JP2000515014A - 哺乳動物へパラナーゼ活性の検出および哺乳動物へパラナーゼの精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳動物組織、細胞または体液のごとき試料中の哺乳動物ヘパラナーゼ活性を検出する方法；ならびにヒト血小板のごときヘパラナーゼ含有材料から哺乳動物ヘパラナーゼを精製する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物ヘパラナーゼ活性の検出および哺乳動物ヘパラナーゼの精製 発明の分野 本発明は、血清ならびに正常および癌の細胞および組織を包含する種々の哺乳 動物組織、細胞および体液に存在する哺乳動物ヘパラナーゼ活性の検出のための アッセイに関し、そのアッセイは、種々の組織および細胞源からの哺乳動物ヘパ ラナーゼ活性の測定のために、転移能の決定のための道具として、およびヘパラ ナーゼ活性および転移に対する特異的阻害剤の開発のために、種々の組織および 細胞起源由来の哺乳動物ヘパラナーゼ活性の決定のために使用できる。 また本発明は、哺乳動物ヘパラナーゼ、詳細にはヒト血小板ヘパラナーゼの精 製方法、ならびにこの方法により得られる精製哺乳動物ヘパラナーゼに関する。 ヒト血小板ヘパラナーゼのごとき精製哺乳動物ヘパラナーゼの利用は、哺乳動物 ヘパラナーゼ活性に対する阻害剤の開発、該酵素に対するモノクローナル抗体の 製造、ならびに該酵素の最終的なクローニングおよび発現のための該酵素のアミ ノ酸およびｃＤＮＡ配列の同定を可能にするであろう。 発明の背景 血液−骨の悪性腫瘍細胞および白血球による組織侵入の重要なプロセスは、血 管内皮層表面へのそれらの付着、それらの血管内皮細胞層の通過、ならびにその 後の分泌および／または細胞表面のプロテアーゼおよびグリコシダーゼ活性の共 働による基底層および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解を包含する（Nakaji ma et al.,1983;Schmitto et al.，1992;Vlodavsky et al.，1992）。基底層お よびその下の結合組織間質は、主としてフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲ ンタイプＶＩおよびビトロネクチンの複合体ネットワークからなっており、これ らの各成分は、マトリックス中に埋没しているヘパラン硫酸プロテオグリカン( ＨＳＰＧ)のヘパラン硫酸(ＨＳ)側鎖と相互作用する(Yurichence andSchittny， 1990)。一般的には、ＨＳ鎖はあまり硫酸化されていない領域および非硫酸化領 域（１−４結合でβ−Ｄ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル化されたグルコ サミンのジサッカライドユニットが主たるものである）により隔てられた硫酸化 ジサッカライドユニット(１−４結合でα−Ｌ−イジュロン酸残基に結合したＮ −硫酸化グルコサミンが主たるものである)のクラスターからなる(Turnbull and Gallagher，1990，1991)。それゆえ、侵入細胞により生産されるエンドグリコ シダーゼまたはヘパラナーゼ活性によるＨＳ鎖の開裂は、ＥＣＭ分解の一助とな り、細胞移動を容易にする。ヘパラナーゼ活性は、ネズミおよびヒトの線維肉腫 および黒色腫細胞系の転移能に関連していることが示されている（Nakajima et al.，1983，l968a,b，1988;Ricoveri and Cappelletti，1986）。さらにそのう え、ヘパラナーゼ活性は、ラット肝臓（Gallagher et al，1988;Hook et al，19 75）、ヒト胎盤(Klein and Von Figura，1979;Lider et al，1989)、ヒト血小板 (Hoogewerf et l，1995;Oldberg et al，1980;Oosta et al，1982)、培養ヒト皮 膚繊維芽細胞（Klein and Von Figura，1976）、ヒト好中球（Matzner et al，1 985，1992）、活性化されていて休眠していないラットＴ−リンパ球（Naparstek et al，1984）、正常および新生物ネズミＢ−リンパ球（Laskov et al，1991） 、ヒト単球（Sewell et al，1989）およびヒト請静脈内皮細胞（Bartlett et al ，1995;Godder et al，1991）を包含する多くの組織および細胞タイプおける存 在が記載されている。ＨＳの開裂は、転移性腫瘍細胞および白血球の基底膜通過 に必須と思われるので、ヘパラナーゼ阻害剤についての研究は、新規かつ非常に 選択的なクラスの抗転移薬および抗炎症薬の開発可能性を提供する(Coombe et a l.，1987;Irimuraetal.，1986; Parish et al.，1990;Vlodavsky et al.，1992; Willenborg and Parish，1988)。 血小板、転移性腫瘍細胞および免疫系の循環細胞によるヘパラナーゼ活性の発 現は、それらの漏出および溢出におけるそれらの関与に関連している。毛細血管 内皮による転移性腫瘍細胞の最初の捕捉は血小板依存的であるが、その後間もな く起こる血小板凝集は血小板活性化および脱顆粒反応を導き、ギャップを形成し 、基底膜に露出している内皮細胞を元に戻し、腫瘍細胞による付着を導く可能性 が あることが、研究により示されている（Tanaka et al.，1986;Crissman et al. ，1985;Yahalom et al.，1985）。ヒト血小板は、高レベルのヘパラナーゼ活性 を含み、内皮細胞表面、腫瘍由来およびＥＣＭ由来のＨＳＰＧ(Bartlett et al. ，1995a，1995b;Castellot et al.，1982;Hoogewerf et al.，1995;Masteson et al.，1976，1977;Yahalom et al.，1984)ならびに遊離ＨＳおよびヘパリン鎖（ Hoogewerf et al，1995;Nakajaima et al.，1988;Thunberg et al，1982）を分 解しうることが示されている。より最近の研究により、ネズミ黒色腫およびマク ロファージ抽出は実際にＨＳおよびヘパリンの両方を分解できたが、ヘパリンに ついてはヒト血小板抽出物による場合よりも分解の程度が低かったことが示され ている(Graham and Underwood，1996)。Hennes et al（1988）は、腫瘍由来のヘ パラナーゼはマトリックスのＨＳを分解できたが、内皮細胞表面のＨＳを分解で きなかったと報告しており、ヒト血小板が構造的によりヘパリン様である内皮細 胞表面ＨＳを分解することがGamse et al(1978)により示されている。よって、 ヘパリンおよびＨＳの両方を分解できる血小板ヘパラナーゼは、狭い範囲の付着 プラークにおける細胞表面ＨＳの分解、および血液−骨細胞の溢出の促進におい て重要な役割を果たしている可能性がある。 ヘパラナーゼがＮ−硫酸化されたイジュロン酸含有ヘパリン生合成中間体に作 用するエンドグルクロニダーゼであることを決定したOldberg et al(1980)によ るヒト血小板ヘパラナーゼの部分精製に続いて、該酵素は６つのカラムにより２ ４００００倍に精製されて見かけ上均一とされた（収率６％）（Oosta et al.， 1982）。該酵素は１３４ｋＤａの単一サブユニット蛋白であり、¹²⁵Ｉ−ヘパリ ンに対して活性があり、エンドグルクロニダーゼであることが確認された。その 後の研究において、血小板ヘパラナーゼは、平滑筋細胞増殖を阻害する内皮細胞 表面のヘパリン様物質を開裂すること（Castellot et al，1982）、ならびにＧ ｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ間のアンチスロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）結合オク タサッカライド（Thunberg et al，1982）を開裂して、おそらくヘパリンを分解 後その抗凝血活性を消失させることが示された（Oldberg et al．1980）。精製 酵素はオクタサッカライド基質に作用することが示されたが、血小板抽出物もま た、 ＥＣＭ由来のＨＳ鎖を分解して１０ｋＤａのフラグメント（Yahalom，et al 198 4）および５ｋＤａのフラグメント（Freeman and Bartlettの未公表観察結果） とすることが示された。血小板ヘパラナーゼ作用後のヘパリン開裂生成物のサイ ズは決定されなかった（Graham and Underwood，1996;Oldberg et al，1980;Oos ta et al，1982）。しかしながら、最近、Hoogewerf et al(1985)は、ヒト血小 板ヘパラナーゼ活性を収率８％で４１００倍に精製し、それがエンドグルコサミ ニダーゼであり、ヘパリンおよびＨＳを主としてジサッカライドにまで開裂する ことを、消化生成物を放射性標識して示した。その活性は、血小板塩基性蛋白フ ァミリーのメンバーである８〜１０ｋＤａサブユニットＣＸＣケモカイン結合組 織活性化ペプチド−ＩＩＩ（ＣＴＡＰ−ＩＩＩ）および好中球活性化ペプチド− ２（ＮＡＰ−２）に帰属するものであった。対称的に、Graham and Underwood(1 996)は、ヒト血小板抽出物中のヘパラナーゼ活性が４０〜６０ｋＤａの分子量を 有し、ＨＳおよびヘパリンの両方を開裂したことを示したが、分解生成物のサイ ズは決定されなかった。 報告された分子サイズ（８ｋＤａないし１３４ｋＤａ）、基質特異性（酵素が エンドグルクロニダーゼであるかエンドグルコサミニダーゼであるか）、ならび に基質開裂生成物のサイズ（ジサッカライドまたは５ないし１０ｋＤａ）の相異 を解明することは、酵素を高収率で均一にまで精製することを要する。血小板酵 素の基質特異性についてのいくつかの研究が報告されており(Oldberg et al 198 0;Oosta et al 1992;Thunberg et al 1982)、驚くべきことに、硫酸化されたポ リサッカライドによる酵素阻害に関しては、ある主の修飾ヘパリンおよびヘパリ ン自体をＥＣＭ結合ＨＳＰＧの血小板による分解を阻害するために用いることを 除いては、腫瘍細胞ヘパラナーゼ活性の阻害についてわずかに報告があるだけで ある（Eldor，et al 1987）。腫瘍細胞溢出の初期段階における血小板の潜在的 に重要な役割を考慮すると、このことは特に驚くべきことである。 哺乳動物ヘパラナーゼ活性を精製し特徴づけし、有効なヘパラナーゼ阻害剤を スクリーニングし開発するために、ヘパラナーゼ活性についての簡単かつ迅速な アッセイが必要である。しかしながら、以前のヘパラナーゼアッセイは、放射性 標識基質の調製ならびに未開裂基質からの分解生成物の分離に両方において繁雑 で時間のかかるものであった。しばしば、ヘパラナーゼアッセイはＥＣＭ結合Ｈ ＳＰＧの生合成的放射性標識およびＥＣＭから遊離された放射性物質のゲル濾過 分析によるＨＳ鎖分解の検出を必要とした（Bartlett et al，1995;Vlodavsky e t al，1992およびそれらの中の文献）。かかるアプローチは、ＥＣＭ中のＨＳ鎖 の分解がプロテアーゼ（次のヘパラナーゼ攻撃のためにＨＳ鎖を曝露するのに必 要）の相乗作用を含むという大きな欠点を有する（Bar-Ner et al，1985，1986; Benezra et al，1992;Vlodavsky et al，1988）。さらにそのうえ、大部分のヘ パラナーゼアッセイは、ゲル濾過による基質からの分解生成物の分離を可能にす るために放射性標識ＨＳ（またはＥＣＭ由来のＨＳＰＧ）のかなりの程度の分解 を必要とするが（Bartlett et al，1995;Klein and Von Figura，1979;Nakajima et al，1986a;Vlodavsky et al，1992）、単一部位でのＨＳ鎖の開裂が、白血 球および腫瘍細胞の基底膜通過に必要なもののすべてである可能性がある。固相 ヘパラナーゼアッセイも開発され、化学的および生合成的に放射性標識されたヘ パリンおよびＨＳ鎖が固体支持体に結合され、固体支持体からの放射性標識の遊 離が酵素活性の測定値となるものであった（Nakajima et al，1986a;Oosta et a l，1982;Sewell et al，1989）。しかしながら、かかるアッセイは、哺乳動物ヘ パラナーゼ酵素は固定化基質にアクセスしにくい可能性があり、基質の還元末端 を介する放射性標識基質の固体支持体へのカップリングは複雑かつ非効率的な手 順であるという欠点を有する。以前の研究もまた、本来的に存在するグルコサミ ン残基におけるヨウ素化（Oosta et al，1982）または部分的に脱Ｎ−硫酸化さ れた基質のＮ−アセチル化（Nakajima et al，1986a）によりヘパリンおよびＨ Ｓの両方を放射性標識していた。しかしながら、かかる手順はヘパラナーゼ開裂 部位のマスキングまたは新たなヘパラナーゼ開裂部位の創製を引き起こす可能性 がある。 発明の概要 １の態様において、本発明は、哺乳動物組織、細胞または体液のごとき試料中 の哺乳動物ヘパラナーゼ活性の検出方法を提供する。 この態様によれば、本発明は、下記工程： （ｉ）試料中のヘパラナーゼがヘパラナーゼ基質を分解するのに十分な条件下 で試験試料をヘパラナーゼ基質と一定時間接触させ； （ｉｉ）未分解または部分分解ヘパラナーゼ基質をヘパラン硫酸結合蛋白と結 合させることにより、分解生成物を未分解または部分分解ヘパラナーゼ基質から 分離し；ついで （iｉi）分離された分解生成物を検出してそれを試料中のヘパラナーゼ活性を 示すものとする を含む、試料中の哺乳動物ヘパラナーゼ活性の検出方法を提供する。 この態様において、本発明は、試料中の哺乳動物ヘパラナーゼ活性の検出に使 用するキットも提供し、該キットは仕切られた形態の下記のもの： （ｉ）ヘパラナーゼ基質 （ii）ヘパラン硫酸結合蛋白；および （ｉｉｉ）所望により、上でおおまかに説明した本発明方法を遂行するための 説明書 を含む。 もう１つの態様において、本発明は、哺乳動物ヘパラナーゼ活性、より詳細に はヒト血小板ヘパラナーゼ活性の迅速精製のための新規方法、ならびにこの方法 により調製される精製哺乳動物ヘパラナーゼを提供する。 この態様によれば、本発明は、下記工程： （ｉ）固定化レクチンアフィニティークロマトグラフィーマトリックスにヘパ ラナーゼ活性を結合させるための界面活性剤の存在下で、ヘパラナーゼ含有材料 を固定化レクチンアフィニティークロマトグラフィーマトリックスと接触させ； （ｉｉ）第１の精製ヘパラナーゼ含有フラクションを該マトリックスから溶離 させ； （ｉｉｉ）所望により、該第１の精製ヘパラナーゼ含有フラクションを固定化 金属イオンアフィニティークロマトグラフィーマトリックスと接触させ； （ｉｖ）該第１の精製ヘパラナーゼ含有フラクションを色素−樹脂マトリック スと接触させてヘパラナーゼ活性を該色素−樹脂マトリックスに結合させ；つい で （ｖ）第２の精製ヘパラナーゼ含有フラクションを該色素−樹脂マトリックス から溶離させる を含む、ヘパラナーゼ含有材料からの哺乳動物ヘパラナーゼの精製方法を提供す る。 この態様において、本発明は、上で大まかに説明した方法により調製された実 質的に精製された哺乳動物ヘパラナーゼ、詳細には実質的に精製されたヒト血小 板ヘパラナーゼも提供し、該実質的に精製されたヒト血小板ヘパラナーゼは、ゲ ル濾過クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によれば、生の（ native）分子量（Mr）が約５０ｋＤａであり、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両 方を分解することにおいて特徴づけられる。本発明の実質的に精製されたヒト血 小板ヘパラナーゼは、ゲル濾過分析によれば、ウシ肺およびブタ粘膜ヘパリンを 分解して１２ｋＤａからそれぞれ６ｋＤａおよび４ｋＤａのフラグメントとし、 ブタ粘膜ヘパラン硫酸を段階的に分解して２２ｋＤａから５ｋＤａのフラグメン トとする。 上でおおまかに説明した本発明ヘパラナーゼ精製方法を用いて、ラット肝臓、 ラット１３７６２ＭＡＴアデノカルシノーマ細胞およびヒトＨＣＴ１１６結腸カ ルシノーマ細胞のヘパラナーゼを包含する他のヘパラナーゼを精製してもよい。 実質的に精製されたＭＡＴおよびＨＣＴ細胞のヘパラナーゼは上記ヒト血小板ヘ パラナーゼと同様のＭｒを有するが、実質的に精製されたラット肝臓ヘパラナー ゼは生の分子量約４５ｋＤａを有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて４３ないし４７ ｋＤａの間に３本のバンドを示す。 本明細書全体にわたって、特記しないかぎり、単語「含む(comprise、compris esまたはcomprising)」は記載したものを包含するは、他のものを排除するもの ではない。 発明の詳細な説明 １の態様において、本発明は、特に、ヒト癌患者の血清を包含する血清、なら びに例えばヒト血小板、結腸カルシノーマ細胞、臍静脈内皮細胞およびラット乳 腺アデノカルシノーマ細胞(転移性および非転移性の両方)および肝臓ホモジネー トを包含する種々の組織および細胞ホモジネートまたは抽出物における哺乳動物 ヘパラナーゼ活性の検出に関する。該方法を用いてヒトおよび非ヒト（例えば、 ラットおよびネズミ）の血清、細胞および組織ホモジネートまたは抽出物におけ るヘパラナーゼ活性を測定してもよい。 好ましくは、ヘパラナーゼ基質は標識基質であり、より好ましくは放射性標識 基質である。好ましくは、基質はヘパラン硫酸（ＨＳ）であり、特に好ましい基 質は³Ｈ−ブタ粘膜ＨＳおよび³Ｈ−ウシ腎臓ＨＳである。好ましくは、ブタ粘膜 ＨＳを部分的に脱Ｎ−アセチル化し、³Ｈ-無水酢酸を用いて再Ｎ−アセチル化し て所望放射性標識基質を得る。 上でおおまかに説明したように、試料中のヘパラナーゼ（存在する場合）が基 質を分解するのに十分な条件下で試験試料をヘパラナーゼ基質と一定時間接触さ せる。過度の実験を行わずに適当なインキュベーション時間および条件を容易に 決定できる。例えば、試料と基質とのインキュベーションを、４.２ないし７.５ の範囲のｐＨにおいて、好ましくはｐＨ約５.１において、３５℃ないし４０℃ の範囲の温度において、好ましくは約３7℃において、２ないし４８時間、好ま しくは約１６時間行ってもよい。好ましくは、ウシ血清アルブミン、Ｎ−アセチ ルマンノサミンおよび／またはTriton X-100のごとき界面活性剤の存在下でイン キュベーション工程を行う。後で詳細に説明するように、適当なインキュベーシ ョン時間および条件においてヘパラナーゼ活性は好ましいブタ粘膜ヘパラン硫酸 基質を段階的に分解して２２ｋＤａから１７ｋＤａに、ついで８ｋＤａに、最後 に５ｋＤａのフラグメントまたは分解生成物にする。 未分解または部分分解ヘパラナーゼ基質からの分解生成物の分離を、ヘパラン 硫酸結合蛋白への結合により行う。用語「ヘパラン硫酸結合蛋白」は、ヘパリン 結合蛋白を包含するが、これに限らない。本発明での使用に特に好ましいヘパラ ン硫酸結合蛋白はヒスチジン豊富な糖蛋白である。より好ましくは、ヒスチジン 豊富な糖蛋白（ＨＲＧ）はニワトリＨＲＧであるが、しかしながら、ヒトＨＲＧ を包含する他のＨＲＧを用いてもよい。しかしながら、本発明は、例えば、アン チスロンビン１１１およびヘパリンコファクター１１のごときプロテアーゼ阻害 剤；アポリポ蛋白Ｂ−１００およびアポリポ蛋白Ｅのごとき血漿リポ蛋白；酸性 および塩基性繊維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、肝細胞増殖因子および血 小板由来増殖因子のごとき増殖因子；ラミニン、コラーゲンおよびエラスチンの ごとき細胞外マトリックス蛋白；リポ蛋白リアーゼ、スーパーオキサイドジスム ターゼ、カテプシンＧ、エラスターゼおよび細菌ヘパリンリアーゼ１、１１およ び１１１のごとき酵素；ならびに血小板因子４、von Willebrand因子およびβ− スロンボグロブリンのごとき他の適当な結合蛋白を包含する、ＨＲＧ以外の他の ヘパラン硫酸結合蛋白およびヘパリン結合蛋白の使用も含む。また本発明は、ヘ パラン硫酸結合領域またはヘパリン結合領域を含むこれらのヘパラン硫酸結合蛋 白またはヘパリン結合蛋白由来、特にＨＲＧ由来のペプチドも含む。 好ましくは、固定化ヘパラン硫酸結合蛋白に結合させることにより分離を行う 。いずれの適当な固定化方法を用いてもよいが、アガロースビーズに、より好ま しくはセファロースビーズに固定化することによりＨＲＧまたは他の適当な結合 蛋白を固定化するのが目下のところ好ましい。この好ましい態様において、ＨＲ Ｇ−セファロースビーズをカラムに入れ、インキュベーション混合物を添加し、 カラムを洗浄して未分解または部分分解ヘパラナーゼ基質を結合させるが、分解 生成物は結合しないか、またはＨＲＧ−セファロースビーズにより弱く結合する 。別法として、ＨＲＧまたは他の適当な結合蛋白をインキュベーション混合物に 添加して未分解または部分分解ヘパラナーゼ基質複合体に結合させ、ついで、例 えば基材（例えばImmobilonまたはStrataClean）に固定化することにより複合体 を分離し、例えば遠心分離または濾過により固定化複合体を除去した後、インキ ュベーション混合物中の分解されたヘパラナーゼ基質フラグメントを残すように してもよい。 本発明のこの態様の最終工程において、分離された分解生成物を検出し、試験 試料中のヘパラナーゼ活性の存在を示すものとする。この検出工程は、分解生成 物の定量的および／または定性的検出を包含してもよい。³Ｈ−ブタ粘膜ＨＳの ごとき放射性標識ヘパラナーゼ基質を用いる場合、検出工程は未結合分解生成物 の放射活性レベルの検出からなるものであってもよい。 この態様において、本発明は、開裂されたヘパラナーゼ分解生成物のヘパラン 硫酸結合蛋白（ＨＲＧのごとき）、特にニワトリヒスチジン豊富糖蛋白(ｃＨＲ Ｇ)に対する低下したアフィニティーを利用することによる、ヘパラナーゼ基質 から分解生成物を分離するための新規方法を提供する。インキュベーション混合 物をヘパラナーゼ分解生成物に該当する未結合物質とともにｃＨＲＧ−セファロ ースカラムに添加する。ヘパラナーゼ活性は種々のヒト、ラットおよびネズミの 細胞および組織ホモジネートについて決定されている。例えば、非常に転移性の あるラット乳腺アデノカルシノーマおよびネズミ黒色腫細胞系は、非転移性変種 と比較して４ないし１０倍のヘパラナーゼ活性を有しており、ヘパラナーゼ活性 と転移能との関係が確認される。ヒト癌患者は正常な健康成人のレベルの２倍の 血清ヘパラナーゼレベルを有する。 本発明のこの態様は、天然の放射性標識基質に対する哺乳動物ヘパラナーゼ活 性の検出のための新たな簡単かつ迅速な定量アッセイを提供し、該アッセイはイ ンビボで起こる可能性のある最小数のＨＳ鎖の開裂を検出でき、さらに該アッセ イは新規原理、すなわち鎖開裂後のＨＳ鎖上の蛋白結合部位の消失に基づくもの である。該アッセイにおいて、ＨＳ結合蛋白ＨＲＧがＨＳ鎖上のヘパラナーゼ開 裂部位をマスクするという観察結果を利用する。ヘパラナーゼによる開裂後、無 傷および部分分解された基質とは異なり、放射性標識ＨＳフラグメント（生成物 ）はＨＲＧ結合セファロースビーズのミニカラムに結合せず、基質からの開裂生 成物の迅速分離が可能となる。 本発明のこの態様のアッセイは、（ａ）本来の構造を維持しつつ比較的多量の 放射性標識天然基質の調製が容易、（ｂ）多数の試料の迅速かつ同時決定が可能 、および（ｃ）基質の単一部位開裂を検出することによるヘパラナーゼ活性の正 確な定量が可能であることにおいて慣用的なアッセイに優る利点を有する。 もう１つの態様において、本発明は、ヘパラナーゼ含有材料からの哺乳動物へ パラナーゼの精製に関する。本発明方法における出発物質として使用するヘパラ ナーゼ含有材料は哺乳動物ヘパラナーゼ活性のいかなる源であってもよく、例え ば、ヒト結腸カルシノーマＨＣＴ １１６細胞、ラット乳腺アデノカルシノーマ １３７６２ＭＡＴ細胞、またはラット肝臓組織のものであってもよい。しかしな がら、本発明は、ヒト血小板ヘパラナーゼに特に指向され、この材料の便利な源 は、凍結され洗浄されたヒト血小板のホモジネートからの酵素活性の可溶化によ り得られる。 界面活性剤（例えばTriton X-100）の存在下でヘパラナーゼ含有材料を固定化 レクチンアフィニティークロマトグラフィー、好ましくはコンカンバリンＡ−セ ファロースクロマトグラフィーにかけてヘパラナーゼ活性をクロマトグラフィー カラムに結合させる。結合ヘパラナーゼ活性の溶離により第１の精製ヘパラナー ゼ含有フラクションを得る。 最適かつ好ましくは、ついで、ヘパラナーゼ活性を結合しないが他の混入蛋白 を除去する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、好まし くはＺｎ²⁺−キレーティングセファロースのごときマトリックスを用いるクロマ トグラフィーに第１の精製ヘパラナーゼ含有フラクションを供する。ついで、第 １の精製ヘパラナーゼ含有フラクションを色素−樹脂クロマトグラフィー、好ま しくはＩＭＡＣと直列になった色素-樹脂クロマトグラフィーに供してヘパラナ ーゼを再度結合させる。適当な色素−樹脂マトリックスは、Blue-Aアガロースを 包含するが、Reactive Redのごとき他の色素ならびにセファロースおよびアクリ ルアミドのごとき他のマトリックス支持体を用いてもよい。色素−樹脂マトリッ クスからの第２の精製ヘパラナーゼ含有フラクションの溶離の後に、再び混入蛋 白を結合するがヘパラナーゼ活性を結合しないオクチル−アガロースクロマトグ ラフィーを行ってもよい。 第２の精製ヘパラナーゼ含有フラクションの最終精製を、ゲル濾過クロマトグ ラフィー、例えばスーパ−ロース１２クロマトグラフィーにより行ってもよく、 その後精製酵素を濃縮してもよい。 上記のように、本発明のこの態様により得られる生成物は実質的に精製された 哺乳動物ヘパラナーゼであり、詳細には、実質的に精製されたヒト血小板ヘパラ ナーゼである。本明細書の用語「実質的に精製」は、生成物が精製手順に供され て、ヘパラナーゼ含有出発材料の活性と比較した場合、ヘパラナーゼ酵素活性が 少なくとも１０００倍、好ましくは少なくとも１５００倍になっていることをい う。 また好ましくは、実質的に精製された哺乳動物ヘパラナーゼは均一であり、本 来の形態において通常共存している他の蛋白に対して好ましくは少なくとも７５ 重量％、さらにより好ましくは少なくとも８５重量％、最も好ましくは少なくと も９５〜９９重量％のヘパラナーゼ酵素を含有する。 本発明の個の態様によれば、前以て凍結され洗浄された血小板からヒト血小板 ヘパラナーゼが均一にまで精製された。ヒト血小板は、蛋白１ｍｇあたりの活性 として表した場合、転移性腫瘍細胞および他の細胞タイプと比較して非常に多量 のヘパラナーゼ活性を含有することが示された。 後で実施例において詳述する本発明のこの態様の１の具体例において、ヒト血 小板ヘパラナーゼは、コンカナバリンＡ−セファロース、Ｚｎ²⁺−キレーティン グセファロース、Blue A-アガロース、オクチル−アガロースおよびゲル濾過ク ロマトグラフィーからなる５つのカラム手順により１９％の収率で均一に１９０ ０倍にまで精製された。同じ精製手順を用いて他の哺乳動物ヘパラナーゼ活性を 、例えばヒト結腸カルシノーマＨＣＴ １１６細胞、ラット乳腺アデノカルシノ ーマ１３７６２ＭＡＴ細胞およびラット肝臓から精製することができる。ヘパリ ンおよびＨＳの両方を分解するヒト血小板ヘパラナーゼは、ゲル濾過クロマトグ ラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合、５０ｋＤａの生の分子量 を有していた。該酵素はブタ粘膜ＨＳを段階的に分解し、２２ｋＤａから１７ｋ Ｄａ、１０ｋＤａに、最後に５ｋＤａのフラグメントにし、その一方ではウシ肺 およびブタ粘膜ヘパリンは、ゲル濾過分析によれば１２ｋＤａからそれぞれ６ｋ Ｄａおよび４ｋＤａのフラグメントにまで分解された。 本発明のさらなる詳細は、説明のためのものであり本発明を限定しない後記実 施例における詳細な説明、ならびに添付図面から明かであろう。 図面の説明： 図１：ＨＳの分解をインキュベーションpＨの関数として示す。ｐＨ４.２（〇 ）、５.１（□）、６.５（△）および７.５（▲）において、また酵素を添加せ ずにｐＨ５.１において（■）、ラット１３７６２ＭＡＴホモジネートとともに ＨＳを３７℃で１６時間インキュベーションした。インキュベーション混合物を スーパーロース−６ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。Ｍｒ標準物質 はａ）１６.７、ｂ）１０.６、ｃ）６.７、ｄ）３．１およびｅ）０.２ｋＤａで ある。詳細については方法のセクション参照。 図２：ＨＳの分解をインキュベーション時間の関数として示す。３７℃、ｐＨ ５.１において、ＨＳをラット１３７６２ ＭＡＴホモジネートとともに２時間( △)、４時間（▲）、１６時間（□）インキュベーションし、さらに酵素を添加 せずに４時間(■)インキュベーションした。インキュベーション混合物をスーパ ーロース−６ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。Ｍｒ標準物質ａ〜ｅ は図１の説明と同じ。詳細については方法のセクション参照。 図３：転移性および非転移性ラット乳腺アデノカルシノーマ細胞系によるＨＳ の分解を示す。３７℃、ｐＨ５.１においてＨＳを酵素無添加で（■）、非転移 性変種ＤＭＢＡ−Ｓａｓｋのホモジネートとともに（□）、１３７６２ ＭＡＴ （j-クローン）とともに（▲）、非常に転移性のある１３７６２ ＭＡＴおよび ＤＭＢＡ−８Ａ細胞系とともに（△）インキュベーションしたものを便利ののた めに示す。インキュベーション混合物をスーパーロース−６ゲル濾過クロマトグ ラフィーにより分画した。Ｍｒ標準物質ａ〜ｅは図１の説明と同じ。詳細につい ては方法のセクション参照。 図４：ＨＳの分解をインキュベーション時間の関数として示し、ｃＨＲＧ−セ ファロースに対する消化ＨＳ生成物のアフィニティーを示す。３７℃、ｐＨ５. １において２時間（□）、４時間（△）、１６時間（▲）、また、酵素を添加せ ずに４時間（■）ＨＳをインキュベーションした。インキュベーション混合物を ＰＢＳ中のｃＨＲＧ−セファロースカラムに添加し、ＰＢＳで洗浄し、 ＮａＣｌグラジエントにより溶離した。矢印はＮａＣｌグラジエントの開始を示 す。−はＮａＣl濃度である。詳細については方法のセクション参照。 図５：ｃＨＲＧによるＨＳ分解の阻害を示す。３７℃、ｐＨ５.１において、 酵素無添加またはｃＨＲＧ不存在下で（■）、３：１（ｃＨＲＧ：ＨＳ）モル比 のｃＨＲＧの存在下（△）および不存在下（▲）において、ＨＳをラット１３７ ６２ＭＡＴ細胞ホモジネートとともに８時間インキュベーションした。インキュ ベーション混合物をスーパーロース−６ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画 した。Ｍｒ標準物質ａ〜ｅは図１の説明と同じ。詳細については方法のセクショ ン参照。 図６：ＨＳの分解をインキュベーション時間の関数として示す。３７℃、ｐＨ ５.１において２時間（□）、４時間（▲）、６時間（△）、８時間（●）およ び１０時間（〇）、また酵素を添加せずに４時間（■）、ＨＳをラット１３７６ ２ＮＡＴホモジネートとともにインキュベーションした。インキュベーション混 合物を分割し、Ａ）セファロース６ゲル濾過クロマトグラフィーおよびＢ）ｃＨ ＲＧ−セファロースカラムへの結合により分画し、未結合フラクションを各時点 において調べた。Ｍｒ標準物質ａ〜ｅは図１の説明と同じ。詳細については方法 のセクション参照。 図７：ヒト血小板ヘパラナーゼのスーパーロース１２クロマトグラフィーを示 す。工程４からの血小板ヘパラナーゼを方法のセクションに記載のごとくゲル濾 過することにより精製した。ヘパラナーゼ活性(○)についてフラクションをアッ セイし、蛋白（−Ａ₂₈₀）をモニターした。矢印１および２はそれぞれウシ血清 アルブミンおよびオボルブミンについてのＶｅを示す。 図８：精製ヒト血小板ヘパラナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。工程５の精製 血小板ヘパラナーゼをジチオスレイトールで還元し、１０％ポリアクリルアミド ゲルにおいて電気泳動した。実験の詳細については方法のセクション参照。レー ン１はＭｒ標準物質；レーン２は工程５のヘパラナーゼである。 実施例１ 使用略号は以下のとおり：ｂＦＧＦは塩基性繊維芽細胞増殖因子；ＢＳＡはウ シ血清アルブミン；ｃＨＲＧはニワトリヒスチジン豊富糖蛋白；ＣＮＢｒは臭化 シアン;ＣＲ−ＨＳはカルボキシル−還元ヘパラン硫酸;ＥＣＭは細胞外マトリッ クス；ＧｌｃＡはグルクロン酸；ＧｌｃＮＡｃはＮアセチル化グルコサミン；Ｇ ｌｃＮＳはＮ−硫酸化グルコサミン;ＧｌｃＮＳ３ＳはグルコサミンＮ,３−ジ硫 酸；ｈＨＲＧはヒトヒスチジン豊富糖蛋白；ＨＲＧはヒスチジン豊富糖蛋白；Ｈ Ｓはヘパラン硫酸；ＨＳＰＧはヘパラン硫酸プロテオグリカン；ＨＵＶＥＣはヒ ト臍静脈内皮細胞；ＩｄｏＡ２Ｓはイジュロン酸２−硫酸；ＮＡＭはＮ−アセチ ルマンノサミン；ＰＢＳはリン酸塩緩衝化セイラインである。 Ｉ−材料 １６.７、１０.６、６.７および３.１ｋＤａのヘパリン由来の分子量（Ｍｒ_{av e} ）標準は親切にもNova Nordisk(Gentofte，Denmark)から贈られた（Kristensen et al，1991参照）。ブタ粘膜ＨＳ（ＯＲＧ ５５３）は親切にもOrganon Int.B ，(Oss,The Netherlands)から贈られた。Pharmacia Fine Chemicals(Uppsala，S weden)からＰＤ−１０カラム、ＤＥＡＥ−セファロースおよび臭化シアン活性化 セファロース４Ｂを得た。Sigma Chemical Co．(St Louis，MO)から結晶ウシ血 清アルブミン、ウシ肺ヘパリン、コンドロイチンＡＢＣ−リアーゼ、ヒドラジン 水和物およびヒドラジン硫酸を得た。トルエン溶液中³Ｈ−無水酢酸（５００ｍ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をAmersham International(Sydney，Australia)から得た。Bec kmann(Gladesville，Australia)からReady Safeシンチレーション液を得た。Dow ex AG50W-X8（１００〜２００メッシュ；Ｈ⁺型）をBio-Rad Laboratories(Richm ond，CA)から得た。 下記の細胞系を培養し、以前に記載されているようにして細胞を集めた：転移 性ヒト結腸カルシノーマＨＣＴ １１６（Schlechte et al，1989）およびＫＭ １２ ＳＭ（Morikawa et al，1988）；転移性ネズミ黒色腫Ｂ１６−Ｆ１０、非 常に転移性のある１３７６２ＭＡＴおよびＤＭＢＡ−８Ａラット乳腺アデノカ ルシノーマ、ならびにそれらの非転移性変種Ｊ−クローンおよびＤＭＢＡ−Ｓａ ｓｋ（Parish et al，1992）；ヒト臍静脈内皮細胞およびマクロファージ細胞系 Ｕ９３７（Bartlett et al，1995）；ヒト平滑筋、ヒト配列番号：繊維芽細胞お よびヒトケラチノサイト細胞系（ＫＪＤ）。Bartlett et al，(1995)の方法によ りヒト血小板を得た。ネズミLewis肺カルシノーマ（転移性（Ｄ１２２）および 非転移性（ＬＬＣ）変種）およびネズミ肺カルシノー細胞系（転移性（Ａ３ａ） および非転移性（ＳＰ１）変種）を、親切にもそれぞれJames W.Dennis博士，Sa muel Lunenfeld Research Institute，Mount Sinai Hospital，Toronto，Canada およびLea Eisenbach博士，Department of Immunology，The Weizmann Institut e of Science，Rehovot，Israelから贈られた。これらの細胞系の細胞ペレット を、Robin Anderson博士，Peter MacCallum Cencer Institute Melbourne，Aust raliaにより凍結状態（−８０℃）で得た。１０⁶個の細胞または１０⁸個の血小 板（前以て標準セイラインで洗浄してある）を０.２ｍｌの０．１％（ｖ：ｖ）T riton X-100水溶液に懸濁し、ついで、ドライアイス／エタノール混合物中で凍 結し、ついで融解することを３回繰り返して破壊することにより細胞ホモジネー トを調製した。 １０週齢のFischer F344ラットから新たに切除した肝臓を、０.５Ｍ−ＮａＣ ｌを含有する３倍体積(ｗ:ｖ)の１５ｍＭ−ジメチルグルタル酸バッファー，ｐ Ｈ６.０中でポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ヒト癌患者 由来の血清ならびに腫瘍原性肺組織および隣接正常肺組織の両方を、Royal Nort h Shore Hospital，Sydney，Australaから凍結状態（−８０℃）で得た。上記の ごとく組織を融解し、ホモジナイズした。癌患者および健康なボランティアから の凍結血清を融解し、標準セイラインに対して４℃で１６時間透析した。ＢＳＡ を標準物質として用いてBio-Rad Coomasie蛋白アッセイキット（Bio-Rad Labora tories，Richmond，CA）により蛋白濃度を測定した。 ＩＩ−方法 放射性標識ヘパラン硫酸：粗ブタ腸粘膜ヘパラン硫酸ＯＲＧ５５３（１００ ｍｇ）を２ｍｌのＨ₂Ｏに溶解し、１０ｋＤａカットオフの透析チューブ中、４ ℃において２１の標準セイラインに対して４時間、ついで、２１のＨ₂Ｏに対し て１６時間透析した。透析された溶液を、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび２ユ ニットのコンドロイチンＡＢＣ−リアーゼを含有する２ｍｌの０．１Ｍ−Ｔｒｉ ｓ．ＨＣｌ,ｐＨ８.０と混合し、３７℃で１６時間インキュベーションした。４ ℃において２１のＰＢＳに対してで１６時間透析後、溶液を、ＰＢＳで平衡化し たＤＥＡＥ−セファロースカラム（１.０ｘ６.０ｃｍ）に添加した。カラムをＰ ＢＳ、ついで０.３Ｍ−ＮａＣｌ（各１２ｍｌ）で洗浄し、その後、１０ｍｌの ２Ｍ−ＮａＣｌで溶離し、続いて凍結乾燥した。固体を最小量のＨ₂Ｏに溶解し 、Pharmacia PD-10カラムを用いて脱塩した。ＮａＣｌに先んじて現れる溶離物 （２０％硝酸銀溶液１滴を添加することにより検出）を凍結乾燥して３３ｍｇの 精製ヘパラン硫酸を得た。 精製ヘパラン硫酸（２６ｍｇ）を、ヒドラジン硫酸（２０ｍｇ）を含有するヒ ドラジン水和物（１ｍｌ）中に溶解し、栓をしたガラスバイアル中で混合物を１ ００℃において２時間加熱した。トルエン（１ｍｌ）を添加し、混合物を乾燥さ せ、この手順を２回繰り返した。残渣を２ｍｌの１Ｍ−ＮａＣｌに溶解し、ＰＤ −１０カラムで脱塩し、脱塩した物質をDowex 50X-8（Ｎａ⁺型）カラム（１.０ ｘ６.０ｃｍ）に通し、カラムを１０ｍｌのＨ₂Ｏでさらに洗浄した。一緒にした 素通し画分および洗浄画分を凍結乾燥して１９ｍｇの部分的に脱Ｎ−アセチル化 されたヘパラン硫酸を得た。 脱Ｎ−アセチル化ヘパラン硫酸（１９ｍｇ）を、１０％（ｖ：ｖ）メタノール を含有する１ｍｌの０.５Ｍ−ＮａＨＣＯ₃に溶解し、アイスバスで０℃に冷却し 、０.１ｍｌのトルエン中³Ｈ−無水酢酸（５ｍＣｉ,５００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ） を添加し、混合物を０℃で３時間激しく撹拌した。さらに０.０５ｍｌのメタノ ール、０.１ｍｌのＮａ₂ＣＯ₃および０.０５ｍｌの無水酢酸を添加し、０℃で３ ０分撹拌した。個の手順を２回以上繰り返し、ｐＨがアルカリ性のままであるこ とをチェックし、ついで、酢酸を用いて混合物酸性にしｐＨ４.０とした。混合 物を２２℃まで暖め、窒素その流れの下でトルエンを除去し、１０％（ｖ：ｖ） エタノール水 溶液で平衡化したＰＤ−１０カラムで脱塩し、１０％（ｖ：ｖ）エタノール水溶 液で展開した。³Ｈ−酢酸ピークに先んんじて現れる放射活性物質を凍結乾燥し て２１ｍｇの放射性標識ヘパラン硫酸を得て、これを１０％（ｖ：ｖ）エタノー ル水溶液に溶解して２ｍｇ／ｍｌの濃度とし、−２０℃で保存した。 ヒスチジン豊富糖蛋白−セファロース：ヒワトリヒスチジン豊富糖蛋白（ｃＨ ＲＧ）を、ホスホセルロースイオン交換クロマトグラフィー(Rylatt et al，198 1)によりニワトリ血漿から調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調製物の純度を検 定し、分子量１３５ｋＤａの単一クーマシーブルー染色バンドを検出した。その 物質を濃縮して蛋白濃度２ｍｇ／ｍｌとし、ＰＢＳに対して透析し、使用まで− ２０℃で保存した。 ウシ肺ヘパリン（５０ｍｇ）を、１０％（ｖ：ｖ）メタノールを含有する１０ ｍｌの０.５Ｍ−ＮａＨＣＯ₃に溶解し、４℃まで冷却し、ついで、０.０４ｍｌ の無水酢酸を５分間隔で５回添加した。１Ｍ−Ｎａ₂ＣＯ₃を用いてｐＨを８.０ 以上に維持した。混合物をさらに３０分撹拌し、ついで、アセチル化ヘパリンを 、０.１５Ｍ−ＮａＣｌを含有する１Ｍ−ＮａＨＣＯ₃（カップリングバッファー ）５１に対して４℃で１６時間透析した。 ｃＨＲＧ（１０ｍｇ）を２１のカプリングバッファーに対して４℃で１６時間 透析し、上で調製したアセチル化ヘパリン溶液と４℃で３０分混合して、セファ ロースビーズに対するｃＨＲＧのＨＳ結合部位のカップリングを防止した。臭化 水素（ＣＮＢｒ）活性化セファロース４Ｂ（２ｇ）を５０ｍｌの１ｍＭ-ＨＣｌ 中で３０分膨潤させ、ついで、減圧しながら焼結漏斗中で１５０ｍｌの１ｍＭ− ＨＣｌで洗浄し、ついで、２０ｍｌのカップリングバッファーで洗浄した。洗浄 されたＣＮＢｒ−セファロースを即座にヘパリン−ｃＨＲＧ溶液に添加し、４℃ で２４時間おだやかに撹拌した。カップリングバッファー中２Ｍ−エタノールア ミン溶液４ｍｌ（１Ｍ−ＨＣｌでｐＨ８.０に調節）を添加し、さらに１６時間 おだやかに撹拌した。スラリーをクロマトグラフィーカラム（１.５ｘ５.０ｃｍ ）中に注ぎ、４℃においてカップリングバッファー、２Ｍ−ＮａＣｌ含有０.０ ５Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー,ｐＨ８.０、最後にＰＢＳで（各５０ｍｌ） 順次 洗浄した。ｃＨＲＧ−セファロースをＰＢＳ中４℃で保存した。カップリングに より、１ｍｌのビーズあたり０.８ｍｇの蛋白の結合濃度となり、それぞれ６.２ ｎｍｏｌおよび３.１ｎｍｏｌの放射性標識肺ヘパリンおよびＨＳが結合された 。 ヘパラナーゼアッセイ：ｃＨＲＧ−セファロースビーズ(０.２ｍｌベッドのカ ラム)を、グラスウールで栓をした使い捨ての１ｍｌシリンジ中に詰め、そのミ ニカラムを、氷浴中に立てた１０ｍｌの遠心チューブ中に入れた。使用前にカラ ムを１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。すべてのカラム手順を氷上で行った。 ヘパラナーゼ活性をアッセイするために、５ｍＭ-Ｎ−アセチルマンノサミン および０.１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する０.０５Ｍ−酢酸ナトリウムバッファ ー，ｐＨ５.１中の９０ｐｍｏｌの放射性標識ＨＳからなるインキュベーション 混合物に２μｌまでの試料を添加して全体積２０μｌとして３７℃で適当時間イ ンキュベーションした。チューブを凍結することにより反応を停止させ、０.３ ｍｌの冷ＰＢＳを添加し、必要ならば４℃で溶液を遠心分離し、ついで、０.１ ｍｌの試料を、ＰＢＳで前以て平衡化しておいたｃＨＲＧ−セファロースミニカ ラムに添加した。カラムを０.７ｍｌのＰＢＳで洗浄し、洗浄液および素通し画 分をシンチレーションバイアルに移し、１０ｍｌのシンチレーション液を添加し 、放射活性を測定した。蛋白１ｍｇまたは細胞１０⁶個または血清１ｍlあたり１ 時間で得られる生成物のｐｍｏｌ数として酵素活性を示した。２Ｍ−ＮａＣｌを 含有する１ｍｌの０.０５Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー,ｐＨ７.５、ついで ＰＢＳで平衡化することによりｃＨＲＧ−セファロースカラムを再生させた。 ｐＢＳで平衡化し、ついでＰＢＳで展開するスーパーロース６ＨＲ１０／３０ カラム（Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden）によるインキュベー ション混合物のゲル濾過クロマトグラフィーによってもヘパラナーゼ活性を検出 した。Pharmacia FPLCシステムを０.２５ｍｌ／分の流速で作動させ、０.５ｍｌ のフラクションをシンチレーションバイアル中に直接集め、これに３ｍｌのシン チレーション液を添加し、放射活性を測定した。³Ｈ−Ｎ−アセチルグルコサミ ン（２２１Ｄａ）、ウシ肺ヘパリン（１２.５ｋＤａ）およびヘパリン由来のＭ ｒ標準物質（１６.７、０１.６、６.７および３.１ｋＤａ）（放射性 標識ＨＳを調製するために上記のごとく部分的に脱Ｎ−アセチル化され、³Ｈ− 無水酢酸で再Ｎ−アセチル化されている）を用いてカラムをキャリブレーション した。放射性標識コンドロイチン−６−硫酸およびカルボキシル−還元ＨＳ（Ka ramanos et al，(1988)の方法により調製）も上記方法により調製した。 ｃＨＲＧ−セファロースへのＨＳの結合：２００μｌのＰＢＳ中の試料を、４ ℃でＰＢＳで平衡化したｃＨＲＧ−セファロースのミニカラム（０.５ｘ４.０ｃ ｍ）に添加した。カラムを２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳおよび１.２Ｍ−Ｎ ａＣｌを含有する１０ｍＭ−リン酸ナトリウムバッファー,ｐＨ７.２の直線的グ ラジント（２ｘ１０ｍｌ）で、０.５ｍｌ／分の流速で展開して溶離し、０.５ｍ ｌのフラクションをシンチレーションバイアル中に直接集め、これに４ｍｌのシ ンチレーション液を添加し、放射活性を測定した。さらなる使用のためにカラム をＰＢＳで再平衡化した。 ＩＩＩ−結果および議論 放射活性ヘパラナーゼ基質の調製 ヘパリンまたはＨＳに対するヘパラナーゼ活性に関する以前の研究は、放射ヨ ウ素化を可能にするために結合試薬を用いるもの（Oosta et al，1982）（潜在 的な開裂部位をマスクする可能性があった）、あるいは先に脱Ｎ−硫酸化された ＨＳを放射性標識無水酢酸でアセチル化するもの(Nakajima et al,1986a)であっ た。しかしながら、報告されたように、後者の方法は、基質の見かけのＭｒなら びにヘパリン中に生じるヘパラナーゼ感受性結合の双方に影響を及ぼし、該感受 性結合はネズミＢ１６黒色腫ヘパラナーゼ活性に耐性があることが示された（Na kajima et al，1986a）。種々の生物学的試料中のヘパラナーゼ活性の測定のた めの放射性標識された生物学的に活性のある天然基質の製造を確実にするために 、精製ブタ粘膜ＨＳを部分的に脱Ｎ−アセチル化し、ついで、³Ｈ−無水酢酸で 再Ｎ−アセチル化して比活性１６５０ないし２０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌとし、¹⁴ Ｃ標識ＨＳに関して以前報告されたもの（Nakajima et al，1986a）の１００倍 にも達した。この標識方法は、新たな開裂部位または変化した開裂部位を基質 に導入しないという大きな利点がある。基質を１０％（ｖ：ｖ）エタノール水溶 液中−２０℃で保存し、凍結融解を繰り返したにもかかわらず、基質は検知可能 な分解産物を生じることなく１年以上安定であった。Hahnenberger et al（1993 ）によりすでに単離されているブタ粘膜ＨＳは２２ｋＤａのＭｒ_aveを有し、重 合度２ないし１６のヘパリチナーゼ耐性サッカライドを含み、ｂＦＧＦ活性を媒 介するＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ配列に富むことが示されている(Walker et al ，1994)。また、それは重合度６ないし１４〜１６の伸長した硝酸耐性(ＧｌｃＮ Ａｃ含有)配列を有し（J．E．Turnbull未公表観察結果）、それゆえ、ＨＳ種に 典型的な変化した硫酸化および非硫酸化領域を含んでいる。 ＨＳ基質のヘパラナーゼ消化についての分析 新たなヘパラナーゼアッセイを開発できる以前は、放射性標識ＨＳを適当な基 質であると認め、慣用的なゲル濾過を用いて分離して分解生成物を特徴づけるこ とが必須であった。また、この研究に使用するヘパラナーゼ酵素の分解特性を定 義づけることも重要であった。非常に侵入性のあるラット乳腺アデノカルシノー マ１３７６２ ＭＡＴおよびヒト血小板ホモジネートを用いて放射性標識基質の ヘパラナーゼ分解を評価した。なぜなら、腫瘍および血小板由来の酵素は異なる 基質特異性を有し、それぞれ、ＨＳのみ、ヘパリンおよびＨＳの両方を分解する ことが示されていたからである（Nakajima et al，1988）。引き続き起こるヘパ ラナーゼ分解生成物のエキソ酵素による分解を防止するため、５ｍＭ−Ｎ−アセ チルマンノサミン（ＮＡＭ）をインキュベーション混合物に添加して、α−Ｎ− アセチルグルコサミニダーゼ活性による³Ｈ−標識Ｎ−アセチルグルコサミン残 基の遊離を抑制（Hopwood and Elliot，1982）した。 ＮＡＭ存在下、ｐＨ４.２、５.１、６.５および７.５においてＨＳを１３７６ ２ ＭＡＴ細胞ホモジネートとともに３７℃で１６時間インキュベーションし、 反応混合物をゲル濾過クロマトグラフィーにより分析した（図１）。ヘパラナー ゼによる生成物のサイズを一連の放射性標識ヘパリン由来Mr標準物質と比較した 。ｐＨ５.１においてＨＳは最大に分解されて見かけのＭｒ約５ｋＤａの フラグメントを生じ、ｐＨ６.５および７.５においてはそれぞれ見かけのＭｒ８ ｋＤａおよび１６ｋＤａのフラグメントを生じた。ｐＨ４.２における分解速度 はｐＨ６.５における分解速度よりも遅く、段階的であることがあまり明らかで ない分解生成物を生じた。ＨＳを１３７６２ ＭＡＴ細胞ホモジネートとともに ４０時間の長いインキュベーションを行っても、やはりｐＨ６.５および７.５に おいては不完全な分解であった（データ示さず）。高いｐＨ値において異なる酵 素活性が存在するかどうか、あるいは異なる開裂部位が生じるのかどうかを調べ るために、ｐＨ５.１、６.５および７.５における１６時間インキュベーション 後の分解生成物をそれぞれ集め、脱塩し、ｐＨ５.１または６.５のいずれかにお いて新鮮ホモジネートとともにさらに１６時間インキュベーションした。それぞ れの場合において、各試験フラグメントは最小サイズである５ｋＤａにまで分解 されていた（データ示さず）。ヘパラナーゼ消化による５ｋＤａの生成物のＤＥ ＡＥ−セファロースに添加したところ、０.３Ｍ−ＮａＣｌ存在下でさえもすべ ての放射活性が結合したままであり、ヘパラナーゼ消化により生じるすべてのＨ Ｓフラグメントが高度に硫酸化されたＨＳドメインを含むことが示された。 ｐＨ５.１における１３７６２ ＭＡＴ細胞ホモジネートとＨＳとの２、４およ び１６時間のインキュベーションの経時変化によっても、やはり明らかなＨＳの 段階的分解が示され、２２ｋＤａから１６ｋＤａ、８ｋＤａそして最後に５ｋＤ ａへの３段の明らかな開裂が示された。ｐＨ５.１、６.５または７.５における １６時間インキュベーション後、コンドロイチン−６−硫酸またはカルボキシル −還元ＨＳ（ＣＲ−ＨＳ）に対する活性は検出されなかった（結果示さず）。同 様に、ヒト血小板ホモジネートのヘパラナーゼ活性は、ＣＲ−ＨＳには作用しな かったが、ＨＳを消化して５ｋＤａのフラグメントとし、そのフラグメントは０ .３Ｍ−ＮａＣｌ中においてＤＥＡＥ−セファロースに保持された。非常に転移 性のあるヒト結腸カルシノーマＨＣＴ １１６およびＫＭ１２−５ＳＭ系、ヒト 臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、マウス黒色腫Ｂ１６−Ｆ１０細胞およびラット 肝臓抽出物を包含する種々の細胞系から得たホモジネートはすべて、１６時間の インキュベーションの過程でＨＳを加水分解して１７ｋＤａ、８ｋＤａ、そして 最後に５ｋＤａのフラグメントにすることがゲル濾過分析により示され（結果示 さず）、各細胞系におけるヘパラナーゼ活性がＨＳを同様のサイズの生成物に分 解することが示された。以前には、ヒト血小板、ＨＵＶＥＣ、リンパ球、好中球 および白血球のウシ内皮ＥＣＭ結合ＨＳＰＧに対するヘパラナーゼ活性もまた、 同様のサイズのＨＳ消化最終生成物を生じることが示されていた(Vlodavsky et al，1992)。 非常に転移性のあるラット１３７６２ＭＡＴおよびＤＭＢＡ−８Ａ細胞系およ び非転移性変種Ｊ−クローンおよびＤＭＢＡ−Ｓａｓｋの抽出物とＨＳとのイン キュベーションを行ったところ、１３７６２ ＡＴおよびＤＭＢＡ−８Ａヘパラ ナーゼ活性によりＨＳは５ｋＤａフラグメントへと完全に分解されたが、Ｊ−ク ローンおよびＤＭＢＡ−Ｓａｓｋ抽出物はＨＳを部分的に分解して、それぞれ見 かけ上８ｋＤａおよび１７ｋＤａのフラグメントを生じるのみであった（図３） 。以前には、基底膜透過性アッセイにおいて、非常に転移性のある１３７６２ ＭＡＴおよびＤＭＢＡ−８Ａ細胞系は、Ｊ−クローンおよびＤＭＢＡ−Ｓａｓｋ 変種よりも人工基底膜に対する活性のほうが強力であることが示されており（Pa rish et al，1992）、それゆえ、転移能とヘパラナーゼ活性との関連性が確認さ れる（Nakajima et al，1983）。 それゆえ、ブタ粘膜ＨＳが、種々の細胞タイプ、血小板および組織抽出物にお けるヘパラナーゼ活性の検出、ならびに腫瘍細胞のヘパラナーゼ含量および転移 能の評価に適した天然基質であるといえる。しかしながら、開裂部位が多数ある ことにより、未消化基質からの生成物の分離方法としてのゲル濾過の使用は、正 確なヘパラナーゼ活性の定量を困難なものとする。その理由は、特に、多数部位 での開裂は生成物からの基質の分離を必要とするからである。さらに、個々の開 裂の相対速度が同様なものであるかどうか、あるいは消化の最初の生成物が生成 物阻害によりさらなる開裂を阻害して、研究された大部分のＨＳ分解エキソ−活 性（Freeman and Hopwood，1986，1987，1989a，1989b）に関して観察されてい る時間に対するアッセイの直線性の欠如を引き起こしうるかどうかについては知 られていない。時間および労力を伴うヘパラナーゼ活性の定量性の欠如は、ゲル 濾 過分析による単一試料の分析を必要とし、そのことは最小箇所の基質開裂を検出 しうる迅速な定量的ヘパラナーゼアッセイに対する必要性を明示する。 定量的ヘパラナーゼアッセイの開発 アンチスロンビンＩＩＩ、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、 血小板因子４、β−スロンボグロブリンおよびヒスチジン豊富糖蛋白（ＨＲＧ） のごときＨＳ結合蛋白およびヘパリン結合蛋白のＨＳとの相互作用は十分に説明 されているが（Jackson et al，1991）、化学的消化（主として硝酸による分解 ）または細菌ヘパラナーゼおよびヘパリチナーゼ消化後のＨＳ分子上のそれらの 蛋白の結合モチーフを決定するためのより最近の試みがある(Turnbell and Gall agher，1990，1991;Turnbell et al，1992;Walker et al，1994)。しかしながら 、哺乳動物ヘパラナーゼがＥＣＭから活性ｂＦＧＦを遊離させうるということ（ Ishai-Michaeli et al，1990）は別として、哺乳動物ヘパラナーゼ分解後のＨＳ 結合蛋白とＨＳとの相互作用についての研究はほとんど公表されていない。 豊富な血漿由来のＨＳ結合蛋白であるニワトリＨＲＧ（ｃＨＲＧ）とＨＳとの 相互作用を調べている間に、ｃＨＲＧはＨＳ鎖上の哺乳動物ＭＡＴ細胞のヘパラ ナーゼ開裂部位をマスクするのみならず、ヘパラナーゼによるＨＳの分解後にＨ Ｓ上のｃＨＲＧ結合モチーフが消失することが観察された。それゆえ、ヘパラナ ーゼ消化後に、開裂されたＨＳフラグメントがｃＨＲＧ結合セファロースビーズ にあまり強くない結合をし、ヘパラナーゼ消化生成物からのＨＳ基質の分離のた めの有効かつ新規な方法の開発が可能となった。 ＨＳをｃＨＲＧ−セファロースカラムに添加し、ｐＨ７.２における塩グラジ エントにより溶離した場合、比較的弱く結合しているＨＳは０.２７Ｍ−ＮａＣ ｌにより溶離されたが(図４)、肺ヘパリンは０.６Ｍ−ＮａＣｌにより溶離され た(結果示さず)。しかしながら、１３７６２ ＭＡＴ細胞ホモジネートによるＨ Ｓ完全消化後の５ｋＤａフラグメントはｃＨＲＧ−セファロースに結合しなかっ た。ついで、ｐＨ５.１で２、４および１６時間の標準アッセイを用いてＨＳを １３７６２ ＭＡＴ細胞のヘパラナーゼにより分解した場合、アッセイ混合物を ３ つに分割し、ゲル濾過クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファロースへの結合お よびｃＨＲＧ−セファロースへの結合により分析した。ゲル濾過分析は図１と同 様のプロファイルを生じ、生成物はそれぞれ１７ｋＤａ、８ｋＤａ、５ｋＤａで あった。アッセイ混合物をｃＨＲＧ−セファロースカラムに添加し、ついで、塩 グラジエントにより放射性標識ＨＳ生成物をｃＨＲＧ−セファロースカラムから 溶離させたところ、ゲル濾過によるＨＳフラグメントの見かけのＭｒの減少がｃ ＨＲＧ−セファロースに結合しない物質の増加に対応することが示され(図４)、 ヘパラナーゼ消化後にＨＳ上のＨＲＧ結合モチーフが消失することが示された。 インキュベーション時間中、ＣＨＲＧ−セファロースカラムに対する結合ＨＳフ ラグメントのアフィニティーの明らかな変化はなかった。ｃＨＲＧ−セファロー スへのＨＳの結合(ならびにゲル濾過分析中のＨＳの見かけのＭｒ)は、バッファ ーのみ、０.１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、熱不活性化酵素、または４℃でＨＳとともに クロマトグラフィーに供された活性酵素を含有するアッセイブランクによっては 影響されなかった（結果示さず）。インキュベーション混合物をＤＥＡＥ−セフ ァロースに添加した後、０.３Ｍ−ＮａＣｌ存在下ですべての放射活性は結合し たままであり、消化生成物がいくぶんかのエンド−スルファターゼ活性による脱 硫酸（Bartlett et al，1995;Dawe and Pepper，1992;Wells and Dawes，1995） によるものではないことが示された。 ＨＲＧへのＨＳの結合がヘパラナーゼ感受性開裂部位においてあるいはその近 傍において起こるかどうかを調べるために、モル比３：１のｃＨＲＧ：ＨＳの不 存在下および存在下でＨＳを１３７６２ ＭＡＴ細胞ホモジネートで消化した（ ＨＳは３つの潜在的な開裂部位を有すると思われ、それぞれがＨＲＧ分子に結合 するかもしれない）。図５は、基質が完全には分解されなかったｃＨＲＧ不存在 下における開裂と比較すると、ｃＨＲＧの存在下においてＨＳの分解速度（小型 （５ｋＤａ）フラグメントを生じる）が有意に低下したことを示す。 ヘパラナーゼ活性の測定 ｃＨＲＧ−セファロースアッセイを用いて、ｐＨ５.１において最大ヘパラナ ー ゼ活性が観察され（結果示さず）、先のゲル濾過による分析（図１）と同様であ った。ＮＡＭをインキュベーション混合物に添加して、エキソ−グリコシダーゼ による³Ｈ−ＧｌｃＮＡｃ（ｃＨＲＧ−セファロースに結合しないであろう）の 遊離を抑制した。ｃＨＲＧ−セファロースに対するＨＳおよび消化生成物のアフ ィニティーは、最終濃度０.１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０.１％（ｖ：ｖ）Triton X- 100または０.２ＭまでのＮａＣｌを含有するインキュベーション混合物によって は影響されなかった。しかしながら、組織ホモジネートのヘパラナーゼ活性は、 ０.１％ Triton X-100の存在下で２倍にまで上昇した。対照的に、可溶性ヘパラ ナーゼ活性（遠心分離により膜を除去した後）は、ＢＳＡまたはTriton X-100を インキュベーション混合物に添加しても影響を受けなかったが、高度に精製され た酵素標品は、最適活性および安定性を得るためにはインキュベーション混合物 中にＢＳＡが存在することを必要とした。高度に精製された酵素の最適活性の決 定のためのＢＳＡの必要性、ならびに組織ホモジネートの最大活性のためのTrit on X-100の必要性が、ＨＳ分解性エキソ−酵素活性の測定に関してたくさん報告 されている（Freeman and Hopwood，1986，1987，1989a,b，1992）。通常どおり ｃＨＲＧ−セファロスカラムを高塩濃度により溶出し、ＰＢＳで再平衡化した。 カラムをＰＢＳ中、４℃で保存し、カラムは結合能の検出可能な低下なしに２年 間にわたり一定して使用可能であった。 図６は、１３７６２ ＭＡＴホモジネートのヘパラナーゼによるＨＳ消化後の 見かけのＭｒの変化（図６Ａ）を、インキュベーション混合物をｃＨＲＧ−セフ ァロースに添加後の未結合放射活性ＨＳフラグメントの出現（図６Ｂ）と比較す るものである。６時間インキュベーション後のｃＨＲＧ−セファロースに結合し ない物質のゲル濾過分析により、見かけのＭｒ１７ｋＤａが示された(結果示さ ず)。ｃＨＲＧ−セファロース分析により決定された酵素活性は時間に関して１ ０時間までのインキュベーションについて直線的であり、基質から生成物への変 換率３０％まで直線的であった（図６Ｂ）。延長されたインキュベーション（２ ４時間）後、放射活性の８４％がｃＨＲＧ−セファロースカラムを通過し、見か けのＭｒは５ｋＤａであった。カラムに結合したままである物質は、おそらく、 高ア フィニティーＨＲＧ結合モチーフを含んでいたか、あるいはヘパラナーゼ耐性で あっただろうが、その現象については検討しなかった。一般的には、ｃＨＲＧ− セファロースに結合しないバックグラウンド物質は低いＭｒ、６ｋＤａ未満であ り、ブタ粘膜からのＨＳの単離の間に得られた、すでに開裂されたＨＳフラグメ ントであるかもしれない。ｃＨＲＧ−セファロースを用いるＨＳ基質を前以てア フィニティー精製するか、あるいは前以てゲル濾過して低いＭｒの種を除去する ことにより、そのフラグメントを除去してもよい。 ｃＨＲＧ−セファロースのかわりにヒトＨＲＧ（ｈＨＲＧ）−セファロースを うまく用いてヘパラナーゼを測定することができる。しかしながら、ＢＡＬＢ／ ｃ ３Ｔ３細胞表面ＨＳＰＧに対するｈＨＲＧの結合アフィニティーはｃＨＲＧ について観察されたものよりも弱く（Brown and Parish 1994）、このことは、 ｈＨＲＧ−セファロースにおいて観察されたものよりも強力なブタ粘膜ＨＳに対 するｃＨＲＧ−セファロースのアフィニティーを反映していた（結果示さず）。 ニワトリＨＲＧは、ｈＨＲＧよりも高い収率で血漿から精製できるというさらな る利点を有する（C．Parish未公表観察結果）。ヘパラナーゼ活性の測定のため に、ブタ腸ＨＳのかわりに市販ウシ腎臓ＨＳ（Ｍｒ １７ｋＤａ）を用いること ができる。対照的に、市販ウシ腸ＨＳをヘパラナーゼ活性測定に使用することは できない。なぜなら、ゲル濾過およびｃＨＲＧ−セファロース分析によれば、そ れは５ｋＤａ未満のＭｒを有し、本質的に哺乳動物ヘパラナーゼ感受性でないか らである。 異なる生物学的試料におけるヘパラナーゼ活性の分析 種々の細胞系、組織および血小板ホモジネートならびに正常および癌患者由来 の血清を、定量的ｃＨＲＧ−セファロースヘパラナーゼアッセイを用いてヘパラ ナーゼ活性について試験した。表１は、非常に転移性のあるラット乳腺アデノカ ルシノーマ１３７６２ ＭＡＴおよびＤＭＢＡ−８Ａ細胞系のホモジネートに存 在するヘパラナーゼ活性が、非転移性Ｊ−クローンおよびＤＭＢＡ−Ｓａｓｋ変 種よりもそれぞれ４倍および１０倍高かったことを示す。これらの値は、人工 （Matrigel）基底膜を分解するこれらの細胞系の相対能力ならびにゲル濾過分析 により評価されるＨＳを分解する細胞ホモジネートの相対能力の両方と密接な相 関関係がある。ネズミLewis肺カルシノーマの転移性変種（Ｄ１２２）および肺 カルシノーマの転移性変種（Ａ３ａ）は、それぞれの非転移性変種よりも２.５ 倍および４.８倍早くＨＳを分解した(表１)。以前には、Nakajima et al,(1986a ,b)は、脱Ｎ−硫酸化され脱Ｎ−アセチル化されたＨＳを用いる固相アッセイを 用いた場合、ほとんど転移性のないＢ１６−Ｆ１１亜系と、より転移性のあるＢ １６−ＢＬ６、−Ｆ１０および−Ｂ１６ｂ亜系との間にはわずか１.５ないし２. ２倍の相異しかないことを報告している。 本発明ヘパラナーゼアッセイの感度は癌患者の臨床試験に有用でありうる。６ 人の肺カルシノーマ患者から採取した肺腫瘍組織においてヘパラナーゼ活性を測 定した。これらのうち、初期の癌である５人の患者におけるヘパラナーゼ活性は 、当該患者の隣接非腫瘍肺組織の活性と比較して、２ないし４倍に上昇していた (結果示さず)。ヒト血漿においてヘパラナーゼ活性はかろうじて検出可能（４ｐ ｍｏｌ／時／ｍｌ血漿）であったが、正常成人血清および転移性悪性疾患の患者 からの血清においては有意なヘパラナーゼ活性が検出された。試験した癌患者の 血清ヘパラナーゼ活性は、正常対照について観察された値（１１６.６±１３.３ ４ｐｍｏｌ／時／ｍｌ血清（ｎ＝５））よりも２倍高く（２２９.７±２８.８ｐ ｍｏｌ／時／ｍｌ血清（ｎ＝８））、悪性黒色腫患者由来の血清に関する観察結 果（Nakajima et al，1988）が確認された。実際、これらの著者らは、組織転移 が存在する患者における血清ヘパラナーゼ活性の４倍の上昇を観察した。また、 Nakajima et al (1986c，1988)も、非常に転移性のある１３７６２ＮＦ乳腺アデ ノカルシノーマ細胞注射３０日後のラットにおけるヘパラナーゼ血清レベルが正 常のものよりも１７倍高かったく、ＭＴＬｎ３腫瘍を有するラットの血清中の活 性は転移の程度と良好な相関関係があることを観察した。 種々のヒトおよびラット細胞系、血小板および組織ホモジネートにおいてもヘ パラナーゼ活性が検出され（図２）、それらは将来の精製のためのヘパラナーゼ 酵素の貴重な源であるはずである。細胞および組織の間の比較を容易にするため に、ヘパラナーゼ活性を抽出蛋白１ｍｇあたりとして表す。この迅速かつ定量的 ヘパラナーゼアッセイの開発は、種々の源からのヘパラナーゼ活性の精製にとり 非常に貴重であろうし、ヘパラナーゼ阻害剤と推定されるものを迅速にスクリー ニングすることを可能にするであろう。 表１ 転移性および非転移性腫瘍細胞系のヘパラナーゼ活性 ｃＨＲＧ−セファロースによるインキュベーション混合物の分画後に腫瘍細胞 ホモジネートのヘパラナーゼ活性を評価した。特記しないかぎり、酵素活性を、 ３系の別個の実験についての平均値±標準偏差として表す。詳細については方法 のセクション参照。 表２ ヒトおよびラット細胞および組織におけるヘパラナーゼ活性 ヒトおよびラット組織および培養細胞の種々のホモジネートにおけるヘパラナ ーゼ活性の範囲を、ｃＨＲＧ−セファロースによるインキュベーション混合物の 分画後に評価した。詳細については方法のセクション参照。 実施例２ 使用略号： ＢＳＡはウシ血清アルブミン；ｃＨＲＧはニワトリヒスチジン豊富 糖蛋白；ＨＲＧはヒスチジン豊富糖蛋白；ＨＳはヘパラン硫酸；ＨＳＰＧはヘパ ラン硫酸プロテオグリカン；ＨＵＶＥＣはヒト請静脈内皮細胞；ＰＢＳはリン酸 塩緩衝化セイラインである。 Ｉ−材料 １６.７、１０.６、６.７および３.１ｋＤａのヘパリン由来の分子量（Ｍｒ_{av e} ）標準物質は親切にもNova Nordisk(Gentofte，Denmark)から贈られた（Kriste nsen et al，1991参照）。ブタ粘膜ＨＳ（ＯＲＧ ５５３）は親切にもOrganon I nt．B，(Oss，The Netherlands)から贈られた。Pharmacia Fine Chemicals(Upps ala，Sweden)からコンカナバリンＡ−セファロース４Ｂ、キレー ティングセファロース４Ｂ、スーパーロース６および１２ＨＲ１０／３０ゲルク ロマトグラフィーカラム、ゲル濾過カラム標準化用分子量標準物質キットおよび ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、ならびにオクチル−セファロースを得た。Sigma Chemic al Co．(St Louis，MO)から結晶ウシ血清アルブミン、ウシ肺およびブタ粘膜ヘ パリン、ウシ腎臓ＨＳ、３,３−ジメチルグルタミン酸、Blue A-アガロース、オ クチル−アガロース、ＣＨＡＰＳ、酢酸亜鉛を得た。Amicon Corp．(Bevery，MA )からCentricon 100および30マイクロコンセントレーターを得た。Beckmann(Gla desville，Australia)からReady Safeシンチレーション液を得た。Stratagene U SA(La Jolla，CA)からStrataClean樹脂を得た。 死体の血小板豊富血漿をCanbera Hospitalから得て、標準セイラインに懸濁し た血小板を１６００ｘｇで１５分、２０℃において遠心分離することにより２回 洗浄し、血小板を−８０℃で保存した。Bartlett et al(1995)の方法によっても ヒト血小板を得て、標準セイラインで２回洗浄した。１０⁸個の血小板を０.２ｍ ｌの０.１％（ｖ：ｖ）Triton X-100水溶液に懸濁し、ドライアイス／エタノー ル混合物中で凍結し、次いで融解することを３回繰り返すことにより細胞ホモジ ネートを調製した。ＢＳＡを標準物質として用いてBio-Rad Coomasie蛋白アッセ イキット（Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA）により蛋白濃度を測定した。 ＩＩ−方法 放射性標識基質の調製 放射性標識ブタ腸粘膜ヘパラン硫酸（ＯＲＧ５５３）、ブタ腸粘膜およびウシ 肺ヘパリンを、実施例１の方法によりヒドラジンでの脱Ｎ−アセチル化および³ Ｈ−無水酢酸でのＮ−アセチル化を行うことにより調製した。 ヘパラナーゼアッセイ： アッセイ１． ＨＳならびに実施例１のヒワトリヒスチジン豊富糖蛋白（ｃＨＲ Ｇ）−セファロースニーズ分離方法を用いて基質から分離した生成物に対するヒ ト血小板ヘパラナーゼ活性を調べた。５ｍＭ−Ｎ−アセチルマンノサミ ンおよび０.１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する０.０５Ｍ−酢酸ナトリウムバッフ ァー，ｐＨ５.１中の９０ｐｍｏｌの放射性標識ＨＳからなるインキュベーショ ン混合物に２μｌまでの試料を添加して全体積２０μｌとして３７℃で適当時間 インキュベーションして基質から生成物への分解率を５ないし２０％の間とした 。チューブを凍結することにより反応を停止させ、０.３ｍｌの冷ＰＢＳを添加 し、必要ならば４℃で溶液を遠心分離し、ついで、０.１ｍｌの試料を、ＰＢＳ で前以て平衡化しておいたｃＨＲＧ−セファロースミニカラム（０.２ｍｌ）に 添加した。カラムを０.７ｍｌのＰＢＳで洗浄し、洗浄液および素通し画分をシ ンチレーションバイアルに移し、１０ｍｌのシンチレーション液を添加し、放射 活性を測定した。蛋白１ｍｇあたり１時間で得られる生成物のｐｍｏｌ数として 酵素活性を示した。 アッセイ２． ２μｇの放射性標識ＨＳまたはヘパリンアナログに対するヘパラ ナーゼ活性を、上記のごとく、３７℃で１６時間アッセイし、インキュベーショ ン混合物をスーパーロース６（ＨＳ分解）またはスーパーロース１２（ヘパリン 分解）のいずれかによりゲル濾過分析することにより検出を行った。クロマトグ ラフィーカラムをＰＢＳで平衡化ならびに展開し、流速を０.２５ｍｌ／分とし 、０.５ｍｌのフラクションをシンチレーションバイアル中に直接集め、これに ３ｍｌのシンチレーション液を添加し、放射活性を測定した。³Ｈ−Ｎ−アセチ ルグルコサミン（２２１Ｄａ）、ウシ肺ヘパリン（１２.５ｋＤａ）およびヘパ リン由来のＭｒ標準物質（１６.７、０１.６、６.７および３.１ｋＤａ）（放射 性標識ＨＳを調製するために上記のごとく部分的に脱Ｎ−アセチル化され、³Ｈ −無水酢酸で再Ｎ−アセチル化されている）を用いてカラムをキャリブレーショ ンした。 血小板ヘパラナーゼの精製 特記しないかぎり、すべての手順を４℃で行った。ＨＳに対するヘパラナーゼ 活性をアッヤセイ１を用いて測定した。各工程において（工程３における０.８ Ｍ−ＮａＣｌでのBlue A-アガロースの洗浄を除く）、Bio-Radの蛋白アッセイを 用い てもはやカラム溶出物中に蛋白が検出できなるなるまでバッファーによるカラム 洗浄を継続した。 工程１． 酵素活性の可溶化：５０ユニットの凍結し洗浄したヒト血小板を、０ .５Ｍ−ＮａＣｌを含有する４倍体積の１５ｍＭ−ジメチルグルタル酸ナトリウ ムバッファー,ｐＨ６.０（バッファーＡ）に懸濁することにより融解し、ついで 、ドライアイス／エタノール浴に浸して凍結させ、その後融解することを３回繰 り返した。懸濁された血小板ホモジネートを３５０００ｘｇで６０分遠心分離し 、上清を工程２で使用した。ペレット化した物質を２００ｍｌのバッファーＡに 再懸濁し、溶血／融解を再度行い、上記のごとく遠心分離した。この手順を２回 以上繰り返し、ついで、最終ペレットを、１％（ｖ：ｖ）ＣＨＡＰＳを含有する バッファーＡ中でホモジナイズし、上記のごとく遠心分離した。工程２の抽出物 にTriton X-100を添加すること以外は以下の説明に正確に従ってＣＨＡＰＳ上清 中のヘパラナーゼ活性を精製した。 工程２． コンカナバリンＡ−セファロースクロマトグラフィー：工程１からの 上清を２％（ｖ：ｖ）Triton X-100とし、約１ｍｌ／分の流速でコンカナバリン Ａ−セファロースカラム（１.５ｘ５.０ｃｍ）（０.２％Triton X-100を含有す るバッファーＡ（バッファーＢ）で平衡化してある）に添加した。４℃において 、２５ｍｌのバッファーＢ、ついで、４０ｍｌのバッファーＡでカラムを洗浄し 、ついで、前以て２０℃に暖めておいた４０ｍｌのバッファーＡで洗浄した。２ ０％（ｗ：ｖ）α−メチルマンノースを含有する４０ｍｌのバッファーＡ（前以 て２０℃に暖めておいた）によりヘパラナーゼ活性を溶離した。溶出液を氷浴中 の容器に集めた。 工程３． Ｚｎ²⁺−キレーティングセファロース／Blue A-アガロースクロマト グラフィー：工程２からの酵素溶液を、Blue A-アガロースカラム（１.０ｘ２. ０ｃｍ）と直列に接続されたＺｎ²⁺−キレーティングセファロースカラム （１.０ｘ１０.０ｃｍ）に、流速１ｍｌ／分で添加した。連結カラムを５０ｍｌ のバッファーＡで洗浄し、ついで、切り離したBlue A-アガロースカラムを０.５ Ｍ−ＮａＣｌを含有する２０ｍｌのTrisバッファー（６０ｍＭ−Ｔｒｉｓ／ＨＣ ｌバッファー,ｐＨ７.４、グリセロールを１０％（ｖ：ｖ）とする）、ついで、 ０.８Ｍ−ＮａＣｌを含有する１.５ｍｌのTrisバッファーで洗浄した。 工程４． Blue A-アガロース／オクチル−アガロースクロマトグラフィー：工 程３のBlue A-アガロースカラムをオクチル−アガロースカラム（１.０ｘ１.５ ｃｍ）(２Ｍ−ＮａＣｌ含有Trisバッファーで平衡化してある)に接続した。Blue A-アガロースカラムを、２Ｍ−ＮａＣｌを含有する１５ｍｌのTrisバッファー で流速０.５ｍｌ／分として溶離した。オクチル−アガロース溶出液を、ＰＭ１ ０膜を装備したAmicon限外濾過撹拌セルにおいて５ｍｌにまで濃縮し、ついで、 Centricon 30遠心分離により０.２ｍｌにまで濃縮した。１０％（ｖ：ｖ）グリ セロールを含有するバッファーＡ（バッファーＣ）を添加し、酵素溶液を０.４ ｍｌにまで再濃縮した。 工程５． スーパーロース１２クロマトグラフィー：上程４からの濃縮酵素溶液 を２００μｌの２つの別個のロットに分割し、直列接続した２本のスーパーロー ス１２ＨＷ １０／３０カラム（バッファーＣで平衡化）に添加し、バッファー Ｃで流速０.５ｍｌ／分として展開した。０.５ｍｌのフラクションを集め、ヘパ ラナーゼ活性についてアッセイし、ヘパラナーゼ活性含有フラクションをCentri con 30での遠心分離により０.４ｍｌにまで濃縮した。精製酵素は、バッファー Ｃ中４℃で保存した場合、数カ月間安定であった。 工程６． Centricon 100および30遠心分離：２０ユニット未満の洗浄血小板か ら得た血小板調合物については、工程４のオクチル-セファロースカラムからの ２Ｍ−ＮａＣｌ溶出液をCentricon 100マイクロコンセントレーターで遠心分離 することにより濃縮し、ヘパラナーゼ活性を含有する濾液を、工程４で説明し たようにしてCentricon 30マイクロコンセントレーターを用いて濃縮し、バッフ ァーＣに対して透析した。 生の（native）ＭｒおよびサブユニットのＭｒ 精製ヒト血小板ヘパラナーゼ活性の生のＭｒを、上記工程５で説明したように 直列接続した２本のスーパーロース１２ＨＷ １０／３０カラムでのクロマトグ ラフィーにより決定した。下記Ｍｒ標準物質を用いてカラムをキャリブレーショ ンした：チログロブリン（６６９ｋＤａ）、フェリン（４４０ｋＤａ）、カタラ ーゼ（２３２ｋＤａ）、フラクトース−バイホスフェートアルドラーゼ（１５８ ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（７６ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ） 、キモトリプシノーゲン（２５ｋＤａ）およびリボヌクレアーゼＡ（１３ｋＤａ ）。 Laemmli(1981)の方法に従って不連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クーマシーブ リリアントブルーＲ２５０で染色した。下記Ｍｒ標準物質を用いて１０％ポリア クリルアミドゲルをキャリブレーションした：ホスホリラーゼｂ（９４ｋＤａ） 、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、カルボ ニックアンヒドラーゼ（３０ｋＤａ）、大豆トリプシンインヒビ−（２０ｋＤａ ）およびα−ラクトアルブミン（１４ｋＤａ）。製造者の指示に従って１０μｌ のStrataClean樹脂を添加し、ボルテックスで撹拌し、懸濁液を遠心分離するこ とにより試料を濃縮した。ジチオスレイトール中で煮沸することによりペレット 化物質を還元し、標準的方法により懸濁液をスタッキングゲルに添加した。 ＩＩＩ−結果および議論 血小板ヘパラナーゼの精製 先に、ヒト血小板ホモジネートはＨＳに対する２.２〜３.６ｎｍｏｌ／ｍｇ蛋 白のヘパラナーゼ活性を含み、転移性のヒト結腸カルシノーマ腫瘍細胞系ＨＣＴ １１６において観察されるよりも６０倍高い活性であることを示した(実施例１) 。それゆえ、血小板は哺乳動物ヘパラナーゼ活性の非常に豊富な源である。スロ ンビンにより誘導される脱顆粒反応（Hoogewerf et al，1995）により、新鮮な 血小 板からヘパラナーゼ活性を放出させることができるが、古い血小板からスロンビ ン刺激により放出されるヘパラナーゼ活性のレベルは非常に変動しやすい。それ ゆえ、前以て凍結してある洗浄血小板を凍結／融解することによりヘパラナーゼ 活性を得た。 酵素の不安定性（Oldberg et al，1980）および酵素精製で得られる活性回収 率が比較的低いこと（Hoogewerf et al，1995;Oosta et al，1982）が報告され ているので、クロマトグラフィー条件を、溶出酵素の濃度が最大となるようにし た。このことは、グラジエント溶離よりもむしろバッチ（またはイソクラチック ）溶離によって、そして酵素が１のカラムに結合せず通過し、直列接続された次 のカラムに結合するような条件とすることにって達成された。このことにより、 塩グラジエント溶離後の酵素活性のアッセイにかかる時間を節約し、酵素の希釈 による活性の損失を最小にした。 バッファーＡ（０.５Ｍ−ＮａＣｌ含有）中で前以て凍結された洗浄血小板を ホモジナイズしたが、検出可能な可溶性酵素活性は放出されなかった。しかしな がら、血小板の凍結／融解を繰り返し、ついで、ホモジネートを遠心分離するこ とにより全ヘパラナーゼ活性の約７５％が可溶化された（表３）。残存している 膜結合酵素は、１％（ｖ：ｖ）ＣＨＡＰＳ含有バッファーＡ中でホモジナイズす ることによってのみ放出され得た。１％ Triton X-100含有バッファーＡととも に膜をホモジナイズして酵素を可溶化させたが、急速に活性が消失した。可溶性 酵素の単離に使用したのと同じ手順により５０ユニットの洗浄血小板から膜結合 酵素を精製した。 コンカナバリンＡ−セファロースカラムに添加されたすべての酵素活性は、界 面活性剤の存在下ではかたく結合した。２０℃でバッファーＡを添加することに よるカラムの洗浄により、４℃でカラムを洗浄するよりも多くの非特異的結合蛋 白が除去された。４℃での通常の溶離と比較して、２０℃でカラムを溶離するこ とにより酵素活性の回収率および溶離速度（カラムの５倍未満の体積の溶離液） は大幅に向上した。ヘパラナーゼ活性は、もとの血小板上清から１９倍に精製さ れ、収率は５６％であった（表３）。この工程からの酵素活性の回収率は、一般 的には５５ないし７０％の範囲であった。α−メチルマンノシドおよび０.１％T riton X-100を含有する２０℃のバッファーによっても、さらなるヘパラナーゼ 活性はカラムから溶離されなかった。ＨＳ分解性エキソ酵素活性の精製にうまく 用いられたキレーティング−セファロースおよび色素−マトリックスクロマトグ ラフィー（Bielicki et al，1990; Clements，et al 1985;Freeman and Hopwood ，1986，1987，1989）は、哺乳動物ヘパラナーゼ活性の単離にはいままで使用さ れていなかった。亜鉛キレートカラムに結合しなかった酵素は色素カラムに強く 結合し、ヘパリン分解性エキソ酵素活性α−Ｌ−イジュロニダーゼ、β−Ｄ−グ ルクロニダーゼおよびα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが血小板ヘパラナー ゼから完全に分離された（結果示さず）。ヘパラナーゼ活性は未結合フラクショ ンまたは色素カラムの低塩濃度（０.５および０.８Ｍ−ＮａＣｌ）Trisバッファ ー洗浄液中に検出された。Blue A-アガロースカラムからの高塩濃度（２Ｍ−Ｎ ａＣｌ）によるヘパラナーゼの溶離により、オクチル−アガロースカラムに結合 していた混入物質が最も多い蛋白が得られ、一方、未結合ヘパラナーゼはゲルク ロマトグラフィーによる最終精製でほとんど純粋な形態にまで濃縮された。酵素 はオクチル−アガロースに結合しなかったが、２Ｍ−ＮａＣｌを用いた場合オク チル−セファロースに結合した。しかし、１Ｍ−ＮａＣｌでカラムから溶離され た（結果示さず）。ヘパラナーゼ活性は工程２においてさらに８０倍精製され、 これまでの精製倍率は１５００倍、活性回収率は２６％であった。０.１Ｍ−イ ミダゾールおよび１％ Triton X-100をそれぞれ含有するバッファーＡを用いて カラムから残りの結合蛋白を溶離した後、キレーティング−セファロースカラム またはオクチル−アガロースカラムからはそれ以上の活性は回収されなかった。 さらにそのうえ、Hoogewerf et al(1995)による報告とは対照的に、ほとんど純 粋な酵素をCentricon 30で濃縮した後の濾液中にはヘパラナーゼ活性は検出され なかった。 ゲル濾過クロマトグラフィー（図７）により、工程４の酵素を最後に１.１倍 精製し、その結果、最終的にもとのホモジネートからは１９００倍の精製倍率と なり、回収率は１９％となった。これは、Oosta et al(1982)、およびHoogewerf et al(1995)による、精製倍率２４００００倍、収率５.６％、および精製倍率４１ ００倍、収率８％に匹敵する。この実施例に記載の方法を用いて、精製ヒト血小 板ヘパラナーゼを２日間で３０％までの収率にて小規模に調製できた。この場合 、規模に見合った小型カラムを用い、工程５のゲル濾過を、オクチル−アガロー ス溶出液Centricon 100で濾過し、Centricon 30フィルターにより濃縮すること に置き換えた。膜結合酵素も、活性収率２５％、比活性６６００ｎｍｏｌ／時／ ｍｇ蛋白で精製され、可溶性酵素に関する観察結果と同様であった。膜結合形態 の酵素は、可溶性形態の酵素と同じクロマトグラフィー特性を示した。 生の分子量 精製ヘパラナーゼのゲル濾過分析(図７参照)およびコンカナバリンＡ−セファ ロースクロマトグラフィー（工程２）の後に得られた酵素のゲル濾過分析は、酵 素が見かけのＭｒ ５０ｋＤａを有することを示した。Hoogewerf et al（1995） により報告されたケモカインサイズの血小板ヘパラナーゼ活性の８〜１０ｋＤａ またはダイマーもしくはテトラマーに対応するＭｒ値においては酵素活性は検出 されず、また、Oosta et al(1982)により報告されたみかけの分子量１３４ｋＤ ａに対応する活性も検出されなかった。その結果はこの実施例に示したが、ヒト 血小板抽出物に関してGraham and Underwood(1996)により得られた４０〜６０ｋ Ｄａという値と同様であった。この値は、精製ヒト胎盤ヘパラナーゼ(Gilat et al，1995)に関して報告された４５ｋＤａという生のＭｒおよび部分精製ヒト脾 臓ヘパラナーゼ（Sewell et al，1989）に関して報告された５０ｋＤａとも類似 しているが、ネズミ黒色腫酵素（Jin et al，1990）に関して報告された６４ｋ ＤａというＭｒ値とは異なる。さらにそのうえ、精製ヒトヘパラナーゼはCentri con 100膜によっては保持されなかったが、Centricon 30kDa膜により保持された 。Hoogewerf et al(1995)による報告と同様、３０ｋＤａ膜による濾液中にはヘ パラナーゼ活性は検出されなかった。しかしながら、工程２のクロマトグラフィ ー後、酵素活性はCentricon 100kDa膜により保持され、濃縮プロセスの間の他の 蛋白との実質的な相互作用が示された。なぜなら、工程２の物質はゲル濾過分析 に よれば見かけのＭｒ ５０ｋＤａを有していたからである（結果示さず）。精製 酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、精製酵素が還元条件下（図８）および非還元条 件下の両方においてＭｒ値５０ｋＤａに対応する単一のクーマシーブルー染色バ ンドを示し（結果示さず）、その値はゲル濾過分析により得られた値と同一であ った。精製膜結合酵素も、ゲル濾過およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件下） によれば、生のＭｒおよびサブユニットＭｒは５０ｋＤａであった。酵素がどの ようにして膜に結合しているのかは知られていない。そのサイズが可溶性酵素と 類似であるので、マンノース−６−リン酸依存的経路によりライソソームに輸送 され、２ｋＤａのＣ末端膜貫通ペプチドを有し、その結果ライソソームにおいて 膜結合形態および可溶性形態の両方として存在しているライソソーム酵素である 酸性ホスファターゼ（Peters et al，1990）と同様、ヘパラナーゼは可溶性形態 および膜結合形態の両方において存在する可能性がある。以前、Gallagher et a l(1988)は、ラット肝臓膜ヘパラナーゼ活性の存在を報告した。しかしながら、 本明細書記載の酵素とは異なり、７.５未満のｐＨ値では不活性であった。 精製血小板ヘパラナーゼの基質特異性 アッセイ１により測定されたＨＳに対する精製ヒト血小板ヘパラナーゼ活性は ｐＨ５.１において最大であり、血小板ホモジネートのヘパラナーゼ活性に関し て述べた（実施例１）のと同様である。ゲル濾過によるアッセイ分析によれば、 精製酵素はＨＳおよびヘパリンの両方を開裂した。粘膜ＨＳに対する血小板ホモ ジネートのヘパラナーゼ活性について報告したのと同様に（実施例１）、ブタ粘 膜ＨＳ（２２ｋＤａ）、およびウシ腎臓ＨＳ（１７ｋＤａ）はそれぞれ開裂され て５ｋＤａのフラグメントとなった。先に、ブタ粘膜ＨＳは段階的に開裂されて ２２ｋＤａから１７ｋＤａ、１１ｋＤａそして最後に５ｋＤａフラグメントとな ることを示した（実施例１）。 粘膜ヘパリンおよびより高度に硫酸化された肺ヘパリンはそれぞれ開裂されて １２.５ｋＤａからそれぞれ４ｋＤａおよび６ｋＤａのフラグメントとなった。 粘膜ヘパリンは、１回で開裂される肺ヘパリンと比較すると、段階的に２回開裂 さ れると思われた。しかしながら、Hoogewerf et al(1995)の報告とは異なり、精 製酵素または工程１のホモジネートのヘパラナーゼとの延長インキュベーション 後に、さらにはこれらの著者により記載されているように還元剤および酸化剤で 酵素を前処理した後であっても、ＨＳまたはヘパリン（または修飾ヘパリン）か らの優勢なジサッカライド生成については証拠がない。 表３ ヒト血小板からのヘパラナーゼの精製文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記工程： ｉ．試料中のヘパラナーゼがヘパラナーゼ基質を分解するのに十分な条件下で 試験試料をヘパラナーゼ基質と一定時間接触させ； ｉｉ．未分解または部分分解ヘパラナーゼ基質をヘパラン硫酸結合蛋白と結合 させることにより、分解生成物を未分解または部分分解ヘパラナーゼ基質から分 離し；ついで ｉｉｉ．分離された分解生成物を検出してそれを試料中のヘパラナーゼ活性を 示すものとする を含む、試料中の哺乳動物ヘパラナーゼ活性の検出方法。 ２．該試料がヒトおよび非ヒトの血清、細胞および組織ホモジネートまたは抽 出物から選択される請求項１記載の方法。 ３．該ヘパラナーゼ基質が標識基質である請求項１または２に記載の方法。 ４．該ヘパラナーゼ基質が放射性標識基質である請求項３記載の方法。 ５．該ヘパラナーゼ基質がヘパラン硫酸である請求項１ないし４のいずれかに 記載の方法。 ６．該ヘパラン硫酸がブタ粘膜ヘパラン硫酸またはウシ腎臓ヘパラン硫酸であ る請求項５記載の方法。 ７．該ヘパラン硫酸が³Ｈブタ粘膜ヘパラン硫酸または³Ｈウシ腎臓ヘパラン硫 酸である請求項６記載の方法。 ８．該ヘパラン硫酸結合蛋白がヒスチジン豊富糖蛋白である請求項１ないし７ のいずれかに記載の方法。 ９．該ヒスチジン豊富糖蛋白がニワトリヒスチジン豊富糖蛋白である請求項８ 記載の方法。 １０．該ヘパラン硫酸結合蛋白が固定化されている請求項１ないし９のいずれ かに記載の方法。 １１．該ヘパラン硫酸結合蛋白がアガロースビーズへの結合により固定化され ている請求項１０記載の方法。 １２．３５℃ないし４０℃の範囲の温度、好ましくは約３７℃で２ないし４８ 時間、好ましくは約１６時間、４．２ないし７．５の範囲のｐＨ、好ましくはｐ Ｈ約５．１において該試料を該ヘパラナーゼ基質と接触させる請求項１ないし１ １のいずれかに記載の方法。 １３．仕切られた形態の下記のもの： ｉ．ヘパラナーゼ基質 ｉｉ．ヘパラン硫酸結合蛋白；および ｉｉｉ．所望により、請求項１ないし１２のいずれかに記載の本発明方法を遂 行するための説明書 を含む、試料中の哺乳動物ヘパラナーゼ活性の検出に使用するキット。 １４．該ヘパラナーゼ基質が標識基質である請求項１３記載のキット。 １５．該ヘパラナーゼ基質が放射性標識基質である請求項１４記載のキット。 １６．該ヘパラナーゼ基質がヘパラン硫酸である請求項１３ないし１５のいず れかに記載のキット。 １７．該ヘパラン硫酸がブタ粘膜ヘパラン硫酸またはウシ腎臓ヘパラン硫酸で ある請求項１６記載のキット。 １８．該ヘパラン硫酸が³Ｈブタ粘膜ヘパラン硫酸または³Ｈウシ腎臓ヘパラン 硫酸である請求項１７記載のキット。 １９．該ヘパラン硫酸結合蛋白がヒスチジン豊富糖蛋白である請求項１３ない し１８のいずれかに記載のキット。 ２０．該ヒスチジン豊富糖蛋白がニワトリヒスチジン豊富糖蛋白である請求項 １９記載のキット。 ２１．該ヘパラン硫酸結合蛋白が固定化されている請求項１３ないし２０のい ずれかに記載のキット。 ２２．該ヘパラン硫酸結合蛋白がアガロースビーズへの結合により固定化され ている請求項２１記載のキット。 ２３．下記工程： ｉ．固定化レクチンアフィニティークロマトグラフィーマトリックスにヘパラ ナーゼ活性を結合させるための界面活性剤の存在下で、ヘパラナーゼ含有材料を 固定化レクチンアフィニティークロマトグラフィーマトリックスと接触させ； ｉｉ．第１の精製ヘパラナーゼ含有フラクションを該マトリックスから溶離さ せ； ｉｉｉ．所望により、該第１の精製ヘパラナーゼ含有フラクションを固定化金 属イオンアフィニティークロマトグラフィーマトリックスと接触させ； ｉｖ．該第１の精製ヘパラナーゼ含有フラクションを色素−樹脂マトリックス と接触させてヘパラナーゼ活性を該色素−樹脂マトリックスに結合させ；ついで ｖ．第２の精製ヘパラナーゼ含有フラクションを該色素−樹脂マトリックスか ら溶離させる を含む、ヘパラナーゼ含有材料からの哺乳動物ヘパラナーゼの精製方法。 ２４．該ヘパラナーゼ含有材料がヒト血小板を含むものである請求項２３記載 の方法。 ２５．該固定化レクチンアフィニティークロマトグラフィーマトリックスがコ ンカナバリンＡ−セファロースマトリックスを含むものである請求項２３または ２４記載の方法。 ２６．該界面活性剤がTriton X-100を含むのもである請求項２３ないし２５の いずれかに記載の方法。 ２７．該固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーマトリックスが Ｚｎ²⁺−キレーティングセファロースマトリックスを含むものである請求項２２ ないし２６のいずれかに記載の方法。 ２８．該色素−樹脂マトリックスがBlue A-樹脂またはReactive Red-樹脂マト リックスを含むものである請求項２２ないし２７のいずれかに記載の方法。 ２９．該色素−樹脂マトリックス中の樹脂がアガロース、セファロースまたは アクリルアミドを含むものである請求項２８記載の方法。 ３０．第２の精製ヘパラナーゼ含有フラクションをオクチル−アガロースマト リックスと接触させて混入蛋白を除去するさらなる工程を含む、請求項２２ない し２９のいずれかに記載の方法。 ３１．該第２の精製ヘパラナーゼ含有フラクションの精製あるいはゲル濾過ク ロマトグラフィーのさらなる工程を含む請求項２３ないし３０のいずれかに記載 の方法。 ３２.該ゲル濾過クロマトグラフィーがスーパーロース１２クロマトグラフィ ーを含む者である請求項３１記載の方法。 ３３．請求項２３ないし３２のいずれかの方法により調製される実質的に精製 された哺乳動物ヘパラナーゼ。 ３４．ｉ．ゲル濾過クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し た場合、約５０ｋＤａの生の分子量（Ｍｒ）を有すること；および ｉｉ．ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方を分解すること を特徴とする、実質的に精製されたヒト血小板ヘパラナーゼ。 ３５．ゲル濾過分析によれば、ウシ肺およびブタ粘膜ヘパリンを分解して１２ ｋＤａからそれぞれ６ｋＤａおよび４ｋＤａのフラグメントとし、ブタ粘膜ヘパ ラン硫酸を段階的に分解して２２ｋＤａから５ｋＤａのフラグメントとすること を特徴とする、請求項３４記載の実質的に精製されたヒト血小板ヘパラナーゼ。