ４（５’ＣＣＮＴＴＹＧＣＮＷＳＮＣＣＮＡＣＮＡＡＹＣＡ３’）(配列番号３)、およびＦ５Ｗ（５’ＴＡＲＡＡＮＡＣＲＴＡＲＴＣＮＣＣＲＴＡＮＧＣ３’）(配列番号４)とともに使用して、マウス精巣ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから製造された、１本鎖ｃＤＮＡ鋳型に入れ子（ネステッド、nested）ＰＣＲを実施し、続いて最初の増幅生成物の１／１００を、プライマーＮ５（５’ＧＣＮＷＳＮＣＣＮＡＣＮＡＡＹＣＡＲＹＴＮＴＡ３’）(配列番号５)およびＦ５Ｗと他の回転のＰＣＲを行った。変性した位置は、ＩＵＰＡＣの協定で示唆され、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴ、ＹはＣまたはＴ、ＷはＡまたはＴ、ＲはＡまたはＧである。Ｎ４およびＮ５プライマーは、キモトリプシン・ペプチド１の重複する部分を含み、プライマーＦ５Ｗはキモトリプシン・ペプチド２に相当する。得られた増幅された１キロベース（ｋｂ）の、ｓｐ５６ＮＨ₂末端(ＰＣＲプライマーＮ５によりコードされたアミノ酸１１〜１８)、エンド・アルグＣペプチド１(アミノ酸２７１〜２９４)、エンド・アルグＣペプチド２(アミノ酸２９１〜３０３)、トリプシン・ペプチド１(アミノ酸１９９〜２０５)、キモトリプシン・ペプチド(アミノ酸１２〜１８)、キモトリプシン・ペプチド（ＰＣＲプライマーＦ５Ｗによりコードされたアミノ酸３４２〜３４９）の部分をコードする配列を含んだ。ここに記載されたプライマーおよびペプチド配列の位置については、配列番号１に示されたｓｐ５６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を参照されたい。ｓｐ５６ｃＤＮＡクローンの全長は、オリゴ（ｄＴ）−プライマーマウス精巣 λ−ＺａｐｃＤＮＡライブラリ（Dr．Bleilの研究室で製造された）を、上記のように得られた、³²Ｐ標識された、ランダム−プライマー化された１ｋｂのＰＣＲ生成物、または、配列５’ＡＣＣＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴ３’(配列番号６)、および５’ＧＡＡＧＧＡＡＡＣＣＡＣＴＣＧＣＣＡ３’（配列番号７）を有する１ｋｂのＰＣＲ生成物に特異的な３２Ｐ標識されたプライマーでスクリーニングすることによって得られる。単離されたｓｐ５６ｃＤＮＡクローンは、ｓｐ５６ＮＨ₂末端アミノ酸１〜１０をコードする塩基の上流に沿って完全な１ｋｂＰＣＲ生成物を含み、クローンがｓｐ５６をコードしていることを確認した。マウスｓｐ５６ｃＤＮＡクローンの鎖の冒頭の塩基配列は、受託番号Ｕ１７１０８としてジェンバンク（Genbank）に記載されている。ｓｐ５６ｃＤＮＡは、最初の枠内（in-frame）のメチオニンから、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏの３つの塩基で開始される実験的に決定されたｓｐ５６のＮＨ₂末端の間に配置された、仮定された３２のアミノ酸シグナルペプチドにより開始される５４７アミノ酸のオープンリーディングフレームをコードする。「プレ−プロ５ｓｐ５６」タンパクといわれる、仮定のシグナルペプチドを含むマウスｓｐ５６ｃＤＮＡのコードされたアミノ酸残基配列は、ｃＤＮＡが配列番号１に、それ自身が配列番号２に示されている。「プロｓｐ５６」といわれる、シグナルペプチドを欠くハロプロテインは、マウスｓｐ５６タンパクが存在しない、約６，０００ダルトンのＣ末端ペプチドを含む。非変性洗浄液中での精巣上体の精子の分離および処理の間、および／またはＺＰ３に結合したときの天然の移動可能な精子では、分裂が起こることか明らかとなった。これらの観察は、本発明の目的のために重要であり、基本的な範囲内で、プロｓｐ５６のＣ末端テール、およびこの配列をコードする核酸を、それぞれ、免疫避妊の使用のため、および相同性研究のための核酸プローブの開発のために使用することができる。ｓｐ５６ｃＤＮＡは、実験的に決定されたＮ−末端から、ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの末端まで、６２，０００ダルトンのペプチドをコードするが、成熟したｓｐ５６は５６ｋＤａタンパクである。コードされたマウスのｓｐ５６タンパクは、明らかに膜間スパニングドメインを欠き、これは、このタンパクが膜の辺縁のタンパクであることを確信させる。マウスｓｐ５６（ｓｐ５６という）は、タンパクレセプターのスーパーファミリーの一つであると決定され、各繰り返しが１０の事実上変動しないアミノ酸を含む、一連の６０のアミノ酸鎖長相同的な繰り返しの存在を基に「スシ（Ｓｕｓｈｉ）スーパーファミリー」と呼ばれる。ｓｐ５６はこのような７つのドメインを有し、その位置は、スシ・ドメインの開始および末端をシステイン（Ｃ）アミノ酸とともに下線をつけられた配列で示されている、図１に示されている。ｓｐ５６のｃＤＮＡおよびコードされたアミノ酸配列の図は、図２に記載されている。スーパーファミリーの構成要素と一貫して、ｓｐ５６もまた、４４のアミノ酸の鎖をＣ末端の付近に含み、その部分はタンパクに特徴的であり、ｓｐ５６特異的ドメインとしていわれる。図１に示すように、４４のアミノ酸の鎖（配列番号２として示されているマウスｓｐ５６のアミノ酸３８０〜４２３）は、スシ・ドメイン６および７の間に介入する。この「ｓｐ５６種特異的ドメイン」は、既知のいずれのタンパクとも検出可能な相同性を有さず、システイン残基を含まず、ジスルフィド結合によって決定される二次元構造の可能性を消失させる。ｓｐ５６−特異的ドメインは、高度に荷電したアミノ酸からなり、これは、タンパクの外部に存在し、Ｂ細胞エピトープなどのようである。コンピューター・シュミレーションは、ヘリックスまたはβ−シートの二次元構造を示さなかった。したがって、その独自の配列、ｓｐ５６表面上の可能性のある配置、および二次元構造の欠如から、ｓｐ５６のこのドメインは、マウス精子、およびより広く、げっ歯類の精子のｓｐ５６に対して特異的な免疫反応を誘導することを設計されたハプテンとして非常に優れた候補である。本発明のｓｐ５６に由来する組成物の治療への使用は、ｓｐ５６の限られた組織分布性によっても支持される。マウスでのｓｐ５６の発現は、精子生成細胞に限られて測定され、マウスの心臓、肝臓、腎臓、脳、卵巣、および筋肉には、タンパクおよびｍＲＮＡのいずれも観察されなかった。ｓｐ５６タンパクおよびｍＲＮＡは、丸い精子細胞において促進されることが決定されているが、ｍＲＮＡが後続の丸い精子細胞段階で明らかに減成している。しかし、タンパクは、細長い精子細胞および精子の頭部を覆う原形質膜へ移動される。これに加えて、マウスｓｐ５６は、マウス卵ＺＰ３タンパクに結合する精子上に発見され、同様にハムスターに存在するが、モルモットおよびヒトのような、マウス卵を認識しない精子には存在しない。したがって、精子の表面にｓｐ５６が存在するかしないかは、精子−卵認識の種特異性により、したがって、本発明の免疫避妊治療の基礎を提供する。３．組換えマウスｓｐ５６タンパクおよびポリペプチド免疫原の調製本発明の組換え免疫避妊剤を調製するために、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の系統を、その表面にｓｐ５６ポリペプチドのフラグメントを存在させるために製造した。マウスは、改変されたウイルスを含む植物を消費する密接な関係のある他の種と同様に、組換えｓｐ５６免疫原に対する粘膜および系統的な免疫反応を開発する。雄のマウスは、約８０ｎｇのｓｐ５６しか含まず、実施例１に記載されたような従来の生成では経済的に実施不可能であるので、組換えｓｐ５６およびそのフラグメントの調製は、本発明において好ましい。しかし、ｓｐ５６をコードするｃＤＮＡは、実施例２に記載されたように分離できるので、本発明は、組換えＳｐ５６含有ポリペプチド免疫原を製造するために、ｓｐ５６の発現または選択されたその一部を記述する。マウスｓｐ５６タンパクをコードするｃＤＮＡの特定の領域が、組換え分子を調製するために選択される。好ましい組換えタンパクは、５７９アミノ酸のプレ −プロｓｐ５６および５４７アミノ酸のプロｓｐ５６を含む。他の好ましいｓｐ５６ＤＮＡ領域は、７つのスシ・ドメインの外部ループ領域をコードするヌクレオチドを含む。これらのドメインは、１０個の事実上不変のアミノ酸を含む約６０のアミノ酸の鎖である。図３は、典型的なスシ・ドメインを示すと共に、１０の事実上不変のアミノ酸を示している。ジスルフィド結合が不変パターンＣ１〜Ｃ３、およびＣ２〜Ｃ４中に形成され、その中に疎水性アミノ酸の鎖が位置する大小両方の内部連結された輪の付いたループ構造を形成する。約２５〜３０の、ほとんどが荷電されたアミノ酸の鎖からなる、「大ルー」は、Ｃ１およびＣ２の間でスーパーファミリー内ではっきりと分かれ、その荷電の性質のために、スーパーファミリーの構成要素のタンパクレセプターの機能に一般に関与している(I chinoseら、J.Bio.Chem、２６５：１３４１１〜１３４１６頁(１９９０年))。ｓｐ５６は、７つのこのようなドメインを有し、その各々は、それぞれ「ｌｌ」および「ｓｌ」といわれる大小のループを形成する。７つのスシ・ドメインのこれらの領域に由来するポリペプチドは、「Ｓｈ」といわれ、さらに個々のドメイン１〜７（例えばＳｈ１〜Ｓｈ７）によって示される。これに加えて、スシ・ドメイン６は、大きなループ内に追加のシステイン残基を有することによって特徴付けられる。このように、大きなループはさらにシステイン残基によって第一のループ（Ｓｈ６ｆ１）および中間のループ（Ｓｈ６ｍ１）に分離され、それぞれの配列は表１に示されている。他の追加の好ましいｓｐ５６ｃＤＮＡ領域は、独自のｓｐ５６種特異性配列( ｓｓｓという)を含み、実施例１に記載したようにスシ・ドメイン６および７の間に位置する。この保存されていない独自の領域のヌクレオチドの位置は、配列番号１に示したように位置１３１３で始まり、位置１４４４で終わる。相当するアミノ酸残基は、図１に示されているように、配列番号１の３８０〜４２３に位置される。このｓｐ５６の種特異的領域内で、好ましいポリペプチドの数々は、本発明の免疫避妊剤として使用することを企図されている。これらのポリペプチドは、「ｓｓｓ」といわれ、さらにポリペプチドの数（例えば、ｓｓｓ１）によって示される。ｓｐ５６タンパクの全てまたは種々の部分をコードする選択されたヌクレオチドの位置に相当するｃＤＮＡ領域は、表１に示され、相当するアミノ酸残基配列位置（ＡＡ）もまた示される。ｃＤＮＡフラグメントのヌクレオチドの位置および相当するアミノ酸残基の位置は、それぞれ配列番号１および２に由来し、ここにおいて、配列番号２のアミノ酸残基配列もまた配列番号１のヌクレオチド配列とともに示されている。配列番号１に示されているコードされた核酸配列との混乱を防ぐために、アミノ酸は、配列番号１よりもむしろ配列番号２から定義される。位置は、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）のコロンの後に示される。例えば、ｃＤＮＡｓｓｓ１は、配列番号１の１３１３〜１４４４のヌクレオチド配列を持ち、配列番号１：(ＳＥＱＩＤＮＯ１：)１３１３−１４４４と示される。したがって、コードされたポリペプチドは、配列番号２：３８０−４２３のアミノ酸残基配列を有する。本発明の免疫避妊剤の設計されたｃＤＮＡのポリペプチド対は、ｃＤＮＡ設計に「ｐｐ」を加えて明細書に示す。表１設計ｃＤＮＡの位置ＡＡの位置プレ−プロｓｐ５６１：８０−１８１６２：−３２から５４７プロｓｐ５６１：１７６−１８１６２：１−５４７成熟型ｓｐ５６１：１７６−１６０６２：１−４７７Ｓｈ１１：１７６−３５２２：１−５９Ｓｈ１ｌｌ１：１８２−２７１２：３−３２Ｓｈ１ｓｌ１：２７５−３１３２：３４−４６Ｓｈ２１：３６５−５３８２：６４−１２１Ｓｈ２ｌｌ１：３６８−４４５２：６５−９０Ｓｈ２ｓｌ１：４４９−４８７２：９２−１９４Ｓｈ３１：５５１−７３３２：１２６−１８６Ｓｈ３ｌｌ１：５５４−６３７２：１２７−１５４Ｓｈ３ｓｌ１：６４１−６７９２：１５６−１６８Ｓｈ４１：７４６−９１３２：１９１−２４６Ｓｈ４ｌｌ１：７４９−８２９２：１９２−２１８Ｓｈ４ｓｌ１：８３３−８７１２：２２０−２３２Ｓｈ５１：９２６−１１１４２：２５１−３１３Ｓｈ５ｌｌ１：９２９−１０２７２：２５２−２８４Ｓｈ５ｓｌ１：１０３１−１０７５２：２８６−３００Ｓｈ６１：１１２４−１３１２２：３１７−３７９Ｓｈ６ｌｌ１：１１３０−１２２５２：３１９−３５０Ｓｈ６ｓｌ１：１２２９−１２７０２：３５２−３６５Ｓｈ６ｆｌｌ１：１１３０−１１８９２：３１９−３３８Ｓｈ６ｍｌ２１：１１９３−１１２５２：３４０−３５０Ｓｈ７１：１４４５−１６０６２：４２４−４７７Ｓｈ７ｌｌ１：１４４８−１５２５２：４２５−４５０Ｓｈ７ｓｌ１：１５２９−１５６７２：４５２−４６４ｓｓｓ１１：１３１３−１４４４２：３８０−４２３ｓｓｓ２１：１３２２−１３６９２：３８３−３９８ｓｓｓ３１：１３６１−１４０８２：３９６−４１１ｓｓｓ４１：１３９１−１４３８２：４０６−４２１Ｓｈ６ｆｌ１およびＳｈ６ｍｌ２は、スシ・ドメイン６の大きなループに由来するシステイン結合によって分離される、それそれ、第一および中間のループである。表１にその概要が記載されたこれらの領域の選択は、避妊のブロッキングに基づくが抗体力価には基づかない効果的な免疫避妊剤である、組換えｓｐ５６ポリペプチド免疫原の同定を容易にする。Ｂ細胞エピトープを含むことができるポリペプチドにとって、選択は好ましく、それは、更に、免疫化の中断の後に、避妊の効果の潜在的な反転を可能にする。従って、ある態様においては、可逆性は、本発明の免疫避妊剤分子の望ましい特徴である。哺乳類において避妊を引き起こすための免疫原としての、表１に挙げられた完全プロｓｐ５６タンパクを調製するために、プレ−プロｓｐ５６タンパクをコードするｃＤＮＡ配列が、組織培養での哺乳類細胞中における発現のための発現ベクターに挿入された。簡単に述べると、ブッタバインダー（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ）等によってサイエンス、２６９巻、８６−８９頁（１９９５年）に記載されているようなクローン７．１ｓｐ５６ｃＤＮＡからの２０４３塩基対ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメント（当該フラダメントは、表１に挙げられたプレ−プロｓｐ５６ｃＤＮＡをコードする配列を含んでいる）が、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３［インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ］に挿入され、ｓｐ５６ｃＤＮＡクローンの直接的な挿入を可能にするために、同じ制限酵素で線状化され、それにより、ｐｃＤＮＡ３−ｓｐ５６発現ベクターが形成された。発現ベクター構築物は、次の状況を提供した：１）ヒトのサイトメガロウイルスの直近の初期遺伝子から上流のプロモーター配列による、哺乳類細胞中におけるｓｐ５６ｃＤＮＡの高レベルでの本質的な転写；２）更なるポリアデニル化シグナルおよび、ＲＮＡの安定性を高めるウシ成長ホルモン遺伝子からの転写終止配列；３）ｓｐ５６シグナル・ペプチドの初めにコードされたＡＴＧ( 即ち、配列番号１に示されているシグナル配列の８１〜８３に対応する塩基)からの翻訳の開始；および４）Ｇ４１８耐性安定細胞株の選択のためのネオマイシン耐性遺伝子。コンピテントｒｅｃＡ（−）Ｅ．ｃｏｌｉ［ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラ・ホヤ］が、ｐｃＤＮＡ３− ｓｐ５６で形質転換され、増幅されたプラスミドは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（カリフォルニア州チャットワース）プラスミド精製キットを用いて細菌から精製された。精製されたプラスミドＤＮＡは、多陽イオン性脂質トランスフェクションにより、ＣＨＯおよびＣＯＳ細胞に導入された［フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８４巻、７４１３−７４１７頁（１９８７年）］。Ｍａｂ７Ｃ５を用い、銀増幅免疫金染色［チェング（Ｃｈｅｎｇ）等、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１２５巻、８６７−８７８頁（１９９４年）］が、ｓｐ５６挿入物（インサート）で形質転換された、Ｇ４１８耐性のクローニングされたＣＯＳ細胞中において、細胞内ｓｐ５６を検出した。挿入物を含まないプラスミドｐｃＤＮＡ３で形質転換されたプラスミド対照細胞は、ｓｐ５６の発現を示さなかった。予期されたように、発現されたｓｐ５６（シグナル・ペプチドを欠いている）が、これらの細胞から分泌され、かつ、組織培養培地のウェスターン・ブロットにより検出された。発現され分泌されたタンパクは、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで６２ｋＤａの分子量の位置に移動した。これは、これらの細胞では、Ｃ末端テールの翻訳後の除去［ブックバインダー（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻、８６−８９頁（１９９５年）］が生じなかったことを示している。経口での免疫化のための完全プロｓｐ５６ポリペプチドを発現させるための他の方法は、昆虫細胞中における組換えバキュロウイルスからの発現を包含する( 但しこれに限定されない)。表１に挙げられた残りのｓｐ５６から誘導されたポリペプチド同様、シグナル・ペプチド配列を保持する組換えプレ−プロｓｐ５６とシグナル・ペプチド配列とＣ末端テールの両者を欠く成熟ｓｐ５６の調製は、それぞれのｃＤＮＡ配列の適切な発現ベクターへのクローニングにより、同様に成し遂げられる。発現ベクターおよびその挿入のための手順の選択は、当業者には周知である。一旦分泌されると、組換えタンパク（培地中に放出されているプロｓｐ５６または成熟ｓｐ５６）は、抗ｓｐ５６モノクローナル抗体７Ｃ５、５Ｆ１２、１２Ｄ２、７Ｈ１２または４Ｂ２で免疫的に精製される［チェング（Ｃｈｅｎｇ）等、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１２５巻、８６７−８７８頁（１９９４年）］か、あるいは、最近単離された抗プロＳＰ５６モノクローナル抗体１０ｂ６によって、免疫的に精製される。精製されたタンパクは、その後、経口的に免疫化される哺乳類の飼料に混合される。下記するように、別々の試みにおいて、表１に挙げられた組換えｓｐ５６ポリペプチド免疫原（ハプテンとも呼ばれる）が、タバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）コート・タンパクであって、そのＴＭＶのＣ末端テール上に設計された選択されたｓｐ５６特異的ドメインを有するタンパクで構成されるキメラ・ペプチド分子の一部として調製される。ＴＭＶの複製に基づいて、集められたウイルス粒子は、その後、植物材料中で消費されるときに免疫原として作用するこの選択されたｓｐ５６組換えフラグメントの多くの複製物を提供する。同定の目的のために、ｓｐ５６ポリペプチドに固着（アンカー）された組換えＴＭＶは、ＴＭＶの後の特定のポリペプチドの名称によって、例えば、ＴＭＶ− ｓｓｓ１ｐｐ（ここで、ｓｓｓ１は、ｃＤＮＡ配列の名称を示し、ｐｐは、コードされたポリペプチドを示す）と呼称される。図４は、組換えＴＭＶ−ｓｐ５６ポリペプチド融合体を調製するために使用された方法の概要を示す。ＴＭＶのＤＮＡ配列を両側面に配置することを含むＴＭＶ種Ｕ１（普通）から、ＴＭＶコート・タンパク（ｃｐ）の遺伝子が、制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩを用いてブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プラスミド・ベクター［ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）］にクローニングされた。ＴＭＶｃｐの配列を含むＴＭＶ遺伝子が、ホルト（Ｈｏｌｔ）等、Ｖｉｒｏｌ．、１８１巻、１０９頁（１９９１年）（この開示事項は、参照によりここに組み入れられる）に記載されているようにして、プラスミドｐＵ３／１２−４から誘導された。第４図に示されているように、プラスミド中において、これらの制限部位の両側には、バクテリオファージＴ７およびＴ３・ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列が配置されている。選択されたｓｐ５６ｃＤＮＡ−ＴＭＶキメラの構築は、ここに記載されている。当業者は、一つの特定のＴＭＶ−ｓｐ５６キメラを製造するために記載された教示が、表１に挙げられたｓｐ５６ｃＤＮＡ分子すべてに適用可能であり且つ容易に適合させられることを、理解するであろう。従って、ｓｓｓ１ｃＤＮＡ配列に基づくＴＭＶ−ｓｐ５６が固定されたポリペプチドを調製するために、ｓｓｓ１ｃＤＮＡ（配列番号１：１３１３−１４４４）が、ＴＭＶコート・タンパク遺伝子に挿入され、キメラ遺伝子を生じ、それがその後、完全ＴＭＶ遺伝子を含む別個のベクターに挿入される。これを成し遂げるために、初めに、ｓｓｓ−１（ｓｓｓ１−ａおよびｓｓｓ１ −ｂ）をコードする塩基と共に、ＴＭＶコート・タンパク遺伝子の３’末端での塩基のストレッチが合成され（ｃｐ−ａおよびｃｐ−ｂ）、二つのキメラＰＣＲプライマー（ｓｓｓ１−ａ／ｃｐ−ａおよびｓｓｓ１−ｂ／ｃｐ−ｂ）が生ずる。その手順は、類似のＺＰ３発現分子の調製のために記載されている手順［フィッチェン（Ｆｉｔｃｈｅｎ）等、Ｖａｃｃｉｎｅ、１３巻、１０５１−１０５７頁（１９９５年）、この開示事項は、参照によりここに組み入れられる］と同じである。ｓｓｓ１−ａヌクレオチド配列は、配列番号１の１３２２−１３６９の位置のトップ鎖ヌクレオチド配列に相当する。ｓｓｓ１−ｂヌクレオチド配列は、ｓｓｓ１−ａの配列の相補的配列である。５’から３’の方向に書いた場合に、ｓｓｓ１−ａ／ｃｐ−ａプライマーおよびｓｓｓ１−ｂ／ｃｐ−ｂプライマーのヌクレオチド配列は、それぞれ、５’ＡＣＣＡＡＴＧＴＧＡＣＧＡＡＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＧＡＧＧ３’（配列番号８）および５’ＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＧＴＣＡＣＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＧＧＣＴＡＡＴＣＴＡＴＴＴＴＧＴＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡＣ３’（配列番号９）である。各プライマーの下線部分は、ＴＭＶ配列を示し、一方、下線がない部分は、相補的ｓｓｓ１ヌクレオチド配列を示す。プライマーｓｓｓ１−ｂ／ｃｐ−ｂと、ヌクレオチド配列５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ３’（配列番号１０）を有するＴ７プロモーター配列（Ｔ７プライマー）に特異的にアニールするプライマーは、ＴＭＶコート・タンパク配列を含むプラスミドと共に使用され、ｓｓｓ１ｃＤＮＡに連続するｃｐ領域の「左腕」を増幅させる。プライマーｓｓｓ１−ａ／ｃｐ−ａと、ヌクレオチド配列５’ＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ３’（配列番号１１）を有するＴ３プロモーター配列（Ｔ３プライマー）に特異的にアニールするプライマーは、ＴＭＶコート・タンパク・プラスミドと共に使用され、ｓｓｓに連続するｃｐ領域の「右腕」を増幅させる。領域ｃｐ−ａおよびｃｐ−ｂは、ＴＭＶＣＰ領域に連続する部分をコードするが、反対側の鎖ではない。上記領域を増幅するために、フィッチェン（Ｆｉｔｃｈｅｎ）等、Ｖａｃｃｉｎｅ、１３巻、１０５１−１０５７頁（１９９５年）に記載されたようにして、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）が行われる。ＰＣＲのために使用されたサイクル・パラメータは、第一ラウンドでは、９５℃に３０秒間／４７℃に６０秒間／７２℃に６０秒間を２５回であり、その後の第二ラウンドは、７２℃にて６００秒間のインキュベーションであった。それぞれＴＭＶの左腕または右腕と共にｓｓｓ１の相補鎖を含む、結果として得られるＰＣＲ産物は、混合され、変性され、その後再びアニールされ、第５図にその概要を示すように、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長された、再アニールされた生成物をもたらす。この反応の生成物は、ＴＭＶコート・タンパクをコードする上流配列、それに続く、アミノ酸残基３８０−４２３（配列番号２）のｓｐ５６−特異的ドメインをコードするｓｓｓ１ｃＤＮＡ配列、それに続く終始コドンをコードする下流配列、およびＴＭＶコート・タンパク遺伝子の下流の配列の残部から構成されている（図５を参照されたい）。ＴＭＶ−ｓｓｓ１ｐｐと名付けられた、結果として得られるｓｓｓ１ｃＤＮＡ産物を含む遺伝子をコードするＴＭＶコート・タンパクは、その後、上記の如く、プライマーＴ７およびＴ３を用い、ＰＣＲによって再び増幅される。増幅された物質は、その後、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで制限的に消化される。制限的に消化されたＰＣＲフラグメントは、その後、ｐＵ３／１２−４の誘導体中において、ＴＭＶｃＤＮＡフラグメントの対応する制限部位にクローニングされ、ＴＭＶの修飾された全長ｃＤＮＡクローンを生ずる。結果として得られるキメラ組換えプラスミドは、従って、修飾されたＴＭＶゲノム（これには、ｓｓｓ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡが挿入されている）を含む。キメラ・プラスミドは、その後、イン・ビトロでの転写アッセイでの使用のために線状化され、それは、フィッチエン（Ｆｉｔｃｈｅｎ）等、Ｖａｃｃｉｎｅ、１３巻、１０５１−１０５７頁（１９９５年）に記載されているように行われる。簡単に述べると、修飾されたコート・タンパク遺伝子を含む全長ＴＭＶゲノムの合成に触媒作用を及ぼすために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが使用される。一般的には、２μｇの線状プラスミドが、１０−２０葉に接種するのに十分な物質を提供する。ＴＭＶ−ｓｓｓ１ＲＮＡ／ポリペプチドの転写の後に、感染性の産物が、ホウレン草の植物上にこすりつけられる。上記転写産物は、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で１／１０に稀釈され、１００ｍｌが、植物に付与される。大規模接種のために、最初の感染に由来する感染された植物の粗均質物が、転写産物の換りに用いられる。このタイプの感染は、図５に示されているように、キメラ・コート・タンパク分子の一部として、それらの表面上にｓｐ５６特異的ｓｓｓ１ドメインを提供するウイルス粒子をもたらす。実際は、大量の免疫避妊ハプテンの摂取を考慮に入れて、この方法により、１ウイルス粒子あたり数千にものぼるハプテンが提供される。ウイルスそれ自体は感染性であり、それゆえ、成長するのに経済的であり、且つ、抗原の供給を事実上制限されずに行うのに有用である。ウイルスが感染した植物は、ＵＳＤＡガイドラインに従って、ザ・スクリップス・リサーチ・インスティチュート（ＴｈｅＳｃｒｉｐｐｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）にて栽培されている。ＴＭＶウイルス粒子は、使用の前に、感染された植物材料の加熱および／またはオートクレーブ処理により、非感染性に変えられている。表１に挙げられた残りのｓｐ５６ポリペプチドの発現のための、ＴＭＶ−ｓｐ５６キメラ遺伝子の構築は、キメラ・プライマー対が特定のｓｐ５６ｃＤＮＡヌクレオチド配列およびその相補配列で再設計されることを除いて、ｃｐａおよびｂプライマー配列を用い、上記のように行われる。植物中での製造のための本発明の組換えｓｐ５６タンパクを製造するための他のそれに代る組換えの試みは、ｐＲＴＬ２ベクターと呼称されるシャトル・ベクターの使用と、その後の植物発現ベクターｐＧＡ４８２への挿入のためのｓｐ５６含有フラグメントの単離に依存するものである。シャトル・ベクターおよび発現ベクター系のための引用文献およびそれについての議論は、第５章に記載されている。シャトル・ベクターｐＲＴＬ２は、発現制御配列と、コレラ毒素−ｓｐ５６融合タンパクの発現のために、特定のｓｐ５６をコードするｃＤＮＡフラグメントに作用するように連結されたコレラ毒素αまたはβ鎖のヌクレオチド領域とを、ＨｉｎｄＩＩＩで分離可能な制限フラグメント内において含むように設計された。下記するｐＲＴＬベクター中において、コレラ毒素α鎖およびβ鎖をコードする遺伝子は、それらが作用するような連結をするように、ｓｐ５６ｃＤＮＡ配列を用いてシャトル・ベクターに直接的に連結されるために、別々に設計されており、それは、コレラ毒素含有融合タンパクをコードする構築物をもたらす。コレラ毒素αおよびβ融合タンパクをコードするカセットの、適切な植物発現ベクターへの別々のサブクローニングの際には、ベクターは、その後、二つの融合タンパクをコードする発現ベクター両者を含むＦ１植物を作るための、その後の交配用の別々の植物を形質転換するために使用される。二つのコレラ毒素α鎖は、発現された融合タンパクの細胞への導入を容易にし、その中での免疫応答を刺激するために、一つのβ鎖遺伝子と共に設計されている。修飾されていないコレラα鎖は、アジュバントおよびキャリアー・タンパクとして作用する。β鎖との複合化によって仲介されて、一旦、受容（レシピエント）上皮細胞に吸収されると、コレラα鎖のアジュバントの側面が、細胞の基底外側の表面上における抗原の提供を刺激する。α鎖のヌクレオチド配列は、下記するように修飾されており、それは、７位におけるアルギニンからリジンへのアミノ酸の置換をもたらし、それは、アジュバント部分がアミノ酸置換によってもたらされたときに、キャリアー・タンパクとしてのみ働くα鎖を与える。コレラ β鎖は、上皮細胞の先端の表面上におけるβ鎖のＧＭ１ガングリオシドへの結合を仲介するキャリアー・タンパクとしてのみ働く。いずれかの発現されたα鎖の吸収が、発現されたコレラ毒素β鎖タンパクとの複合化によって達成される。 α鎖およびβ鎖構築物両者は、本発明のｓｐ５６タンパクを含む融合タンパクの発現のために設計されている。免疫避妊融合タンパクの製造のために、αまたはβ鎖、あるいはその両者が、融合タンパクとして使用される。ｐＲＴＬ２ベクターは、６〜９図において同様にラベルされた、植物発現ベクター中でのｓｐ５６の発現を仲介するためのシャトルされた発現要素として有用である、次の要素を有している：カリフラワー・モザイク・ウイルスの３５Ｓ転写遺伝子に由来する３５プロモーター（３５ＳＰｒ）；翻訳エンハンサーとして役立つタバコ・エッチ・ウイルス非翻訳リーダー配列（ＴＥＶＬ）；および導入遺伝子転写物の直接のポリアデニル化のためのカリフラワー・モザイク・ウイルスの３５Ｓ転写遺伝子の３’末端の３５Ｓポリアデニル化配列（ｐＡ−Ｓ）。これらの要素は、シングル・カセット中に設計されており、それは、植物発現ベクターへのその後のサブクローニングのための、制限部位消化フラグメントの単離を可能にする。シャトル・ベクターｐＲＴＬＣＴＡ−ｓｐ５６のプラスミド地図は、図６に示されており、それにおいては、ＨｉｎｄＩＩＩセグメントが、発現制御配列を含み、且つコレラ毒素α鎖（ＣＴＯＸＡとしてラベルされている）内に機能するように連結されているｓｐ５６をコードするＤＮＡフラグメント（「ｓｓｓ」とラベルされている）の位置を実例をもって示していることが、示されている。コレラ毒素α鎖−ｓｐ５６融合構築物を生ずるために、表１から、コレラ毒素α鎖遺伝子中に存在するＣｌａＩ制限部位への連結を考慮に入れて、ＣｌａＩ制限部位を含むｓｐ５６ｃＤＮＡ配列が選択され、且つ、合成またはＰＣＲにより製造される。制限部位解析により、一旦、ｓｐ５６をコードする配列の挿入が確かめられたら、融合タンパクをコードするカセットが、ＨｉｎｄＩＩＩ消化により、同様に消化されたｐＧＡ４８２植物発現ベクターへのその後の連結のために、単離される。ｓｐ５６挿入物のない、コレラ毒素α鎖融合タンパク・カセットのヌクレオチド配列は、１９５６塩基を有して配列番号１２に挙げられている。コレラ毒素遺伝子の７位においてアルギニンの替わりにリジンをコードする修飾されたコレラ毒素α鎖は、７８７位と７８８位に、配列番号１２に示されているようなシトシンおよびグアニンの替わりに、二つのアデニン・ヌクレオチドを含む。修飾されたα鎖を有する、ベクターでラベルされたｐＲＴＬＣＴＡｍ−ｓｐ５６は、図７に概略的に示されている。同図においては、他のすべてのベクター要素は、図６のために記載されたも要素と同様である。前記したものと同じベクター要素を含みもするが、コレラ毒素β鎖をコードするヌクレオチド配列を有するコレラβ鎖融合タンパク構築物は、図８に示されている。ＢｇｌＩＩに特異的な末端を含むｓｐ５６をコードする配列が、同図において「ｓｓｓ」として示されている、コレラ毒素β鎖内のＢｇｌＩＩ部位に挿入される。ｐ５６挿入物を欠く、コレラ毒素β鎖ＨｉｎｄＩＩＩ融合カセットのヌクレオチド配列は、配列番号１３に挙げられている。より大きなｓｐ５６ポリペプチドおよび融合タンパクを発現するために、図９に概略的に示されているベクターｐＣＴＡ０２−１ｓｐ５６も構築された。ＣｌａＩ制限部位以外のコレラ毒素α鎖中のヌクレオチドが除去され、それにより、同様に調製されたｓｐ５６挿入物のＫｐｎＩ／ＣｌａＩ消化ベクターへの直接的な連結を可能にする。他のベクターを用いるときには、融合タンパク発現カセットは、植物発現ベタターへのその発現のためのサブクローニングのために、ＨｉｎｄＩＩＩでの消化によって単離される。融合構築物を調製するために使用された、選択されたシャトル・ベクターに応じて、コレラ鎖をコードする遺伝子／ｓｐ５６コード領域と共に、またはコレラ毒素α鎖を欠くもの（ｐＣＴＡ０２−１ｓｐ５６）と共に、制御要素を含むＨｉｎｄＩＩＩ単離フラグメントが、その後、別々に、同様に消化されたｐＧＡ４８２へ挿入される［アン（Ａｎ）等、ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ、Ａ３巻、１−１９頁（１９８８年）］。組換え植物ベクターは、その後、タバコやアルファルファ等の植物に感染させるために使用される。好ましい植物ウイルスは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株のＬＢＡ４４０４である。４．合成ムリン（ネズミ）ｓｐ５６ポリペプチドおよびキメラｓｐ５６ポリペプチド免疫原の調製本発明の免疫避妊分子を調製するための、替わりの、しかし同様に有効な方法においては、それを受け取る患者に注入されたときに、選択されたキャリアー分子と協力して免疫応答をもたらすためのハプテンとしての使用のために、ｓｐ５６由来ポリペプチドが合成される。この試みの一例として、表１に挙げられているｓｓｓ３ｃＤＮＡによってコードされる、下線を引いた一文字法アミノ酸残基配列ＣＮＩＳＥＴＮＶＴＮＫＴＹＬＦＧＨ（配列番号１４）を有する、ｓｐ５６特異的配列の１６アミノ酸ペプチドが、マウスを経口的に免疫化するために、ハプテンとして使用された。ペプチドが、ザ・スクリップス・リサーチ・インスティチュート・コア・ファシリティ（ＴｈｅＳｃｒｉｐｐｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙ）によって合成され、それは、Ｎ−末端に更なるシステインを含んでいた。ペプチドの下線部分は、配列番号２に挙げられたｓｐ５６タンパクの、アミノ酸残基３９６−４１１位に相当する。上記ｓｐ５６ペプチドの逆のアミノ酸残基配列ＣＨＧＦＬＹＴＫＮＴＶＮＴＥＳＩＮ（配列番号１５）を有するペプチドが、免疫応答の特異性を評価するために、対照として使用された。このハプテン（１．５ｍｇ）が、露出されたＮ−エチルマレイミドを介して、１ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ修飾コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴ−Ｂ、１サブユニットあたり最大１０ＳＭＣＣ残基）に架橋された。結果として得られた免疫原は、ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐと命名された。コレラ毒素は、経口での耐性( トレランス)なしに強い粘膜の免疫応答を発現させるために他のハプテンを提供するためにうまく使用されているので、アジュバントまたはキャリアーとして選択された［ブラック（Ｂｌａｃｋ）等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、５５巻、１１１６−１１２０頁（１９８７年）；マックギー（ＭｃＧｈｅｅ）等、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖｅｌ．、６巻、３６９−３７９頁（１９９４年）］。ジフテリア毒素を含む替わりの試薬も、キャリアーとして有用である。ペプチド・ハプテンを含むＣＴ−Ｂ（ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ）は、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製され、そのアリコートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、修飾が確かめられた。結果として得られた免疫原は、その後、実施例５に記載のように、マウスを免疫するために使用された。表１に挙げられた他のｓｐ５６ポリペプチドは、経口摂取での免疫避妊の誘導での使用のための免疫原として、同様に調製される。当業者は、また、キャリアー分子と協力してまたは協力することなしに、合成ポリペプチドが使用されること、およびキャリアー分子は、コレラ毒素に限定されないことをも理解する。５．ｓｐ５６免疫原によるマウスの免疫化免疫避妊剤としての役割を果たすためのｓｐ５６組成物の能力は、先ず、実施例１に記載されているように調製された、精製され、変性され、還元されたｓｐ５６を用いて評価された。試験のために、２５日令の一匹の雄のマウスが、精製され、変性され、還元されたｓｐ５６で、腹腔内免疫された（１日目に完全フロインド・アジュバントを５００ｎｇ、６０日目に不完全フロインド・アジュバントを５００ｎｇ）。完全および不完全フロインド・アジュバントの偽の注入が、他の雄のマウスに対して行われた。ｓｐ５６で免疫された雄からの睾丸の切片が、ヤギ抗マウスＩｇ接合ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを用いて、ジアミノベンヂジンで発色させ、ヘマトキシリン／エオシンで対比染色されて、免疫組織化学的に解析された。同じ方法で免疫組織化学的に染色された、偽薬で免疫された雄からの睾丸の切片と比べたときに、ｓｐ５６で免疫された雄は、精子細胞および精子の除去が引き伸ばされていた。閉鎖性細胞が、マウスＩｇに陽性に染色されたので、観察された精子形成の後期の除去は、大部分は免疫攻撃によるものらしかった。免疫された雄は、４匹の雌のマウスと交尾し且つ挿入したが、子孫は観察されなかった。偽薬で免疫された雄は、５腹の子を作った。この結果は、マウスにおいて、ｓｐ５６への免疫応答が、雄性不妊をもたらすことを示している。免疫避妊剤として作用する他のｓｐ５６に由来するポリペプチドを評価するために、実施例４で調製されたハプテン修飾ＣＴ−Ｂ（ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ、実験用、マウス番号５−８）またはＣＴ−Ｂ単独（ＣＴ−Ｂ、対照、マウス番号１−４）が、２８日令の処女雌マウス（ＨＳＤ：ＩＣＲ系、ハーラン・スプラグ −ドーリー）に、１００μｌの生理食塩水中でおよそ２０μｇのタンパク／週／マウスを使用して、週ごとの挿管で投与された。３回の週ごとの挿管の後、眼窩内の出血により、血清が得られ、粘膜抽出物は、均質化された大便のペレットから得られた。稀釈された血清（５０μｌ、１／１０、トリス緩衝生理食塩液中）および粘膜抽出物（トリス緩衝生理食塩液０．５ｍｌ中で均質化された一つの大便のペレットから５０μｌ）が、精製され凍結乾燥されたｓｐ５６（５ｎｇ）を含む９６ウェルのプレート中でインキュベートされ、以前に記載された［チェング（Ｃｈｅｎｇ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１２５巻、８６７−８７８頁（１９９４年）］ように行われた修飾ＥＬＩＳＡにおいて、抗原認識が解析された。結合した血清および粘膜Ｉｇを検出するために、ヤギ抗マウスＩｇＧの銀増幅コロイド状金接合体（シグマ、ミズーリ州セントルイス）とヤギ抗マウスＩｇＡ（シグマ）がそれぞれ使用された。ｓｐ５６由来ハプテン（ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ、実験用）で免疫されたマウスは、表２に示されている精製されたｓｐ５６を認識する抗体を含んでいた。血清ＩｇＧと粘膜ＩｇＡの両者について、結果は同じであった。各免疫原について、陽性（＋）または陰性（−）として提供されたものそれ自体、結果のみ、が示されている。表２マウス番号免疫原結果１ＣＴ−Ｂ − ２ＣＴ−Ｂ − ３ＣＴ−Ｂ − ４ＣＴ−Ｂ − ５ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ＋６ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ＋７ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ＋８ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ＋表２に示されるように、４匹のＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐで免疫されたマウスすべてが、ｓｐ５６に結合したＩｇＡとＩｇＧの両者を含んでいたが、一方、４匹のＣＴ−Ｂで免疫されたマウスのいずれもが、タンパクを検出可能に認識する抗体を含んでいなかった。免疫されたマウスの抗血清を特徴付けるために、免疫組織化学およびウェスターン・ブロット解析の両者が、マウスの精子および可溶化されたマウス精子タンパクにつき、それぞれ行われた。免疫されたマウスからの血清は、３回の週ごとの経口免疫化の後、眼窩内の出血によって得られた。免疫組織化学的解析のために、稀釈された血清（トリス緩衝生理食塩液中で１／１０）が、ガラススライド上において、固定されたアクロソームが完全なマウス精子（免疫されなかった雄からのもの）のＩｇＧの認識について、以前に記載された［チェング（Ｃｈｅｎｇ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１２５巻、８６７−８７８頁（１９９４年）；ブックバインダー（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻、８６−８９頁（１９９５年）］ように、コロイド状金接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（シグマ）を用い、銀増幅免疫金染色により、試験された。ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐで免疫されたマウス番号５からのＩｇＧは、もっぱら、免疫されなかった精子のアクロソームを覆っている原形質膜の領域（ｓｐ５６が位置している）に結合した。マウス番号６−８からの血清ＩｇＧは、免疫組織化学染色で同じパターンを与えた。ＣＴ−Ｂ単独で免疫されたマウス番号１からのＩｇＧの結合は、検出されなかった。マウス番号２−４からの血清ＩｇＧは、免疫染色で同じパターンを与えた。マウス番号１および５（それぞれ、対照ＣＴ−ＢおよびＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐにて免疫されたもの）の血清ＩｇＧが、ウエスタン・ブロットにより、抗原特異性について解析された。このアッセイのために、免疫されなかったマウスの精子からの総トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）可溶性タンパクが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供せられ、インモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）膜に移され、且つ、ストリップ（ストリップあたりおよそ５０５ｇの精子タンパク含有）が、前記[チェング（Ｃｈｅｎｇ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１２５巻、８６７〜８７８頁（１９９４年）]のようにして、免疫性血清でプローブされた。抗体でプローブされた膜が、前記のように、銀増幅免疫金染色で発色された。ブロットをプローブするために使用された基本的な抗体は、マウス番号１（１／１００希釈）からまたはマウス番号５（１／１０希釈）からの抗体、または抗ｓｐ５６モノクローナル抗体７Ｈ１２（５０μｇ／ｍｌ；陽性の対照）であった。総界面活性剤可溶性精子タンパクのウェスターン・ブロット解析は、ｓｐ５６が、抗ｓｓｓ抗体によって認識される唯一のタンパクであることを示した。ＣＴ −Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐで免疫されたマウスからの血清ＩｇＧは、第１０図に示すように、非還元ゲル上で、単一の分子量４０ｋＤａのバンドを認識した。同図においては、陽性の対照のモノクローナル抗体７Ｈ１２も、４０ｋＤａのタンパクと免疫反応した。「ｏ」は、分離ゲルの起源を示す。これらの結果は、選択されたｓｐ５６ｓｓｓ３ｐハプテンが、マウスを経口的に免疫するためにうまく使用され、且つ、イン・サイツで、ｓｐ５６に対して、免疫応答が指示されたことを示している。免疫されたマウスからの精子は、その後、本発明のｓｐ５６ポリペプチド免疫避妊組成物の直接の影響を評価するために、免疫組織化学的に解析された。このアッセイのために、前記［ブレイル（Ｂｌｅｉｌ）およびワッサーマン（Ｗａｓｓａｒｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８５巻、６７７８−６７８３頁（１９８８年）］されたように、免疫されたマウスからの精巣上体尾部精子が単離され、受精能獲得を支持する培地中で、３０分間インキュベートされた。インキュベートされた精子は、上に前もって記載された免疫組織化学のために、固定され且つ調製された。乾燥され培養皿に塗られた精子が、元に戻され（水和され）、２５℃で４時間、ＴＮＢＧ（５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、４ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）［シグマ］、および５％正常ヤギ血清［シグマ］）中でインキュベートされ、その後、５０μｇ／ｍｌでコロイド状金−接合ヤギ抗マウスＩｇＡ（シグマ）を含むＴＮＢＧ中で、４時間インキュベートされた。精子は、洗浄され、銀で増幅され、且つ前記したように対比染色された。明白な観察結果は、対照または実験マウスからの精子の運動性のレベル（およそ７０％）間のまたはタイプ間の違いを示さなかった。ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ免疫マウスからのアクロソームが完全な精子は、「三日月」が、ｓｐ５６の位置を定めて、アクロソームの上を覆っている原形質膜の表面にまったく限定された免疫金染色を示した。対照のＣＴ−Ｂ免疫マウスからの精子では、免疫金染色は、検出されなかった。免疫されたマウスからの精子は、その後、精子−卵子結合アッセイで特徴づけられる。前記したように、受精能獲得のためにインキュベートされた精子の一部が、前記［ブレイル（Ｂｌｅｉｌ）およびワッサーマン（Ｗａｓｓａｒｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８５巻、６７７８−６７８３頁（１９８８年）］したように、塊のないマウス卵子を用いて、精子−卵子結合アッセイに挑戦させられた。卵子あたりの結合精子の数（アッセイあたり、１０個の卵子および２個の二細胞胚）が、前記のようにして測定される。他のマウス（雄および雌）が、組換えおよび合成分子のためにそれぞれ実施例３および４に記載されたようにして調製された、同等に調製されたｓｐ５６免疫避妊組成物を用いて、免疫される。免疫化に対する応答は、キャリアー分子を用いてまたは用いずに、組換え型でまたは合成によって調製される、アッセイされたｓｐ５６タンパクまたはポリペプチド試薬のそれぞれについて、ここに記載のようにして評価される。本発明のｓｐ５６免疫避妊タンパクまたはポリペプチドを用いてうまく免疫された雄のマウスは、その後、生殖可能性を評価するために、交尾させられる。ＥＬＩＳＡにより、免疫応答を明示している少なくとも一種を含む群からのすべての雄および雌は、生殖能力が無いことを試験するために、６０日目（免疫化後６０日）に、別々に、免疫されていない相手と交尾させられる。最大２０日間、つかいが一緒に檻で飼われ、雌は、各朝に、交尾栓について検査される。交尾し、免疫されていない雌は、２０日間と、その期間の後の２１日間、妊娠について、腹部の膨張の明白な観察結果と分娩の両者によって検査される。免疫された雄の避妊の成功は、出産できない、免疫されていない雌（免疫された雄と交尾させられた）の百分率として測定される。交尾し、免疫された雌は、分離されて、同様の方法で妊娠について検査される。免疫された雌の避妊の成功は、出産できない交尾し、免疫された雌の百分率として測定される。各群について、成功率の最小要求値は、雄について５０％の避妊および雌について５０％の避妊である。これらの低い数値ですら、げっ歯類の固体数の低下のために、試薬の効果は十分である。１０１日目に、１０−２０匹のうまく免疫された避妊雄（各群から５匹以下）が、その後、免疫避妊の部位を決定するために解析される。これらの雄は、免疫されていない雌と交尾させられる。交尾した雌は、交尾後７時間で犠牲とされ、それらの卵管および子宮角が、切り開かれ且つ生理食塩水で洗い流された。すべての細胞性物質が、遠心分離によって分離される。洗浄水（フラッシュ）中の可溶性物質が、上記の如く、ＥＬＩＳＡによって抗ｓｐ５６Ｉｇについて解析される。Ｉｇの型の決定は、ＥＬＩＳＡによって行われる。洗浄水中に精子が無いということは、免疫攻撃および管の防御の上流における精子の除去を示す。洗浄水中に見出された精子には、損なわれた運動性、Ｔ細胞またはマクロファージとの会合、およびヤギ抗マウスＩｇＧ−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合体を用いての抗体被覆が観察される。すべてのケースにおいて、Ｆｃレセプターの結合が、前記［チェング（Ｃｈｅｎｇ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１２５巻、８６７−８７８頁（１９９４年）］したように、正常ヤギ血清によって事前ブロックされる。精子の存在と、Ｉｇおよび／または免疫細胞の会合は、精巣上体または精液中で分化された精子に対する粘膜の免疫攻撃を示す。次に、うまく免疫された不妊雄の半分が犠牲にされ、生殖器官が、免疫化依存病理学の観点で解析される。睾丸および精巣上体が、前記の如く、固定され、包埋され、切片にされ且つ染色される。これらの不妊、ｓｐ５６免疫化雄の睾丸および精巣上体切片は、前記の如く、免疫攻撃の方法を定めるために、免疫組織化学によって解析される。この手順は、免疫応答が、免疫系の細胞（例えば、マクロファージ、キラーＴ細胞）による侵襲を含むのか、あるいは単に循環しているまたは分泌された抗体による攻撃によるのかを決定するために使用される。これらの５−１０匹のｓｐ５６で免疫された雄の死体は、ザ・スクリップス・アニマル・ファシリティ・ベタリナリアン（ｔｈｅＳｃｒｉｐｐｓＡｎｉｍａｌＦａｃｉｌｉｔｙＶｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎ）により、他の器官における解剖病理学のために、更に解析される。仮に、ｓｐ５６で免疫された雌が避妊（即ち、交尾栓によって決定して交尾に成功、しかし子孫はなし）を証明するなら、それらは、その後、卵管および子宮角中での精子への免疫攻撃が試験される。１０匹もの避妊、ＴＭＶ−ｓｐ５６免疫化雌が、免疫されていない雄と交尾させられ、それらの卵管および子宮角中の精子が、前記の如く、免疫攻撃の根拠のために解析される。ＴＭＶ−ｓｐ５６タンパクまたはポリペプチド免疫が可逆性であるか否かを決定するために、更なるアッセイが行われる。ｓｐ５６依存性不妊の可逆性は、絶滅の危機に瀕した（ｔｈｒｅａｔｅｎｅｄｏｒｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ）げっ歯類が有害なげっ歯類の個体群と同じ生態的地位を占めるならば、望ましいかもしれない。この状況のために、残りの、うまく免疫された雄および雌の繁殖力の試験が、続けられる。８１日目の後、これらの動物が、野生型ＴＭＶまたは他のデリバリー・ビヒクルを含む食用ペレットの飼料を与えられる。１２０日間、前記の如く、それらの繁殖力が試験される。ｓｐ５６依存性不妊の可逆性の成功が、ｓｐ５６で免疫された雄との交尾の後に出産した免疫されなかった雌の百分率および免疫されなかった雄との交尾の後に出産したｓｐ５６で免疫された雌の百分率として測定される。６．ムリン（ネズミ）ｓｐ５６の哺乳類ｃＤＮＡホモログの単離実施例２に記載のようにして得られたムリンｃＤＮＡｓｐ５６の哺乳類ｃＤＮＡホモログが、ここに記載のスクリーニング・プロトコルによって得られる。そのプロトコルは、哺乳類組織をスクリーニングするために設計されているとはいえ、その手順は、ヒトホモログのみを単離するために記載されている。当業者は、ヒトｓｐ５６ホモログを単離するための記載された方法が、他の哺乳類のホモログの同定における使用のために、容易に推定によって適用されることを理解する。更に又、当業者は、哺乳類のホモログの同定は、ここに記載された方法に限定されないことも理解する。予備スクリーニングにおいて、ヒト睾丸ＲＮＡの厳密さの低いノーザン・ブロット解析（マウス精子ｓｐ５６をコードする全長ｃＤＮＡでプローブ）が、１− ２ｋｂ範囲において、かすかなＲＮＡバンドを検出した。ＲＮＡのハイブリダイズは、低い厳密さで検出されるのみであるので、そのＲＮＡによってコードされたホモログは、おそらく、ｓｐ５６に対して遠い関係にある。ヒト精子タンパクのヒト卵母細胞ＺＰ認識ドメインが、マウスにおけるケース［フローマン（Ｆｌｏｒｍａｎ）等、Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．、１０６巻、２４３０１５１頁（１９８４年）；フローマン（Ｆｌｏｒｍａｎ）およびワッサーマン（Ｗａｓｓａｒｍａｎ）、Ｃｅｌｌ、４１巻、３１３−３２４頁（１９８５年）；ブレイル（Ｂｌｅｉｌ）およびワッサーマン（Ｗａｓｓａｒｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.，ＵＳＡ、８５巻、６７７８−６７８３頁（１９８８年）］のように、炭水化物の替わりにＺＰポリペプチドを認識できるので、このことは、予期されるかもしれない。ヒト睾丸ＲＮＡの更なるノーザン・ブロット解析が、ｓｐ５６ホモログをコードするヒト睾丸ｃＤＮＡを同定するためのプローブ（ｓｐ５６ｃＤＮＡ由来）を同定するために、行われる。すべてのノーザン・ブロット解析が、好結果のＲＮＡの、単離、転写およびＧ３ＰＤＨｍＲＮＡのためのプローブを用いた後スクリーニングによる提供のために、試験される。ｓｐ５６ホモログをコードするヒト睾丸ＲＮＡをノーザン・ブロットで検出するために、二つのタイプの核酸プローブが使用される。最も高いピーク／ノイズ比を提供し、且つ、ブロット上のＲＮＡバンドの最も小さい数に明らかに結合するこれらのプローブが、ｃＤＮＡスクリーニングのために選択されるこれらのプローブは、次のように説明される：Ｉ型プローブ：二本鎖³²Ｐラベルのランダムに用意されたＤＮＡｓｐ５６ｃＤＮＡプローブが、配列番号１のヌクレオチド配列を有する全長ｓｐ５６ｃＤＮＡクローン７．１から、またはそのｃＤＮＡのサブクローンから調製され、前記されたように［ブックバインダー（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻、８６−８９頁（１９９５年）］、ノーザン・ブロットをプローブするために使用される。全長プローブは、マウス睾丸ＲＮＡのノーザン・ブロットにおいて、ｓｐ５６ＲＮＡを同定するために巧く使用されているという、そして、比較的低い厳密さで、ヒト睾丸ＲＮＡを検出するという利点を有する。更なるノーザン・ブロットの全長プローブを用いての研究が行われる。その研究においては、よりよいピーク／ノイズ比を得るために、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件の厳密さは、様々とされる。例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、４×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ（２５℃）を用いて繰り返され、ＳＳＣの濃度は後に多様化され（４×〜６×）、ＳＤＳの濃度は多様化され（０．５％〜０．１％）、且つ、いくつかの実験においては、デンハーツの試薬（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓＲｅａｇｅｎｔ）等のブロッキング剤が添加される。替わりに、ノーザン・ブロットをスクリーニングするために、上記の如く、ｓｐ５６ｃＤＮＡのサブクローンを表し、且つ、ｓｐ５６ｃＤＮＡクローン７．１の５’側半分（配列番号１の塩基１−１３００）またはｓｐ５６ｃＤＮＡクローン７．１の３’側半分（配列番号１の塩基１３０１−２０５０）に相当する他のプローブが、使用される。ＩＩ型プローブ：ｓｐ５６ｃＤＮＡに由来する、その３’末端にビオチンを有する一本鎖合成ビオチン化デオキシリボヌクレオチド６０量体アンチセンス・、プローブが、ザ・スクリップス・インスティチュート・コア・ファシリティ（ＴｈｅＳｃｒｉｐｐｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙ）によって合成される。これらのアンチセンス・プローブは、遺伝子銀行の継承番号Ｕ１７１０８として挙げられているｓｐ５６ｃＤＮＡ配列中および配列番号１中に示された領域に対する、５’から３’の方向に書かれた、次に記載された相補配列を有する：５’非翻訳領域中のヌクレオチド１−６０（配列番号１）に相補的な：５’ＴＣＴＧＡＡＴＡＡＧＡＣＧＴＡＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＡＧＴＧＴＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＣＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＧＴＧＣＣ３’(配列番号１６)；Ｓｕｓｈｉドメイン１中のヌクレオチド１８１−２４０（配列番号１）に相補的な：５’ＧＴＴＧＴＴＧＡＣＴＣＡＴＡＣＡＡＣＴＧＧＴＴＧＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＧＧＴＡＡＡＡＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＣＡ３’(配列番号１７)；Ｓｕｓｈｉドメイン４中のヌクレオチド７８１−８４０（配列番号１）に相補的な：５’ＣＣＣＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＧＣＧＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＣＡＴＡＧＡＡＣＴＧＴＣＧＡＡＡＴＣＣＡＧＧＧ３’(配列番号１８)；および配列特異的ドメイン（ｓｓｓ）中のヌクレオチド１３８１−１４４０（配列番号１）に相補的な：５’ＣＣＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＴＧＣＴＣＧＧＴＴＧＡＧＴＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴＡＧＡＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＣ３’(配列番号１９)。四つのプローブが、可能性のあるｓｐ５６のヒト精子アナログに対する予期されたｓｐ５６相同性に基づいて選択された。５’非翻訳領域が、発現におけるその殆ど確実な調整機能のために、選択された。Ｓｕｓｈｉドメイン１および４の領域は、ｓｐ５６のＮ末端の半分が、保存された精子固定（アンカーリング）ドメインを表すという証拠の下で、大部分が保存されている。ｓｐ５６の炭水化物認識ドメインの一部としてのｓｐ５６特異的配列（ｓｓｓ）は、保存されていないらしく、且つ、ノーザン・ブロット解析では、陰性の対照として機能する。しかしながら、ノーザン・ブロット上でヒト睾丸ＲＮＡを明確に且つ満足に検出するプローブのいずれか（またはすべて）は、その後ｃＤＮＡスクリーニングのために使用される。一本鎖ビオチン化ポリヌクレオチド・プローブが、製造者［ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、バイオラッド］によって示唆された条件の下、ヒト睾丸およびマウス睾丸(陽性の対照)からのＵＶ架橋ＲＮＡを含むノーザン・ブロットにハイブリダイズされる。最も高いピーク／ノイズ比を得るために、ハイブリダイゼーション後の洗浄が、様々なレベルの厳密さの下で行われる。ハイブリッドの検出のために、ブロットが、その後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ接合体を用いてプローブされ、且つ、ＢＣＩＴ−ＢＰＴ試薬を用いて発色される。ｓｐ５６ｃＤＮＡ配列（その配列のプローブは、ヒト睾丸ＲＮＡを有するノーザン・ブロット上の個々のＲＮＡバンドを巧く検出するために明らかとされている）が、その後、ヒト睾丸ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために使用される。ブレイル博士（Ｄｒ．Ｂｌｅｉｌ）の研究室が、前記［ブックバインダー（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻、８６−８９頁（１９９５年）］の如く創造され、且つλ−ＺａｐＩＩベクター中におよそ１０⁸ 個の独立クローンを含むオリゴ−ｄＴ−プライムド・ヒト睾丸ｃＤＮＡライブラリを開発した。それに匹敵するライブラリは、市場で入手可能でもある。前記の如く選択されたプローブが、本質的にマウス睾丸ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングのために前記されたようにして、ライブラリをスクリーニングするために使用される。そのようなスクリーニングにおいて検出されたプラークが、クローニングされ、且つ、前記の如く、ｃＤＮＡの配列が決定される。配列が決定されたｃＤＮＡは、次の基準に基づいて、ｓｐ５６のヒトアナログをコードするｃＤＮＡの候補として同定される：１．ｃＤＮＡクローンを同定するプローブは、マウス（陽性の対照）およびヒト睾丸ＲＮＡの両者のノーザン・ブロット上で、個々のＲＮＡバンドも検出しなければならない。前記の如く、ｓｐ５６のｓｓｓをコードするプローブは、ヒト睾丸ＲＮＡまたはそれらの個々のｃＤＮＡを同定するために予期されない。２．選択されたｃＤＮＡの翻訳された配列は、ｓｐ５６アミノ酸配列（の少なくとも半分）に対して、かなりの相同性を有さなければならない。ｓｐ５６は、タンパク・レセプター（そのそれぞれは、Ｓｕｓｈｉドメインと呼ばれる短い相同の繰返しを含む）のスーパーファミリーの一種であるから、スーパーファミリーの他のもの（ｓｐ５６ホモログではない）が、偶然に同定され得る。例えば、相補的４Ｂ結合タンパク（Ｃ４ＢＰ）のαサブユニットが、４７％の全体としてのアミノ酸同一性を有して、ｓｐ５６に最も密接に関連する。しかしながら、Ｓｕｓｈｉドメイン１−５のｓｐ５６のＮ末端側の半分は、ヒトＣ４ＢＰに対して５４％のアミノ酸同一性を有し、一方、Ｓｕｓｈｉドメイン６、ＳＳＳ、Ｓｕｓｈｉドメイン７および基本的なＣ末端テールを含むＣ末端側の半分は、ヒトＣ４ＢＰに対して３６％のアミノ酸同一性しか有さない。従って、ｓｐ５６のヒト精子ホモログとしての候補であるためには、選択されたｃＤＮＡの翻訳された配列は、４７％を超える、ｓｐ５６に対する全体としてのアミノ酸同一性を有さなければならないか、または、Ｎ末端側の半分が、５４％を超える同一性を有さなければならないか、または、Ｃ末端側の半分、３６％を超える同一性を有さなければならない。これらの必要条件は、機能的にマウス精子ｓｐ５６のホモログではないタンパクを同一視する機会を最小化するために、選択される。上記基準に適合して選択され且つ配列が決定されたｃＤＮＡは、ｓｐ５６のヒト精子ホモログの候補をコードするとして同定される。ヒトｓｐ５６ホモログは、精子および精子形成の後期に限定されねばならず、且つ、他のヒト組織が不存在でなければならない。候補のタンパクの発現が、ヒトにおいて制限されているか否かを試験するために、前記のようにして、ヒト組織（心臓、肝臓、上皮、睾丸、筋肉、肺、脳、腎臓および卵巣）から抽出されたＲＮＡのノーザン・ブロット解析が、選択されたヒト睾丸ｃＤＮＡに由来する³²Ｐハイブリダイゼーション・プローブを用いて行われる。仮に、ムリンｓｐ５６のように、ノーザン・ブロットが、候補のｓｐ５６ホモログをコードするＲＮＡが、睾丸においてもっぱら発現されることを明らかにするならば、コードされたタンパクは、イン・ビボにおけるその機能とは関係なく、ヒトにおいて、理想的な免疫避妊の目標に相当する。そのような候補の一つの他の要求される特徴は、仮にそれが有効な目標であるとするならば、タンパクが、ヒト精子の表面上で発現されるということである。ヒトまたは他の哺乳類ホモログの同定および配列解析が、その後、本質的に実施例３および４に記載の如く調製され且つ実施例５に記載の如く放出されたｓｐ５６タンパクおよびポリペプチド免疫原の調製を可能とする。特定の態様および例を包含する先行する明細書は、本発明の実例を示すものであることが意図されており、且つ、限定するものとして解されることは意図されていない。本発明の真の意図および範囲から離れることなく、多くの他の変形および修飾が行われ得る。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Immunocontraceptive compositions containing sperm antigens and methods of using the sameTechnical field The present invention relates generally to mammalian sp56 cDNAs encoding immunocontraceptive proteins. Related to the discovery of nucleic acids. The present invention further relates to a screening method related to immunocontraception. Described are immunocontraceptive polypeptides useful in methods, diagnostic methods and therapeutic methods.background Recent interest in the potential for the development of oral contraceptive vaccines has led to potential costs [Alexanderand Baily, Reprod. Fertil. Devel., 6: 273-280 (1994)]. When administered orally, gamete-specific Kuching elicits a mucosal immune attack restricted to the reproductive tract, with one or both mates Eliminate children [Mestecky and McGhee, Adv. Immunol., 40: 153-245 (1987); McGhe e et al., J. et al. Clin. Immunol., 9: 175-199 (1989); Stern et al., J. Am. Reprod. Im munol., 22: 73-85 (1992); Meinertz et al., Amer. J. Reprod. Immunol., 25:15 8-162 (1991); McGhee et al., Reprod. Fertil. Devel., 6: 369-379 (1994)]. Development of oral contraceptive vaccines is based on the cell specificity required for sperm-egg interactions I have. To fertilize an egg, the mammalian sperm must first be thickened around the egg Must bind specifically and strongly to the zona pellucida, a coat of extracellular glycoprotein No. Binding is associated with contact between the sperm head plasma membrane and the surface of the zona pellucida, Species-specific. For example, in mice, sperm is composed of three glycoproteins in the zona pellucida. Is recognized as ZP3. ZP3 domain recognized by sperm plasma membrane In is a 3,900 dalton O-linked oligosaccharide. Amino acid sequence of ZP3 Does not vary significantly between species, and its ubiquitous role in sperm-egg recognition For some reason, considerable efforts have been made to develop immunocontraceptives that target ZP3. [Spifano and Dean, Rep. Fertil. Devel., 6: 319-330 (1994)]. Although this strategy may be effective in theory, recent studies have shown that ZP3 Filtration accelerated by orally immunizing female mice with a derived B cell epitope Ovarian involvement, including follicular atresia and massive proliferation of follicular cells Ki Suggested that the immune response does not necessarily lead to contraception I have. Ovarian lesions can be expected after immunizing females with ZP3. This is an immune attack Strike and removal of the growing oocytes from the follicles is triggered by the "stop growth" signal from the oocytes. Absent conditions can result in unlimited follicular cell division and tumor formation is there. Another strategy for developing effective immunocontraceptives is to target sperm-specific antigens. is there. The immune challenge of such antigens in males renders those animals infertile. Antigen challenge with antigen, even during spermatogenesis, occurs during early meiosis in seminiferous tubules It should not have interfered with or affected the fissure event It is not believed that this would result in unlimited cell growth. In addition, the immunized female Due to the immune attack of sperm in the female reproductive tract, it is likely to be infertile. Sperm Allonidase PH-20 antigen [Primakoff et al., Nature, 335: 543-546 (1988) ); Fiszer-Szafarz et al., Acta. Biochimica Polonica, 42: 31-33 (1995); Line t al., J.S. Cell. Biol., 125: 157-163 (1994); and Gmachl et al., FEBS Lett. , 336: 545-548 (1993)], sperm lactate dehydrogenase isozyme LDH-C4. [Goldberg et al., Fertil. Steril., 35: 214-217 (1981); Freemerman et al., Mol. Reprod. Dev., 34: 140-148 (1993)], protein acrosome sp-10. [Srinivasan et al., Biology of Reprod., 53: 462-471 (1995)], and sp. 17 [O'Rand et al., J. Am. Reprod. Immonol., 25: 89-102 (1993)] Sperm proteins are used to immunize animals and / or cause infertility. I have been. A mouse sperm protein called sp56 is a protein that mediates ZP3 sperm recognition. It has many of the expected properties of the protein and has recently been identified [Bleil and Wassarman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 5563-5567 (1990); Cheng et al. Cell Biol., 125: 867-878 (1994)]. sp56 is First in a study designed to identify the ZP3-recognition protein of mouse sperm It's been found. Purified ZP3 is modified with a photoactivatable crosslinker and attacked with live sperm Or cross-linked to an affinity column and reacted with soluble whole sperm protein. In each of these two independent methods, the only identified mouse sperm protein was sp5 6. sp56 is a homomultimeric peripheral membrane protein whose monomer is Rhinoceros Size is 56,000 daltons, and the acrosome in which the ZP3 binding site is located exactly. It is localized only in the plasma membrane of the sperm head overlying the soma (acrosome). sp56 is ZP 3, terminal sugars required for sperm recognition of FD oligos and FD-oligos of Zp3 It is a lectin having specific affinity for certain a-galactose. On sperm Based on the number of ZP3 binding sites, approximately 25,000 sp56 molecules form the sperm surface It is predicted to exist. Recently, a cDNA encoding sp56 has been cloned [Bookbinder et al. al., Science, 269: 86-89 (1995)]. Sp56 derived from the isolated cDNA The primary sequence is a series of 60 amino acids in length, called the Sushi domain. Superfamily of protein receptors characterized by the presence of homologous repeats of Indicates that you are a member of Each Sushi domain has 10 substantially unchanged Contains amino acids. In line with their qualification to be a member of the superfamily, sp56 The cDNA is a 44 amino acid stretch near the carboxy terminus unique to that protein. Code the reticle. Therefore, this unique stretch is the sp56 specific sequence Called the domain (sss), which is thought to define a species-specific epitope . As predicted by the cDNA encoding the peripheral membrane protein, this cDNA sequence Encodes a signal peptide located upstream of the Sp56 amino terminus. sp 56 cDNA is from the amino terminus to the end of the cDNA open reading frame. Encodes a polypeptide of 62,000 daltons, as determined above. This 62, The 000 dalton polypeptide is called "prosp56" and has a carboxy terminal Proteolytic removal of approximately 6,000 daltons of mature sp56 (5 6,000 Daltons). Therefore, this molecule is It is called sp56 in connection with 56,000 daltons. sp56 cDNA The monoclonal antibody and molecular probe developed by Are limited to only spermatogenic cells, and neither their protein nor mRNA They have been used to demonstrate that they do not accumulate in other mouse tissues. However, in contrast to the sperm antigens described above, sp56 is unique in the following respects: You. 1) sp56 expression is restricted to sperm only and is closely related to protein ( Ma Or isozymes) are not expressed in body tissues, providing an opportunity for systemic immunity. Is minimal; 2) sp56 is present on the sperm surface and therefore in both male and female reproductive tracts And is subject to immune attacks; and 3) The expression of sp56 occurs after maturation of the immune system, which is both male and female. It means that immunity presents "foreign" antigens. Thus, in light of the above features of sp56, sp56 antigenic polypeptides It is desirable to design an immunocontraceptive vaccine composition based onBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION A mammalian sperm protein, named sp56, is available from rodents to humans. Have been found to be useful as immunocontraceptive vaccines for certain mammalian species. Accordingly, the present invention relates to sp56 antigens useful in immunocontraceptive vaccine compositions. Various antigenic polypeptides containing determinants are described. In addition, a bait (bait) or a feed (feed) containing the antigenic polypeptide may be used. Immunocontraceptive methods using the above vaccine composition, including oral contraception using agents, are also described. You. The present invention relates to anti-sp56 antibodies useful for detecting the presence of sp56 antigen in a sample. Also described are monoclonal antibodies. Immunological methods include sp56 antigenic determinants and Using antibodies and antigenic polypeptides to detect and anti-sp56 antibodies. Illustrated. These methods evaluate sperm fertility, detect sperm sp56 antigen and It is useful for confirming the effectiveness of the vaccine of the present invention which induces immune responses. Recombinant DNA expression vector and recombinant protein containing sp56 antigenic determinant The manufacturing method is also described. The present invention has the following advantages. The use of immunocontraceptives can be used in the absence of repeated exposure to the sp56 antigenic determinant. It is reversible as long as the level of circulating antibodies is reduced. Wild pest control This substance is non-toxic as long as it does not contain toxins when formulated as feed for Therefore, compared to accidental consumption by non-target animals or humans. Relatively secure. In addition, immunocontraceptives can only be reached in the animals that contraception targets. So that it does not occur in other animals or humans that It can be formulated to include a restricted sp56 sequence. Other advantages are to those skilled in the art. Is easily understood.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows the mouse sp56 cDN with GenBank accession number U17108. 2 shows the amino acid residue sequence of A clone 7.1. Signal peptide (leader sequence ) Starts at -32 and is two residues before the first Sushi domain underlined. Ends with glycine. The remaining six Sushi domains are shown similarly . FIG. 2 is a diagram showing a sp56 7.1 cDNA clone. Is indicated by a “scale” mark. Ribosome binding site (RBS) and poly A signal Is shown on the scale with the experimentally determined poly A site. Coded poly Peptide regions are indicated by arrows. Sushi domains 1 to 7, signal peptide, sp56-specific sequence (sss) and the basic C-terminus of prosp56 polypeptide The position of the end tail is also shown. FIG. 3 schematically shows a typical Sushi domain structure. In that, Each domain is composed of about 60 amino acids, of which 10 discontinuous amino acids ( C, P, Y, C, G in one-letter notation from the amino acid terminal to the carboxy terminal , C, G, W, P, and C) are substantially invariant and specific positions within the sequence Exists. The remaining about 50 amino acids show considerable diversity. This general The structure has the following features. 1) Two disulfide bonds of C1-C3 and C2-C4 are looped loops Form a structure; 2) at least one proline near each disulfide bond, continuous Provide the necessary strand turns for connection of the Sushi domain; and 3) G and W are present in the inner hydrophobic loop. FIG. 4 shows the sp56 polypeptide (in this case, sp56 specific sequence (sss) domain). Chimeric poly (TMV) containing TMV coat protein (cp) The first part of a step-wise method for the preparation of chimeric genes encoding peptide molecules Show. This method, including the step of preparing chimeric primers, Completely describe. FIG. 5 shows the cloning of the TMV / sss gene into the homologous region of the complete TMV gene. Contains TMV coat protein (cp) along with sp56 polypeptide Of a stepwise method for the preparation of a chimeric gene encoding a chimeric polypeptide molecule Shows the final step. Expression of the chimeric polypeptide molecule is exposed on the viral coat Shown with TMV having a sp56-specific polypeptide (hapten) . The final step is described more fully in Example 3. FIG. 6 is a schematic plasmid map of pRLCTA-sp56 described in Example 3. It is. FIG. 7 is a schematic plasmid map of pRLCTm-sp56 described in Example 3. It is. FIG. 8 shows a schematic plasmid site of pRLCTB-lsp56 described in Example 3. FIG. FIG. 9 shows a schematic plasmid site of pCTA02-lsp56 described in Example 3. FIG. FIG. 10 shows from non-immunized mice under non-reducing conditions on SDS-PAGE. From mice immunized with CT-B-sss3pp against mouse sperm protein Figure 4 shows a Western blot analysis of antisera. CT-B- labeled CTB-SSS Antiserum from sss3pp-immunized mice and monoclonal antibody 7H as a positive control 12 is specific for non-immune sperm proteins with a molecular weight of 40,000 daltons (40 kDa) Reactive.Detailed description of the invention A. Definition Amino acid residue : The polypeptide was chemically digested (hydrolyzed) at its peptide bond. Amino acids formed at the time. The amino acid residues described herein are preferably Is in the “L” isomer form. However, the residues in the "D" isomeric form , Any L-amino acid residue so long as the polypeptide retains the desired functional properties. Can be replaced. NH_TwoIs the free amino acid at the amino terminus of the polypeptide. Refers to the amino group of COOH is free at the carboxy terminus of the polypeptide Of the carboxyl group. According to the standard polypeptide nomenclature [J. Biol . Chem., 243: 3552-59 (1969), and 37 CFR 91.822 (b). Used in (2)], and the abbreviations of amino acid residues are as shown in the following correspondence table. is there. Correspondence table Notation amino acid One character Three letters Y Tyr tyrosine G Gly Glycine F Phe phenylalanine M Met methionine A Ala Alanine S Ser Serine I Ile Isoleucine L Leu Leucine T Thr threonine V Val Valin P Pro Proline K Lys Lysine H His histidine Q Gln Glutamine E Glu Glutamic acid Z Glx Glu and / or Gln W Trp Tryptophan R Arg Arginine D Asp Aspartic acid N Asn Asparagine B Asx Asn and / or Asp C Cys cysteine X Xaa unknown or other amino acid As used herein, all amino acid residue sequences represented by the formula Note that it has a left-to-right orientation, in the conventional direction to the carboxy terminus. I want to. Furthermore, the phrase “amino acid residue” refers to the amino acids listed in the correspondence table, And 37 CFR 1.822 (b) (4), incorporated herein by reference. It is broadly defined to include modified and unusual amino acids such as those described. Further In addition, the first or last dash of the amino acid residue sequence may include one or more amino acids. Peptide bond with a further sequence of noic acid residues or NH_TwoOr an acetyl group Shows a covalent bond with an amino terminal group or a carboxy terminal group such as COOH Note thatRecombinant DNA (rDNA) molecule : Two operably linked DNA segments DNA molecule produced by Thus, recombinant DNA molecules are usually Is a hybrid D comprising at least two nucleotide sequences not found together NA molecule. rDNA does not have a common biological origin, ie evolution Such differences are called "heterologous".vector : RDNA molecules capable of autonomously replicating in cells, and DNA A segment, for example, a gene or polynucleotide, Operablely linked to provide for orderly replication. One or more polypep Vectors capable of directing the expression of the gene encoding the tide are described herein. Are referred to as “expression vectors”.antibody : The term antibody is used herein to refer to immunoglobulin molecules and immunoglobulins. The immunologically active portion of the Bryn molecule, ie, the antibody binding site or paratope Used in various grammatical forms to refer to the containing molecule. An exemplary antibody molecule is Intact (complete) immunoglobulin molecule, virtually intact immunoglobulin Of Fab molecule, immunoglobulin molecule [Fab, Fab ', F (ab')_TwoYou And portions known in the art such as F (v)].Antibody binding site : The antibody binding site specifically binds to the antigen (immunoreacts with the antigen ) A structural part of an antibody molecule composed of heavy and light chain variable and hypervariable regions is there. The term “immune response” in various forms refers to molecules that contain an antigenic determinant. Specificity between a molecule containing an antibody binding site, such as a whole antibody molecule or a portion thereof Result MeansMonoclonal antibody : Monoclonal antibodies, in various grammatical forms, A collection of antibody molecules containing only one antibody binding site capable of immunoreacting with the tope Group (population). Therefore, monoclonal antibodies are typically Represents a single binding affinity for any epitope with which it immunoreacts. So Therefore, monoclonal antibodies are immunospecific for each different epitope An antibody molecule having a plurality of antibody binding sites, such as a bispecific antibody, may be included. History Historically, monoclonal antibodies have been cloned into pure immunoglobulin-secreting cells. Although created by immortalizing the strain, it can also be created by the method of the present invention.Upstream : MRNA opposite to the direction of DNA transcription, 5 ′ to 3 ′ on non-coding strand The direction from 3 'to 5' above.downstream : Along the DNA sequence in the direction of sequence transcription or reading, 3 'to 5' direction along the non-coding strand or 5 'to 3' along the RNA transcript It is to go in the direction.Reading frame : Specify the structural protein coding part of the gene or the structural gene Three consecutive nucleotides used for translation (triplet, code) A) a specific array. Reading frame depends on translation initiation codon position .Polypeptide : Between the α-amino group and the carboxyl group of consecutive amino acid residues A linear series of amino acid residues linked together by peptide bonds.Protein : More than 50 amino acids linked together as in a polypeptide A linear series of residues.Substantially pure or isolated : In the context of polypeptides or proteins When used, these terms are separated from the components that naturally accompany them. Means a molecule. Typically, the monomeric protein is at least about 60% to 7%. If 5% of the samples exhibit a single polypeptide backbone, they are substantially pure. important Variants or chemical modifications typically share the same polypeptide sequence . Substantially pure proteins are typically more than about 85% to 90%, more usually Contains a protein sample of about 95%, and preferably more than about 99% pure. The purity or homogeneity of the protein or polypeptide can be determined by using polyacrylamide Get A number of well-known techniques in the art, such as electrophoresis followed by visualization by staining. Can be indicated by means. High resolution is required for certain purposes. Use high performance liquid chromatography (HPLC) or similar means for purification. Can be.Synthetic peptide ： Peptide bond not containing natural protein or its fragment Chains of chemically generated amino acid residues linked together byFusion protein : A polypeptide produced by a recombinant DNA method, A single open reading frame for expressing a "fused" polypeptide The first polypeptide domain, produced through expression of the frame, is a peptide bond Operably linked to a second polypeptide domain byChimeric molecule : Through chemical linkage to crosslink two separate polypeptides Bifunctional molecule formed by connecting two separate molecules together. B. Immunocontraceptive vaccine composition The present invention provides an immunogen for the purpose of inducing an immune response in a subject mammal. The mammalian sperm sp56 antigenic determinant is used, thereby allowing sp56 on sperm in vivo. Produce antibodies that immunoreact with antigenic determinants, thereby producing sperm in the mammal Or state that it affects fertility. Accordingly, the compositions of the invention are intended to elicit an immune response in a subject. For purposes, referred to as vaccines, in that respect they are further described herein. Intended to contain typical components of the vaccine according to the route of administration to It is. The composition of the present invention is characterized in that the contraceptive mechanism implemented according to the invention is subject to treatment. The presence of an immune response (affecting sperm content and quality) in infected mammals And therefore affects fertility and acts as a contraceptive, Also called. In this context, any effects on sperm fertility may be attributed to birth control properties And absolute fertility is typically preferred in most aspects of the invention. It should be appreciated that, although good, it is not required for efficacy. The present invention relates to a method in which mammalian sperm protein sp56 Is primarily based on the discovery that it plays a major role in Physically, the sp56 protein targets the immune system in effecting an immune contraceptive response. It is based on the discovery that it is very suitable as a target. The present invention also provides therapeutic Within sp56 to provide unique and distinct antigenic determinants (targets) useful for epidemiological responses It is characterized by identifying various useful epitopes (antigenic determinants). Thus, an antigenic polypeptide is referred to herein as its amino acid residue Defined as a polypeptide comprising in its sequence the sequence of amino acids defining the sp56 antigenic determinant Is defined. The sp56 antigenic determinant is a sp56 tag as described herein. It can be any part of the protein, which upon immunization, is sp56 protein Antibodies can be induced that are immunoreactive with the immunizing moiety. In the technical field of antibodies As is well known, antigenic determinants can be any of a variety of substances in terms of chemical composition and size. You may be. In the context of the present invention, a determinant has the sp56 sequence The polypeptide can be of various lengths, typically at least about 7 amino acids in length. From amino acids to large portions of 400-600 amino acid residues in length. Determinant The size of is intended to be limiting except to identify preferred embodiments. There is no. The present invention can be used alone or in combination in the composition of the present invention. Very diverse sp56 determinants derived from different parts of the sp56 protein Is described. The defined rules for polypeptides from these different parts of sp56 The use of defined groups offers different advantages that will be apparent to those skilled in the art. For example, sp56 Certain regions contain species-specific sequences (sss), which are specific species-specific immunizations. Provide an epidemiological response. Compositions restricted to these sss sp56 determinants are described as It causes infertility only in the target species and does not become a contraceptive in other species. is there Alternatively, other regions of sp56 are conserved in different mammalian species (homologous ) Sequence and thus serves as a universal immunocontraceptive determinant. In addition, The use of a combination of sp56 determinants in one composition can be a class of different immunocontraceptives (Battery) production and further features of the immunocontraceptive vaccine composition of the present invention. Give a sign. Immunocontraceptive vaccine compositions use a variety of substances to facilitate the purpose of the vaccine. Can be included. In addition to the antigenic polypeptide, the composition is well known in the art. Thus, pharmaceutically acceptable excipients, carriers, immunostimulants, antigenic molecules, Materials such as adjuvants, stabilizers and the like can be included. Also, the antigenic polypeptide A synthetic polypeptide comprising an sp56 antigenic determinant, which can be in various forms; Hybrid molecules, fusion proteins, recombinant proteins, chimeric polypeptide molecules, Forms such as isolated proteins are included. Synthetic polypeptides are described in detail below. Hybrid molecules have two domains Wherein the first polypeptide domain comprises an sp56 antigenic determinant. The second domain is carrier, representation, delivery, immunity It has different functions like stimulants or vehicles for synthesis. The second polypeptide domain has a variety of purposes, as described herein. can do. It is a carrier protein that adds bulk to the composition There can be. It can be used to add immunogenicity to vaccine compositions to bacteria or bacteria. Or a viral antigenic protein. It is expressed and / or Bacterial or viral structural tags to facilitate delivery to preselected formulations Can be compact. For example, tobacco mosaic The use of Lus (TMV) coat protein was expressed in tissues of TMV infected plants facilitates the spread of the sp56 antigenic determinant, thereby providing an active immunocontraceptive component Facilitate the production of contained feed. The second polypeptide stimulates an immune response It can be an active protein. Other functions included in the second polypeptide And it will be apparent to those skilled in the art. Preferred second polypeptide domains include cholera toxin subunit A, Cholera toxin subunit B, diphtheria toxin, influenza virus HA tan Protein, mouse leukemia virus coat protein, salmonella surface protein and protein Bako mosaic virus coat protein. These proteins are recombinant Well-characterized in the field of DNA technology, It is readily available for use in melapolypeptide molecules. Exemplary use Are described below. The first and second polypeptide domains of the hybrid molecule can be Can be more connected. Produced by recombinant DNA expression of a single polypeptide The first and second polypeptide domains comprise a single fusion protein. Operably linked by a peptide bond as described above. Fusion by recombinant DNA method Protein production is described below. When produced as separate polypeptides, the first and second polypeptides are: As is well known, they are operably linked by chemical cross-linking, the product of which is described herein. And is called a chimeric polypeptide molecule. The method of chemical cross-linking between polypeptides is Is well known in the chemical, protein and protein arts. Vaccine composition of the present invention Exemplary chimeric polypeptide molecules useful in products are described herein. You. As long as sp56 can be isolated from sperm, the substantially isolated sp56 Proteins can be used in the vaccine compositions of the present invention. Epididymis tissue Of isolating native (native) sp56 protein from sperm or semen , Will be described in Examples. The antigenic polypeptide having the sp56 antigenic determinant of the present invention may be prepared according to the present invention. It has various uses. Accordingly, the polypeptides of the present invention may comprise an epitope expressed by sp56. It is characterized by its ability to immunologically mimic (antigenic determinant). Such a polype The peptide is immunoreactive with a component in the immunocontraceptive vaccine composition, native sp56. As a component in the inoculum to make antibodies that Useful as an antigen. As used herein, "immunologically mimics" in various grammatical forms The phrase “the invention recognizes the sp56 epitope as defined herein Refers to the ability of an antigenic polypeptide of the invention to immunoreact with a clear antibody. The subject polypeptide has the sp56 as long as it contains the necessary sequences. It should be understood that the amino acid residue sequence need not be identical. C. sp56 protein and polypeptide The cDNA encoding the mouse sperm protein sp56 was constructed as described below. Quotes based on the mature processed protein Is described in Bookbinder et al., Science, 269: 86-89 (1995), the disclosure of which is incorporated by reference. Cloned and sequenced as described by It is a thing. Comparison between the known sequence and the encoded sp56 amino acid sequence For example, sp56 is a multiple of about 60 amino acids in length called the Sushi domain. A protein receptor containing a consensus repeat sequence, which is described in more detail below. Is considered a new member of the Super Family. Therefore, sp56 is Sufficiently similar to other proteins to allow for generalization in function, Ensure that the sp56 gene can be identified and isolated in any mammalian species. Therefore, mutations at both the amino acid and nucleotide sequence levels Although there may be 6 mammalian isolates, such mutations are limited. Is not to be interpreted as For example, allelic variation in a mammalian species Can tolerate a few percent difference between certain types of sp56 isolates. The difference consists of harmless mutant amino acid residues. Therefore, the disclosed s about 95% homology to p56 protein, preferably at least 98% homology The sex protein is considered an allelic variant of the disclosed sp56 protein, Therefore, it is considered to be the sp56 protein of the present invention. The complete coding nucleotide sequence of the mouse pre-prosp56 cDNA is Called Lone 7.1, 2026 nucleotides in length as set forth in SEQ ID NO: 1 And registered in GenBank as accession number U17108. Complete The cDNA clone encoding reprosp56 has a 1737 nucleotides length. Stands for open reading frame (ORF), which is a 32 amino acid N-terminal Side peptide, whose cleavage site is between amino acid positions -1 and +1. Thus, it corresponds to the cleavage site after nucleotide position 175 (SEQ ID NO: 1). A translation of this mouse cDNA sequence is shown at positions -32 to +547 of SEQ ID NO: 2. As shown, the unprocessed pre-prosp5 of 579 amino acid residues Encodes 6 proteins and is called mouse pre-pro sp56. Mouthpiece The amino acid sequence of Reprosp56 is shown in SEQ ID NO. Also described in No. 1. Processing from pre-pro sp56 to pro-sp56 is described in the Examples. Based on the experimentally determined amino terminus as described, a molecular weight of 62,000 dal Tons of protein of 547 amino acids. Amino acid residue of mouse pro sp56 The base sequence is shown in FIG. 1 and SEQ ID NO: 2 (starting at amino acid position 1 and ending at position 547. Shown). The prosp56 species is a highly basic of about 6,000 daltons (70 amino acids). Further processing by post-translational truncation of the carboxy-terminal tail As a result, a mature sp56 protein having a molecular weight of 56 kDa is obtained. Post-translation processing Phenotypic events can occur in motile sperm naturally or in epididymal sperm Oocyte ligands during treatment in a sexual agent and / or as discussed in the Background. Is thought to occur during receptor-specific binding to zona pellucida, zp3. Has been obtained. The mature sp56 amino acid residue sequence of 477 amino acids is shown in SEQ ID NO: 2, beginning with aspartic acid at position 1 and remaining at the cysteine at position 477 Ends with a group. This arrangement is also shown in FIG. As already introduced, the encoded sp56 amino acid sequence is Sp56, based on the presence of Sushi domain repeats, Are shown to be members of the superfamily of protein receptors. Professional The sp56 protein is a C4BP, C3b receptor, CR1 and CR2 receptor. It has considerable homology to proteins of the complement system such as ter. Complement proteins are As in sp56 of the present invention, when bound to another protein, It is known to exhibit a pacratic activity. Molecular cleavage is a conformation Has been shown to cause a change in it, which activates subsequent biological events Which is mediated by a single sperm acrosome for the sp56 case. Specific interaction with the resulting oocyte ligand, resulting in fertilization. As a member of the superfamily, sp56 has seven Sushi domains And six of them are contiguous, while the seventh is mouse sp56 Followed by a unique 44 amino acid intervening region. The coding intervening region is mouse s This region has been determined to be unique to the p56 cDNA, It is called a specific sequence and is also indicated as "sss". 70 amino acid basic cal At the boxy-terminal domain, the encoded pro-sp56 protein is completed. Seven The Sushi domain is shown by underlining the amino acid region in FIG. Sus The amino acid residue positions of the hi domain and the sp56 species-specific sequence Table 1 shows the corresponding cDNA region described in SEQ ID NO: 1. Table 1 Is presented in Example 2 and discussed in more detail. The Sushi domain is about 60 amino acids containing 10 substantially invariant amino acids. Consists of an acid stretch. FIG. 3 shows a typical Sushi domain, Here, 10 discontinuous amino acids (from amino terminal to carboxy terminal , Including C, P, Y, C, G, C, G, W, P, and C) And is located at a specific position in the sequence. About 50 remaining amino acids Demonstrate the diversity of nature. This general structure has the following features: 1) Two dislocations C1-C3 and C2-C4 forming a looped loop structure Sulfide bond; 2) at least one proline near each disulfide bond, which is continuous Provide the necessary strand turns for connection of the Sushi domain; and 3) Presence of G and W on internal hydrophobic loop. In the looped loop structure, there are both large loops and small loops, There is a stretch of hydrophobic amino acids in it. "Large loop" consists of C1 and C2 Consisting of a stretch of about 25-30 most charged amino acids between It is quite different within the superfamily, and because of its charged nature, Contributes significantly to protein receptor function of family members [Ichinose et al., J. Amer. Biol. Chem., 265: 13411-13416 (1990)]. Large and small loops Are called "ll" and "sl", respectively. In addition, Sushi domain 6 Have additional cysteine residues and therefore additional loops within the large loop It is characterized by doing. As such, the large loop is primed by cysteine residues. (Sh6fl) and the middle loop (Sh6ml). This The sequence of each of these is shown in Table 1. In line with the qualification as a member of the superfamily, sp56 species-specific domains Has no detectable homology to any other known protein and Possibility of secondary structure determined by disulfide bond because it does not contain in residues Or be eliminated. sp56 species-specific domain is composed of highly charged amino acids And that it exists outside the protein and is likely to be a B-cell epitope. And In computer simulations, the helix or beta sheet The next structure was not elucidated. Therefore, its unique sequence, probably the sp56 table Due to its surface location and lack of secondary structure, this domain of sp56 A hapten designed to induce a species-specific immune response specific to sp56 Represent good candidates. For generating the conserved domain and mature sp56 protein described above From the point of view of the cleavage site, similar cleavage patterns, three-dimensional structures and resulting Protein species are identifiable in other mammals, including humans. To the extent that the disclosure herein identifies sp56 from different mammalian species, The invention should be limited to sp56 proteins from one or a few mammalian species is not. Thus, the present invention is not limited to rDNA or natural sources. Biochemical purification of humans and other primates, rabbits, rats and mice Including rodents, ungulates, including dogs, cats and pigs, marsupials, and other mammalian species Mammalian sp56 protein or homologue that can be derived from any of a variety of species, including Investigate. Therefore, the term “homolog” is based on the amino acid residue sequence. Any sp56 protein or polypeptide having a similar three-dimensional structure Refers to tide. In other words, sp56 species of the invention have amino acid sequence similarity, The presence of the census Sushi domain, the presence of species-specific sequences, the overall secondaryity of the molecule And homologous molecules in terms of tertiary structure and similar physical parameters. Human and agriculturally related animal species are particularly preferred homologs of mouse sp56. It is. Exemplary sp56 species identified herein include mice, rats, , Rabbit, woodchuck, prairie dog, raccoon, deer and related Ungulates, kangaroos and human sp56. As mentioned above, sp56 is first produced in vivo in a precursor form and then Smaller polypeptides having biological activity as described herein Is processed to These different polypeptide forms are contemplated as useful To the extent possible, the term sp56 protein or polypeptide refers to sp56 All species of polypeptides having amino acid residue sequences derived from 56 genes Include. Accordingly, the sp56 protein of the present invention is described herein. As such, it can be in various forms depending on its use. Therefore, As used herein, "sp56 protein" and "sp56 polypeptide" The phrase "tide" is a preferred term corresponding to the portion of the mammalian sp56 protein of the present invention. Having the same amino acid residue sequence as the sp5 Refers to 6 molecules. Therefore, the present invention corresponds to the sequence of sp56 protein shown in SEQ ID NO: 1. A polypeptide having an amino acid residue sequence and, as described in Example 2, shown in Table 1. Sp56 comprising an amino acid residue sequence represented by a formula selected from the group consisting of: Polypeptides are also contemplated. In this embodiment, the polypeptide is an sp56 Has the ability to mimic a pitope, thereby being described herein and in the background Inhibiting the biological activity of sp56 as described above is further characterized. Due to the three-dimensional structure of the native folded sp56 molecule, the present invention It is contemplated that multiple regions of p56 are involved in sp56 receptor function, The various regions of number are defined by the various sp56 polypeptides described above. Rece The ability of the above-described polypeptides to inhibit Pter-ligand binding is demonstrated in the Examples As discussed more fully, assays for infertility, the presence of anti-sp56 antibodies Immunochemical analysis, sperm-egg along with in vivo methods including detection and the like In vitro binding assays, including binding assays and the like, It can be easily measured. Thus, in another aspect, the present invention provides for multiple contacts of the sp56 receptor. Promotes immunocontraception, which are combined in combination to give simultaneous inhibition of the site Different sp56 polypep as described above, thereby inhibiting sp56 receptor function Sp56 polypeptide compositions comprising one or more tides are contemplated. Preferred sp for use as an antigenic polypeptide in an immunocontraceptive vaccine composition The 56 proteins and polypeptides are shown in Table 1 of Example 2. Preferred sp56 The proteins include pre-pro sp56, pro sp56 and mature sp56. No. Preferred portions of sp56 include each complete Sushi domain and And the defined large and small loops (in the large loop of Sushi domain 6) (Including alternative loops formed). Particularly preferred sp56 polypep Ptides include species-specific sequences and fragments thereof as shown in Table 1. It is. In view of various forms of the sp56 protein of the present invention, sp56 protein and po Ripeptides can be obtained in a variety of ways. In one embodiment, s p56 can be isolated from natural tissues such as testis. Biochemical purification An exemplary method for the isolation of sp56, including and affinity purification, is described in Example 1 It describes in. Alternatively, sp56 of the present invention is a recombinant protein, ie, as described herein. It can be produced by such a recombinant DNA (rDNA) method. Recombinant production methods result in isolated or substantially pure receptor compositions. A preferred means of producing material for further purification is to use recombinant sp. 56 protein is not necessarily substantially equivalent to be useful in certain embodiments. It need not be pure or even isolated. Recombinant sp56 The protein is present on or in a mammalian cell line or in a crude extract of a mammalian cell line. May exist. In other embodiments, the recombinant sp56 protein is a feed or feed. On a plant or plant cell line for subsequent use in delivery means Or produced therein. Production of sp56 protein of the invention in this context Preferred expression vector systems for are described in Section E. In one embodiment, the sp56 protein is purified by sp56 reagent purity and pharmacology. The degree of protein-freeness of the diagnostic and therapeutic methods described herein Substantially contains other proteins or peptides to give use in the method Absent. Biochemical purification methods from natural sources should also be contemplated as described above. However, recombinant production methods are ideally absolutely pure in this regard. Suitable for producing In this regard, the sp56 protein has ligand binding. Pharmaceuticals in traditional screening assays for combined or biological activity If there are not enough other molecules present so that no cross-reactivity is detected, virtually no Contains no other protein molecules. In addition to the isolated and recombinant sp56 proteins, the present invention relates to sp56 proteins. Also considers Park analogs. Analogs have immunological reactivity, ligand binding ability, etc. Or the sp56 protein of the invention for similar functional properties of the sp56 protein of the invention. It is an artificial mutant that exhibits properties. Therefore, to name a few examples, analog Can be the cleavage product of sp56, and the poly- A sp56 polypeptide from which the membrane anchor has been removed. Mutation sp56 in which several amino acid residues have been changed It can be an array. The sp56 polypeptide has approximately 200 amino acid residues in length for ease of synthesis. Preferably it does not exceed. Therefore, when the production method by synthesis is used, s More preferably, the p56 polypeptide does not exceed about 150 amino acid residues. More preferably no more than about 65 residues, and most preferably 30 amino acids in length. Less than acid. The subject sp56 polypeptide is a polypeptide that mimics an epitope of sp56. The amino acid sequence provided herein is as long as And any analogs, fragments or chemical derivatives of the polypeptide. Thus, the polypeptides of the invention have such alterations in their use. Subject to various modifications, substitutions, insertions, and deletions to provide certain advantages be able to. In this regard, the sp56 polypeptides of the present invention may comprise Rather than being identical to the sequence of the protein, Further modifications have been made to elicit antibodies immunoreactive with the sp56 polypeptides of the invention. Retain the ability to guide. Thus, the term "analog" is specifically indicated herein. Has substantially the same amino acid residue sequence as the An antibody described herein that is conservatively substituted with a functionally similar residue. Includes any polypeptide that exhibits the ability to induce production. Examples of conservative substitutions One non-polar, such as isoleucine, valine, leucine or methionine. Substituting an acidic (hydrophobic) residue with another, between arginine and lysine, gluta One polarity (hydrophilic) as between min and asparagine, between glycine and serine ) Replacing a residue with another, such as lysine, alkynine or histidine Replacing one basic residue with another, or aspartic acid or Replacing one acidic residue, such as glutamic acid, with another. The phrase "conservative substitution" refers to such polypeptides that exhibit the required binding activity. Use chemically derived residues instead of non-derived residues. And also included. A “chemical derivative” is one or more chemically derived by reaction of a side chain functional group. Refers to a subject polypeptide having more residues. With such derived molecules For example, amine hydrochloride, p-toluenesulfonyl group, carbobenzoxy group To form a t-butyloxycarbonyl group, a chloroacetyl group or a formyl group As described above, a molecule from which a free amino group is derived. Free carboxy The radicals may be salts, methyl and ethyl esters or other types of esters, or It may be induced to form hydrazides. Free hydroxyl groups are Or an O-alkyl derivative. Histi Imidazole nitrogen is induced to form N-im-benzylhistidine It may be. Further included as chemical derivatives are 20 types of There are peptides that contain one or more natural amino acid derivatives of a standard amino acid. For example, proline may be substituted with 4-hydroxyproline, Lysine may be substituted for lysine, and 3-methylhistidine may be substituted for histidine. May substitute for serine with homoserine, or lysine with ornithine. It may be replaced. D-amino acids can also replace one or more L-amino acids. May be included. The polypeptides of the present invention also maintain the required activity. Insofar as the sequence is compared to the sequence of the polypeptide provided herein, Any polypeptide having one or more additions and / or deletions Include. The term "fragment" refers to a polypeptide that indicates the amino acid residue sequence herein. Any subject polypeptide having an amino acid residue sequence shorter than the sequence of the polypeptide Point. The polypeptide of the present invention has a sequence that is not identical to the sequence of the sp56 polypeptide. If so, it typically involves one or more conservative or non-conservative substitutions. And usually does not exceed about 30% (number percent), more usually 20% Not more than 10 and preferably not more than 10% of the amino acid residues are replaced I have. Additional residues may also be added at either end to provide a "linker". The polypeptides of the present invention may be labeled or solid matrices. Rix or a carrier can be conveniently fixed. Preferably, Anker residues do not form the sp56 epitope, ie, sections B and And D, do not resemble the sp56 protein in structure. Any peptide of the invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt . Suitable acids capable of forming salts with the peptides of the present invention include hydrochloric acid, bromide Inorganic acids such as hydrochloric, perchloric, nitric, thiocyanic, and sulfuric horic acetic acid), propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, oxalic acid, Malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, anthranilic acid, cinnamic acid, naphtha Examples include lensulfonic acid and sulfanilic acid. Suitable bases capable of forming salts with the peptides of the present invention include hydroxylamines. Inorganic bases such as thorium, ammonium hydroxide, potassium hydroxide and the like; and , Di- and trialkyl and allylamines (eg, triethylamine, Isopropylamine, methylamine, dimethylamine, etc.), optionally substituted Ethanolamine (for example, ethanolamine, diethanolamine, etc.) Organic bases. The sp56 polypeptides of the present invention are also referred to herein as subject polypeptides. The synthesis by any technique known to those skilled in the art of polypeptide technology. May also include recombinant DNA technology, as described above. Solid phase merif Synthetic chemistry techniques, such as field synthesis, provide purity, antigen specificity, and unwanted by-products. This is preferable because of the absence of a product and the ease of production. Many technology advantages available The summarized summary is described in J. P. for solid phase peptide synthesis. M. Steward and J. D. Young, “S olid Phase Peptide Synthesis ", WH Freeman Co., San Francisco, 1969; M . Bodanszky, et al., “Peptide Synthesis”, John Wiley & Sons, Second e dition, 1976; Meienhofer, “Hormonal Proteins and Peptides”, Vo l. 2, P. 46, Academic Press (New York) 1983; Schroder and K. Kubke, "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 Each of which can be found and is hereby incorporated by reference. like this Suitable protecting groups that can be used in various syntheses are described in the texts above and in J. Am. F. W. McOmie, “Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, New York, 1973, which is incorporated herein by reference. Generally, contemplated solid phase synthesis methods involve one or more amino acid residues or amino acid residues. Continuous addition of appropriately protected amino acid residues to the growing peptide chain Including. Usually, either the amino or carboxyl group of the first amino acid residue Protect with a suitable selectively removable protecting group. Contains reactive side groups such as lysine For amino acids, different protecting groups that can be selectively removed are used. Using solid-phase synthesis as an example, protected or derived amino acids can be Attaching to an inert solid support through unprotected carboxyl or amino groups To wear. Then, the protecting group for the amino group or the carboxyl group is selectively removed. In the sequence with the corresponding (amino or carboxyl) group suitably protected Mixes the following amino acids to form an amide bond with the residue already attached to the solid support Under conditions suitable for the reaction. Then, the newly added amino acid residue Amino or carboxyl protecting groups are removed from the Protected) and continue as well. All desired amino acids are in the correct sequence And any remaining terminal and side chain protecting groups (and solid support ) Are removed sequentially or simultaneously to obtain the final polypeptide. The sp56 polypeptide is particularly useful in body samples in the diagnostic methods and systems of the present invention. Used to detect sp56 receptor or sp56 itself present in Or of an antibody that immunoreacts with a conserved epitope on sp56. Can be used to prepare inoculum described herein for preparation . Furthermore, certain of the sp56 polypeptides of the present invention may be used in the therapeutic methods of the present invention. And used to inhibit the function of sp56 as further described herein. be able to. Labels, solid matrices that can be used with the polypeptides of the invention And the carrier are described below. Amino acid residue linkers are usually at least one residue and no more than 40 residues. Group, but more often from 1 to 10 residues, Does not form a toup. Typical amino acid residues used for ligation are Cysteine, lysine, glutamic acid and aspartic acid. further The subject polypeptide has a terminal NH unless specified to the contrary._TwoReed Acetylation, or thioglycolic acid amidation, for example, Modified by terminal carboxyamidation using monia, methylamine, etc. Depending on the sequence, it may differ from the native sequence of the sp56 protein. What is known in the art as a carrier hapten conjugate Sp5 of the present invention when coupled to a carrier to form Six polypeptides can induce antibodies that immunoreact with sp56. did Thus, in view of the well-established principle of immunological cross-reactivity, the present invention Antigenically related variants of the polypeptides set forth in the text are contemplated. "Antigenically related variants" refers to the polypeptides described herein and the subject Subject matter capable of inducing an antibody molecule immunoreactive with the sp56 protein of the invention It is a repeptide. D. sp56 fusion protein In one aspect, the invention relates to use in an immunocontraceptive vaccine composition. And other methods in which the determinants are useful as disclosed herein. A fusion protein comprising the antigenic polypeptide of the invention for use in . The fusion protein comprises a first polypeptide operably linked to a second polypeptide domain. A polypeptide domain, wherein the first polypeptide domain The amino acid residue sequence containing the antigenic polypeptide of Contains the array to define. The second polypeptide domain is any poly Functions and advantages which may be peptide sequences but are preferably in fusion proteins I will provide a. Exemplary functions are as a carrier, as a presentation structure, as a fusion protein. Associated with larger structures such as assembled virions Immune stimuli, such as proteins, that enhance the immune response as binding moieties for controlling As an agent, as an antigenic molecule (eg, to promote a stronger immune response) Adjuvants include acting and similar functions. The present invention Is found to be restricted with respect to the function of the second polypeptide domain There is no. Operably linked means that for a fusion protein, two separate genes are simply combined. Recombinant DNA (rDNA) method that fuses into one open reading frame By the characteristics of rDNA expression of a single polypeptide from a gene created from The resulting two polypeptides form two amino acids in the protein, regardless of order. Means linked by a normal polypeptide bond found between the acids I do. The order of the first and second domains in a single polypeptide depends on the polypeptide. It need not be continuous with respect to the amino and carboxy termini of the peptide, Or any of the second domains is amino-terminal, or vice versa be able to. A preferred fusion protein comprises a cholera toxin protein as the second polypeptide domain. Bunit A, cholera toxin subunit B, diphtheria toxin, influenza Ils HA protein, mouse leukemia virus coat protein, Salmonella surface Protein, and tobacco mosaic virus coat protein It has an array that Exemplary fusion proteins are described in the Examples. Fusion proteins are well-known rDNA for manipulation and expression of recombinant gene products. Produced by the method. Various vectors and host systems for expression of fusion proteins Any of the above may be used, provided that the expressed fusion protein from the host expression system is Determine the recovery and purification pathways. Bacterial, yeast and plant expression systems are preferred. A plant expression vector combines the produced fusion protein with a plant substance in the feed or feed. It is particularly preferred when both are to be formulated. These are referred to herein as Describe. E. FIG. Vectors for expression of sp56 protein and fusion protein The sp56 protein of the present invention can be used in mammalian cells using an rDNA expression vector. Although expression is preferred, it can be prepared by various means. Recombinant sp56 Exemplary production methods for are described in the Examples. Therefore, the present invention relates to fusion proteins as intact sp56 proteins. Or as a smaller polypeptide fragment of sp56 Also provided is a method for producing an isolated sp56 protein. The production method of the present invention generally comprises Inducing cells to express the sp56 protein of the present invention. Recovering the sp56 expressed from the cells, Purification by fractionation, using the specific antibodies of the invention, or by other chemical procedures. Manufacturing process. Induction of recombinant sp56 protein expression triggers sp56. The sp56 protein of the present invention, which is an rDNA that can be expressed, or a flag thereof Inserting the rDNA vector encoding the fragment into a suitable host cell; and And expressing the sp56 gene of the vector. Therefore, expression of the recombinant sp56 protein or fusion protein of the present invention is not possible. To facilitate, the DNA segment encoding sp56 or a portion thereof is Insert into expression vector. The DNA segment encodes the sp56 protein of the present invention. And the DNA sequence to be encoded. That is, the DN of the present invention The A segment is characterized by the presence of some or all of the sp56 structural gene. Good More preferably, the above gene has the amino acid residue at which each codon is found in the sp56 protein. A series of uninterrupted linear codons encoding the group, i.e., containing introns. It exists as a gene that cannot be found. One of the preferred embodiments defines the sp56 protein as defined herein. A DNA segment that encodes the amino acid residue sequence. Can express the sp56 protein of the present invention. Preferred DNA Seg Is substantially the same as the amino acid residue sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a portion thereof; And preferably encodes an amino acid residue sequence consisting essentially of it. In particular A preferred DNA segment is a nucleotide sequence derived from the sequence shown in SEQ ID NO: 1. With columns. Representative and preferred DNA segments are further described in the Examples. And listed in Table 1. Homologous DNA and RNA sequences encoding the above sp56 proteins are also contemplated. Is done. The amino acid residue sequence of a protein or polypeptide is Directly related to the deoxyribonucleic acid (DNA) sequence of the structural gene encoding the protein I do. Thus, a structural gene or DNA segment is Amino acid residue sequence, i.e. as defined for proteins or polypeptides it can. An important and well-known feature of the genetic code is its duplication. That is, tampa For most amino acids used to make Tide triplets (codons) encode specific amino acid residues (ie, can do. Therefore, many different nucleotide sequences may May encode the amino acid residue sequence of Such a nucleotide sequence Functionally because it results in the production of the same amino acid residue sequence in all organisms Are considered equivalent. Often purine or pyrimidine methylated variants May be incorporated into a given nucleotide sequence. But such methyl The transformation does not affect the code relationships anyway. The nucleic acid is a polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide , That is, RNA, DNA, or an analog thereof. Any polynucleotide or nucleic acid fragment, whether or not You. In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule is a segment of double-stranded DNA, i.e., It is a form of a DNA segment. However, in certain molecular biological methodologies Preferably, single-stranded DNA or RNA is used. DNA segments are numerous, including chemically synthesized and recombinant approaches. Cloning or polymerase chain reaction Reaction (PCR) is preferred. DN encoding the sp56 protein part The A segment can be prepared by chemical techniques, for example, Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc., 103: 31. 85-3191, 1981) using the phosphotriester method or the automated synthesis method. Can be synthesized. In addition, long DNA segments can Synthesis of defined oligonucleotide groups, followed by hives Well-known, such as re-ligation and concatenation to build complete segments It can be easily prepared by the method. Alternatively, a pair of oligonucleotides Isolation of preferred DNA segments by PCR using nucleotide primers No. Of course, by chemical synthesis, the native Any desired modifications can be made by substituting the base encoding the amino acid residue sequence. Can be achieved. Furthermore, D is substantially composed of a structural gene encoding sp56 protein. The NA segment is a recombinant D containing the gene defining the sp56 protein of the present invention. NA molecules, followed by, for example, site-specific or random Mutations can be made to introduce desired substitutions. 1. Cloning of sp56 gene The sp56 gene of the present invention can be obtained from any mammal by various cloning methods. Can be cloned. A sp56 homolog can be obtained by cloning. Means that sp56 is a protein receptor characterized by the presence of a conserved domain It is based on the observation that it is one of All sp56 remains Gene cloning is performed by the general method described in the Examples using a nucleic acid homology strategy. Can be performed. Preferred proteins for isolating nucleic acid molecules encoding sp56 proteins of the invention The roning method is described in the Examples, and contains the sp56 gene of interest. Polynus useful for screening libraries of contemplated nucleic acid molecules Includes a detailed description of nucleotide probes. Especially for isolating the human sp56 gene Preferred probes are described in Example 6. A library source for cloning the sp56 gene of the present invention Of cDNA library from tissue believed to express sp56 Genomic DNA or messenger RNA (mRNA). preferable The tissue is testis tissue. 2. Expression vector The present invention relates to a method for encoding a sp56 protein, as described herein. Recombinant DNA molecules (rDNA) containing the following DNA segments are contemplated. rD NA is obtained by operably linking a vector to a DNA segment of the present invention. Can be generated. As used herein, the term "vector" refers to an autonomous replication in a cell. DNA molecule that can be produced, other DNA segments Operably linked to a vector to effect replication of the fragment. Gene generation A vector adapted for expression of a product and capable of directing the expression of sp56, In the description, it is referred to as “expression vector”. Thus, recombinant DNA molecules are usually Contains at least two nucleotide sequences that are not found together in nature And hybrid DNA molecules. The selection of a vector operably linked to the DNA segment of the present invention depends on this technique. As is well known in the field, desirable functional properties, such as protein expression and And directly depends on the host cell to be transformed, these construct recombinant DNA molecules It is an inherent limitation in technology. However, the vectors contemplated by the present invention are: At least included in a DNA segment operably linked to the vector. The replication, and preferably also the expression, of the sp56 structural gene can be directed. . Both prokaryotic and eukaryotic expression vectors are used in vector construction. Well known to those skilled in the art, Inuse Protocols in Molec by Ausebel et al. ular Biology [Wiley and Sons (New York) (1993)] and Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]. In one aspect, the vectors contemplated by the invention include a prokaryotic replicon, That is, in a prokaryotic host cell, such as a bacterial host cell, transformed thereby. Capable of directing the maintenance and autonomous replication of recombinant DNA molecules outside the chromosome DNA sequences. Such replicons are well known in the art. I have. Also, in embodiments that include a prokaryotic replicon, the expression thereof may be And genes that confer drug resistance on a given bacterial host. Typical bacterial medicine Drug resistance genes are genes that confer resistance to ampicillin or tetracycline. It is a messenger. Vectors containing prokaryotic replicons are also more efficient than E. coli transformed thereby. Directs sp56 gene expression (transcription and translation) in bacterial host cells such as Including a prokaryotic promoter. The promoter is an RNA polymerase Expression control formed by a DNA sequence that allows binding and transcription to occur It is your element. Promoter sequences compatible with bacterial hosts are typically those of the present invention. Plasmid vector containing convenient restriction sites for insertion of DNA segments Provided inside. A typical such vector plasmid is BioRad ・ Laboratories (Biorad Laboratories) (Richmond, CA) PUC8, pUC9, pBR322 and pBR329, available from PR available from Invitrogen (San Diego, CA) SET and Pharmacia [Piscatawe, NJ] PPL and pKK223 available from Piscataway. An expression vector compatible with eukaryotic cells, preferably an expression vector compatible with vertebrate cells. Vectors can also be used to form the recombinant DNA molecules of the present invention. Eukaryotic Cell expression vectors are well known in the art and are available from several commercial sources. Available from Typically, such vectors contain the desired DNA segments. Provided with convenient restriction sites for insertion of the target. Typical Such vectors include pSVL and pKSV-10 (Pharmacia), pBPV- 1 / pML2d [International Biotechnology Inc. Ted (International Biotechnologies, Inc.)], pTDT1 (ATCC # 31 255), pRc / CMV (Invitrogen, Inc.), preferred A vector, pcDNA3 (Invitroken) described in the Examples, And similar eukaryotic expression vectors. Other expression systems that can be used to express the proteins of the invention include insect systems. It is. In one such system, Autographa California (Autograp ha californica ) Nuclear polyhedrosis virus group (AcNPV) expresses foreign gene Used as a vector for The virus is Spondoptera Fulgi Perda (Spondoptera frugiperda) Grow in cells. Polypeptide The nucleotide sequence to be coded is a non-essential region of the virus [Spondoptera frugipe. Le For example, in the case of the polyhedrin gene, Under the control of an AcNPV promoter (eg, a polyhedrin promoter) It is. Successful insertion of a nucleotide sequence encoding a polypeptide will The drin gene and non-occluded recombinant virus (ie Virus that lacks the protein coat encoded by the drin gene) Inactivates production. These recombinant viruses then produce the inserted gene. Used to infect the cells that appear. Smith et al. Biol. Chem. 46 rolls , 584 (1983), U.S. Patent No. 4,215,051 to Smith. . Mammalian cells using recombinant viruses or viral elements to direct expression The system can be operated. For example, when using an adenovirus expression vector, If the coding sequence for the polypeptide is an adenovirus transcription / translation control complex, such as Can be ligated to the late promoter and tripatite leader sequence . This chimeric gene can then be transformed by adenovirus by in vitro or in vivo recombination. Can be inserted into the lus genome. Non-essential regions of the viral genome (eg, region E1 or Indicates that the insertion at E3) is viable in the infected host Resulting in a recombinant virus that can express Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81: 3655-3659 (1984)]. other For example, the 7.5 K promoter of vaccinia virus may be used [eg, M Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 7415-7419 (1982); J. et al. Virol., 49: 857-864 (1984); Proc. Natl. Acad. S ci. USA, 79: 4927-4931 (1982)]. Of particular interest are Bovine papillomavirus-based vector capable of replicating as an extrachromosomal element [Solver et al., Mol. Cell. Biol., 1: 486 (1981)]. To mouse cells Immediately after this DNA insertion, the plasmid contains approximately 100-200 copies per cell. Replicated up to. Transcription of the inserted cDNA results in transfer of the plasmid to the host chromosome. No integration is required, which results in high expression. These vectors are By including a selectable marker such as the neo gene in the rasmid, Can be used for stable expression. Alternatively, the retroviral genome can be Introduce a polypeptide-encoding nucleotide sequence into the cell and direct its expression Can be modified for use as a vector that can be used [Cone & Mulligan According to Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6349-6353 (1984)]. High expression The metallothionine IIA promoter and heat shock Using an inducible promoter, including but not limited to a promoter, Can be achieved. For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression is preferred. C Rather than using an expression vector containing the viral origin of replication, Expression control elements (eg, promoter and enhancer sequences, CDNA and selectivity controlled by the terminator, polyadenylation site, etc.) It can be transformed with a marker. Selectivity in recombinant plasmids as described above The marker confers resistance to selection and allows the cell to place the plasmid in its chromosome. Allows for stable integration, growth and formation of focus, The cass can be cloned and expanded into cell lines. For example, following the introduction of the foreign DNA, the engineered cells may be incubated for 1-2 days in enriched media. (Enriched medium) and then can be switched to a selective medium. many A selection system can be used, herpes simplex (herpes) virus thymidine kinase [W igler et al., Cell, 11: 223 (1977)], hypoxanthine-guanine phosphoribo Siltransferase [Proc. Szybalska and Szybalski. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962)] and adenine phosphoribosyl transferer (Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980)) gene (tk-, hgprt, respectively) -Or aprt- cells). Not determined. In addition, antimetabolites resistance conferring genes such as methotrexate The dhfr gene that confers resistance to [Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 77: 3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1 527 (1981)]; gpt gene that confers resistance to mycophenolic acid [Mulli Proc. gan and Berg. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981)]; Amino The neo gene that confers resistance to glycoside G-418 [Colberre-Garapi J. from n et al. Mol. Biol. 150, 1 (1981)]; and The hygro gene that confers resistance to hygromycin [Santerre et al. Gene, 30: 147 (1984)] can also be used as a basis for selection. In recent years, others Selectivity gene, that is, cells use indole instead of tryptophan TrpB that allows cells to use histinol instead of histidine HisD [Hartman and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 85: 804 (1988)]; and ornithine decarboxylase inhibitors, 2- ( Difluoromethyl) -DL-ornithine, O that confers resistance to DFMO DC (ornithine decarboxylase) [McConlogue L., In: Current Communica Editions in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory (1987)] It is listed. In another preferred embodiment, the expression vector is compatible with use with plant cells. Is used to express sp56 in plants. The plant is Universally accessible proteins that can be isolated or ingested in the plant In recent years, large quantities of bulky (bulk) protein can be easily supplied from plants. Provides advantageous expression and delivery aspects. Thus, the recombinant sp5 of the present invention Transgenic plants containing an expression vector for encoding 6 proteins Produces sp56 antigenic polypeptide for use in immunocontraceptive vaccine compositions Useful for. Typical expression vectors useful for the expression of genes in plants are described in the art. Well known in the field. The gene encoding sp56 is implanted via an expression vector. Typical methods for introduction into an organism include Agrobacterium tumefaciens (Ag robacterium tumefaciens) vehicle transformation, plant virus transfection , Protoplast transformation, gene transfer into pollen, injection into reproductive organs Implantation, injection into immature embryos, and a method called "biolystics" Some direct insertions are involved. In the case of infection by a plant virus, the sp56 protein Produced in high concentration, can be isolated at low cost, gene stock And is easily maintained for a long time without going through. Plants suitable for such expression have expression vectors compatible with the plant And delivering the sp56 immunocontraceptive antigen polypeptide of the invention to a mammal. And plants that can be used for the above. Examples of plants include dicots and monocots included. Particularly preferred plants include alfalfa, tomato, petunia, Soy, tobacco, corn, wheat, rice, spinach, asparagus, etc. . Examples of expression vector systems for expression of the sp56 recombinant protein of the present invention include rice No. 5,202,422 and Plant Molecular Biology Manu by An et al. al, A3: 1-19 (1988), Agrobacterium tumefacien Such as a binary vector system that uses More herein incorporated by reference. Other preferred plant vector systems include those described by J. Freed and Carrington. Virol., 64: 1590 (1988). Those Is a sp56 in-frame recombinant operably linked to an expression control sequence. DNA segment, which is then implanted as a single fragment. Product expression vector, which is then introduced into the selected plant It is called a shuttle vector. The pRTL2 vector is Remove the GUS coding sequence from pRTL-GUS and replace it with the desired code It is derived from pRTL-GUS by replacing the sequence. Described in the examples Thus, the GUS sequence replaces the gene encoding the α or β chain of cholera toxin. And provides expression of a fusion protein comprising the sp56 protein of the present invention. . pRTL2 vector mediates sp56 expression in plant expression vectors Having the following elements that are useful as shuttle expression elements for: 35S promoter derived from the 35S transcript gene of Zyk virus, translation Tabacco etch virus untranslated leader, useful as an enhancer Sequences and caliphs to direct polyadenylation of transgene transcripts 35S polyadenyl at the 3 'end of the 35S transcript gene of Lawr mosaic virus Array. The elements are a single cassette isolated by HindIII restriction digestion. Created in the shape of Cholera gene system / contains control elements with sp56 coding region Having the isolated fragment thereof followed by a preferred plant such as pGA482. Insert into an expression vector [Plan Molecular Biology Manual by An et al., A3: 1-1 9 (1988)]. Next, the recombinant plant vector is transformed into a plant virus. And then using the plant virus, such as tobacco or alfalfa Infect plants. A preferred plant virus is Agrobacterium (Agrobact erium) strain LBA4404. A more preferred plant delivery expression system is a modified tobacco mosaic virus (TMV), the TMV coat protein-sp56 key on the surface of TMV Directs synthesis of a melapolypeptide molecule. Autoantibody response to mediate immune contraception A method of using this system to elicit an answer is described in Fitchen et al., Vaccine, Vol. 13, 10 It is listed under Members 51-1057 (1995). The authors have been delivered parenterally. Hybrid molecule having oocyte-derived antigen used as immunogen Are described. TMV assembles into rod-shaped particles, which are then Is a self-assembled virus that accumulates in leaves infected with It is the original carrier molecule. The protein component of the aggregated particles is a coat protein (c p), in which a non-TMV epitope is inserted in the carboxy-terminal part. infection And after expression, the TMV cp and the assembled TMV particles are themselves immunogenic. While providing an antigenic system that delivers antigenic epitopes. Court tongue Park is easily isolated and exists in granular or aggregated form. This situation is Effective parenteral or oral administration of high concentrations of antigens as described in Provides benefits for immunization. Preparation of exemplary TMV-sp56 chimeric polypeptide molecules of the invention is described in the Examples. Described in 3. Other preferred plant expression vector systems include pMON530 [Metho by Rogers et al. ds in Enzymol., 153: 253 (1987)], pKLYX5, 6, 7 series [Schardl et al. Gene, 61: 1 (1987), and Clontech (California) (Palo Alto). F. Methods of immunocontraception The present invention provides a method for immunization by eliciting an immune response against sperm sp56 protein. Contraceptive vaccine compositions useful for inducing infertility in a class are contemplated. Of the present invention The vaccine composition comprises a physiologically acceptable excipient as an active ingredient therein. An antigenic polypeptide comprising the antigenic sp56 of the present invention dissolved or dispersed in Both can be contained. As used herein, "pharmaceutically (pharmaceutical) acceptable" "physiologically acceptable" The term `` acceptable '' and their grammatical inflections refer to their composition, Used interchangeably, referring to rear, diluent and agent Without the occurrence of undesirable physiological effects such as nausea, dizziness and stomach upset Indicates that the substance can be administered to a mammal. Preparation of a pharmaceutical composition containing the active ingredient dissolved or dispersed in the pharmaceutical composition Are well known in the art. Typically, such compositions are intended for administration. Formulated by the route shown. As oral immunocontraceptives, typically the present invention Is contained in a feed or feed. On the other hand, the target (direct, Vaccines), the antigenic polypeptide may be combined with a liquid solution or onion suspension. Prepared as an injectable solution, but suitable for liquid solutions or suspensions before use. Solid forms can also be prepared. The preparation can also be emulsified. Active antigenic polypeptides for use in the therapies described herein In a suitable amount, it can be mixed with excipients which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient . Suitable excipients are, for example, water, saline, glucose, glycerol, ethanol, etc. And combinations thereof. Also, if desired, the composition can contain small amounts of Auxiliary substances such as wetting agents, emulsifiers, pH buffers, etc., which increase the effect of the active ingredient. Can be contained. The vaccine composition of the present invention contains a pharmaceutically acceptable salt of the component. Can be. Pharmaceutically acceptable salts include, for example, inorganic salts such as hydrochloric acid or phosphoric acid. Use acids or organic acids such as acetic acid, tartaric acid, and mandelic acid Acid addition salts (formed by the free amino groups of the polypeptide) You. Salts formed with free carboxyl groups include, for example, sodium hydroxide, hydroxide Inorganic like potassium, ammonium hydroxide, calcium hydroxide or iron hydroxide Base, and isopropylamine, trimethylamine, 2-ethylaminoethano , Histidine, procaine and the like. Physiologically acceptable carriers are well-known in the art. Liquid key An example of a carrier is one that contains no substance besides the active ingredient and water, Includes buffering agents such as sodium phosphate, physiological salt solution or both at H value Sterile aqueous solutions such as phosphate buffered saline. Still further, an aqueous cap Rear is sodium chloride, potassium chloride, glucose, polyethylene glycol And, like other solutes, may contain more than one buffer salt. Liquid compositions may also contain a liquid phase, with or without water. That's it Examples of such additional liquid phases include glycerin, vegetable oils such as cottonseed oil, and water-oil oils. There is Marjon. The immunocontraceptive composition can be used in an immunized mammal after one or more immunizations. For effective in eliciting an immune response containing an anti-sp56 antibody. It contains a certain amount of the sp56 antigenic determinant. The route of immunization is further described herein. As described, can vary, but is effective in eliciting an immune response Affects the preparation of compositions containing the necessary amount of the sp56 antigenic determinant. did Thus, an effective amount is an anti-sp56 antibody upon administration by a suitable and contemplated route. Is an amount that induces the production of Repeated immunizations may be used, which involve the Enables low concentration. Thus, in one aspect, the invention resides in the mammalian sperm to be treated. An immunocontraceptive vaccine composition as described herein containing an sp56 antigenic determinant A method of immunocontraception in a mammal or human, comprising administering to a mammal . The antigenic polypeptide is administered via a typical administration route which can vary as described herein. After passage, present in the composition in an amount sufficient to elicit an anti-sp56 antibody response. I do. The efficacy of the vaccine was determined by the presence of anti-sp56 antibodies in the serum of treated mammals. Or the fertility of sperm produced by the treated mammal It can be determined by measuring. Immunocontraceptive vaccine compositions are conventionally administered intravenously, subcutaneously, intramuscularly or intraperitoneally. However, in many preferred embodiments, it is administered orally in a feed or feed. The composition may be used in an immunotherapeutic manner in a manner compatible with the dosage formulation. Is administered in an effective amount. The amount administered will depend on the subject being treated and the active ingredient. Depends on the absorptive capacity of the subject system and the desired degree of immune response. Administered The exact amount of active ingredient that needs to be determined depends on the judgment of the practitioner or practitioner. And is unique to each individual. However, dosage ranges suitable for systemic administration are described herein. And depends on the route of administration. Initial and additional doses Suitable forms for administration can also vary, but typically after the first administration, the next injection or Repeated doses at one hour or more intervals by other administration methods. Preferably, the antigenic polypeptide of the invention is in isolated form, i.e. At least about 0.1% by weight of the total composition, preferably at least 1%, more preferably Or at least about 10% is present in the composition. For use in blended compositions Particularly preferred for this is a substantially pure preparation of the antigenic polypeptide, i.e. At least 90% by weight, before mixing into the composition of the invention, More preferably at least 99% by weight of the preparation. Chemical properties of polypeptides Biochemical methods useful for the concentration and preparation of isolated polypeptides based on Well known and customary for the production of proteins enriched in more than 99% by weight Can be used for The most important use of the present invention is for the production of wild pest mammal populations such as rodents and the like. Formulation for the vaccine composition of the invention wherein the use of feed or feed is controlled It is particularly useful as Therefore, the preferred route of administration is oral It is a route. The composition can include botanicals or other carriers, Therefore, preferred carriers are non-toxic edible carriers. You. Food and feed distribution to pellets, capsules, tablets, food bars, etc. In general, those skilled in the agricultural arts are well-known and do not limit the invention. I do not think. Particularly preferred formulations include recombinants for the production of antigenic polypeptides in plants. The use or inclusion of a DNA expression vector, depending on its use, Plant harvest, thereby providing a vaccine formulation. Exemplary A method comprising an expressible gene encoding the antigenic polypeptide of the present invention. Preparation of transgenic plants is included. In addition, plants are antigenic polypep Can be infected with a viral vector containing and engineered to express You. In a preferred embodiment described herein, infection of the plant and feeding or feeding Of antigenic polypeptides in plant material that is ultimately used to prepare TMV is used for presentation. G. FIG. Anti-sp56 antibody In one embodiment, an antibody of the invention, ie, an anti-sp56 antibody, It is characterized as including antibody molecules that immunoreact with the sp56 antigenic determinant. Thus, the present invention provides a preferred method of immunoreacting with an antigenic polypeptide of the present invention. Or an anti-sp56 antibody that also immunoreacts with native sp56 protein. . Preferably, the antibody has substantially no immune response with sperm proteins other than sp56. Absent. Assays for immune responses useful for assessing immunoreactivity are described herein. It is described in the book. In one embodiment, the immunoreactive with a preselected domain of sp56 and the other domain. An antibody molecule that does not immunoreact with ins, thereby conferring the desired specificity to the antibody, is noted. It is listed. For example, as shown herein, the domain of sp56 It has a species-specific sequence (sss) unique to the sp56 species from which it is derived. sss Antibodies immunoreactive with the domain did not immunoreact with sp56 from different species Therefore, it is useful for classifying sp56 species. On the other hand, the domain of sp56 is Are conserved between species, and therefore immunoreactive with their conserved domains The body immunoreacts with other sp56 species and has the benefit of a wide range of species reactivity. It is shown in the description. Antibodies of the invention typically comprise a mammal comprising an antigenic polypeptide of the invention. Immunization with the inoculum to be immunized, thereby determining antigens on the immunized polypeptide Antibody molecules with immunospecificity for groups and for sp56 Produced by triggering. The antibody molecule is then recovered from the mammal and, for example, D Well-known techniques, such as those from EAE Sephadex, can be used to the desired extent. To obtain a TgG fraction. Using antigenic polypeptides in immunogens Examples of antibody preparation methods are widely known in the antibody art. The term “antibody” in its various grammatical forms is used herein for immunity. An immunoglobulin molecule, and / or an immunologically active portion of an immunoglobulin molecule, In other words, it is a collective noun that refers to a group of molecules containing the antibody binding site or paratope. Used. "Antibody binding sites" are defined as variable and super-variable heavy and light chains that specifically bind antigen. It is the structural part of the antibody molecule that consists of a variant. As used herein, the term "antibody molecule" in its various grammatical forms The term refers to intact immunoglobulin molecules and the immunology of immunoglobulin molecules Both chemically active moieties are contemplated. Examples of antibody molecules for use in the diagnostic methods and systems of the present invention include intact Immunoglobulin molecules, substantially intact immunoglobulin molecules and Fa b, Fab ', F (ab')_TwoAnd what is known in the art as F (v) Is the part of the immunoglobulin molecule containing the paratope. Antibodies Fab and F (ab ')_TwoThe parts are, in a well-known manner, substantially Proteolytic reactions of intact antibodies with papain and pepsin, respectively. Is generated. For example, U.S. Patent Nos. See 4,342,566. Fab 'antibody portions are also well known, This is F (ab ')_TwoGenerated from the part, followed by mercaptoethanol Reduction of the disulfide bond linking the two heavy chains, followed by the resulting tamper Prepared by alkylation of cumercaptan with a reagent such as iodoacetamide. It is. Antibodies containing intact antibody molecules are preferred, but are referred to herein as It is used as an example. The production of antibodies to polypeptides is well known in the art. Staudt J. et al. Exp. Med., 157: 687-704 (1983) or U.S. Pat. Sutcliffe, J. No. 811; See the teachings of G. Those teachings The indications are incorporated herein by reference. Briefly, to produce a peptide antibody composition of the present invention, an experimental mammal In addition, the immunization of antigenic polypeptides, such as those typically present in the vaccines of the present invention. Inoculate an epidemiologically effective amount. Next, the anti-sp56 antibody induced thereby is converted to the protein. Immunization using a polypeptide for immunization in solid phase By well-known techniques such as by affinity chromatography, Immunization polypeptides, such as recombinant sp56 protein, and native sp56 protein Those that are immunospecific for both proteins are isolated to the extent desired. In order to increase the specificity of the antibody, preferably, The antibody is purified by immunoaffinity chromatography using the peptide. The antibody is used as a solid phase-attached polypeptide for immunization, and the polypeptide as an antibody molecule. Contact for a time sufficient to allow the immune reaction to form a solid-phased immune complex . The bound antibody is separated from the complex by standard techniques. The term "inoculum" in its various grammatical forms is used herein to refer to As an active ingredient used to generate antibodies against sp56 determinant-containing polypeptide Used to describe compositions containing the antigenic polypeptide of the invention. . If the polypeptide is used in an inoculum to elicit antibodies, the polypeptide The tide can be used in various embodiments, for example, alone or as a conjugate (conjugate; conjug ate) linked to a carrier or used as a polypeptide polymer Should be understood. However, for ease of expression, the In the context of an inoculum, various aspects of the polypeptides of the invention are described herein as: Collectively represented by "polypeptide" and its various grammatical forms. Polypeptides containing less than about 35 amino acid residues trigger antibody production For this purpose, it is preferable to use a peptide bound to a carrier. To aid in binding the polypeptide to the carrier, the polypeptide One or more additional amino acid residues may be added at the amino or carboxy terminus. Can be made. Added to the amino or carboxy terminus of the polypeptide Cysteine residues form conjugates via disulfide bonds Have been found to be particularly useful. However, for producing conjugates Other methods well known in the art can also be used. Coupling or activating via activated functional groups currently known in the art. Techniques for conjugating peptides are also particularly applicable. For example, Scan by Aurameas et al. d. J. Immunol., 8: Addendum 7: 7-23 (1978), and US Patent No. 4,493,7. Nos. 95, 3,791,932 and 3,839,153. Ma Was After coupling, to minimize loss of activity due to polypeptide orientation, A site-specific coupling reaction may be performed. See, for example, Biotech., 3 by Rodwell et al. : 889-894 (1985) and U.S. Patent No. 4,671,958. Other examples of ligation operations include Michael addition reaction products, glutar The use of dialdehydes, such as aldehydes, by Klipstein et al. Infect. Dis., 147: 318-326 (1983), or for forming an amide bond to a carrier Including the use of carbodiimide technology as in the use of water-soluble carbodiimides. You. Alternatively, a peptide having a carboxy terminal cysteine introduced therein is bound. To achieve this, a heterobifunctional cross-linking linker, SPDP [N-succinimidyl-3 -(2-pyridyldithio) proprionate (n-succinimidyl-3- (2-pyridyldit hio) proprionate))] is used. The invention in both the production of the antibodies of the invention and the production of the vaccine compositions of the invention Carriers useful for use in Ming are well known in the art, Generally it is a protein in itself. An example of such a carrier is keyhole Keyhole limpet hemocyanin (KLH), edestin, Immunoglobulin, bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HS A) albumin, red blood cells such as sheep red blood cells (SRBC), diphtheria A toxin, tetanus toxin, cholera toxin subunit A, B or both, and poly D-lysine: a polyamino acid such as D-glutamic acid and the like. The choice of carrier will depend more on the ultimate use of the inoculum, and will And standards not specifically included. For example, the smell of a particular animal being inoculated A carrier that does not cause unfavorable reactions must be selected. The inoculum is typically effective as a conjugate linked to a carrier. Contains an immunogenic amount of a polypeptide of the invention. Immunization polypeptide Effective amount of polypeptide per unit dose sufficient to elicit an immune response against Depends, inter alia, on the species of animal to be inoculated, the weight of the animal and the mode of inoculation chosen. Are well known in the art. Typically, the inoculum is about 10 μg to about 500 mg, preferably about 50 μg to about 50 mg per dose of polypeptide Contains peptide concentration. The term “unit dose” for inoculum is suitable as a unit dose for animals. Units, each of which is a required diluent, i.e., a carrier Or activity calculated to produce the desired immunogenic effect in relation to the vehicle Contains a predetermined amount of the substance. For a new unit dose of the inoculum according to the invention The specification determines (a) the specific properties and properties of the active substance, as disclosed in detail herein. Specific immune effects to be achieved and (b) Dictated by the inherent limitations in the art of formulating such actives, And they are a feature of the present invention. The inoculum is typically prepared from a dried solid polypeptide-conjugate. The polypeptide conjugate is added to water, saline, or phosphate buffered saline. Dispersion in a physiologically acceptable (acceptable) diluent such as To be prepared. The inoculum can also include an adjuvant as part of the diluent. Complete Freud's Adjuvant (CFA), Incomplete Freud's Adjuvant (IFA) Adjuvants such as and aluminum (alum) are well known in the art. And are commercially available from several sources. The antibodies so generated are particularly useful for samples such as tissue sections or body fluid samples. Use in the diagnostic methods and systems of the present invention for detecting existing sp56 Can be. Preferred anti-sp56 antibodies are monoclonal antibodies. The phrase “monoclonal antibody” in its various grammatical forms refers to the specific Antibodies containing only a single antibody binding site capable of immunoreacting with the epitope Refers to a group of molecules. Thus, monoclonal antibodies typically produce an immune response. Exhibit a single binding affinity for the epitope. Therefore, monoclonal Antibodies have multiple antibody binding sites, each of which is immunospecific for a different epitope May contain an antibody molecule having, for example, a bispecific monoclonal antibody. . Preferred monoclonal antibodies of the present invention are those described for the anti-sp56 antibody of the present invention. It contains an antibody molecule that immunoreacts with the listed antigenic polypeptide of the invention. Than Preferably, the monoclonal antibodies are also recombinantly produced or naturally occurring. It also immunoreacts with the isolated sp56 protein. Monoclonal antibodies typically secrete (produce) only one antibody molecule Consists of antibodies produced by single cell clones called hybridomas. The hybridoma cells continue to be antibody-producing cells and myeloma or other indefinitely It is produced by fusing with a possible cell line. Generation of such antibodies is most First described in Nature by Kohler and Milstein, 256: 495-497 (1975) Was. The description is incorporated herein by reference. Hybrids so generated The domema supernatant is immunized with the polypeptide for immunization or the whole sp56 protein. One can screen for the presence of reactive antibody molecules. Briefly, hybridomas producing monoclonal antibody compositions are produced. Myeloma or other infinitely viable cell lines for the generation of Antigenic polypeptides containing sp56 antigenic determinants such as those present in polypeptides Fusing with lymphocytes obtained from the spleen of a mammal highly immunized with the polypeptide You. Hybridoma technology induced by polypeptides is described in Proc. . Acad. Sci. USA, 80: 4949-4953 (1983). Hereby incorporated by reference. The myeloma cell line used to generate hybridomas is the same as lymphocytes. Those from the same species are preferred. Typically, 129 GLX⁺Strain mice are preferred It is a new mammal. Mouse myelomas suitable for use in the present invention include: , Hypoxanthine-aminopterin-thymidine sensitive (HAT) cell line, American From the Can Type Culture Collection (Rockville, MD) , Available under the designations CRL 1580 and CRL 1581, respectively. There are 3X63-Ag8.653 and Sp2 / 0-Ag14. Spleen cells typically use polyethylene glycol (PEG) 1500 Fused with myeloma cells. The fused hybrid gives a sense of HAT Selected by receptivity. Hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention Uses the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) described in the Examples. Identified using The monoclonal antibodies of the present invention also provide antibody molecules of suitable polypeptide specificity. Monoclonal hive containing nutrient medium containing hybridomas that produce and secrete It can also be produced by initiating a lidoma culture. The culture is hybridized The antibody is maintained under conditions sufficient for the antibody to secrete the antibody molecule into the medium for a sufficient time. Next Next, the antibody-containing medium is recovered. Next, the antibody molecules are further refined using well-known techniques. Can be isolated. Useful vehicles for preparing these compositions are well known in the art of branch surgery. And are commercially available and include synthetic media, inbred mice, etc. . Examples of synthetic media are 4.5 g / l glucose, 20 mM glutamine and 2 g / l. Dulbecco's minimum essential medium supplemented with 0% fetal bovine serum [DMEM, Dulbecco Korol et al., Virol, 8: 396 (1959)]. Examples of inbred mice are Balb / c It is. Monoclonal antibodies, hybridoma cells or hybridoma cell cultures Other methods of generating are well known. For example, Prod.Natl.Acad by Sastry et al. Sci. USA, 86: 5728-5732 (1989) and Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (19 1989) to isolate monoclonal antibodies from the immunological repertoire described in See the law. The monoclonal antibodies of the invention are disclosed herein for the antibodies of the invention. It can be used in the same way. For example, monoclonal antibodies can be used when immunoreaction with sp56 is desired. For use in the therapeutic, diagnostic or in vitro methods disclosed herein. Can be. Further, the present invention provides a hybridoma cell and the monoclonal antibody of the present invention. Cultures containing the producing hybridoma cells are also contemplated. H. Diagnostic method The present invention is directed to the use of tissue samples, including tissue clumps, tissue sections, or biological fluid samples. The presence of sp56, sp56 antigenic determinant or anti-sp56 antibody in such a body sample. A variety of assays to determine the presence and, preferably, the amount are contemplated, including Immunochemistry of polypeptides, polyclonal or monoclonal antibodies of the invention To generate an immune reaction product that is used directly or indirectly Specifically related to the amount of the sp56 antigenic determinant or antibody in the sample. One of skill in the art will appreciate the immunochemical reagents of the present invention for the amount of antigen or antibody in a body sample. Numerous, which can be used to form linked amounts of immune reaction products It will be appreciated that there are well-known chemical methods of clinical diagnosis. Therefore, Although exemplary assays are described herein, the invention is not limited thereto. Not. Various heterogeneous, either competitive or non-competitive, and Homogeneous protocols are used to perform the assays of the invention. Can be The sperm having sp56 is effective for interacting with the zona pellucida of the egg and is fertile. It is estimated that Sperm lacking sp56 is ineffective for interaction and fertility is Not guessed. Accordingly, one aspect of the present invention is the use of an anti-sp56 antibody in a sp56 protein in a sample. The amount of sp56 protein in the sperm-containing sample used to immunoreact with the protein A method of assaying is contemplated. In this aspect, the antibody immunoreacts with sp56. , Form a sp56-antibody immunoreactive complex that is detected and detected in the sample Indicates the presence of p56. Thus, this assay format is compatible with mammalian sperm sp5 A method to determine the fertility of a mammal by detecting the presence of 6 is defined. Anti-sp for assaying for the presence and preferably the amount of sp56 in a sample An immunoassay using 56 antibody molecules typically includes the following steps. (A) mixing a sample with an anti-sp56 antibody of the present invention, preferably a monoclonal antibody; By combining (contacting), an immune reaction mixture is formed. The sample is typical Of the sample in the solid phase so that the immune reaction mixture has both a liquid phase and a solid phase. And the antibody functions as a reagent to detect the presence of sp56 in the sample. The sample is a sperm-containing sample such as semen or epididymal tissue, and is a well-known immune system. It is preferably prepared with biological stains, but other tissues containing tissue extracts or bodily fluids The sample may be adsorbed on a solid phase. In such cases, adsorption to the solid phase is well known in the art. It can be performed as described in Estanblots or ELISA. You. (B) scheduling the immune reaction mixture such as from about 10 minutes to about 16-20 hours; At about 4 ° C. to about 45 ° C. for a period of time in which sp56 present in the sample In response to immunological binding to form sp56-containing immune reaction product (immune complex) And maintained under biological assay conditions. Biological assay conditions include the immunochemical reagents of the invention and the sp5 to be assayed. 6 maintain the biological activity. These conditions range from about 4 ° C to about 45 ° C. Temperature range, pH value range of about 5 to about 9, and ionic strength of distilled water to about 1 mol / Includes ionic strength varying over a range of ionic strengths equal to 1 sodium chloride solution . Methods for optimizing such conditions are well known to those skilled in the art. (C) the presence of the sp56-containing immune reaction product formed in step (b); More preferably, the amount is measured (detected) to determine the amount of sp56 present in the sample. Measuring the presence or amount of an immune product, directly or indirectly, is well known to those of skill in the art. The type of indicating means achieved by known assay techniques and typically used According to Preferably, the determination of step (c) comprises the following steps. (i) mixing the sp56-containing immunoreaction product with a second antibody to form a second (detection) Forming an immune reaction mixture, wherein the second antibody molecule comprises a first antibody molecule in the immune reaction product. It has the ability to immunoreact with (primary) antibodies. Antibodies useful as second antibodies can be polyclonal or monoclonal to the primary antibody. Includes a clonal antibody preparation. (ii) combining the second immunoreaction mixture with a second antibody and an immunoreaction product. And maintained for a time sufficient to form a second immune response product; and (iii) the amount of the second antibody present in the second immune reaction product, and Determine the amount of the immune reaction product formed in step (c). In one embodiment, the method comprises detecting the presence of a labeled second immune reaction product. The second antibody may be a labeled antibody (ie, Antibody). Label is measured in the second immunoreaction product and, therefore, is fixed. Indicates the presence and preferably the amount of the second antibody in the phase. Instead, the amount of the second antibody is, as is well known, specifically reactive with the second antibody. Can be determined by preparing an additional reaction mixture having an indicating means to You. For example, with a labeled anti-immunoglobulin antibody molecule specific for the second antibody The third immune reaction mixture. After the third immune response, the third immune response formed The product is detected via the presence of the label. Methods for detecting the amount and presence of an sp56 antigenic determinant depend on the species of sp56 in the sample. And therefore also useful for determining sperm type, the antibodies used are For example, sp56 domains in species-specific, specific forms, such as sss domains, etc. It is. Thus, the present invention uses the above assay with an anti-sss antibody. Also contemplated are methods of identifying sperm donor or sample species. Another diagnostic aspect involves the presence of any anti-sp56 antibody in circulating blood or semen. And determining the contraceptive status of the mammal by measuring its presence. In the presence of anti-sp56 antibodies, mammals do not fertilize or impair fertility It is. Thus, another aspect is that the sp56 antigenic determinant is isolated from the anti-sp56 antibody in the sample. For assaying the amount of anti-sp56 antibody in a body sample used for epidemics Contemplate the law. In this embodiment, the antibody in the sample immunoreacts with sp56 and sp5 A 6 antibody immunoreactive complex is formed, which is the presence of the anti-sp56 antibody in the sample. Is detected. Therefore, this assay format is compatible with mammalian immunocontraceptive anti- To determine the fertility of a mammal by detecting the presence of the sp56 antibody Define the method. This method identifies whether the immunocontraceptive method of the present invention is effective. And to identify mammals experiencing an autoimmune response that causes infertility It is for. Sp to assay for the presence and preferably the amount of anti-sp56 antibody in the sample An immunoassay using 56 antigenic determinants typically involves the following steps. (A) mixing a sample with an antigenic polypeptide comprising an sp56 antigenic determinant of the invention (Contact) to form an immune reaction mixture. This sample is typically In the form of a sample immobilized in a solid phase, so that the mixture has both a liquid phase and a solid phase Yes, the antigenic polypeptide is a reagent for detecting the presence of an anti-sp56 antibody in a sample. Function. Preferably, the sample is a blood, serum or plasma sample, such as semen or Epididymal tissue, preferably prepared by well-known immunohistological staining However, other samples, including tissue extracts or body fluids, may also be adsorbed on the solid phase. like this In some cases, adsorption on a solid phase has been described for the well-known Western blot method. Can be done as follows. (B) scheduling the immune reaction mixture such as from about 10 minutes to about 16-20 hours; At about 4 ° C. to about 45 ° C., the sp56 present in the sample was In response to immunological binding to form sp56-containing immune reaction product (immune complex) And maintained under biological assay conditions. Biological assay conditions include the immunochemical reagents of the invention and the sp5 to be assayed. 6 maintain the biological activity. These conditions range from about 4 ° C to about 45 ° C. Temperature range, pH value range of about 5 to about 9, and ionic strength of distilled water to about 1 mol / Includes ionic strength varying over a range of ionic strengths equal to 1 sodium chloride solution . Methods for optimizing such conditions are well known to those skilled in the art. (C) the presence of the sp56-containing immune reaction product formed in step (b); More preferably, the amount is measured (detected) to determine the amount of the anti-sp56 antibody present in the sample. . Measuring the presence or amount of an immune reaction product, directly or indirectly, is well known to those skilled in the art. Achieved by assay techniques well-known in the art and as described herein; Typically, it depends on the type of pointing means used. The term “conjugate” as used herein refers to an antibody-antigen or receptor -Refers to the product of a specific binding reaction, such as a ligand reaction. An example of a complex is an immune response It is a reaction product. As used herein, various grammatical forms of the word "marker" or "indicator" are used. Are directly or indirectly involved in generating a detectable signal indicating the presence of the complex. A type of atom or molecule. Any label or indicating means may be used, including antibodies of the invention. Or a portion of a monoclonal antibody composition, an antibody molecule, an expressed protein, Alternatively, it may be associated with, incorporated into, or used separately from a polypeptide. These atoms or molecules can be used alone or with additional reagents can do. Such labels are well known in clinical diagnostic chemistry and are Otherwise, within the scope of using the novel proteins, methods and / or systems It constitutes a part of the present invention. The labeling means chemically binds to the antibody or antigen without denaturing them. A fluorescent labeling agent that forms fluorescent dyes that are useful immunofluorescent tracers be able to. Suitable fluorescent labeling agents are fluorescein isocyanate (FIC), Fluorescein isothiocyanate (FITC), 5-dimethylamine-1-naph Tarensulfonyl chloride (DANSC), tetramethylrhodamine isothio Cyanate (TRITC), lysamine, rhodamine 8200 sulfonylchlora And a fluorescent dye such as Id (RB200SC). For a description of immunofluorescence analysis technology, see `` `` Immunofluorescence Analysis '', Antibody As a Tool, Marchalo nis et al., edited by John Wiley & Sons, Ltd., pages 189-231 (1982). And is incorporated herein by reference. In a preferred embodiment, the indicator group is horseradish peroxidase (HRP) , Glucose oxidase and the like. The main indicator is HRP or If is an enzyme such as glucose oxidase, additional reagents Clarify the fact that a ter-ligand complex (immunoreactant) is formed Is required. Such additional reagents for HRP include hydrogen peroxide, and And oxidation dye precursors such as diaminobenzidine. Glucose oxidase Additional reagents useful with are 2,2'-amino-di- (3-ethyl-benzthia Zoline-G-sulfonic acid) (ABTS). Radioactive elements are also useful labeling agents and are used as examples herein. . An example of a radiolabel is a radioactive element that emits gamma rays.¹²⁴I,¹²⁵I,¹²⁸ I,¹³²I, and⁵¹Elements that emit gamma rays themselves, such as Cr, emit gamma rays and emit It refers to one class that produces radioactive element indicator groups. Particularly preferred is¹²⁵At I is there. Another group of useful labeling means emits positrons themselves¹¹C,¹⁸F,¹⁵O and And¹³It is an element such as N. The emitted positrons combine with the electrons present in the animal's body. When encountered, produces gamma rays. Also,¹¹¹Indium or^ThreeΒ emitter like H Is also useful. The attachment of a label, i.e., the labeling of polypeptides and proteins, is well known in the art. It is well known. For example, antibody molecules produced by hybridomas By metabolically incorporating radioisotope-containing amino acids given as fractions Can be labeled. For example, Galfre et al., Meth. Enzymol., 73: 3-46. (1981). Conjugation of proteins via activated functional groups (Conjugation) or coupling techniques are particularly preferred. For example, Aurameas 7, Scand. J. Immunol. Vol. 8, Suppl. 7: 7-23 (1978); Rodwell et al., B. iotech, 3: 889-894 (1984) and U.S. Pat. See No. 795. This diagnostic method uses a specific binding agent for the detection of immune reaction products. Is also possible. A “specific binding agent” is one that selectively binds to a reagent species of the present invention. Molecule or a complex containing such a species. It is not the polypeptide or the antibody molecule composition itself. An example of a specific binding agent is a second antibody Molecules, complement proteins, or fragments thereof, S. aureus (S.aureu s ) Protein A. Specific if the species is present as part of a complex Preferably, the binding agent binds to the reagent species. In a preferred embodiment, the specific binding agent is labeled. But in diagnostics, the sign If unspecific binding agents are used, the reagents will typically be Is used as a reagent. In these embodiments, the amplification means comprises a complex containing a reagent species. When bound to the body, the labeled specific binding agent specifically binds to the amplification means Have the ability. The diagnostic method of the present invention uses "EL to detect the amount of sp56 antigenic determinant in a sample. It can be implemented in the "ISA" format. "ELISA" is an antibody that binds to a solid phase Or using an antigen and an enzyme-antigen or enzyme-antibody conjugate in the sample. This is an enzyme-linked immunosorbent assay that detects and quantifies the antigen present. ELISA technology Is described in Chapter 22 of the 4th edition of Basic and Clinical Immunology, by D.P. Sites et al. (From Lange Medical Publications in Los Altos, CA) Rows), and U.S. Patent Nos. 3,654,090, 3,850,752, , 016,043, which are incorporated herein by reference. Thus, in some embodiments, forming a solid support for use in a diagnostic method of interest In order to achieve this, a polypeptide, antibody or monoclonal antibody of the invention It can be fixed to a matrix. Reagents are typically adsorbed from aqueous media and immobilized on a solid matrix. Other types of immobilization methods applicable to proteins and polypeptides well known to those of skill in the art Can also be used. Examples of adsorption methods are described herein. Useful solid matrices are also well known to those skilled in the art. Such substances can be found in water Insoluble, cross-linked dextran [Piscataway (new Fine Chemicals (Jersey) icals)) under the trade name SEPHADEX], agarose, Polystyrene beads with a diameter of about 1 micron (μm) to about 5 millimeters (mm) [Abbott Laboratories in North Chicago (Illinois) (Available from Abbott Laboratories)], polyvinyl chloride, polystyrene, Bridged polyacrylamide, sheet, strip, or spatula Dollar), nitrocellulose or nylon based fibers, or Tubes, flutes, or tubes made of polystyrene or polyvinyl chloride Includes wells of a chromatographic plate.Example The following examples are intended to be illustrative and the specification and claims are not to be considered as limiting. It is not so limited.1. Preparation of a purified sp56 protein immunogen Mouse sp56 protein was purified from male mice in two different ways. Raw Male mice with reduced breeding ability [HSD: ICR species, Indianapolis (Indy Harlan Sprague Dawley I, Ana nc.)] (8-18 weeks old), and the epididymis tail and vas deferens were replaced with 5 mM EGTA. Containing pre-warmed (37 ° C.) M119M medium [Bleil and Wassarman, J. Ce. II. Biol, 102: 1363-1369 (1986)]. My organization The incision was made with black scissors, and sperm were allowed to swim for 10 minutes and taken out. Sperm in 9 times M11 Transferred to 9M and fertilized for 30 minutes at 37 ° C. Sperm that has acquired fertility Sorvall SS-34 rotator [Willington, Delaware] 5,000r for 7 minutes at Du Pont Instruments centrifugation at 25 ° C through a Parcoll gradient at pm And purified. This gradient is 70% Percoll, 25 mM Tris -HCl, pH 7.4, 39 ml of 150 mM NaCl was added to Soval SS-34. Prepared by centrifuging at 19,000 rpm for 1 hour on a rotator . Next, Parker containing 50 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA. Le gradient followed by 35,000 g for 7 minutes at 25 ° C. Acrosome intact sperm and acrosomal The spermatozoa that had acquired the fertility to which the reaction had reacted were collected separately. Isolated in suspension The sperm mass is removed from the gradient, then diluted with eight volumes of medium, and then Pelleted at 5,000 rpm in an upper centrifuge. For processing in subsequent experiments The pellet was resuspended in buffer or medium. Sperm purified by this method is sufficient Minutes have motor skills and are fertile. In parallel experiments, Pups and fertilized, percoll purified spermatozoa are 8 out of 10 mice Fertilized the eggs. Average 4 × 10⁷Purified spermatozoa were separated from each male. all The water used for the experiments in this study was a Nanopure system (Dubucure). -Barnstead, Dubuque, Iowa. One method of purifying sp56 is essentially as described above [Bleil and Wassarm. An, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 5563-5567 (1990)]. ZP3-affinity chromatography. 20 2 mg of percoll-purified, acrosome-free sperm from males Per ml of turkey egg white trypsin inhibitor in 2 ml of buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl_Two, 1 mM KCl, and 0.2% hydrogenated Triton X -100). Under the conditions described herein, UV-transparent, hydrogenated Triton X-100 (San Diego, CA) Calbiochem Corp. has 100% sp5 6 were extracted, but only 12% of these sperm proteins were equimolar in Triton X-10. 0 did not dissolve. Centrifuge insoluble material at 14,000 g for 5 minutes And removed. The sample was filtered through a 0.22 μM filter and the [Bleil and And Wassarman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 5563-5567 (19). 1990)], a ZP3 affinity column [Rainin nin) EP column, 10 μM ZP3, Woburn (Massachusetts) In Linz (Instruments). 20 times column Volume of buffer A and remove bound protein from 0-8M urea and 0.2% water. Elution was performed with a gradient of triton X-100 to which nitrogen was added. Fraction (0.1m l) was collected and analyzed by 2-D SDS-PAGE. A number of extracellular proteins, sp56, are typically ZP3 Eluted from the affinity column but contain intracellular disulfide bonds. This When exposed to 2-D SDS-PAGE, the protein is 40,0 under non-reducing conditions. 00D (40 kDa), double line with coordination of 56 kDa under reducing conditions Moved as (doublet). Analysis of the concentration of such gels indicated that sp56 was hydrogenated Triton X-10. 0% (~ 2.3 pg or 25,000 mo) of the sperm protein extracted l sp56 / sperm). In contrast, Parko Of purified protein and triton produced from acrosome-reacted sperm On DSDS-PAGE, sp56 was not detected. This result is Observation that sp56 is not present in acrosome-reacted sperm [Bleil and Wassarman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:55. 63-5567 (1990)]. As described above, percoll purified mouse sperm to obtain protein sequences ZP3 affinity purified sp56, biochemically purified from sp56 (see below), or a protein containing total triton extracted protein. The protein samples were first subjected to 2-D SDS-PAGE. Gel moves for 15 minutes Buffer [10% methanol, 1 μM DTT, 100 mM CAPS (Na- [3 -(Cyclohexylamino) -propane] -sulfonic acid), pH 10]. And treated with 300 mA buffer for 1 hour at 4 ° C in an electrophoresis apparatus. Polyvinyl Difluoride Protein Sequencing Membrane [ Bio-Rad Laboratories]. men The whole bran was washed with water containing 1 μM DTT, and the protein was washed with 1 μM DTT. Detected by Ponceau staining. sp56 equivalent (non-reducing article The stained protein located at 40 kDa under the conditions and 56 kDa under reducing conditions , Sliced from the membrane, the whole is 50% methanol and 1 μM D Wash with 50% water containing TT and extract by digestion with trypsin or directly Subjected to solid phase amino acid sequencing. Sp5 separated by reverse phase HPLC 6 were isolated and subjected to solid-phase amino acid sequencing. Was. Degradation with trypsin, reverse phase HPLC, and amino acid sequencing The Scripps Research Institute Protein Sequencing Core Facility gave. The protein (〜30 pmol) subjected to the amino acid sequence contains one NH_Two -Has a terminal sequence, the first 12 amino acids of which are DCGPPP LLPFAS (positions 1 to 12 of SEQ ID NO: 2). An alternative method of purifying sp56 from sperm is based on biochemical purification. 40 ５０50 male, Percoll-purified, acrosomes are 20 mM Tris-HCl, pH 8.5, 0.5% hydrogenated Triton X- Extract with 100 and treat extract with 1 mM PMSF to inactivate protease I let it. The extract was centrifuged at 14,000 g for 5 minutes to remove insoluble substances. Supernatant Was filtered (0.22 μM filter), and 75 × 7.5 mm DEAE-5PW color Bio-Rad Laboratory in Richmond, California Iz]. The protein was added to a column buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8. 5, 0-0.5 M NaC in 0.1% hydrogenated Triton X-100) Elution was performed at a rate of 0.5 ml / min over a 20 minute period with one gradient. Eluate Analyzed at 280 nm. 0.5 ml fractions were collected and 2-D SDS-PAGE To the position of sp56 [equivalent to 40 kDa (non-reduced), 56 kDa (reduced)] Kel was silver stained for identification. Pool fractions containing sp56 and filter -[Centricon 30, Bedford (Massachusetts) (Millipore Corp., Setts.) And add 200 μl to 30 0x7.8mm Bio-Sil (BIO-SIL) SEC 250 column (Bio -Rad Laboratories). Equilibrate the column to 50 ml at 0.2 ml / min. mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.1 M NaCl, 0.1% hydrogenated Triton X-100 was washed away. The eluate was analyzed at 280 nm. 0.2ml Were collected and subjected to 2-D SDS-PAGE to identify the position of sp56. I took it. Fractions containing sp56 were pooled, concentrated and used for further studies. Was. Measuring the size of molecules on a size exclusion column is> 300, 150, 44, 1 7, and <10 kD standard protein. Separates denatured proteins (Replace 0.1% Triton in column buffer with 0.1% SDS), 2 Standards of 00, 60 and 30 kD were used. Biochemically purified sp56 was eluted from the size exclusion column and reduced to 110 k Estimated molecular weight of Da (range = 90-130 kDa, based on size standard) Was. Total triton extracted sperm protein was purified under non-denaturing conditions (0.1% triton ), Fractions containing sp56 protein when subjected to size exclusion chromatography (Determined by 2-D SDS-PAGE profile) at 110 kDa Was. When sperm proteins are exposed to denaturing conditions (0.1% SDS), sp56 Fraction containing 46 kD (determined by 2-D SDS-PAGE profile) a. In addition, the two lines show affinity-purified sp56 and It shows that chemically purified proteins are equivalent. First, biochemically purified Protein NH_TwoThe terminal amino acid sequence was affinity purified as described above. Sp56. Second, for biochemically purified proteins Monoclonal antibodies are used for biochemically purified protein and affinity purification. Both sp56s produced were recognized. In addition to these, biochemically purified s p56 with sp56 affinity purified on a 2-D SDS gel moved.2. Isolation of mouse sp56 cDNA The biochemically purified sp56 prepared in Example 1 above was Proteolytic analysis with Endo Arg C, trypsin, and chymotrypsin By automated solid phase Edman-degradation peptide sequencing. The first fragment for the amino acid sequence was generated. First substance And quantification of released amino acids, it was confirmed that only sp56 sequence was obtained. I accepted. From the sp56 peptide fragment, a modified polymerase chain reaction (PC In order to use the primer of R) for amplification of the sp56 cDNA fragment, Bookbinder et al., Science, 269: 86-88 (1995). Designed to be. Briefly, primers are described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory ManuaL Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Cold Spring Harbor (New York) (1989), and Lee Et al., BioTechniques, 14: 191 (1993). It was designed. Oligo (dT) -primed paramagnetic particles were -N4 (5'CCNTTYGCNWSNCCCNACNAAYCA3 ') (sequence number No. 3), and F5W (5 'TARAANACRARTARTCNCRTANGC) 3 ') (SEQ ID NO: 4) for use from mouse testis poly (A) + RNA Nested PCR was performed on the single-stranded cDNA template Subsequently, 1/100 of the first amplification product was replaced with primer N5 (5'GCNWSNC CNACNAAYCARYTNTA3 ') (SEQ ID NO: 5) and F5W and other rotations Was performed. Denatured positions are suggested in IUPAC agreements, where N is A, G , C, or T, Y is C or T, W is A or T, and R is A or G. N 4 and N5 primers contain overlapping portions of chymotrypsin peptide 1 Primer F5W corresponds to chymotrypsin peptide 2. The resulting amplified 1 kilobase (kb), sp56NH_TwoEnd (PCR Amino acids 11-18 encoded by immersion N5), endo-arg C pepti De 1 (amino acids 271 to 294), endo-Arg C peptide 2 (amino acids 291 ~ 303), trypsin peptide 1 (amino acids 199-205), chymotrypsi Peptide (amino acids 12-18), chymotrypsin peptide (PCR The portion of amino acids 342-349) encoded by primer F5W To include an array. The location of the primer and peptide sequences described here For reference, refer to the nucleotide and amino acid sequence of sp56 shown in SEQ ID NO: 1. I want to be illuminated. The full length of the sp56 cDNA clone is the oligo (dT) -primer mouse testis The λ-Zap cDNA library (produced in the laboratory of Dr. Bleil) was prepared as described above. So obtained,³²P-labeled, random-primed 1 kb PC R product or the sequence 5 'ACCTCGCATCACGGCTT3' (SEQ ID NO: No. 6), and 5'GAAGGAAACCACTCGCCA3 '(SEQ ID NO: 7) With a 32P-labeled primer specific for the 1 kb PCR product It is obtained by training. The isolated sp56 cDNA clone , Sp56NH_TwoComplete along the bases encoding the terminal amino acids 1-10 Confirm that the clone encodes sp56, containing the 1 kb PCR product. Was. The base sequence at the beginning of the mouse sp56 cDNA clone chain is accession number U171. 08 is described in Genbank. sp56 cDNA is From the methionine in the first frame (in-frame), the three salts of Asp-Cys-Pro Experimentally determined NH of sp56 initiated with a group_TwoTemporary, located between the ends 547 amino acids initiated by a defined 32 amino acid signal peptide Code the open reading frame. "Pre-Pro 5sp56" protein Mouse sp56 cDNA code containing a hypothetical signal peptide, referred to as The amino acid residue sequence is shown in SEQ ID NO: 1 for the cDNA and SEQ ID NO: 2 for itself. It is shown. Halopro lacking a signal peptide called "prosp56" Thein is a C-terminus of approximately 6,000 daltons in the absence of mouse sp56 protein. Includes terminal peptides. During the separation and processing of epididymal sperm in a non-denaturing wash, and / or Z It is clear that division occurs in the native, mobile sperm when bound to P3. became. These observations are important for the purposes of the present invention and within the basic scope , The C-terminal tail of prosp56, and the nucleic acid encoding this sequence, respectively. , For use in immunocontraception and for the development of nucleic acid probes for homology studies Can be used. The sp56 cDNA opens the cDNA from the experimentally determined N-terminus. Encodes a 62,000 dalton peptide to the end of the reading frame However, mature sp56 is a 56 kDa protein. Coded mouse s The p56 protein apparently lacks the transmembrane spanning domain, Convince that the protein is a protein at the edge of the membrane. Mouse sp56 (sp56 Is a member of the superfamily of protein receptors. A series of 60 amino acids, each repeat containing 10 virtually unchanged amino acids "Sushi superfamily" based on the existence of repeats of homologous length Called. sp56 has seven such domains, the position of which is Domain start and end are underlined with cysteine (C) amino acids FIG. 1 is shown in a different arrangement. sp56 cDNA and code A diagram of the amino acid sequence is shown in FIG. Consistent with members of the superfamily, sp56 also has 44 amino acids. Chain near the C-terminus, a part of which is characteristic for proteins and sp56 specific Domain. As shown in FIG. 1, a chain of 44 amino acids (SEQ ID NO: Amino acids 380-423 of mouse sp56, shown as 2 Intervene between mains 6 and 7. This “sp56 species-specific domain” is known Has no detectable homology to any of the proteins, does not contain cysteine residues, Eliminates the possibility of two-dimensional structures determined by disulfide bonds. sp5 The 6-specific domain consists of highly charged amino acids, which are It is external and appears to be a B cell epitope and the like. Computer Sumire The solution did not show a helix or β-sheet two-dimensional structure. But Thus, its unique sequence, possible arrangement on the sp56 surface, and its two-dimensional structure Due to the lack of this domain of sp56, mouse sperm, and more widely, rodents Designed to induce a specific immune response against sp56 of spermatozoa A very good candidate for Ten. Therapeutic use of the sp56-derived compositions of the present invention is a limited set of sp56. It is also supported by the weave distribution. Expression of sp56 in mice is It has been measured in a limited number of minutes in the heart, liver, kidneys, brain, Neither protein nor mRNA was observed. sp56 protein and m RNA has been determined to be promoted in round sperm cells, but mRNA Is clearly degraded in the subsequent round sperm cell stage. But proteins are slender Are transferred to the plasma membrane, which covers the sperm cells and the sperm head. In addition to this, Sp56 is found on sperm that binds to mouse egg ZP3 protein, and Present in musters but does not recognize mouse eggs, such as guinea pigs and humans Not present in sperm. Therefore, whether or not sp56 exists on the surface of sperm Is based on the species specificity of sperm-egg recognition and thus I will provide a.3. Preparation of recombinant mouse sp56 protein and polypeptide immunogen To prepare the recombinant immunocontraceptive of the present invention, tobacco mosaic virus (TM The V) strain was used for the presence of sp56 polypeptide fragments on its surface. Manufactured for Mice are Closely Consuming Plants Containing Modified Virus As with certain other species, mucosal and systematic immunity to recombinant sp56 immunogens Develop a reaction. Male mice contained only about 80 ng of sp56 and were as described in Example 1. It is not economically feasible to produce the recombinant sp56 and its recombinant The preparation of a fragment is preferred in the present invention. But code sp56 Since the cDNA can be isolated as described in Example 2, the present invention Expression or selection of sp56 to produce a p56-containing polypeptide immunogen Describe some of them. Certain regions of the mouse sp56 protein-encoding cDNA encode recombinant molecules. Selected to prepare. A preferred recombinant protein is a 579 amino acid pre- -Including prosp56 and 547 amino acid prosp56. Other preferred sp The 56 DNA region is a nucleic acid encoding the outer loop region of the seven sushi domains. Including otide. These domains contain approximately 6 amino acids, including 10 virtually invariant amino acids. A chain of zero amino acids. FIG. 3 shows a typical sushi domain and 10 Indicate virtually invariant amino acids. Disulfide bond invariant pattern C1 Formed in C3, and C2-C4, in which the chain of hydrophobic amino acids is located Form a loop structure with both large and small interconnected loops. About 25-30, "Large roux", consisting mostly of chains of charged amino acids, is the C1 and C2 Are clearly divided within the superfamily, and due to their charged nature, It is generally involved in the function of protein receptors, members of the parfamily (I Chinose et al., J. Bio. Chem, 265: 13411-13416 (1990)). s p56 has seven such domains, each of which has "11" and And large and small loops called "sl". This of seven sushi domains Polypeptides derived from these regions are referred to as "Sh" 1 to 7 (for example, Sh1 to Sh7). In addition to this, Sushi Dome In 6 is characterized by having an additional cysteine residue in the large loop. Be killed. In this way, the large loop is further cysteine residue driven by the first loop. (Sh6f1) and an intermediate loop (Sh6m1). The sequence is shown in Table 1. Other additional preferred sp56 cDNA regions include unique sp56 species specific sequences ( sss) and of sushi domains 6 and 7 as described in Example 1. Located between. The nucleotide position of this unconserved unique region is the sequence Beginning at position 1313 and ending at position 1444 as shown in number 1. Equivalent to The amino acid residues are located at positions 380-423 of SEQ ID NO: 1, as shown in FIG. Is placed. Within this sp56 species-specific region, a number of preferred polypeptides are: It is contemplated for use as the immunocontraceptive of the present invention. These polypeptides Is referred to as “sss” and is further dependent on the number of polypeptides (eg, sss1). Is shown. Selected nucleotids encoding all or various portions of the sp56 protein The cDNA region corresponding to the position of the amino acid residue is shown in Table 1 and has the corresponding amino acid residue sequence. Position (AA) is also shown. nucleotide positions of the cDNA fragment and And the corresponding amino acid residue positions are derived from SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. The amino acid residue sequence of SEQ ID NO: 2 is also the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 It is shown with Mixing with the encoded nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 To prevent perturbation, the amino acids are defined from SEQ ID NO: 2 rather than SEQ ID NO: 1. You. The position is indicated after the colon in SEQ ID NO. For example, cDNA sss1 has the nucleotide sequence of 1313 to 1444 of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1: (SEQ ID NO 1: 1) 1313-1444. Accordingly, the encoded polypeptide is the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 380-423. Noic acid residue sequence. Designed cDNA polypeptide of the immunocontraceptive agent of the present invention C pairs are indicated in the specification with "pp" added to the cDNA design. Table 1 design cDNA location AA position Pre-pro sp56 1: 80-1816 2: -32 to 547 Pro sp56 1: 176-1816 2: 1-547 Mature sp56 1: 176-1606 2: 1-477 Sh1 1: 176-352 2: 1-59 Sh11 1: 182-271 2: 3-32 Sh1sl 1: 275-313 2: 34-46 Sh2 1: 365-538 2: 64-121 Sh211 1: 368-445 2: 65-90 Sh2sl 1: 449-487 2: 92-194 Sh3 1: 551-733 2: 126-186 Sh311 1: 554-637 2: 127-154 Sh3sl 1: 641-679 2: 156-168 Sh4 1: 746-913 2: 191-246 Sh411 1: 749-829 2: 192-218 Sh4sl 1: 833-872 2: 220-232 Sh5 1: 926-1114 2: 251-313 Sh5ll 1: 929-1027 2: 252-284 Sh5sl 1: 1031-1075 2: 286-300 Sh6 1: 1124-1312 2: 317-379 Sh6ll 1: 1130-1225 2: 319-350 Sh6sl 1: 1229-1270 2: 352-365 Sh6fl 1: 1130-1189 2: 319-338 Sh6ml2 1: 1193-1125 2: 340-350 Sh7 1: 1445-1606 2: 424-377 Sh7ll 1: 1448-1525 2: 425-450 Sh7sl 1: 1529-1567 2: 452-464 sss1: 1: 1313-1444 2: 380-423 sss2 1: 1322-1369 2: 383-398 sss3 1: 1361-1408 2: 396-411 sss4 1: 1391-1438 2: 406-421 Sh6fl1 and Sh6ml2 are derived from a large loop of sushi domain 6 In each of the first and intermediate loops, separated by cysteine bonds is there. The selection of these regions, summarized in Table 1, is based on contraceptive blocking. Recombinant sp56 polysaccharide, which is an effective immunocontraceptive based on but not based on antibody titer Facilitates identification of peptide immunogens. Poly that can contain B cell epitopes For peptides, selection is preferred, and it is also contraceptive after interruption of immunization. Enables a potential reversal of the effect. Thus, in one embodiment, the reversibility is: This is a desirable feature of the immunocontraceptive agent molecule of the present invention. The completeness listed in Table 1 as an immunogen to cause contraception in mammals Pre-pro-sp56 protein is used to prepare total pro-sp56 protein. The resulting cDNA sequence is an expression vector for expression in mammalian cells in tissue culture. Inserted into the reactor. Briefly, Bookbinde r) et al., Science, Vol. 269, pp. 86-89 (1995). 2043 bp Eco from clone 7.1 sp56 cDNA as described RI / XhoI fragment (the fragmentation was prepared according to the preps listed in Table 1) A sequence encoding a mammalian expression vector. pcDNA3 [Invitrogen, CA San Diego], allowing direct insertion of sp56 cDNA clones To be linearized with the same restriction enzyme, whereby pcDNA3-sp5 6 expression vectors were formed. The expression vector construct provided the following conditions: 1) Human cytomegaloy A promoter sequence upstream from the immediate early gene of Lu High level essential transcription of sp56 cDNA at 2 ° C; 2) additional polyadenylation Signal from the bovine growth hormone gene that enhances RNA stability 3) ATG (encoded at the beginning of the sp56 signal peptide) That is, bases corresponding to 81 to 83 of the signal sequence shown in SEQ ID NO: 1) Initiation of their translation; and 4) Neomy for selection of G418 resistant stable cell lines. Syn resistance gene. Competent recA (-)E. FIG. coli[XL1-Blue, Strategy (Stratagene, La Jolla, CA). Plasmids transformed and amplified with sp56 were isolated from Qiagen. (Chatworth, CA) Purify bacteria from bacteria using a plasmid purification kit. Was made. The purified plasmid DNA is used for polycationic lipid transfection. Was introduced into CHO and COS cells [Felgner er), etc.Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 84 volumes, 741 3-7417 (1987)]. Silver amplified immunogold staining using Mab 7C5 [ Cheng, etc.J. Cell Biol., 125, 867-8 78 (1994)] was transformed with the sp56 insert. In G418-resistant cloned COS cells, intracellular sp56 was detected. Issued. Plasmid transformed with plasmid pcDNA3 without insert Control cells did not show sp56 expression. As expected, the expressed s p56 (lacking the signal peptide) is secreted from these cells and First, it was detected by Western blot of tissue culture medium. Expressed The secreted protein had a molecular weight of 62 kDa by SDS-PAGE under reducing conditions. Moved to the position. This is due to the post-translational removal of the C-terminal tail in these cells [ Book binders, etc.Science, 269, 8 6-89 (1995)]. Others for expressing the complete pro-sp56 polypeptide for oral immunization Involves expression from recombinant baculovirus in insect cells ( However, it is not limited to this). The ports derived from the remaining sp56 listed in Table 1 Like the peptide, the recombinant pre-prosp56 retains the signal peptide sequence. The preparation of mature sp56, which lacks both the signal peptide sequence and the C-terminal tail, By cloning each cDNA sequence into an appropriate expression vector, Achieved. Selection of the expression vector and the procedure for its insertion is within the skill of the art. Is well known. Once secreted, recombinant proteins (such as prosp56 released into the medium) Or mature sp56) is the anti-sp56 monoclonal antibody 7C5, 5F12, 12 Immunopurified with D2, 7H12 or 4B2 [Cheng et al. ,J. Cell Biol.125, 867-878 (1994)] Or with the recently isolated anti-pro-SP56 monoclonal antibody 10b6. And purified immunologically. The purified protein is then orally immunized. Mixed with mammal feed. As described below, in a separate attempt, the recombinant sp56 poly- Peptide immunogens (also called haptens) are used for tobacco mosaic virus (T MV) a selection of coat proteins, designed on the C-terminal tail of the TMV. Chimeric pepti composed of a protein having a selected sp56-specific domain Prepared as part of the molecule. Viruses collected based on TMV replication The particles then act as an immunogen when consumed in plant material. Many replicates of the modified sp56 recombinant fragment are provided. For identification purposes, recombinants anchored to the sp56 polypeptide TMV is designated by the name of the particular polypeptide after TMV, eg, TMV- sss1pp (where sss1 indicates the name of the cDNA sequence, and pp indicates Designated polypeptide). FIG. 4 shows the results used to prepare the recombinant TMV-sp56 polypeptide fusion. Here is an overview of the method used. TM including arranging the DNA sequence of TMV on both sides From the V species U1 (normal), the gene for TMV coat protein (cp) Bluescript using NcoI and KpnI Closin in Rasmid Vector [Stratagene] Was done. The TMV gene containing the sequence of TMV cp is Virol. 181: 109 (1991) (this disclosure is incorporated by reference. Plasmid pU3 / 1, as described in US Pat. Derived from 2-4. As shown in FIG. On both sides of these restriction sites are bacteriophage T7 and T3 RNA A merase promoter sequence is located. The construction of the selected sp56 cDNA-TMV chimera is described herein. . One of skill in the art has been described to produce one particular TMV-sp56 chimera. The teaching is applicable and applicable to all sp56 cDNA molecules listed in Table 1. It will be appreciated that it can be easily adapted. Therefore, the sss1 cDNA To prepare a polypeptide with immobilized column-based TMV-sp56, ss s1 cDNA (SEQ ID NO: 1313-1444) Gene into a chimeric gene, which then replaces the complete TMV gene. Inserted into a separate vector. To accomplish this, first, sss-1 (sss1-a and sss1 -B) at the 3 'end of the TMV coat protein gene together with the base encoding A stretch of bases is synthesized (cp-a and cp-b) and the two chimeric PCRs Generates primers (sss1-a / cp-a and sss1-b / cp-b) . The procedure is similar to that described for the preparation of similar ZP3-expressing molecules. Fitchen, etc.Vaccine, 13 volumes, 1051-1057 Page (1995), the disclosure of which is incorporated herein by reference]. It is. The sss1-a nucleotide sequence has the sequence of 1322-1369 of SEQ ID NO: 1. The position corresponds to the top strand nucleotide sequence. The sss1-b nucleotide sequence is , It is a complementary sequence to the sequence of sss1-a. When written in the 5 'to 3' direction, the sss1-a / cp-a primer and And the nucleotide sequences of the sss1-b / cp-b primers are 5'A CCAATGTGACGAACAAAGACCCTACTTATTCGGTCATG AAAAAAATTCTACTGAGCATGCCATGAAAGGTGTGG GTCCTGCAACTTGAGGG 3 '(SEQ ID NO: 8) and 5' GGTCTT GTTCGTCACATTGGTTTCAGATATATTTGGGAAAAGT GAATAAAGGGCTAATCTATTTGTAAAACCAGAGTCTG CTTGAGAGGTCCAAACCAAAAC3 '(SEQ ID NO: 9). Each step The underlined portion of the primer indicates the TMV sequence, while the unlined portion indicates the complementary s 1 shows the ss1 nucleotide sequence. Primer sss1-b / cp-b and nucleotide sequence 5'TAATACG T7 promoter having ACTCACTATAGGGAGA3 '(SEQ ID NO: 10) Primers that specifically anneal to the primer sequence (T7 primer) Used with a plasmid containing the protein sequence and is continuous with the sss1 cDNA. The "left arm" of the cp region to be amplified is amplified. A primer sss1-a / cp-a; Nucleotide sequence 5 'AATAACCCTCACTAAAAGGGA3' (SEQ ID NO: No. 11) specifically anneals to the T3 promoter sequence (T3 primer) Primers are used with the TMV coat protein plasmid, The "right arm" of the cp region following s is amplified. The regions cp-a and cp-b are , Encodes a portion contiguous to the TMV CP region, but not the opposite strand. In order to amplify the region, Fitchen et al.Vacci ne 13, Vol. 1051-1057 (1995), A polymerase chain reaction (PCR) is performed. Used for PCR The cycling parameters were 30 seconds at 95 ° C / 60 at 47 ° C for the first round. 25 sec / sec at 72 ° C., followed by a second round at 72 ° C. The incubation was for 600 seconds. Includes the complementary strand of sss1 together with the left or right arm of TMV, respectively. The resulting PCR products were mixed, denatured and then annealed again, FIG. Re-annealing extended by DNA polymerase as outlined in Product. The product of this reaction is to coat TMV coat protein. Upstream sequence followed by s of amino acid residues 380-423 (SEQ ID NO: 2) sss1 cDNA sequence encoding the p56-specific domain, followed by the entire sequence A downstream sequence encoding a codon and a downstream sequence of the TMV coat protein gene; It consists of the rest of the column (see FIG. 5). The resulting sss1 cDN, named TMV-sss1pp The TMV coat protein encoding the gene containing the A product was then Alternatively, it is re-amplified by PCR using primers T7 and T3. Amplified The resulting material is then restrictedly digested with NcoI and KpnI. Restrictively The digested PCR fragment was then rescued in a derivative of pU3 / 12-4. And cloned into the corresponding restriction sites of the TMV cDNA fragment. This yields a modified full-length cDNA clone of MV. The resulting chimeric recombinant plasmid is, therefore, modified TMV gene Nom (to which the cDNA encoding the sss1 polypeptide has been inserted) )including. The chimeric plasmid was then used in an in vitro transcription assay. Linearized for use, it can be used by Fitchen et al.Vac cine 13, Vol. 1051-1057 (1995). Done in Briefly, the full length T including the modified coat protein gene Use of T7 RNA polymerase to catalyze MV genome synthesis Is done. Generally, 2 μg of linear plasmid is used to inoculate 10-20 leaves. Provide sufficient material. After transcription of the TMV-sss1 RNA / polypeptide, the infectious product is Rubbed on spinach plants. The transcript was 20 mM sodium phosphate Diluted to 1/10 with um (pH 7.2) and 100 ml is applied to the plants. For large-scale inoculation, the crude homogenate of the infected plant from the initial infection is transcribed. Used to replace products. This type of infection, as shown in FIG. Sp56-specific s on their surface as part of the Mera coat protein molecule This results in a virus particle providing the ss1 domain. In fact, large amounts of immune contraception Taking into account the consumption of pentene, this method can result in thousands of particles per virus particle. A climbing hapten is provided. The virus itself is infectious and, therefore, Economical to extend and useful for virtually unlimited supply of antigen It is. Plants infected with the virus are identified according to USDA guidelines The Lips Research Institute arch Institute). TMV virus particles Prior to use, heat and / or autoclaving the infected plant material. Has been converted to non-infectious. TMV-sp for expression of the remaining sp56 polypeptides listed in Table 1. The construction of the 56 chimera gene is based on the assumption that the chimera primer pair has a specific sp56 cDNA. Except that it is redesigned with the nucleotide sequence and its complement, And b, using the primer sequences. Others for producing the recombinant sp56 protein of the invention for production in plants An alternative recombination attempt has been the shuttle vector called the pRTL2 vector. And sp5 for subsequent insertion into the plant expression vector pGA482 Depends on the isolation of the 6-containing fragment. Shuttle vector and departure References for current vector systems and discussions thereof are provided in Chapter 5. ing. The shuttle vector pRTL2 contains an expression control sequence and cholera toxin-sp56 fusion. CDNA fragment encoding a specific sp56 for expression of synthetic protein A cholera toxin α or β chain nucleotide region linked to act on Designed to include within a HindIII-separable restriction fragment . In the following pRTL vector, cholera toxin α chain and β chain are encoded. Genes are ligated in such a way that they operate, the sp56 cDNA Separately designed for direct ligation to shuttle vectors using arrays And it results in a construct encoding a cholera toxin-containing fusion protein. Ko Appropriate plant expression vectors for cassettes encoding rela toxin α and β fusion proteins For separate subcloning into the vector, the vector is then Subsequent exchanges to generate F1 plants containing both expression vectors encoding the protein. Used to transform separate plants for distribution. Two cholera toxin α-chains facilitate the introduction of the expressed fusion protein into cells. Designed to stimulate an immune response in it, along with a single β-chain gene You. Unmodified cholera α-chain is used for adjuvant and carrier protein Act as Once mediated by complexation with the β-chain, G) When absorbed by epithelial cells, the cholera α-chain adjuvant flanks Stimulates the presentation of antigen on the outer surface. The nucleotide sequence of the α chain is Which is the arginine to lysine accession at position 7. Resulting in amino acid substitution, wherein the adjuvant moiety is also When released, it provides an α-chain that acts only as a carrier protein. cholera The β-chain binds the β-chain to GM1 ganglioside on the surface of the epithelial cell tip Only works as a carrier protein that mediates Of any expressed α-chain Absorption is achieved by conjugation with the expressed cholera toxin β chain protein. Both the α and β chain constructs are fusion proteins comprising the sp56 protein of the invention. Designed for expression of For the production of immunocontraceptive fusion proteins, α or Is used as a fusion protein, or both β chains. The pRTL2 vector is a plant expression vector, also labeled in FIGS. Useful as a shuttled expression element to mediate the expression of sp56 in proteins Has the following elements: 35S inversion of cauliflower mosaic virus 35 promoter (35S Pr) derived from a transcript; as a translation enhancer Useful tobacco etch virus untranslated leader sequence (TEVL); and Cauliflower mosaic for direct polyadenylation of transgene transcripts 35S polyadenylation sequence (pA-S) at the 3 'end of the 35S transcribed gene of Irus . These elements are designed in a single cassette, which is Restriction site digestion fragments for subsequent subcloning into vector Allows isolation. The plasmid map of the shuttle vector pRTLCTA-sp56 is shown in FIG. In which the HindIII segment contains an expression control sequence. And functions within the cholera toxin α-chain (labeled as CTOX A) DNA fragments encoding sp56 ("sss" and (Labeled) is shown by way of example. Ko To generate the rela toxin α-chain-sp56 fusion construct, Table 1 shows that cholera toxin α-chain Taking into account ligation to the ClaI restriction site present in the gene, the ClaI restriction site The sp56 cDNA sequence containing the position is selected and synthesized or produced by PCR. Built. Restriction site analysis confirmed that sp56-encoding sequence was once inserted. Once obtained, the cassette encoding the fusion protein is digested with HindIII For subsequent ligation into a similarly digested pGA482 plant expression vector, Isolated. cholera toxin alpha chain fusion protein cassette without sp56 insert The nucleotide sequence has 1956 bases and is listed in SEQ ID NO: 12. Ko Modification encoding lysine instead of arginine at position 7 of the rela toxin gene The cholera toxin α chain obtained is shown in SEQ ID NO: 12 at positions 787 and 788. Contains two adenine nucleotides instead of cytosine and guanine . Vector-labeled pRTLCTAm-sp5 with modified α-chain 6 is shown schematically in FIG. In the figure, all other vector The elements are similar to those described for FIG. It may contain the same vector elements as described above, but encode the cholera toxin β chain. The cholera β-chain fusion protein construct having the nucleotide sequence shown in FIG. I have. The sequence coding for sp56, which contains the end specific for BglII, is shown in FIG. At the BglII site in the cholera toxin β chain, designated as “sss” Is done. Null of the cholera toxin β chain HindIII fusion cassette lacking the p56 insert The nucleotide sequence is listed in SEQ ID NO: 13. To express larger sp56 polypeptides and fusion proteins, FIG. The vector pCTA02-1sp56, which is shown schematically in, was also constructed. Cl Nucleotides in the cholera toxin alpha chain other than the aI restriction site are removed, thereby Direct insertion of a similarly prepared sp56 insert into a KpnI / ClaI digestion vector Enables easy connection. When using other vectors, the fusion protein expression cassette Is used for subcloning for its expression into a plant expression vector, Hi. Isolated by digestion with ndIII. Depending on the selected shuttle vector used to prepare the fusion construct. Together with the cholera chain-encoding gene / sp56 coding region or cholera Hi lacking toxin alpha chain (pCTA02-1sp56), as well as control elements The ndIII isolated fragment was then separately and similarly digested with pGA48 [An (An) etc.Plant Molecular Biol oggy Manual A3, 1-19 (1988)]. Recombinant plant vector Tar is then used to infect plants such as tobacco and alfalfa. You. A preferred plant virus is Agrobacterium (Agrobacteriu m ) Strain LBA4404.4. Synthetic murine (murine) sp56 polypeptide and chimeric sp56 polypep Preparation of Pide Immunogen Alternative, but equally effective method for preparing immunocontraceptive molecules of the invention In the case of injection into the patient receiving it, Sp5 for use as a hapten to produce an immune response in cooperation with the offspring A 6-derived polypeptide is synthesized. As an example of this attempt, the sss3 cDNA listed in Table 1 Underlined single letter amino acid residue sequence CNISETNVTNKT YLFGH 16 amino acid peptide of sp56 specific sequence having (SEQ ID NO: 14) Pide was used as a hapten to immunize mice orally. Pep Cid joins The Scripps Research Institute Core Facility (The Scripts Research Institute Cor e Facility), which comprises additional cysteine at the N-terminus. Was included. The underlined portion of the peptide is the sp56 protein listed in SEQ ID NO: 2. It corresponds to amino acid residues 396-411 of the Park. Reverse of the above sp56 peptide Has the amino acid residue sequence CHGFLYTKNTVNTESIN (SEQ ID NO: 15). The corresponding peptide was used as a control to evaluate the specificity of the immune response. This hapten (1.5 mg) was added via the exposed N-ethylmaleimide 1 mg of Sulfo-SMCC modified cholera toxin B subunit (CT-B, (Up to 10 SMCC residues per buunit). Resulting exemption The epidermis was named CT-B-sss3pp. Cholera toxin is orally resistant ( Provides other haptens to develop strong mucosal immune responses without tolerance Selected as an adjuvant or carrier Selected [Black (Black), etc.Infect. Immunity, 55 Volume, pp. 1116-1120 (1987); McGhee, et al.R eprod. Fertil. Devel. 6, 369-379 (1994). Year)]. Alternative reagents, including diphtheria toxin, are also useful as carriers. CT-B containing peptide haptens (CT-B-sss3pp) Aliquots purified by dechromatography and subjected to SDS-PAGE analysis Analysis confirmed the modification. The resulting immunogen was then As described in 5, used to immunize mice. The other sp56 polypeptides listed in Table 1 induce immune contraception upon oral ingestion Similarly prepared as an immunogen for use in Those skilled in the art will also -The use of synthetic polypeptides with or without cooperation with molecules And that the carrier molecule is not limited to cholera toxin.5. Immunization of mice with sp56 immunogen The ability of the sp56 composition to play a role as an immunocontraceptive Purified, denatured, reduced sp prepared as described in Example 1. 56. For testing, one 25 day old male mouse was purified Immunized intraperitoneally with modified, reduced and reduced sp56 (complete flow on day 1). 500 ng of Indian adjuvant, incomplete Freund's adjuvant on day 60 500ng). Sham injections of complete and incomplete Freund's adjuvant Performed on other male mice. Sections of testes from males immunized with sp56 were from goat anti-mouse Ig conjugated Using dish peroxidase, color with diaminobenzidine They were counterstained with toxillin / eosin and analyzed immunohistochemically. Same person Compared to sections of testes from placebo-immunized males stained immunohistochemically When immunized with sp56, males immunized with sperm cells and sperm removal were prolonged. Had been. Observed sperm as closed cells stained positively for mouse Ig Late removal of formation was most likely due to immune attack. The immunized male 4, mated and inserted with 4 female mice, but no offspring were observed. With placebo Immunized males produced 5 litters. This result was translated into sp56 in mice. Have been shown to result in male infertility. To evaluate other sp56-derived polypeptides that act as immunocontraceptives First, the hapten-modified CT-B prepared in Example 4 (CT-B-sss3pp, Experimental, mouse number 5-8) or CT-B alone (CT-B, control, mouse number) 1-4) is a 28-day-old virgin female mouse (HSD: ICR strain, Harlan Spragg) -Dolly) contains approximately 20 μg protein / week / 100 μl saline Mice were used to administer weekly intubation. After three weekly intubations, the orbit Bleeding in the inside gives serum, and the mucosal extract is a homogenized stool pellet. Obtained. Diluted serum (50 μl, 1/10 in Tris buffered saline) And mucosal extract (one large homogenized in 0.5 ml of Tris buffered saline) 50 μl from the stool pellet) was purified (5 ng) from sp56 (freeze-dried). Incubated in 96-well plates containing Cheng, etc.J. Biol. Chem.125, 867-878 (1994)], antigen recognition was analyzed in a modified ELISA performed as described above. Was. To detect bound serum and mucosal Ig, goat anti-mouse IgG was used to increase silver Wide colloidal gold conjugate (Sigma, St. Louis, Mo.) and goat anti-mouse Ig A (Sigma) was used for each. Mouse immunized with sp56-derived hapten (CT-B-sss3pp, experimental) Contained antibodies that recognized the purified sp56 shown in Table 2. blood The results were the same for both clear IgG and mucosal IgA. About each immunogen , What was provided as positive (+) or negative (-) itself, results only Have been. Table 2 Mouse number Immunogen result 1 CT-B- 2 CT-B- 3 CT-B- 4 CT-B- 5 CT-B-sss3pp + 6 CT-B-sss3pp + 7 CT-B-sss3pp + 8 CT-B-sss3pp + As shown in Table 2, four mice immunized with CT-B-sss3pp All contained both IgA and IgG bound to sp56, whereas 4 All of the mice immunized with CT-B did not detect the protein in a detectable manner. Did not contain body. Immunohistochemistry and Wester to characterize antisera of immunized mice Both mouse sperm and solubilized mouse sperm tan Park was done individually. Sera from immunized mice were injected into the orbit after three weekly oral immunizations. Obtained by blood. Diluted serum (Tris buffer) for immunohistochemical analysis 1/10) in a saline solution was fixed on a glass slide. Sosomes Recognize IgG in Intact Mouse Sperm (from Unimmunized Males) As previously described [Cheng et al.J. Biol. Che m. 125, 867-878 (1994); Book binder (Boo). kbinder), etc.Science269, 86-89 (1995) Using colloidal gold-conjugated goat anti-mouse IgG (Sigma) Tested by gold staining. IgG from mouse number 5 immunized with CT-B-sss3pp was exclusively A region of the plasma membrane covering the acrosome of unimmunized sperm (sp56 Is located). Serum IgG from mouse nos. Chemical staining gave the same pattern. From mouse number 1 immunized with CT-B alone IgG binding was not detected. Serum IgG from mouse numbers 2-4 was Immunostaining gave the same pattern. Mouse numbers 1 and 5 (control CT-B and CT-B-sss3p, respectively) p) immunized with serum IgG by Western blot. It was analyzed for isomerism. For this assay, unimmunized mouse sperm Total Triton soluble protein from offspring is converted to SDS-PAGE Provided, transferred to Immobilon membrane and stripped (Containing about 505 g of sperm protein per strip) Cheng), etc.J. Biol. Chem.125, 867-878 (1 994)] and probed with immune serum. Probed with antibodies The membrane was developed with silver-amplified immunogold staining as described above. Probe the blot The basic antibody used for the mouse was from mouse number 1 (1/100 dilution) Is the antibody from mouse number 5 (1/10 dilution) or anti-sp56 monoclonal Antibody 7H12 (50 μg / ml; positive control). Western blot analysis of total detergent soluble sperm proteins was performed on sp56 Was the only protein recognized by the anti-sss antibody. CT -Serum IgG from mice immunized with B-sss3pp is shown in FIG. Thus, a single 40 kDa band was recognized on the non-reducing gel. In the figure In addition, the positive control monoclonal antibody 7H12 also contains a 40 kDa protein. Immune reaction. "O" indicates the origin of the separating gel. These results were selected sp56 sss3p hapten successfully used to orally immunize mice And that an immune response was directed against sp56 in situ. Is shown. Spermatozoa from the immunized mice are then immunized with the sp56 polypeptide of the invention. To evaluate the direct effects of the contraceptive composition, it was analyzed immunohistochemically. this For the assay, see [Brail and Wasserman (Was). sarman),Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 85 volumes, 6778-6783 (1988)] from immunized mice. Epididymal sperm are isolated and incubated in a medium that supports capacitation for 30 minutes. Was added. The incubated spermatozoa are from the immune system previously described above. Fixed and prepared for weaving chemistry. The sperm that was dried and applied to the culture dish Restored (hydrated), TNBG (50 mM Tris-HCl) at 25 ° C. for 4 hours PH 7.5, 150 mM NaCl, 4 mg / ml bovine serum albumin (B SA) [Sigma], and incubated in 5% normal goat serum [Sigma]) And then at 50 μg / ml colloidal gold-conjugated goat anti-mouse IgA (Signal 4) Incubated for 4 hours in TNBG containing Sperm is washed and silver And counterstained as described above. Obvious observations indicate the level of sperm motility from control or experimental mice (and 70%) or between types. CT-B-sss3pp Acrosome-complete spermatozoa from immunized mice have “crescent moon” at sp56 position. Completely restricted to the surface of the plasma membrane overlying the acrosome Immunogold staining was indicated. In sperm from control CT-B immunized mice, immunogold staining was , Not detected. Sperm from immunized mice was then characterized in a sperm-egg binding assay Can be As described above, a portion of the sperm incubated for capacitation Are described in [Brail and Wasserman]. ,Proc. Natl. Acad. Sci. , USA85, 6778-67 83 (1988)], using sperm-egg by using a mouse egg without a lump. The binding assay was challenged. Number of bound sperm per egg (per assay, Ten eggs and two two-cell embryos) are measured as described above. Other mice (male and female) were tested for recombinant and synthetic molecules, respectively. Equivalently prepared sp56 immunities prepared as described in 3 and 4 Immunized using a contraceptive composition. Response to immunization uses carrier molecules Assayed, prepared either recombinantly or synthetically, with or without Described herein for each of the sp56 protein or polypeptide reagents. Is evaluated as follows. Successfully immunized with sp56 immunocontraceptive proteins or polypeptides of the invention. The resulting male mice are then mated to assess reproductive potential. E All from the group containing at least one that has demonstrated an immune response by LISA Males and females were tested on day 60 (6 days post immunization) to test for infertility. On day 0), they are separately mated with an unimmunized partner. Up to 20 days Paddles are kept in cages and females are inspected each morning for mating plugs. Mating, Non-immunized females will have 20 days and then 21 days It is examined by both obvious observations of abdominal distention and delivery. Immunized male Successful contraception is due to the inability to give birth to non-immunized females (eg, Measured) as a percentage. Mated and immunized females are separated and Tested for pregnancy in the manner described above. Successful contraception of immunized females does not give birth Mating, measured as percentage of immunized females. For each group, the minimum success rate The requirement is 50% contraception for males and 50% contraception for females. this Even at these lower numbers, the effectiveness of the reagents is sufficient to reduce rodent solids. You. On day 101, 10-20 successfully immunized contraceptive males (5 or less from each group) Is then analyzed to determine the site of immunocontraception. These males are immune She is mated with a non-female. The mated female is sacrificed 7 hours after mating, Their fallopian tubes and uterine horns were cut open and flushed with saline. Everything All cellular material is separated by centrifugation. Possible in flushing water (flash) Soluble substances were analyzed for anti-sp56Ig by ELISA, as described above. You. The determination of the Ig type is performed by ELISA. If there is no sperm in the wash water What is meant is the removal of sperm upstream of the immune attack and ductal defenses. Washing water The sperm found therein has impaired motility, with T cells or macrophages. Association and goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase conjugation Antibody coating with the body is observed. In all cases, the Fc receptor Is bonded to the above-mentioned [Cheng et al.J. Biol. Chem., 125, 867-878 (1994)]. Pre-blocked. The association of Ig and / or immune cells with the presence of sperm Figure 7 shows mucosal immune attack on spermatozoa differentiated in epididymis or semen. Next, half of the successfully immunized sterile males are sacrificed and the reproductive organs become immune dependent. Analyzed in terms of pathology. The testes and epididymis are fixed and Embed, section and stain. These infertile, sp56 immunized male testes And epididymal sections were immunoassembled to determine the method of immune attack, as described above. Analyzed by science. This procedure is based on the finding that the immune response is Lphage, killer T cells) or simply circulating Or by attack by secreted antibodies. this The male cadaver immunized with 5 to 5 sp56s was the Scripps anima. Le Facility Veterinarian (The Scripts Animal) (Facility Veterinarian), dissection in other organs Further analysis for pathology. If a female immunized with sp56 was contraceptive (ie, determined by mating plugs to mate) If they prove success, but no progeny), then An immune attack on sperm in the horn is tested. Contraception of 10 animals, TMV-sp56 immunity Epidemic females are mated with unimmunized males and their tubules and uterine horn Sperm is analyzed for evidence of an immune attack, as described above. Determine if TMV-sp56 protein or polypeptide immunity is reversible Further assays are performed to determine. The reversibility of sp56-dependent infertility is Threatened or endangered It may be desirable if the teeth occupy the same ecological status as the harmful rodent population unknown. Because of this situation, the remaining fertility of the well-immunized male and female Testing continues. After day 81, the animals are replaced with wild-type TMV or other An edible pellet feed containing the delivery vehicle is provided. 120 days ago As noted, their fertility is tested. Successful reversibility of sp56-dependent infertility Percentage of unimmunized females delivered after mating with male immunized with sp56 And one hundred sp56 immunized females delivered after mating with unimmunized males. Minute It is measured as a percentage.6. Isolation of a mammalian cDNA homolog of murin (murine) sp56 Mammalian cDNA of murine cDNA sp56 obtained as described in Example 2. NA homologs are obtained by the screening protocol described herein. The protocol is designed to screen mammalian tissues However, the procedure has been described for isolating only human homologs. Skilled person Have described the described method for isolating human sp56 homologs in other mammalian hosts. Understand that it is easily applied by estimation for use in identifying mologs I do. Furthermore, those skilled in the art will appreciate that the identification of mammalian homologs can be accomplished using the methods described herein. Also understand that it is not limited. In preliminary screening, less stringent Northern Analysis (probe with full-length cDNA encoding mouse sperm sp56) A faint RNA band was detected in the 2 kb range. RNA hybridization Can only be detected with low stringency and therefore are encoded by that RNA. The homologs are probably distantly related to sp56. Human sperm protein Human oocyte ZP recognition domain in a mouse [Flowman (Fl orman), etc.Devel. Biol.106, 243151 (19 1984); Florman and Wasserman an),Cell41, 313-324 (1985); eir) and Wasserman,Proc. Natl. A cad. Sci., USA 85, 6778-6678 (1988)]. This is because it can recognize ZP polypeptides instead of carbohydrates, May be expected. Further Northern blot analysis of human testis RNA encodes sp56 homologs For identifying human testis cDNA to be loaded (derived from sp56 cDNA) Is performed to identify All Northern blot analyzes were successful R After using probes for isolation, transcription and G3PDH mRNA of NA, Tested for delivery by cleaning. encodes sp56 homolog To detect human testicular RNA by Northern blot, two types of nucleic acid Robes are used. Providing the highest peak / noise ratio and also on the blot These probes, which clearly bind to the lowest number of RNA bands, Selected for screening These probes are described as follows:Type I probe : Double strand³²DNA sp56c randomly prepared with P label The DNA probe has the full length sp56 cD having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Prepared from NA clone 7.1 or from a subclone of its cDNA, As noted [Bookbinder, etc.Sciencec e 269, 86-89 (1995)], and probe Northern blot Used to The full-length probe is the Northern block of mouse testis RNA. Have been used successfully to identify sp56 RNA in Thus, it has the advantage of detecting human testis RNA with relatively low stringency. Change Studies are performed using full length probes of the resulting Northern blots. In that research In order to obtain a better peak / noise ratio, The strictness of the washing conditions is varied. For example, washing after hybridization Purification is repeated using 4 × SSC, 0.5% SDS (25 ° C.) The degree was later diversified (4x-6x) and the concentration of SDS was diversified (0.5% -0 . 1%), and in some experiments, Denhardt's reagent (Denhars reagent). dt's Reagent) or the like. Instead, no To screen the Zan blots, as described above, the sp56 cDNA And the 5 'half of sp56 cDNA clone 7.1 (Base 1-1300 of SEQ ID NO: 1) or sp56 cDNA clone 7.1 Another probe corresponding to the 3 'half (bases 1301 to 2050 of SEQ ID NO: 1) ,used.Type II probe : Derived from sp56 cDNA, Single-stranded synthetic biotinylated deoxyribonucleotide 60-mer antisense , The probe is from The Scripps Institute Core Facility ( The Scripts Institute Core Facility Synthesized by These antisense probes are the successors of gene banks issue In the sp56 cDNA sequence listed as U17108 and in SEQ ID NO: 1 The phase described below, written in the 5 'to 3' direction to the region indicated therein With complement sequence: Complementary to nucleotides 1-60 (SEQ ID NO: 1) in the 5 'untranslated region: 5'TCTGGAATAAGACGGTAGGAAGACTCTAGTGTTGCCC TTGGGTTTTTCGCCCCTCCCTGGTCC3 '(SEQ ID NO: 16); Complementary to nucleotides 181-240 (SEQ ID NO: 1) in Sushi domain 1 What: 5'GTTGTGTGACTCATACAACTGGTTTGGTTGGAGAAG CAAACGGTAAAAGGGGTGGAGGGTCCA3 '(SEQ ID NO: 17); Complementary to nucleotides 781-840 in Sushi domain 4 (SEQ ID NO: 1) What: 5'CCCTTCTTGCCATCGATCTCAAGAGCGTCCTCTGT ACGCATAGAACTGTCGAATCCAGGGG3 '(SEQ ID NO: 18); and Nucleotides 1381-1440 in the sequence specific domain (sss) (SEQ ID NO: Complementary to 1): 5 'CCTTTCATGGCATGCTCGGGTTGAGTTTTCTTTCAT GACCAAATAGATAGGTTTTGTTTGTC3 '(SEQ ID NO: 19). Four probes show potential for human sperm analog of sp56 Were selected based on the determined sp56 homology. The 5 'untranslated region is Was selected for its almost reliable adjustment function. Sushi domains 1 and 4 The region is such that the N-terminal half of sp56 contains the conserved sperm anchoring anchor. Most are preserved, with evidence that they represent the main. sp56 carbohydrates The sp56-specific sequence (sss) as part of the recognition domain is not conserved. Apparent and serves as a negative control in Northern blot analysis. I However, it clearly and satisfactorily detects human testis RNA on Northern blots. Any (or all) of the probes Used for The single-stranded biotinylated polynucleotide probe was purchased from the manufacturer [ Under the conditions suggested by Millipore, Bio-Rad] Northern blots containing UV cross-linked RNA from human testes and mouse testes (positive control) Hybridized to blot. To obtain the highest peak / noise ratio, Post-hybridization washes are performed under varying levels of stringency. Yes For brid detection, blots were subsequently treated with streptavidin-alkaline. Probed with phosphatase conjugate and using BCIT-BPT reagent Color. sp56 cDNA sequence (the probe of which sequence is Revealed to better detect individual RNA bands on Southern blots Was subsequently used to screen a human testis cDNA library. Used. Dr. Brail's lab has joined the [Bookbine (Bookbinder), etc.Science269, pp. 86-89 ( 1995)] and approximately 10 in the λ-ZapII vector.⁸ -DT-primed human testis cDNA library containing two independent clones Developed. Comparable libraries are also available on the market. The above The probe selected in this way is essentially a screen of the mouse testis cDNA library. To screen a library, as described above for used. Plaques detected in such a screen are And the sequence of the cDNA is determined as described above. The sequenced cDNA is a human analog of sp56 based on the following criteria: Identified as candidate cDNAs encoding: 1. Probes to identify cDNA clones are available in mice (positive control) and humans. Individual RNA bands detected on both Northern blots of testicular RNA Must. Probe encoding sp56 sss as described above Expected to identify human testis RNA or their individual cDNAs Not. 2. The translated sequence of the selected cDNA was a sp56 amino acid sequence (less At least half). sp56 Are protein receptors (each of which is called a Sushi domain) (Including short homologous repeats) Others in the par family (not sp56 homologs) were identified by chance. Can be For example, the α subunit of the complementary 4B binding protein (C4BP) , With 47% overall amino acid identity, most closely related to sp56 Connect. However, N-terminal side of sp56 of Sushi domain 1-5 Half have 54% amino acid identity to human C4BP, while Su shi domain 6, SSS, Sushi domain 7 and basic C-terminal The C-terminal half, including the amino acid sequence, is 36% amino acid identical to human C4BP. Only has sex. Therefore, sp56 is a candidate as a human sperm homolog. In order for the translated sequence of the selected cDNA to be greater than 47% Must have overall amino acid identity to 56, or Indicates that the N-terminal half must have greater than 54% identity, Alternatively, it must have more than 36% identity at the C-terminal half. These requirements are for proteins that are not functionally homologs of mouse sperm sp56. It is chosen to minimize the chance of identifying a park. The cDNA selected and sequenced to meet the above criteria is a sp56 human. Identified as encoding a candidate sperm homolog. The human sp56 homolog is Must be restricted to late in spermatozoa and spermatogenesis and are free of other human tissues Must be present. Candidate protein expression is restricted in humans To test whether or not human tissues (heart, liver, epithelium, testis) Northern blot of RNA extracted from round, muscle, lung, brain, kidney and ovary) Analysis derived from selected human testis cDNA³²P hybridization -It is performed using a probe. Suppose, like Mulin sp56, Northern Bro Show that RNA encoding the candidate sp56 homolog is exclusively present in testis If revealed to be expressed, the encoded protein can be used in vivo. Irrespective of its function in humans, represents an ideal immunocontraceptive goal in humans You. One other required feature of one such candidate is that it is a valid goal. If the protein is expressed on the surface of human sperm . Identification and sequence analysis of human or other mammalian homologs is subsequently Sp prepared as described in Examples 3 and 4 and released as described in Example 5 It allows the preparation of 56 protein and polypeptide immunogens. The preceding specification, including specific embodiments and examples, is illustrative of the invention. It is intended to be and is intended to be construed as limiting. Not. Many other variations and modifications may be made without departing from the true spirit and scope of the invention. And modifications can be made.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｊ 33/53 33/53 Ｄ 33/577 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者ブックバインダー、ルイス・エイチアメリカ合衆国、カリフォルニア州 92122、サン・ディエゴ、クリスタル・ドーン・ドライブ 4075、ナンバー 204、──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C07K 16/18 C07K 16/18 C12P 21/08 C12P 21/08 G01N 33/50 G01N 33/50 J 33 / 53 33/53 D 33/577 33/577 B // C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA (72) Inventor Bookbinder, Louis H. Crystal Dawn, San Diego, USA 92122, California, USA・ Drive 4075, number 204,

Claims

[Claims] 1. Has the sp56 antigenic determinant in combination with a pharmaceutically acceptable excipient Antigenic polypeptides to induce anti-sp56 antibodies in mammals. An immunocontraceptive vaccine composition comprising an effective amount. 2. 2. The method of claim 1, wherein the antigenic determinant comprises a sp56 species-specific sequence (sss). Composition. 3. 2. The antigenic determinant comprises the Sushi domain of sp56. Composition. 4. The antigenic polypeptide is a synthetic polypeptide, hybrid molecule, fusion Proteins, recombinant proteins, chimeric polypeptide molecules and isolated proteins 2. The composition of claim 1, wherein the composition is selected from the group consisting of park. 5. The mammals are rodents, ungulates, marsupials, primates, pigs, dogs, cats, The composition of claim 1, wherein the composition is selected from the group consisting of: and a human. 6. The antigenic polypeptide is SEQ ID NO: 2:32 to 547, 2: 1 to 54 7, 2: 1 to 477, 2: 1 to 59, 2: 3 to 32, 2: 34 to 46, 2: 64-121, 2: 65-90, 2: 92-104, 2: 126-186, 2: 127-154, 2: 156-168, 2: 191-246, 2:19 2-218, 2: 220-232, 2: 251-313, 2: 252-28 4, 2: 286-300, 2: 317-379, 2: 319-350, 2: 352-365, 2: 319-338, 2: 340-350, 2: 424- 477, 2: 425-450, 2: 452-464, 2: 380-423, 2: 383-398, 2: 396-411 and 2: 406-421. The composition of claim 1, comprising a polypeptide selected from the group consisting of: 7. 7. The composition of claim 6, wherein said composition comprises two or more of said antigenic polypeptides. Composition. 8. Further comprising a carrier, an immunostimulant, an antigenic molecule or an adjuvant; The composition of claim 1. 9. The carrier is cholera toxin subunit A, cholera toxin subunit B, diphtheria toxin, influenza virus HA protein, mouse leukemia Virus coat protein, salmonella surface protein, and tobacco mosai A polypeptide selected from the group consisting of quavirus coat proteins The composition of claim 8. 10. The composition of claim 1, further comprising a stabilizer. 11. The carrier is a non-toxic, edible carrier The composition of claim 8. 12. The composition according to claim 11, wherein the carrier is a plant substance. 13. 12. The composition of claim 11, wherein the composition is formulated as a feed or feed. Composition. 14． The hybrid molecule is operably linked to a second polypeptide domain A first polypeptide domain consisting of a modified sp56 antigenic determinant. The composition of claim 4. 15. The second polypeptide domain is cholera toxin subunit A, cholera Toxin subunit B, diphtheria toxin, influenza virus HA tamper Protein, mouse leukemia virus coat protein, Salmonella surface protein, Selected from the group consisting of and tobacco mosaic virus coat protein, A composition according to claim 14. 16. The hybrid molecule defines a sp56 species-specific sequence (sss) Cholera toxin subunit A polypeptide operably linked to a polypeptide 15. The composition of claim 14, comprising a polypeptide having a tide domain. 17． The sss polypeptide is 2: 380-423, 2: 383 -398, 2: 396-411 and 2: 406-421. 17. The composition of claim 16, which is selected. 18. The hybrid molecule is a fusion protein, and the operable linkage is A peptide bond between said first and second polypeptide domains; A composition according to claim 14. 19. The hybrid molecule is a chimeric polypeptide molecule and the operable 15. The composition of claim 14, wherein the link is a chemical crosslink. 20. Use of the immunocontraceptive composition according to claim 1 to induce the production of an anti-sp56 antibody. An immunocontraceptive method comprising administering to a mammal in an effective amount. 21. The above administration route is a group consisting of oral, intravenous, subcutaneous, intramuscular and intraperitoneal. 21. The method of claim 20, which is selected. 22. 22. The method of claim 21, wherein said oral administration is by food intake. 23. The mammals are rodents, ungulates, marsupials, primates, pigs, dogs, cats, 22. The method of claim 21, wherein the method is selected from the group consisting of: and a human. 24. A method for determining sterility in a mammal, comprising the steps of: a) determining a bodily sample containing antibodies from the mammal by the sp56 antigen of the mammal; Mixing with an antigenic polypeptide having a group; b) reacting said mixture with said polypeptide immunoreacting with any of said antibodies; Maintaining under conditions sufficient to form an immune response complex; c) detecting the presence of the immunoreactive complex in the mixture. 25. An antibody that immunoreacts with an antigenic polypeptide having an sp56 antigenic determinant. The polypeptide is not more than about 65 amino acid residues in length; Column numbers 2: 1 to 59, 2: 3 to 32, 2:34 to 46, 2:64 to 121, 2: 65-90, 2: 92-104, 2: 126-186, 2: 127-1 54, 2: 156-168, 2: 191-246, 2: 192-218,2 : 220-232, 2: 251-313, 2: 252-284, 2: 286-300, 2:31 17-379, 2: 319-350, 2: 352-365, 2: 319-3 38, 2: 340-350, 2: 424-477, 2: 425-450,2 : 452-464, 2: 380-423, 2: 383-398, 2: 396 411 and 2: 2: 406-421 comprising a sequence selected from the group consisting of: antibody. 26. The polypeptide is SEQ ID NOs: 2: 1 to 59, 2: 3 to 32, 2:34 to 46, 2: 64-121, 2: 65-90, 2: 92-104, 2: 126 186, 2: 127-154, 2: 156-168, 2: 191-246 2: 192-218, 2: 220-232, 2: 251-313, 2: 2 52-284, 2: 286-300, 2: 317-379, 2: 319-3 50, 2: 352-365, 2: 319-338, 2: 340-350,2 : 424-477, 2: 425-450, 2: 452-464, 2: 380 423, 2: 383-398, 2: 396-411 and 2: 406-4. 26. An amino acid residue sequence selected from the group consisting of 21. Antibodies. 27. 26. The antibody according to claim 25, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 28. A method for determining male sterility in a mammal, comprising the steps of: a) determining a bodily sample containing sperm from the mammal by sp56 antigen determination of the mammal; Mixing with an antibody that immunoreacts with the antigenic polypeptide having a group; b) combining the mixture with the sperm whose antibody comprises the antigenic determinant in the body sample. The condition must be sufficient to immunoreact with any to form an immune response complex. Holding process; c) detecting the presence of the immunoreactive complex in the mixture.