【発明の詳細な説明】
メラトニン1aレセプター遺伝子調節領域およびその使用 連邦政府の支援による研究であることの声明
本発明は、少なくとも部分的に連邦政府の基金（NIH認可番号R37 HD 14427）
を受けて成されたものであり、従って政府は、本発明において権利を有する。
発明の背景
本発明は、高親和性メラトニンレセプター遺伝子の転写調節配列をコードする
核酸に関する。
高親和性メラトニンレセプターは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（G
タンパク質）に結合する膜タンパク質である。つまり、Gタンパク質はリガンド
によって活性化されたレセプターシグナルを適当な細胞内エフェクター系へ伝達
する。ホルモンであるメラトニンは、細胞内環状AMP（cAMP）濃度を減少させる
、アデニル酸シクラーゼを抑制する。
メラトニンは脊椎動物の松果体腺の主要なホルモンであり、強力な神経生物学
的な効果を呈する。メラトニンは概日リズムに影響を与え、季節周期的に繁殖す
る哺乳類の生殖機能へ光周期の効果を伝達する。ヒトにおいては、いくつかの標
準時間帯を越える空の旅の後の時差ぼけの症状が、メラトニンを服用すると緩和
されることが示されている。また、このホルモンはヒトにおいて強い鎮静作用も
有しており、有用な催眠薬になるかもしれない。
メラトニンは、その光周期および概日リズムの効果を、薬剤学的に特異的で、
高親和性のレセプターを介して呈する（Dubocovich，M．L．and Takahashi，J.
，Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1987）84:3916-3920;Vanecek，J.，J．Neuroch
em．（1988）51:1436-1440;Reppert et al.，(1988)前記）。季節周期的に繁殖
する咄乳類では、松果体のメラトニン分泌が季節による反応を、昼の長さの変化
に応じて調節する（Bartness，T．J．and Goldman，B．D.，Experientia（1989
）45:939-945;Karch et al.，Recent Prog．Horm．Res．（1984）40:185-232）
。今日のところ調べられている、すべての光周期性の種において、メラトニン1a
レセプターを有する唯一の部位（Weaver，et al.，Suprachiasmatic nucleus:th
emind's clock;Klein，D．C.，Moore，R．Y.，and Reppert，S．M.，eds．New Y
o
rk:Oxford University Press;（1991）pp．289-308）は、下垂体の一部である、
隆起部（pars tuberalis）（PT）である。その他の種と比較して、ヒトではメラ
トニン1aレセプターは、PTにはっきりとは存在していない。
高親和性メラトニン-1a（Mel1a）レセプターは、ヒトを含むいくつかの哺乳類
種の脊椎中枢神経系の離散性の領域に位置する。リガンド2-[125I]-ヨードメラ
トニン（iodomelatonin）（125I-メラトニンまたは[125I]MEL）を用いた結合の
研究により、視交叉上核（SCN）などの、無数の概日リズムを調節する生物時計
の部位において、高親和性メラトニン1aレセプター（Kd<２ｘ10-10M）が同定さ
れている（Reppert et al.，Science（1988）242:78-81）。現在のところ、高親
和性メラトニンレセプターは脳以外の中枢神経系組織において同定されていない
。
レセプター親和性はグアニンヌクレオチド感受性であり、レセプターの活性化
は百日咳毒素感受性の機構を介して、確実にアデニル酸シクラーゼの抑制を導く
（Rivkees，S．A．wt al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1989）86:3883-3886;
Carlson，L．L．et al.，Endocrinology（1989）125:2670-2676;Morgan，P．J．
et al.，Neuroendocrinolology（1989）50:358-362;Morgan，P．J．et al.，J．
Neuroendocrinol．（1990）2:773-776;Laitinen，J．T．and Saavedra，J．M.，
Endocrinology（1990）126:2110-2115）。したがって高親和性メラトニンレセプ
ターは、Gタンパク質結合レセプターのスーパーファミリーに属すると思われる
。
発明の概要
一般的に、本発明は、脳における高親和性メラトニン1aレセプターの３'およ
び5'側転写調節領域とコード領域をコードする、実質的に純粋なDNA（cDNAまた
はゲノムDNA）を特徴とする。好ましい態様において、本発明には、メラトニン1
aレセプター遺伝子の3'および5'側転写調節領域に対する塩基配列が含まれる。
本発明のこのような配列には、メラトニン1aレセプター遺伝子の転写調節におい
て機能するプロモーター、ならびに、上流および下流のエンハンサー因子、およ
び/または、シス-およびトランス-作用因子結合部位が含まれる。メラトニン1a
レセプター遺伝子の転写において機能する配列は、レセプターのコード配列の開
始位置または終結位置から1.5キロベース対以上離れたところに位置しているか
もしれな
い。本発明の別の態様において、転写調節配列は、配列番号：1の一部になって
いる。また、メラトニン1aレセプターのコード領域とアミノ酸配列も、配列番号
：1に含まれており、1994年6月17日に提出された、出願人の米国特許出願第08/2
61,857号、1994年10月7日に提出された米国特許出願第08/319,887号、および199
5年6月6日に提出された米国特許出願第08/466,103号で開示されているが、これ
らの出願は、全体として、参照として本明細書に組み入れられる。
さまざまな好ましい態様において、転写調節領域は、マウス、ヒトまたはヒツ
ジなどの脊椎動物に由来している。
本発明の一つの局面において、レポーター遺伝子など、目的とする遺伝子に、
操作可能なように結合されたメラトニン1aプロモーターを含む核酸構築物が提供
されている。好ましくは、メラトニン1aプロモーターは、メラトニン1aレセプタ
ー遺伝子の転写調節配列を含む配列番号：1の一部と実質的に同一な塩基配列を
もつ。
本発明の一つの態様において、構築物のメラトニン1a転写調節領域は、ストリ
ンジェントな条件下で、配列番号：1の塩基配列をもつ核酸分子にハイブリダイ
ズする。
別の態様において、本発明の構築物は、配列番号：1の転写調節配列に約95％
の相同性をもつメラトニン1a調節領域を含んでいる。
別の関連する局面において、本発明は、このような単離DNAを含み、好ましく
は、このDNAによってコードされている目的の遺伝子の発現を、ベクターを含む
細胞の中で誘発することができるベクター、および、このようなベクターを含む
細胞（好ましくは、例えば、RT2-2細胞（ニュージャージー州のブリストル-マイ
ヤーズ・スクィーブ社（Bristol-Myers Squibb，New Jersey）、C.マーレ（C．M
ahle）から入手した）、またはCHO細胞（ATCCカタログ番号：CCL 61）、またはC
OS-7細胞（ATCCカタログ番号：CRL1651）などの真核細胞）を特徴としている。
好ましくは、このような細胞は、上記の単離されたDNAによって安定的に形質転
換されている。
別の局面において、本発明は、機能的なメラトニン1aレセプター遺伝子のプロ
モーターからの転写を変更できる能力について、候補化合物をスクリーニングす
る方法を特徴としている。本方法には、a）レポーター遺伝子に操作可能なよう
に結合された、組換えメラトニン1aレセプター遺伝子のプロモーターを含む細胞
を提供すること、b）この細胞を、候補化合物に接触させること、およびc）候補
化合物存在下で、レポーター遺伝子の発現をモニターすることに関係する。
好ましい態様において、本方法には、組換えメラトニン1aレセプター遺伝子の
プロモーターで、配列番号：1の転写調節配列に実質的に同一の塩基配列をもつ
プロモーターを含む細胞が含まれる。
別の好ましい態様において、このプロモーターは、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下で、配列番号：1に相補的な塩基配列、および、好まし
くは、5'側の非翻訳領域、および/または3'側の非翻訳領域の一部、または全部
に相当する配列番号：1の部位をもつ核酸分子にハイブリダイズすることができ
る。
さらに、別の好ましい態様において、このプロモーターは、配列番号：1（図
２）のおよそ-1142番目のヌクレオチドから+26番目のヌクレオチドまでの塩基配
列で、操作可能なように結合している遺伝子配列の転写および翻訳において機能
する遺伝子要素を含む配列を含んでいる。本発明の態様には、さらに、コード配
列の3'側領域の中の配列で、好ましくは、+1165番目のヌクレオチド（終止コド
ンからすぐの3'側）から+1606番目のヌクレオチド（ポリ(A)シグナルの3'側）ま
での配列が含まれる（図2）。メラトニン1aレセプター遺伝子の機能的な遺伝子
要素を含んでいるイントロン配列（図2）は、本発明のさらなる態様である。こ
のような機能的な遺伝子要素には、エンハンサー、応答要素、シスおよび/また
はトランス作用因子結合部位などが含まれるが、これらに限定はされない。
スクリーニング方法の好ましい態様において、組換え高親和性メラトニンレセ
プター遺伝子のプロモーターを、目的の遺伝子に操作可能なように結合させるこ
とによって、目的の遺伝子が、通常は、目的の遺伝子を発現しない哺乳動物細胞
によって安定して発現されるようになる。目的の遺伝子は、細胞の中で発現しう
る遺伝子で、その転写が、細胞の中に導入された後検出されるものであればよい
。目的の遺伝子で好ましいのは、β−ガラクトシダーゼ、抗生物質耐性遺伝子、
SV40 T抗原、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ヒト
成長ホルモン（hGH）などを含むが、これらに限定はされないレポーター遺伝子
であ
る。
「転写調節領域」もしくは「転写調節配列」または「プロモーター」は、メラ
トニン1aレセプター遺伝子のコード領域の上流および下流の核酸配列で、コード
領域をmRNAに転写開始するときに機能し、また、このmRNAを、高親和性メラトニ
ンレセプターポリペプチドのアミノ酸配列に翻訳するときに機能する配列をコー
ドする配列を意味する。また、転写調節配列とは、転写を誘発するのに十分な最
小の配列である。プロモーター依存的な遺伝子発現が、細胞型特異的、または組
織特異的に調節でき、または、外部からのシグナルもしくは薬剤によって誘導で
きるように調節できるようにするのに十分なプロモーター要素も本発明に含まれ
るが、このような要素は、本来の遺伝子の5'または3'領域に位置しているかもし
れない。
「レポーター遺伝子」とは、その発現を測定しうる遺伝子を意味するが、この
ような遺伝子に制限はないが、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、および
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）が含まれる。
「操作可能なように結合された」とは、適当な分子（例えば、転写活性化因子
蛋白質）が調節配列に結合すると、遺伝子発現を可能にさせるようなやり方で、
遺伝子と調節配列とを連結することを意味する。
「発現のために置かれた」とは、DNA分子が、その配列の転写と翻訳を誘発す
る（すなわち、例えば、組換え蛋白質やRNA分子の産生を促進する）DNA配列に隣
接して置かれていることを意味する。
「高親和性メラトニンレセプターポリペプチド」は、メラトニンと特異的に結
合し、メラトニンを介する適当な生物学的現象（たとえば、細胞内cAMP濃度の減
少）のカスケードにシグナル伝達を行う、脊椎動物細胞表面タンパク質の全部ま
たは一部を意味する。該ポリペプチドは、本明細書において記載されるリガンド
結合特性（アゴニストおよびアンタゴニストの結合特性を含む）および組織分布
を有することによって特徴づけられる。
「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後の修飾（たとえば、グリコシル化）に
かかわらず、あらゆるアミノ酸鎖を意味する。
「実質的に同一の」塩基配列とは、メラトニン1aレセプター遺伝子の転写調節
領域の核酸との違いが、10％よりも低い、好ましくは、5％よりも低い塩基配列
を意味する。好ましくは、転写調節領域の実質的に同一の塩基配列は、配列番号
：1の調節領域と実質的に同じ頻度、好ましくは、配列番号：1の調節領域によっ
て開始される頻度の、少なくとも50％、より好ましくは80％の頻度で転写を開始
する機能をもっている。配列番号：1の塩基配列、または、実質的に同一の配列
は、脊椎動物から単離することができ、または、標準的な技術によって、化学的
に合成することができる。
「に由来する」とは、該生物のゲノムによってコードされ、該生物の細胞のサ
ブセットの表面に存在することを意味する。
「単離DNA」とは、本発明のDNAが由来する生物の天然に存在するゲノムにおい
て、直接に接している（つまり、1つは5'末端側、もう1つは3'末端側に）どちら
のコード配列とも直接に接しない（つまり、共有結合していない）DNAを意味す
る。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自律的に複製するプラスミド
もしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれ
る、組換えDNAを含む。または、この用語は、その他の配列から独立した、別個
の分子（例えば、PCRまたは制限酵素エンドヌクレアーゼによる消化によって産
生される、cDNAまたはゲノムもしくはcDNA断片）として存在する、組換えDNAを
含む。また、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部
である、組換えDNAも含む。
「形質転換された細胞」とは、遺伝子工学の手法を用いて、高親和性メラトニ
ンレセプターの転写調節領域（または、その断片もしくはアナログ）をコードす
るDNA分子を導入された（またはその祖先に導入された）細胞を意味する。この
ようなDNA分子は「発現のための位置に置かれた」ものであり、該配列の転写お
よび翻訳を指向するDNA配列に近接して位置するDNA分子を意味する（すなわち、
遺伝子転写物および／または目的のタンパク質またはその断片もしくは類似体の
製造を容易にする）。
「トランスジェニック動物」は、本明細書において用いられるように、その有
核細胞の一部または全部が、異なる種由来の遺伝子（外因性）を1つまたはそれ
以上有する動物（ヒト以外の哺乳類など）を意味する。外因性遺伝子を有する細
胞
に該動物の生殖細胞が含まれる場合は、その遺伝子を該動物の子孫に伝えること
ができる。本明細書において用いられるように、異なる動物種由来の遺伝子は、
外因性遺伝子である。好ましくは、外因性遺伝子は、内因性の組織分布における
遺伝子の発現に影響を与えるヌクレオチド配列を含む。
本発明のメラトニン1aレセプター転写調節領域は、脊椎動物の概日リズムの機
能に関与する可能性が高いレセプターであるメラトニン1aの発現を調節する。し
たがって、このような転写調節領域は、時差ボケのような症状を治療し、いくつ
かの内因性メラトニンリズムの再同調を促進し、盲人の不安定な睡眠−覚醒周期
を同調させ、交替制勤務者の睡眠障害を軽減し、新生児の日周性の睡眠-覚醒パ
ターンの出現を促進し、人間の女性における卵巣の周期性を調節し、人間の思春
期の開始とタイミングを調節し、また、ヒツジなど、季節的に交配する動物にお
ける交配周期を変更させるための治療薬を開発するのに役立つ。好ましい治療薬
には、1）転写活性化因子、例えば、本発明の高親和性メラトニンレセプター遺
伝子のプロモーターとの相互作用によって、操作可能なように結合された、目的
の遺伝子の転写を増加させる化合物、2）転写不活性化因子、例えば、転写活性
化因子：プロモーターの相互作用を妨害することによって、高親和性メラトニン
レセプター遺伝子のプロモーターの機能を遮断する化合物が含まれる。
今日ではレセプター遺伝子プロモーターの成分が組換え技術によって産生され
るため、ならびに候補化合物が形質転換した培養細胞を用いてスクリーニングさ
れるため、本発明は有用な処方物の同定に対する簡素かつ迅速なアプローチを提
供する。ほとんどの哺乳類において、該レセプターおよびその遺伝子調節領域の
所在は中枢神経系に散在する少数の領域にあったため、従来このようなアプロー
チは困難であった。高親和性メラトニンレセプター転写調節領域の単離により、
目的の遺伝子を通常は発現しない細胞タイプにおいて目的の遺伝子の発現が可能
となり、それによりメラトニン1aレセプター転写活性化因子または阻害因子を解
析するためのシステムが提供される。
本発明のその他の特徴および利点は以下に示すその好ましい態様の記述および
請求の範囲から明らかになると思われる。
詳細な説明
始めに図面を簡単に説明する。図面
図1は、マウスMel1aメラトニンレセプター遺伝子の構造の概略を示している。
ゲノム地図には、四角で表したエクソンをもつレセプター遺伝子を示している。
エクソンの翻訳領域は黒い四角で、5'側および3'側の非翻訳領域は白い四角であ
る。遺伝子の下に、コード領域を四角で表わした、レセプターcDNAが示されてい
て、膜貫通ドメインIからVIIまでが示されている。細い線は、非翻訳領域を表し
ている。遺伝子とcDNAの間に描かれた点線は、cDNAをコードしている遺伝子の部
位を示している。
図2は、マウスMel1aレセプター遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。ヌ
クレオチド配列には、第一エクソンの開始する位置を画定する主要な転写開始部
位から番号を付けてある。コード領域の中に、N-結合グリコシル化に関するコン
センサス部位（四角）と、プロテインキナーゼCリン酸化に関するコンセンサス
部位（楕円）が示されており、また、膜貫通ドメインに下線を施してある。3'側
非翻訳領域では、ATTTA配列（太字）とポリアデニル化シグナルのコンセンサス
配列（下線）が強調されている。塩基とアミノ酸の番号は、各行の右側に示され
ている。この配列は、登録番号U52222として、GenBankに登録されている。
図3A〜3Bは、マウスMel1aレセプター遺伝子の転写開始部位を決定するための
方法の概略図である。A．5'-RACE解析を用いて、上流配列をクローニングした。
逆転写後、アミノ末端にあるプライマーと5'アンカープライマーとを用いて、PC
R増幅を行なった。垂直線は、配列決定した15クローンの位置を示している。星
印（*）は、翻訳開始コドンの上流103塩基のところで終わる6クローンを表して
おり、+は、翻訳開始コドンの上流133塩基のところで終わる2クローンを表して
いる。B．RNaseプロテクション解析を用いて、さらに、転写開始位置を明らかに
した。cRNAプローブ（335塩基長）と、プロテクトされた断片（長さ186塩基対）
が示されている。
図4は、マウスMel1aレセプター遺伝子の5'側近傍領域が、RT2-2細胞において
プロモーターとして機能することを示す棒グラフである。RT2-2細胞は、1.1kbの
5'側近傍領域を含むpGL2-ベーシック（pGL2-Basic）ルシフェラーゼ・レポータ
ー
ベクター、または挿入配列なしのpGL2ベクターによって形質転換された。結果は
、4回の独立の実験の平均値±SEM（標準誤差）である。
実施例
以下で、マウスの高親和性メラトニン1aレセプターの転写調節領域のクローニ
ングとキャラクタリゼーションについて説明する。マウスメラトニン1aレセプタ
ーの転写領域に操作可能なように結合されたDNAを含み、それを発現させる、形
質転換された細胞についても説明されている。これらの実施例は、本発明を例示
する目的で提供されており、制約するものと解してはならない。
実施例１：マウスメラトニン1aレセプターの転写調節領域の分子クローニング
マウスMel1aメラトニンレセプター遺伝子の466bpの断片を、ゲノムDNAからPCR
によってクローニングした。2種のオリゴヌクレオチドプライマー（最終濃度200
nM）を用いて、ゲノムDNA、またはcDNAの第一鎖に、PCRによる30〜35サイクルの
PCR増幅を行なった。各反応サイクルは、アンプリタックDNAポリメラーゼ（Ampl
eTaq DNAPolymerase）（パーキン-エルマー・シータス社（Perkin-Elmer Cetus
）、カリフォルニア州フォスターシティー）によって、94℃で45秒間、45℃で2
分間（縮退プライマーのとき）、または60℃で2分間（特異的なプライマー）、
また、72℃で2分間インキュベートすることからなっていた。増幅されたDNAは、
以前に説明されたところに従って、アガロースゲルで分離して、濾紙によって溶
出した（レッパート（Reppert,S.M.）ら、（1994）Neuron 13:1177-1185）。次
に、ティーエー（TA）クローニングキット（インビトロジェン社（Invitrogen）
、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、DNAをpCRIIにサブクローニングす
るか、制限酵素によって分解してから、ピー・ブルースクリプト（pBluescriptI
I）SK+またはKS+（ストラタジーン社（Stratagene）、カリフォルニア州ラホヤ
）にサブクローニングした。
以前にクローニングされている哺乳動物のMel1aレセプターの間で保存されて
いる第3および第7膜貫通ドメイン中のアミノ酸残基を基にした縮退オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて、PCRを行なった（例えば、その全体が参照として本
明細
書に組み入れられる、米国特許出願第08/466,103号を参照のこと）。マウスのゲ
ノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、ラットとDjungarianハムスタ
ーのMel1aレセプターcDNAに、アミノ酸レベルで94％一致する、466bpの断片が得
られた。
PCR-生成された、マウスMel1aレセプターの断片を用いて、マウスのゲノミッ
クライブラリーを検索した。BALB/c成獣マウス肝臓のEMBL3 SP6/T7ゲノミックラ
イブラリー（クローンテック社（Clontech）、カリフォルニア州パロアルト）を
培養し（12プレート；100,000pfu/プレート）、コロニープラークスクリーンフ
ィルター（ニューイングランドヌクレア社（New England Nuclear）、マサチュ
ーセッツ州ボストン）に移行させた。以前に説明されたところ（レッパート（Re
ppert，S.M.）ら、前記）に従って、高ストリンジェンシーの、または低ストリ
ンジェンシーの条件下で、フィルターをスクリーニングした。プローブは、ラン
ダムプライミング法（ファルマシア社（Pharmacia）、ニュージャージー州ピス
カタウェイ）により、[アルファ-32P]dCTP（3000Ci/mmol)で標識したcDNA断片で
あった。プローブにハイブリダイズしたファージをプラーク精製した。
10個のハイブリダイゼーション陽性クローンを単離して、プラーク精製した。
ヒツジとヒトのMel1aレセプター遺伝子には、1番目の細胞内ループをコードする
領域の中にイントロンがある。このため、ヒツジのMel1aレセプターの第1の細胞
質ループに存在するGNモチーフから直上流にあるコード領域の160bpの断片を用
いて、ゲノミックライブラリーを再検索した（レッパート（Reppert，S.M.）ら
、(1994)Neuron 13:1177-1185）。ヒツジの断片は、10個の分離集団にハイブリ
ダイズした。これらのクローンは、マウスの断片を用いて発見したクローンと重
複しなかったため、大きなイントロンの存在が示唆された。制限エンドヌクレア
ーゼ、およびPCRならびにサザン解析によって、ファージクローンの両セットを
マッピングした。選抜したゲノム断片をサブクローニングしてから、標準的な技
術によって配列決定した。
ゲノム配列を、cDNAのコード領域および非翻訳領域と比較したところ、マウス
Mel1aレセプター遺伝子は、2個のエクソンからできていることが示された。エク
ソン1は、5'側非翻訳領域の全部と、1番目の細胞質ループまでのコード領域をコ
ードしていた（図1参照）。エクソン2は、残りのコード領域と、3'側非翻訳領域
の全部をコードしていた。ゲノムクローンの制限エンドヌクレアーゼマッピング
によると、イントロンの長さは13kbよりも長い。このイントロンは、スプライシ
ングのための保存された5' GT-AG 3'配列をもっている。以前の研究によって、
マウスMel1aレセプター遺伝子（Mtnrla）は、単一コピー数の遺伝子で、第8染色
体の上に存在していることが明らかになった（スローゲンハウプト（Slaugenhau
pt，S.A.）ら、（1994）Genomics 27:355〜357）。
実施例２：哺乳動物細胞におけるメラトニン1aレセプターの遺伝子の発現
ラットとハムスターでの研究によると、Mel1aレセプターmRNAは、脳の中に分
布を制限され、低いレベルで発現される（レッパート（Reppert，S.M.）ら、（1
994）Neuron 13:1177-1185）。Mel1aレセプターを発現する、脊椎動物の細胞系
を、レセプターDNAの5'-および3'-非翻訳領域を解析するために探した。RT2-2細
胞は、トランスジェニックマウスの、SV40 T抗原によって誘導された腫瘍から採
られた、不死化した網膜アマクリン細胞の細胞系である（ハマング（Hammang，J
.P.）ら、（1990）Neuron 4:775〜782；RT2-2細胞は、ニュージャージーのブリ
ストル-マイヤーズ・スクィーブ社（Bristol-Myers Squibb，New Jersey）のC.
マーレ（C．Mahle）によって提供された）。RT2-2細胞は、強い親和性（Kd＝50
から100pM）と中度の能力（Bmax20から40fmol/mg蛋白質）をもって、メラトニン
に結合し、これらの細胞が高親和性のメラトニンレセプターを発現することを示
唆している（マーレ（Mahle，C.D.）ら、（1994）要旨、第24回神経科学学会年
会プログラム（Abstract，Program of the 24th Annual Meeting of The Societ
y for Neuroscience）、フロリダ州マイアミ、p．535）。
以下のようにして、RT2-2細胞からのRNA抽出を行なった。10％の熱不活性化ウ
シ胎児血清入りのOPTI-MEM I（ギブコ/ビー・アール・エル（GIBCO/BRL）、ニュ
ーヨーク州グランドアイランド）の中、5％CO2中、37℃で、RT2-2細胞を単層に
なるよう増殖させた。酸-フェノール法を用いて、RT2-2細胞から全RNAを抽出し
た（チョムチンスキー（Chomczynski，P.）とサキ（Sacchi，N.）(1987)Anal．B
iochem．162:156〜159）。以前説明されたとおりに、ポリ(A)+RNAを調製した（
レッパート（Reppert,S.M.）ら、（1991）Mol．Endocrinol．5:1037-1048）。PC
Rで作
製したレセプター断片を用いたRNaseプロテクション解析によって、大量のMel1a
レセプターmRNAが、RT2-2細胞の中で同定された。
マウスのゲノミックライブラリーからの2組のクローンの配列解析によって、
コード領域の5'末端と3'末端と思われるところを明確にした。コード領域の5'末
端と3'末端に隣接する特異的プライマーを用いた、RT2-2細胞のmRNAのRT-PCRに
よって、スプライス部位と予想されたところでイントロンがスプライスアウトさ
れた、予想通りのcDNAが増幅された。配列解析とインサイチューハイブリダイゼ
ーションを行なうために、PCR生成されたcDNAをpcDNA3にサブクローニングした
。
マウスMel1aレセプターは、353アミノ酸の蛋白質をコードしており、メラトニ
ンレセプターファミリーに特徴的な構造特徴をもっている（出願人が関係してい
る米国特許出願第08/466,103号を参照のこと）。これらは、第3の膜貫通ドメイ
ンのすぐ下流にあるNRYモチーフ、NRYの直下流にあるC(C/Y)ICHモチーフ、およ
び、膜貫通7にあるNAXXYモチーフを含む。全体として、マウスレセプターのコー
ド領域は、アミノ酸レベルで、ヒツジとヒトのMel1aレセプターに、それぞれ、8
3％と85％一致しているが、このヒツジとヒトのレセプターだけが、哺乳動物に
おけるこのサブタイプのメンバーで、全長のコード領域がクローニングされ、配
列決定され、また、発現されているものである（米国特許出願第08/466,103号；
およびレッパート（Reppert，S.M.）ら、（1994）Neuron、前記）。マウスのメ
ラトニン1aレセプターには、アミノ末端に、Ｎ結合グリコシル化のコンセンサス
部位が2箇所ある。第２の細胞質ループは、レセプターの調節に関係のある、プ
ロテインキナーゼCによってリン酸化される2つのコンセンサス部位をもつ。また
、カルボキシ末端部には、リン酸化部位として使用されるかもしれない、いくつ
かのセリン部位をもっている。
実施例３：マウスメラトニン1aレセプター遺伝子の5'側非翻訳領域の解析
5'-RACEを用いて、Mel1aレセプター遺伝子の転写開始部位を調べた。5'-アン
プリファインダー（AmpliFINDER）RACEキット（クローンテック社（Clonetech）
）を用いて、5'-RACEを行なった。マウスMel1aメラトニンレセプターの膜貫通1
のヌクレオチド配列に対応するプライマーを用いた、RT2-2細胞に由来するポリ(
A)+RNAの逆転写によって、第一鎖cDNAを作製した。T4RNAリガーゼを用いて、cDN
Aの
末端に、アンプリファインダー（AmpliFINDER）のアンカーをライゲーションし
た。次に、アンカープライマー（アンプリファインダー（AmpliFINDER）プライ
マーに相補的）と、逆転写に用いられたプライマーの直上流で入れ子となったプ
ライマーを用いてcDNAを増幅した。増幅されたcDNAを、アガロースゲル上で分離
した。特異的なバンドを濾紙溶出し、pCRIIにサブクローニングして、配列決定
した。
膜貫通1の+248から+271に相当するプライマー5'-GTACACAGACAGGATGACCAGCAG-3
'（配列番号：3）を逆転写に用い、すぐ上流の+227から+253で入れ子になったプ
ライマー5'-CAGCAGGTTGCCCAGAATGTCCACCAC-3'（配列番号：4）をPCR増幅に用い
た。5'-RACEクローンの配列解析によって、多数の開始可能部位が存在すること
が示された（図3A）。5'-非翻訳領域において、cDNA配列がゲノム配列と一致し
たが、このことは、イントロンが存在しないことを示している。配列決定した15
クローンのうち、6クローンが、翻訳開始コドンから103bp上流で終わっており、
これが主要な転写開始部位であることを示している。最も長い2つのcDNAは、翻
訳開始コドンから133bp上流まで続いていた（図3A）。
5'-RACEの結果を明らかにするために、Mel1aのゲノム配列に由来するプライマ
ーを用いたPCRによって作製された335bpの断片を用いて、RNaseプロテクション
解析を行なった（図3B）。プライマーの一つ（5'-TTCAAGCTTAGCCAGGACGGTCGTGGT
CTCCCT-3'（配列番号：5））は、アミノ末端側+166から+189に一致していた。も
う一つのプライマー（5'-TCAGAATTCGAGTCCAAGTTGCTGGGCAGTGGA-3'（配列番号：6
））は、5'-RACE解析によって示唆された推定転写開始部位の上流にある125から
149番目のヌクレオチドであった。この結果生じた断片をサブクローニングして
、cRNAプローブを作製するために直鎖化した。マキシスクリプト（MAXIscript）
システム（アンビオン社（Ambion）テキサス州オースチン）を用いて、32P-UTP
（6000Ci/mmolまで）によって、プローブを作製した。リボヌクレアーゼプロテ
クションアッセイは、以前説明された（レッパート（Reppert，S.M.）ら、（199
4）Neuron 13:1167-1176）とおりに、RPAIIシステム（アンビオン社（Ambion）
）を用いて行なわれた。全RNA、またはポリ(A)+RNAを、約105cpmの各プローブと
、20mlのハイブリダイゼーション緩衝液の中で混合した。ハイブリダイゼーショ
ン混合
液を95℃で3分間加熱した後、45℃で一晩インキュベートした。ハイブリダイズ
しなかったRNAを、RNase A/RNase T1混合液によって、37℃で1時間分解した。サ
ンプルを煮沸して、8M尿素/5％アクリルアミドゲルで分離した。すべてのRNase
プロテクション解析について、酵母RNA、センス鎖プローブ、およびRNaseを除い
たものを用いて、対照用サンプルをアッセイした。
RNaseプロテクション解析の結果、主な転写開始部位は、翻訳開始コドンから1
03bp上流にあり、副次的な部位は、133bp上流にあることが確認された。クロー
ニングされた5'側上流領域の配列決定は、標準的な技術によって行なわれた。
1.1kbの5'側近傍領域の配列解析によって、転写開始部位領域には、典型的なT
ATAまたはCAATボックスが含まれてないことが明らかになった（図2）。しかし、
-27から-34のヌクレオチドには、ATに富む領域があった。配列決定した領域には
、cAMP調節因子が結合するコンセンサス配列配列が同定されなかった。この領域
がプロモーターとして機能することを確認するために、5'側近傍領域の1.1kbの
断片で、転写開始位置に対して、-1132から+26に相当する領域（図2参照）を、
標準的な技術によって、pGL2-ベーシック（pGL2-Basic）ルシフェラーゼレポー
ターベクター（プロメガ社（Promega）、ウィスコンシン州マディソン）にサブ
クローニングした。挿入配列を含むベクター、または挿入配列を含まないベクタ
ーを、改変したジエチルアミノエチルデキストラン法（カレン（Cullen，B.R.）
、（1987）Methods Enzymol．152:684〜704）を用いて、RT2-2細胞（2μｇ cDNA
/35mmウエル）に形質転換した。形質転換してから2日後に、レポーターリーシス
緩衝液（プロメガ社（Promega））によって、細胞溶解液を回収した。ルミノス
キャン（Luminoskan）発光測定器（デウェット（deWet，J．R.）ら、（1987）Mo
l．Cell Biol．7:725〜737）によって、溶解液中のルシフェラーゼ活性を測定し
た。各cDNA構築物について、3つの35mmウエルを2回反復して測定した。予備実験
で、pCMV-β-ガラクトシダーゼベクターによる同時形質転換によって、形質転換
効率に一貫性があることが確認された（Rosenthal，N．（1987）Methods Enzymo
l．152:704〜720）。陽性対照として、各実験において、並行したプレートをpCM
V-ルシフェラーゼで形質転換した（トリーシー（Treacy，M.N.）ら、(1991)Natu
re 350:577〜584）。
5'側近傍/pGL2構築物によって形質転換されたRT2-2細胞におけるルシフェラー
ゼ活性は160±3.4（平均値±標準誤差）であり、挿入配列をもたないpGL2ベクタ
ーによって形質転換されたRT2-2細胞においては、ルシフェラーゼ活性は、1.4±
0.4であった（図4）。このように、マウスのレセプター遺伝子の1.1kbの5'側近
傍領域配列は、対照（ベクターのみ）の値に対して平均114倍のルシフェラーゼ
活性の誘導を生じさせた。これは、転写開始位置に対して、およそ-1132番目の
塩基から+26番目の塩基の、転写開始位置の直上流の5'側近傍領域（図2）が、RT
2-2細胞において、機能的なプロモーターとして作用していることを示していた
。
転写開始のためにRNAポリメラーゼIIを配置するための、マウスのレセプター
遺伝子のプロモーターには、TATAボックスは存在しない。マウスのMel1aレセプ
ター遺伝子の場合のように、複数の転写開始部位をもつ遺伝子では、TATA配列が
欠如しているのは普通である。実際、黄体形成ホルモンレセプター（ツァイ-モ
リス（Tsai-Morris，C.H.）ら、（1991）J．Biol．Chem．266:11355〜11359）、
濾胞刺激ホルモンレセプター（ヘッカート（Heckert，L.L.）ら、（1992）Molec
ular Endocrinology 6:70〜80）、甲状腺刺激ホルモンレセプター（イクヤマ（I
kuyama，S.）ら、（1992）Molecular Endocrinology 6:793〜804）、性腺刺激ホ
ルモン放出ホルモンレセプター（アルバラシン（Albarracin，C.T.）ら、（1994
）Endocrinology135:2300〜2306）、オキシトシンレセプター（ローゼン（Rozen
，F.）(1995)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:200〜204）を含む、Ｇ-蛋白質結
合レセプター遺伝子の多くも、同じように、プロモーターにTATAボックスを欠い
ており、これらのレセプター遺伝子のすべてにおいて、多数の開始部位が見つけ
られている。マウスのMel1aレセプター遺伝子において、転写の開始に関与するA
Tに富む領域（ハーン（Hahn，S.）ら、（1989）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86
:5718〜5722；シンガー（Singer，V.L.）ら、（1990）Genes and Development 4
:636〜645；およびウォッブ（Wobbe，C.R.）とストルール（Struhl，K.）(1990)
Molecular and Cellular Biology 10:3859〜3867）は、主なキャップ部位の27か
ら34塩基上流のところに位置している。しばしば、TATAボックスの近くにあるGC
に富んだ領域が、このATに富む領域の近くにある。主要な転写開始位置から、最
初の200塩基上流のGC含量は65％であり、他のＧ-蛋白質結合レセプター遺伝子の
含量と同じくらいで
ある（イクヤマ（Ikuyama，S.）ら、（1992）前記）。しかし、マウスのMel1aレ
セプター遺伝子のプロモーターには、正規のGCボックスもCAATボックスも存在し
ていない。
マウスのMel1aレセプター遺伝子の1.1kbの5'側近傍領域には、機能的なプロモ
ーターが存在していることが明らかになった。マウスのMel1aレセプター遺伝子
のプロモーターを含むベクターで形質転換されたRT2-2細胞におけるルシフェラ
ーゼ活性が、プロモーターをもたないレポーターベクターで形質転換された細胞
に較べて114倍増加したことは、このプロモーターがRT2-2細胞において機能する
ことを示していた。
転写調節に関与する要素について、マウスのMel1aレセプター遺伝子の5'側近
傍領域の配列を解析した。論理名ジェンモアデータ（genmoredata）によって定
義された、データファイルtfsites.datを用いて、GCG（ジェネティック・コンピ
ュータ・グループ、ウィスコンシン州マディソン）ウィスコンシンパッケージMA
Pコマンドを利用した。
実施例４：マウスメラトニン1aレセプター遺伝子の3'側非翻訳領域の解析
PCR増幅を2回行なって、3'-RACEによって、3'-非翻訳領域の長さを決定した。
3'-RACEシステム（ギブコ/ビー・アール・エル（GIBCO/BRL）、メリーランド州
ベセスダ）によって、3'-RACEを行なった。5'末端に3つの制限エンドヌクレアー
ゼをもつように作製されたオリゴ(dT)プライマーであるアダプタープライマー（
Adapter Primer）を用いて、第一鎖cDNAを作製した。そして、アダプタープライ
マーの特異的5'側配列に相補的なアンカープライマーと、マウスのMel1aレセプ
ターの膜貫通6の塩基配列に一致するプライマーを用いてcDNAを増幅した。第２
の増幅ステップは、アンカープライマーと、一回目の増幅で用いられたプライマ
ーの下流の膜貫通７で入れ子になったプライマーを用いて行なわれた。２回目で
増幅されたcDNAを、アガロースゲル上で分離した。単一のバンドを濾紙溶出し、
pCRIIにサブクローニングして、配列決定した。
第1回目の増幅では、膜貫通6の+871から+894に相当するプライマー5'-ACTCAAC
CTCATAGGTCTTATTGT-3'（配列番号：7）が用いられたが、第２回目では、下流の
膜貫通7の+929から+952で入れ子になったプライマー5'-CCAGAGTGGCTGTTCG
TGGCTAGT-3'（配列番号：8）が用いられた。3'-RACEクローンの配列解析によっ
て、ポリ(A)テールで終わる440bpの3'非翻訳領域を含む、650bpのcDNA断片が、
終始一貫して出現した。この断片には、mRNAの安定性の制御に関係するATTTA配
列（ザックス（Sachs，A.B.）(1993)Cell 74:413〜421）と、ポリ(A)テールの開
始点から18bp前にあるポリアデニル化コンセンサス配列ATTAAAとを含んでいた（
図2）。3'-非翻訳配列は、ゲノムDNAのコード領域の下流に存在する配列と一致
したが、このことは、3'-非翻訳領域には、イントロンが存在しないことを示し
ている。
遺伝子の3'非翻訳領域は、mRNAの安定性に関係すると考えられており、遺伝子
活性を調節する配列を含んでいるかもしれない（ジャクソン（Jackson，R.J.）
とスタンダート（Standart，N.）(1990)Cell 62:15〜24）。マウスMel1aレセプ
ター遺伝子の3'-非翻訳領域が、AUに富む因子（ATTTA）を含んでいることは注目
に値する。この因子は、mRNAの不安定化を誘導することができ（ザックス（Sach
s，A.B.）前記）、このことは、マウスMel1aレセプターの転写産物が、不安定で
、短命であることを示唆している。Mel1aレセプターの転写産物の安定性を変え
るために、AUに富む因子を欠失させたり、改変したりすることは、Mel1aの発現
を増加させるために本発明の範囲内にある。
実施例５：マウスのメラトニン1aレセプター遺伝子発現の組織分布
RT2-2細胞からのRNAのノザンブロット解析によって、これらの細胞で、Mel1a
レセプターがある程度発現されるというRNaseプロテクション解析の結果が確認
された。エクソン2からPCRで作製したMel1aプローブによる、このブロットのハ
イブリダイゼーションによって、転写産物のサイズ標準と較べて、約1.8kbのと
ころの強いハイブリダイゼーションシグナルと、約7kbのずっと弱いシグナルと
いう、2つの転写産物が明らかになった。
ラットとハムスターにおいて、PTとSCNでMel1aメラトニンレセプターの転写産
物が同定されている（レッパート（Reppert，S.M.）ら、（1994）Neuron、前記
）。全コード領域に相補的なcRNAプローブを用いたインサイチューハイブリダイ
ゼーションによって、マウスのSCNと下垂体におけるMel1aレセプターmRNAの分布
を調べた。マウスレセプターの全コード領域を含むpCDNA3のHindIII消化によっ
て、35
S-標識したアンチセンスcRNAプローブを作製してから、以前に説明されたよう
にして（レッパート（Reppert，S.M.）ら、（1991）Mol．Endocrinol．5:1037-1
048）、[35S]alpha-チオ-UTP（ニューイングランドヌクレア社（New England Nu
clear）；1100〜1200Ci/mmol）の存在下で、SP6 RNAポリメラーゼ（アンビオン
社（Ambion））によるインビトロ転写を行なった。対照として、各プラスミドか
らセンス鎖cRNAプローブを作製し、アンチセンスプローブによって処理した。マ
ウスのSCNと下垂体におけるMel1aレセプターmRNAの分布に加えて、125I-Melを用
いたインビトロオートラジオグラフィーによって、高親和性メラトニン結合部位
の分布を調べた。
レセプターmRNAの最も高いレベルは、マウスのPTで見られた。成獣マウスのSC
Nも、ある程度のハイブリダイゼーションシグナルを示した。PTでもSCNでも、強
い125I-Melの結合が見られた。新生児マウスにおけるSCNのインサイチューハイ
ブリダイゼーション解析によって、SCNでは、強いハイブリダイゼーションシグ
ナルが、また、視床下部外側部では、拡散シグナルが示された。これらの動物か
らのエマルジョンオートラジオグラムは、腹側部SCNでは、ハイブリダイゼーシ
ョンシグナルがより強いことを示していた。この領域の中では、散在する細胞だ
けが銀粒子を示した。成獣のSCNでは、ハイブリダイゼーションシグナルに、昼-
夜の明らかな違いはなかった。
実施例６：脊椎動物のメラトニン1aレセプター遺伝子プロモーターからの外来遺
伝子の発現
本発明による、脊椎動物のメラトニン1aレセプター遺伝子プロモーター（マウ
スに由来するものなど）の転写調節領域に操作可能なように結合された目的の遺
伝子（レポーター遺伝子など）を含む発現カセット、遺伝子構築物、または、発
現ベクターは、適当な宿主細胞の形質転換によって発現させることができる。
分子生物学分野における当業者には、組換え発現構築物を提供するために、広
く多様な発現システムのいずれかを用いることができることが分かる。用いられ
る宿主細胞が厳密に何であるかは、宿主細胞が、マウスMel1aレセプター遺伝子
プロモーターに操作可能なように結合されたDNAを発現させれば、本発明にとっ
ては重要ではない。マウスMel1aレセプター遺伝子プロモーターから発現させる
ために
有用な宿主細胞は、RT2-2細胞である（ブリストル-マイヤーズ・スクィーブ社（
Bristol-Myers Squibb）、ニュージャージー州。形質転換の方法と発現ベクター
の選択は、選択された宿主システムに依存する。形質転換および哺乳動物細胞の
トランスフェクション法は、例えば、アウスウーベル（Ausubel）ら、（分子生
物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、ジョン
ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク、(1989)）において説明されており
、発現ベクターは、例えば、クローニングベクター：実験マニュアル（Cloning
Vectors:A LaboratoryManual）（パウエルズ(Pouwels，P.H.)ら、(1985)，補遺
、1987）において提供されているものから選ぶことができる。
特に好ましい発現システムは、上記したような、マウスMel1aレセプター遺伝
子の転写開始位置から、-1132から+26上流にある、1.1kbの5'側近傍領域の配列
を含むpGL2-ベーシック（pGL2-Basic）ルシフェラーゼベクターで形質転換され
たRT2-2細胞である。マウスMel1aレセプター遺伝子プロモーターをコードするDN
Aを、ルシフェラーゼを発現させるような方向で、pGL2-ベーシック（pGL2-Basic
）ルシフェラーゼベクターに挿入した。この発現構築物は、本発明のスクリーニ
ング法において用いることができる。
または、マウスMel1aレセプター遺伝子プロモーター：レポーター遺伝子構築
物は、安定して形質転換された哺乳動物の細胞系で発現される。
哺乳動物細胞の安定した形質転換に適した多くのベクターが、一般的に入手可
能であり、例えば、パウエルズ(Pouwels)ら、前記を参照、また、このような細
胞系を構築するための方法も一般的に利用可能である。例えば、アウスウーベル
（Ausubel）ら、前記を参照のこと。一つの例としては、Mel1aプロモーター：レ
ポーター遺伝子構築物をコードするcDNAを、プロモーターのない第2のレポータ
ー遺伝子を含む発現ベクターにクローニングする。このような構築物は、プラス
ミドと、したがって、Mel1aレプロモーター：レポーター遺伝子構築物を、（ア
ウスウーベル（Ausubel）ら、前記で説明されているように）選抜すべき宿主細
胞染色体の中に組み込むことができる。この優性選抜は、ほとんどの細胞型で行
なうことができる。
Mel1aプロモーター：レポーター遺伝子の発現（例えば、本明細書で説明され
て
いる発現システムのいずれかで産生されるもの）は、例えば、組換え細胞抽出物
のウエスタンブロットまたは免疫沈殿解析などの免疫学的処理法によって、また
は、組換え細胞そのものの免疫蛍光（例えば、アウスウーベル（Ausubel）ら、
前記で述べられている方法）によって、（例えば、本明細書で説明されているル
シフェラーゼを用いた）発光測定法によって、（例えば、β−ガラクトシダーゼ
の発現を用いた）比色定量測定法によって測定することができる。
実施例７：メラトニン1aレセプター遺伝子プロモーターの活性化因子と阻害因子
上で検討したように、本発明の一つの局面は、マウスMel1aレセプター遺伝子
転写調節配列からの転写を活性化する化合物をスクリーニングし、それによって
、SCNおよびPTでMel1aレセプターを発現させる細胞の量の増加を誘導し、次に、
循環するメラトニンに対する感受性を強化することを特徴としている。スクリー
ニングの要素となるのは、Mel1aレセプター遺伝子プロモーターを発現させる細
胞（RT2-2細胞など）の中に形質転換させられた組換えMel1aレセプター遺伝子プ
ロモーター：レポーター遺伝子である。好ましくは、Mel1aレセプター遺伝子プ
ロモーターは、マウスなどの脊椎動物に由来するものである。スクリーニングの
その他の要素には、形質転換された細胞を候補物質と接触させ、Mel1aレセプタ
ー遺伝子プロモーターからの発現増加を示すものとして、レポーター遺伝子活性
の増加をモニターする。
Mel1aレセプター遺伝子プロモーターの機能を阻害することができる化合物の
スクリーニングは、レポーター遺伝子の活性の低下をモニターする点以外は、転
写活性因子に関して説明したのと同じようにしてスクリーニングする。
好ましくは、このようなスクリーニング法を、Mel1aレポーター遺伝子プロモ
ーター：レポーター遺伝子構築物で安定して形質転換された細胞系（RT2-2細胞
など）を用いて行なう。もっとも好ましくは、形質転換されていない細胞系は、
実質的にレポーター遺伝子を発現しない。
転写活性化因子は、SCNまたはPTの中の細胞表面上のメラトニンレセプターの
数を増加させ、それによって、循環しているメラトニンに対する、動物の感受性
を高めることによって、ヒトにおける時差ボケ、昼/夜の周期障害、または、ヒ
ツジなどの動物における交配周期の変化などの概日リズム障害に対する有用な治
療薬
剤となることが期待できる。
転写阻害因子は、SCNまたはPTの細胞の表面上のメラトニンレセプターの数を
減少させ、それによって、メラトニンに対する動物の感受性を低下させることに
よって治療可能な障害に対する有用な治療薬剤となることが期待できる。このよ
うな障害には、ヒトにおける思春期の開始やタイミングを調節することなど、哺
乳動物の生殖サイクルを調節することが含まれるが、これらに限定はされない。
実施例８：組換えメラトニン1a調節配列:レポーター遺伝子カセットを含む遺伝
子導入動物の調製
遺伝子導入動物を作製することができる方法は、いくつかある。遺伝子導入動
物（例えば、哺乳動物）は、外来のメラトニンレセプター遺伝子を、動物の内生
的な遺伝子の中に狙いをつけて挿入することや、当業者に周知されている他の方
法など、いくつかの方法のうちの一つによって構築することができる。
その生殖細胞と体細胞が、メラトニンレセプター遺伝子の転写調節領域の制御
の下に外来レポーター遺伝子を含む遺伝子導入哺乳動物を、当技術分野において
既知の方法によって作出する。例えば、全体として本明細書に参照として組み入
れられる、遺伝子導入哺乳動物の作製について説明している米国特許第4,736,86
6号を参照のこと。一般的に、目的とするレポーター遺伝子に操作可能なように
結合された、外来のメラトニン1aレセプター遺伝子プロモーターをコードするDN
A配列を、動物、または、胚の段階（好ましくは、1細胞、受精した卵子、および
、一般的には、ほぼ8細胞期より後でない）にある、動物の原型の中に導入する
。外来遺伝子の安定した発現を達成するために、動物の胚の中に外来遺伝子を導
入する方法で、当技術分野において既知の方法がいくつかある。一つの方法は、
天然の遺伝子と同じ遺伝子で胚を形質転換し、外来遺伝子が、その発現をもたら
す遺伝子座でゲノムに組み込まれている遺伝子導入動物を選択するという方法で
ある。別の方法は、胚の中に導入する前に、外来遺伝子か、その調節配列を改変
することを含む。
外来のレポーター遺伝子産物があるかを解析するために、mRNAを直接解析する
か、または外来の産物に関して組織をアッセイするかして、遺伝子導入哺乳動物
の組織を解析する。
実施例９：メラトニンレセプター遺伝子プロモーターの活性化と阻害を判定する
ために、遺伝子導入哺乳動物を用いること
上記の動物を用いて、候補物質が、インビボで、メラトニンプロモーターの活
性化因子であるか、阻害因子であるかを判定することができる。
本発明の一つの局面は、インビボでメラトニン活性に作用するか、拮抗する化
合物をスクリーニングすることを特徴とする。スクリーニングの要素は、Mel1a
プロモーター：レポーター遺伝子の遺伝子導入哺乳動物であり、また、哺乳動物
に投与するために適当な処方剤となった、メラトニン1aレセプター遺伝子プロモ
ーターの活性化因子または阻害因子の可能性あるものである。プロモーター活性
化因子も阻害因子も投与していない対照遺伝子導入哺乳動物に較べて、目的とす
る表現形質（例えば、睡眠/覚醒周期、または生殖周期）に変化が起きたことが
検出されれば、有用な候補物質であることが示されたことになる。治療法
ヒトの概日リズム障害の治療のため、および季節的に繁殖する動物の生殖周期
の変化を調節するために特に適した治療薬は、生理食塩水などの適当な緩衝液で
処方した、上記の転写活性化因子および阻害因子である。
治療用調製物は、治療すべき状態にしたがって静脈投与される。通常、ある用
量で、ある期間、所望の反応を誘導するのに適当なタイミングで、静脈投与され
る。適当なタイミングとは、治療用組成物の投与により所望の反応が誘導される
、自然の概日リズムの中の時間を意味する。または、治療薬を経口的、経鼻的ま
たは局所的に、例えば、液体もしくはスプレー状にして投与するのが便利である
。この場合も、用量は前記と同様である。治療は、病徴が軽減するのに必要なだ
け繰り返されよう。
メラトニン1aレセプター遺伝子プロモーター転写活性化因子を用いて、ヒトの
内在性メラトニンリズムを再同調させる、すなわち、ヒトの時差ぼけ症状を緩和
させたり、盲人の睡眠/覚醒周期を位相変化させたり、低強度の明期/暗期周期を
用いた内在性メラトニンリズムの同調を補強したり、ヒトの排卵期を調節したり
、季節的に繁殖する動物の生殖周期を変えたりすることができる。アンタゴニス
トは、ヒトの思春期の開始またはタイミングを調節する上で有用かもしれない。
メラトニン1aレセプター遺伝子プロモーターの転写阻害因子は、ヒトの思春期
の開始またはタイミングを調節するなど、哺乳動物の生殖周期を調節するのに有
用かもしれない。
本発明の方法を用いて、治療用レセプター遺伝子プロモーター転写活性化因子
または阻害因子を、上述の解析法により、インビトロまたはインビボでの目的の
遺伝子の発現の変化におけるそれらの有効性についてスクリーニングすることが
できる。ヒト以外の哺乳類を治療したり、ヒト以外の動物のための治療薬をスク
リーニングする場合は、メラトニン1aレセプター遺伝子調節領域は、好ましくは
その種に特異的なものである。
その他の態様
本発明に係るメラトニン1aレセプター転写調節領域には、すべてのメラトニン
1aレセプター遺伝子プロモーター（例えば、本明細書において説明されているよ
うな調節領域）が含まれる。このようなプロモーターは、どのような生物に由来
していてもよいが、好ましくは、例えば、マウス、ヒト、ヒツジ、またはカエル
などの脊椎動物に由来する。これらのプロモーターは、例えば、メラトニン1aレ
セプターの産生を変化させ、それによって、細胞系や遺伝子導入動物全身におけ
るメラトニンに対する感受性を変えるために用いられる。
目的とする特異的なレセプター遺伝子プロモーター領域には、メラトニン1aレ
セプター遺伝子の転写開始領域の上流、イントロンの中、またはMel1aコード領
域の下流の配列で、本発明のレセプター遺伝子プロモーター領域に操作可能なよ
うに結合された、目的の遺伝子を細胞の中で発現させるように機能する配列が含
まれる。プロモーターの転写開始能力を破壊することなく、また、翻訳されるべ
きmRNAを生じさせる能力も破壊させるこのないような、塩基配列のいくつかの位
置での塩基置換、欠失、または挿入は、本発明の範囲内に含まれる。
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１月１９日（１９９９．１．１９）
【補正内容】
(1)明細書第３頁５行目の
「6月6日に提出された米国特許出願第08/466,103号で開示されているが、」
を
「6月6日に提出された米国特許出願第08/446,103号で開示されているが、」
と補正する。
(2)明細書第４頁１２行〜１３行の
「別の好ましい態様において、このプロモータ一は、配列番号：１（図2）
のおよそ-1142番目のヌクレオチドから」を
「別の好ましい態様において、このプロモーターは、配列番号:1の24位から 1192 位のヌクレオチドに相当する図2のおよそ-1142番目のヌクレオチドから
」と補正する。
(3)明細書第４頁１６行目の
「好ましくは、+1165番目のヌクレオチド」を
「好ましくは、配列番号:1の2331位から2722位のヌクレオチドに相当する+1
165番目のヌクレオチド」と補正する。
(4)明細書第１１頁７行目の
「(1994)Genomics 27:355〜357」を
「(1995)Genomics 27:355〜357」と補正する。
(5)明細書第１４頁１４行目の
「転写開始位置に対して、-1132から+26に相当する領域（図2参照）を、」
を
「転写開始位置に対して、-1132から+26に相当し、かつ配列番号:1の34位か ら1192位のヌクレオチドに相当する領域（図2参照）を、」と補正する。
(6)明細書第１９頁１１行目の
「1.1kbの5'側近傍領域の配列を含む」を
「1.1kbの5'側近傍領域の配列（図2および配列番号:1の34〜1192位の核酸に 相当する領域を参照のこと）を含む」と補正する。
(7)請求の範囲 別紙の通り請求の範囲
１．レポーター遺伝子に操作可能なように結合された機能的メラトニン1aレセ
プター遺伝子のプロモーターを含む単離核酸分子。
２．メラトニン1aレセプター遺伝子のプロモーターが、転写および翻訳の調節
領域を含む配列番号：1の一部である、請求項1記載の核酸分子。
３．メラトニン1aレセプター遺伝子のプロモーターが、高ストリンジェンシー な
条件の下で、配列番号：1に相補的な塩基配列をもつ核酸分子にハイブリダイ
ズする請求項1記載の核酸分子。
４．メラトニン1aレセプター遺伝子のプロモーターが、転写および翻訳の調節
配列をコードする配列番号：1の一部を含む塩基配列と、少なくとも約95％の相
同性を有する、請求項1記載の核酸分子。
５．メラトニン1aレセプター遺伝子のプロモーターが、配列番号：1の24位か ら1192位のヌクレオチド
を含む、請求項1記載の核酸分子。
６．配列番号：1の2331位から2772位のヌクレオチドをさらに含む、請求項5記
載の核酸分子。
７．下記の段階を含む、機能的なメラトニン1aレセプター遺伝子のプロモータ
ーからの転写を変化させるか否かについて、候補化合物をスクリーニングする方
法：
a）レポーター遺伝子に操作可能なように結合された組換えメラトニン1aレセ
プター遺伝子のプロモーターを含む細胞を提供する段階、
b）該細胞を、該候補化合物に接触させる段階、および
c）該候補化合物の存在下でレポーター遺伝子の発現を検出する段階であって
、該候補化合物が存在しない場合の発現と比較した候補化合物存在下における該
発現の増加または減少により、該候補化合物がプロモーターからの転写を変化さ
せることの指標となる段階。
８．メラトニン1aレセプター遺伝子のプロモーターが、転写および翻訳の調節
配列を含む配列番号：1の一部である、請求項7記載の方法。
９．メラトニン1aレセプター遺伝子のプロモーターが、高ストリンジェンシー な
ハイブリダイゼーション条件の下で、配列番号：1に相補的な塩基配列を有す
る
核酸分子にハイブリダイズする、請求項7記載の方法。
10．メラトニン1aレセプター遺伝子のプロモーターが、配列番号：1の転写お
よび翻訳の調節領域に、少なくとも約95％の相同性を有する、請求項7記載の方
法。
11．メラトニン1aレセプター遺伝子のプロモーターが、配列番号：1の24位か ら1192位のヌクレオチド
を含む、請求項7記載の方法。
12．配列番号:1の2331位から2772位のヌクレオチドをさらに含む、請求項11記
載の方法。