JP2000514430A - 精子抗原を含む免疫避妊組成物およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳類ｓｐ５６精子タンパク抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドを含む免疫避妊ワクチン組成物に関する。抗原性ポリペプチドは、合成ポリペプチド、融合タンパクおよびキメラ分子であってもよい。ワクチンは、好ましくは野生の哺乳類に餌または飼料製剤中で投与する。ある態様では、ｓｐ５６の種特異的配列の用途を説明する。免疫避妊方法、ｓｐ５６抗原決定基と免疫反応性の抗体、および精子の受精能のスクリーニング方法も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 精子抗原を含む免疫避妊組成物およびその使用方法技術分野 本発明は、一般的に免疫避妊タンパクをコードする哺乳類ｓｐ５６ ｃＤＮＡ 核酸の発見に関する。本発明は、さらに、免疫避妊に関連するスクリーニング方 法、診断方法および治療方法に有用な免疫避妊ポリペプチドを記載する。背景 経口避妊ワクチンの開発の可能性に対する近年の関心は、その潜在的なコスト に対する有効性および副作用の欠如に起因する〔Alexanderand Baily，Reprod． Fertil．Devel.，6:273-280(1994年)〕。経口的に投与すると、配偶子特異的ワ クチンは、生殖器官に限定された粘膜免疫攻撃を惹起し、一方または両方の配偶 子を排除する〔Mestecky and McGhee，Adv．Immunol.，40:153-245(1987);McGhe e et al.，J．Clin．Immunol.，9:175-199(1989);Stern et al.，J．Reprod．Im munol.，22:73-85(1992);Meinertz et al.，Amer．J．Reprod．Immunol.，25:15 8-162(1991);McGhee et al.，Reprod．Fertil．Devel.，6:369-379(1994)〕。 経口避妊ワクチンの開発は、精子−卵相互作用に必要な細胞特異性に基づいて いる。卵を受精させるためには、哺乳類精子は、まず、卵をとりまいている厚い 細胞外糖タンパクのコートである透明帯に特異的に強固に結合しなければならな い。結合は、精子の頭部原形質膜と透明帯の表面との間の接触に関連し、かなり 種特異的である。例えば、マウスにおいては、精子は透明帯の３つの糖タンパク の１つであるＺＰ３を認識する。精子原形質膜によって認識されるＺＰ３のドメ インは、３，９００ダルトンのＯ−結合オリゴ糖である。ＺＰ３のアミノ酸配列 は種間でほとんど変化しないので、そして精子−卵認識におけるその偏在的な役 割のため、ＺＰ３を標的とする免疫避妊剤の開発にはかなりの努力がなされてき た〔Spifano and Dean，Rep．Fertil．Devel.，6:319-330(1994)〕。 この戦略は、理論的には有効である可能性があるが、最近の研究では、ＺＰ３ 由来Ｂ細胞エピトープで雌マウスを経口的に免疫することによって加速された濾 胞の閉鎖（follicular atresia）および濾胞細胞の大量増殖を含む卵巣の病変が 起 こり得ること、そして免疫反応は必ずしも避妊をもたらさないことが示唆されて いる。卵巣の病変は、雌をＺＰ３で免疫した後に予期されうる。これは、免疫攻 撃および濾胞からの生育卵母細胞の除去が、卵母細胞からの「生育停止」信号の ない状態では、無制限の濾胞細胞の分裂および腫瘍の形成をもたらしうるためで ある。 有効な免疫避妊剤の開発への別の戦略は、精子特異的抗原を標的にすることで ある。雄におけるそのような抗原の免疫攻撃は、それらの動物を不妊にさせる。 抗原の抗体攻撃は、精子形成中に起こるとしても、精細管における初期の減数分 裂の事象を妨害したり、それに影響を与えたりすることがないはずであり、した がって無制限な細胞増殖をもたらさないと考えられる。さらに、免疫された雌は 、雌性生殖管における精子の免疫攻撃のため、不妊になる可能性が高い。精子ヒ アルロニダーゼＰＨ−２０抗原〔Primakoff et al.，Nature，335:543-546(1988 );Fiszer-Szafarz et al.，Acta．Biochimica Polonica，42:31-33(1995);Lin e t al.，J．Cell．Biol.，125:157-163(1994);およびGmachl et al.，FEBS Lett. ，336:545-548(1993)〕、精子乳酸デヒドロゲナーゼアイソザイムＬＤＨ−Ｃ４ 〔Goldberg et al.，Fertil．Steril.，35:214-217(1981);Freemerman et al.， Mol．Reprod．Dev.，34:140-148(1993)〕、アクロソーム内タンパクｓｐ−１０ 〔Srinivasan et al.，Biology of Reprod.，53:462-471(1995)〕、およびｓｐ １７〔O'Rand et al.，J．Reprod．Immonol.，25:89-102(1993)〕を含む多数の 精子タンパクが、動物を免疫し、および／または不妊を起こさせるために用いら れてきた。 ｓｐ５６と呼ばれるマウスの精子タンパクは、ＺＰ３の精子認識を媒介するタ ンパクに予期される特性の多くを有するものであり、最近になって同定されたも のである〔Bleil and Wassarman，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，87:5563-5567 (1990);Cheng et al.，J．Cell Biol.，125:867-878(1994)〕。ｓｐ５６は、マ ウス精子のＺＰ３認識タンパクを同定するために設計された研究において最初に 発見された。精製ＺＰ３を、光活性化可能な架橋剤で修飾して生きた精子で攻撃 し、またはアフィニティカラムに架橋して可溶性全精子タンパクと反応させた。 これら２つの独立の方法の各々で、唯一同定されたマウス精子タンパクがｓｐ５ ６である。ｓｐ５６は、ホモマルチマー状の末梢膜タンパクで、そのモノマーの サイ ズは５６，０００ダルトンであり、ＺＰ３結合部位が正確に位置しているアクロ ソーム（先体）の上を覆う精子頭部原形質膜のみに局在する。ｓｐ５６は、ＺＰ ３、Ｚｐ３のＦＤオリゴ体、およびＦＤ−オリゴ体の精子認識に必要な末端糖で あるａ−ガラクトースに対して特異的親和性を有するレクチンである。精子上の ＺＰ３結合部位の数に基づいて、およそ２５，０００のｓｐ５６分子が精子表面 に存在すると予測されている。 最近、ｓｐ５６をコードするｃＤＮＡがクローニングされた〔Bookbinder et al.，Science，269:86-89(1995)〕。単離されたｃＤＮＡから導かれたｓｐ５６ の一次配列は、それがＳｕｓｈｉドメインと呼ばれる一連の６０アミノ酸の長さ のホモロジー反復の存在を特徴とするタンパクレセプターのスーパーファミリー の一員であることを示す。各Ｓｕｓｈｉドメインは、実質的に不変の１０個のア ミノ酸を含む。そのスーパーファミリーの一員である資格と一致して、ｓｐ５６ ｃＤＮＡは、そのタンパクに特有のカルボキシ末端近くの４４アミノ酸のスト レッチをコードする。そのため、この特有のストレッチは、ｓｐ５６特異的配列 ドメイン（ｓｓｓ）と呼ばれ、種限定的エピトープを定義すると考えられている 。末梢膜タンパクをコードするｃＤＮＡに予測されるように、このｃＤＮＡ配列 は、Ｓｐ５６アミノ末端の上流に位置するシグナルペプチドをコードする。ｓｐ ５６ｃＤＮＡは、アミノ末端からｃＤＮＡオープンリーディングフレームの最後 までで決定した６２，０００ダルトンのポリペプチドをコードする。この６２， ０００ダルトンのポリペプチドは、「プロｓｐ５６」と呼ばれ、カルボキシ末端 のおよそ６，０００ダルトンのタンパク分解的除去により、成熟型ｓｐ５６（５ ６，０００ダルトン）にプロセッシングされる。したがって、この分子は、精子 ５６，０００ダルトンに関連して、ｓｐ５６と呼ばれる。ｓｐ５６ ｃＤＮＡか ら開発されたモノクローナル抗体および分子プローブは、ｓｐ５６の発現がマウ スの精子形成細胞のみに限定されていること、そのタンパクもｍＲＮＡも、いず れも他のマウス組織には蓄積しないことを明らかにするために使用されてきた。 しかし、上記の精子抗原とは対照的に、ｓｐ５６は以下の点において独特であ る。 1）ｓｐ５６発現は、精子のみに限定されており、密接に関連するタンパク（ ま たはアイソザイム）が体組織において発現されていないため、全身性免疫の機会 が最小である； 2）ｓｐ５６は精子表面に存在し、したがって雄および雌の両方の生殖管にお いて免疫攻撃にさらされている；そして 3）ｓｐ５６の発現は、免疫系の成熟後に起こり、これは雄および雌の両方の 免疫が「外来」抗原を提示することを意味する。 したがって、ｓｐ５６の上述の特徴に照らして、ｓｐ５６抗原性ポリペプチド に基づく免疫避妊剤ワクチン組成物を設計することは望ましいことである。本発明の簡単な説明 ｓｐ５６と名付けられた哺乳類精子タンパクが、げっ歯類からヒトまであらゆ る哺乳類種のための免疫避妊ワクチンとして有用であることが発見された。 したがって、本発明は、免疫避妊ワクチン組成物において有用なｓｐ５６抗原 決定基を含む種々の抗原性ポリペプチドを記載する。 また、上記抗原性ポリペプチドを含む餌（バイト）または飼料（フィード）製 剤を用いる経口避妊を含め、上記ワクチン組成物を用いる免疫避妊方法も記載す る。 本発明は、試料中のｓｐ５６抗原の存在を検出するのに有用な抗ｓｐ５６抗体 およびモノクローナル抗体も記載する。免疫学的方法は、ｓｐ５６抗原決定基お よび抗ｓｐ５６抗体を検出するための抗体および抗原性ポリペプチドを用いて企 図される。これらの方法は、精子の受精能の評価、精子ｓｐ５６抗原の検出およ び免疫応答を誘導する本発明のワクチンの有効性の確認に有用である。 組換えＤＮＡ発現ベクターおよびｓｐ５６抗原決定基を含む組換えタンパクの 製造方法も記載する。 本発明は、以下の利点を有する。 免疫避妊剤の使用は、ｓｐ５６抗原決定基に対する反復的な暴露がない場合に 循環抗体のレベルが低下する限りにおいて可逆的である。野生の有害動物制御の ための餌として調剤する場合、この物質は、毒素を含まない限りにおいて非毒性 であり、したがって、標的としていない動物またはヒトが偶然消費した場合に比 較的安全である。さらに、免疫避妊剤は、避妊が標的とする動物においてのみ達 成され、餌を偶然消費した他の動物またはヒトにおいては起こらないように、種 限定的ｓｐ５６配列を含むように調剤することができる。他の利点は、当業者に は容易に理解される。図面の簡単な説明 図１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１７１０８であるマウスｓｐ５６ ｃＤＮ Ａクローン７．１のアミノ酸残基配列を示す。シグナルペプチド（リーダー配列 ）は、−３２で始まり、下線で示す最初のＳｕｓｈｉドメインの２残基手前にあ るグリシン（ｇｌｙ）で終わる。残りの６個のＳｕｓｈｉドメインも同様に示す 。 図２は、ｓｐ５６ ７．１ｃＤＮＡクローンを図示したものであり、塩基番号 は「目盛り」の印で示す。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）およびポリＡシグナル を、実験的に決定したポリＡ部位とともに、目盛り上に示す。コードされたポリ ペプチド領域は、矢印で示す。Ｓｕｓｈｉドメイン１〜７、シグナルペプチド、 ｓｐ５６特異的配列（ｓｓｓ）、およびプロｓｐ５６ポリペプチドの塩基性Ｃ末 端テールの位置も示す。 図３は、典型的なＳｕｓｈｉドメイン構造を模式的に示す。それにおいては、 各ドメインが約６０アミノ酸で構成され、そのうち１０個の不連続なアミノ酸（ アミノ酸末端からカルボキシ末端に向かって、一文字表記でＣ、Ｐ、Ｙ、Ｃ、Ｇ 、Ｃ、Ｇ、Ｗ、ＰおよびＣを含む）が実質的に不変であり、配列内で特異的な位 置に存在する。残りの約５０個のアミノ酸はかなりの多様性を示す。この一般的 な構造は以下の特徴を有する。 1）Ｃ１−Ｃ３およびＣ２−Ｃ４の２つのジスルフィド結合がループドループ 構造を形成する； 2）各ジスルフィド結合の付近に少なくとも１個のプロリンがあり、連続する Ｓｕｓｈｉドメインの接続に必要な鎖のターンを提供する；および 3）内部疎水性ループ中にＧおよびＷが存在する。 図４は、ｓｐ５６ポリペプチド（この場合、ｓｐ５６特異的配列（ｓｓｓ）ド メイン）由来のもの）とともにＴＭＶコートタンパク（ｃｐ）を含むキメラポリ ペプチド分子をコードするキメラ遺伝子調製のための段階的方法の最初の部分を 示す。この方法は、キメラプライマーの調製の工程を含め、実施例３においてよ り完全に記載する。 図５は、完全ＴＭＶ遺伝子の相同領域中へのＴＭＶ／ｓｓｓ遺伝子のクローニ ングによる、ｓｐ５６ポリペプチドとともにＴＭＶコートタンパク（ｃｐ）を含 むキメラポリペプチド分子をコードするキメラ遺伝子調製のための段階的方法の 最終工程を示す。キメラポリペプチド分子の発現は、ウイルスコート上に露出さ れたｓｐ５６特異的ポリペプチド（ハプテン）を有するＴＭＶとともに示される 。最終工程は、実施例３においてより完全に記載する。 図６は、実施例３に記載するｐＲＬＣＴＡ−ｓｐ５６の模式的プラスミド地図 である。 図７は、実施例３に記載するｐＲＬＣＴｍ−ｓｐ５６の模式的プラスミド地図 である。 図８は、実施例３に記載するｐＲＬＣＴＢ−ｌｓｐ５６の模式的プラスミド地 図である。 図９は、実施例３に記載するｐＣＴＡ０２−ｌｓｐ５６の模式的プラスミド地 図である。 図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで非還元条件下での、免疫していないマウスから のマウス精子タンパクに対するＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐで免疫したマウスからの 抗血清のウェスタンブロット解析を示す。ＣＴＢ−ＳＳＳと表示したＣＴ−Ｂ− ｓｓｓ３ｐｐ免疫マウスからの抗血清および陽性対照のモノクローナル抗体７Ｈ １２は、分子量４０，０００ダルトン（４０kDa）の非免疫精子タンパクと特異 的に反応した。本発明の詳細な説明 Ａ．定義 アミノ酸残基 ：ポリペプチドをそのペプチド結合で化学的消化（加水分解）した 際に形成されるアミノ酸。本明細書において記載するアミノ酸残基は、好ましく は「Ｌ」アイソマー形態のものである。しかし、「Ｄ」アイソマー形態の残基は 、 そのポリペプチドが所望の機能的特性を保持する限り、任意のＬ−アミノ酸残基 を置換することができる。ＮＨ₂は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離 のアミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離 のカルボキシル基を指す。標準的なポリペプチドの命名にしたがって〔J．Biol ．Chem.，243:3552-59(1969)に記載されており、３７ＣＦＲ９１．８２２（ｂ） （２）で採用されている〕、アミノ酸残基の略号は以下の対応表に示すとおりで ある。 対応表 表記 アミノ酸 一文字 三文字 Ｙ Tyr チロシン Ｇ Gly グリシン Ｆ Phe フェニルアラニン Ｍ Met メチオニン Ａ Ala アラニン Ｓ Ser セリン Ｉ Ile イソロイシン Ｌ Leu ロイシン Ｔ Thr トレオニン Ｖ Val バリン Ｐ Pro プロリン Ｋ Lys リジン Ｈ His ヒスチジン Ｑ Gln グルタミン Ｅ Glu グルタミン酸 Ｚ Glx Gluおよび/またはGln Ｗ Trp トリプトファン Ｒ Arg アルギニン Ｄ Asp アスパラギン酸 Ｎ Asn アスパラギン Ｂ Asx Asnおよび/またはAsp Ｃ Cys システイン Ｘ Xaa 不明または他のアミノ酸 本明細書において式により表すすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端から カルボキシ末端への従来の方向に、左から右への方向性を有することに注意され たい。さらに、「アミノ酸残基」という語句は、対応表に列記したアミノ酸、お よび３７ＣＦＲ１．８２２（ｂ）（４）に列記され、参照により本明細書に包含 されるもののような改変および異常アミノ酸を含むように広く定義される。さら に、アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュは、１またはそれ以上のアミ ノ酸残基のさらなる配列とのペプチド結合またはＮＨ₂もしくはアセチル基のよ うなアミノ末端基もしくはＣＯＯＨのようなカルボキシ末端基との共有結合を示 すことに注意されたい。組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子 ：作動可能に連結された２つのＤＮＡセグメント により生成されるＤＮＡ分子。したがって、組換えＤＮＡ分子は、天然には通常 は一緒に見出されない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤ ＮＡ分子である。ｒＤＮＡが共通の生物学的起源を有さないこと、すなわち進化 的に異なることは、「非相同（ヘテロロガス）」と呼ばれる。ベクター ：細胞内で自立的に複製可能なｒＤＮＡ分子であって、これに、ＤＮＡ セグメント、例えば遺伝子またはポリヌクレオチドが、接続したセグメントの自 律的複製をもたらすように作動可能に連結される。１またはそれ以上のポリペプ チドをコードする遺伝子の発現を指令することができるベクターは、本明細書に おいて「発現ベクター」と呼ばれる。抗体 ：抗体という用語は、本明細書において免疫グロブリン分子および免疫グロ ブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗体結合部位またはパラトープを 含む分子を指すために、種々の文法的形態で用いられる。例示的な抗体分子は、 インタクトな（完全）免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリ ン分子および免疫グロブリン分子の部分〔Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂お よびＦ（ｖ）のような当業界で公知の部分を含む〕である。抗体結合部位 ：抗体結合部位は、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する ）重鎖および軽鎖可変および超可変領域から構成される抗体分子の構造的部分で ある。種々の形態の「免疫反応（する）」という用語は、抗原決定基を含む分子 と、全抗体分子またはその部分のような抗体結合部位を含む分子との間での特異 的結 合を意味する。モノクローナル抗体 ：種々の文法的形態で、モノクローナル抗体は、特定のエピ トープと免疫反応することができる１種の抗体結合部位のみを含む抗体分子の集 団（ポピュレーション）を指す。したがって、モノクローナル抗体は、典型的に は、それが免疫反応する任意のエピトープに対する単一の結合親和性を表す。そ のため、モノクローナル抗体は、各々が異なるエピトープに対して免疫特異的で ある複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば二特異性抗体を含みうる。歴 史的には、モノクローナル抗体はクローンとして純粋な免疫グロブリン分泌細胞 株の不死化によって作成されたが、本発明の方法により作成することもできる。上流 ：ＤＮＡ転写の方向と逆であって、非コード鎖上で５'から３'へ、ｍＲＮＡ 上で３'から５'へ向かう方向。下流 ：配列転写または読み取りの方向にＤＮＡ配列に沿うことであり、ＤＮＡの 非コード鎖に沿って３'から５'方向へ、またはＲＮＡ転写物に沿って５'から３' 方向へ向かうことである。リーディングフレーム ：遺伝子の構造タンパクコード部分または構造遺伝子を定 義する、翻訳に使用される連続するヌクレオチドの３つ組（トリプレット、コド ン）の特定の配列。リーディングフレームは、翻訳開始コドンの位置に依存する 。ポリペプチド ：連続するアミノ酸残基のα−アミノ基とカルボキシル基との間の ペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸残基の直線状の系列。タンパク ：ポリペプチドにおけるように互いに連結された５０を超えるアミノ酸 残基の直線状の系列。実質的に純粋な、または単離された ：ポリペプチドまたはタンパクの文脈におい て使用される場合、これらの用語は、天然にそれらに付随する成分から分離され た分子を意味する。典型的には、モノマータンパクは、少なくとも約６０％〜７ ５％の試料が単一のポリペプチド骨格を呈する場合、実質的に純粋である。重要 でない変異体または化学修飾物は、典型的には同じポリペプチド配列を共有する 。実質的に純粋なタンパクは、典型的には約８５％〜９０％を超える、より通常 は約９５％の、そして好ましくは約９９％を超える純度のタンパク試料を含む。 タンパクまたはポリペプチドの純度または均一性は、試料をポリアクリルアミド ゲ ル電気泳動にかけ、続いて染色により可視化するような、当業界で周知の多数の 手段により示すことができる。ある種の目的のためには、高い解像度が必要であ り、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）または精製のための同様の手段が用 いられる。合成ペプチド ：天然タンパクまたはそのフラグメントを含まない、ペプチド結合 により互いに連結された化学的に生成されたアミノ酸残基の鎖。融合タンパク ：組換えＤＮＡ法により産生されたポリペプチドであって、単一の 「融合された」ポリペプチドを発現させるための単一のオープンリーディングフ レームの発現を通じて産生される、第一のポリペプチドドメインがペプチド結合 により第二のポリペプチドドメインに作動可能に連結されているもの。キメラ分子 ：２つの別個のポリペプチドを架橋させるように、化学的連結を通じ て２つの別個の分子を接続することによって形成される二機能性分子。 Ｂ．免疫避妊ワクチン組成物 本発明は、対象哺乳類において免疫反応を誘導する目的のための免疫原として 哺乳類精子ｓｐ５６抗原決定基を用い、それによりインビボで精子上のｓｐ５６ 抗原決定基と免疫反応する抗体を産生させ、それによりその哺乳類での精子含量 または受精能に影響を与えることを記載する。 したがって、本発明の組成物は、対象において免疫反応を誘発する意図された 目的のため、ワクチンと呼ばれ、その点において、本明細書においてさらに記載 するように投与の経路にしたがってワクチンの典型的成分を含有するよう意図さ れる。 本発明の組成物は、本発明により実行される避妊のメカニズムが、処理を受け た哺乳類における免疫応答（精子の含量および質に影響する）の存在に基づいて おり、それによって受精能に影響し、避妊剤として作用するため、免疫避妊剤と も呼ばれる。この文脈において、精子受精能に対するあらゆる影響が避妊剤特性 と認められ、絶対的な受精能は、本発明のほとんどの態様において典型的には好 ましいものの、有効性には必要とされないことは認められるべきである。 本発明は、哺乳類精子タンパクｓｐ５６が哺乳類における受精過程において卵 との結合に主要な役割を果たしていることの発見に、主に基づいており、より具 体的には、ｓｐ５６タンパクが免疫避妊応答を実行することにおいて免疫系の標 的として非常に適していることの発見に基づいている。本発明はまた、治療的免 疫応答のために有用な特有の異なる抗原決定基（標的）を提供するｓｐ５６内の 種々の有用なエピトープ（抗原決定基）を同定することを特徴とする。 したがって、抗原性ポリペプチドは、本明細書においては、そのアミノ酸残基 配列中にｓｐ５６抗原決定基を定義するアミノ酸の配列を含むポリペプチドと定 義される。ｓｐ５６抗原決定基は、本明細書において記載するようにｓｐ５６タ ンパクの任意の部分であることができ、これは、免疫すると、ｓｐ５６タンパク の免疫部分と免疫反応性である抗体を誘導することができる。抗体の技術分野で 周知のように、抗原決定基は、化学的組成およびサイズの点で種々の物質のいず れてあってもよい。本発明の文脈においては、決定基は、ｓｐ５６配列を有する 種々の長さのポリペプチドであることができ、典型的には少なくとも長さ約７ア ミノ酸から、長さ４００〜６００アミノ酸残基の大きな部分までである。決定基 のサイズは、好ましい態様を特定する以外、制限的であることを意図するもので はない。 本発明は、本発明の組成物において単独でまたは組み合わせて使用することが できるｓｐ５６タンパクの異なる部分に由来する、非常に多様なｓｐ５６決定基 を記載する。ｓｐ５６のこれらの異なる部分からのポリペプチドに定義された決 定基の使用は、当業者には明らかな異なる利点を提供する。例えば、ｓｐ５６の ある領域は種特異的配列（ｓｓｓ）を含み、これらは特定の種のみに特異的な免 疫応答を提供する。これらのｓｓｓ ｓｐ５６決定基に制限された組成物は、標 的種のみにおいて不妊を起こさせ、他の種においては避妊剤とはならない。ある いは、ｓｐ５６の他の領域は、異なる哺乳類種において保存されている（相同な ）配列を含み、したがって、普遍的な免疫避妊決定基として役立つ。さらに、単 一の組成物中でのｓｐ５６決定基の組合わせの使用は、異なる免疫避妊剤の一群 （バッテリー）の製造を提供し、本発明の免疫避妊ワクチン組成物にさらなる特 徴を与える。 免疫避妊ワクチン組成物は、ワクチンの目的を容易にするために多様な物質を 含むことができる。抗原性ポリペプチドに加えて、組成物は、当業界で周知のよ うに、医薬的に容認されうる賦形剤、キャリアー、免疫刺激剤、抗原性分子、ア ジュバント、安定剤等の物質を含むことができる。また、抗原性ポリペプチドは 、種々の形態であることができ、ｓｐ５６抗原決定基を含む合成ポリペプチド、 ハイブリッド分子、融合タンパク、組換えタンパク、キメラポリペプチド分子、 単離タンパク等の形態が含まれる。 合成ポリペプチドは、以下で詳述する。ハイブリッド分子は、２つのドメイン を有する分子であって、第一のポリペプチドドメインはｓｐ５６抗原決定基を含 み、第二のドメインはキャリアー、提示（representation）、デリバリー、免疫 刺激剤または合成のためのベヒクルのような異なる機能を有する。 第二のポリペプチドドメインは、本明細書で記載するように、種々の目的を有 することができる。それは、組成物にかさを与えるためのキャリアータンパクで あることができる。それは、ワクチン組成物に免疫原性を付加するために細菌ま たはウイルス抗原性タンパクであることができる。それは、発現および／または 予め選択した製剤へのデリバリーを容易にするために細菌またはウイルス構造タ ンパクであることができる。例えば、融合タンパクにおけるタバコモザイクウイ ルス（ＴＭＶ）コートタンパクの使用は、ＴＭＶ感染植物の組織中に発現された ｓｐ５６抗原決定基が広がるのを容易にし、それによって活性免疫避妊剤成分を 含有する飼料の生産を容易にする。第二のポリペプチドは、免疫応答を刺激する 活性を有するタンパクであることができる。他の機能を第二のポリペプチドに含 有させることができ、それは当業者には明らかである。 好ましい第二のポリペプチドドメインとしては、コレラ毒素サブユニットＡ、 コレラ毒素サブユニットＢ、ジフテリア毒素、インフルエンザウイルスＨＡタン パク、マウス白血病ウイルスコートタンパク、サルモネラ表面タンパクおよびタ バコモザイクウイルスコートタンパクが挙げられる。これらのタンパクは、組換 えＤＮＡ技術の分野において十分に特徴づけされており、融合タンパクまたはキ メラポリペプチド分子における使用について容易に利用可能である。例示的な使 用を以下に記載する。 ハイブリッド分子の第一および第二のポリペプチドドメインは、多様な手段に より連結することかできる。単一ポリペプチドの組換えＤＮＡ発現によって産生 させる場合、第一および第二のポリペプチドドメインは、単一の融合タンパクの ようにペプチド結合によって作動可能に連結される。組換えＤＮＡ法による融合 タンパクの産生は、後述する。 別個のポリペプチドとして生産する場合、第一および第二のポリペプチドは、 周知のように化学的架橋により作動可能に連結され、その生成物は本明細書にお いてキメラポリペプチド分子と呼ばれる。ポリペプチド間の化学的架橋の方法は 、化学およびタンパクの技術の分野において周知である。本発明のワクチン組成 物において有用な例示的なキメラポリペプチド分子を、本明細書において記載す る。 ｓｐ５６が精子から単離されうる限りにおいて、実質的に単離されたｓｐ５６ タンパクを本発明のワクチン組成物において用いることができる。精巣上体組織 、精子または精液からのネイティブな（天然の）ｓｐ５６タンパクの単離方法は 、実施例において記載する。 本発明のｓｐ５６抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドは、本発明にしたが った多様な用途を有する。 したがって、本発明のポリペプチドは、ｓｐ５６により発現されるエピトープ （抗原決定基）を免疫学的に模倣するその能力を特徴とする。このようなポリペ プチドは、免疫避妊ワクチン組成物中の成分、ネイティブなｓｐ５６と免疫反応 する抗体を作成するための接種物中の成分として、および免疫学的方法における 抗原として、有用である。 本明細書において用いる場合、種々の文法的形態での「免疫学的に模倣する」 という語句は、本明細書において定義するｓｐ５６のエピトープを認識する本発 明の抗体と免疫反応する本発明の抗原性ポリペプチドの能力をいう。 主題ポリペプチドは、それが必要な配列を含んでいる限りにおいて、ｓｐ５６ のアミノ酸残基配列と同一である必要はないことは理解されるべきである。 Ｃ．ｓｐ５６タンパクおよびポリペプチド マウス精子タンパクｓｐ５６をコードするｃＤＮＡは、以下に記載するように 成熟型のプロセッシングされたタンパクに基づいたものとして引用するが、これ は、Bookbinder et al.，Science，269:86-89(1995)（その開示は参照により本 明細書に包含される）により記載されたようにクローニングされ、配列決定され たものである。既知の配列とコードされたｓｐ５６アミノ酸配列との比較によれ ば、ｓｐ５６は、Ｓｕｓｈｉドメインと呼ばれる長さ約６０アミノ酸の複数のコ ンセンサス反復配列（これについては以下に詳述する）を含むタンパクレセプタ ーのスーパーファミリーの新規な一員と考えられる。したがって、ｓｐ５６は、 機能に関して一般化することを可能にするように他のタンパクに十分に類似し、 任意の哺乳類種でｓｐ５６遺伝子を同定し単離できることを確実にする。 したがって、アミノ酸およびヌクレオチド配列レベルの両方での変異がｓｐ５ ６の哺乳類単離株に存在する可能性はあるが、そのような変異は、限定的なもの として解釈されるものではない。例えば、ある哺乳類種における対立遺伝子変異 は、ｓｐ５６のあるタイプの単離株間で数パーセントの差異を許容することがで き、その差異は、無害な変異アミノ酸残基からなる。したがって、開示されたｓ ｐ５６タンパクに対して約９５％の相同性、好ましくは少なくとも９８％の相同 性のタンパクは、開示されたｓｐ５６タンパクの対立遺伝子変異体と考えられ、 したがって、本発明のｓｐ５６タンパクと考えられる。 マウスのプレ−プロｓｐ５６ ｃＤＮＡの完全コードヌクレオチド配列は、ク ローン７．１と呼ばれ、配列番号１に記載するように長さ２０２６ヌクレオチド であり、受託番号Ｕ１７１０８としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。完全プ レ−プロｓｐ５６をコードするｃＤＮＡクローンは、１７３７ヌクレオチドのオ ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を表し、これは、３２アミノ酸のＮ末端 側シグナルペプチドを有し、その切断部位はアミノ酸位置−１と＋１との間であ って、ヌクレオチド位置１７５の後の切断部位に相当する（配列番号１）。 このマウスｃＤＮＡ配列の翻訳物は、配列番号２の位置−３２〜＋５４７に示 すように、５７９アミノ酸残基のプロセッシングされていないプレ−プロｓｐ５ ６タンパクをコードし、これはマウスプレ−プロｓｐ５６と呼ばれる。マウスプ レ−プロｓｐ５６のアミノ酸配列は、コードするｃＤＮＡ配列とともに配列番号 １にも記載されている。 プレ−プロｓｐ５６からプロ−ｓｐ５６へのプロセッシングは、実施例に記載 したとおりの実験的に決定したアミノ末端に基づくと、分子量６２，０００ダル トンの５４７アミノ酸のタンパクをもたらす。マウスプロｓｐ５６のアミノ酸残 基配列は、図１および配列番号２（アミノ酸位置１で始まり、位置５４７で終わ る）に示す。 プロｓｐ５６種は、約６，０００ダルトン（７０アミノ酸）の非常に塩基性の カルボキシ末端テールの翻訳後切断（truncation）によりさらにプロセッシング を受けて、分子量５６kDaの成熟型ｓｐ５６タンパクとなる。翻訳後プロセッシ ング事象は、運動性の精子で天然に、または精巣上体精子を単離し非変性界面活 性剤中で処理する間に、および／または「背景」で論じたように卵母細胞リガン ドである透明帯３すなわちｚｐ３へのレセプター特異的結合の際に、起こると考 えられている。４７７アミノ酸の成熟型ｓｐ５６アミノ酸残基配列は、配列番号 ２に記載するが、位置１のアスパラギン酸で始まり、位置４７７のシステイン残 基で終わる。この配列は、図１にも示す。 既に紹介したように、コードされるｓｐ５６アミノ酸配列をタンパクデータベ ースと比較すると、ｓｐ５６は、Ｓｕｓｈｉドメイン反復配列の存在に基づいて 、タンパクレセプターのスーパーファミリーの一員であることが示される。プロ ｓｐ５６タンパクは、Ｃ４ＢＰ、Ｃ３ｂレセプター、ＣＲ１およびＣＲ２レセプ ターのような補体系のタンパクにかなりの相同性を有している。補体タンパクは 、本発明のｓｐ５６のように、他のタンパクに結合するとエキソまたは自己タン パク分解的活性を示すことが知られている。分子の切断は、コンフォメーション の変化を引き起こし、それが後続する生物学的事象を活性化することが示されて おり、これは、ｓｐ５６の場合については、単一の精子アクロソームに媒介され た卵母細胞リガンドとの特異的相互作用であり、結果として受精が起こる。 スーパーファミリーの一員として、ｓｐ５６は、７個のＳｕｓｈｉドメインを 有し、そのうち６個は連続しているが、一方、７番目のものはマウスｓｐ５６に 独特の４４アミノ酸の介在領域に続いている。コードされる介在領域はマウスｓ ｐ５６ ｃＤＮＡに独特であることが決定されたので、この領域は、ｓｐ５６種 特異的配列と呼ばれ、「ｓｓｓ」とも表示される。７０アミノ酸の塩基性のカル ボキシ末端ドメインで、コードされるプロｓｐ５６タンパクが完了する。７個の Ｓｕｓｈｉドメインは、図１においてアミノ酸領域に下線を付して示す。Ｓｕｓ ｈｉドメインならびにｓｐ５６種特異的配列のアミノ酸残基位置は、各領域をコ ードする配列番号１に記載する対応するｃＤＮＡ領域とともに表１に示す。表１ は、実施例２において提示し、より詳細に論じる。 Ｓｕｓｈｉドメインは、１０個の実質的に不変のアミノ酸を含む約６０アミノ 酸のストレッチから構成される。図３は、典型的なＳｕｓｈｉドメインを示し、 ここで、１０個の不連続なアミノ酸（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって 、一文字表記でＣ、Ｐ、Ｙ、Ｃ、Ｇ、Ｃ、Ｇ、Ｗ、ＰおよびＣを含む）は実質的 に不変であり、配列内で特異的な位置に位置する。残りの約５０アミノ酸は、か なりの多様性を示す。この一般的構造は、以下の特徴を有する： 1）ループドループ構造を形成するＣ１−Ｃ３およびＣ２−Ｃ４の２つのジス ルフィド結合； 2）各ジスルフィド結合の付近に少なくとも１個のプロリン、これは連続する Ｓｕｓｈｉドメインの接続に必要な鎖のターンを提供する；および 3）内部疎水性ループ上でのＧおよびＷの存在。 ループドループ構造において、大きいループと小さいループの両方が存在し、 その中に疎水性アミノ酸のストレッチが存在する。「大ループ」は、Ｃ１とＣ２ との間の約２５〜３０個の最も電荷の高いアミノ酸のストレッチから構成され、 スーパーファミリー内で相当異なっており、その荷電した性質のため、スーパー ファミリーのメンバーのタンパクレセプター機能に多大な貢献をする〔Ichinose et al.，J．Biol．Chem.，265:13411-13416(1990)〕。大ループおよび小ループ は、それぞれ「ｌｌ」および「ｓｌ」と呼ぶ。さらに、Ｓｕｓｈｉドメイン６は 、さらなるシステイン残基を有し、したがって大ループ内に付加的なループを有 することを特徴とする。そのようにして、大ループはシステイン残基により第一 のループ（Ｓｈ６ｆｌ）および中ループ（Ｓｈ６ｍｌ）にさらに分離される。こ れらの各々の配列は、表１に示す。 スーパーファミリーの一員としての資格に一致して、ｓｐ５６種特異的ドメイ ンは、他の既知のあらゆるタンパクに対して検出可能な相同性を有さず、システ イン残基を含まないため、ジスルフィド結合により決定される二次構造の可能性 か排除される。ｓｐ５６種特異的ドメインは、高度に荷電したアミノ酸から構成 され、それがタンパクの外部に存在し、Ｂ細胞エピトープである可能性が高いこ とを示す。コンピュータシミュレーションでは、ヘリックスまたはβシートの二 次構造は解明されなかった。したがって、その独特の配列、おそらくｓｐ５６表 面に位置すること、および二次構造の欠如のため、ｓｐ５６のこのドメインは、 ｓｐ５６に特異的な種特異的免疫応答を誘導するために設計されるハプテンとし て優れた候補を表す。 上述した保存されたドメインおよび成熟型ｓｐ５６タンパクを生成するための 切断部位から見て、類似の切断パターン、三次元構造および結果として生じるタ ンパク種は、ヒトを含む他の哺乳類において同定可能である。 本明細書の開示が異なる哺乳類種からのｓｐ５６を同定する限りにおいて、本 発明は、１または少数の哺乳類種に由来するｓｐ５６タンパクに制限されるべき ではない。したがって、本発明は、無制限に、ｒＤＮＡまたは天然供給源からの 生化学的精製によって、ヒトおよび他の霊長類、ウサギ、ラットおよびマウスを 含むげっ歯類、イヌ、ネコ、ブタを含む有蹄類、有袋類、および他の哺乳類種を 含め種々の種の任意のものから由来しうる哺乳類ｓｐ５６タンパクまたはホモロ グを企図する。したがって、「ホモログ」という用語は、アミノ酸残基配列に基 づいて類似の三次元構造を有する任意の哺乳類ｓｐ５６タンパクまたはポリペプ チドをいう。換言すれば、本発明のｓｐ５６種は、アミノ酸配列類似性、反復コ ンセンサスＳｕｓｈｉドメインの存在、種特異的配列の存在、分子の全体的二次 および三次構造、および同様の物理的パラメータから見て、相同な分子である。 ヒトおよび農業に関連する動物種は、マウスｓｐ５６の特に好ましいホモログ である。本明細書において同定された例示的ｓｐ５６種は、マウス、ラット、リ ス、ウサギ、ウッドチャック、プレーリードッグ、アライグマ、シカおよび関連 有蹄類、カンガルーおよびヒトｓｐ５６である。 上述したように、ｓｐ５６は、まずインビボで前駆体形態で産生され、次いで 本明細書において記載するような生物学的活性を有するより小さいポリペプチド へとプロセッシングされる。これらの異なるポリペプチド形態が有用として企図 される限りにおいて、ｓｐ５６タンパクまたはポリペプチドという用語は、ｓｐ ５６遺伝子から由来するアミノ酸残基配列を有するポリペプチドのすべての種を 内包する。したがって、本発明のｓｐ５６タンパクは、本明細書において記載す るように、その用途にしたがって種々の形態であることができる。したがって、 本明細書において用いる場合、「ｓｐ５６タンパク」および「ｓｐ５６ポリペプ チド」という語句は、本発明の哺乳類ｓｐ５６タンパクの部分に相当する、好ま しくはそれと同一の、アミノ酸残基配列を含むアミノ酸残基配列を有するｓｐ５ ６分子を指す。 したがって、本発明は、配列番号１に示すｓｐ５６タンパクの配列に相当する アミノ酸残基配列を有し、実施例２に記載するように、表１に示すポリペプチド よりなる群から選択される式によって表されるアミノ酸残基配列を含むｓｐ５６ ポリペプチドをも企図する。この態様においては、ポリペプチドは、ｓｐ５６エ ピトープを模倣する能力を有し、それによって本明細書および背景において記載 したようにｓｐ５６の生物学的活性を阻害することを、さらに特徴とする。 ネイティブな折りたたまれたｓｐ５６分子の三次元構造のため、本発明は、ｓ ｐ５６の複数の領域がｓｐ５６レセプター機能に関与することを企図し、その複 数の種々の領域は、上記の種々のｓｐ５６ポリペプチドにより定義される。レセ プター−リガンド結合を阻害する上述のポリペプチドの能力は、実施例において より十分に論じるように、不妊性についてのアッセイ、抗ｓｐ５６抗体の存在の 検出および同様のものを含むインビボの方法とともに、免疫化学分析、精子−卵 結合アッセイおよび同様のものを含むインビトロでの結合アッセイにおいて、容 易に測定することができる。 したがって、別の態様においては、本発明は、ｓｐ５６レセプターの複数接触 部位の同時阻害を与えるように組合わせて混合されている、免疫避妊を促進する ことによってｓｐ５６レセプター機能を阻害する上述の異なるｓｐ５６ポリペプ チドを１またはそれ以上含む、ｓｐ５６ポリペプチド組成物を企図する。 免疫避妊ワクチン組成物中の抗原性ポリペプチドとしての使用に好ましいｓｐ ５６タンパクおよびポリペプチドは、実施例２の表１に示す。好ましいｓｐ５６ タンパクとしては、プレ−プロｓｐ５６、プロｓｐ５６および成熟型ｓｐ５６が 挙げられる。好ましいｓｐ５６の部分としては、各完全Ｓｕｓｈｉドメインおよ びその中の定義された大および小ループ（Ｓｕｓｈｉドメイン６の大ループ中に 形成される代替的ループを含む）が挙げられる。特に好ましいｓｐ５６ポリペプ チドとしては、表１に示すような種特異的配列およびそのフラグメントが挙げら れる。 本発明のｓｐ５６タンパクの種々の形態から見て、ｓｐ５６タンパクおよびポ リペプチドは、多様な方法で入手することができる。１つの態様においては、ｓ ｐ５６は、精巣のような天然の組織から単離することができる。生化学的精製お よびアフィニティ精製を含むｓｐ５６の単離のための例示的な方法は、実施例１ に記載する。 あるいは、本発明のｓｐ５６は、組換えタンパク、すなわち、ここで記載する ような組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）法により生産されるものであることができる。 組換え生産方法は、単離されたまたは実質的に純粋なレセプター組成物を得るた めにさらに精製するための材料を生産する好ましい手段ではあるが、組換えｓｐ ５６タンパクは、ある種の態様において有用であるためには、必ずしも実質的に 純粋である必要はなく、あるいは単離されている必要さえない。組換えｓｐ５６ タンパクは、哺乳類細胞株上もしくはその中、または哺乳類細胞株の粗抽出物中 に存在しうる。他の態様においては、組換えｓｐ５６タンパクは、飼料または餌 というデリバリー手段におけるその後の用途のために、植物または植物細胞株上 またはその中に産生される。この文脈において本発明のｓｐ５６タンパクの生産 のための好ましい発現ベクター系は、セクションＥにおいて記載する。 １つの態様においては、ｓｐ５６タンパクは、ｓｐ５６試薬の純度および薬学 的に異なるタンパクを含有しない度合いが、本明細書で記載する診断および治療 方法における用途を与えるように、実質的に他のタンパクまたはペプチドを含ま ない。天然供給源からの生化学的精製法もまた既に記載したように企図すること ができるが、組換えによる生産方法は、理想的にはこの点において絶対的な純度 を生じるために適している。この点に関して、ｓｐ５６タンパクは、リガンド結 合または生物学的活性についての従来のスクリーニングアッセイにおいて薬学的 交差反応性が検出されないように、他の分子が十分に存在しない場合、実質的に 他のタンパク分子を含まない。 単離されたおよび組換えｓｐ５６タンパクに加えて、本発明は、ｓｐ５６タン パクのアナログをも企図する。アナログは、免疫学的反応性、リガンド結合能ま たは本発明のｓｐ５６タンパクの同様の機能的特性に関して本発明のｓｐ５６の 性質を呈する人造変異体である。したがって、少数の変更例を挙げれば、アナロ グは、ｓｐ５６の切断生成物であることができ、ｓｐ５６の部分に相当するポリ ペプチドであることができ、膜アンカーが除去されたｓｐ５６ポリペプチドであ ることができ、そして、いくつかのアミノ酸残基が変更されている変異ｓｐ５６ 配列であることができる。 ｓｐ５６ポリペプチドは、合成の容易さのため、長さ約２００アミノ酸残基を 超えないことが好ましい。したがって、合成による生産法を用いる場合には、ｓ ｐ５６ポリペプチドは約１５０アミノ酸残基を超えないことがより好ましく、さ らにより好ましくは約６５残基を超えず、そして最も好ましくは長さ３０アミノ 酸未満である。 主題ｓｐ５６ポリペプチドは、そのポリペプチドがｓｐ５６のエピトープを模 倣することができる限りにおいて、アミノ酸配列が本明細書において示されてい るポリペプチドのあらゆるアナログ、フラグメントまたは化学的誘導体を含む。 したがって、本発明のポリペプチドは、そのような変更がその用途においてある 種の利点を提供するような、種々の変更、置換、挿入、および欠失の対象とする ことができる。この点に関して、本発明のｓｐ５６ポリペプチドは、ｓｐ５６タ ンパクの配列と同一であるというよりも、それに相当するものであり、１または それ以上の変更がされ、本発明のｓｐ５６ポリペプチドと免疫反応する抗体を誘 導する能力を保持する。 したがって、「アナログ」という用語は、本明細書において具体的に示されて いる配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を有し、１またはそれ以上の残基が 機能的に類似の残基で保存的に置換されており、本明細書において記載した抗体 産生を誘導する能力を呈する、あらゆるポリペプチドを含む。保存的置換の例と しては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの非極 性（疎水性）残基を別のもので置換すること、アルギニンとリシンの間、グルタ ミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間でのように１つの極性（親水性 ） 残基を別のもので置換すること、リシン、アルキニンまたはヒスチジンのような １つの塩基性残基を別のもので置換すること、またはアスパラギン酸もしくはグ ルタミン酸のような１つの酸性残基を別のもので置換すること、が挙げられる。 「保存的置換」という語句は、そのようなポリペプチドが必要な結合活性を呈 することを条件に、非誘導残基の代わりに化学的に誘導された残基を使用するこ とをも含む。 「化学的誘導体」は、側鎖官能基の反応により化学的に誘導された１またはそ れ以上の残基を有する主題ポリペプチドを指す。このような誘導された分子とし ては、例えば、塩酸アミン、ｐ−トルエンスルフォニル基、カルボベンゾキシ基 、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成す るように遊離のアミノ基が誘導されている分子が挙げられる。遊離のカルボキシ ル基は、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステル、または ヒドラジドを形成するように誘導されていてもよい。遊離の水酸基は、Ｏ−アシ ルまたはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導されていてもよい。ヒスチジ ンのイミダゾール窒素は、Ｎ−イム−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導 されていてもよい。さらに化学的誘導体として含まれるものとしては、２０種の 標準アミノ酸の１またはそれ以上の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドがある。 例えば、４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換してもよく、５−ヒドロキシ リシンでリシンを置換してもよく、３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換し てもよく、ホモセリンでセリンを置換してもよく、また、オルニチンでリシンを 置換してもよい。Ｄ−アミノ酸もまた、１またはそれ以上のＬ−アミノ酸の代わ りに包含させてもよい。本発明のポリペプチドはまた、必要な活性が維持されて いる限りにおいて、配列を本明細書に示すポリペプチドの配列と比較して残基の １またはそれ以上の付加および／または欠失を有するあらゆるポリペプチドをも 包含する。 「フラグメント」という用語は、アミノ酸残基配列を本明細書において示すポ リペプチドの配列よりも短いアミノ酸残基配列を有するあらゆる主題ポリペプチ ドを指す。 本発明のポリペプチドがｓｐ５６ポリペプチドの配列と同一ではない配列を有 する場合、それは、典型的には１またはそれ以上の保存的または非保存的置換が なされており、通常約３０％（number percent）を超えない、より通常は２０％ を超えない、そして好ましくは１０％を超えない数のアミノ酸残基が置換されて いる。付加的な残基もまた、「リンカー」を提供する目的でいずれかの末端に付 加されていてもよく、これにより本発明のポリペプチドは、標識または固体マト リックス、またはキャリアーに好都合に固定することができる。好ましくは、リ ンカー残基は、ｓｐ５６エピトープを形成しない、すなわち、セクションＢおよ びＤにおいて記載したように、構造においてｓｐ５６タンパクに類似しない。 本発明のあらゆるペプチドは、医薬的に容認されうる塩の形態で用いてもよい 。本発明のペプチドと塩を形成することができる好適な酸としては、塩酸、臭化 水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸のような無機酸、リン酢酸(phosp horic acetic acid)、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、 マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタ レンスルホン酸、スルファニル酸等が挙げられる。 本発明のペプチドと塩を形成することができる好適な塩基としては、水酸化ナ トリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等のような無機塩基;およびモ ノ、ジおよびトリアルキルおよびアリルアミン（例えばトリエチルアミン、ジイ ソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン等）、場合により置換されて いるエタノールアミン（例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン等）のよ うな有機塩基が挙げられる。 本発明のｓｐ５６ポリペプチドは、本明細書において主題ポリペプチドとも呼 ばれ、ポリペプチド技術の分野において当業者に公知のいかなる技術によって合 成してもよく、これには上述のように組換えＤＮＡ技術も含まれる。固相メリフ ィールド合成法のような合成化学技術は、純度、抗原特異性、望ましくない副産 物の不存在、生産の容易さ等の理由から、好ましい。利用可能な多くの技術の優 れた要約は、固相ペプチド合成についてはJ．M．Steward and J．D．Young，“S olid Phase Peptide Synthesis”，W．H．Freeman Co.，San Francisco，1969;M ．Bodanszky，et al.，“Peptide Synthesis”，John Wiley ＆ Sons，Second e dition，1976;およびJ．Meienhofer，“Hormonal Proteins and Peptides”，Vo l．2，P.46， Academic Press(New York)1983、および古典的溶液合成についてはE．Schroder and K．Kubke，“The Peptides”，Vol．1，Academic Press(New York)，1965に 見出すことができ、これらの各々は参照により本明細書に包含される。このよう な合成において使うことができる適切な保護基は、上述のテキストおよびJ．F． W．McOmie，“Protective Groups in Organic Chemistry”，Plenum Press，New York，1973（これは参照により本明細書に包含される）に記載されている。 一般に、企図される固相合成法は、１またはそれ以上のアミノ酸残基または好 適に保護されたアミノ酸残基を、伸長中のペプチド鎖に連続的に添加することを 含む。通常、最初のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを 好適な選択的に除去可能な保護基で保護する。リシンのような反応性側鎖基を含 むアミノ酸については、選択的に除去可能な異なる保護基を用いる。 例として固相合成を用いると、保護されたまたは誘導されたアミノ酸を、その 保護されていないカルボキシル基またはアミノ基を通じて不活性固体支持体に付 着させる。次いで、アミノ基またはカルボキシル基の保護基を、選択的に除去し 、好適に保護された対応する（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中の 次のアミノ酸を混合し、固体支持体に既に付着している残基とアミド結合を形成 するのに好適な条件下で反応させる。次いで、この新規に付加したアミノ酸残基 からアミノ基またはカルボキシル基の保護基を除去し、次のアミノ酸（好適に保 護されたもの）を添加し、同様に続ける。すべての所望のアミノ酸が正しい配列 で連結された後、あらゆる残存する末端および側鎖基保護基（および固体支持体 ）を連続的にまたは同時に除去し、最終的なポリペプチドを得る。 ｓｐ５６ポリペプチドは、特に、本発明の診断方法および系において身体試料 中に存在するｓｐ５６レセプターまたはｓｐ５６それ自身を検出するために用い ることができ、またはｓｐ５６上の保存されたエピトープと免疫反応する抗体の 調製のための本明細書に記載された接種物を調製するために用いることができる 。 さらに、本発明のｓｐ５６ポリペプチドのあるものは、本発明の治療方法にお いて、さらに本明細書で記載するようにｓｐ５６の機能を阻害するために用いる ことができる。 本発明のポリペプチドとともに使用することができる標識、固体マトリックス およびキャリアーは、以下に記載する。 アミノ酸残基リンカーは、通常、少なくとも１個の残基であり、４０以上の残 基であることができるが、より頻繁には１〜１０個の残基であり、ｓｐ５６エピ トープを形成しない。連結のために用いられる典型的なアミノ酸残基は、チロシ ン、システイン、リシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸等である。さらに 、主題ポリペプチドは、反対のことが指定されていない限り、末端ＮＨ₂のアシ ル化、例えばアセチル化、またはチオグリコール酸アミド化により、例えばアン モニア、メチルアミン等を用いる、末端カルボキシアミド化により、修飾された 配列によって、ｓｐ５６タンパクの天然配列とは異なることができる。 当業界においてキャリアーハプテンコンジュケート（接合体）として公知のも のを形成するためにキャリアーにカップリングされている場合、本発明のｓｐ５ ６ポリペプチドは、ｓｐ５６と免疫反応する抗体を誘導することができる。した がって、免疫学的交差反応性の十分に確立された原理から見て、本発明は、本明 細書に示すポリペプチドの抗原的に関連する変異体を企図する。 「抗原的に関連する変異体」は、本明細書に記載されたポリペプチドおよび本 発明のｓｐ５６タンパクと免疫反応する抗体分子を誘導することができる主題ポ リペプチドである。 Ｄ．ｓｐ５６融合タンパク １つの態様においては、本発明は、免疫避妊ワクチン組成物中での用途のため の、および決定基が本明細書において開示されたように有用である他の方法にお ける用途のための、本発明の抗原性ポリペプチドを含む融合タンパクを企図する 。 融合タンパクは、第二のポリペプチドドメインに作動可能に連結された第一の ポリペプチドドメインを含み、ここで、第一のポリペプチドドメインは、本発明 の抗原性ポリペプチドを含むアミノ酸残基配列、すなわちｓｐ５６抗原決定基を 定義する配列を含むものである。第二のポリペプチドドメインは、いかなるポリ ペプチド配列であってもよいが、好ましくは融合タンパクにある機能および利点 を提供する。 例示的な機能としては、キャリアーとして、提示構造として、融合タンパクが アセンブリー（集合）をしたウイルス粒子のようなより大きい構造と関連するの を制御するための結合部分として、免疫応答を高めるタンパクのような免疫刺激 剤として、（例えばより強力な免疫応答を促進するための）抗原性分子として、 アジュバントとして、作用すること、および同様な機能が挙げられる。本発明は 、第二のポリペプチドドメインの機能に関して制限的であると認定されるもので はない。 作動可能に連結するとは、融合タンパクに関しては、２つの別個の遺伝子を単 一のオープンリーディングフレームへと融合する組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）法に より作成された遺伝子からの単一のポリペプチドのｒＤＮＡ発現の特徴によって 生じる、２つのポリペプチドが、順序にかかわらず、タンパク中で２個のアミノ 酸間に見出される通常のポリペプチド結合によって、結合されていることを意味 する。第一および第二のドメインの単一ポリペプチド中における順序は、ポリペ プチドのアミノおよびカルボキシ末端に関して連続的である必要はなく、第一ま たは第二のいずれかのドメインがアミノ末端であること、あるいはその逆である ことができる。 好ましい融合タンパクは、第二のポリペプチドドメインとして、コレラ毒素サ ブユニットＡ、コレラ毒素サブユニットＢ、ジフテリア毒素、インフルエンザウ イルスＨＡタンパク、マウス白血病ウイルスコートタンパク、サルモネラ表面タ ンパク、およびタバコモザイクウイルスコートタンパクよりなる群から選択され る配列を有する。例示的な融合タンパクは、実施例において記載する。 融合タンパクは、組換え遺伝子産物の操作および発現のための周知のｒＤＮＡ 法により産生される。融合タンパクの発現のための種々のベクターおよび宿主系 の任意のものを用いてよく、それが、宿主発現系からの発現された融合タンパク の回収および精製の経路を決定する。細菌、酵母および植物発現系が好ましい。 植物発現ベクターは、産生された融合タンパクを餌または飼料中に植物性物質と ともに製剤化しようとする場合には、特に好ましい。これらは本明細書において 記載する。 Ｅ．ｓｐ５６タンパクおよび融合タンパクの発現のためのベクター 本発明のｓｐ５６タンパクは、ｒＤＮＡ発現ベクターを用いる哺乳類細胞での 発現が好ましいが、種々の手段によって調製することができる。組換えｓｐ５６ についての例示的産生方法は、実施例において記載する。 したがって、本発明は、インタクトなｓｐ５６タンパクとして、融合タンパク として、またはｓｐ５６のより小さいポリペプチドフラグメントとしての、組換 え単離ｓｐ５６タンパクの生産方法をも提供する。本発明の生産方法は、一般に 、本発明のｓｐ５６タンパクを発現するよう細胞を誘導する工程、生じた細胞か ら発現されたｓｐ５６を回収する工程、および回収されたｓｐ５６を、生化学的 分画法により、本発明の特異的抗体を用いて、または他の化学的手順により、精 製する工程を包含する。組換えｓｐ５６タンパクの発現の誘導は、ｓｐ５６を発 現することができるｒＤＮＡである本発明のｓｐ５６タンパクまたはそのフラグ メントをコードするｒＤＮＡベクターを好適な宿主細胞中に挿入すること、およ びベクターのｓｐ５６遺伝子を発現させることを含むことができる。 したがって、本発明の組換えｓｐ５６タンパクまたは融合タンパクの発現を容 易にするためには、ｓｐ５６またはその部分をコードするＤＮＡセグメントは、 発現ベクターに挿入する。ＤＮＡセグメントは、本発明のｓｐ５６タンパクをコ ードするＤＮＡ配列を含むものとして特徴づけられる。すなわち、本発明のＤＮ Ａセグメントは、ｓｐ５６構造遺伝子の一部または全部の存在を特徴とする。好 ましくは、上記遺伝子は、各コドンがｓｐ５６タンパクに見出されるアミノ酸残 基をコードする中断されない直鎖状の一連のコドン、すなわち、イントロンを含 まない遺伝子として存在する。 好ましい態様の１つは、本明細書において定義するｓｐ５６タンパクを定義す るアミノ酸残基配列をコードするＤＮＡセグメントであり、このＤＮＡセグメン トは、本発明のｓｐ５６タンパクを発現することができる。好ましいＤＮＡセグ メントは、配列番号２に示すアミノ酸残基配列またはその部分と実質的に同じ、 そして好ましくは本質的にそれからなる、アミノ酸残基配列をコードする。特に 好ましいＤＮＡセグメントは、配列番号１に示す配列に由来するヌクレオチド配 列を有する。代表的な、かつ好ましいＤＮＡセグメントは、実施例においてさら に記載し、表１に列挙する。 上述のｓｐ５６タンパクをコードする相同ＤＮＡおよびＲＮＡ配列もまた企図 される。 タンパクまたはポリペプチドのアミノ酸残基配列は、遺伝コードを介してその タンパクをコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列と直接関連 する。したがって、構造遺伝子またはＤＮＡセグメントは、それがコードするア ミノ酸残基配列、すなわちタンパクまたはポリペプチドに関して定義することが できる。 遺伝コードの重要でよく知られた特徴は、その重複である。すなわち、タンパ クを作るのに用いられるほとんどのアミノ酸について、２以上のコードヌクレオ チドトリプレット（コドン）が特定のアミノ酸残基をコードする（すなわち指定 する）ことができる。したがって、多数の異なるヌクレオチド配列が、ある特定 のアミノ酸残基配列をコードする可能性がある。このようなヌクレオチド配列は 、すべての生物において同じアミノ酸残基配列の産生をもたらすので、機能的に 等価であると考えられる。しばしば、プリンまたはピリミジンのメチル化変異体 が、ある所定のヌクレオチド配列に取り込まれうる。しかし、このようなメチル 化は、いずれにせよコードの関係に影響を与えない。 核酸は、それがポリリボヌクレオチドであるかポリデオキシリボヌクレオチド であるか、すなわちＲＮＡであるかＤＮＡであるか、またはそのアナログである かどうかにかかわらず、あらゆるポリヌタレオチドまたは核酸フラグメントであ る。好ましい態様においては、核酸分子は、二本鎖ＤＮＡのセグメント、すなわ ちＤＮＡセグメントの形態である。しかし、ある種の分子生物学的方法論におい ては一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましい。 ＤＮＡセグメントは、化学合成法および組換えによるアプローチを含め、多数 の手段により製造することができるが、クローニングまたはポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）によることが好ましい。ｓｐ５６タンパクの部分をコードするＤＮ Ａセグメントは、化学的技術、例えばMatteucciら（J．Am．Chem．Soc.，103:31 85-3191，1981）のホスホトリエステル法または自動化合成法を用いて、容易に 合成することができる。さらに、長いＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントを 定義するオリゴヌタレオチドのグループの合成、およびそれに続くハイブ リダイゼーションおよび完全セグメントを構築するための連結のような、周知の 方法により、容易に調製することができる。別の方法としては、１対のオリゴヌ クレオチドプライマーを用いるＰＣＲによる好ましいＤＮＡセグメントの単離が 挙げられる。 もちろん、化学的に合成することによって、単に適切な塩基でネイティブなア ミノ酸残基配列をコードする塩基を置換することにより、任意の所望の改変を作 成することができる。 さらに、ｓｐ５６タンパクをコードする構造遺伝子から実質的に構成されるＤ ＮＡセグメントは、本発明のｓｐ５６タンパクを定義する遺伝子を含む組換えＤ ＮＡ分子から得ることができ、続いて、例えば位置特異的またはランダム突然変 異生成により改変して、所望の置換を導入することができる。 １．ｓｐ５６遺伝子のクローニング 本発明のｓｐ５６遺伝子は、種々のクローニング法により、任意の哺乳類から クローン化することができる。クローニングによりｓｐ５６のホモログを得るこ とは、ｓｐ５６が、保存ドメインの存在により特徴づけられるタンパクレセプタ ーのスーパーファミリーの１つであるという観察に基づいている。全ｓｐ５６遺 伝子のクローニングは、核酸相同性の戦略を用いる実施例に記載した一般的方法 により行うことができる。 本発明のｓｐ５６タンパクをコードする核酸分子を単離するための好ましいク ローニング法は、実施例に記載されており、目的のｓｐ５６遺伝子を含有すると 考えられている核酸分子のライブラリーをスクリーニングするのに有用なポリヌ クレオチドプローブの詳説を含む。ヒトのｓｐ５６遺伝子を単離するための特に 好ましいプローブは、実施例６に記載する。 本発明のｓｐ５６遺伝子をクローニングするためのライブラリー源は、本発明 のｓｐ５６を発現すると考えられている組織からのｃＤＮＡライブラリーの形態 のゲノムＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得る。好ましい 組織は、精巣組織である。 ２．発現ベクター 本発明は、本明細書に記載するように、ｓｐ５６タンパクをコードする本発明 のＤＮＡセグメントを含有する組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を企図する。ｒＤ ＮＡは、ベクターを本発明のＤＮＡセグメントに作動可能に連結することにより 生成できる。 本明細書中で用いる場合、「ベクター」という用語は、細胞において自律的複 製することができるＤＮＡ分子をいい、他のＤＮＡセグメントは、結合されたセ グメントの複製をもたらすようにベクターに作動可能に連結される。遺伝子生成 物の発現のために適合され、そしてｓｐ５６の発現を指令しうるベクターを、本 明細書では、「発現ベクター」という。このように、組換えＤＮＡ分子は、通常 、天然には一緒に見出されることはない、少なくとも２つのヌクレオチド配列を 含むハイブリッドＤＮＡ分子である。 本発明のＤＮＡセグメントを作動可能に連結するベクターの選択は、本技術分 野でよく知られているように、望ましい機能的性質、例えば、タンパク発現およ び形質転換される宿主細胞に直接依存し、これらは組換えＤＮＡ分子を構築する 技術における固有の制限である。しかし、本発明により企図されるベクターは、 少なくとも、そのベクターに作動可能に連結されるＤＮＡセグメントに含まれる ｓｐ５６構造遺伝子の複製を、そして好ましくは発現も、指令することができる 。 原核発現ベクターおよび真核発現ベクターの両方とも、ベクター構築における 当業者にはよく知られており、AusebelらによるIn Current Protocols in Molec ular Biology［Wiley and Sons（ニューヨーク）(1993年)］およびSambrookらに よるMolecular Cloning:A Laboratory Manual［Cold Spring Harbor Laboratory (1989年)］に記載されている。 １つの態様では、本発明により企図されたベクターには、原核レプリコン、す なわち、それにより形質転換された、細菌宿主細胞のような原核宿主細胞におけ る染色体外での組換えＤＮＡ分子の維持および自律的複製を指令する能力を有す るＤＮＡ配列が含まれる。そのようなレプリコンは、本技術分野でよく知られて いる。また、原核レプリコンを含む態様には、その発現が、それにより形質転換 された細菌宿主に対して薬剤耐性を与える遺伝子が含まれる。典型的な細菌の薬 剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与える遺 伝子である。 原核レプリコンを含むベクターはまた、それにより形質転換された大腸菌のよ うな細菌宿主細胞におけるｓｐ５６遺伝子の発現（転写および翻訳）を指令する ことができる原核プロモーターを含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの 結合および転写が起こることを可能にさせるＤＮＡ配列により形成される発現制 御要素である。細菌宿主と適合性のプロモーター配列は、典型的には、本発明の ＤＮＡセグメントの挿入のための便利な制限部位を含有するプラスミドベクター 中に備えられている。典型的なそのようなベクタープラスミドは、バイオラッド ・ラボラトリース（Biorad Laboratories）(カリフォルニア州、リッチモンド) から入手できるｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、インビ トローゲン（Invitrogen）[カリフォルニア州、サンジエゴ)から入手できるｐＲ ＳＥＴならびにファルマシア（Pharmacia）[ニュージャージー州、ピスカタウェ イ(Piscataway)]から入手できるｐＰＬおよびｐＫＫ２２３である。 真核細胞と適合性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と適合性の発現ベ クターも、本発明の組換えＤＮＡ分子を形成するのに用いることができる。真核 細胞発現ベクターは、本技術分野でよく知られており、いくつかの商業的供給源 から入手できる。典型的には、そのようなベクターは、望ましいＤＮＡセグメン トの挿入のための便利な制限部位を含有する状態で提供される。典型的なそのよ うなベクターは、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（ファルマシア）、ｐＢＰＶ− １／ｐＭＬ２ｄ[インターナショナル・バイオテクノロジーズ・インコーポレー テッド(International Biotechnologies，Inc．)]、ｐＴＤＴ１(ＡＴＣＣ＃３１ ２５５)、ｐＲｃ／ＣＭＶ(インビトローゲン・インコーポレーテッド)、好まし いベクターである、実施例に記載されているｐｃＤＮＡ３(インビトローケン)、 および同様の真核発現ベクターである。 本発明のタンパクを発現させるのに用いることができる他の発現系は、昆虫系 である。１つのそのような系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Autograp ha californica ）核多角体病ウイルス群（ＡｃＮＰＶ）が外来遺伝子を発現させ るためのベクターとして用いられる。このウイルスは、スポンドプテラ・フルギ ペルダ（Spondoptera frugiperda）細胞において生育する。ポリペプチドをコー ドするヌクレオチド配列は、ウイルスの非必須領域［スポンドプテラ・フルギペ ル ダにおいては、例えばポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子］内にクローン化され 、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下におか れる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の成功裡での挿入は、ポリヘ ドリン遺伝子および非閉鎖（non-occluded）組換えウイルス（すなわち、ポリヘ ドリン遺伝子によりコードされるタンパクのコートが欠損しているウイルス）の 産生を不活性化する。それらの組換えウイルスは、次に、挿入された遺伝子が発 現される細胞を感染させるのに用いられる。SmithらによるJ．Biol．Chem．46巻 、584頁(1983年)、Smithによる米国特許第４，２１５，０５１号を参照されたい 。 組換えウイルスまたは発現を指令するためのウイルス要素を用いる哺乳類細胞 系は、操作することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場 合、ポリペプチドのコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例え ば、後期プロモーターおよび３文節系（tripatite）リーダー配列に連結しうる 。次にこのキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイ ルスゲノムに挿入しうる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１また はＥ３）における挿入は、感染した宿主において生存能力があり、ポリペプチド を発現することができる組換えウイルスをもたらす[例えば、Logan & Shenkによ るProc．Natl．Acad．Sci．USA.，81:3655-3659（1984年）を参照されたい]。他 には、ワクチニアウイルスの７．５ Ｋプロモーターが用いられ得る[例えば、M ackettらによるProc．Natl．Acad．Sci.，USA，79:7415-7419(1982年);Mackett らによるJ．Virol.，49:857-864(1984年);PanicaliらによるProc．Natl.Acad．S ci．USA，79:4927-4931（1982年）を参照されたい]。特に興味がもたれるものは 、染色体外要素として複製する能力を有するウシ乳頭腫ウイルスに基づくベクタ ーである[SarverらによるMol．Cell．Biol.，1:486(1981年)]。マウス細胞への このＤＮＡの挿入のすぐ後に、プラスミドは、細胞当り約１００〜２００コピー まで複製される。挿入されたｃＤＮＡの転写は、宿主の染色体へのプラスミドの 組込みを必要とせず、それにより高度の発現を生じる。それらのベクターは、プ ラスミド内に、ｎｅｏ遺伝子のような選択性マーカーを含有させることにより、 安定な発現のために用いうる。他には、レトロウイルスゲノムを、宿主細 胞内にポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入し、その発現を指令す ることができるベクターとしての使用のために改変しうる［Cone & Mulliganに よる、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:6349-6353(1984年)]。高度の発現はま た、メタロチオネイン（metallothionine）IIＡプロモーターおよび熱ショック プロモーターを含むがそれらに限定されない誘導可能なプロモーターを用いても 達成されうる。 長期の高収量の組換えタンパクの産生のためには、安定な発現が好ましい。ウ イルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞を、適 する発現制御要素（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列、転写タ ーミネーター、ポリアデニル化部位等）により制御されるｃＤＮＡおよび選択性 マーカーで形質転換しうる。先に記載したように、組換えプラスミド中の選択性 マーカーは、選択に対する抵抗性を付与し、細胞がその染色体中にプラスミドを 安定に組込み、生育してフォーカスを形成するのを可能にし、次に、そのフォー カスは、クローン化され、細胞系へと拡張されうる。 例えば、外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞を１〜２日間、強化培地 （enriched medium）で生育させ、次に選択培地に換えることができる。多くの 選択系を用いることができ、単純疱疹（ヘルペス）ウイルスチミジンキナーゼ[W iglerらによるCell，11:223（1977年)]、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ シルトランスフェラーゼ［SzybalskaおよびSzybalskiによるProc．Natl．Acad． Sci．USA，48:2026(1962年)］およびアデニンホスホリボシルトランスフェラー ゼ（LowyらによるCell,22:817(1980年)]遺伝子（それぞれｔｋ− 、ｈｇｐｒｔ − またはａｐｒｔ− 細胞に用いることができる）が含まれるが、それらに限 定されない。また、代謝拮抗物質抵抗性付与遺伝子、例えばメソトレキセートに 対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ遺伝子[WiglerらによるProc．Natl．Acad．Sci ．USA，77:3567（1980年）;O’HareらによるProc．Natl．Acad．Sci．USA，78:1 527(1981年)]；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ遺伝子[Mulli ganおよびBergによるProc．Natl．Acad．Sci．USA，78:2072(1981年)]；アミノ グリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ遺伝子[Colberre-Garapi nらよるJ．Mol．Biol．、150巻、１頁(1981年)]；および ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子［Santerreらによ るGene，30:147(1984年)］も、選択の基礎として用いることができる。近年、他 の選択性遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを使う ことを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを使うこ とを可能にするｈｉｓＤ［HartmanおよびMulliganによるProc．Natl．Acad．Sci ．USA，85:804(1988年)］;およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する抵抗性を付与するＯ ＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）[McConlogue L.，In:Current Communica tions in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory編(1987年)]が記 載されている。 他の好ましい態様では、植物細胞とともに使用するのに適合性の発現ベクター を、植物においてｓｐ５６を発現させるのに用いる。植物は、そのものからその タンパクを単離できるものであるかまたはその植物中で摂取できる、普遍的な接 近での嵩高（バルク）のタンパクの多量の供給が植物から容易に行われる点で、 有利な発現およびデリバリー面を提供する。このように、本発明の組換えｓｐ５ ６タンパクをコードするための発現ベクターを含有するトランスジェニック植物 は、免疫避妊ワクチン組成物に使用するｓｐ５６抗原性ポリペプチドを製造する ために有用である。 植物における遺伝子の発現のために有用な典型的な発現ベクターは、本技術分 野でよく知られている。ｓｐ５６をコードする遺伝子を発現ベクターを介して植 物に導入する典型的な方法には、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ag robacterium tumefaciens）媒体形質転換、植物ウイルストランスフェクション 、原形質体（プロトプラスト）形質転換、花粉への遺伝子導入、生殖器官への注 入、未熟胚への注入、および「バイオリスチックス(biolystics)」という方法で ある直接挿入が含まれる。植物ウイルスによる感染の場合、ｓｐ５６タンパクは 、高濃度で産生され、低コストで単離することができ、遺伝子ストックは、植物 を経由することなく、長期間容易に維持される。 そのような発現に好ましい植物には、その植物に適合性の発現ベクターが存在 し、本発明のｓｐ５６免疫避妊性抗原ポリペプチドを哺乳類にデリバリーするの に用いられ得る植物が含まれる。植物の例には、双子葉植物および単子葉植物が 含まれる。特に好ましい植物としては、アルファルファ、トマト、ペチュニア、 大豆、タバコ、コーン、小麦、米、ホウレンソウ、アスパラガス等が挙げられる 。本発明のｓｐ５６組換えタンパクの発現のための発現ベクター系の例には、米 国特許第５，２０２，４２２号およびAnらによるPlant Molecular Biology Manu al，A3:1-19（1988年）に記載された、アグロバクテリウム・チュメファシエン スを用いるバイナリーベクター系のようなものが含まれ、それらの記載を引用に より本明細書に援用する。 他の好ましい植物ベクター系には、FreedおよびCarringtonによるJ．Virol.， 64:1590（1988年）に記載されたｐＲＴＬ２系列のベクターが含まれる。それら のベクターは、発現制御配列に作動可能に連結されたｓｐ５６インフレーム組換 えＤＮＡセグメントを生成し、そのセグメントは次に単一フラグメントとして植 物発現ベクターに移行され、その発現ベクターは次に選ばれた植物に導入される ために用いられるので、シャトルベクターと呼ばれる。ｐＲＴＬ２ベクターは、 ｐＲＴＬ−ＧＵＳからＧＵＳコード配列を除去し、その代わりに、目的のコード 配列と換えることにより、ｐＲＴＬ−ＧＵＳから誘導される。実施例に記載する ように、ＧＵＳ配列は、コレラ毒素のαまたはβ鎖をコードする遺伝子に取り換 えられており、本発明のｓｐ５６タンパクを含む融合タンパクの発現を提供する 。ｐＲＴＬ２ベクターは、植物発現ベクターにおけるｓｐ５６の発現を媒介する ためのシャトル化発現要素とて有用である下記の要素を有する：カリフラワーモ ザイクウイルスの３５Ｓ転写物遺伝子から誘導される３５Ｓプロモーター、翻訳 エンハンサーとして役立つタバコエッチ（tabacco etch）ウイルス非翻訳リーダ ー配列、およびトランス遺伝子転写物のポリアデニル化を指令するためのカリフ ラワーモザイクウイルスの３５Ｓ転写物遺伝子の３’末端の３５Ｓポリアデニル 化配列。それらの要素は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限消化により単離される単一カセッ ト状に作成される。コレラ遺伝子系／ｓｐ５６コード領域を有する制御要素を含 有するその単離されたフラグメントを、次にｐＧＡ４８２のような好ましい植物 発現ベクターに挿入する[AnらによるPlant Molecular Biology Manual，A3：1-1 9(1988年)]。次に、組換え植物ベクターを、植物ウイルスを形質転換させるの に用いて、次にその植物ウイルスを用いて、タバコまたはアルファルファのよう な植物に感染させる。好ましい植物ウイルスは、アグロバクテリウム（Agrobact erium）株ＬＢＡ４４０４である。 さらに好ましい植物デリバリー発現系は、改変されたタバコモザイクウイルス （ＴＭＶ）に依存し、ＴＭＶの表面におけるＴＭＶコートタンパク−ｓｐ５６キ メラポリペプチド分子の合成を指令する。免疫避妊を媒介するための自己抗体応 答を誘発するためにこの系を用いる方法が、FitchenらによるVaccine、13巻、10 51-1057員（1995年）に記載されている。その著者は、非経口的にデリバリーさ れる免疫源として用いられる卵母細胞由来抗原を有するＴＭＶハイブリッド分子 の産生を記載している。ＴＭＶは、桿状粒子へと集合し、次にその粒子がウイル スに感染した葉に蓄積する、自己集合ウイルスであることにおいて、好ましい抗 原キャリアー分子である。集合した粒子のタンパク成分は、コートタンパク（ｃ ｐ）であり、そのカルボキシ末端部分に非ＴＭＶエピトープか挿入される。感染 および発現の後に、ＴＭＶ ｃｐおよび集合したＴＭＶ粒子は、それ自体免疫原 性である一方、抗原エピトープをデリバリーする抗原系を提供する。コートタン パクは容易に単離されて、粒状でまたは団粒形態で存在する。この状況は、本発 明の方法において記載されたような抗原の高濃度の有効な非経口のまたは経口の 免疫感作のために利点を与える。 本発明の例示的なＴＭＶ-ｓｐ５６キメラポリペプチド分子の調製は、実施例 ３に記載する。 他の好ましい植物発現ベクター系には、ｐＭＯＮ５３０[RogersらによるMetho ds in Enzymol.，153:253(1987年)]、ｐＫＬＹＸ５、６、７系列［Schardlらに よるGene，61:1(1987年)、およびクロンテック（Clontech）(カリフォルニア州 、パロアルト)から市販されているｐＢＩＮ１９が含まれる。 Ｆ．免疫避妊の方法 本発明は、精子ｓｐ５６タンパクに対する免疫応答を誘発することにより哺乳 類に不妊性を誘導するのに有用な免疫避妊ワクチン組成物を企図する。本発明の そのワクチン組成物は、生理学的に許容できる賦形剤を、活性成分としてその中 に溶解または分散された、本発明の抗原性ｓｐ５６を含む抗原性ポリペプチドと ともに含有することができる。 本明細書において用いる場合、「医薬（薬剤）的に容認できる」「生理学的に許 容できる」という用語およびそれらの文法的語尾変化は、それらが組成物、キャ リアー、希釈剤および作用剤に言及するにしたがって、互換的に用いられ、そし て悪心、めまい、胃の不調のような望ましくない生理学的影響の発生がなくその 物質を哺乳類に投与できることを表わす。 医薬組成物中に溶解または分散された活性成分を含有する医薬組成物の調製は 、本技術分野でよく知られている。典型的には、そのような組成物は、投与の企 図される経路により製剤化される。経口免疫避妊剤として、典型的には、本発明 の抗原性ポリペプチドは、餌または飼料に含有される。一方、目標物（直接、投 与されるワクチン）としては、抗原性ポリペプチドは、液体溶液または葱濁液と しての注射液として調製されるが、使用の前の液体溶液または懸濁液に適してい る固体形態も調製できる。その調製物はまた、乳化され得る。 活性抗原性ポリペプチドを、本明細書に記載されている治療法における使用に 適する量で、薬剤として容認でき、活性成分と適合性である賦形剤と混合しうる 。適する賦形剤は、例えば、水、塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等 およびそれらの組合わせである。また、望ましい場合は、その組成物は、少量の 、活性成分の効果を増大する湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤等のような補助物質を 含有することができる。 本発明のワクチン組成物には、成分の薬剤的に容認できる塩を含有させること ができる。薬剤的に容認される塩には、例えば、塩酸またはリン酸のような無機 酸、または酢酸、酒石酸、マンデリン酸（mandelic acid）のような有機酸を用 いて生成される酸添加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基で生成される）が含まれ る。遊離カルボキシル基で生成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化 カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄のような無機 塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノ ール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基からも誘導され得る。 生理学的に許容できるキャリアーは、本技術分野でよく知られている。液体キ ャリアーの例は、活性成分および水の他には物質を含まないか、または生理的ｐ Ｈ値のリン酸ナトリウム、生理的塩類溶液またはその両方のような緩衝剤を含有 する滅菌水性溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水である。なおさらに、水性キャ リアーは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ブドウ糖、ポリエチレングリコール および他の溶質と同様に、２以上の緩衝塩を含有し得る。 液体組成物はまた、水に加えて、または水なしで、液相も含有し得る。そのよ うな付加的な液相の例には、グリセリン、綿実油のような植物油および水−油エ マルジョンがある。 免疫避妊組成物は、１回以上の免疫処理後、免疫処理された哺乳類において、 抗ｓｐ５６抗体を含有する免疫応答を誘発するのに効果的であることについての ｓｐ５６抗原決定基を、ある量含有する。免疫処理の経路は、さらに本明細書に 記載されているように、変わりうるが、免疫応答を誘発するのに有効であるため に必要な量のｓｐ５６抗原決定基を含有する組成物の調製に影響を与える。した がって、有効量は、適するそして企図された経路による投与時に抗ｓｐ５６抗体 の産生を誘発する量である。反復免疫処理を用いてもよく、これは、活性成分の 低濃度化を可能にする。 このように、１つの態様では、本発明は、処理される哺乳類の精子に存在する ｓｐ５６抗原決定基を含有する、本明細書に記載された免疫避妊ワクチン組成物 を、哺乳類に投与することを含む、哺乳類またはヒトの免疫避妊方法を提供する 。抗原性ポリペプチドは、本明細書に記載したように変わりうる典型的な投与経 過の後に、抗ｓｐ５６抗体応答を誘発するのに十分な量で、その組成物中に存在 する。 ワクチンの有効性は、処理された哺乳類の血清中の抗ｓｐ５６抗体の存在を観 察することによって、または処理された哺乳類により産生された精子の受精能を 測定することにより、決定できる。 免疫避奸ワクチン組成物は、慣習的に、静脈、皮下、筋肉または腹膜内に投与 されるが、多くの好ましい態様では、餌または飼料中に経口で投与される。 本組成物は、調剤配合物（dosage formulation）と適合する様式で、免疫治療 的に有効な量で投与される。投与される量は、処理される対象体、活性成分を用 いるための対象体系の吸収力、および望ましい免疫応答の程度による。投与され ることが必要な活性成分の正確な量は、医師または実施者の判断によることがで き、そして各個体に特有である。しかし、全身投与に適する用量範囲は、本明細 書に開示されており、そして投与の経路に依存する。初回投与および追加用量の ための適する型も変わりうるが、典型的には、初回投与の後に、次の注射または 他の投与方法による１時間以上の間隔での反復投与量、とされる。 好ましくは、本発明の抗原性ポリペプチドは、分離された形態で、すなわち、 全組成物の少なくとも約０．１重量％、好ましくは少なくとも１％、より好まし くは少なくとも約１０％で、組成物中に存在する。配合組成物における使用のた めに特に好ましいのは、抗原性ポリペプチドの実質的に純粋な調製物、すなわち 、本発明の組成物へと混合する前に、最初に、少なくとも９０重量％、そしてよ り好ましくは少なくとも９９重量％の調製物である。ポリペプチドの化学的性質 に基づく単離されたポリペプチドの濃縮および調製に有用な生化学的方法は、よ く知られており、９９重量％よりも多く濃縮されたタンパクの製造のために慣例 的に用いることができる。 本発明の最も重要な用途は、げっ歯動物等のような野生の有害哺乳類個体群の 制御であるので、餌または飼料の使用が本発明のワクチン組成物のための配合物 として特に有用である。したがって、好ましい投与経路は、食物摂取による経口 経路である。本組成物には、植物物質または他のキャリアーを含むことができ、 したがって、好ましいキャリアーは非毒性の食することができるキャリアーであ る。ペレット、カプセル、錠剤、食物バー（food bar）等への餌および飼料の配 合は、農業の技術分野で一般的によく知られており、本発明を制限するものとは 考えない。 特に好ましい製剤には、植物における抗原性ポリペプチドの産生のための組換 えＤＮＡ発現ベクターの使用か含まれ、その使用により、飼料または餌中へのそ の植物の収穫を可能にし、それによって、ワクチン配合物が提供される。例示的 な方法には、本発明の抗原性ポリペプチドをコードする発現性遺伝子を含有する トランスジェニック植物の調製が含まれる。その他に、植物は、抗原性ポリペプ チドを含有し、そして発現するように操作されたウイルスベクターで感染され得 る。本明細書中に記載された好ましい態様では、植物の感染、および餌または飼 料を調製するために最終的に用いられる植物物質における抗原性ポリペプチドの 呈示のためにＴＭＶが用いられる。 Ｇ．抗ｓｐ５６抗体 １つの態様において、本発明の抗体、すなわち、抗ｓｐ５６抗体は、本発明の ｓｐ５６抗原決定基と免疫反応する抗体分子を含むものと特徴づけられる。 このように、本発明は、本発明の抗原性ポリペプチドと免疫反応する、好まし くは天然のｓｐ５６タンパクとも免疫反応する、抗ｓｐ５６抗体を記載している 。好ましくは、抗体は、実質的に、ｓｐ５６以外の精子タンパクとの免疫反応が ない。免疫反応性を評価するために有用な免疫反応のためのアッセイは、本明細 書に記載されている。 １つの態様では、ｓｐ５６の予備選択されたドメインと免疫反応し、他のドメ インとは免疫反応せず、それにより抗体に望ましい特異性を与える抗体分子が記 載されている。例えば、本明細書に示すように、ｓｐ５６のドメインは、それが 由来するｓｐ５６の種に対して特有の種特異的配列（ｓｓｓ）を有する。ｓｓｓ ドメインと免疫反応性の抗体は、異なる種からのｓｐ５６と免疫反応せず、した がって、ｓｐ５６種を分類化するのに有用である。一方、ｓｐ５６のドメインは 、種間で保存され、したがって、それらの保存されたドメインと免疫反応性の抗 体は、他のｓｐ５６種と免疫反応し、広範囲の種反応性の利点を有することが本 明細書に示されている。 本発明の抗体は、典型的には、哺乳類を、本発明の抗原性ポリペプチドを含有 する接種物で免疫処理し、それにより、免疫処理するポリペプチド上の抗原決定 基についておよびｓｐ５６についての免疫特異性を有する抗体分子を哺乳類中に 誘発することにより産生される。次に抗体分子を哺乳類から回収し、例えば、Ｄ ＥＡＥセファデックスによるような、よく知られた技術により、望ましい程度ま で単離し、ＴｇＧフラクションを得る。免疫原中に抗原性ポリペプチドを用いる 抗体調製法の例は、抗体の技術分野において広く知られている。 その種々の文法的形態における「抗体」という用語は、本明細書において、免 疫グロブリン分子、および／または免疫グロブリン分子の免疫的に活性な部分、 すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子の集団をいう集合名詞とし て用いられている。 「抗体結合部位」は、抗原を特異的に結合する重鎖および軽鎖可変および超可 変部から成る抗体分子の構造部分である。 本明細書において用いる場合、種々の文法的形態における「抗体分子」という 用語は、インタクトな免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学 的に活性な部分の両方を企図する。 本発明の診断法および系における使用のための抗体分子の例は、インタクトな 免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、および、Ｆａ ｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）₂およびＦ（ｖ）として本技術分野で知られている部 分を含むパラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分である。 抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ'）₂部分は、よく知られた方法により、実質的に インタクトな抗体の、それぞれパパインおよびペプシンのタンパク分解反応によ って生成される。例えば、TheofilopolousおよびDixonに付与された米国特許第 ４，３４２，５６６号を参照されたい。Ｆａｂ’抗体部分もよく知られており、 これは、Ｆ（ａｂ'）₂部分から生成され、続いてメルカプトエタノールを用いる ような、２つの重鎖を連結するジスルフィド結合の還元、続いて得られるタンパ クメルカプタンのヨードアセトアミドのような試薬でのアルキル化により製造さ れる。インタクトな抗体分子を含有する抗体が好ましいが、本明細書ではこれを 例示として用いている。 ポリペプチドに対する抗体の製造は、本技術分野でよく知られている。Staudt らによるJ．Exp．Med.，157:687-704（1983年）または米国特許第４，９００， ８１１号に記載されているSutcliffe，J．G.の教示を参照されたい。それらの教 示を引用により本明細書に援用する。 簡単に記載すると、本発明のペプチド抗体組成物を産生するために、実験哺乳 類に、典型的には本発明のワクチンに存在するような、抗原性ポリペプチドの免 疫的有効量を接種する。次に、それにより誘導された抗ｓｐ５６抗体を、その哺 乳類から回収し、例えば、固相において免疫処理用ポリペプチドを用いる免疫ア フィニティークロマトグラフィによるようなよく知られた技術により、相当する 組換えｓｐ５６タンパクのような、免疫処理用ポリペプチドと天然のｓｐ５６タ ンパクの両方について免疫特異性のものを、望ましい程度まで単離する。 抗体の特異性を増大するために、好ましくは、固相付着された免疫処理用ポリ ペプチドを用いる免疫アフィニティークロマトグラフィにより抗体を精製する。 抗体を、固相付着された免疫処理用ポリペプチドと、ポリペプチドが抗体分子と 免疫反応して固相付着された免疫複合体を形成するのに十分な時間、接触させる 。その結合された抗体を、標準技術によりその複合体から分離する。 その種々の文法的形態における「接種物」という用語は、本明細書において、 ｓｐ５６決定基含有ポリペプチドに対する抗体の生成に用いられる活性成分とし て本発明の抗原性ポリペプチドを含有する組成物を記載するのに用いられている 。ポリペプチドが、抗体を誘発するための接種物中に用いられる場合、ポリペプ チドは、種々の態様で、例えば、単独でもしくは接合体(コンジュゲート;conjug ate)としてキャリアーに連結させて、またはポリペプチドポリマーとして、用い られると理解すべきである。しかし、表現を容易にするために、ポリペプチドの 接種物の状況において、本発明のポリペプチドの種々の態様は、本明細書では、 「ポリペプチド」およびその種々の文法的形態により、集合的に表わされる。 約35より少ないアミノ酸残基を含有するポリペプチドでは、抗体の産生を誘発 させるためにはキャリアーに結合されたペプチドを用いることが好ましい。 ポリペプチドをキャリアーに結合させるのを補助するために、ポリペプチドの アミノ末端またはカルボキシ末端に、１つ以上の付加的なアミノ酸残基を付加さ せることができる。ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に付加され るシステイン残基は、ジスルフィド結合を介してコンジュゲートを形成するため に特に有用であることが見出された。しかし、コンジュゲートを製造するための 本技術分野でよく知られた他の方法も用いることができる。 本技術分野で現在知られている活性化官能基を介してカップリングまたはポリ ペプチドを接合する技術も、特に適用できる。例えば、Aurameasらによる、Scan d．J．Immunol.，８:補遺７：7-23(1978年)、および米国特許第４，４９３，７ ９５号、３，７９１，９３２号および３，８３９，１５３号を参照されたい。ま た、 カップリングの後に、ポリペプチド配向による活性の損失が最小になるように、 部位特異的カップリング反応を行い得る。例えば、RodwellらによるBiotech.，3 :889-894（1985年）および米国特許第４，６７１，９５８号を参照されたい。 連結操作のその他の例には、ミカエル（Michael）付加反応生成物、グルタル アルデヒドのようなジアルデヒドの使用、KlipsteinらによるJ．Infect．Dis.， 147:318-326（1983年）等、またはキャリアーへのアミド結合を形成するための 水溶性カルボジイミドの使用におけるようなカルボジイミド技術の使用が含まれ る。あるいは、カルボキシ末端システインが導入されているペプチドを結合させ るために、ヘテロ二官能性架橋リンカー、ＳＰＤＰ［Ｎ−スクシンイミジル−３ −（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（n-succinimidyl-3-(2-pyridyldit hio)proprionate））］が用いられる。 本発明の抗体の生成および本発明のワクチン組成物の生成の両方における本発 明における使用のために有用なキャリアーは、本技術分野でよく知られており、 一般的にそれ自体、タンパクである。そのようなキャリアーの例は、キーホール カサガイヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin(ＫＬＨ)、エデスチン、チ ログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳ Ａ）のようなアルブミン、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）のような赤血球、ジフテリ ア毒素、テタヌス毒素、コレラ毒素サブユニットＡ、Ｂまたは両者、およびポリ Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸のようなポリアミノ酸等である。 キャリアーの選択は、接種物の最終的な使用に、より多く依存し、本発明にお いて特に含まれない基準に基づいている。例えば、接種される特定の動物におい て都合の悪い反応を生じないキャリアーを選ばなくてはならない。 本接種物は、典型的にはキャリアーに連結されたコンジュゲートとして、有効 な免疫原性の量の本発明のポリペプチドを含有する。免疫処理用ポリペプチドに 対する免疫応答を誘発するために十分な、単位用量当りのポリペプチドの有効量 は、特に、接種される動物の種、動物の体重、および選ばれた接種様式に依存し 、本技術分野でよく知られている。典型的には、接種物は、接種（用量）当り約 １０μｇ〜約５００ｍｇ、好ましくは用量当り約５０μｇ〜約５０ｍｇのポリペ プチド濃度を含有する。 接種物に関する「単位用量」という用語は、動物に対する単位用量として適す る物理的に別個の単位をいい、各単位は、必要な希釈剤、すなわち、キャリアー またはビヒクルに関連して望ましい免疫原性効果を生じるように計算された活性 物質の予め決定された量を含有する。本発明の接種物の新規な単位用量のための 特定化は、本明細書に詳細に開示したように、（a）活性物質の特有の性質およ び達成すべき特定の免疫効果、および(b)動物における免疫用途のためのそのよ うな活性物質を配合する技術における固有の制限により指示され、それらに直接 依存し、それらは、本発明の特徴である。 接種物は、典型的には、乾燥した固体のポリペプチド−コンジュゲートから、 そのポリペプチドコンジュゲートを、水、塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水の ような生理的に許容できる（容認できる）希釈剤中に分散させ、水性組成物を生 成することにより調製する。 接種物にはまた、希釈剤の一部として、アジュバントを含めることができる。 完全フロイトアジュバント(ＣＦＡ)、不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）お よびアルミニウム（ミョウバン）のようなアジュバントが、本技術分野でよく知 られており、そして、いくつかの供給源から市販されている。 そのように生成された抗体は、特に、組織切片または体液試料のような試料に 存在するｓｐ５６を検出するための本発明の診断法および系において用いること ができる。好ましい抗ｓｐ５６抗体は、モノクローナル抗体である。 その種々の文法的形態における「モノクローナル抗体」という語句は、特定の エピトープと免疫反応することができる単一の抗体結合部位のみを含有する抗体 分子の集団をいう。このように、モノクローナル抗体は、典型的には、免疫反応 するエピトープに対して単一の結合親和性を示す。したかって、モノクローナル 抗体は、各々が異なるエピトープに対して免疫特異性である複数の抗体結合部位 を有する抗体分子、例えば、二特異性モノクローナル抗体を含有していてもよい 。 本発明の好ましいモノクローナル抗体は、本発明の抗ｓｐ５６抗体について記 載された本発明の抗原性ポリペプチドと免疫反応する抗体分子を含有する。より 好ましくは、モノクローナル抗体はまた、組換えにより生成されたまたは天然の 単離されたｓｐ５６タンパクとも免疫反応する。 モノクローナル抗体は、典型的には、１種のみの抗体分子を分泌（産生）する ハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンにより産生される抗体から成る。 そのハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞とミエローマまたは他の無際限に継続 できる細胞株とを融合することにより生成される。そのような抗体の生成は、最 初に、KohlerおよびMilsteinによるNature，256:495-497（1975年）に記載され た。その記載を引用により本明細書に援用する。そのように生成されたハイブリ ドーマ上清液は、免疫処理用ポリペプチドまたは全体のｓｐ５６タンパクと免疫 反応する抗体分子の存在についてスクリーニングすることができる。 簡単に記載すると、モノクローナル抗体組成物を産生するハイブリドーマを生 成するために、ミエローマまたは他の無際限に継続できる細胞株を、本発明の好 ましいポリペプチド中に存在するようなｓｐ５６抗原決定基を含有する抗原性ポ リペプチドで高度免疫処理された哺乳類の脾臓から得られるリンパ球と融合させ る。ポリペプチドで誘発されたハイブリドーマ技術は、NimanらによるProc.Natl ．Acad．Sci．USA，80:4949-4953（1983年）に記載されており、その記載を引用 により本明細書に援用する。 ハイブリドーマを生成するのに用いられるミエローマ細胞系は、リンパ球と同 じ種からのものが好ましい。典型的には、１２９ ＧＬＸ⁺株のマウスは、好ま しい哺乳類である。本発明における使用のために適するマウスのミエローマには 、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（ＨＡＴ）細胞株、アメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州、ロックビル）から 、それぞれＣＲＬ １５８０およびＣＲＬ １５８１という表示で入手できるＰ ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳｐ２／０−Ａｇ１４がある。 脾臓細胞は、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を用い てミエローマ細胞と融合される。融合されたハイブリッドは、ＨＡＴに対する感 受性により選択される。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ は、実施例に記載された、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を 用いて同定される。 本発明のモノクローナル抗体はまた、適するポリペプチド特異性の抗体分子を 産生し分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含むモノクローナルハイブ リドーマ培養を開始することによっても生成し得る。その培養物を、ハイブリド ーマが培地中に抗体分子を分泌するのに十分な条件下で十分な時間維持する。次 に、抗体含有培地を回収する。次に、抗体分子をよく知られた技術により、さら に単離し得る。 それらの組成物を調製するために有用な媒体は、本枝術分野でよく知られてお り、そして市販されており、これらには、合成培地、近交系マウス等が含まれる 。合成培地の例は、４．５ｇ／ｌのグルコース、２０ｍＭのグルタミンおよび２ ０％のウシ胎児血清を補なったダルベッコの最少必須培地［ＤＭＥＭ、ダルベッ コらによるVirol，8:396(1959年)］である。近交系マウスの例は、Ｂａｌｂ／ｃ である。 モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞またはハイブリドーマ細胞培養物を 生成する他の方法もよく知られている。例えば、SastryらによるProd.Natl.Acad .Sci.USA,86:5728-5732(1989年)およびHuseらによるScience,246:1275-1281（19 89年）に記載された免疫学的レパートリーからモノクローナル抗体を単離する方 法を参照されたい。 本発明のモノクローナル抗体は、本発明の抗体について本明細書に開示されさ れたのと同じように用いられることができる。 例えば、モノクローナル抗体は、ｓｐ５６との免疫反応が望ましい場合に本明 細書中に開示された治療的方法、診断的方法またはインビトロの方法において用 いることができる。 また、本発明は、ハイブリドーマ細胞、および本発明のモノクローナル抗体を 産生するハイブリドーマ細胞を含有する培養物も企図する。 Ｈ．診断法 本発明は、組織の塊、組織の切片を含む組織試料または生物学的な液体試料の ような身体試料中の、ｓｐ５６、ｓｐ５６抗原決定基または抗sｐ５６抗体の存 在および好ましくは量を決定する種々のアッセイ法を企図し、この方法では、本 発明のポリペプチド、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を免疫化学 的な試薬として使用して免疫反応生成物を生成させ、その量が直接的または間接 的に試料中のｓｐ５６抗原決定基または抗体の量に関連する。 当業者は、本発明の免疫化学的試薬を、体の試料中の抗原または抗体の量に関 連する量の免疫反応生成物を形成させるために使用することができる、数多くの 周知の臨床診断の化学的方法が存在することを理解するであろう。したがって、 本明細書に例としてのアッセイ法が記載されているが、本発明はこれらに限定さ れない。 競合的または非競合的のいずれかの、種々の不均一（ヘテロジニアス）および 均一（ホモジニアス）プロトコルを、本発明のアッセイ法を実施するのに使用す ることができる。 ｓｐ５６を有する精子は、卵の透明帯との相互作用に有効であり、受精能があ ることが推定される。ｓｐ５６を欠く精子は、相互作用に無効であり、受精能は 推測されない。 したがって、本発明の態様の一つは、抗ｓｐ５６抗体を試料中のｓｐ５６タン パクと免疫反応させるのに使用する、精子含有試料中のｓｐ５６タンパクの量を アッセイする方法を企図する。この態様では、抗体は、ｓｐ５６と免疫反応して 、ｓｐ５６−抗体免疫反応複合体を形成し、この複合体は検出され、試料中のｓ ｐ５６の存在を示す。したがって、このアッセイ形式は、哺乳類の精子のｓｐ５ ６の存在を検出することにより、哺乳類の受精能力を決定する方法を定義する。 試料中のｓｐ５６の存在および好ましくはその量をアッセイするための抗ｓｐ ５６抗体分子を使用する免疫測定法は、典型的には以下の工程を含む。 （ａ）試料を、本発明の抗ｓｐ５６抗体、好ましくはモノクローナル抗体と混 合する（接触させる）ことにより、免疫反応混合物を形成する。試料は、典型的 には、免疫反応混合物が液相および固相の両方を有するように固相中の試料の形 であり、抗体は、試料中のｓｐ５６の存在を検出する試薬として機能する。 試料は、精液または精巣上体組織などの精子含有試料であり、周知の免疫組織 学的染色で準備されていることが好ましいが、組織抽出物または体液を含む他の 試料を固相上に吸着させてもよい。このような場合、固相への吸着は、周知のウ エスタン・ブロットまたはＥＬＩＳＡ法に記載されているように行うことができ る。 （ｂ）免疫反応混合物を、約１０分間から約１６〜２０時間のような予定され た時間、約４℃〜約４５℃で、時間は試料中に存在するｓｐ５６が抗体と免疫反 応（免疫学的に結合）してｓｐ５６含有免疫反応生成物（免疫複合体）を形成す るのに十分となるようにし、生物学的なアッセイ条件下で維持する。 生物学的アッセイ条件は、本発明の免疫化学試薬およびアッセイされるｓｐ５ ６の生物学的活性を維持するものである。これらの条件は、約４℃〜約４５℃の 温度範囲、約５〜約９のｐＨ値範囲、および蒸留水のイオン強度〜約１ｍｏｌ／ ｌの塩化ナトリウム溶液に等しいイオン強度の範囲を変動するイオン強度を含む 。このような条件を最適化する方法は、当業者に周知である。 （ｃ）工程（ｂ）で形成されたｓｐ５６含有免疫反応生成物の存在、および好 ましくは量を測定（検出）し、試料中に存在するｓｐ５６の量を決定する。 直接または間接的に免疫生成物の存在または量を測定することは、当業者に周 知のアッセイ技術により成し遂げられ、典型的には使用される指示手段の種類に よる。 好ましくは工程（ｃ）の決定は、以下の工程を含む。 (i) ｓｐ５６含有免疫反応生成物を、第二の抗体と混合し、第二の（検出） 免疫反応混合物を形成させ、前記第二の抗体分子は、免疫反応生成物中の第一の （一次）抗体と免疫反応する能力を有する。 第二の抗体として有用な抗体は、一次抗体に対するポリクローナルまたはモノ クローナル抗体調製物を含む。 (ii) 前記第二の免疫反応混合物を、第二の抗体が、免疫反応生成物と複合体 を形成し、第二の免疫反応生成物を形成するのに十分な時間維持し、そして、 (iii) 第二の免疫反応生成物中に存在する第二の抗体の量、したがって、工 程（ｃ）で形成された免疫反応生成物の量を決定する。 一つの態様では、標識が形成された第二の免疫反応生成物の存在を検出するた めの指示手段を提供するように、第二の抗体は、標識された抗体（すなわち、検 出抗体）である。標識は、第二の免疫反応生成物中に測定され、したがって、固 相中の第二の抗体の存在および好ましくは量を示す。 代わりに、第二の抗体の量は、周知のように、第二の抗体と特異的に反応（結 合）する指示手段を有する追加の反応混合物の調製によって決定することができ る。例えば、第二の抗体に特異的な、標識された抗免疫グロブリン抗体分子との 第三の免疫反応混合物である。第三の免疫反応の後、形成された第三の免疫反応 生成物は、標識の存在を介して検出される。 ｓｐ５６抗原決定基の量および存在を検出する方法は、試料中のｓｐ５６の種 類、したがって、精子の種類を決定するのにも有用であり、使用する抗体は、例 えば、ｓｓｓドメインなどのような種特異的な、特異的な形態のｓｐ５６ドメイ ンである。したがって、本発明は、抗ｓｓｓ抗体とともに上記のアッセイを使用 して精子提供者または試料の種を同定する方法もまた企図する。 別の診断法の態様は、循環血液または精液中にいずれかの抗ｓｐ５６抗体が存 在するかどうかを測定することによる、哺乳類の避妊状態の決定を含む。 抗ｓｐ５６抗体が存在すると、哺乳類は受精しないか、または受精能は損なわ れる。 したがって、別の態様は、ｓｐ５６抗原決定基を試料中の抗ｓｐ５６抗体と免 疫反応させるのに使用する、体の試料中の抗ｓｐ５６抗体の量をアッセイする方 法を企図する。この態様では、試料中の抗体がｓｐ５６と免疫反応して、ｓｐ５ ６抗体免疫反応複合体を形成し、この複合体は、試料中の抗ｓｐ５６抗体の存在 を示して検出される。したがって、このアッセイ形式は、哺乳類の免疫避妊性抗 ｓｐ５６抗体の存在を検出することにより、哺乳類の受精不能性を決定するため の方法を定義する。この方法は、本発明の免疫避妊法が効果的であるかを同定し 、および不妊を引き起こす自己免疫反応を経験している哺乳類を同定するのに有 用である。 試料中の抗ｓｐ５６抗体の存在および好ましくは量をアッセイするためのｓｐ ５６抗原決定基を使用する免疫測定法は、典型的には以下の工程を含む。 （ａ）試料を、本発明のｓｐ５６抗原決定基を含む抗原性ポリペプチドと混合 （接触）して、免疫反応混合物を形成する。この試料は、典型的には、免疫反応 混合物が液相および固相の両方を有するように、固相中に固定された試料の形で あり、抗原性ポリペプチドは、試料中の抗ｓｐ５６抗体の存在を検出する試薬と して機能する。 好ましくは、試料は、血液、血清または血漿試料であり、例えば、精液または 精巣上体組織であり、周知の免疫組織学的染色で準備されていることが好ましい が、組織抽出物または体液を含む他の試料も固相上に吸着され得る。このような 場合、固相上への吸着は、周知のウエスタン・ブロット法について記載されてい るように行うことができる。 （ｂ）免疫反応混合物を、約１０分間から約１６〜２０時間のような予定され た時問、約４℃〜約４５℃で、時間は試料中に存在するｓｐ５６が抗体と免疫反 応（免疫学的に結合）してｓｐ５６含有免疫反応生成物（免疫複合体）を形成す るのに十分となるようにし、生物学的なアッセイ条件下で維持する。 生物学的アッセイ条件は、本発明の免疫化学試薬およびアッセイされるｓｐ５ ６の生物学的活性を維持するものである。これらの条件は、約４℃〜約４５℃の 温度範囲、約５〜約９のｐＨ値範囲、および蒸留水のイオン強度〜約１ｍｏｌ／ ｌの塩化ナトリウム溶液に等しいイオン強度の範囲を変動するイオン強度を含む 。このような条件を最適化する方法は、当業者に周知である。 （ｃ）工程（ｂ）で形成されたｓｐ５６含有免疫反応生成物の存在、および好 ましくは量を測定（検出）し、試料中に存在する抗ｓｐ５６抗体の量を決定する 。 直接または間接的に免疫反応生成物の存在または量を測定することは、当業者 に周知の、そして本明細書に記載するようなアッセイ技術により成し遂げられ、 典型的には使用される指示手段の種類による。 本明細書で使用している「複合体」という語は、抗体−抗原またはレセプター −リガンド反応のような特異的結合反応の生成物をいう。複合体の例は、免疫反 応生成物である。 本明細書において、種々の文法的な形の「標識」または「指示手段」という語 は、複合体の存在を示す検出可能な信号の生成に直接または間接的に関与する一 種類の原子または分子をいう。あらゆる標識または指示手段は、本発明の抗体ま たはモノクローナル抗体組成物の一部である、抗体分子、発現されたタンパク、 またはポリペプチドと結合するか、または組み込まれるか、別々に使用されるこ とができ、これらの原子または分子は、単独で、または追加の試薬とともに使用 することができる。このような標識は、臨床診断の化学において周知であり、そ れ以外は新規なタンパク、方法、および／またはシステムを使用する範囲内では 本発明の一部を構成する。 標識手段は、抗体または抗原を変性することなく、これらに化学的に結合して 有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識剤である ことができる。適する蛍光標識剤は、フルオレセインイソシアネート(ＦＩＣ)、 フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、５−ジメチルアミン−１−ナフ タレンスルフォニルクロライド(ＤＡＮＳＣ)、テトラメチルローダミンイソチオ シアネート(ＴＲＩＴＣ)、リッサミン、ローダミン８２００スルフォニルクロラ イド（ＲＢ２００ＳＣ）などの蛍光色素である。免疫蛍光分析技術の記載は、「 免疫蛍光分析(Immunofluorescence Analysis)」、Antibody As a Tool、Marchalo nisら編集、John Wiley&Sons,Ltd、１８９〜２３１頁（１９８２）に記載されて おり、本明細書に援用する。 好ましい態様では、指示基は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ) 、グルコースオキシダーゼなどのような酵素である。主要な指示基がＨＲＰまた はグルコースオキシダーゼのような酵素である場合、追加の試薬により、レセプ ター−リガンド複合体（免疫反応体）が形成されているという事実を明視化する ことか要求される。ＨＲＰのためのこのような追加の試薬は、過酸化水素、およ びジアミノベンジジンのような酸化染料前駆体を含む。グルコースオキシダーゼ とともに有用な追加の試薬は２，２’−アミノ−ジ−（３−エチル−ベンズチア ゾリン−Ｇ−スルホン酸）(ＡＢＴＳ)である。 放射性元素もまた、有用な標識剤であり、本明細書において例として使用する 。放射性標識剤の例は、γ線を放出する放射性元素である。¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹²⁸ Ｉ、¹³²Ｉ、および⁵¹Ｃｒなどの、自らγ線を放出する元素は、γ線放出して放 射性元素指示基を生成する一つのクラスを意味する。特に好ましいのは¹²⁵Ｉで ある。有用な標識手段の他の群は、自ら陽電子を放出する¹¹Ｃ、¹⁸Ｆ、¹⁵Ｏおよ び¹³Ｎのような元素である。放出された陽電子は、動物の体内に存在する電子と 遭遇すると、γ線を生じる。また、¹¹¹インジウムまたは³Ｈのようなβエミッタ ーも有用である。 標識の結合、すなわち、ポリペプチドおよびタンパクの標識は、当技術分野に 周知である。例えば、ハイブリドーマにより産生された抗体分子は、培地中の成 分として付与された放射性同位体含有アミノ酸を代謝的に組み込むことによって 標識することができる。例えば、GalfreらのMeth.Enzymol.，７３：３〜４６頁 （１９８１年）を参照されたい。活性化された官能基を介してのタンパクの共役 (コンジュゲート化)またはカップリング技術は特に好ましい。例えば、Aurameas ら、Scand.J.Immunol.Vol.8.Suppl.７：７〜２３頁(１９７８年)、Rodwellら、B iotech、３：８８９〜８９４頁（１９８４年）および、米国特許第４，４９３， ７９５号を参照されたい。 この診断法は、免疫反応生成物の検出のために、特異的結合剤を使用すること もまた可能である。「特異的結合剤」は、本発明の試薬種に選択的に結合するこ とのできる分子の実体、またはこのような種を含む複合体であるが、本発明のポ リペプチドまた抗体分子組成物自体ではない。特異的結合剤の例は、第二の抗体 分子、補体タンパク、またはそれらのフラグメント、エス・アウレウス(S.aureu s )プロテインＡなどである。その種が複合体の一部として存在する場合、特異的 結合剤が試薬種に結合することが好ましい。 好ましい態様では、特異的結合剤は標識されている。しかし、診断法で、標識 さ れていない特異的結合剤を使用する場合、試薬は、典型的には増幅手段また は試薬として使用される。これらの態様では、増幅手段が試薬種を含有する複合 体と結合する場合に、標識された特異的結合剤は、増幅手段に特異的に結合する 能力を有する。 本発明の診断法は、試料中のｓｐ５６抗原決定基の量を検出するために「ＥＬ ＩＳＡ」形式で実施することができる。「ＥＬＩＳＡ」は、固相に結合する抗体 または抗原、および酵素−抗原または酵素−抗体接合体を使用して、試料中に存 在する抗原を検出および定量する、酵素結合免疫吸着法である。ＥＬＩＳＡ技術 の説明は、D.P.Sitesら著、Basic and Clinical Immunologyの第４版の第２２章 (ロスアルトス(Los Altos)(カリフォルニア州)のLange Medical Publications発 行)、および米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号、第４ ，０１６，０４３号に見受けられ、これらを本明細書に援用する。 したがって、ある態様においては、目的の診断法で使用する固体支持体を形成 するために、本発明のポリペプチド、抗体またはモノクローナル抗体を、固体の マトリックスに固定することができる。 試薬は、典型的には水性媒体から吸着されて固体マトリックスに固定されるが 、当業者に周知のタンパクおよびポリペプチドに適用できる他の様式の固定法を 使用することもできる。吸着法の例は本明細書に記載されている。 有用な固体マトリックスもまた当業者に周知である。このような物質は、水に 不溶性であり、架橋されたデキストラン〔ピスカタウエイ（Piscataway）(ニュ ージャージー州)のファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chem icals)）からセファデックス（SEPHADEX）の商品名で入手可能〕、アガロース、 直径約１ミクロン（μｍ）〜約５ミリメートル（ｍｍ）のポリスチレン・ビーズ 〔ノース・シカゴ（North Chicago）(イリノイ州)のアボット・ラボラトリーズ （Abbott Laboratories）から入手可能〕、塩化ポリビニル、ポリスチレン、架 橋されたポリアクリルアミド、シート、細長い片(ストリップ)、またはへら（パ ドル）のような、ニトロセルロースまたはナイロンをベースにする繊維、または ポリスチレンまたは塩化ポリビニルから作られたチューブ、フルートまたはマイ クロ滴定プレートのウェルを含む。実施例 以下の実施例は説明を意図するものであって、明細書および請求の範囲をこの ように制限するものではない。１．精製されたｓｐ５６タンパク免疫原の調製 マウスｓｐ５６タンパクを、雄のマウスから二つの異なる方法で精製した。生 殖能力の衰えた雄のマウス〔ＨＳＤ：ＩＣＲ種、インディアナポリス（インディ アナ州）のハーラン・スプラージ・ダウレイ・インク(Harlan Sprague Dawley I nc.)〕(８〜１８週令)を殺し、副睾丸尾部および輸精管を、５ｍＭ ＥＧＴＡを 含む、予め暖められた（３７℃）Ｍ１１９Ｍ培地〔BleilおよびWassarman、J.Ce ll.Biol、１０２：１３６３〜１３６９頁(１９８６年)〕へ移した。組織をマイ クロ鋏で切開し、精子を１０分間遊泳させて出した。精子を９倍量のＭ１１ ９Ｍに移し、３０分間３７℃で受精能を獲得させた。受精能を獲得した精子を、 ソーバル（Sorvall）ＳＳ−３４ローテーター〔ウィリントン（デラウエア州） のデュポン・インストロメンツ(Du Pont Instruments)〕で７分間５，０００ｒ ｐｍでパーコール（Parcoll）グラジエントを介して２５℃で遠心分離すること により精製した。このグラジエントは、７０％のパーコール、２５ｍＭ トリス −ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌの３９ｍｌをソーバルＳＳ−３４ ローテーターで１時間１９,０００ｒｐｍで遠心分離することにより調製された 。 次に、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するパーコー ル・グラジエント、およびこれに続いて、３５，０００ｇ、７分間、２５℃で遠 心分離したグラジエントから、アクロソームがそのままの精子、およびアクロソ ームが反応した受精能を獲得した精子を別々に回収した。懸濁液中の分離された 精子の集まりをグラジエントから除去し、次に８倍量の培地で希釈し、続いて卓 上遠心器で５，０００ｒｐｍでペレット化した。後に続く実験での処理のために 、ペレットを緩衝液または培地で再懸濁した。この方法で精製された精子は、十 分に運動能力があり、受精可能である。平行実験において、受精能を獲得した精 子、および受精能を獲得し、パーコール精製された精子は、１０中８個のマウス の卵を受精させた。平均４×１０⁷の精製された精子を各雄から分離した。全て の実験のための水は、ナノピュア・ システム(Nanopure system)〔デュブキュ ー（Dubuque）(アイオワ州)のバーンステッド(Barnstead)〕で精製された。 ｓｐ５６の精製方法の一つは、本質的に前記されている〔BleilおよびWassarm an、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、８７：５５６３〜５５６７頁(１９９０年)〕よ うなＺＰ３−アフィニティークロマトグラフィーによるものであった。２０匹の 雄からの、パーコール精製され、アクロソームがそのままである精子を、２ｍｇ ／ｍｌのシチメンチョウ卵白トリプシン阻害剤を含む、２ｍｌの緩衝液Ａ（５０ ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、 １ｍＭ ＫＣｌ、および０．２％の水素添加されたトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ −１００）で抽出した。本明細書に記載した条件下で、ＵＶ透過性の、水素添加 されたトリトンＸ−１００〔サンディエゴ（San Diego）(カリフォルニア州)の カルバイオケム・コーポ(Calbiochem Corp.)〕は、１００％のｓｐ５ ６を抽出したが、これらの精子タンパクの１２％しか等モルのトリトンＸ−１０ ０により溶解されなかった。不溶性の物質を、１４，０００ｇで５分間遠心分離 して除去した。試料を０．２２μＭフィルターを通して濾過し、前記〔Bleilお よびWassarman、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、８７：５５６３〜５５６７頁(１９ ９０年)〕のように構成されているＺＰ３アフィニティーカラム〔ライニン（Rai nin）ＥＰカラム、１０μＭ ＺＰ３、ウォーバーン（Woburn）(マサチューセッ ツ州)のライニン・インストロメンツ(Instruments)〕にかけた。カラムを２０倍 量の緩衝液Ａで洗浄し、結合したタンパクを０〜８Ｍの尿素および０.２％の水 素添加されたトリトンＸ−１００のグラジエントで溶出させた。画分（０．１ｍ ｌ）を回収し、２−Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 多くの細胞外タンパク、ｓｐ５６は、典型的に、強い変性条件下でＺＰ３アフ ィニティー・カラムから溶出されるが、細胞内ジスルフィド結合を含む。このタ ンパクは、２−Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにさらされると、非還元条件下で４０，０ ００Ｄ(４０ｋＤａ)、還元条件下で５６ｋＤａのコーディネートを有する二重線 （ダブレット）として移動した。 このようなゲルの濃度分析は、ｓｐ５６が、水素添加されたトリトンＸ−１０ ０で抽出された精子タンパクの０．２％（〜２．３ｐｇまたは２５，０００ｍｏ ｌ ｓｐ５６／精子）のみを示していることを意味する。これに対し、パーコー ル精製され、アクロソーム反応した精子からトリトン生成されたタンパクの２− Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、ｓｐ５６は検出されなかった。この結果は、先行す る観察、すなわち、ｓｐ５６はアクロソーム反応された精子には存在しないこと を示したもの〔BleilおよびWassarman、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、８７：５５ ６３〜５５６７頁(１９９０年)〕と合致する。 上記のように、タンパク配列を得るために、パーコール精製されたマウス精子 に由来する、ＺＰ３アフィニティー精製されたｓｐ５６、生化学的に精製された ｓｐ５６(以下を参照されたい)、または総トリトン抽出されたタンパクを含むタ ンパク試料を、初めに２−Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルは１５分間移動 緩衝液〔１０％メタノール、１μＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＣＡＰＳ(Ｎａ−［３ −（シクロヘキシルアミノ）−プロパン］−スルホン酸)、ｐＨ１０〕で平衡さ せ、タンパクは、電気泳動装置中で、４℃で１時間、３００ｍＡの緩衝液で処理 されたポリビニルジフルオライド・タンパク・シークエンシング・メンブラン〔 バイオーラド・ラボラトリイズ(Bio-Rad Laboratories)〕中で泳動させた。メン ブランを１μＭ ＤＴＴを含む水で全体を洗浄し、タンパクを１μＭ ＤＴＴを含 むポンソー（Ponceau）染色により検出した。ｓｐ５６に相当する所（非還元条 件下で４０ｋＤａ、還元条件下で５６ｋＤａ）に位置した染色されたタンパクは 、メンブランから薄く切り取られ、全体を５０％のメタノールおよび１μＭ Ｄ ＴＴを含む５０％の水で洗浄し、トリプシンで分解して抽出するか、または直接 固相アミノ酸シークエンシングにかけた。逆相ＨＰＬＣにより分離されたｓｐ５ ６のトリプシン性フラグメントを分離し、固相アミノ酸シークエンシングにかけ た。トリプシンでの分解、逆相ＨＰＬＣ、およびアミノ酸シークエンシングは、 The Scripps Research Institute Protein Sequencing Core Facilityにより実 施した。 アミノ酸シークエンスに供されたタンパク（〜３０ｐｍｏｌ）は一つのＮＨ₂ −末端配列を有することが分かり、その最初の１２のアミノ酸は、ＤＣＧＰＰＰ ＬＬＰＦＡＳ（配列番号２の位置１〜１２）である。 精子からｓｐ５６を精製する代わりの方法は、生化学的精製に基づいた。４０ 〜５０の雄の、パーコール精製され、アクロソームはそのままの精子を２ｍｌの ２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．５％の水素添加されたトリトンＸ− １００で抽出し、抽出物を１ｍＭのＰＭＳＦで処理してプロテアーゼを不活性化 させた。抽出物を１４，０００ｇで５分間遠心し、不溶性物質を除去した。上清 を濾過し(０．２２μＭフィルター)、７５×７．５ｍｍ ＤＥＡＥ−５ＰＷカラ ム〔リッチモンド（Richmond）(カリフォルニア州)のバイオーラド・ラボラトリ イズ〕にかけた。タンパクをカラム緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８． ５、０．１％の水素添加されたトリトンＸ−１００）中、０−０．５Ｍ ＮａＣ ｌグラジエントで、２０分に渡り０．５ｍｌ／分の速度で溶出させた。溶出物を ２８０ｎｍで分析した。０．５ｍｌの画分を回収し、２−Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ にかけ、ｓｐ５６の位置〔４０ｋＤａ(非還元)、５６ｋＤａ（還元）に相当〕を 同定するためにケルを銀染色した。ｓｐ５６を含む画分をプールし、フィルタ ー〔セントリコン（Centricon）３０、ベットフォード（Bedford）(マサチュー セッツ州)のミリポア・コーポ(Millipore Corp.)〕で濃縮し、２００μｌを３０ ０×７．８ｍｍバイオーシル（ＢＩＯ−ＳＩＬ）ＳＥＣ ２５０カラム（バイオ ーラド・ラボラトリイズ）にかけた。カラムを平衡させ、０．２ｍｌ／分で５０ ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％の水素添加さ れたトリトンＸ−１００を流した。溶出物を２８０ｎｍで分析した。０．２ｍｌ の画分を回収し、ｓｐ５６の位置を同定するために２−Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに かけた。ｓｐ５６を含む画分をプールし、濃縮し、さらなる研究のために使用し た。サイズ除去カラムでの分子の大きさの測定は、＞３００、１５０、４４、１ ７、および＜１０ｋＤの標準タンパクに基づいた。変性されたタンパクを分離す る場合(カラム緩衝液中の０．１％トリトンを０．１％ＳＤＳに置き換える)、２ ００、６０および３０ｋＤの標準を使用した。 生化学的に精製されたｓｐ５６は、サイズ除去カラムから溶出され、１１０ｋ Ｄａ（範囲＝９０〜１３０ｋＤａ、サイズ標準を基にする）の分子量と見積もら れた。総トリトン抽出された精子タンパクは、非変性条件下（０．１％トリトン ）でサイズ除去クロマトグラフィーにかける場合、ｓｐ５６タンパクを含む画分 (２−Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルによって決定)を１１０ｋＤａで溶出し た。精子タンパクが、変性条件（０．１％ＳＤＳ）にさらされる場合、ｓｐ５６ を含む画分（２−Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルによって決定）を４６ｋＤ ａで溶出した。 さらに、この二つのラインは、アフィニティー精製されたｓｐ５６および生化 学的に精製されたタンパクが同等であることを示す。第一に、生化学的に精製さ れたタンパクのＮＨ₂末端アミノ酸配列は、上記のようにアフィニティー精製さ れたｓｐ５６と同一であった。第二に、生化学的に精製されたタンパクに対する モノクローナル抗体は、生化学的に精製されたタンパクおよびアフィニティー精 製されたｓｐ５６の両方を認識した。これらに加えて、生化学的に精製されたｓ ｐ５６は、２−Ｄ ＳＤＳゲル上でアフィニティー精製されたｓｐ５６とともに 移動した。２．マウスｓｐ５６ｃＤＮＡの分離 上記の実施例１で調製された、生化学的に精製されたｓｐ５６をエンド・アル グ（Endo Arg）Ｃ、トリプシン、およびキモトリプシンでタンパク質分解的に分 解し、固相自動エドマン分解（Edman-degradation）ペプチドシークエンスによ りアミノ酸シークエンスのための最初のフラグメントを生成させた。最初の物質 および放出されたアミノ酸の定量により、ｓｐ５６配列のみが得られたことを確 認した。 ｓｐ５６ペプチドフラグメントから、変性されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）のプライマーを、ｓｐ５６ｃＤＮＡフラグメントの増幅に使用するために、 Bookbinderら、Science、２６９：８６〜８８頁（１９９５）に記載されている ように設計した。簡潔には、プライマーは、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory ManuaL Cold Spring Harbor Laboratory、コールド・スプリング・ ハーバー（Cold Spring Harbor）(ニューヨーク州)(１９８９年)、およびＬｅｅ ら、BioTechniques、１４：１９１頁（１９９３年）に記載された方法にしたが って設計された。オリゴ（ｄＴ）−プライマー化された常磁性粒子を、プライマ −Ｎ４（５’ＣＣＮＴＴＹＧＣＮＷＳＮＣＣＮＡＣＮＡＡＹＣＡ３’）(配列番 号３)、およびＦ５Ｗ（５’ＴＡＲＡＡＮＡＣＲＴＡＲＴＣＮＣＣＲＴＡＮＧＣ ３’）(配列番号４)とともに使用して、マウス精巣ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから製造 された、１本鎖ｃＤＮＡ鋳型に入れ子（ネステッド、nested）ＰＣＲを実施し、 続いて最初の増幅生成物の１／１００を、プライマーＮ５（５’ＧＣＮＷＳＮＣ ＣＮＡＣＮＡＡＹＣＡＲＹＴＮＴＡ３’）(配列番号５)およびＦ５Ｗと他の回転 のＰＣＲを行った。変性した位置は、ＩＵＰＡＣの協定で示唆され、ＮはＡ、Ｇ 、Ｃ、またはＴ、ＹはＣまたはＴ、ＷはＡまたはＴ、ＲはＡまたはＧである。Ｎ ４およびＮ５プライマーは、キモトリプシン・ペプチド１の重複する部分を含み 、プライマーＦ５Ｗはキモトリプシン・ペプチド２に相当する。 得られた増幅された１キロベース（ｋｂ）の、ｓｐ５６ＮＨ₂末端(ＰＣＲプラ イマーＮ５によりコードされたアミノ酸１１〜１８)、エンド・アルグＣペプチ ド１(アミノ酸２７１〜２９４)、エンド・アルグＣペプチド２(アミノ酸２９１ 〜３０３)、トリプシン・ペプチド１(アミノ酸１９９〜２０５)、キモトリプシ ン・ペプチド(アミノ酸１２〜１８)、キモトリプシン・ペプチド（ＰＣＲ プライマーＦ５Ｗによりコードされたアミノ酸３４２〜３４９）の部分をコード する配列を含んだ。ここに記載されたプライマーおよびペプチド配列の位置につ いては、配列番号１に示されたｓｐ５６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を参 照されたい。 ｓｐ５６ｃＤＮＡクローンの全長は、オリゴ（ｄＴ）−プライマーマウス精巣 λ−Ｚａｐ ｃＤＮＡライブラリ（Dr．Bleilの研究室で製造された）を、上記の ように得られた、³²Ｐ標識された、ランダム−プライマー化された１ｋｂのＰＣ Ｒ生成物、または、配列５’ＡＣＣＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴ３’(配列番 号６)、および５’ＧＡＡＧＧＡＡＡＣＣＡＣＴＣＧＣＣＡ３’（配列番号７） を有する１ｋｂのＰＣＲ生成物に特異的な３２Ｐ標識されたプライマーでスクリ ーニングすることによって得られる。単離されたｓｐ５６ ｃＤＮＡクローンは 、ｓｐ５６ＮＨ₂末端アミノ酸１〜１０をコードする塩基の上流に沿って完全な １ｋｂＰＣＲ生成物を含み、クローンがｓｐ５６をコードしていることを確認し た。 マウスｓｐ５６ｃＤＮＡクローンの鎖の冒頭の塩基配列は、受託番号Ｕ１７１ ０８としてジェンバンク（Genbank）に記載されている。ｓｐ５６ｃＤＮＡは、 最初の枠内（in-frame）のメチオニンから、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏの３つの塩 基で開始される実験的に決定されたｓｐ５６のＮＨ₂末端の間に配置された、仮 定された３２のアミノ酸シグナルペプチドにより開始される５４７アミノ酸のオ ープンリーディングフレームをコードする。「プレ−プロ５ｓｐ５６」タンパク といわれる、仮定のシグナルペプチドを含むマウスｓｐ５６ ｃＤＮＡのコード されたアミノ酸残基配列は、ｃＤＮＡが配列番号１に、それ自身が配列番号２に 示されている。「プロｓｐ５６」といわれる、シグナルペプチドを欠くハロプロ テインは、マウスｓｐ５６タンパクが存在しない、約６，０００ダルトンのＣ末 端ペプチドを含む。 非変性洗浄液中での精巣上体の精子の分離および処理の間、および／またはＺ Ｐ３に結合したときの天然の移動可能な精子では、分裂が起こることか明らかと なった。これらの観察は、本発明の目的のために重要であり、基本的な範囲内で 、プロｓｐ５６のＣ末端テール、およびこの配列をコードする核酸を、それぞれ 、 免疫避妊の使用のため、および相同性研究のための核酸プローブの開発のために 使用することができる。 ｓｐ５６ｃＤＮＡは、実験的に決定されたＮ−末端から、ｃＤＮＡのオープン リーディングフレームの末端まで、６２，０００ダルトンのペプチドをコードす るが、成熟したｓｐ５６は５６ｋＤａタンパクである。コードされたマウスのｓ ｐ５６タンパクは、明らかに膜間スパニングドメインを欠き、これは、このタン パクが膜の辺縁のタンパクであることを確信させる。マウスｓｐ５６（ｓｐ５６ という）は、タンパクレセプターのスーパーファミリーの一つであると決定され 、各繰り返しが１０の事実上変動しないアミノ酸を含む、一連の６０のアミノ酸 鎖長相同的な繰り返しの存在を基に「スシ（Ｓｕｓｈｉ）スーパーファミリー」 と呼ばれる。ｓｐ５６はこのような７つのドメインを有し、その位置は、スシ・ ドメインの開始および末端をシステイン（Ｃ）アミノ酸とともに下線をつけられ た配列で示されている、図１に示されている。ｓｐ５６のｃＤＮＡおよびコード されたアミノ酸配列の図は、図２に記載されている。 スーパーファミリーの構成要素と一貫して、ｓｐ５６もまた、４４のアミノ酸 の鎖をＣ末端の付近に含み、その部分はタンパクに特徴的であり、ｓｐ５６特異 的ドメインとしていわれる。図１に示すように、４４のアミノ酸の鎖（配列番号 ２として示されているマウスｓｐ５６のアミノ酸３８０〜４２３）は、スシ・ド メイン６および７の間に介入する。この「ｓｐ５６種特異的ドメイン」は、既知 のいずれのタンパクとも検出可能な相同性を有さず、システイン残基を含まず、 ジスルフィド結合によって決定される二次元構造の可能性を消失させる。ｓｐ５ ６−特異的ドメインは、高度に荷電したアミノ酸からなり、これは、タンパクの 外部に存在し、Ｂ細胞エピトープなどのようである。コンピューター・シュミレ ーションは、ヘリックスまたはβ−シートの二次元構造を示さなかった。したが って、その独自の配列、ｓｐ５６表面上の可能性のある配置、および二次元構造 の欠如から、ｓｐ５６のこのドメインは、マウス精子、およびより広く、げっ歯 類の精子のｓｐ５６に対して特異的な免疫反応を誘導することを設計されたハプ テンとして非常に優れた候補である。 本発明のｓｐ５６に由来する組成物の治療への使用は、ｓｐ５６の限られた組 織分布性によっても支持される。マウスでのｓｐ５６の発現は、精子生成細胞に 限られて測定され、マウスの心臓、肝臓、腎臓、脳、卵巣、および筋肉には、タ ンパクおよびｍＲＮＡのいずれも観察されなかった。ｓｐ５６タンパクおよびｍ ＲＮＡは、丸い精子細胞において促進されることが決定されているが、ｍＲＮＡ が後続の丸い精子細胞段階で明らかに減成している。しかし、タンパクは、細長 い精子細胞および精子の頭部を覆う原形質膜へ移動される。これに加えて、マウ スｓｐ５６は、マウス卵ＺＰ３タンパクに結合する精子上に発見され、同様にハ ムスターに存在するが、モルモットおよびヒトのような、マウス卵を認識しない 精子には存在しない。したがって、精子の表面にｓｐ５６が存在するかしないか は、精子−卵認識の種特異性により、したがって、本発明の免疫避妊治療の基礎 を提供する。３．組換えマウスｓｐ５６タンパクおよびポリペプチド免疫原の調製 本発明の組換え免疫避妊剤を調製するために、タバコモザイクウイルス（ＴＭ Ｖ）の系統を、その表面にｓｐ５６ポリペプチドのフラグメントを存在させるた めに製造した。マウスは、改変されたウイルスを含む植物を消費する密接な関係 のある他の種と同様に、組換えｓｐ５６免疫原に対する粘膜および系統的な免疫 反応を開発する。 雄のマウスは、約８０ｎｇのｓｐ５６しか含まず、実施例１に記載されたよう な従来の生成では経済的に実施不可能であるので、組換えｓｐ５６およびそのフ ラグメントの調製は、本発明において好ましい。しかし、ｓｐ５６をコードする ｃＤＮＡは、実施例２に記載されたように分離できるので、本発明は、組換えＳ ｐ５６含有ポリペプチド免疫原を製造するために、ｓｐ５６の発現または選択さ れたその一部を記述する。 マウスｓｐ５６タンパクをコードするｃＤＮＡの特定の領域が、組換え分子を 調製するために選択される。好ましい組換えタンパクは、５７９アミノ酸のプレ −プロｓｐ５６および５４７アミノ酸のプロｓｐ５６を含む。他の好ましいｓｐ ５６ＤＮＡ領域は、７つのスシ・ドメインの外部ループ領域をコードするヌクレ オチドを含む。これらのドメインは、１０個の事実上不変のアミノ酸を含む約６ ０のアミノ酸の鎖である。図３は、典型的なスシ・ドメインを示すと共に、１０ の事実上不変のアミノ酸を示している。ジスルフィド結合が不変パターンＣ１〜 Ｃ３、およびＣ２〜Ｃ４中に形成され、その中に疎水性アミノ酸の鎖が位置する 大小両方の内部連結された輪の付いたループ構造を形成する。約２５〜３０の、 ほとんどが荷電されたアミノ酸の鎖からなる、「大ルー」は、Ｃ１およびＣ２の 間でスーパーファミリー内ではっきりと分かれ、その荷電の性質のために、スー パーファミリーの構成要素のタンパクレセプターの機能に一般に関与している(I chinoseら、J.Bio.Chem、２６５：１３４１１〜１３４１６頁(１９９０年))。ｓ ｐ５６は、７つのこのようなドメインを有し、その各々は、それぞれ「ｌｌ」お よび「ｓｌ」といわれる大小のループを形成する。７つのスシ・ドメインのこれ らの領域に由来するポリペプチドは、「Ｓｈ」といわれ、さらに個々のドメイン １〜７（例えばＳｈ１〜Ｓｈ７）によって示される。これに加えて、スシ・ドメ イン６は、大きなループ内に追加のシステイン残基を有することによって特徴付 けられる。このように、大きなループはさらにシステイン残基によって第一のル ープ（Ｓｈ６ｆ１）および中間のループ（Ｓｈ６ｍ１）に分離され、それぞれの 配列は表１に示されている。 他の追加の好ましいｓｐ５６ｃＤＮＡ領域は、独自のｓｐ５６種特異性配列( ｓｓｓという)を含み、実施例１に記載したようにスシ・ドメイン６および７の 間に位置する。この保存されていない独自の領域のヌクレオチドの位置は、配列 番号１に示したように位置１３１３で始まり、位置１４４４で終わる。相当する アミノ酸残基は、図１に示されているように、配列番号１の３８０〜４２３に位 置される。このｓｐ５６の種特異的領域内で、好ましいポリペプチドの数々は、 本発明の免疫避妊剤として使用することを企図されている。これらのポリペプチ ドは、「ｓｓｓ」といわれ、さらにポリペプチドの数（例えば、ｓｓｓ１）によ って示される。 ｓｐ５６タンパクの全てまたは種々の部分をコードする選択されたヌクレオチ ドの位置に相当するｃＤＮＡ領域は、表１に示され、相当するアミノ酸残基配列 位置（ＡＡ）もまた示される。ｃＤＮＡフラグメントのヌクレオチドの位置およ び相当するアミノ酸残基の位置は、それぞれ配列番号１および２に由来し、ここ において、配列番号２のアミノ酸残基配列もまた配列番号１のヌクレオチド配列 とともに示されている。配列番号１に示されているコードされた核酸配列との混 乱を防ぐために、アミノ酸は、配列番号１よりもむしろ配列番号２から定義され る。位置は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）のコロンの後に示される。例えば、 ｃＤＮＡ ｓｓｓ１は、配列番号１の１３１３〜１４４４のヌクレオチド配列を 持ち、配列番号１：(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １：)１３１３−１４４４と示される。 したがって、コードされたポリペプチドは、配列番号２：３８０−４２３のアミ ノ酸残基配列を有する。本発明の免疫避妊剤の設計されたｃＤＮＡのポリペプチ ド対は、ｃＤＮＡ設計に「ｐｐ」を加えて明細書に示す。 表１ 設計 ｃＤＮＡの位置 ＡＡの位置 プレ−プロｓｐ５６ １：８０−１８１６ ２：−３２から５４７ プロｓｐ５６ １：１７６−１８１６ ２：１−５４７ 成熟型ｓｐ５６ １：１７６−１６０６ ２：１−４７７ Ｓｈ１ １：１７６−３５２ ２：１−５９ Ｓｈ１ｌｌ １：１８２−２７１ ２：３−３２ Ｓｈ１ｓｌ １：２７５−３１３ ２：３４−４６ Ｓｈ２ １：３６５−５３８ ２：６４−１２１ Ｓｈ２ｌｌ １：３６８−４４５ ２：６５−９０ Ｓｈ２ｓｌ １：４４９−４８７ ２：９２−１９４ Ｓｈ３ １：５５１−７３３ ２：１２６−１８６ Ｓｈ３ｌｌ １：５５４−６３７ ２：１２７−１５４ Ｓｈ３ｓｌ １：６４１−６７９ ２：１５６−１６８ Ｓｈ４ １：７４６−９１３ ２：１９１−２４６ Ｓｈ４ｌｌ １：７４９−８２９ ２：１９２−２１８ Ｓｈ４ｓｌ １：８３３−８７１ ２：２２０−２３２ Ｓｈ５ １：９２６−１１１４ ２：２５１−３１３ Ｓｈ５ｌｌ １：９２９−１０２７ ２：２５２−２８４ Ｓｈ５ｓｌ １：１０３１−１０７５ ２：２８６−３００ Ｓｈ６ １：１１２４−１３１２ ２：３１７−３７９ Ｓｈ６ｌｌ １：１１３０−１２２５ ２：３１９−３５０ Ｓｈ６ｓｌ １：１２２９−１２７０ ２：３５２−３６５ Ｓｈ６ｆｌｌ １：１１３０−１１８９ ２：３１９−３３８ Ｓｈ６ｍｌ２ １：１１９３−１１２５ ２：３４０−３５０ Ｓｈ７ １：１４４５−１６０６ ２：４２４−４７７ Ｓｈ７ｌｌ １：１４４８−１５２５ ２：４２５−４５０ Ｓｈ７ｓｌ １：１５２９−１５６７ ２：４５２−４６４ ｓｓｓ１ １：１３１３−１４４４ ２：３８０−４２３ ｓｓｓ２ １：１３２２−１３６９ ２：３８３−３９８ ｓｓｓ３ １：１３６１−１４０８ ２：３９６−４１１ ｓｓｓ４ １：１３９１−１４３８ ２：４０６−４２１ Ｓｈ６ｆｌ１およびＳｈ６ｍｌ２は、スシ・ドメイン６の大きなループに由来 するシステイン結合によって分離される、それそれ、第一および中間のループで ある。 表１にその概要が記載されたこれらの領域の選択は、避妊のブロッキングに基 づくが抗体力価には基づかない効果的な免疫避妊剤である、組換えｓｐ５６ポリ ペプチド免疫原の同定を容易にする。Ｂ細胞エピトープを含むことができるポリ ペプチドにとって、選択は好ましく、それは、更に、免疫化の中断の後に、避妊 の効果の潜在的な反転を可能にする。従って、ある態様においては、可逆性は、 本発明の免疫避妊剤分子の望ましい特徴である。 哺乳類において避妊を引き起こすための免疫原としての、表１に挙げられた完 全プロｓｐ５６タンパクを調製するために、プレ−プロｓｐ５６タンパクをコー ドするｃＤＮＡ配列が、組織培養での哺乳類細胞中における発現のための発現ベ クターに挿入された。簡単に述べると、ブッタバインダー（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅ ｒ）等によってサイエンス、２６９巻、８６−８９頁（１９９５年）に記載され ているようなクローン７．１ ｓｐ５６ ｃＤＮＡからの２０４３塩基対Ｅｃｏ ＲＩ／ＸｈｏＩフラグメント（当該フラダメントは、表１に挙げられたプレ−プ ロｓｐ５６ ｃＤＮＡをコードする配列を含んでいる）が、哺乳類発現ベクター ｐｃＤＮＡ３［インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州 サンディエゴ］に挿入され、ｓｐ５６ ｃＤＮＡクローンの直接的な挿入を可能 にするために、同じ制限酵素で線状化され、それにより、ｐｃＤＮＡ３−ｓｐ５ ６発現ベクターが形成された。 発現ベクター構築物は、次の状況を提供した： １）ヒトのサイトメガロウイ ルスの直近の初期遺伝子から上流のプロモーター配列による、哺乳類細胞中にお けるｓｐ５６ ｃＤＮＡの高レベルでの本質的な転写； ２）更なるポリアデニ ル化シグナルおよび、ＲＮＡの安定性を高めるウシ成長ホルモン遺伝子からの転 写終止配列； ３）ｓｐ５６シグナル・ペプチドの初めにコードされたＡＴＧ( 即ち、配列番号１に示されているシグナル配列の８１〜８３に対応する塩基)か らの翻訳の開始；および ４）Ｇ４１８耐性安定細胞株の選択のためのネオマイ シン耐性遺伝子。 コンピテントｒｅｃＡ（−）Ｅ．ｃｏｌｉ［ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ストラタジー ン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラ・ホヤ］が、ｐｃＤＮＡ３− ｓｐ５６で形質転換され、増幅されたプラスミドは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ） （カリフォルニア州チャットワース）プラスミド精製キットを用いて細菌から精 製された。精製されたプラスミドＤＮＡは、多陽イオン性脂質トランスフェクシ ョンにより、ＣＨＯおよびＣＯＳ細胞に導入された［フェルグナー（Ｆｅｌｇｎ ｅｒ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８４巻、７４１ ３−７４１７頁（１９８７年）］。Ｍａｂ ７Ｃ５を用い、銀増幅免疫金染色［ チェング（Ｃｈｅｎｇ）等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２５巻、８６７−８ ７８頁（１９９４年）］が、ｓｐ５６挿入物（インサート）で形質転換された、 Ｇ４１８耐性のクローニングされたＣＯＳ細胞中において、細胞内ｓｐ５６を検 出した。挿入物を含まないプラスミドｐｃＤＮＡ３で形質転換されたプラスミド 対照細胞は、ｓｐ５６の発現を示さなかった。予期されたように、発現されたｓ ｐ５６（シグナル・ペプチドを欠いている）が、これらの細胞から分泌され、か つ、組織培養培地のウェスターン・ブロットにより検出された。発現さ れ分泌されたタンパクは、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで６２ｋＤａの分子量 の位置に移動した。これは、これらの細胞では、Ｃ末端テールの翻訳後の除去［ ブックバインダー（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻、８ ６−８９頁（１９９５年）］が生じなかったことを示している。 経口での免疫化のための完全プロｓｐ５６ポリペプチドを発現させるための他 の方法は、昆虫細胞中における組換えバキュロウイルスからの発現を包含する( 但しこれに限定されない)。表１に挙げられた残りのｓｐ５６から誘導されたポ リペプチド同様、シグナル・ペプチド配列を保持する組換えプレ−プロｓｐ５６ とシグナル・ペプチド配列とＣ末端テールの両者を欠く成熟ｓｐ５６の調製は、 それぞれのｃＤＮＡ配列の適切な発現ベクターへのクローニングにより、同様に 成し遂げられる。発現ベクターおよびその挿入のための手順の選択は、当業者に は周知である。 一旦分泌されると、組換えタンパク（培地中に放出されているプロｓｐ５６ま たは成熟ｓｐ５６）は、抗ｓｐ５６モノクローナル抗体７Ｃ５、５Ｆ１２、１２ Ｄ２、７Ｈ１２または４Ｂ２で免疫的に精製される［チェング（Ｃｈｅｎｇ）等 、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２５巻、８６７−８７８頁（１９９４年）］か 、あるいは、最近単離された抗プロＳＰ５６モノクローナル抗体１０ｂ６によっ て、免疫的に精製される。精製されたタンパクは、その後、経口的に免疫化され る哺乳類の飼料に混合される。 下記するように、別々の試みにおいて、表１に挙げられた組換えｓｐ５６ポリ ペプチド免疫原（ハプテンとも呼ばれる）が、タバコ・モザイク・ウイルス（Ｔ ＭＶ）コート・タンパクであって、そのＴＭＶのＣ末端テール上に設計された選 択されたｓｐ５６特異的ドメインを有するタンパクで構成されるキメラ・ペプチ ド分子の一部として調製される。ＴＭＶの複製に基づいて、集められたウイルス 粒子は、その後、植物材料中で消費されるときに免疫原として作用するこの選択 されたｓｐ５６組換えフラグメントの多くの複製物を提供する。 同定の目的のために、ｓｐ５６ポリペプチドに固着（アンカー）された組換え ＴＭＶは、ＴＭＶの後の特定のポリペプチドの名称によって、例えば、ＴＭＶ− ｓｓｓ１ｐｐ（ここで、ｓｓｓ１は、ｃＤＮＡ配列の名称を示し、ｐｐは、コー ドされたポリペプチドを示す）と呼称される。 図４は、組換えＴＭＶ−ｓｐ５６ポリペプチド融合体を調製するために使用さ れた方法の概要を示す。ＴＭＶのＤＮＡ配列を両側面に配置することを含むＴＭ Ｖ種Ｕ１（普通）から、ＴＭＶコート・タンパク（ｃｐ）の遺伝子が、制限酵素 ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩを用いてブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プ ラスミド・ベクター［ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）］にクローニン グされた。ＴＭＶ ｃｐの配列を含むＴＭＶ遺伝子が、ホルト（Ｈｏｌｔ）等、 Ｖｉｒｏｌ．、１８１巻、１０９頁（１９９１年）（この開示事項は、参照によ りここに組み入れられる）に記載されているようにして、プラスミドｐＵ３／１ ２−４から誘導された。第４図に示されているように、プラスミド中において、 これらの制限部位の両側には、バクテリオファージＴ７およびＴ３・ＲＮＡポリ メラーゼ・プロモーター配列が配置されている。 選択されたｓｐ５６ｃＤＮＡ−ＴＭＶキメラの構築は、ここに記載されている 。当業者は、一つの特定のＴＭＶ−ｓｐ５６キメラを製造するために記載された 教示が、表１に挙げられたｓｐ５６ｃＤＮＡ分子すべてに適用可能であり且つ容 易に適合させられることを、理解するであろう。従って、ｓｓｓ１ ｃＤＮＡ配 列に基づくＴＭＶ−ｓｐ５６が固定されたポリペプチドを調製するために、ｓｓ ｓ１ ｃＤＮＡ（配列番号１：１３１３−１４４４）が、ＴＭＶコート・タンパ ク遺伝子に挿入され、キメラ遺伝子を生じ、それがその後、完全ＴＭＶ遺伝子を 含む別個のベクターに挿入される。 これを成し遂げるために、初めに、ｓｓｓ−１（ｓｓｓ１−ａおよびｓｓｓ１ −ｂ）をコードする塩基と共に、ＴＭＶコート・タンパク遺伝子の３’末端での 塩基のストレッチが合成され（ｃｐ−ａおよびｃｐ−ｂ）、二つのキメラＰＣＲ プライマー（ｓｓｓ１−ａ／ｃｐ−ａおよびｓｓｓ１−ｂ／ｃｐ−ｂ）が生ずる 。その手順は、類似のＺＰ３発現分子の調製のために記載されている手順［フィ ッチェン（Ｆｉｔｃｈｅｎ）等、Ｖａｃｃｉｎｅ、１３巻、１０５１−１０５７ 頁（１９９５年）、この開示事項は、参照によりここに組み入れられる］と同じ である。ｓｓｓ１−ａヌクレオチド配列は、配列番号１の１３２２−１３６９の 位置のトップ鎖ヌクレオチド配列に相当する。ｓｓｓ１−ｂヌクレオチド配列は 、 ｓｓｓ１−ａの配列の相補的配列である。 ５’から３’の方向に書いた場合に、ｓｓｓ１−ａ／ｃｐ−ａプライマーおよ びｓｓｓ１−ｂ／ｃｐ−ｂプライマーのヌクレオチド配列は、それぞれ、５’Ａ ＣＣＡＡＴＧＴＧＡＣＧＡＡＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＣＡＴＧ ＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＧＧ ＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＧＡＧＧ ３’（配列番号８）および５’ＧＧＴＣＴＴ ＧＴＴＣＧＴＣＡＣＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＡＡＧＴ ＧＡＡＴＡＡＡＧＧＣＴＡＡＴＣＴＡＴＴＴＴＧＴＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＣＴＧ ＣＴＴＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡＣ３’（配列番号９）である。各プ ライマーの下線部分は、ＴＭＶ配列を示し、一方、下線がない部分は、相補的ｓ ｓｓ１ヌクレオチド配列を示す。 プライマーｓｓｓ１−ｂ／ｃｐ−ｂと、ヌクレオチド配列５’ＴＡＡＴＡＣＧ ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ３’（配列番号１０）を有するＴ７プロモー ター配列（Ｔ７プライマー）に特異的にアニールするプライマーは、ＴＭＶコー ト・タンパク配列を含むプラスミドと共に使用され、ｓｓｓ１ ｃＤＮＡに連続 するｃｐ領域の「左腕」を増幅させる。プライマーｓｓｓ１−ａ／ｃｐ−ａと、 ヌクレオチド配列５’ＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ３’（配列番 号１１）を有するＴ３プロモーター配列（Ｔ３プライマー）に特異的にアニール するプライマーは、ＴＭＶコート・タンパク・プラスミドと共に使用され、ｓｓ ｓに連続するｃｐ領域の「右腕」を増幅させる。領域ｃｐ−ａおよびｃｐ−ｂは 、ＴＭＶ ＣＰ領域に連続する部分をコードするが、反対側の鎖ではない。 上記領域を増幅するために、フィッチェン（Ｆｉｔｃｈｅｎ）等、Ｖａｃｃｉ ｎｅ 、１３巻、１０５１−１０５７頁（１９９５年）に記載されたようにして、 ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）が行われる。ＰＣＲのために使用された サイクル・パラメータは、第一ラウンドでは、９５℃に３０秒間／４７℃に６０ 秒間／７２℃に６０秒間を２５回であり、その後の第二ラウンドは、７２℃にて ６００秒間のインキュベーションであった。 それぞれＴＭＶの左腕または右腕と共にｓｓｓ１の相補鎖を含む、結果として 得られるＰＣＲ産物は、混合され、変性され、その後再びアニールされ、第５図 にその概要を示すように、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長された、再アニール された生成物をもたらす。この反応の生成物は、ＴＭＶコート・タンパクをコー ドする上流配列、それに続く、アミノ酸残基３８０−４２３（配列番号２）のｓ ｐ５６−特異的ドメインをコードするｓｓｓ１ ｃＤＮＡ配列、それに続く終始 コドンをコードする下流配列、およびＴＭＶコート・タンパク遺伝子の下流の配 列の残部から構成されている（図５を参照されたい）。 ＴＭＶ−ｓｓｓ１ｐｐと名付けられた、結果として得られるｓｓｓ１ ｃＤＮ Ａ産物を含む遺伝子をコードするＴＭＶコート・タンパクは、その後、上記の如 く、プライマーＴ７およびＴ３を用い、ＰＣＲによって再び増幅される。増幅さ れた物質は、その後、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで制限的に消化される。制限的に 消化されたＰＣＲフラグメントは、その後、ｐＵ３／１２−４の誘導体中におい て、ＴＭＶ ｃＤＮＡフラグメントの対応する制限部位にクローニングされ、Ｔ ＭＶの修飾された全長ｃＤＮＡクローンを生ずる。 結果として得られるキメラ組換えプラスミドは、従って、修飾されたＴＭＶゲ ノム（これには、ｓｓｓ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡが挿入されている ）を含む。キメラ・プラスミドは、その後、イン・ビトロでの転写アッセイでの 使用のために線状化され、それは、フィッチエン（Ｆｉｔｃｈｅｎ）等、Ｖａｃ ｃｉｎｅ 、１３巻、１０５１−１０５７頁（１９９５年）に記載されているよう に行われる。簡単に述べると、修飾されたコート・タンパク遺伝子を含む全長Ｔ ＭＶゲノムの合成に触媒作用を及ぼすために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが使用 される。一般的には、２μｇの線状プラスミドが、１０−２０葉に接種するのに 十分な物質を提供する。 ＴＭＶ−ｓｓｓ１ ＲＮＡ／ポリペプチドの転写の後に、感染性の産物が、ホ ウレン草の植物上にこすりつけられる。上記転写産物は、２０ｍＭリン酸ナトリ ウム（ｐＨ７．２）で１／１０に稀釈され、１００ｍｌが、植物に付与される。 大規模接種のために、最初の感染に由来する感染された植物の粗均質物が、転写 産物の換りに用いられる。このタイプの感染は、図５に示されているように、キ メラ・コート・タンパク分子の一部として、それらの表面上にｓｐ５６特異的ｓ ｓｓ１ドメインを提供するウイルス粒子をもたらす。実際は、大量の免疫避妊ハ プテンの摂取を考慮に入れて、この方法により、１ウイルス粒子あたり数千にも のぼるハプテンが提供される。ウイルスそれ自体は感染性であり、それゆえ、成 長するのに経済的であり、且つ、抗原の供給を事実上制限されずに行うのに有用 である。ウイルスが感染した植物は、ＵＳＤＡガイドラインに従って、ザ・スク リップス・リサーチ・インスティチュート（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）にて栽培されている。ＴＭＶウイルス粒子は、 使用の前に、感染された植物材料の加熱および／またはオートクレーブ処理によ り、非感染性に変えられている。 表１に挙げられた残りのｓｐ５６ポリペプチドの発現のための、ＴＭＶ−ｓｐ ５６キメラ遺伝子の構築は、キメラ・プライマー対が特定のｓｐ５６ ｃＤＮＡ ヌクレオチド配列およびその相補配列で再設計されることを除いて、ｃｐ ａお よびｂプライマー配列を用い、上記のように行われる。 植物中での製造のための本発明の組換えｓｐ５６タンパクを製造するための他 のそれに代る組換えの試みは、ｐＲＴＬ２ベクターと呼称されるシャトル・ベク ターの使用と、その後の植物発現ベクターｐＧＡ４８２への挿入のためのｓｐ５ ６含有フラグメントの単離に依存するものである。シャトル・ベクターおよび発 現ベクター系のための引用文献およびそれについての議論は、第５章に記載され ている。 シャトル・ベクターｐＲＴＬ２は、発現制御配列と、コレラ毒素−ｓｐ５６融 合タンパクの発現のために、特定のｓｐ５６をコードするｃＤＮＡフラグメント に作用するように連結されたコレラ毒素αまたはβ鎖のヌクレオチド領域とを、 ＨｉｎｄＩＩＩで分離可能な制限フラグメント内において含むように設計された 。 下記するｐＲＴＬベクター中において、コレラ毒素α鎖およびβ鎖をコードす る遺伝子は、それらが作用するような連結をするように、ｓｐ５６ ｃＤＮＡ配 列を用いてシャトル・ベクターに直接的に連結されるために、別々に設計されて おり、それは、コレラ毒素含有融合タンパクをコードする構築物をもたらす。コ レラ毒素αおよびβ融合タンパクをコードするカセットの、適切な植物発現ベク ターへの別々のサブクローニングの際には、ベクターは、その後、二つの融合タ ンパクをコードする発現ベクター両者を含むＦ１植物を作るための、その後の交 配用の別々の植物を形質転換するために使用される。 二つのコレラ毒素α鎖は、発現された融合タンパクの細胞への導入を容易にし 、その中での免疫応答を刺激するために、一つのβ鎖遺伝子と共に設計されてい る。修飾されていないコレラα鎖は、アジュバントおよびキャリアー・タンパク として作用する。β鎖との複合化によって仲介されて、一旦、受容（レシピエン ト）上皮細胞に吸収されると、コレラα鎖のアジュバントの側面が、細胞の基底 外側の表面上における抗原の提供を刺激する。α鎖のヌクレオチド配列は、下記 するように修飾されており、それは、７位におけるアルギニンからリジンへのア ミノ酸の置換をもたらし、それは、アジュバント部分がアミノ酸置換によっても たらされたときに、キャリアー・タンパクとしてのみ働くα鎖を与える。コレラ β鎖は、上皮細胞の先端の表面上におけるβ鎖のＧＭ１ガングリオシドへの結合 を仲介するキャリアー・タンパクとしてのみ働く。いずれかの発現されたα鎖の 吸収が、発現されたコレラ毒素β鎖タンパクとの複合化によって達成される。 α鎖およびβ鎖構築物両者は、本発明のｓｐ５６タンパクを含む融合タンパク の発現のために設計されている。免疫避妊融合タンパクの製造のために、αまた はβ鎖、あるいはその両者が、融合タンパクとして使用される。 ｐＲＴＬ２ベクターは、６〜９図において同様にラベルされた、植物発現ベク ター中でのｓｐ５６の発現を仲介するためのシャトルされた発現要素として有用 である、次の要素を有している：カリフラワー・モザイク・ウイルスの３５Ｓ転 写遺伝子に由来する３５プロモーター（３５Ｓ Ｐｒ）；翻訳エンハンサーとし て役立つタバコ・エッチ・ウイルス非翻訳リーダー配列（ＴＥＶ Ｌ）；および 導入遺伝子転写物の直接のポリアデニル化のためのカリフラワー・モザイク・ウ イルスの３５Ｓ転写遺伝子の３’末端の３５Ｓポリアデニル化配列（ｐＡ−Ｓ） 。これらの要素は、シングル・カセット中に設計されており、それは、植物発現 ベクターへのその後のサブクローニングのための、制限部位消化フラグメントの 単離を可能にする。 シャトル・ベクターｐＲＴＬＣＴＡ−ｓｐ５６のプラスミド地図は、図６に示 されており、それにおいては、ＨｉｎｄＩＩＩセグメントが、発現制御配列を含 み、且つコレラ毒素α鎖（ＣＴＯＸ Ａとしてラベルされている）内に機能する ように連結されているｓｐ５６をコードするＤＮＡフラグメント（「ｓｓｓ」と ラベルされている）の位置を実例をもって示していることが、示されている。コ レラ毒素α鎖−ｓｐ５６融合構築物を生ずるために、表１から、コレラ毒素α鎖 遺伝子中に存在するＣｌａＩ制限部位への連結を考慮に入れて、ＣｌａＩ制限部 位を含むｓｐ５６ ｃＤＮＡ配列が選択され、且つ、合成またはＰＣＲにより製 造される。制限部位解析により、一旦、ｓｐ５６をコードする配列の挿入が確か められたら、融合タンパクをコードするカセットが、ＨｉｎｄＩＩＩ消化により 、同様に消化されたｐＧＡ４８２植物発現ベクターへのその後の連結のために、 単離される。ｓｐ５６挿入物のない、コレラ毒素α鎖融合タンパク・カセットの ヌクレオチド配列は、１９５６塩基を有して配列番号１２に挙げられている。コ レラ毒素遺伝子の７位においてアルギニンの替わりにリジンをコードする修飾さ れたコレラ毒素α鎖は、７８７位と７８８位に、配列番号１２に示されているよ うなシトシンおよびグアニンの替わりに、二つのアデニン・ヌクレオチドを含む 。修飾されたα鎖を有する、ベクターでラベルされたｐＲＴＬＣＴＡｍ−ｓｐ５ ６は、図７に概略的に示されている。同図においては、他のすべてのベクター要 素は、図６のために記載されたも要素と同様である。 前記したものと同じベクター要素を含みもするが、コレラ毒素β鎖をコードす るヌクレオチド配列を有するコレラβ鎖融合タンパク構築物は、図８に示されて いる。ＢｇｌＩＩに特異的な末端を含むｓｐ５６をコードする配列が、同図にお いて「ｓｓｓ」として示されている、コレラ毒素β鎖内のＢｇｌＩＩ部位に挿入 される。ｐ５６挿入物を欠く、コレラ毒素β鎖ＨｉｎｄＩＩＩ融合カセットのヌ クレオチド配列は、配列番号１３に挙げられている。 より大きなｓｐ５６ポリペプチドおよび融合タンパクを発現するために、図９ に概略的に示されているベクターｐＣＴＡ０２−１ｓｐ５６も構築された。Ｃｌ ａＩ制限部位以外のコレラ毒素α鎖中のヌクレオチドが除去され、それにより、 同様に調製されたｓｐ５６挿入物のＫｐｎＩ／ＣｌａＩ消化ベクターへの直接的 な連結を可能にする。他のベクターを用いるときには、融合タンパク発現カセッ トは、植物発現ベタターへのその発現のためのサブクローニングのために、Ｈｉ ｎｄＩＩＩでの消化によって単離される。 融合構築物を調製するために使用された、選択されたシャトル・ベクターに応 じて、コレラ鎖をコードする遺伝子／ｓｐ５６コード領域と共に、またはコレラ 毒素α鎖を欠くもの（ｐＣＴＡ０２−１ｓｐ５６）と共に、制御要素を含むＨｉ ｎｄＩＩＩ単離フラグメントが、その後、別々に、同様に消化されたｐＧＡ４８ ２へ挿入される［アン（Ａｎ）等、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ 、Ａ３巻、１−１９頁（１９８８年）］。組換え植物ベク ターは、その後、タバコやアルファルファ等の植物に感染させるために使用され る。好ましい植物ウイルスは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ ）株のＬＢＡ４４０４である。４．合成ムリン（ネズミ）ｓｐ５６ポリペプチドおよびキメラｓｐ５６ポリペプ チド免疫原の調製 本発明の免疫避妊分子を調製するための、替わりの、しかし同様に有効な方法 においては、それを受け取る患者に注入されたときに、選択されたキャリアー分 子と協力して免疫応答をもたらすためのハプテンとしての使用のために、ｓｐ５ ６由来ポリペプチドが合成される。 この試みの一例として、表１に挙げられているｓｓｓ３ ｃＤＮＡによってコ ードされる、下線を引いた一文字法アミノ酸残基配列ＣＮＩＳＥＴＮＶＴＮＫＴ ＹＬＦＧＨ （配列番号１４）を有する、ｓｐ５６特異的配列の１６アミノ酸ペプ チドが、マウスを経口的に免疫化するために、ハプテンとして使用された。ペプ チドが、ザ・スクリップス・リサーチ・インスティチュート・コア・ファシリテ ィ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｒ ｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）によって合成され、それは、Ｎ−末端に更なるシステイ ンを含んでいた。ペプチドの下線部分は、配列番号２に挙げられたｓｐ５６タン パクの、アミノ酸残基３９６−４１１位に相当する。上記ｓｐ５６ペプチドの逆 のアミノ酸残基配列ＣＨＧＦＬＹＴＫＮＴＶＮＴＥＳＩＮ（配列番号１５）を有 するペプチドが、免疫応答の特異性を評価するために、対照として使用された。 このハプテン（１．５ｍｇ）が、露出されたＮ−エチルマレイミドを介して、 １ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ修飾コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴ−Ｂ、１サ ブユニットあたり最大１０ＳＭＣＣ残基）に架橋された。結果として得られた免 疫原は、ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐと命名された。コレラ毒素は、経口での耐性( トレランス)なしに強い粘膜の免疫応答を発現させるために他のハプテンを提供 するためにうまく使用されているので、アジュバントまたはキャリアーとして選 択された［ブラック（Ｂｌａｃｋ）等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、５５ 巻、１１１６−１１２０頁（１９８７年）；マックギー（ＭｃＧｈｅｅ）等、Ｒ ｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖｅｌ． 、６巻、３６９−３７９頁（１９９４ 年）］。ジフテリア毒素を含む替わりの試薬も、キャリアーとして有用である。 ペプチド・ハプテンを含むＣＴ−Ｂ（ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ）は、サイズ排 除クロマトグラフィーによって精製され、そのアリコートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解 析により、修飾が確かめられた。結果として得られた免疫原は、その後、実施例 ５に記載のように、マウスを免疫するために使用された。 表１に挙げられた他のｓｐ５６ポリペプチドは、経口摂取での免疫避妊の誘導 での使用のための免疫原として、同様に調製される。当業者は、また、キャリア ー分子と協力してまたは協力することなしに、合成ポリペプチドが使用されるこ と、およびキャリアー分子は、コレラ毒素に限定されないことをも理解する。５．ｓｐ５６免疫原によるマウスの免疫化 免疫避妊剤としての役割を果たすためのｓｐ５６組成物の能力は、先ず、実施 例１に記載されているように調製された、精製され、変性され、還元されたｓｐ ５６を用いて評価された。試験のために、２５日令の一匹の雄のマウスが、精製 され、変性され、還元されたｓｐ５６で、腹腔内免疫された（１日目に完全フロ インド・アジュバントを５００ｎｇ、６０日目に不完全フロインド・アジュバン トを５００ｎｇ）。完全および不完全フロインド・アジュバントの偽の注入が、 他の雄のマウスに対して行われた。 ｓｐ５６で免疫された雄からの睾丸の切片が、ヤギ抗マウスＩｇ接合ホースラ ディッシュ・ペルオキシダーゼを用いて、ジアミノベンヂジンで発色させ、ヘマ トキシリン／エオシンで対比染色されて、免疫組織化学的に解析された。同じ方 法で免疫組織化学的に染色された、偽薬で免疫された雄からの睾丸の切片と比べ たときに、ｓｐ５６で免疫された雄は、精子細胞および精子の除去が引き伸ばさ れていた。閉鎖性細胞が、マウスＩｇに陽性に染色されたので、観察された精子 形成の後期の除去は、大部分は免疫攻撃によるものらしかった。免疫された雄は 、４匹の雌のマウスと交尾し且つ挿入したが、子孫は観察されなかった。偽薬で 免疫された雄は、５腹の子を作った。この結果は、マウスにおいて、ｓｐ５６へ の免疫応答が、雄性不妊をもたらすことを示している。 免疫避妊剤として作用する他のｓｐ５６に由来するポリペプチドを評価するた めに、実施例４で調製されたハプテン修飾ＣＴ−Ｂ（ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ、 実験用、マウス番号５−８）またはＣＴ−Ｂ単独（ＣＴ−Ｂ、対照、マウス番号 １−４）が、２８日令の処女雌マウス（ＨＳＤ：ＩＣＲ系、ハーラン・スプラグ −ドーリー）に、１００μｌの生理食塩水中でおよそ２０μｇのタンパク／週／ マウスを使用して、週ごとの挿管で投与された。３回の週ごとの挿管の後、眼窩 内の出血により、血清が得られ、粘膜抽出物は、均質化された大便のペレットか ら得られた。稀釈された血清（５０μｌ、１／１０、トリス緩衝生理食塩液中） および粘膜抽出物（トリス緩衝生理食塩液０．５ｍｌ中で均質化された一つの大 便のペレットから５０μｌ）が、精製され凍結乾燥されたｓｐ５６（５ｎｇ）を 含む９６ウェルのプレート中でインキュベートされ、以前に記載された［チェン グ（Ｃｈｅｎｇ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１２５巻、８６７−８７８頁 （１９９４年）］ように行われた修飾ＥＬＩＳＡにおいて、抗原認識が解析され た。結合した血清および粘膜Ｉｇを検出するために、ヤギ抗マウスＩｇＧの銀増 幅コロイド状金接合体（シグマ、ミズーリ州セントルイス）とヤギ抗マウスＩｇ Ａ（シグマ）がそれぞれ使用された。 ｓｐ５６由来ハプテン（ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ、実験用）で免疫されたマウ スは、表２に示されている精製されたｓｐ５６を認識する抗体を含んでいた。血 清ＩｇＧと粘膜ＩｇＡの両者について、結果は同じであった。各免疫原について 、陽性（＋）または陰性（−）として提供されたものそれ自体、結果のみ、が示 されている。 表２ マウス番号 免疫原 結果 １ ＣＴ−Ｂ − ２ ＣＴ−Ｂ − ３ ＣＴ−Ｂ − ４ ＣＴ−Ｂ − ５ ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ ＋ ６ ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ ＋ ７ ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ ＋ ８ ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ ＋ 表２に示されるように、４匹のＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐで免疫されたマウスす べてが、ｓｐ５６に結合したＩｇＡとＩｇＧの両者を含んでいたが、一方、４匹 のＣＴ−Ｂで免疫されたマウスのいずれもが、タンパクを検出可能に認識する抗 体を含んでいなかった。 免疫されたマウスの抗血清を特徴付けるために、免疫組織化学およびウェスタ ーン・ブロット解析の両者が、マウスの精子および可溶化されたマウス精子タン パクにつき、それぞれ行われた。 免疫されたマウスからの血清は、３回の週ごとの経口免疫化の後、眼窩内の出 血によって得られた。免疫組織化学的解析のために、稀釈された血清（トリス緩 衝生理食塩液中で１／１０）が、ガラススライド上において、固定されたアクロ ソームが完全なマウス精子（免疫されなかった雄からのもの）のＩｇＧの認識に ついて、以前に記載された［チェング（Ｃｈｅｎｇ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ． 、１２５巻、８６７−８７８頁（１９９４年）；ブックバインダー（Ｂｏｏ ｋｂｉｎｄｅｒ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻、８６−８９頁（１９９５年） ］ように、コロイド状金接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（シグマ）を用い、銀増幅免疫 金染色により、試験された。 ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐで免疫されたマウス番号５からのＩｇＧは、もっぱら 、免疫されなかった精子のアクロソームを覆っている原形質膜の領域（ｓｐ５６ が位置している）に結合した。マウス番号６−８からの血清ＩｇＧは、免疫組織 化学染色で同じパターンを与えた。ＣＴ−Ｂ単独で免疫されたマウス番号１から のＩｇＧの結合は、検出されなかった。マウス番号２−４からの血清ＩｇＧは、 免疫染色で同じパターンを与えた。 マウス番号１および５（それぞれ、対照ＣＴ−ＢおよびＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐ ｐにて免疫されたもの）の血清ＩｇＧが、ウエスタン・ブロットにより、抗原特 異性について解析された。このアッセイのために、免疫されなかったマウスの精 子からの総トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）可溶性タンパクが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに 供せられ、インモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）膜に移され、且つ、ストリップ （ストリップあたりおよそ５０５ｇの精子タンパク含有）が、前記[チェング（ Ｃｈｅｎｇ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１２５巻、８６７〜８７８頁（１ ９９４年）]のようにして、免疫性血清でプローブされた。抗体でプローブされ た膜が、前記のように、銀増幅免疫金染色で発色された。ブロットをプローブす るために使用された基本的な抗体は、マウス番号１（１／１００希釈）からまた はマウス番号５（１／１０希釈）からの抗体、または抗ｓｐ５６モノクローナル 抗体７Ｈ１２（５０μｇ／ｍｌ；陽性の対照）であった。 総界面活性剤可溶性精子タンパクのウェスターン・ブロット解析は、ｓｐ５６ が、抗ｓｓｓ抗体によって認識される唯一のタンパクであることを示した。ＣＴ −Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐで免疫されたマウスからの血清ＩｇＧは、第１０図に示すよ うに、非還元ゲル上で、単一の分子量４０ｋＤａのバンドを認識した。同図にお いては、陽性の対照のモノクローナル抗体７Ｈ１２も、４０ｋＤａのタンパクと 免疫反応した。「ｏ」は、分離ゲルの起源を示す。これらの結果は、選択された ｓｐ５６ ｓｓｓ３ｐハプテンが、マウスを経口的に免疫するためにうまく使用 され、且つ、イン・サイツで、ｓｐ５６に対して、免疫応答が指示されたことを 示している。 免疫されたマウスからの精子は、その後、本発明のｓｐ５６ポリペプチド免疫 避妊組成物の直接の影響を評価するために、免疫組織化学的に解析された。この アッセイのために、前記［ブレイル（Ｂｌｅｉｌ）およびワッサーマン（Ｗａｓ ｓａｒｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８５巻、 ６７７８−６７８３頁（１９８８年）］されたように、免疫されたマウスからの 精巣上体尾部精子が単離され、受精能獲得を支持する培地中で、３０分間インキ ュベートされた。インキュベートされた精子は、上に前もって記載された免疫組 織化学のために、固定され且つ調製された。乾燥され培養皿に塗られた精子が、 元に戻され（水和され）、２５℃で４時間、ＴＮＢＧ（５０ｍＭ トリス−塩酸 、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）［シグマ］、および５％ 正常ヤギ血清［シグマ］）中でインキュベート され、その後、５０μｇ／ｍｌでコロイド状金−接合ヤギ抗マウスＩｇＡ（シグ マ）を含むＴＮＢＧ中で、４時間インキュベートされた。精子は、洗浄され、銀 で増幅され、且つ前記したように対比染色された。 明白な観察結果は、対照または実験マウスからの精子の運動性のレベル（およ そ７０％）間のまたはタイプ間の違いを示さなかった。ＣＴ−Ｂ−ｓｓｓ３ｐｐ 免疫マウスからのアクロソームが完全な精子は、「三日月」が、ｓｐ５６の位置 を定めて、アクロソームの上を覆っている原形質膜の表面にまったく限定された 免疫金染色を示した。対照のＣＴ−Ｂ免疫マウスからの精子では、免疫金染色は 、検出されなかった。 免疫されたマウスからの精子は、その後、精子−卵子結合アッセイで特徴づけ られる。前記したように、受精能獲得のためにインキュベートされた精子の一部 が、前記［ブレイル（Ｂｌｅｉｌ）およびワッサーマン（Ｗａｓｓａｒｍａｎ） 、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８５巻、６７７８−６７ ８３頁（１９８８年）］したように、塊のないマウス卵子を用いて、精子−卵子 結合アッセイに挑戦させられた。卵子あたりの結合精子の数（アッセイあたり、 １０個の卵子および２個の二細胞胚）が、前記のようにして測定される。 他のマウス（雄および雌）が、組換えおよび合成分子のためにそれぞれ実施例 ３および４に記載されたようにして調製された、同等に調製されたｓｐ５６免疫 避妊組成物を用いて、免疫される。免疫化に対する応答は、キャリアー分子を用 いてまたは用いずに、組換え型でまたは合成によって調製される、アッセイされ たｓｐ５６タンパクまたはポリペプチド試薬のそれぞれについて、ここに記載の ようにして評価される。 本発明のｓｐ５６免疫避妊タンパクまたはポリペプチドを用いてうまく免疫さ れた雄のマウスは、その後、生殖可能性を評価するために、交尾させられる。Ｅ ＬＩＳＡにより、免疫応答を明示している少なくとも一種を含む群からのすべて の雄および雌は、生殖能力が無いことを試験するために、６０日目（免疫化後６ ０日）に、別々に、免疫されていない相手と交尾させられる。最大２０日間、つ かいが一緒に檻で飼われ、雌は、各朝に、交尾栓について検査される。交尾し、 免疫されていない雌は、２０日間と、その期間の後の２１日間、妊娠について、 腹部の膨張の明白な観察結果と分娩の両者によって検査される。免疫された雄の 避妊の成功は、出産できない、免疫されていない雌（免疫された雄と交尾させら れた）の百分率として測定される。交尾し、免疫された雌は、分離されて、同様 の方法で妊娠について検査される。免疫された雌の避妊の成功は、出産できない 交尾し、免疫された雌の百分率として測定される。各群について、成功率の最小 要求値は、雄について５０％の避妊および雌について５０％の避妊である。これ らの低い数値ですら、げっ歯類の固体数の低下のために、試薬の効果は十分であ る。 １０１日目に、１０−２０匹のうまく免疫された避妊雄（各群から５匹以下） が、その後、免疫避妊の部位を決定するために解析される。これらの雄は、免疫 されていない雌と交尾させられる。交尾した雌は、交尾後７時間で犠牲とされ、 それらの卵管および子宮角が、切り開かれ且つ生理食塩水で洗い流された。すべ ての細胞性物質が、遠心分離によって分離される。洗浄水（フラッシュ）中の可 溶性物質が、上記の如く、ＥＬＩＳＡによって抗ｓｐ５６Ｉｇについて解析され る。Ｉｇの型の決定は、ＥＬＩＳＡによって行われる。洗浄水中に精子が無いと いうことは、免疫攻撃および管の防御の上流における精子の除去を示す。洗浄水 中に見出された精子には、損なわれた運動性、Ｔ細胞またはマクロファージとの 会合、およびヤギ抗マウスＩｇＧ−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合 体を用いての抗体被覆が観察される。すべてのケースにおいて、Ｆｃレセプター の結合が、前記［チェング（Ｃｈｅｎｇ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、 １２５巻、８６７−８７８頁（１９９４年）］したように、正常ヤギ血清によっ て事前ブロックされる。精子の存在と、Ｉｇおよび／または免疫細胞の会合は、 精巣上体または精液中で分化された精子に対する粘膜の免疫攻撃を示す。 次に、うまく免疫された不妊雄の半分が犠牲にされ、生殖器官が、免疫化依存 病理学の観点で解析される。睾丸および精巣上体が、前記の如く、固定され、包 埋され、切片にされ且つ染色される。これらの不妊、ｓｐ５６免疫化雄の睾丸お よび精巣上体切片は、前記の如く、免疫攻撃の方法を定めるために、免疫組織化 学によって解析される。この手順は、免疫応答が、免疫系の細胞（例えば、マク ロファージ、キラーＴ細胞）による侵襲を含むのか、あるいは単に循環している または分泌された抗体による攻撃によるのかを決定するために使用される。これ らの５−１０匹のｓｐ５６で免疫された雄の死体は、ザ・スクリップス・アニマ ル・ファシリティ・ベタリナリアン（ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎ）により、他の器官における解剖 病理学のために、更に解析される。 仮に、ｓｐ５６で免疫された雌が避妊（即ち、交尾栓によって決定して交尾に 成功、しかし子孫はなし）を証明するなら、それらは、その後、卵管および子宮 角中での精子への免疫攻撃が試験される。１０匹もの避妊、ＴＭＶ−ｓｐ５６免 疫化雌が、免疫されていない雄と交尾させられ、それらの卵管および子宮角中の 精子が、前記の如く、免疫攻撃の根拠のために解析される。 ＴＭＶ−ｓｐ５６タンパクまたはポリペプチド免疫が可逆性であるか否かを決 定するために、更なるアッセイが行われる。ｓｐ５６依存性不妊の可逆性は、絶 滅の危機に瀕した（ｔｈｒｅａｔｅｎｅｄ ｏｒ ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ）げっ 歯類が有害なげっ歯類の個体群と同じ生態的地位を占めるならば、望ましいかも しれない。この状況のために、残りの、うまく免疫された雄および雌の繁殖力の 試験が、続けられる。８１日目の後、これらの動物が、野生型ＴＭＶまたは他の デリバリー・ビヒクルを含む食用ペレットの飼料を与えられる。１２０日間、前 記の如く、それらの繁殖力が試験される。ｓｐ５６依存性不妊の可逆性の成功が 、ｓｐ５６で免疫された雄との交尾の後に出産した免疫されなかった雌の百分率 および免疫されなかった雄との交尾の後に出産したｓｐ５６で免疫された雌の百 分 率として測定される。６．ムリン（ネズミ）ｓｐ５６の哺乳類ｃＤＮＡホモログの単離 実施例２に記載のようにして得られたムリンｃＤＮＡ ｓｐ５６の哺乳類ｃＤ ＮＡホモログが、ここに記載のスクリーニング・プロトコルによって得られる。 そのプロトコルは、哺乳類組織をスクリーニングするために設計されているとは いえ、その手順は、ヒトホモログのみを単離するために記載されている。当業者 は、ヒトｓｐ５６ホモログを単離するための記載された方法が、他の哺乳類のホ モログの同定における使用のために、容易に推定によって適用されることを理解 する。更に又、当業者は、哺乳類のホモログの同定は、ここに記載された方法に 限定されないことも理解する。 予備スクリーニングにおいて、ヒト睾丸ＲＮＡの厳密さの低いノーザン・ブロ ット解析（マウス精子ｓｐ５６をコードする全長ｃＤＮＡでプローブ）が、１− ２ｋｂ範囲において、かすかなＲＮＡバンドを検出した。ＲＮＡのハイブリダイ ズは、低い厳密さで検出されるのみであるので、そのＲＮＡによってコードされ たホモログは、おそらく、ｓｐ５６に対して遠い関係にある。ヒト精子タンパク のヒト卵母細胞ＺＰ認識ドメインが、マウスにおけるケース［フローマン（Ｆｌ ｏｒｍａｎ）等、Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．、１０６巻、２４３０１５１頁（１９ ８４年）；フローマン（Ｆｌｏｒｍａｎ）およびワッサーマン（Ｗａｓｓａｒｍ ａｎ）、Ｃｅｌｌ、４１巻、３１３−３２４頁（１９８５年）；ブレイル（Ｂｌ ｅｉｌ）およびワッサーマン（Ｗａｓｓａｒｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ.，ＵＳＡ 、８５巻、６７７８−６７８３頁（１９８８年）］の ように、炭水化物の替わりにＺＰポリペプチドを認識できるので、このことは、 予期されるかもしれない。 ヒト睾丸ＲＮＡの更なるノーザン・ブロット解析が、ｓｐ５６ホモログをコー ドするヒト睾丸ｃＤＮＡを同定するためのプローブ（ｓｐ５６ ｃＤＮＡ由来） を同定するために、行われる。すべてのノーザン・ブロット解析が、好結果のＲ ＮＡの、単離、転写およびＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡのためのプローブを用いた後ス クリーニングによる提供のために、試験される。ｓｐ５６ホモログをコードする ヒト睾丸ＲＮＡをノーザン・ブロットで検出するために、二つのタイプの核酸プ ローブが使用される。最も高いピーク／ノイズ比を提供し、且つ、ブロット上の ＲＮＡバンドの最も小さい数に明らかに結合するこれらのプローブが、ｃＤＮＡ スクリーニングのために選択される これらのプローブは、次のように説明される：Ｉ型プローブ ： 二本鎖³²Ｐラベルのランダムに用意されたＤＮＡ ｓｐ５６ｃ ＤＮＡプローブが、配列番号１のヌクレオチド配列を有する全長ｓｐ５６ ｃＤ ＮＡクローン７．１から、またはそのｃＤＮＡのサブクローンから調製され、前 記されたように［ブックバインダー（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ）等、Ｓｃｉｅｎｃ ｅ 、２６９巻、８６−８９頁（１９９５年）］、ノーザン・ブロットをプローブ するために使用される。全長プローブは、マウス睾丸ＲＮＡのノーザン・ブロッ トにおいて、ｓｐ５６ ＲＮＡを同定するために巧く使用されているという、そ して、比較的低い厳密さで、ヒト睾丸ＲＮＡを検出するという利点を有する。更 なるノーザン・ブロットの全長プローブを用いての研究が行われる。その研究に おいては、よりよいピーク／ノイズ比を得るために、ハイブリダイゼーション後 の洗浄条件の厳密さは、様々とされる。例えば、ハイブリダイゼーション後の洗 浄は、４×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ（２５℃）を用いて繰り返され、ＳＳＣの濃 度は後に多様化され（４×〜６×）、ＳＤＳの濃度は多様化され（０．５％〜０ ．１％）、且つ、いくつかの実験においては、デンハーツの試薬（Ｄｅｎｈａｒ ｄｔ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）等のブロッキング剤が添加される。替わりに、ノー ザン・ブロットをスクリーニングするために、上記の如く、ｓｐ５６ ｃＤＮＡ のサブクローンを表し、且つ、ｓｐ５６ ｃＤＮＡクローン７．１の５’側半分 （配列番号１の塩基１−１３００）またはｓｐ５６ ｃＤＮＡクローン７．１の ３’側半分（配列番号１の塩基１３０１−２０５０）に相当する他のプローブが 、使用される。ＩＩ型プローブ ： ｓｐ５６ ｃＤＮＡに由来する、その３’末端にビオチンを 有する一本鎖合成ビオチン化デオキシリボヌクレオチド６０量体アンチセンス・ 、プローブが、ザ・スクリップス・インスティチュート・コア・ファシリティ（ Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ） によって合成される。これらのアンチセンス・プローブは、遺伝子銀行の継承番 号 Ｕ１７１０８として挙げられているｓｐ５６ ｃＤＮＡ配列中および配列番号１ 中に示された領域に対する、５’から３’の方向に書かれた、次に記載された相 補配列を有する： ５’非翻訳領域中のヌクレオチド１−６０（配列番号１）に相補的な： ５’ＴＣＴＧＡＡＴＡＡＧＡＣＧＴＡＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＡＧＴＧＴＴＧＣＣ ＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＣＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＧＴＧＣＣ３’(配列番号１６)； Ｓｕｓｈｉドメイン１中のヌクレオチド１８１−２４０（配列番号１）に相補的 な： ５’ＧＴＴＧＴＴＧＡＣＴＣＡＴＡＣＡＡＣＴＧＧＴＴＧＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧ ＣＡＡＡＣＧＧＴＡＡＡＡＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＣＡ３’(配列番号１７)； Ｓｕｓｈｉドメイン４中のヌクレオチド７８１−８４０（配列番号１）に相補的 な： ５’ＣＣＣＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＧＣＧＴＣＴＣＴＧＴ ＡＣＧＣＡＴＡＧＡＡＣＴＧＴＣＧＡＡＡＴＣＣＡＧＧＧ３’(配列番号１８)； および 配列特異的ドメイン（ｓｓｓ）中のヌクレオチド１３８１−１４４０（配列番号 １）に相補的な： ５’ＣＣＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＴＧＣＴＣＧＧＴＴＧＡＧＴＴＴＴＣＴＴＣＡＴ ＧＡＣＣＡＡＡＴＡＧＡＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＣ３’(配列番号１９)。 四つのプローブが、可能性のあるｓｐ５６のヒト精子アナログに対する予期さ れたｓｐ５６相同性に基づいて選択された。５’非翻訳領域が、発現におけるそ の殆ど確実な調整機能のために、選択された。Ｓｕｓｈｉドメイン１および４の 領域は、ｓｐ５６のＮ末端の半分が、保存された精子固定（アンカーリング）ド メインを表すという証拠の下で、大部分が保存されている。ｓｐ５６の炭水化物 認識ドメインの一部としてのｓｐ５６特異的配列（ｓｓｓ）は、保存されていな いらしく、且つ、ノーザン・ブロット解析では、陰性の対照として機能する。し かしながら、ノーザン・ブロット上でヒト睾丸ＲＮＡを明確に且つ満足に検出す るプローブのいずれか（またはすべて）は、その後ｃＤＮＡスクリーニングのた めに使用される。一本鎖ビオチン化ポリヌクレオチド・プローブが、製造者［ミ リポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、バイオラッド］によって示唆された条件の下、 ヒト睾丸およびマウス睾丸(陽性の対照)からのＵＶ架橋ＲＮＡを含むノーザン・ ブロットにハイブリダイズされる。最も高いピーク／ノイズ比を得るために、ハ イブリダイゼーション後の洗浄が、様々なレベルの厳密さの下で行われる。ハイ ブリッドの検出のために、ブロットが、その後、ストレプトアビジン−アルカリ ホスファターゼ接合体を用いてプローブされ、且つ、ＢＣＩＴ−ＢＰＴ試薬を用 いて発色される。 ｓｐ５６ ｃＤＮＡ配列（その配列のプローブは、ヒト睾丸ＲＮＡを有するノ ーザン・ブロット上の個々のＲＮＡバンドを巧く検出するために明らかとされて いる）が、その後、ヒト睾丸ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために使 用される。ブレイル博士（Ｄｒ．Ｂｌｅｉｌ）の研究室が、前記［ブックバイン ダー（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻、８６−８９頁（ １９９５年）］の如く創造され、且つλ−ＺａｐＩＩベクター中におよそ１０⁸ 個の独立クローンを含むオリゴ−ｄＴ−プライムド・ヒト睾丸ｃＤＮＡライブラ リを開発した。それに匹敵するライブラリは、市場で入手可能でもある。前記の 如く選択されたプローブが、本質的にマウス睾丸ｃＤＮＡライブラリのスクリー ニングのために前記されたようにして、ライブラリをスクリーニングするために 使用される。そのようなスクリーニングにおいて検出されたプラークが、クロー ニングされ、且つ、前記の如く、ｃＤＮＡの配列が決定される。 配列が決定されたｃＤＮＡは、次の基準に基づいて、ｓｐ５６のヒトアナログ をコードするｃＤＮＡの候補として同定される： １． ｃＤＮＡクローンを同定するプローブは、マウス（陽性の対照）およびヒ ト睾丸ＲＮＡの両者のノーザン・ブロット上で、個々のＲＮＡバンドも検出 しなければならない。前記の如く、ｓｐ５６のｓｓｓをコードするプローブ は、ヒト睾丸ＲＮＡまたはそれらの個々のｃＤＮＡを同定するために予期さ れない。 ２． 選択されたｃＤＮＡの翻訳された配列は、ｓｐ５６アミノ酸配列（の少な くとも半分）に対して、かなりの相同性を有さなければならない。ｓｐ５６ は、タンパク・レセプター（そのそれぞれは、Ｓｕｓｈｉドメインと呼ばれ る短い相同の繰返しを含む）のスーパーファミリーの一種であるから、スー パーファミリーの他のもの（ｓｐ５６ホモログではない）が、偶然に同定さ れ得る。例えば、相補的４Ｂ結合タンパク（Ｃ４ＢＰ）のαサブユニットが 、４７％の全体としてのアミノ酸同一性を有して、ｓｐ５６に最も密接に関 連する。しかしながら、Ｓｕｓｈｉドメイン１−５のｓｐ５６のＮ末端側の 半分は、ヒトＣ４ＢＰに対して５４％のアミノ酸同一性を有し、一方、Ｓｕ ｓｈｉドメイン６、ＳＳＳ、Ｓｕｓｈｉドメイン７および基本的なＣ末端テ ールを含むＣ末端側の半分は、ヒトＣ４ＢＰに対して３６％のアミノ酸同一 性しか有さない。従って、ｓｐ５６のヒト精子ホモログとしての候補である ためには、選択されたｃＤＮＡの翻訳された配列は、４７％を超える、ｓｐ ５６に対する全体としてのアミノ酸同一性を有さなければならないか、また は、Ｎ末端側の半分が、５４％を超える同一性を有さなければならないか、 または、Ｃ末端側の半分、３６％を超える同一性を有さなければならない。 これらの必要条件は、機能的にマウス精子ｓｐ５６のホモログではないタン パクを同一視する機会を最小化するために、選択される。 上記基準に適合して選択され且つ配列が決定されたｃＤＮＡは、ｓｐ５６のヒ ト精子ホモログの候補をコードするとして同定される。ヒトｓｐ５６ホモログは 、精子および精子形成の後期に限定されねばならず、且つ、他のヒト組織が不存 在でなければならない。候補のタンパクの発現が、ヒトにおいて制限されている か否かを試験するために、前記のようにして、ヒト組織（心臓、肝臓、上皮、睾 丸、筋肉、肺、脳、腎臓および卵巣）から抽出されたＲＮＡのノーザン・ブロッ ト解析が、選択されたヒト睾丸ｃＤＮＡに由来する³²Ｐハイブリダイゼーション ・プローブを用いて行われる。仮に、ムリンｓｐ５６のように、ノーザン・ブロ ットが、候補のｓｐ５６ホモログをコードするＲＮＡが、睾丸においてもっぱら 発現されることを明らかにするならば、コードされたタンパクは、イン・ビボに おけるその機能とは関係なく、ヒトにおいて、理想的な免疫避妊の目標に相当す る。そのような候補の一つの他の要求される特徴は、仮にそれが有効な目標であ るとするならば、タンパクが、ヒト精子の表面上で発現されるということである 。 ヒトまたは他の哺乳類ホモログの同定および配列解析が、その後、本質的に実 施例３および４に記載の如く調製され且つ実施例５に記載の如く放出されたｓｐ ５６タンパクおよびポリペプチド免疫原の調製を可能とする。 特定の態様および例を包含する先行する明細書は、本発明の実例を示すもので あることが意図されており、且つ、限定するものとして解されることは意図され ていない。本発明の真の意図および範囲から離れることなく、多くの他の変形お よび修飾が行われ得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｊ 33/53 33/53 Ｄ 33/577 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ブックバインダー、ルイス・エイチ アメリカ合衆国、カリフォルニア州 92122、サン・ディエゴ、クリスタル・ド ーン・ドライブ 4075、ナンバー 204、

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 医薬的に容認されうる賦形剤と組み合わせて、ｓｐ５６抗原決定基を有す る抗原性ポリペプチドを、哺乳類において抗ｓｐ５６抗体を誘導するのに有 効な量で含む免疫避妊ワクチン組成物。 ２． 上記抗原決定基が、ｓｐ５６種特異的配列（ｓｓｓ）を含む、請求項１記 載の組成物。 ３． 上記抗原決定基が、ｓｐ５６のＳｕｓｈｉドメインを含む、請求項１記載 の組成物。 ４． 上記抗原性ポリペプチドが、合成ポリペプチド、ハイブリッド分子、融合 タンパク、組換えタンパク、キメラポリペプチド分子および単離されたタン パクよりなる群から選択される、請求項１記載の組成物。 ５． 上記哺乳類が、げっ歯類、有蹄類、有袋類、霊長類、ブタ、イヌ、ネコお よびヒトよりなる群から選択される、請求項１記載の組成物。 ６． 上記抗原性ポリペプチドが、配列番号２：−３２〜５４７、２：１〜５４ ７、２：１〜４７７、２：１〜５９、２：３〜３２、２：３４〜４６、２： ６４〜１２１、２：６５〜９０、２：９２〜１０４、２：１２６〜１８６、 ２：１２７〜１５４、２：１５６〜１６８、２：１９１〜２４６、２：１９ ２〜２１８、２：２２０〜２３２、２：２５１〜３１３、２：２５２〜２８ ４、２：２８６〜３００、２：３１７〜３７９、２：３１９〜３５０、２： ３５２〜３６５、２：３１９〜３３８、２：３４０〜３５０、２：４２４〜 ４７７、２：４２５〜４５０、２：４５２〜４６４、２：３８０〜４２３、 ２：３８３〜３９８、２：３９６〜４１１および２：４０６〜４２１よりな りなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１記載の組成物。 ７． 上記組成物が、２以上の上記抗原性ポリペプチドを含む、請求項６記載の 組成物。 ８． キャリアー、免疫刺激剤、抗原性分子またはアジュバントをさらに含む、 請求項１記載の組成物。 ９． 上記キャリアーが、コレラ毒素サブユニットＡ、コレラ毒素サブユニット Ｂ、ジフテリア毒素、インフルエンザウイルスＨＡタンパク、マウス白血病 ウイルス・コートタンパク、サルモネラ表面タンパク、およびタバコモザイ クウイルス・コートタンパクよりなる群から選択されるポリペプチドである 、請求項８記載の組成物。 １０．安定剤をさらに含む、請求項１記載の組成物。 １１．上記キャリアーが、非毒性であり、食することができるキャリアーである 、請求項８記載の組成物。 １２．上記キャリアーが、植物性物質である、請求項１１記載の組成物。 １３．上記組成物が、餌または飼料として製剤化されている、請求項１１記載の 組成物。 １４．上記ハイブリッド分子が、第二のポリペプチドドメインに作動可能に連結 されたｓｐ５６抗原決定基からなる第一のポリペプチドドメインを含む、請 求項４記載の組成物。 １５．上記第二のポリペプチドドメインが、コレラ毒素サブユニットＡ、コレラ 毒素サブユニットＢ、ジフテリア毒素、インフルエンザウイルスＨＡタンパ ク、マウス白血病ウイルス・コートタンパク、サルモネラ表面タンパク、お よびタバコモザイクウイルス・コートタンパクよりなる群から選択される、 請求項１４記載の組成物。 １６．上記ハイブリッド分子が、ｓｐ５６の種特異的配列（ｓｓｓ）を定義する ポリペプチドに作動可能に連結されたコレラ毒素サブユニットＡポリペプチ チドドメインを有するポリペプチドを含む、請求項１４記載の組成物。 １７．上記ｓｓｓポリペプチドが、２：３８０〜４２３、２：３８３ 〜３９８、２：３９６〜４１１および２：４０６〜４２１よりなる群から選 択される、請求項１６記載の組成物。 １８．上記ハイブリッド分子が、融合タンパクであり、上記作動可能な連結が、 上記第一および第二のポリペプチドドメインの間のペプチド結合である、請 求項１４記載の組成物。 １９．上記ハイブリッド分子が、キメラポリペプチド分子であり、上記作動可能 な連結が、化学的架橋である、請求項１４記載の組成物。 ２０．請求項１記載の免疫避妊組成物を、抗ｓｐ５６抗体の産生を誘導するのに 有効な量で哺乳類に投与することを含む、免疫避妊方法。 ２１．上記投与経路が、経口、静脈内、皮下、筋内および腹腔内よりなる群から 選択される、請求項２０記載の方法。 ２２．上記経口投与が、食物摂取によるものである、請求項２１記載の方法。 ２３．上記哺乳類が、げっ歯類、有蹄類、有袋類、霊長類、ブタ、イヌ、ネコお よびヒトよりなる群から選択される、請求項２１記載の方法。 ２４．以下の工程を含む、哺乳類の不妊性を決定する方法： ａ）上記哺乳類からの抗体を含む身体試料を、上記哺乳類のｓｐ５６抗原決定 基を有する抗原性ポリペプチドと混合する工程； ｂ）上記混合物を、上記ポリペプチドが上記抗体の任意のものと免疫反応して 免疫反応複合体を形成するのに十分な条件下に維持する工程； ｃ）上記混合物中の上記免疫反応複合体の存在を検出する工程。 ２５．ｓｐ５６抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドと免疫反応する抗体であ って、上記ポリペプチドが、約６５アミノ酸残基を超えない長さであり、配 列番号２：１〜５９、２：３〜３２、２：３４〜４６、２：６４〜１２１、 ２：６５〜９０、２：９２〜１０４、２：１２６〜１８６、２：１２７〜１ ５４、２：１５６〜１６８、２：１９１〜２４６、２：１９２〜２１８、２ ：２２０〜２３２、 ２：２５１〜３１３、２：２５２〜２８４、２：２８６〜３００、２：３１ １７〜３７９、２：３１９〜３５０、２：３５２〜３６５、２：３１９〜３ ３８、２：３４０〜３５０、２：４２４〜４７７、２：４２５〜４５０、２ ：４５２〜４６４、２：３８０〜４２３、２：３８３〜３９８、２：３９６ 〜４１１および２：４０６〜４２１よりなる群から選択される配列を含む、 抗体。 ２６．上記ポリペプチドが、配列番号２：１〜５９、２：３〜３２、２：３４〜 ４６、２：６４〜１２１、２：６５〜９０、２：９２〜１０４、２：１２６ 〜１８６、２：１２７〜１５４、２：１５６〜１６８、２：１９１〜２４６ 、２：１９２〜２１８、２：２２０〜２３２、２：２５１〜３１３、２：２ ５２〜２８４、２：２８６〜３００、２：３１７〜３７９、２：３１９〜３ ５０、２：３５２〜３６５、２：３１９〜３３８、２：３４０〜３５０、２ ：４２４〜４７７、２：４２５〜４５０、２：４５２〜４６４、２：３８０ 〜４２３、２：３８３〜３９８、２：３９６〜４１１および２：４０６〜４ ２１よりなる群から選択されるアミノ酸残基配列からなる、請求項２５記載 の抗体。 ２７．上記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２５記載の抗体。 ２８．以下の工程を含む、哺乳類の雄性不妊性を決定する方法： ａ）上記哺乳類からの精子を含む身体試料を、上記哺乳類のｓｐ５６抗原決定 基を有する抗原性ポリペプチドと免疫反応する抗体と混合する工程； ｂ）上記混合物を、上記抗体が上記身体試料中の上記抗原決定基を含む精子の 任意のものと免疫反応して免疫反応複合体を形成するのに十分な条件下に維 持する工程； ｃ）上記混合物中の上記免疫反応複合体の存在を検出する工程。