JP2000515363A

JP2000515363A - Ｍｈｃ複合体及びその用途

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Publication number: JP2000515363A
Application number: JP09527863A
Authority: JP
Inventors: ロード，ピーター・アール; ジァオ，ジン―アン; バークハート，マーチン; ウォン，ヒン・シー
Original assignee: スノール・モレキュラー・コーポレーション
Priority date: 1996-01-31
Filing date: 1997-01-30
Publication date: 2000-11-21
Also published as: ATE276275T1; WO1997028191A1; EP0877760A4; DE69730693T2; US5869270A; EP0877760A1; EP1526141A3; DE69730693D1; US7141656B2; CA2244755A1; AU729672B2; DK0877760T3; EP0877760B1; US6309645B1; US20020034513A1; AU2253897A; EP1526141A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規な主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子及びこのような複合体の用途に関する。１つの側面で、本発明は、ペプチド結合溝を有する少なくとも１つのＭＨＣ分子、及びＭＨＣタンパク質に非共有結合した提示ペプチドを含む、装填されたＭＨＣ複合体に関する。別の側面で、本発明は、複合体のペプチド結合溝に共有結合した提示ペプチドを有する一本鎖ＭＨＣクラスIIペプチド融合複合体を特徴とする。本発明のＭＨＣ複合体は、１）選択されるＴ細胞の活性を調節するペプチド（Ｔ細胞受容体のアンタゴニスト及び部分アゴニストであるペプチドを含む）の同定及び単離のためのインビトロスクリーニング、及び２）哺乳動物における免疫応答の抑制方法又は誘導方法を含む、種々の応用に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ＭＨＣ複合体及びその用途発明の背景１．発明の分野本発明は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の新規な複合体及びこのような複合体の用途に関する。例えば、１つの側面で、本発明は、ペプチド結合溝を有するＭＨＣ分子、及びＭＨＣタンパク質に非共有結合した提示ペプチドを含有する、空のＭＨＣ複合体に関する。別の側面で、本発明は、一本鎖ＭＨＣクラスII分子、及びＭＨＣタンパク質のペプチド結合溝に共有結合した提示ペプチドを含む、ＭＨＣクラスII−ペプチド融合複合体に関する。本発明のＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞の活性を調節するペプチドの同定及び単離のためのインビトロスクリーニングを含む、種々の応用に有用である。２．背景抗原特異的Ｔ細胞応答は、外来抗原を同定してこれに応答するための免疫系の機作の一部として、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）糖タンパク質の結合溝（binding groove）又は裂溝（cleft）に結合した抗原性ペプチドにより呼び起こされる。結合した抗原性ペプチドは、Ｔ細胞受容体と相互作用し、それにより免疫応答を調節する。抗原性ペプチドは、ＭＨＣタンパク質の結合溝の多様な残基よりなる、特定の「結合ポケット」に非共有手段により結合する。ＭＨＣクラスII分子は、α及びβ鎖よりなる、ヘテロ二量体糖タンパク質である。これらの分子のα１及びβ１ドメインは、一緒に折り畳まれて、ペプチド結合溝を形成する。抗原性ペプチドは、ペプチドのアンカーアミノ酸と、α１及び β１ドメインとの間の相互作用により、ＭＨＣ分子に結合する。インフルエンザウイルスペプチドとのヒトクラスII ＨＬＡ−ＤＲ１複合体の結晶構造は、ペプチドのＣ−末端がβ鎖のＮ−末端に隣接するように、結合したペプチドのＮ−及びＣ−末端が結合溝から延び出ていることを示している［J．Brown et al.，Nat ure，364:33-39(1993);L．Stern et al.，Nature，368:215-221(1994)］。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣクラスII分子とは異なるドメイン構成であるが、一般に、膜ドメインに対して遠位のペプチド結合部位又は溝を有する同様な構造である［例えば、A．Rudensky et al.，Nature，353:622-626(1991)を参照のこと］。また、ＭＨＣ分子の考察に関して、米国特許5,284,935号；5,260,422号;5 ,194,425号;5,130,297号;並びにWO92/18150及びWO93/10220も参照のこと。 α及びβ鎖の膜貫通ドメインは、ＭＨＣ分子の組み立て及び／又は細胞内輸送において重要な役割を果たす。例えば、ＴＭドメイン内のアミノ酸が変化すると、欠陥のあるＭＨＣ分子が生じることがある［P.Cosson et al.，Science,258:6 59(1992);W．Wade et al.，Immunology，32:433(1995);H.Kozono et al.，Natur e，369: 151 (1994)］。α及びβ鎖の膜貫通及び細胞質ドメインは開示されている［（例えば、Brown、前出、及びその引用文献を参照のこと）］。抗原性ペプチドと複合体化したＭＨＣ分子は、幾つかの異なる機作により選択的な免疫抑制を誘導することができる［例えば、J．Guery et al.，Critical Re views in Immunology，13(3/4):195-206(1993)を参照のこと］。更に具体的には、抗原提示細胞が、同時刺激性シグナル（co-stimulatory sig nals）をも送達するならば、抗原提示細胞の表面のペプチド−ＭＨＣ複合体は、ＭＨＣ結合ペプチドに特異的なＴ細胞系のクローンの拡大（expansion）のみを誘導することが報告されていろ。１つの提案されたアプローチでは、Ｔ細胞活性化のためのこの要求を利用し、同時刺激性シグナルの非存在下でのＭＨＣ分子に結合した抗原性ペプチドとの相互作用によるＴ細胞発生の阻害を報告している［ M.Nicolle et al.，J．Clin.Invest.，93:1361-1369(1994);及びS．Sharma et a l.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:11465-11469(1991)を参照のこと］。別の提案されたアプローチでは、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）に対するアンタゴニスト又は部分アゴニストである結合ペプチドを含有するＭＨＣ分子で、Ｔ細胞発生を阻害している[B.Evavold et al.，Immunology Today，14(12):602-609(1993 )を参照のこと]。特異的Ｔ細胞応答を担当する残基を検討するために、Ｔ細胞受容体に結合した抗原性ペプチドの修飾が試みられてきた。このような抗原性ペプチドの「活性化」アミノ酸の決定により、ＴｃＲの部分アゴニスト又はアンタゴニストの適切な配列の洞察することができた。Evavold，B．et al.，前出を参照のこと。また、ＭＨＣ分子に結合した種々の抗原性ペプチドの性質の決定に基づき、新規なワクチンを開発することが考察されてきた［R．Chicz et al.，Immunology Today，15(4):155-160(1994)を参照のこと］。発明の要約本発明は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（クラスＩ又はII）の新規な複合体(例えば、空の一本鎖ＭＨＣクラスII複合体、装填された（loaded）一本鎖ＭＨＣクラスII複合体、及び一本鎖ＭＨＣクラスIIペプチド融合複合体) 、及びこのようなＭＨＣ複合体の用途に関する。本発明者らは今や、提示ペプチドが複合体のペプチド結合溝に非共有結合するように、複合体に提示ペプチドを接触させることにより、共有結合した提示ペプチドを持たない一本鎖ＭＨＣクラス複合体（即ち、空のＭＨＣ複合体）を装填することができることを発見した。一般に、提示ペプチドは、安定な水素結合により、空のＭＨＣ複合体のペプチド結合溝に非共有的に結合する。本発明の一本鎖ＭＨＣクラス複合体、特に一本鎖ＭＨＣクラスII複合体は、驚くべきことに安定であり、そして種々の応用において有用である。例えば、装填された一本鎖ＭＨＣクラスII複合体又は一本鎖ＭＨＣクラスIIペプチド融合複合体は、哺乳動物における種々の免疫系応答（例えば、Ｔ細胞アポトーシス、Ｔ細胞アネルギー、Ｔ細胞サイトカイン放出、免疫抑制及びＴ細胞の誘導）を調節するために使用することができる。空のＭＨＣ分子、特に空の一本鎖ＭＨＣクラスII分子は、例えば、Ｔ細胞受容体のアンタゴニスト及び部分アゴニストであるペプチドを含む、Ｔ細胞の活性を調節するペプチドを検出するためのインビトロスクリーニングに有用である。本発明者らは以前に、１９９５年７月３１日に出願した、未公開のＰＣＴ出願番号PCT/US95/09816（時に本明細書では該「ＰＣＴ出願」と呼ぶ）、更には１９９５年２月１日に出願した、係属中の米国出願番号08/382,454において、非常に有用なＭＨＣクラスＩ及びクラスIIペプチド融合分子を開示した。ＭＨＣ融合複合体は、ＭＨＣ分子に共有結合した（即ち、融合した）提示ペプチドを含む。ＰＣＴ出願番号PCT/US95/09816及び該米国出願番号08/382,454は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用されるとき、「提示ペプチド」という用語は、Ｔ細胞受容体の活性を調節して、Ｔ細胞増殖を誘導することができるか、又は以下に開示されるアッセイ（Ｔ細胞を増殖させるためにＴ細胞を培養し、そしてＴ細胞を本発明の一本鎖ＭＨＣペプチド融合複合体又は本発明の装填された一本鎖ＭＨＣ複合体と接触させ、次に複合体がＴ細胞の更なる発生を阻害するかどうかを評価するという連続工程を含むアッセイを含む）により決定されるように、Ｔ細胞発生を阻害若しくは不活化することができるペプチドを意味する。「空の（empty）」（特に「空のＭＨＣ分子」又は同様の句）という用語は、本明細書で使用されるとき、共有結合又は非共有結合した提示ペプチドの欠けている、本発明のＭＨＣ分子（クラスＩ又はII）を意味する。好ましくは、空のＭＨＣ分子はクラスIIであり、別々のポリペプチドというよりはむしろ単一のポリペプチド鎖よりなる。「装填された（loaded）」（特に「装填されたＭＨＣ分子」又は同様の句）という用語は、本明細書で使用されるとき、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝又は裂溝に非共有結合した提示ペプチドを含む、空のＭＨＣ分子（クラスＩ又はII）（好ましくは、そのため、装填されたＭＨＣ分子は、Ｔ細胞の活性を調節することができる）を意味する。非共有結合は、適切には、提示ペプチドと空のＭＨＣ分子のペプチド結合溝又は裂溝との間の、安定な水素結合による。非共有結合は、インビトロでもインビボでも行われ得る。好ましくは、装填されたＭＨＣ分子はクラスIIであり、別々のポリペプチドというよりはむしろ単一のポリペプチド鎖よりなる。本発明の一本鎖ＭＨＣペプチド融合複合体、及び該ＰＣＴ出願に開示された複合体は、多くの重要な長所を提供する。例えば、以前の慣行では、前もって抗原提示細胞からのペプチドを装填したＭＨＣ分子の精製を必要とした。このような装填したペプチドは、一般に強力に結合しており、目的のペプチドで効率的に交換できなかった。これとは対照的に、該ＰＣＴ出願に開示されたＭＨＣ複合体又は本発明の一本鎖ＭＨＣクラスII複合体は、既知構造のペプチドを含む、単一の抗原性ペプチドを含有することができる。Ｔ細胞受容体との相互作用の分析は、このようなＭＨＣ分子の使用により促進されるだろう。更に、提示ペプチド中の少数（約４〜６）のアミノ酸のみが、特定のＭＨＣ分子への結合にとって重要であるという事実により、Ｔ細胞との相互作用のために広範なペプチドを提示することができる。即ち、ＭＨＣアンカー残基のみに束縛される異なるペプチドのライブラリーを、Ｔ細胞の提示のためにＭＨＣ分子に共有結合させることができる。更に、治療的応用のために、ＭＨＣ分子を被検体に投与するよりは、むしろＭＨＣ融合複合体のインビボ発現のために、提示ペプチドに結合したＭＨＣ分子をコードするＤＮＡ発現ベクターを投与することができる。このようなアプローチにより、典型的には組換えタンパク質の調製を伴う費用のかかる精製工程を回避でき、そして従来のアプローチに伴う抗原の取り込み及び加工の複雑さを回避できる。本発明の空のＭＨＣ分子はまた、独特な長所を提供する。例えば、空の一本鎖ＭＨＣクラスII分子は、容易に種々の適切な提示ペプチドと結合して、装填されたＭＨＣ分子を形成することができる。本発明の空のＭＨＣ分子を便利に装填できることにより、Ｔ細胞受容体活性を調節する各提示ペプチドの能力を評価するための、多くの提示ペプチドのスクリーニングが可能になる。本発明の空のＭＨＣ分子（例えば、空の一本鎖ＭＨＣクラスII分子）は、可溶性型で、又は哺乳動物細胞の表面上で安定なポリペプチドとして発現することができる。いずれの型でも、空のＭＨＣ分子は、適切な提示ペプチドと接触させて、所望のＴ細胞調節活性を有する装填されたＭＨＣ分子を形成することができる。本発明の及び該ＰＣＴ出願の一本鎖ＭＨＣペプチド融合分子（例えば、一本鎖ＭＨＣクラスIIペプチド融合分子）は、ＭＨＣタンパク質のα又はβ鎖のＮ−末端に共有結合した提示ペプチドを含む。例えば、一本鎖ＭＨＣクラスII分子は、ＭＨＣのα又はβ鎖に共有結合した提示ペプチドを有する。好ましくは、提示ペプチドは、ペプチドリンカーにより、α又はβ鎖のＮ−末端に結合する。本発明の及び該ＰＣＴ出願の一本鎖ＭＨＣペプチド融合分子は、短縮しても（特に、膜貫通部分を含まない）、又は「完全長」であってもよく、そして膜貫通部分、又はその一部、及び細胞質ドメイン、又はその一部を含む。以下に更に詳細に考察するように、幾つかのアプローチには、膜貫通部分を含まないＭＨＣ分子が使用に適しており、また、他の応用には、膜貫通部分及び／又は細胞質部分及び／又は他のこのようなドメインを含有するＭＨＣ分子が使用される。ＭＨＣ分子が膜貫通ドメイン又はその一部を含まない幾つかの例において、１つ以上の親水性アミノ酸（好ましくは、１〜１０個のヒスチジン）をＭＨＣ分子に付加して、溶解度を上昇させることができる。本発明の及び該ＰＣＴ出願の一本鎖ＭＨＣ融合複合体（例えば、一本鎖ＭＨＣクラスIIペプチド融合複合体）はまた、好ましくは、ＭＨＣタンパク質と提示ペプチドとの間に挿入された可撓性リンカー配列を含む。提示ペプチドが、Ｔ細胞受容体の活性を調節して、Ｔ細胞増殖を誘導することができるか、又は以下に開示されるアッセイ（Ｔ細胞を増殖させるためにＴ細胞を培養し、そしてＴ細胞を一本鎖ＭＨＣペプチド融合複合体と接触させ、次にＭＨＣ複合体がＴ細胞の更なる発生を阻害するかどうかを評価するという連続工程を含むインビトロアッセイを含む）により決定されるように、Ｔ細胞発生を阻害若しくは不活化することができるように、このリンカー配列は、ＭＨＣ分子結合溝に対する提示ペプチドの有効な配置を可能にするはずである。ＭＨＣペプチド融合複合体に関して該ＰＣＴ出願において更に開示されるように、本発明のＭＨＣ複合体は、一本鎖融合タンパク質（即ち、α及びβ鎖サブユニットが、一本鎖融合タンパク質として結合している）であってよく、そして提示ペプチドは、好ましくは融合タンパク質のβ鎖に結合している。このような結合した一本鎖複合体は、多くの長所を提供することができる。詳細には、複合体から単一分子にする際に、分子の収率及び安定性を増強することができる。このことは、活性型では効率的に生成することができない可溶性分子にとっては特に重要であろう。本発明の一本鎖ＭＨＣ複合体（例えば、一本鎖ＭＨＣクラスIIペプチド融合複合体）は、Ｔ細胞受容体に認識されるペプチドのインビトロ同定、免疫応答の抑制方法（例えば、自己免疫疾患又はアレルギーのような免疫疾患の個体の治療）及び所望の免疫応答の誘導方法（例えば、哺乳動物が、免疫系弱体化したか、又は弱体化しそうな場合）（例えば、免疫系が、ウイルス感染（例えば、ＡＩＤＳにおけるような）又は化学療法（例えば、癌を治療するための放射線療法におけるような）により抑制されている場合）、並びにＨＬＡタイピング及びインビボ診断イメージングのような診断方法を含む、本明細書に開示される方法に有用である。一本鎖ＭＨＣクラスIIペプチド融合複合体をコードするＤＮＡ構築物の直接投与もまた好適である。本発明はまた、Ｔ細胞発生を誘導することができるペプチド及びＴ細胞受容体に拮抗することができるペプチド、即ち、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）のアンタゴニスト又は部分アゴニストを含む、Ｔ細胞受容体に認識されるペプチドのインビトロ同定方法を含む。本発明はまた、哺乳動物、特にヒトにおける免疫応答の更に別の抑制方法を提供し、この方法は、哺乳動物に有効量の一本鎖ＭＨＣ複合体、好ましくは一本鎖ＭＨＣクラスIIペプチド融合複合体又は装填された一本鎖ＭＨＣクラスII複合体を投与することを含む。本発明の方法は、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病又は慢性関節リウマチのような自己免疫疾患に罹患しているか、又は罹患しやすい哺乳動物、あるいは、慢性アレルギーを有する被検体又は臓器若しくは皮膚移植手術のような移植手術を受けた患者のような、有害な免疫応答に感受性の哺乳動物の治療を含む。免疫応答は、本発明そのものにより、又は代替方策を組合せて、抑制することができる。即ち、ＭＨＣペプチド融合複合体に関して前記ＰＣＴ出願に開示されるように、本発明は、Ｔ細胞のアネルギー又はアポトーシスを誘導することにより免疫応答の抑制のための治療方法を提供し、そして実質的に同時刺激性シグナルの非存在下での、有効量の１つ以上の本発明のＭＨＣ複合体、好ましくは一本鎖ＭＨＣクラスIIペプチド融合複合体又は装填された一本鎖ＭＨＣクラスII複合体の投与を提供する。典型的には、本発明の短縮型（truncated）ＭＨＣ複合体、即ち、完全長又は完全なＭＨＣ分子の膜貫通及び細胞質ドメインを含有しない、可溶性ＭＨＣ複合体、又はその一部が利用される。免疫応答の抑制のための別の方法は、Ｔ細胞アンタゴニスト又は部分アゴニストである提示ペプチドを含有する、有効量の１つ以上のＭＨＣ融合複合体又は装填されたＭＨＣ分子の投与を提供する。Ｔ細胞受容体のアンタゴニスト又は部分アゴニストである提示ペプチドを含有するＭＨＣペプチド融合複合体に関して、該ＰＣＴ出願に更に開示されるように、そのような提示ペプチドを含む本発明のＭＨＣ分子は、同時刺激性シグナルを欠く可溶性ＭＨＣ融合複合体として投与することができる。あるいは、投与は、「完全長」ＭＨＣ融合複合体（即ち、膜貫通部分を含む完全長ＭＨＣタンパク質、及びＭＨＣ分子に共有結合したアンタゴニスト又は部分アゴニスト活性を有する提示ペプチドを含有する複合体）をコードするベクターを含む、有効量のＤＮＡ配列の形態をとることができる。本発明はまた、一般に、「完全長」ＭＨＣ融合複合体（即ち、膜貫通部分を含む完全長ＭＨＣタンパク質、及びＭＨＣ分子に共有結合した提示ペプチドを含有する複合体）をコードするベクターを含む、有効量のＤＮＡ配列を投与することを含む、哺乳動物の免疫応答を誘導する方法を提供する。あるいは、このベクターは、空の一本鎖ＭＨＣ複合体をコードしてもよく、そこで発現される複合体を、装填された分子を形成する条件下で、適切な提示ペプチドと接触させる。好ましくは、完全長ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡは、Ｂ７又はＢ７−２をコードする遺伝子のようなＴ細胞同時刺激性因子をコードするＤＮＡ配列と共に哺乳動物に投与される。本明細書で使用されるとき、「Ｔ細胞同時刺激性因子」という用語は、１つ以上のＭＨＣ融合複合体の存在下で、同時刺激性シグナルを提供して、それによってＴ細胞増殖を活性化することができるペプチドを意味する。このようなＴ細胞増殖の活性化は、実施例９に例示され、以下に考察されるアッセイを含む、本明細書に開示されるアッセイにより測定することができる。更に、放射活性標識（例えば、¹²⁵Ｉ、³²Ｐ又は⁹⁹Ｔｃ）又は他の検出可能なタグを含有する、ＭＨＣ融合複合体又は装填されたＭＨＣ分子を含む、ＭＨＣ融合複合体又は装填されたＭＨＣ分子を使用する、ＨＬＡタイピング及びインビボ診断イメージングを含む、診断方法が提供される。本発明の他の側面は、以下に考察する。図面の簡単な説明 FIG.１Ａ及び１Ｂは、それぞれリンカー配列を含むＭＨＣ融合複合体を図示する。FIG.１Ｃは、イムノグロブリンに結合又は融合したＭＨＣ融合複合体を図解により示す。 FIG.２は、Ｉ−Ａ^d α１−α２遺伝子断片の単離及びそのクローニングのスキームを示す。FIG.８に、図示した手順に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを明記する。 FIG.３は、Ｉ−Ａ^d β１−β２遺伝子断片の単離、リンカー配列の付加及び抗原性ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの挿入のスキームを示す。FIG.８に、図示した手順に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを明記する。 FIG.４は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１ α１−α２のクローニングスキームを示す。F IG.８に、図示した手順に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを明記する。 FIG.５は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１ β１−β２鎖のクローニングスキームを示す。FIG.８に、図示した手順に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを明記する。 FIG.６は、Ｉ−Ａ^S α１−α２遺伝子断片の単離及びそのクローニングのスキームを示す。FIG.８に、図示した手順に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを明記する。 FIG.７は、Ｉ−Ａ^S β１−β２遺伝子断片の単離、リンカー配列の付加及び抗原性ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの挿入のスキームを示す。FIG.８に、図示した手順に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを明記する。 FIG.８（SEQ ID NOS:26〜74）は、ＭＨＣ融合複合体を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。 FIG.９（FTG.９Ａ〜９Ｆを含む）（SEQ ID NOS:75〜98）は、可溶性ＭＨＣ融合複合体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。 FIG.１０Ａ及び１０Ｂは、以下の実施例２に使用される哺乳動物細胞発現ベクターを示す。 FIG.１１Ａ及び１１Ｂは、以下の実施例２に記載されるＤＮＡ構築物を示す。 FIG.１１Ａ及び１１Ｂ（及びFIG.１５、１６Ａ及び１６Ｂ）において、「ＰＥ」という表示は、プロモーター及びエンハンサーを表し、「ＬＳ」という表示は、リーダー配列エキソンを表し、そして「ＨＣ」という表示は、重鎖を表す。 FIG.１２は、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発によるκ鎖２．７kb挿入物への制限部位の導入のスキームを示す。 FIG.１３は、哺乳動物細胞発現ベクターにおけるＭＨＣ（クラスIIα）／κ鎖定常領域をコードする融合遺伝子の構築のスキームを示す。 FIG.１４（SEQ ID NOS:99〜102）は、変異した２．７kb断片の配列決定に使用されるプライマーを示す。 FIG.１５は、Ｍ１３突然変異誘発及びＭＨＣIIβ可変遺伝子のクローニングのスキームを示す。 FIG.１６Ａ及び１６Ｂは、ＭＨＣ II／Ｉｇキメラタンパク質の発現用のベクターを示す。 FIG.１７は、完全長ＭＨＣ融合複合体発現ベクターの構築のスキームを示す。 FIG.１８Ａ及び１８Ｂ（SEQ ID NOS:103〜109）は、完全長ＭＨＣ融合複合体のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。 FIG.１９（全７枚）は、以下の実施例１２で行われるクローニングスキームを示す。FIG.２０に、図示したクローニングスキームに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを図示する。 FIG.２０（SEQ ID NOS:110〜112）は、ＭＨＣ融合複合体の構築に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの配列を図示する。 FIG.２１は、以下の実施例１３の４つのクローンの機能的な活性を、陰性対照（ＮＳＯ）及び陽性対照（Ａ２０）と共にグラフに示す（ここで、ＤＯ１１．１０培養上清の最初の４つの希釈液のＯ．Ｄ．値が表示される）。 FIG.２２は、以下の実施例１５のＴ細胞増殖アッセイの結果をグラフに示す。 FIG.２３は、以下の実施例１６のＴ細胞増殖アッセイの結果をグラフに示す。 FIG.２４は、一本鎖ＭＨＣ融合複合体を図示する。 FIG.２５（全４枚）は、以下の実施例１７で行われるクローニングスキームを示す。 FIG.２６（SEQ ID NOS:113〜120）は、ＭＨＣ融合複合体の構築に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの配列を図示する。 FIG.２７（SEQ ID NO:121）は、ＳＳＣ１−本鎖遺伝子のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。 FIG.２８（SEQ ID NO:122）は、ＳＣＴ１−本鎖遺伝子のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。 FIG.２９（SEQ ID NO:123）は、ＳＣＥ１−本鎖遺伝子のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。 FIG.３０は、一本鎖ＩＡ^d／ＯＶＡ３２３−２２９ＭＨＣ融合分子（即ち、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ）をコードする遺伝子の図解表示である。Kozakコンセンサス配列が示される。矢印は、シグナルペプチダーゼ開裂部位を表す。ＩＡ^dβ１− β２及びＩＡ^d∝ドメイン中の「／／」は、よく判るように除外したFIG.２８のアミノ酸及びヌクレオチド配列を表す。ＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（点線）は、ｓｃ−ＩＡ^d／ブランクＭＨＣ分子には存在しない。 FIG.３１Ａ及び３１Ｂは、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ分子の細胞表面発現（FIG.３１Ａ）及びＴ細胞誘導活性（FIG.３１Ｂ）を示すグラフである。 FIG.３２は、昆虫細胞における、共有結合したＯＶＡペプチドを有するｓｃ− ＩＡ^dＭＨＣ分子（ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ）及びＯＶＡペプチドを含まないｓｃ− ＩＡ^dＭＨＣ分子（ｓｃ−ＩＡ^d／ブランク）の発現を示す２つのゲルの写真である。 FIG.３３は、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡタンパク質がＴ細胞におけるＩＬ−２発現を誘導することを示すグラフである。 FTG.３４Ａ、３４Ｂ及び３４Ｃは、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ及びsｃ−ＩＡ^d／ｇＤがＴ細胞におけるＩＬ−２発現を誘導することを示すグラフである。FIG.３４Ｃは、装填されたｓｃ−ＩＡ^d分子（中央の四角）が、対応するｓｃ−融合複合体（右の四角）よりも大きくＴ細胞を誘導することを証明する。 FIG.３５は、抗Ｔ細胞受容体抗体（抗−ＴＣＲｍＡｂ）又はｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡが、Ｔ細胞アポトーシスを誘導することができることを示す、臭化エチジウム染色したゲルの写真である。レーン３及び４のヌクレオソームのはしごは、アポトーシスの顕著な特徴である。 FIG.３６Ａ及び３６Ｂは、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡのインビボ発現が、Ｔ細胞のクローンの拡大を抑制することを証明するグラフである。発明の詳細な説明上で考察され、前記ＰＣＴ出願番号PCT/US95/09816（再び「ＰＣＴ出願」）に開示されるように、本発明者らは、ＭＨＣクラスIIペプチド融合複合体、及びこのような複合体をコードする発現ベクター、並びにこのような融合複合体及び発現ベクターの使用方法を明らかにした。一般に、ＭＨＣペプチド融合複合体の調製は、本明細書に開示される手順及び受け入れられている組換えＤＮＡ技術（例えば、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切断、ＤＮＡの連結、宿主の形質転換又はトランスフェクション、宿主の培養、並びに発現された融合複合体の単離及び精製）により達成することができる。このような手順は、一般に既知であり、例えば、Sambrook et al.，Molecular Cloning(2d ed．1989)に開示されている。以下に更に充分に考察するように、これらの方法はまた、本発明の空の及び装填されたＭＨＣ分子の構築にも適している。即ち、本発明の空の及び装填されたＭＨＣ分子を調製するために、融合した提示ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、空の／装填された分子をコードする遺伝子構築物に含めないか、又は本明細書に例示されるように、生成した融合構築物を適切な組換え法により処理して結合した提示ペプチド部分を除去する以外は、ＭＨＣ融合複合体の調製のための以下の手順及び例を利用することができる。更に、ＭＨＣ融合分子に関する以下の考察（例えば、好適な提示ペプチド、好適なリンカー、分子の分子量など）は、同様に本発明の空の及び装填されたＭＨＣ分子に応用可能である。更に具体的には、所望のＭＨＣタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば以下の実施例１に開示されるように、適切な細胞系から得られる。ＭＨＣタンパク質をコードするＤＮＡの他の供給源が既知である（例えば、ヒトリンパ芽球細胞）。一旦単離されると、ＭＨＣ分子をコードする遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は他の当該分野で既知の方法により増幅することができる。ＭＨＣペプチド遺伝子を増幅するための適切なＰＣＲプライマーにより、ＰＣＲ産物に制限部位を付加することができる。例えば、短縮型の融合複合体（具体的には、膜貫通部分又は細胞質部分を含まず、ＩｇＧのようなイムノグロブリンに結合している可溶性ＭＨＣ融合複合体）の発現には、ＰＣＲ産物は、好ましくは、ＭＨＣ−イムノグロブリン融合複合体の適正な発現及び分泌に必要な、ＩｇＧスプライシング部位及びリーダー配列を含む。ＰＣＲ産物はまた、好ましくは、リンカー配列をコードする配列、又はこのような配列の連結のための制限酵素部位を含む。適切なプライマー、ＰＣＲ条件及び発現ベクター構築技術は、例えば、以下の実施例及び図面に開示される。提示ペプチドリンカー配列は、好ましくは、提示ペプチドをＭＨＣ分子の結合溝に有効に配置することができるペプチドをコードするヌクレオチド配列である。本明細書で使用されるとき、「提示ペプチドが、ＭＨＣ分子の結合溝に有効に配置される」若しくは「Ｔ細胞の活性を調節することができるＭＨＣ融合複合体」という句、又は他の同様な句は、提示ペプチドと融合複合体が、Ｔ細胞受容体の活性を調節して、Ｔ細胞増殖を誘導することができるか、又は以下に開示されるアッセイ（Ｔ細胞を増殖させるためにＴ細胞を培養し、そしてＴ細胞を本発明のＭＨＣ融合複合体と接触させ、次にＭＨＣ融合複合体がＴ細胞の更なる発生を阻害するかどうかを評価するという連続工程を含むアッセイを含む）により決定されるように、Ｔ細胞発生を阻害若しくは不活化することができるように、ＭＨＣタンパク質に結合した提示ペプチドが配置されていることを意味するものである。好ましくは、提示ペプチドリンカー配列は、約７〜２０個のアミノ酸、更に好ましくは約８〜１６個のアミノ酸、更になお好ましくは約８〜１２個のアミノ酸を含む。リンカー配列は、単一の望ましくないコンホメーションに提示ペプチドを保持することのないように、好ましくは可撓性である。リンカーは、可撓性を備えるために、好ましくは、グリシン、アラニン及びセリンのような、側鎖が小さなアミノ酸を主に含む。好ましくは約８０又は９０％あるいはそれ以上のリンカー配列は、グリシン、アラニン又はセリン残基であり、特にグリシン及びセリン残基である。好ましくは、リンカー配列は、可撓性を阻害し得るプロリン残基を含まない。ＭＨＣクラスII分子を含有するＭＨＣ融合複合体では、リンカー配列は、適切にはＭＨＣ分子のβ鎖に結合しているが、リンカー配列はまた、ＭＨＣ分子のα鎖に付加されてもよい。ＭＨＣクラスIIβ鎖分子に提示ペプチドを共有結合するために、リンカーのアミノ酸配列は、ＭＨＣクラスIIβ鎖のＮ−末端残基から提示ペプチドのＣ−末端残基まで、約３０Åに及んでよい。例えば、図面のFIG.１Ａ及び１Ｂを参照のこと。このようなβ＋ペプチド鎖が、α鎖と共に発現されるとき、結合した提示ペプチドは、α１及びβ１結合溝中に折り畳まれて、FIG.１Ｃに一般的に図示されるように機能性ＭＨＣ分子が生じる。１つの適切なリンカー配列は、ＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧ（SEQ ID NO:1)（即ち、Ala Ser Gl y Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly）であり、好ましくはＭＨＣクラスIIタンパク質のβ１ドメインの最初のアミノ酸に結合している。抗体可変領域を結合するのに使用して成功した、任意の多くの可撓性リンカーのデザインを含む、異なるリンカー配列を使用することができる［M．Whitlow et al.，Methods:A Com panion to Methods in Enzymology，2:97-105(1991)を参照のこと］。適切なリンカー配列は、経験的に容易に同定することができる。例えば、リンカー配列を含むＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡ構築物は、クローニングして発現させることができ、そして融合複合体は、その複合体が、Ｔ細胞受容体の活性を調節して、Ｔ細胞増殖を誘導することができるか、又は以下に開示されるアッセイにより決定されるように、Ｔ細胞発生を阻害若しくは不活化することができるかどうかを決定するために試験することができる。リンカー配列の適切なサイズと配列はまた、ＭＨＣ分子の予測されるサイズと形に基づいて、従来のコンピュータモデル化法により決定することができる。好ましくは、目的の提示ペプチド（例えば、抗原性又はアンタゴニスト提示ペプチド）をコードする本質的に任意のヌクレオチド配列を構築物に結合することができるように、リンカー配列及びＭＨＣタンパク質をコードする融合ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物中に制限部位を設計する。例えば、以下の実施例に例示される１つの好適な系では、適切な制限部位（例えば、AflII及びNheI部位）が、リーダー配列の末端とリンカーの開始部位の間に含まれ、ＭＨＣ分子のβ 鎖遺伝子への広範な提示ペプチドの挿入を促進する。例えば、図面のFIG.３を参照のこと。特に好適なリーダー配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図面の FIG.１８Ａ及び１８Ｂに図示される。ＭＨＣ融合複合体の提示ペプチド成分は、上で考察されたようにＴ細胞の活性を調節することができるはずである。クラスIIＭＨＣ分子を含有するＭＨＣ融合複合体に関して、好ましくは、提示ペプチドは、約４〜３５個のアミノ酸、更に好ましくは約６〜約３０個のアミノ酸、更になお好ましくは約８〜約２５個のアミノ酸を有する。クラスＩＭＨＣ分子を含有するＭＨＣ融合複合体に関して、好ましくは、提示ペプチドは、約４〜２５個のアミノ酸、更に好ましくは約６〜約２０個のアミノ酸、更になお好ましくは約６〜約１５個のアミノ酸、更により好ましくは８〜約１０個のアミノ酸を有する。クラスＩ及びクラスII ＭＨＣ分子は、異なるペプチド配列に対して選択的な結合を示す。最近になって、クラス II結合ペプチドにおいて、アンカー残基を特徴とするＭＨＣ対立遺伝子特異的ペプチドモチーフが同定された［F．Sinigaglia et al．Curr．Opin．in Immun.， 6:52-56(1994)］。例えば、ヒトクラスII ＨＬＡ−ＤＲＩ分子において、芳香族アミノ酸（例えば、Tyr、Phe、又はTrp）は、通常ペプチドのアミノ末端（１位）、４位の疎水性残基（例えば、Met又はLeu）及び６位の小さなアミノ酸（例えば、Ala又はGly）の近くに見い出される。他のＭＨＣ分子は、異なるモチーフを有する（例えば、クラスII分子については、Sinigag1ia，前出を参照のこと；クラスＩ分子については、K.Parker et al.,J.Tmmunol.,152:163-175(1994)を参照のこと）。好適な提示ペプチドは、最適なＭＨＣ結合を促進するために、所望のＭＨＣ結合モチーフを含む。即ち、例えば、ヒトクラスII ＨＬＡ−ＤＲ１ＭＨＣ分子では、芳香族アミノ酸（例えば、Tyr、Phe、又はTrp）は、好ましくは提示ペプチドのアミノ末端（１位）、提示ペプチドの４位の疎水性残基（例えば、 Met又はLeu）、及び提示ペプチドの６位の小さなアミノ酸（例えば、Ala又はGly ）の近くに位置する。本発明の免疫抑制方法（例えば、自己免疫疾患又はアレルギーを治療するため、又は有害なＴ細胞応答を抑制するため）に関して、提示ペプチドは、好ましくは標的疾患においてＴ細胞の活性化を担当することが知られているか若しくは推測されるペプチドと同一であるか、又は相同（例えば、少なくとも約８０又は９０％を超える共有配列）であってよい。即ち、例えば、ＭＰＢペプチド８０−１０５は、多発性硬化症患者から単離されたＭＰＢ特異的なＴ細胞の３０％以上に認識され［E．Meinl et al.，J．Clin.Invest.，92:2633-26 43(1993)を参照のこと］、本明細書に開示される免疫抑制応用に使用されるＭＨＣ融合複合体における提示ペプチドとして適している。更には、特定の提示ペプチドの活性（即ち、抗原性又はアンタゴニスト若しくは部分アゴニスト性）は、以下に開示されるインビボアッセイを含む、本明細書に開示される方法により、経験的に容易に決定することができる。ＭＨＣ融合複合体をコードするベクターを作製するために、ＭＨＣ分子をコードする配列を、適切なリガーゼを使用することにより、提示ペプチドをコードする配列に結合する。提示ペプチドをコードするＤＮＡは、天然資源からＤＮＡを単離することにより、又は既知の合成方法（例えば、リン酸トリエステル法）により得ることができる。例えば、Oligonucleotide Synthesis,IRL Press(M.Gait ,ed.，1984)を参照のこと。合成オリゴヌクレオチドはまた、市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して調製することができる。ＭＨＣ分子をコードするヌクレオチド配列は、提示ペプチドをコードするＤＮＡ配列に直接結合することができるか、又は更に典型的には、上で考察されるリンカー配列をコードするＤＮＡ配列を、ＭＨＣ分子をコードする配列と提示ペプチドをコードする配列との間に挿入して、適切なリガーゼを使用して連結することができる。他のヌクレオチド配列も遺伝子構築物に含めることができる。例えば、提示ペプチドに融合したＭＨＣペプチドをコードする配列の発現を制御するプロモーター配列、又はＭＨＣ融合複合体を細胞表面若しくは培地に振り向けるリーダー配列を、構築物に含めるか、又は構築物を挿入する発現ベクターに存在させることができる。イムノグロブリン又はＣＭＶのプロモーターが、特に好適である。以下の実施例を参照のこと。強力な翻訳開始配列もこの構築物に含めて、翻訳開始の効率を増強することができる。好適な開始配列は、コザック（Kozak）コンセンサス配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧ）（SEQ ID NO:2）である。図面のFIG.１８Ａ及び１８Ｂも参照のこと。好ましくは、ＤＮＡ構築物に含まれるリーダー配列は、目的の提示ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドが、ＭＨＣ分子に結合することができるように、有効に配置された制限部位を含有する。適切には、制限部位は、提示ペプチドのコード領域の前に位置する、例えば、約２〜１０コドンの長さのリーダー配列の３−末端（本明細書ではしばしば結合部配列と呼ばれる）に組み込むことができる。特に好適な制限部位は、AflII部位であるが、他の切断部位も提示ペプチドコード領域の前に組み込むことができる。上で考察されたように、典型的にはリンカーをコードする配列の開始部に位置する、第２の制限部位と組合せた、このような制限部位の使用により、ＭＨＣ融合複合体のＤＮＡ構築物中への広範な提示ペプチドをコードする配列の迅速かつ直接の挿入が可能になる。好適なリーダー配列は、強力な翻訳開始部位と、そのｍＲＮＡの３’一末端にキャップ部位を含有する。好ましくは、リーダー配列は、クラスＩＭＨＣ分子のαドメインに結合し、そして好ましくはリーダー配列は、クラスII ＭＨＣ分子のβドメインに結合する。好適なリーダー配列は、ＭＨＣ融合複合体の分泌発現を提供する。該ＰＣＴ出願に開示されるように、多くの方策を使用して、本発明のＭＨＣ融合複合体を発現することができる。例えば、上述のＭＨＣ遺伝子融合構築物は、制限酵素を使用して、構築物の挿入のためにベクター中で切断を行い、続いて連結するなどの既知の方法により、適切なベクター中に組み込むことができる。遺伝子構築物を含有するベクターは、次にＭＨＣ融合ペプチド又は複合体の発現のために適切な宿主に導入する。一般には、Sambrook et al.,前出を参照のこと。適切なベクターの選択は、クローニングのプロトコールに関連する要因に基づき、経験的に行うことができる。例えば、ベクターは、利用される宿主と適合性であり、かつその宿主の適正なレプリコンを有するべきである。更にベクターは、発現すべきＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡ配列を収容可能である必要がある。適切な宿主細胞は、真核生物及び原核生物細胞、好ましくは、容易に形質転換することができ、培地中で迅速な増殖を示す細胞を含む。特に好適な宿主細胞は、大腸菌（E．coli）、枯草菌（Bacillus subtillus）などのような原核細胞、並びに動物細胞及び酵母の菌株（例えば、サッカロミセス・セレビジエ（S．c erevisiae））のような真核細胞を含む。哺乳動物細胞、特にＪ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−Ｏ又はＣＨＯが、一般に好適である。他の適切な宿主は、例えば、Ｓｆ９のような昆虫細胞を含む。従来の培養条件を利用する。Sambrook、前出を参照のこと。安定な形質転換又はトランスフェクションされた細胞系は、次に選択することができる。ＭＨＣ融合複合体を発現する細胞は、既知の手順により測定することができる。例えば、イムノグロブリンに結合したＭＨＣ融合複合体の発現は、結合したイムノグロブリンに特異的なＥＬＩＳＡ及び／又はイムノブロッティングにより測定することができる。可溶性ＭＨＣ融合複合体の調製のための１つの好適なプロトコールでは、提示ペプチド及びＭＨＣ分子（クラスII）のβ１−β２ドメインをコードするＤＮＡ配列は、提示ペプチドのＣ−末端が、β１ドメインの最初の方のアミノ酸、好ましくはβ１ドメインの第１のアミノ酸に、可撓性リンカー配列により結合するように配置する。このような構築物は、図面のFTG.１Ａ及び１Ｂに図示される。クラスＩＭＨＣ分子については、好ましくは提示ペプチドがα鎖のＮ−末端に結合するように、好ましくは提示ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＭＨＣ分子のαドメインに結合させる。上で考察したように、好ましくは、制限部位は、目的の（即ち、抗原性又はアンタゴニスト）提示ペプチドをコードする本質的に任意のオリゴヌクレオチドがβ鎖遺伝子に結合することができるように、リーダー配列の末端とリンカーの開始部の間に設計される。可溶性発現のために、 α１−α２及びペプチドが結合したβ１−β２ドメインは、適切にはイムノグロブリン、好ましくは、FIG.１Ｃに図示されるように、それぞれイムノグロブリンのκ鎖及び重鎖の定常ドメインに融合される。可溶性発現のためのα及びβへのこのような融合に好適なイムノグロブリンは、例えば、ＩｇＧ２ｂの軽鎖定常ドメイン及びＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む。発現されたＭＨＣ融合複合体は、既知の方法により単離し精製することができる。典型的には、培養培地を遠心分離し、次に上清を、親和性若しくは免疫親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテイン−Ａ又はプロテイン−Ｇ親和性クロマトグラフィー）により、又は結合したＭＨＣのような発現した融合複合体、若しくはそのイムノグロブリン領域に結合するモノクローナル抗体の使用を含む免疫親和性プロトコールにより精製する。例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１配列を含有するＭＨＣ融合複合体は、一般に既知で開示されている手順（例えば、Harlow,E .et al.，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)を参照のこと）により、モノクローナル抗体Ｌ２４３−セファロースカラムで親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。Ｌ２４３モノクローナル抗体は、適正に折り畳まれたＨＬＡ−ＤＲ１分子のコンホメーションのエピトープに特異的であり［J．Gorga et al.，J．Biol．Chem.，262:16087-16094］、したがって生物学的に活性なＭＨＣ融合複合体の精製には好適であろう。ＭＨＣ融合複合体はまた、精製の際に助けとなる配列を含有してもよい；例えば、６×Hisタグの使用を開示する以下の実施例１７を参照のこと。短縮型ＭＨＣ融合複合体は、ＭＨＣ融合複合体を、発現後に培地（例えば、生理的条件；界面活性剤などが実質的に又は完全に存在しない）中に分泌することができるように、充分に短縮されたＭＨＣ分子を含有する。即ち、短縮型ＭＨＣ融合複合体は、疎水性残基の多い領域（典型的にはＭＨＣ分子の膜貫通及び細胞質ドメイン）を含まないが、少なくともこれらのドメインの一部は、ＭＨＣ分子を上で考察したように分泌することができるならば、適切には存在してよい。即ち、例えば、好適な短縮型ＤＲ１ＭＨＣ分子では、好ましくはＭＨＣ分子のβ 鎖の約１９９〜２３７残基及びα鎖の約１９３〜２３０残基が、短縮型ＭＨＣ融合分子には含まれていない。以下の実施例を参照のこと。本明細書で開示された配列に加えて、ＭＨＣクラスＩ及びII分子のドメインの配列が以前に開示されている（例えば、上述の刊行物を参照のこと）。短縮型ＭＨＣ融合複合体もまた当然ながら経験的に、即ち、ＭＨＣ複合体が上で考察したように発現後に培地に分泌されるかどうかを試験することにより、容易に同定することができる。短縮型ＭＨＣ融合複合体は、幾つかの方法（例えば、可溶性ＭＨＣ分子の発現、又は完全長ＭＨＣ融合複合体の、膜貫通及び／又は細胞質ドメインの少なくとも一部の酵素（例えば、パパイン）開裂）により調製することができる。完全長ＭＨＣ分子は、膜貫通部分及び／又は細胞質ドメイン及び／又は他の細胞膜あるいはその実質部分（例えば、このような配列の約８０又は９０％以上）を含む。完全長ＭＨＣクラスII分子では、一般にα及びβ鎖の両方が、膜貫通及び細胞質ドメインに結合しているが、特に一本鎖ＭＨＣ分子の場合には、α及び β鎖の一方のみが、膜貫通及び細胞質ドメインに結合していてよい。以下に考察するように、完全長ＭＨＣ分子は、疎水性の膜間ドメインにより、あるいはホスファチジルイノシトールの共有結合したグリコシル化型のような他のアンカードメインの翻訳後付加により、細胞膜に繋ぎ止めることができる。上で及び該ＰＣＴ出願で考察したように、一本鎖ＭＨＣ融合複合体、即ち、非共有相互作用によりα及びβ鎖とペプチドが会合している未変性ヘテロ三量体のクラスII／ペプチド複合体のような複数鎖の凝集体よりも、むしろ一本鎖ポリペプチドからなる融合複合体が望ましい。一本鎖ＭＨＣクラスII複合体の場合に、 α及びβ鎖サブユニットは、好ましくはその鎖融合タンパク質のβ鎖に結合している提示ペプチドを含む一本鎖融合タンパク質として結合している。このような好適な一本鎖ＭＨＣ分子は、FIG.２４及びFIG.３０に図示される。好ましくは、 α及びβ鎖を結合するためにリンカー配列が使用される。ＭＨＣ分子のドメインを結合するために使用されるこのようなリンカー配列は、本明細書では時に「一本鎖リンカー配列」と呼び、それによって提示ペプチドとＭＨＣ分子の間に挿入され、これらを共有結合させる、上で考察したリンカー配列とは区別する。好ましくは一本鎖ＭＨＣクラスII複合体は、β２ドメインのカルボキシル末端とα１ドメインのアミノ末端との間で結合するが、ＭＨＣ複合体の複数のドメインを他の位置を介して結合してもよい。一本鎖リンカー配列は、結合したＭＨＣ分子を、折り畳んで活性型、即ち、ＭＨＣ分子がＴ細胞の活性を調節することができる型にすることができる。このような有効な一本鎖リンカー配列は、経験的に容易に決定することができる。即ち、例えば、α及びβ鎖がリンカー配列により結合されている一本鎖ＭＨＣ分子をコードするＤＮＡ構築物を、クローニングし発現させることができ、そしてその一本鎖ＭＨＣ分子を、その複合体が、Ｔ細胞受容体の活性を調節して、Ｔ細胞増殖を誘導することができるか、又は以下に開示されるアッセイにより測定されるようにＴ細胞発生を阻害することができるかどうか決定するために試験することができる。一本鎖リンカー配列の長さと組成の両方とも、一般に変化させることができる。例えば、適切な一本鎖リンカー配列の長さは、リンカー配列がＭＨＣ複合体のポリペプチド鎖に結合する位置により変化してよい；言い換えると、リンカー配列の長さは、リンカー配列が架橋するポリペプチド間の「ギャップ」の幾何学構造により変化し得る。一本鎖リンカー配列もまた、好ましくは活性型への一本鎖分子の折り畳みが可能であるように、可撓性である方がよい。即ち、リンカー配列は、好ましくは、可撓性を備えるように、グリシン、アラニン及びセリンのような小さな側鎖を有するアミノ酸を主として含む。好ましくは、リンカー配列の約８０若しくは９０％又はそれ以上が、グリシン、アラニン又はセリン残基、特にグリシン及びセリン残基である。好ましくは、α及びβ鎖の間のこのリンカー配列は、可撓性を阻害してしまう、プロリン残基を含有しない。好ましくは、β２ドメインのカルボキシル末端とα１ドメインのアミノ末端の間に位置するリンカー配列は、約１５〜４０個のアミノ酸、更に好ましくは約１５〜３０個のアミノ酸を含む。特に好適なリンカー配列は、以下の実施例１７に開示される。一本鎖リンカー配列の適切なサイズと配列もまた、従来のコンピューター法により決定することができる；以下の実施例１７を参照のこと。一本鎖ＭＨＣ複合体は、上記及び該ＰＣＴ出願、更には実施例１７〜１９及び２５を含む以下の実施例で考察されるように、調製することができる。例えば、所望のＭＨＣタンパク質をコードするＤＮＡは、適切な細胞系から得て、単離した遺伝子は、ＰＣＲ又は他の手段により増幅することができる。ＭＨＣクラスII 分子の場合に、α１−α２遺伝子断片を、ベクターにクローン化し、次に挿入された一本鎖リンカー配列を含むβ１−β２ドメインの遺伝子断片をクローニングすることができる。次に単一のベクターを適切な宿主中で発現させて、一本鎖分子を回収し、所望ならば精製する。実施例１７〜１９を含む、以下の実施例を参照のこと。また、一本鎖抗体の調製について記載し、その方法は本発明の一本鎖ＭＨＣ融合複合体に対して一般に利用することができる、Ladner et al.の米国特許第5,260,203号も参照のこと。好適な調製方法において、ＭＨＣクラスII分子のα及びβ鎖のコード領域は、特にＢ細胞系又は他のＭＨＣ分子供給源からＰＣＲによりコード領域を単離することにより、得られる。一本鎖β−α融合ＭＨＣ融合分子をコードする配列は、 β鎖遺伝子の膜貫通伸長ドメインをコードする配列を、上で考察されたように、成熟α鎖（特に、α鎖遺伝子の第１のコドンで）にβ鎖遺伝子を結合させる一本鎖リンカー配列で置換することにより構築することができる。α鎖遺伝子は、適切には、一本鎖融合複合体の膜結合発現のためのその膜貫通領域を含有するか、又はα鎖遺伝子は、一本鎖MHC融合複合体の可溶性発現のための細胞外領域の末端で短縮されていてもよい。提示ペプチドのための適切な制限部位及びリンカーは、好ましくは、β鎖リーダーとβ鎖の第１コドンとの間に含まれる。次に本質的にはどの提示ペプチドのコード領域でも、創り出した制限部位にオリゴヌクレオチドとして導入することができる。生じた構築物は、次に適切には哺乳動物又は細菌のプロモーター（本明細書に開示される特異的なプロモーターを含む）の制御下に配置される。このような１つの好適なＭＨＣクラスII一本鎖構築物は、連続した、β鎖リーダー／提示ペプチド／リンカー配列／β１−β２細胞外領域／一本鎖リンカー配列／α１−α２細胞外領域をコードする、結合したヌクレオチド配列を含有する。ＭＨＣ一本鎖ＤＮＡ構築物は、適切には、細菌、バキュロウイルス−昆虫細胞及び哺乳動物発現系（本明細書に開示される特異的な発現系を含む）に導入し、次に発現させ、所望ならば精製する。一本鎖ＭＨＣ分子は、完全長（即ち、ＭＨＣ分子が、細胞内ドメインに会合しており、例えば、α又はβ鎖の、完全な又は実質的な量（例えば、配列の８０％を超える）の膜貫通及び／又は細胞質部分を含有する）であるか、又は可溶性発現について上で考察されたように短縮されていてもよい。このような短縮型一本鎖ＭＨＣ分子及び完全長の同分子は、上述のように及び複数のポリペプチドのＭＨＣ複合体に関する実施例に記載されるように、産生させることができる。ＭＨＣクラスII分子では、完全長分子は、α及びβ鎖のうち一方のみ（好ましくはα 鎖）が、膜貫通及び細胞質ドメインに結合している。好適な完全長一本鎖融合ＭＨＣクラスII複合体は、連続して共有結合した、１）提示ペプチド、２）膜貫通及び細胞質ドメインを欠くクラスIIβ鎖、３）一本鎖リンカー配列、及び４）膜貫通及び細胞質ドメイン又は膜アンカードメインを含有するクラスIIα鎖を含む。好適な可溶性一本鎖融合ＭＨＣクラスII複合体は、連続して共有結合した、１）提示ペプチド、２）膜貫通及び細胞質ドメインを欠くクラスIIβ鎖、３）一本鎖リンカー配列、及び４）膜貫通及び細胞質ドメインを欠くクラスIIα鎖を含む。完全長ＭＨＣ複合体（一本鎖及び非一本鎖分子の両方）に関して、ＭＨＣタンパク質は、疎水性膜間ドメイン（膜貫通ドメイン）により、更にはホスファチジルイノシトールの共有結合したグリコシル化型（ＧＰＩ膜アンカー）の翻訳後付加により、細胞膜に繋ぎ止めることができる。ＭＨＣクラスII分子のα及びβ鎖で典型的には、膜貫通ドメインは、α２及びβ２ドメインのカルボキシル末端側に連結した約２５個の疎水性アミノ酸からなる。これらの残基により、このタンパク質が膜をまたぐことが可能になる。膜貫通領域は、これらの各鎖のカルボキシル末端の細胞質尾部を含む約１０〜１５残基で終わる。これらの膜貫通及び細胞質領域が、ＧＰＩ結合のシグナル配列で置換することができること、及びキメラのＧＰＩで繋ぎ止めたクラスII分子が、膜結合型であることが、証明されている［D．Wettstein et al.，J．Exp．Med.，174:219-228(1991)］。ＧＰＩ結合膜アンカードメインは、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９及びヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＨＰＡＰ）を含む多くのタンパク質で明らかにされている［D.Wettstein et al.,J.Exp.Med.,174:219-228(1991);D.Kooyman et al.］。例えば、ＨＰＡＰの３８個のカルボキシル末端アミノ酸は、ＧＰＩ結合のシグナル配列として充分に作用する。このドメインをコードするＤＮＡ配列が、ＭＨＣクラスIIα又はβ鎖の可溶性部分のような分泌された分子に結合するならば、膜結合したキメラ分子が形成され[D.Wettstein et al.,J.Exp.Med.,174:219-228(1 991)］、このようなアプローチを利用して、ペプチド結合一本鎖クラスII ＭＨＣ分子を細胞膜に繋ぎ止めることができる。本発明のＭＨＣ融合分子、並びに空の及び装填されたＭＨＣ分子の分子量は、特に、その分子が可溶性であるか又は完全長（膜結合性）であるかにより変化する。可溶性ＭＨＣクラスII融合複合体は、一般に、約４５kDaを超える分子量を有し、そして膜貫通及び細胞質ドメインを含まない成熟α及びβ鎖は、それぞれ、約２０kDaを超える分子量、更に典型的には約２１〜約２６kDaの間の分子量を有する。典型的には、膜貫通及び細胞質ドメインを含まない成熟一本鎖ＭＨＣクラスII分子は、約４８〜約５０kDaの分子量を有する。完全長（膜結合性）分子では、成熟α及びβ鎖は、一般に、約２５kDaを超える分子量、好ましくは約２６〜約３０kDaの間の分子量を有する。典型的には、単一の（α又はβ鎖に結合している）膜貫通又は膜アンカードメインを含む、成熟一本鎖ＭＨＣクラスII融合分子は、約４９kDaを超える分子量、好ましくは約５０〜５２kDaの間の分子量を有する。上述の全ての分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイによる。多価のＭＨＣ融合複合体、又は空の若しくは装填されたＭＨＣ分子は、多くの応用に望ましい。ＭＨＣ−抗原性ペプチド複合体の価数は、Ｔ細胞受容体に及ぼす複合体の効果に影響する。例えば、３ＤＴ５２．５Ｔ細胞ハイブリドーマの活性化には、多価にしたＭＨＣ−抗原分子が必要である。一価の可溶性ＭＨＣ複合体は、このＴ細胞を刺激することができない［J．McCluskey et al.，J.Immunol ogy，141:1451-1455(1988)］。所望の多価のＭＨＣ融合複合体は、イムノグロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ又はＦａｂ'₂に結合した複合体を含む。化学的に架橋したＭＨＣ複合体（例えば、デンドリマー（dendrimers）に架橋した）も適切な多価の種である。例えば、ＭＨＣ複合体は、Cys又はHisのような、化学的に反応性の側鎖を有するアミノ酸残基をコードする配列を含めることにより、遺伝子的に修飾することができる。このような化学的に反応性の側鎖を有するアミノ酸は、ＭＨＣ複合体の種々の位置、好ましくはＭＨＣ複合体の提示ペプチド及び結合ドメインとは遠位に配置することができる。例えば、提示ペプチドから遠位のＭＨＣ分子のβ鎖のＣ−末端は、適切にはこのような反応性アミノ酸を含有してよい。適切な側鎖を使用して、２つ以上のＭＨＣ融合複合体を適切なデンドリマー粒子に化学的に結合して、多価のＭＨＣ融合複合体を得ることができる。デンドリマーは、その表面に多くの異なる官能基のいずれか１つを有してよい合成化学ポリマーである[D.Tomalia,AldrichimicaActa,26:91:101(1993) ］。本発明に使用するためのデンドリマーの例としては、例えば、Ｅ９星形ポリアミンデンドリマー及びＥ９櫛形ポリアミンデンドリマーを含み、これらは、システイン残基を結合することができる。本発明のＭＨＣ融合複合体、又は本発明の空の若しくは装填された分子の両方の鎖を発現する、単一の発現ベクターを構築すること、即ち、ＭＨＣ融合複合体のα及びβ鎖両方をコードする配列が、それぞれ、単一の鎖分子でないとしても、単一の発現ベクターに連結していることが望ましい。このような発現ベクターでは、別々のベクターがＭＨＣ融合複合体の各鎖について使用される場合、特にベクターが導入された細胞の選択が困難である場合よりも良好な結果が得られる。また、ＭＨＣ融合複合体の両方の鎖、及び他の物質、特にＢ７又はＢ７−２のようなＴ細胞同時刺激因子をコードする単一の発現ベクターを構築すること、即ち、ＭＨＣ融合複合体の両方の鎖をコードする配列及び同時刺激因子をコードする配列を、それぞれ、単一の発現ベクターに連結して、単一の形質転換操作を可能にすることが望ましい。再度、このアプローチにより、２回以上形質転換又はトランスフェクションされた細胞の困難な可能性のある選択を回避することができる。本発明の融合複合体のＭＨＣ分子並びに空の及び装填された分子は、適切には、天然に生じるＭＨＣ分子（例えば、ヒト（クラスＩ又はクラスII）、マウス若しくは他の齧歯類、又は他の哺乳動物のＭＨＣ分子）にアミノ酸配列が対応している。好ましくは、融合複合体のＭＨＣ分子のアミノ酸配列の少なくとも約７０％が、上述のような天然に生じるＭＨＣ分子のアミノ酸配列と同一であり、更に好ましくは、融合複合体のＭＨＣ分子の少なくとも約９０％のアミノ酸配列が、天然に生じるＭＨＣ分子のアミノ酸配列と同一であり、更になお好ましくは、融合複合体のＭＨＣ分子のアミノ酸配列の約９８％から全部が、天然に生じるＭＨＣ分子のアミノ酸配列と同一である。本発明の空のＭＨＣ分子、特に空の一本鎖ＭＨＣクラスII分子は、提示ペプチドが分子に共有結合していないことを除いて、上述の任意の適切な方法により作製することができる。例えば、実施例１Ｂにおいて、ＯＶＡ提示ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド(ＯＰＲ１１０及びＯＰＲ１１１)をリンカー−β１− β２遺伝子断片に結合させる工程を割愛することができる。別の実施例において、標準的組換えＤＮＡ操作を使用することにより、既に共有結合している提示ペプチドを有する本発明のＭＨＣ分子から提示ペプチドを除去することができる。例えば、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ提示ペプチドをコードするＤＮＡを適切な制限酵素（例えば、AflII及びNheI）により除去することができる。例示した実施例のように、可溶性の空の一本鎖ＩＡ^dＭＨＣ分子（即ち、ｓｃ−ＩＡ^d／ブランク）の構築は実施例２５〜２７に考察される。該ＰＣＴ出願に開示されるように、ＭＨＣ融合複合体は、組換えペプチドの検出及び特徴付けにおいて使用することができる。例えば、本発明は、以下のようにＴ細胞に関して特徴付けされていないエピトープをマッピングするのに使用可能な方法を含む：ランダムペプチド又は選択されるペプチドのライブラリーをコードする配列を、ＭＨＣ分子をコードするＤＮＡ配列、及び場合によりリンカー配列をコードするＤＮＡ配列を含有する、上で同定されるような、本発明の発現ベクター系の提示ペプチド位置にクローニングすることができる。適切には、適当なｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー（Sambrook，et al.，前出を参照のこと）の制限断片を、発現ベクターに挿入される配列の供給源として使用するか、あるいは、既知配列の合成オリゴヌクレオチドのような選択されるオリゴヌクレオチドを挿入される配列として使用する。上で同定される哺乳動物細胞及び他の細胞のような適切な宿主を、遺伝子融合体（即ち、更に別のペプチドをコードする配列に結合したＭＨＣ分子をコードする配列）を含有するベクターにより形質転換又はトランスフェクションする。形質転換体を適切な条件下で培養して、以下に開示されるアッセイにより測定されるように、Ｔ細胞クローンと反応する目的の融合複合体の発現についてスクリーニングする。次に反応性コロニーを選び取り、ベクターを単離することができる。ＤＮＡ挿入配列の配列解析により、どのクローン化ペプチド配列が、Ｔ細胞クローンに認識されるエピトープに対応していたかが明らかになる。本発明の空のＭＨＣ分子は、消極的な方法によってペプチドを取り込むというよりはむしろ、ペプチドを空の分子に装填することを除いて、同じ方法で使用することができる。本発明のＭＨＣ融合複合体又は装填されたＭＨＣ分子の、Ｔ細胞受容体の活性を調節する（Ｔ細胞応答の不活化を含む）能力は、インビトロアッセイにより容易に測定することができる。典型的には、アッセイ用のＴ細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマのような形質転換したＴ細胞系、又は哺乳動物から（例えば、ヒト又はマウスのような齧歯類から）単離されるＴ細胞により準備する。他の適切なＴ細胞は、１）公的に利用可能であるか、又は既知の方法により調製することができるＴ細胞系、２）Ｔヘルパー細胞、及び３）Ｔ細胞傷害性細胞、好ましくは細胞傷害性ＣＤ４⁺細胞を含む。Ｔ細胞は、既知の方法により哺乳動物から単離することができる。例えば、R．Shimonkevitz et al.，J.Exp.Med.，158:303(1983) 、及び以下の実施例４及び５を参照のこと。本発明のＭＨＣ融合複合体又は装填されたＭＨＣ分子が、Ｔ細胞の活性を調節することができるかどうかを測定するための適切なアッセイは、下記の連続工程１〜４により以下のように実施される。Ｔ細胞は適切には、アッセイすることができ、そしてＴ細胞活性化又は活性化後のＴ細胞活性の調節を示すマーカーを発現する。即ち、例えば以下の実施例４に開示されるように、活性化によりインターロイキン−２（ＩＬ−２）を発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０を使用することができる。ＩＬ−２濃度を測定して、特定の提示ペプチドが、このＴ細胞ハイブリドーマの活性を調節することができるかどうかを決定することができる。このような適切なアッセイは、以下の連続工程により行われる：１．ペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的なＴ細胞受容体を有するＴ細胞を、目的のＴ細胞ハイブリドーマから、又は哺乳動物から単離することにより得る。２．このＴ細胞を増殖可能な条件下で培養する。３．増殖しているＴ細胞を、選択したＭＨＣ融合複合体（又は装填された分子）に接触させる。４．Ｔ細胞を抗原提示細胞に接触させて、活性化に必要なシグナルを生成させ、マーカーについて測定する（例えば、ＩＬ−２産生を測定する）。ＩＬ−２産生の低下（例えば、２４時間後のＩＬ−２産生の４０％以上の低下、更に典型的には、２４時間後のＩＬ−２産生の５０％以上の低下）は、ＭＨＣ融合複合体（又は装填された分子）が、Ｔ細胞の活性を調節して、免疫応答を抑制することができることを示している。以下の実施例４は、そのようなアッセイを例示する。本アッセイは、適切には、膜貫通部分を含有しない可溶性の「短縮型」ＭＨＣ複合体の活性の分析のために使用される。更に、本アッセイは、Ｔ細胞受容体アンタゴニスト又は部分アゴニストとして機能する、共有結合した提示ペプチドを含有するＭＨＣ融合複合体（又は装填された分子）の同定のために適切には使用される。本アッセイはまた、上述のように本発明の装填されたＭＨＣ複合体での使用に便利に適合する。本アッセイに使用されるＴ細胞は、増殖に適した条件下でインキュベーションする。例えば、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマは、適切には約３７℃及び５％ＣＯ₂で完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ− グルタミン及び５×１０^-5M ２−メルカプトエタノールを補足したＲＰＭＩ１６４０）中でインキュベーションする。ＭＨＣ融合複合体の連続希釈液をＴ細胞培地に加えることができる。Ｔ細胞に加えるＭＨＣ融合複合体の適切な濃度は、典型的には１０^-12〜１０^-6Mの範囲にある。Ｔ細胞活性化シグナルは、適切な抗原性ペプチドで装填された抗原提示細胞により提供される。最大よりわずかに低いＴ細胞活性化を与える抗原用量及びＡＰＣ数の使用が、ＭＨＣ融合複合体によるＴ細胞応答の阻害を検出するために好適であると考えられている。ＭＨＣ融合複合体との接触後のＩＬ−２の産生の低下は、この融合複合体が、Ｔ細胞の活性を調節し、そして免疫応答を抑制できることを示す。あるいは、ＩＬ−２のような発現されたタンパク質の測定よりはむしろ、Ｔ細胞活性化の調節は、適切には、当該分野で認知される放射性標識法により測定される、抗原依存性Ｔ細胞増殖の変化により測定することができる。例えば、標識（例えば、トリチウム化）ヌクレオチドをアッセイ培地に導入することができる。このようなタグ付きヌクレオチドのＤＮＡ中への取り込みが、Ｔ細胞増殖の尺度となる。このような手順を具体的に記載する以下の実施例５を参照のこと。このアッセイは、増殖のために抗原提示を必要としないＴ細胞（例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマ）には適切ではない。これは、哺乳動物から単離された形質転換していないＴ細胞についての、ＭＨＣ融合複合体（又は装填されたＭＨＣ分子）によるＴ細胞活性化の調節の測定に適している。ＭＨＣ融合複合体（又は装填されたＭＨＣ分子）との接触後のＴ細胞増殖のレベルの低下は、この複合体が、Ｔ細胞の活性を調節して、免疫応答を抑制できる（例えば、以下の実施例５を参照のこと）ことを示す。このインビトロＴ細胞増殖アッセイは、インビボのＴ細胞のクローンの拡大における抗原特異的な変化に及ぼすＭＨＣ融合複合体（又は装填されたＭＨＣ分子）の作用を測定するのに好適である。このようなアッセイは、以下の実施例７に具体的に記載される。これらのインビトロアッセイは、Ｔ細胞受容体の活性を調節すること（Ｔ細胞発生の活性化又は阻害を含む）ができる、ランダムライブラリーからのＤＮＡ又は他のオリゴヌクレオチドによりコードされるペプチドを選択して同定するために、使用することができる。具体的には、ランダムペプチド又は選択されるペプチドのライブラリーをコードするＤＮＡ配列を、ＭＨＣ分子をコードするＤＮＡ配列、及び場合によりリンカー配列をコードするＤＮＡ配列を含有する、上で同定されるような発現ベクター系の提示ペプチド位置にクローニングすることができる。適切には、ゲノムＤＮＡライブラリー（Sambrook，et al.，前出を参照のこと）の適当なｃＤＮＡの制限断片を発現ベクターへの挿入配列の供給源として使用するか、あるいは既知の配列の合成オリゴヌクレオチドのような選択されるオリゴヌクレオチドを挿入配列として使用する。哺乳動物細胞及び上で同定される他の細胞のような適切な宿主は、遺伝子融合体（例えば、提示ペプチドをコードする配列に結合した、ＭＨＣ分子をコードする配列）を含有するベクターで形質転換する。形質転換体は、適切な条件下で培養し、この細胞を、目的のＭＨＣ融合複合体（又は装填されたＭＨＣ分子）の発現に関して、選択されたＴ細胞とこれらを接触させることによりスクリーニングする。上述のアッセイ（例えば、ＩＬ−２産生又はＴ細胞増殖の測定）を利用して、ＭＨＣ融合複合体（又は装填されたＭＨＣ分子）との接触がＴ細胞活性化を調節するかどうかを決定する。例えば、ＡＰＣで刺激したＴ細胞のＩＬ−２産生の低下により、Ｔ細胞の活性を調節して免疫応答を抑制するＭＨＣ融合複合体が同定される。あるいは、このインビトロアッセイを利用して、Ｔ細胞応答を上昇させる提示ペプチドを含有する、上述の多価のＭＨＣ融合複合体（又は装填されたＭＨＣ分子）を同定することができる。インビボアッセイもまた、Ｔ細胞発生を阻害又は不活化する能力を含む、Ｔ細胞の活性を調節するＭＨＣ融合複合体（又は装填されたＭＨＣ分子）の能力を決定するために適切に使用することができる。例えば、ＭＨＣ融合複合体（又は装填されたＭＨＣ分子）は、イムノグロブリンのクラススイッチング（即ち、ＩｇＭからＩｇＧへの）を阻害するその能力について測定することができる［例えば、P．Linsley et al.，Science，257:792-795(1992)を参照のこと］。このようなアッセイは、以下の実施例６に具体的に記載される。インビボ診断イメージング及びＨＬＡタイピングを含む、ＭＨＣ融合分子を使用する診断法も提供される［例えば、A.K．Abbas，Cellular and Molecular Imm unology，page 328(W.B．Saunders Co．1991)を参照のこと］。インビボイメージングの応用について、放射性標識（例えば、¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、³⁹Tｃ）又は他の検出可能なタグを有するＭＨＣ融合分子又は装填された分子を哺乳動物に投与して、ＭＨＣ分子又は装填された分子の結合について既知の手順により被検体を走査することができる。このような哺乳動物の分析は、例えば、本明細書に開示される有害な免疫応答を含む多くの疾患の診断及び治療の助けとなることができる。本発明の空のＭＨＣ分子、特に空の一本鎖ＭＨＣクラスII分子を使用して、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝又は裂溝に非共有結合する提示ペプチドをスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングは、特定のＭＨＣ分子（例えば、ＩＡ^d、ＤＲ１、ＩＥ、ＤＰ、及びＤＱのようなＭＨＣクラスII分子）に結合することができる提示ペプチドを同定するのに有用である。実施例のように、ｓｃ−ＩＡ^d／ブランク分子を検出可能なタグ（例えば、Ｉ¹²⁵、ビオチン又は本明細書に開示される別のタンパク質）で修飾して、ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。タンパク質をタグ付けするための方法及びライブラリーをスクリーニングするための方法は、よく知られている［例えば、Sambrook et al.，前出及びAusubel et al.，Current Proto cols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1989；本明細書に参照により組み込まれる］。幾つかのランダムペプチドライブラリーの任意のものを適切に利用することができる[例えば、J.Scott et al.,Science,249:386(19 90);J．Devlin et al.，Science，249:404(1990);S．Cwirla et al.,PNAS(USA), 87:6378(1990);J.Hammer et al.,J.Exp.Med.,176:1007(1992);D．O'Sullivan et al.，J．Immunol.，147:2663(1991)を参照のこと］。ｓｃ−ＩＡ^d／ブランク分子に結合するペプチドを使用して、対応する装填された分子を作製することができる。次に同定されたペプチドがＴ細胞活性を調節することができるかどうかを調べるために、装填された分子は、本明細書に記載される任意のＴ細胞アッセイで試験することができる。また、アッセイを利用して、免疫疾患の治療のためのＭＨＣ複合体の使用可能性を評価することができる。例えば、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、マウスにおける自己免疫疾患であり、多発性硬化症の認知されたモデルである。適切なマウスの種を処理してＥＡＥを発症させ、次にＭＨＣ融合複合体又は装填された分子を投与して、このマウスを評価して、ＥＡＥの発症が、ＭＨＣ融合複合体又は装填された分子の投与後に阻害又は妨害されるかどうかを決定することができる。このようなアッセイは、以下の実施例８及び１１に具体的に記載される。標的疾患に対するワクチン接種を含む、免疫応答を誘導するＭＨＣ融合複合体の能力は、インビボアッセイにより容易に測定することができる。例えば、本発明のＭＨＣ融合複合体、又はＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡを、マウスのような哺乳動物に投与し、初回投与時及びその後間隔をとって（例えば、融合複合体又はＤＮＡの投与の２、５及び８週間後）数回この哺乳動物から血液試料を得ることができる。血液試料から血清を回収して、免疫化により生じる抗体の存在について測定する。抗体濃度を測定することができる。以下の実施例９に、このようなアッセイを具体的に記載する。該ＰＣＴ出願に考察されるように、被検体の細胞内での融合複合体の発現のために、ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡ構築物の直接投与を適切には行うことができる。好ましくは、適切にはＣＭＶプロモーターのような適当なプロモーターの制御下にある、ＭＨＣ−提示ペプチド融合体のコード領域を有するＤＮＡを被検体の骨格筋に直接注射する。ＭＨＣ融合分子の表現が被検体の免疫応答を誘導することを確認するために、被検体に、同時刺激因子をコードするＤＮＡベクターを、ＭＨＣ−提示ペプチド融合体をコードするＤＮＡと好ましくは同時投与する。好適な同時投与されるＤＮＡベクターは、例えば、ＣＭＶプロモーターの制御下のＢ７−１又はＢ７−２のコード領域を含むことを特徴とするベクターを含む。発現されるＢ７−１及びＢ７−２タンパク質は、同時刺激シグナルを提供して、免疫応答の開始を支援することができる。哺乳動物のような被検体における免疫応答の誘導のためのこのようなアプローチにより、以前のアプローチにまさる重要な利点が得られる。外来タンパク質抗原の提示における開始工程は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）への未変性抗原の結合である。ＡＰＣへの結合後、抗原は、食作用、受容体介在性エンドサイトーシス又は飲作用により、細胞内に進入する。このような内在化した抗原は、エンドソームと呼ばれる細胞内膜結合小胞に局在する。エンドソームーリソソーム融合後、抗原は、リソソームに存在する細胞内プロテアーゼにより処理されて小さなペプチドになる。このペプチドは、このリソソーム内でＭＨＣクラスII分子のα及び β鎖に会合する。前もって粗面小胞体で合成された、これらのＭＨＣクラスII分子は、順にゴルジ複合体、次いでリソソーム区画に輸送される。ペプチド−ＭＨＣ複合体は、Ｔ及びＢ細胞の活性化のためにＡＰＣの表面に提示される。したがって、抗原内のタンパク分解性処理部位の接近しやすさ、リソソーム内での生じたペプチドの安定性及びＭＨＣ分子に対するペプチドの親和性は、特定のエピトープの免疫原性の決定因子である。これらの因子は、アジュバントの投与により変化させることができない。しかし、ＭＨＣ融合複合体（即ち、提示ペプチドに直接共有結合したＭＨＣ）の直接発現により、このような複雑さは回避されるはずであり、ＭＨＣ融合分子に載ったエピトープに対する免疫応答が誘導されるはずである。また、該ＰＣＴ出願に開示されるように、ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡを被検体に直接投与するよりはむしろ、このようなＤＮＡを導入した宿主適合性の抗原提示細胞を被検体に投与することができる。即ち、１つ以上のＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡを、宿主適合性の抗原提示細胞に導入して、このような形質転換又はトランスフェクションされた抗原提示細胞を標的宿主に、適切なＴ細胞との最も効率的な相互作用が起こる標的部位に投与することができる。例えば、以下の実施例１３及び１４を参照のこと。被検体への投与により、このような改変細胞は、次にＤＮＡによりコードされるＭＨＣ融合複合体を細胞表面上にインビボで発現することができる。このような改変細胞は、被検体に投与して、免疫応答を誘導するか、あるいは本明細書に開示されるように、細胞の他の同時刺激シグナルの発現に依存して免疫応答を抑制することができる。即ち、投与により細胞が、有効量の同時刺激シグナルの非存在下でＭＨＣ融合複合体を提供するか、又はアンタゴニスト若しくは部分アゴニスト活性を有する提示ペプチドを含有するＭＨＣ融合複合体を提供するならば、この細胞を宿主に投与して免疫応答を抑制することができる。あるいは、細胞が、有効量の同時刺激シグナルの存在下でＭＨＣ融合複合体を提供することができる（例えば、Ｂ７又はＢ７− ２のようなＴ細胞同時刺激因子が、細胞の表面上で発現される）ならば、この細胞を哺乳動物宿主に投与して、本明細書に開示されるように、哺乳動物における免疫応答を誘導することができる。上で考察したように、ＭＨＣ融合複合体の両方の鎖、更には使用されるならばＴ細胞同時刺激因子をコードする単一の発現ベクターを構築し、このベクターを宿主適合性ＡＰＣに導入して投与用の細胞を調製することが好適である。当業者には認知されるであろうとおり、「宿主適合性」抗原提示細胞という用語は、細胞を投与する被検体又は「宿主」とハプロタイプが同じ抗原提示細胞を意味する。好ましくは、形質転換した宿主適合性の抗原提示細胞は、細胞を投与した被検体のリンパ節に移行することができ、その部位でＭＨＣ融合複合体を発現することができる細胞である。上及び該ＰＣＴ出願に考察されるように、ＭＨＣ融合複合体、及びこのような融合複合体をコードするＤＮＡ構築物には、多くの応用性がある；装填されたＭＨＣ分子も、本明細書で考察されるこのような応用に使用することができる。例えば、膜貫通部分を含有しないＭＨＣ融合複合体又は装填された複合体（例えば、以下の実施例２の可溶性複合体を参照のこと）を投与して哺乳動物の免疫応答を抑制すること、例えば、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチなどのような自己免疫疾患に罹患しているか、又は罹患しやすい、ヒトを含む哺乳動物を例えば治療することができる。また、有害な免疫応答を受けているか、又は受けそうな被検体（例えば、心臓、腎臓、皮膚又は他の臓器の移植のような幾つかのタイプの移植手術を受けている患者）の治療にも適している。このような状況において、適切には外科的手順に先だって治療プロトコールを開始することができる。該ＰＣＴ出願に開示されるように、免疫応答を抑制するために、イムノグロブリンに結合している（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＡイムノグロブリン又は断片のようなイムノグロブリン分子の定常ドメインに融合した）ＭＨＣ融合複合体を投与する。図面のFIG.ＩＣ及び以下の実施例を参照のこと。多くの独特なアプローチを利用して本発明により哺乳動物の免疫応答を抑制することができる。具体的には、上で考察したように、ＭＨＣ分子は、抗原提示細胞からなどの同時刺激シグナルも送達される場合にのみ、Ｔ細胞系特異的なクローンの拡大を誘導することが証明された。同時刺激シグナルの非存在下では、又は少なくともＴ細胞増殖に有効量のそのようなＴ細胞同時刺激シグナルの送達の非存在下では、Ｔ細胞は、クローンの欠失を引き起こすアネルギー又はアポトーシスの状態まで誘導される。したがって、免疫応答の抑制のための１つの治療方法は、どの同時刺激シグナルも実質的に非存在下で、有効量の１つ以上のＭＨＣ融合複合体又は装填された分子を投与して、こうして特異的なＴ細胞のアネルギーを誘導し、有害な免疫応答を有効に抑制することである。好ましくは、「短縮した」可溶性ＭＨＣ複合体（即ち、膜貫通部分を含有しないＭＨＣ複合体）を投与する。投与される可溶性融合複合体又は装填されたＭＨＣ分子の提示ペプチドは、有害な免疫応答のＴ細胞に特異的であり、これらのＴ細胞に関してアネルギーの状態を誘導するペプチドから選択することができる。このような提示ペプチドは、上と同じインビトロのプロトコールにより、容易に同定して選択することができる。可溶性ＭＨＣ融合複合体又は装填された分子は、適切には注射（例えば、腹腔内又は静脈内注射）により哺乳動物に投与することができる。局所投与（例えば、点眼剤）並びに鼻吸入器及び肺吸入器による投与も可能であろう。ＭＨＣ融合複合体（少なくとも治療的応用に使用される複合体）は、哺乳動物細胞で産生し使用の前に精製するため、どのような細菌も発熱物質も本質的に又は完全に含まない。所定の治療的応用に最適な用量は、従来法により求めることができる。ＭＨＣ融合複合体又は装填された分子は、適切には、融合複合体又は装填された分子を含む治療又は医薬組成物で被検体（特にヒト、又は畜牛のような家畜などの哺乳動物）に投与することができる。本発明のこのような医薬組成物は、当該分野で既知の手順により調製して使用される。例えば、治療的に有効量のＭＨＣ融合複合体又は装填された分子を含有する処方は、単位用量又は多回用量の容器（例えば、密閉アンプル及びバイアル）に入れて提供することができ、使用直前に無菌液体担体（例えば、注射用水）の添加のみを必要とする凍結乾燥条件下で保存することができる。リポソーム処方もまた、多くの応用に好適である。非経口投与のための他の組成物も適切であり、これらは、抗酸化剤、緩衝化剤、制菌剤、及び処方を目的のレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有してもよい、水性及び非水性の無菌注射液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含んでもよい水性及び非水性の懸濁剤を含む。免疫応答の抑制のための別の治療方法は、Ｔ細胞受容体アンタゴニスト又は部分アゴニストである共有結合した提示ペプチドを含有するＭＨＣ融合複合体、あるいはこのようなＴ細胞受容体アンタゴニスト又は部分アゴニストである提示ペプチドを含有する装填されたＭＨＣ分子の投与である［A．Sette et al.，Annu. Rev．Immunol.，12:413-431(1994)を参照のこと］。ＭＨＣ融合複合体又は装填されたＭＨＣ分子は、短縮型であってもよく、上述のように可溶性タンパク質として投与してもよい。あるいは、ＭＨＣ融合複合体又は装填されたＭＨＣ分子は完全長（即ち、膜貫通部分を含有する）であってもよい。これら複合体による治療は、本発明の完全長ＭＨＣ融合複合体、及びＴｃＲアンタゴニスト又は部分アゴニストである提示ペプチドをコードするＤＮＡベクターを含む、有効量のＤＮＡ配列を哺乳動物に投与することを特徴とする。例えば、このようなＭＨＣ融合複合体の調製の適切な方法及び免疫抑制療法のための複合体の用途に関する、上の考察、及び以下の実施例３、１０及び１１を参照のこと。ＴｃＲアンタゴニスト又は部分アゴニストである提示ペプチドは、上に同定されるインビトロのプロトコールにより、容易に同定して選択することができる。Ｔ細胞受容体アンタゴニスト又は部分アゴニストである提示ペプチドを含有するＭＨＣ融合複合体は、アレルギー、並びに多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病及び慢性関節リウマチのような自己免疫疾患の治療に特に好適である。更に、上及び該ＰＣＴ出願に考察したように、ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡが導入された宿主適合性の抗原提示細胞は、被検体に投与して、免疫応答を抑制することができる。投与により、細胞は、有効量のＴ細胞同時刺激シグナルの非存在下ではＭＨＣ融合複合体を発現する(即ち、そのためＴ細胞アネルギーが誘導される)か、かつ／又は投与した細胞は、アンタゴニスト又は部分アゴニスト活性を有する結合した提示ペプチドを含有するＭＨＣ融合複合体を発現する。本発明の異なる免疫抑制療法はまた、Ｔ細胞介在性疾患の更に有効な治療を提供するために、抗炎症剤のような他の既知の免疫抑制剤との組合せで使用することもできる。例えば、免疫抑制性ＭＨＣ融合複合体又は装填されたＭＨＣ分子は、自己免疫疾患及びアレルギーの治療のために、コルチコステロイド及び非ステロイド剤のような抗炎症剤と組合せて使用することができる。本発明はまた、感染性物質に対する、又は癌（特に黒色腫）のような標的疾患若しくはマラリアのような他の疾患に対する、ヒトのような哺乳動物へのワクチン接種を含む、ヒトのような哺乳動物において免疫応答を呼び起こすための方法を提供する。該ＰＣＴ出願に開示されるように、これらの方法は、膜貫通部分を含有する本発明のＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡベクターを含む有効量のＤＮＡ配列の哺乳動物への投与、及び／又は膜貫通部分を含有するこのようなＭＨＣ融合複合体の投与及び／又はこのようなＭＨＣ融合複合体をコードするこのようなＤＮＡを含有する宿主適合性の抗原提示細胞の投与を含む。ＭＨＣ融合複合体の発現ベクターの調製は、上及び以下の実施例３及び１２に記載される。プラスミドD ＮＡの投与方法、投与された被検体の細胞によるこのＤＮＡの取り込み及びタンパク質の発現は、報告されている［J．Ulmer et al.，Science，259:1745-1749( 1993)を参照のこと］。好ましくは、完全長ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡは、Ｂ７又はＢ７− ２をコードするＤＮＡのようなＴ細胞同時刺激因子をコードするＤＮＡ配列と共に哺乳動物に投与される。Ｂ７遺伝子及びその発現は、D.Harlan et.al.,Proc． Natl．Acad．Sci．USA，91:3137-3141(1994)に記載されている。被検体の細胞によりこのＤＮＡが取り込まれると、Ｔ細胞同時刺激因子が、発現して、同時刺激シグナルを提供し、こうして免疫応答の開始を助けることができる。以下の、Ｂ７又はＢ７−２遺伝子を含有する発現ベクターの構築を開示する、実施例３及び１２を参照のこと。上で考察される、ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡのヒトのような哺乳動物への投与は、被検体に免疫応答を呼び起こすための好適な方法であるが、ＭＨＣ融合複合体はまた、適切には他の経路により投与することができる。即ち、上に考察されるように、ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡが導入された宿主適合性の抗原提示細胞を被検体に投与して、免疫応答を誘導することができる。投与により、細胞は、有効量のＢ７又はＢ７−２遺伝子のようなＴ細胞同時刺激シグナルの存在下でＭＨＣ融合複合体を発現して、免疫応答を呼び起こすか、及び／又は投与された細胞は、免疫応答を呼び起こすことのできる完全長ＭＨＣ融合複合体を発現する（例えば、以下の実施例に詳述される手順などによる、Ｔ細胞増殖の増大により証明される）。典型的には上に考察されるアプローチよりも好適とはいえないが、免疫応答を呼び起こすことのできるＭＨＣ融合複合体（例えば、Ｔ細胞増殖を刺激又は誘導することができる、共有結合した抗原提示ペプチドを含有する完全長ＭＨＣ融合複合体）は、被検体に直接投与することもできる。標的疾患に対する被検体へのワクチン接種を含む、免疫応答を誘導するための本発明の方法は、免疫応答を誘導するための既知の方法と組合せて使用することができる。例えば、一本鎖ＭＨＣクラスII複合体、又はこのようなＭＨＣ複合体をコードするＤＮＡ構築物は、ワクチン組成物の所望の作用を増強又は延長するためワクチン組成物の投与と協調させるか、又はこれと組合せて被検体に投与することができる。該ＰＣＴ出願に開示されるように、ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡベクターは、適切にはヒトを含む哺乳動物に、好ましくは筋肉内注射により投与される。ｃＤＮＡの哺乳動物の骨格筋への投与、これに続く筋肉細胞による投与された発現ベクターの取り込み及びこのＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現は、Ulmer et al.により記載されており、プロトコールの一例を表している［J ．Ulmer et al.，Science，259:1745-1749］。所定の治療的適用に最適な用量は、従来法により求めることができる。更に、ＭＨＣ融合複合体、このような複合体をコードするＤＮＡベクター及びこのようなＤＮＡベクターを含有する宿主適合性の抗原提示細胞は、それぞれ適切には種々の他の経路により被検体に投与することができる。例えば、免疫応答を誘導するために、抗原性ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡベクターは、単独又は同時刺激因子をコードするＤＮＡと共に、当業者には既知の手順により、被検体に皮内投与するのが好ましい。このような投与により、皮内抗原提示細胞（例えば、樹枝状細胞（dendritic cells））の形質転換及びT細胞増殖が起こり得る。以下の実施例１６の結果を参照のこと。ＭＨＣ融合複合体及びこのような融合複合体をコードするＤＮＡベクターはまた、他の経路（例えば、経口又は経皮投与）により被検体に投与することができる。ヒトの疾患の治療に加えて、ＭＨＣ融合複合体及びこのような融合複合体をコードするＤＮＡ構築物又は装填されたＭＨＣ分子は、獣医学的応用（例えば、畜牛、羊などのような家畜、並びにイヌ及びネコのようなペットの疾患の治療）にも著しく有用であろう。ＭＨＣ融合複合体若しくはこのような融合複合体をコードするＤＮＡ構築物、又は装填されたＭＨＣ分子は、単独で被検体に投与することができ、また、それぞれ医薬組成物の一部として使用することができる。一般に医薬組成物は、１つ以上のＭＨＣ融合組成物若しくはこのような融合組成物をコードするＤＮＡ構築物、又は装填されたＭＨＣ分子を、１つ以上の受容可能な担体と共に含む。担体は、処方の他の成分と融和性であり、そのレシピエントに有害なものではないという意味で「受容可能な」ものである必要がある。例えば、注射用処方などによる非経口投与では、無菌溶液若しくは水との懸濁液、又は他の薬学的に受容可能な溶液を調製することができる。このような医薬組成物は、適切には当該分野で既知の方法により調製される。所定の治療に使用される、所定のＭＨＣ融合複合体若しくはこれをコードするＤＮＡ構築物又は装填されたＭＨＣ分子の実際の好適な量は、使用される特定の活性化合物又は化合物群、処方される特定の組成物、適用の様式、投与の特定の部位、患者の体重、一般症状、性別など、治療される特定の適応症など、及び担当医又は獣医を含む当業者に認知される他のこのような因子により変化する。投与の所定のプロトコールのための最適な投与速度は、例えば、先のガイドライン及び本明細書に開示されるアッセイに即して実施される従来の用量決定試験法を用いて、当業者には容易に決定することができる。本発明の空の一本鎖ＭＨＣ複合体、好ましくは空の一本鎖ＭＨＣクラスII複合体は、適切な提示ペプチドと結合させて、本発明の装填された一本鎖ＭＨＣ複合体を形成することができる。このような装填された複合体が、上述のようにＭＨＣペプチド融合複合体の投与が指示される場合に、適切に使用することができることがわかる。ＭＨＣペプチド融合複合体をコードするＤＮＡ構築物が使用される場合には、空のＭＨＣ分子のペプチド結合溝又は裂溝への適切な提示ペプチドの非共有結合のために適切な条件が与えられるならば、適切な空の一本鎖ＭＨＣ複合体をコードする１つ以上のＤＮＡ構築物を使用することができる。空の一本鎖ＭＨＣ分子への適切な提示ペプチドの結合のための条件の例は、下に更に充分に考察される。装填されたＭＨＣ複合体、特に装填されたＭＨＣクラスII複合体は、上述のようなヒト、家畜及びペットの疾患の治療に有用である。また、上及び該ＰＣＴ出願に記載された一本鎖ＭＨＣ融合複合体が、トランスジェニックマウス種を作成するのに使用できることもわかる（以下の実施例３１を参照のこと）。このようなマウス種は、例えば、Ｔヘルパー細胞のようなＴ細胞の活性を調節することができるモデル系として有用である。本明細書に挙げられる全ての文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の非限定的な実施例は、本発明を例示するものである。実施例１Ａ〜１Ｆ本発明の可溶性ＭＨＣ融合複合体の構築。共有結合した提示ペプチドを伴う可溶性ＭＨＣクラスII分子を発現するためのＭＨＣクラスII−ペプチド融合ベクターを以下実施例１Ａ〜１Ｆに記載されるように調製した。下記ＭＨＣ融合複合体構築物を調製するために使用したＭＨＣクラスII遺伝子は、図面のFIG.２〜８に示されるように、適切な抗原提示細胞（An tigen Presenting Cell）（ＡＰＣ）から作製されるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により単離した。実施例１ＡＩ−Ａ^d遺伝子のために、マウスＢ細胞リンパ腫Ａ２０細胞系から全ＲＮＡを単離した。簡単に述べると、１×１０⁸個のＡ２０細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ２０８）を、氷冷４Mチオシアン酸グアニジニウム、０．１M Tris-ＨＣｌ（pH７．５）６ml中で、組織破砕（Tissue Tearer）ホモジェナイザーを使用して５分間ホモジェナイズした。ホモジェナイズ後、サルコシル（sarcosyl）を加えて最終濃度０．５％とし、溶液を完全に混合した。このホモジェネートを５, ０００ｇで１０分間遠心分離して、上清を、４Mチオシアン酸グアニジニウム、０．１M Tris−ＨＣｌ（pH７．５）、０．５％サルコシル緩衝液で１０mlにした。上清を、ＳＷ４１透明超遠心管中の５．７M ＣｓＣｌ、０．０１M ＥＤＴＡ（ pH７．５）３．５mlクッションの上に穏やかに積層した。試料をＳＷ４１ローター中で３２,０００rpmで２０℃で２４時間遠心分離した。遠心分離後、上清を慎重に除去して、ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄した。ＲＮＡを、RNas in（Promega）４０単位を含有するＤＥＰＣ処理した水３５０μｌに溶解した。ＲＮＡを３M酢酸ナトリウム３５μｌ及びエタノール９７０μ１で沈殿させた。この手順により、全ＲＮＡ約３７０μｇを得た。ＲＮＡをＤＥＰＣ処理した水で５μｇ/μｌに再懸濁して、Ｉ−Ａ^d遺伝子のＲＴ−ＰＣＲクローニングに使用した。図面のFIG.２は、Ｉ−Ａ^dα１−α２遺伝子断片（ａａ１〜１８２をコードする）を単離するための方策を示し、図面のFIG.８は、使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを列挙する。Ａ２０全ＲＮＡ（５μｇ）は、Supe rscript-MLV Reverse Transcriptase（GTBCO-BRL）及び製造業者の使用説明によるα２特異的プライミングを使用することにより、ｃＤＮＡに変換した。生成したｃＤＮＡ２０μｌの内、２μｌをＰＣＲのテンプレートＤＮＡとして使用した。典型的なＰＣＲ増幅反応液（１００μｌ）は、テンプレートＤＮＡ、適切なプライマー（ＯＰＲ１００及びＯＰＲ１０１）１０pmol、Ｔａｑポリメラーゼ２. ５単位、１００μＭｄＮＴＰ、５０mM ＫＣｌ、１０mM Tris−ＨＣｌ(pH８.３) 、１．５mM ＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチンを含有していた。テンプレートは、最初に９６℃で５分間インキュベーションすることにより変性し、その間Ｔａｑポリメラーゼを加えて反応をホットスタート（hot-start）させた。所望の産物は、５５℃で１分間、７０℃で１分間、次に９６℃で１分間を１０温度サイクル、次いで７０℃で１分間、次に９６℃で１分間を２５工程サイクルにより増幅した。最初のα１−α２ＰＣＲ産物（約５５０塩基対）は、細菌発現ベクターのpJ RS139中にクローン化すべく設計した。５回の反応からのＰＣＲ産物をプールし、エタノール／０．３M酢酸ナトリウム２容量で沈殿させて、生じた産物（ＤＮＡ約０．２μｇ）を水に再懸濁した。このα１−α２遺伝子断片をNcoI及びSpeI で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離して、アガロースゲルからの溶出により精製した。精製した消化ＰＣＲ産物は、次にNcoI／SpeI消化pJRSl39中に連結した。pJRS139にクローン化したα１−α２遺伝子断片は、３９ＡＤ２と命名して、哺乳動物発現ベクターにおけるクローニング及び発現に必要な制限部位及びフランキング配列を付加するために、ＰＣＲ増幅のテンプレートとした。これらの反応において、NcoI消化３９ＡＤ２０．５ngをテンプレートとして使用し、ＯＰＲ１０７及びＯＰＲ１０８をプライマーとし、ＰＣＲ条件は、６０℃で１分間、７０℃で１分間、及び９６℃で１分間を５温度サイクル、次いで７０℃ で１分間及び９６℃で１分間を２０工程サイクルとした。α１−α２ＰＣＲ産物（約５９０塩基対）は、ＩｇＧ κ鎖シャトルベクターのリーダーイントロンとＪ領域イントロンとの間のクローニングのための、5'EcoRV 部位及び3'EagI部位を含有する（図面のFIG.９Ａを参照のこと）。更に、ＰＣＲ産物は、ＭＨＣ−ＩｇＧ融合タンパク質の適正な発現に必要な、ＩｇＧスプライシング部位及びリーダー配列を有する。ＰＣＲ産物は、EcoRV及びEagIで消化してゲル精製した。精製した消化ＰＣＲ産物は、次にEcoRV／EagI消化pBlueScript II SK+（Stratagene）に運結して、ｐＡ１９構築物を得た。このベクターをEcoR V及びEagIで消化して、生じたα１−α２遺伝子断片を、下記実施例２に記載されるように、ｐＪＷ００３ＩｇＧシャトルベクター中にサブクローン化した。実施例１Ｂ下記のアプローチを利用して、Ｉ−Ａ^d β１−β２遺伝子断片（ａａ１〜１８９をコードする）を単離し、リンカー配列を結合し、抗原性ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを挿入した。また、このアプローチは、図面の FIG.３に図示した。Ａ２０全ＲＮＡ（１０μｇ）は、Superscript-MLV Reverse Transcriptase（GIBCO-BRL）及び製造業者の使用説明によるオリゴｄＴ特異的プライミングを使用することにより、ｃＤＮＡに変換した。生成したｃＤＮＡ２０ μｌのうち、２μｌをＰＣＲのテンプレートＤＮＡとして使用した。反応は、オリゴヌクレオチドプライマーを、ＯＰＲ１０２及びＯＰＲ１０４（図面のFIG．８を参照のこと）としたこと、及びＰＣＲ条件は、６０℃で１分間、７０℃で１分間、及び９６℃で１分間を１０温度サイクル、次いで７０℃で１分間及び９６ ℃で１分間を４０工程サイクルとしたことの他は、上述のように行った。最初の β１−β２ＰＣＲ産物（約５７０塩基対）は、細菌発現ベクターのpJRS139中にクローン化すべく設計した。ＰＣＲ産物をNcoI及びSpeIで消化して、上述の方法と同様にゲル精製した。精製した消化ＰＣＲ産物は、次にNcol／SpeI消化pJRS13 9中に連結した。pJRS139にクローン化したβ１−β２遺伝子断片は、３９ＢＤ２と命名して、リンカー配列、並びに哺乳動物発現ベクターにおけるクローニング及び発現に必要な、制限部位及びフランキング配列を付加するために、ＰＣＲ増幅のテンプレートとした。これらの反応において、０．５ngのNcoI消化３９ＡＢ２をテンプレートとして使用し、ＯＰＲ１０７及びＯＰＲ１０８をプライマーとし、ＰＣＲ条件は、６０℃で１分間、７０℃で１分間、及び９６℃で１分間を５温度サイクル、次いで７０℃で１分間及び９６℃で１分間を２０工程サイクルとした。リンカー−β１−β２ＰＣＲ産物（約６４０塩基対）は、ＩｇＧ重鎖シャトルベクターのリーダーイントロンとＪ領域イントロンとの間のクローニングのための、5'EcoRV部位及び3'EagI部位を含有する（FIG.９Ｂ）。更に、ＰＣＲ産物は、ＭＨＣ−ＩｇＧ融合タンパク質の適正な発現に必要な、ＩｇＧスプライシング部位及びリーダー配列を有する。抗原性ペプチド配列のクローニングを可能にするために、AflII部位をシグナル配列の末端に加えて、NheI部位をリンカーの開始部に配置した。ＰＣＲ産物をEcoRV及びEagIで消化してゲル精製した。精製した消化ＰＣＲ産物は、次にEcoRV／EagI消化pBlueScriptII SK+ （Stratagene）に連結して、ｐＢ１５構築物を得た。配列及び制限解析により、この構築物が、EcoRV部位に変異を含むことが判った。この変異を修正するために、２つのオリゴヌクレオチド（ＯＰＲ１１９及びＯＰＲ１２０−２）をアニーリングして、HindIII／NheI消化ｐＢ１５中に連結して、ベクターｐＢＣ１を得た。クラスIIＩ−Ａ^d結合ペプチドをコードする配列を挿入するために、オリゴヌクレオチドをアニーリングして、AflII／NheI消化ｐＢＣ１中に連結した。Ｏｖａ３２３−３３９ペプチド（ＳＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ）（SEQ ID NO:3）は、オリゴヌクレオチドＯＰＲ１１０及びＯＰＲ１１１によりコードされ、Ｏｖａ：Ｈ３３１Ｒ（ＳＩＳＱＡＶＨＡＡＲＡＥＩＮＥＡＧＲ）（SEQ ID NO:4）は、ＯＰＲ１１５及びＯＰＲ１１６により、ＯｖａＡ３３１Ｙ（ＳＩＳＱＡＶＨＡＡＨＹＥＩＮＥＡＧＲ）（SEQ ID NO:5）は、ＯＰＲ１１７及びＯＰＲ１１８により、そしてＨＥＬ７４−８６（ＮＬＣＮＩＰＣＳＡＬＬＳＳ）（SE Q ID NO:6）は、ＯＰＲ１４０及びＯＰＲ１４１によりコードされる。ｐＢＣ１基本骨格の各構築物は、ｐＢ１６、ｐＢ２４、ｐＢ３７及びｐＢ４と命名した。これらのベクターは、EcoRV及びEagIで消化して、生じたペプチド−リンカー− β１−β２遺伝子断片は、以下の実施例２に記載されるようにｐＪＷ００９ＩｇＧシャトルベクター中にサブクローン化した。実施例ＩＣ以下のアプローチを利用してヒトＨＬＡ−ＤＲ１ α１−α２−ヒンジ遺伝子断片（ａａ１〜１９２をコードする）を単離し、このアプローチを図面のFIG.４に図示した。全細胞内ＲＮＡは、上述の手順により、ＨＬＡ−ＤＲ１がホモ接合体の個人から得られた３×１０⁶個のＢＬＣＬ−Ｋ６８細胞から調製した。全ＲＮＡは、製造業者の使用説明にしたがってSuperscript-MLV Re verse Transcriptase（GIBCO-BRL）及びオリゴｄＴ特異的プライミングを使用することにより、ｃＤＮＡ（２０μｌ）に変換した。最初のＰＣＲ反応は、細菌発現ベクター（本出願には関係しない研究用）中にα１−α２−ヒンジ遺伝子断片をクローニングするのに必要な制限部位を付加するために設計した。テンプレートｃＤＮＡ５μｌを使用し、プライマーをＤＲ１Ａ−Ｆ及びＤＲ１Ａ−Ｂ（FIG. ８）とし、そしてＰＣＲ条件は、５５℃で１分間、７０℃で１分間、及び９６℃ で１分間を１０温度サイクル、次いで７０℃で１分間及び９６℃で１分間を２０工程サイクルとした他は、上述のようにＰＣＲを実施した。α１−α２−ヒンジＰＣＲ産物（約５７０塩基対）は、HindIII及びBamHIで消化し、ゲル精製して、 HindIII／BamHI消化ｐＵＣ１８中に連結して、Ｋ６８Ａ３ベクターを得た。このベクター（０．５ng）を、ＡＦ−Ｎ及びＡＢ−Ｓオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する更なるＰＣＲ増幅のテンプレートとした。生じたα１−α２− ヒンジＰＣＲ産物は、NcoI及びSpeIで消化し、ゲル精製してNcoI／SpeI消化pJRS 139中に連結して、３９Ａ２ベクターを得た。このベクターを、リンカー配列、並びに哺乳動物発現ベクターにおけるクローニング及び発現に必要な、制限部位及びフランキング配列を付加するために、ＰＣＲ増幅のテンプレートとした。ＰＣＲは、NcoI消化３９Ａ２テンプレートＤＮＡ１０ngを使用し、プライマーをＯＰＲ１２４及びＯＰＲ１２５（これらの配列は図面のFIG.８に記載される）とし、そしてＰＣＲ条件は、５０℃で１分間、７０℃で１分間、及び９６℃で１分間を５温度サイクル、次いで７０℃で１分間及び９６℃で１分間を１０工程サイクルとした他は、上述のように行った。α１−α２−ヒンジＰＣＲ産物（約６１０塩基対）は、ＩｇＧ κ鎖シャトルベクターのリーダーイントロンとＪ領域イントロンとの間のクローニングのための、5'EcoRV部位及び3'EagI部位を含有する（図面のFIG.９Ｅを参照のこと）。更に、ＰＣＲ産物は、ＭＨＣ−ＩｇＧ融合タンパク質の適正な発現に必要な、ＩｇＧスプライシング部位及びリーダー配列を有する。ＰＣＲ産物は、EcoRV及びEagIで消化して、ゲル精製した。精製した消化ＰＣＲ産物は、次にEcoRV／EagI消化ｐＡ１９中に連結してｐＢＳ−ＤＲ１Ａ構築物を得た。このベクターをEcoRV及びEagIで消化して、生じたＨＬＡ−ＤＲ１ α１−α２−ヒンジ遺伝子断片は、以下の実施例２に記載されるようにｐＪＷ００３ＩｇＧシャトルベクター中にサブクローン化した。実施例１Ｄ下記のアプローチを利用して、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１ β１−β２− ヒンジ遺伝子断片（ａａ１〜１９８をコードする）を単離し、リンカー配列を結合し、抗原性ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを挿入した。また、このアプローチは、図面のFIG.５に図示した。全細胞内ＲＮＡは、ＨＬＡ−ＤＲ１がホモ接合体の個人から得られた３×１０⁶個のＢＬＣＬ−Ｋ６８細胞から、上述の手順により調製した。全ＲＮＡは、製造業者の使用説明にしたがってSuperscr ipt-MLV Reverse Transcriptase（GIBCO-BRL）及びオリゴｄＴ特異的プライミングを使用することにより、ｃＤＮＡ（２０μｌ）に変換した。最初のＰＣＲ反応は、細菌発現ベクター（本出願には関係しない研究用）中にβ１−β２−ヒンジ遺伝子断片をクローニングするのに必要な制限部位を付加するために設計した。テンプレートｃＤＮＡ５μｌを使用し、プライマーをＤＲ１Ｂ−Ｆ及びＤＲ１Ｂ −Ｂ（これらのプライマーの配列は、図面のFIG.８に記載される）とし、そしてＰＣＲ条件は、５５℃で１分間、７０℃で１分間、及び９６℃で１分間を１０温度サイクル、次いで７０℃で１分間及び９６℃で１分間を２５工程サイクルとした他は、上述のようにＰＣＲを実施した。β１−β２−ヒンジＰＣＲ産物(約６１０塩基対)は、HindIII及びBamHIで消化し、ゲル精製して、HindIII／BamHI消化ＪＳ１４３．３中に連結して、ｐＢ７１２ベクターを得た。このベクター（０．５ng）を、ＢＦ−ＮＮ及びＢＢ−Ｓオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する更なるＰＣＲ増幅のテンプレートとした。生じたβ１−β２−ヒンジＰＣＲ産物は、NcoI及びSpeIで消化し、ゲル精製してNcoI／SpeI消化pJRS139中に連結して、３９Ｂ３ベクターを得た。このベクターを、リンカー配列、並びに哺乳動物発現ベクターにおけるクローニング及び発現に必要な、制限部位及びフランキング配列を付加するために、ＰＣＲ増幅のテンプレートとした。オーバーラップ伸長（overlap-extension）ＰＣＲを使用して、β１領域のAflIIを変異させて、リンカー配列を付加した。３９Ｂ３ベクターをAflII及びSpeIで消化し、AflII ／SpeI β１−β２−ヒンジ遺伝子断片をゲル精製した。リンカー及びβ１領域の開始部をコードする２つのオリゴヌクレオチド（ＯＰＲ１２１及びＯＰＲ１２２）をアニーリングし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼで伸長して、指定されるアミノ酸を変化させることなくβ１領域のAflIIが突然変異した７８塩基対断片を得た。この断片（５ng）をAflII／SpeIβ１−β２−ヒンジ遺伝子断片（５ng）と混合して、３７℃で１分間、７０℃で１分間、及び９６℃で１分間の５温度サイクルの重複伸長を行った。ＰＣＲプライマー−ＯＰＲ１１９及びＯＰＲ１２３の付加後、３７℃で１分間、７０℃で１分間、及び９６℃で１分間を更に５温度サイクル、そして７０℃で１分間及び９６℃で１分間を１０工程サイクル行った。生じたリンカー−β１−β２−ヒンジＰＣＲ産物（約６７０塩基対）は、ＩｇＧ重鎖シャトルベクターのリーダーイントロンとＪ領域イントロンとの間のクローニングのための、5'EcoRV部位及び3'EagI部位を含有する（図面のFIG.９Ｆを参照のこと）。更に、ＰＣＲ産物は、ＭＨＣ−ＩｇＧ融合タンパク質の適正な発現に必要な、ＩｇＧスプライシング部位及びリーダー配列を有する。抗原性ペプチド配列のクローニングを可能にするために、AflII部位をシグナル配列の末端に加えて、NheI部位をリンカーの開始部に配置した。ＰＣＲ産物は、NheI及びEagIで消化して、ゲル精製し、β鎖遺伝子断片を交換するため、NheI ／EagI消化ｐＢ１６（上を参照のこと）中に連結した。生じたベクターをｐＢＳ −ＤＲ１βと命名した。クラスIIＨＬＡ−ＤＲ１結合ペプチドをコードする配列を挿入するために、オリゴヌクレオチドをアニーリングして、AflII／NheI消化ｐＢＳ−ＤＲ１β中に連結した。配列ＱＩＳＶＱＰＡＦＳＶＱ（SEQ ID NO:7）を有するＮＰ４０４−４１５ペプチドは、オリゴヌクレオチドＯＰＲ１２８及びＯＰＲ１２９によりコードされ、そして配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ(SEQ I D NO:8)を有するＨＡ３０７−３１９は、ＯＰＲ１３０及びＯＰＲ１３１によりコードされる。ＯＰＲ１２８、ＯＰＲ１２９、ＯＰＲ１３０及びＯＰＲ１３１の配列は、図面のFIG.８に記載した。ｐＢＳ−ＤＲ１β基本骨格の各構築物は、ｐＢＳ−ＤＲ１β／ＮＰ及びｐＢＳ−ＤＲ１β／ＨＡと命名した。これらのベクターをEcoRV及びEagIで消化して、生じたペプチド−リンカー−β１−β２−ヒンジ遺伝子断片は、以下の実施例２に記載されるようにｐＪＷ００９ＩｇＧシャトルベクター中にサブクローン化した。実施例１Ｅ以下のアプローチを利用してＩ−Ａ^s α１−α２遺伝子断片（ａａ１〜１８２をコードする）を単離した。FIG.８に、使用したオリゴヌクレオチドプライマーを列挙した。また、図面のFIG.６にプロトコールを図示した。全ＲＮＡは、細胞培養物からＲＮＡを調製するために使用した手順と同じ手順によりＳＪＬマウスの脾臓から調製した。ＲＮＡ（１０μｇ）は、製造業者の使用説明にしたがってMLV Reverse Transcriptase（GIBCO-BRL）及びα２特異的プライミングを使用することにより、ｃＤＮＡ（５０μｌ）に変換した。ＰＣＲは、テンプレートｃＤＮＡ６μｌを使用し、プライマーをＯＰＲ１００及びＯＰＲ１０１（これらの配列は、図面のFIG.８に記載される）とし、そしてＰＣＲ条件は、５５ ℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、及び９６℃で１分間を５温度サイクル、次いで７２℃で１分間及び９６℃で１分間を２０工程サイクルとした他は、上述のように実施した。最初のα１−α２ＰＣＲ産物（約５５０塩基対）は、ＰＣＲプライマーＯＰＲ１０７及びＯＰＲ１０８を使用して、５５℃で３０秒間、７２℃ で３０秒間、及び９６℃で１分間を５温度サイクル、次いで７２℃で１分間及び９６℃で１分間を１０〜１５工程サイクル、再増幅した。生じたα１−α２ＰＣＲ産物（約５９０塩基対）は、ＩｇＧ κ鎖シャトルベクターのリーダーイントロンとＪ領域イントロンとの間のクローニングのための、5'EcoRV部位及び3'E agI部位を含有する（図面のFIG.９Ｃを参照のこと）。更に、ＰＣＲ産物は、ＭＨＣ−ＩｇＧ融合タンパク質の適正な発現に必要な、ＩｇＧスプライシング部位及びリーダー配列を有する。ＰＣＲ産物は、EcoRV及びEagIで消化して、ゲル精製した。精製した消化ＰＣＲ産物は、α鎖領域を交換するため、EcoRV／EagI消化ｐＡ１９（上を参照のこと）中に連結した。生じたベクターのｐＢＳ−ＩＡＳ αをEcoRV及びEagIで消化して、α１−α２遺伝子断片は、以下の実施例２に記載されるようにｐＪＷ００３ＩｇＧシャトルベクター中にサブクローン化した。実施例１Ｆ下記の方策を利用して、Ｉ−Ａ^s β１−β２遺伝子断片（ａａ１〜１８９をコードする）を単離し、リンカー配列を結合し、抗原性ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを挿入した。また、このアプローチは、図面の FIG.７に図示した。ＳＪＬ脾臓全ＲＮＡ（１０μｇ）は、製造業者の使用説明にしたがってMLV Reverse Transcriptase（GIBCO-BRL）及びβ２特異的プライミングを使用することにより、ｃＤＮＡに変換した。生成したｃＤＮＡ５０μｌの内、６μｌをＰＣＲのテンプレートＤＮＡとして使用した。反応は、オリゴヌクレオチドプライマーを、ＶＷ３１０及びＯＰＲ１０６（FIG.８）とし、そしてＰＣＲ条件は、６２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、及び９６℃で１分間を５温度サイクル、次いで７２℃で１分間及び９６℃で１分間を２１工程サイクルとした他は、上述のように行った。リンカー配列を付加するために、最初のβ１−β ２ＰＣＲ産物（約５７０塩基対）は、ＰＣＲプライマーのＶＷ３０９及びＯＰＲ１０６を使用して、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、及び９６℃で１分間を３温度サイクル、次いで７２℃で１分間及び９６℃で１分間を１０工程サイクルで再増幅した。ＶＷ３０９及びＯＰＲ１０６プライマーの配列についてはFI G.８を参照のこと。リンカー−β１−β２ＰＣＲ産物（約６４０塩基対）をNhe I及びEagIで消化して、ゲル精製し、β鎖遺伝子断片を交換するため、NheI／Eag I消化ｐＢ１６（上を参照のこと）中に連結した。ｐＢＳ−ＩＡＳβと命名した生じたベクターは、ＩｇＧ κ鎖シャトルベクターのリーダーイントロンとＪ領域イントロンとの間のクローニングに必要な、EcoRV／EagIリンカー−β１−β ２断片を含有する（図面のFIG.９Ｄを参照のこと）。クラスII Ｉ−Ａ^s結合ペプチドをコードする配列を挿入するために、オリゴヌクレオチドをアニーリングして、AflII／NheI消化ｐＢＳ−ＩＡＳβ中に連結した。ＭＢＰ９１−１０３ペプチド（ＨＹＧＳＬＰＱＫＳＱＨＧＲ）（SEQ ID NO:9）は、オリゴヌクレオチドＶＷ３１５及びＶＷ３１６によりコードされ、ＰＬＰ１３９−１５１（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ）（SEQ ID NO:10）は、ＶＷ３１３及びＶＷ３１４により、そしてＭＢＰ１−１４（ＭＡＳＱＫＲＰＳＱＲＳＫＹＬ）（SEQ ID NO:11）は、ＶＷ３１７及びＶＷ３１８によりコードされる。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、図面のFIG.８に記載される。ｐＢＳ−ＩＡＳβ基本骨格の各構築物は、ｐＢＳ−ＩＡＳβ／ＭＢＰ９１、ｐＢＳ−ＩＡＳβ／ＰＬＰ及びｐＢＳ−ＩＡＳ β／ＭＢＰ１と命名した。これらのベクターは、EcoRV及びEagIで消化して、生じたペプチド−リンカー−β１−β２遺伝子断片は、以下の実施例２に記載されるようにｐＪＷ００９ＩｇＧシャトルベクター中にサブクローン化した。実施例２イムノグロブリンに結合したＭＨＣ融合複合体の発現ベクターの調製以下のプロトコールは、キメラタンパク質としての可溶性ペプチド結合MＨＣクラスII／イムノグロブリン分子の発現を含む。本目的は、κ定常部ドメインとＭＨＣクラスII α鎖領域、及び目的のペプチドに共有結合したＭＨＣクラスII β鎖と結合したマウスＩｇＧ 2b定常部ドメインを有する、抗体様分子を構築することである。これらの構築物は、次に別々の哺乳動物発現ベクターにクローン化し、リンパ系由来の細胞系（即ち、Ｊ５５８）をトランスフェクションするために使用した。２つの通常使用される哺乳動物発現ベクターを改変して、キメラ構築物をクローン化及び発現できるようにした。元のベクターは、Near et al.，Molecular I mmunology 27:901-909(1990)に記載されている。図面のFIG.１０Ａに、基本骨格としてｐＢＲ３２２、及びネオマイシン耐性遺伝子を含有する１１．７KbのpSVn eoKappa26-10軽鎖発現ベクターを示した。更には、最初にゲノムＤＮＡとしてラムダ中にクローン化した、生殖細胞系κＤＮＡの６．７Kb断片を有する。２．７ KbのEcoRI−XbaI断片は、図面のFIG.１１Ａに示されるように、Ｉｇκプロモーター及びエンハンサー、リーダー配列とそのイントロン、ＪＫ１で再構成した可変部エキソン、残りのＪＫエキソンとイントロン、及びκ定常部から可変部を分離する主要なイントロンの一部を含有する。ペプチド結合β鎖とＩｇＧ２ｂイムノグロブリン定常部を、ｐＪＷＯ１０と呼ばれるpSVgptHC26-10中にクローン化した。この哺乳動物細胞ベクターは、最初にMulligan et al.（Science，209:1422-1427，1980）；及び後にNear et al. ，前出に記載されている。簡単に述べると、図面のFIG.１０Ｂに示されるpSVgpt HC26-10は、１０Kbであり、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下の大腸菌（E．co li）キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）を含有する。生殖細胞系マウスＩｇＧ２ｂ定常部ドメインを、BglII-XbaI断片としてｐＳＶｇｐｔ中にクローン化した。Near et al.，前出により作製されたベクターに対する別の変化は、Ｉｇ重鎖プロモーター／エンハンサーを含有する０．７KbのEcoRI−XbaI断片のクローニングであった。これらの変化により、Near et al.が１．７KbのXbaI断片をクローン化するために使用したXbaIクローニング部位を有するpSVgptHC26-10ベクターが生成した。この１．７Kb挿入断片は、Ｉｇ重鎖リーダー配列とそのイントロン、ＪＨ４ドメインに結合した可変エキソン、及びＶ領域とＣ領域の間に存在する主要なイントロンを含有する。更には、１．７Kb断片は、突然変異した標的配列ＤＮＡである。要約すると、α及びβ鎖のクローニングを可能にするために、２．７Kb及び１．７Kb断片への幾つかの突然変異を以下に記載されるように達成する必要があった。 α鎖遺伝子のクローニング及び発現用のｐＪＷ００４ベクターを調製するための方策は、FIG.１１Ａに記載される２．７Kb挿入断片内に２つの部位突然変異を作製することであった。ｐＪＷ００４の試料は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ＡＴＣＣ)Rockville，Ma ryland，USA）に寄託し、ＡＴＣＣ番号７５８３２を受けた。EcoRV部位をκ可変部の８ヌクレオチド５’に作製したが、EagI部位は、ＪＫ１ドメインの８ヌクレオチド３’に付加した。これらの突然変異により、α鎖／κ定常部融合分子の発現用のベクター中へのＭＨＣクラスII α遺伝子の指向性クローニングが可能になった。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）部位特異的突然変異誘発を使用して、これら２つの制限部位を付加し、これらの変化を起こすためにとったプライマー及び工程は、図面のFIG.１２に示した。ＤＮＡの２．７Kb断片を、ｐＵＣ１９からＭ１３ｍｐ１８中に、EcoRIで線状化したEcoRI−XbaI断片としてクローン化して、ＰＣＲ反応のテンプレート（５ng／１００ul混合物）として使用した。３つの異なる長さのＰＣＲ産物（０．８KbのEcoRI〜EcoRV断片、０．４KbのEcoRV〜E agI断片、及び１．５KbのEagI〜XbaI断片を含む）を特異的に増幅するプライマーを設計することにより、２．７Kb挿入断片を３つのＰＣＲ断片に分割した。各断片を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーをまとめ、下線の配列は、制限エンドヌクレアーゼ部位に対応する。EcoRI部位を含有するプライマーＰＭＣ１２０［５’ＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＣＡＧ３’］（SEQ ID NO:12）、及びEcoRV部位を含有するＰＭＣ１０８［５’ＧＡＴＧＡＴＡＴＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＡＣＡＣＡＣ３’］（SEQ ID NO:13）を使用して、０．８Kb産物を増幅し、一方 EagI部位を含有するプライマーＰＭＣ１００［５’ＣＧＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＴＴＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＴＴＡＣ３’］（SEQ ID NO:14）及びEcoRV部位を含有するＰＭＣ１０２［５’ＧＴＧＴＧＴＴＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧ３’］（SEQ ID NO:15）をＰＣＲに使用して、０．４Kb断片を増幅した。増幅すべき最終の断片は、長さが１．５Kbであり、XbaI部位を含有するプライマーＰＭＣ９９［５’ＴＣＴＴＣＴＡＧＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＴＡＣ３’］（SEQ ID NO:16）及びEagI部位を含有するＰＭＣ１０７［５’ＧＡＴＧＡＴＡＴＣＣＧＧＣＣＧＡＡＧＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＧＴＴＧＴＣ３’］（SEQ ID NO:17）を使用して増幅した。突然変異した２．７Kb挿入断片を作成するために、３つのＰＣＲ産物により２つの重複ＰＣＲ反応を行った。最初の重複ＰＣＲにより、プライマーＰＭＣ１００及びＰＭＣ１２０並びに０．８Kb及び０．４Kb断片を使用して、１．２Kb産物が増幅した。ゲル精製した１．２Kb ＤＮＡ及び１．５Kb断片並びにプライマーＰＭＣ９９及び１２０を使用して、第２の重複ＰＣＲ反応を行った。この反応から、２．７Kb 断片を生成し、これを後にEcoRI及びXbaIで消化して、ｐＵＣ１９中にクローン化した。連結反応混合物からのＤＮＡをＤＧ１０１細胞中に形質転換して、３６コロニーを選び取り、EcoRV−EagI及びEcoRI−XbaI酵素を使用して二重消化物によりスクリーニングした。制限地図作成により幾つかの陽性クローンを検出後、３つのクローンを配列決定のために選択した。プライマーＰＭＣ−３３、７７、１１１、及び１１４（これらのプライマーの配列は、図面のFIG.１４に記載される）を使用することにより、９００塩基対の配列データを得た。正しい配列が、EcoRVとEagI部位との間の４００塩基対のＤＮＡ、並びにEcoRVの３００塩基対５’及びEagI部位の２００塩基対３’を含むことが判った領域。１つのクローンｐＪＷ００１は、コンセンサス配列とは５塩基異なる良好な配列であった。制限地図作成後の、そしてＭ１３ユニバーサルプライマーを使用して作製した配列データの精査からの妨害的（disturbing）観察は、ｐＵＣ１９中にクローン化し、ＤＧ１０１中に形質転換した挿入ＤＮＡが、欠失したことであった。多くの転写装置がEagI部位と XbaIの間に位置する主要なイントロンと共に欠失したため、これらの欠失した配列が問題を均衡させた。突然変異郊位のEcoRV及びEagIを含有するＤＮＡの断片を救い出すために、クローン＃１２挿入断片を２つのユニークなカッターである NcoI及びBsmIで消化した。NcoI部位は、EcoRV部位から約３００塩基対５’に位置し、そしてBsmI部位は、EagI部位の約２００塩基対３’に存在する。したがって、図面のFIG.１３に示されるように、０．９KbのNcoI−BsmI断片をｐＪＷ００１から切り出し、EcoRV及びEagI部位を含まないが、ユニークなNcoI及びBsmI部位を含む、ｐＵＣ１９／κ２６−１０挿入断片中にクローン化した。正しいサイズの挿入断片をｐＪＷ００２中にクローン化したかどうか確認するために、ｐＪＷ００２ＤＮＡのアリコートを制限酵素の３つの異なる対（EcoRI−XbaI、NcoI −BsmI、及びEcoRV−EagI）で消化した。再度組換えが起こるのを防ぐために、大腸菌（E．coli）の種をＤＧ１０１からＸＬ１−Ｂ（ｒｅｃＡ陰性宿主）に変えた。この工程で、挿入ＤＮＡは、２つの部位突然変異を含有しており、ＭＨＣクラスIIα遺伝子のクローニングを進めることができた。ｐＪＷ００２ＤＮＡをEcoRV及びEagIで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化し、次にゲル精製した。次いで単離したベクターＤＮＡを使用して、ゲル精製した５７７塩基対EcoRV−EagI切断α鎖Ｉ−Ａ^d遺伝子と連結した。連結、形質転換及び１０コロニーのスクリーニングにより、単一の陽性クローンを得て、これを２対の酵素（EcoRI−XbaI及びEcoRV−EagI）で消化した。陽性クローンｐＪＷ００３（α遺伝子を含有するｐＵＣ１９突然変異κ）を増殖して、ＤＮＡをキアジェン（Qiagen）精製した。 EcoRI、XbaI、及びHindIIIを使用してｐＪＷ００３ＤＮＡを三重消化した。次に切断ＤＮＡをフェノールクロロホルムで処理し、エタノールで沈殿させて、７０％エタノールで洗浄し、次にこのＤＮＡをScaIで消化して、ＣＩＡＰで処理した。ｐＵＣ１９ＤＮＡは、アガロースゲル上で２．７Kbに移動し、このため目的の挿入ＤＮＡからｐＵＣＤＮＡを分離するのが困難になった。しかし、ｐＵＣ１９は、２つのより小さなサイズの断片を切り出して提供する、ユニークなScaI部位を有し、この小さな断片は、アガロースゲル上で２．９Kbの挿入ＤＮＡから分離することができる。ゲル精製後、２．９KbのαＩ−Ａ^d遺伝子挿入断片をEcoRI−XbaIゲル精製したｐＳＶｎｅｏベクターに連結して、ｐＪＷ００４を作製した（FIG.１６Ａ）。連結断片は、ＤＧ１０３中に形質転換した。キアジェン（Qiagen）のマキシ調製（maxi-preparations）を行って、大量のベクターＤＮＡを単離したため、ｐＪＷ００４を哺乳動物細胞中にトランスフェクションすることができた。ＭＨＣβ可変遺伝子をｐＳＶｇｐｔ発現ベクター中にクローニングするための方策は、FIG.１１Ｂに記載される１．７Kb XbaI断片内に４つの突然変異を作製することであった。４つの突然変異は、２つのEcoRV部位欠失（１つは、リーダー配列エキソンの６８ヌクレオチド５'に位置し、もう１つの部位は可変部の２７ヌクレオチド５’に位置する）を含んでいた。他の２つの突然変異は、部位付加であり、可変部の８ヌクレオチド５’のEcoRV部位及びＪＨ４ドメインの８ヌクレオチド３’のEagI部位を含んでいた。Ｍ１３部位特異的突然変異誘発を使用して、１.７Kb挿入断片上に突然変異を作製した。このアプローチは、pSVgptHC2 6-10からの１．７Kb XbaI断片をサブクローン化し、これをＭ１３中にクローン化することであった。非常に効率的で単純なKunkelの方法に基づく、BioRad Mut a-Gene in vitro Mutagenesis Kitを使用して、部位特異的突然変異誘発を行った。この方法は、ｄＵＴＰアーゼ(ｄｕｔ)及びウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ( ｕｎｇ)の欠損している特別な大腸菌（E．coll）種を利用した。これらの欠損により、Ｍ１３ｓｓＤＮＡ中のチミジンのランダムなウラシル置換が可能になった。二本鎖ＤＮＡ、又は複製型（ＲＦ）が、野生型宿主種中に形質転換して戻るとき、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは、元のテンプレート中に存在するウラシルを分解し、そのため部位特異的突然変異を含むＤＮＡの鎖のみが複製して非常に効率よく陽性クローンが生じた。突然変異を起こすのに利用した工程は、FIG.１５に示した。簡単に述べると、プライマーＰＭＣ２６［５’ＣＡＧＧＧＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣ３’］（SEQ ID NO:１８）を使用して、リーダー配列エキソンの６８ヌクレオチド５’に位置するEcoRV部位を欠失させたが、このプライマーには、下線のヌクレオチドにより示される、ＡからＴへの単一塩基の変化があった。可変領域の２７ヌクレオチド５’の第２のEcoRV部位の欠失は、プライマーＰＭＣ２８［５ ’ＧＴＣＡＣＡＧＴＴＡＴＣＣＡＣＴＣＴＧＴＣ３’］（SEQ ID NO:19）により行ったが、これにもまたＡからＴへの単純な点変異の変化があった。プライマーＰＭＣ９６［５’ＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＡＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＧ３’］（SEQ ID NO:20）には、EagI部位突然変異が含まれており、これは下線のヌクレオチドにより示される４塩基の変化よりなっていた。最後に、プライマーＰＭＣ９７［５’ＣＡＣＡＧＴＴＡＴＣＣＡＣＴＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴ３’］（SEQ TD NO:21）を使用して、示されるように４つのヌクレオチドを変化させることによりEcoRV部位を作製した。突然変異した１．７Kb挿入断片を次にEcoRV−EagIで消化し、ＣＩＡＰ処理し、ゲル精製して、EcoRV−EagIで切断してゲル精製したＭＨＣクラスIIβ遺伝子と連結するのに使用した。上の実施例１に記載されたＯｖａ３２３−３３９／Ｉ−Ａ^d β１−β２遺伝子断片のような他の変種も、EcoRV−EagI部位中にクローン化して、Ｍ１３で増殖させた。図面のFIG.１５に、ＭＨＣクラスII β可変部及び変種をベクターｐＪＷ００９中にクローニングするための方策を記載した。ｐＪＷ００９へのクローニング後、ＤＮＡをXbaIで消化して、種々のペプチド結合したβ可変部遺伝子を含有するXbaI断片を脱落させ、FIG.１６Ｂに示されるように哺乳動物発現ベクターｐＪＷ０１０中にサブクローン化した。指向性クローニングができなかったため、EcoRI−EcoRVでの消化により陽性クローンのスクリーニングを行った。β遺伝子及び他のペプチド結合したβ鎖変種を含有する陽性クローンを単離して、ＤＮＡをキアジェン（Qiagen）精製した。これらペプチドを含まないＩ−Ａ^d β鎖構築物、Ｏｖａ３２３−３３９ペプチド、Ｏｖａ：Ｈ３３１Ｒペプチド及びＯｖａ：Ａ３３１Ｙペプチドを含むＩ−Ａ^d β鎖構築物を、それぞれ、pHＢ２７、pHＢ３１０、pHＢ４１２及びpHＢ５８と命名した（実施例１Ｂを参照のこと）。pHＢ２７、pHＢ３１０、pHＢ４１２及びpHＢ５８の試料は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ＡＴＣＣ)（ロックビル(Rockville)、メリーランド州、米国)に寄託し、それぞれ、ＡＴＣＣ番号７５８３３、７５８３５、７５８３６及び７５８３４を受けた。Ｊ５５８及びＮＳ０細胞のようなリンパ系由来細胞のトランスフェクションは、本質的にはNear et al.に記載されるように行うことができた。ｐＪＷ００４及びｐＪＷ０１０の両方とも２０μｇを、BioRadのジーンパルサー（gene pulse r）を使用する電気穿孔法によりＪ５５８又はＮＳ０細胞中に同時トランスフェクションすることができた。安定な細胞系を７〜１０日以内に選択した。キメラＭＨＣクラスII／Ｉｇ分子の発現は、マウスＩｇＧ 2b定常領域を検出するのに特異的なＥＬＩＳＡにより求めるか、及び／又はウェスタンブロット解析を行うことができた。最終的に、発現したタンパク質をプロテイン−Ａ又は−Ｇ親和性クロマトグラフィーにより精製した。実施例３完全長ペプチド結合ＭＨＣ発現ベクター及び同時刺激因子（Ｂ７−１及びＢ７−２）の発現ベクターの構築完全長Ｉ−Ａ^d α鎖及びペプチド結合Ｉ−Ａ^d β鎖分子を同時発現することができるベクターは、適切には図面のFIG.１７に略述される手順により構築した。完全長Ｉ−Ａ^d α鎖を単離するために、Ａ２０全ＲＮＡ（５μｇ）は、製造業者の使用説明にしたがってSuperscript-MLV Reverse Transcriptase（GIBCO-BRL）及びα鎖ＴＭ特異的プライミングを使用することにより、ｃＤＮＡに変換した。このｃＤＮＡを、α鎖リーダー特異的プライマーＯＰＲ１３６（このプライマーの配列は、FIG.８に記載される）及びα鎖ＴＭ特異的プライマーＯＰＲ１３９（このプライマーの配列は、FIG.８に記載される）を用いて、上の実施例１に記載されたＰＣＲ条件により、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。生じたＰＣＲ産物は、約８００塩基対であり、ＰＥＥ１３哺乳動物発現ベクター(Celltec h)のＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリ−Ａ部位との間のクローニングのための、5'XmaI部位及び3'EcoRI部位を含有していた。更に、この断片は、効率的な翻訳開始のためのKozakコンセンサス配列を有していた（図面のFIG.１８Ａを参照のこと）。ＰＣＲ産物は、XmaI及びEcoRIで消化し、ゲル精製して、XmaI／EcoRI 消化ＰＥＥ１３中に連結して、ＰＥＥ−ＩＡ^d αベクターを得た。完全長ペプチド結合β鎖断片は、リーダー及びＴＭ配列を、上の実施例１に記載されたＯｖａ３２３−３３９及びＨＥＬ７４−８６ペプチド−リンカー−β１−β２ベクター（それぞれ、ｐＢ１６及びｐＢ４）中に挿入することにより構築した。Ａ２０全ＲＮＡ（５μｇ）は、製造業者の使用説明にしたがって Superscript-MLV Reverse Transcriptase（GIBCO-BRL）及びオリゴｄＴ特異的又はβ鎖ＴＭ特異的プライミングを使用することにより、ｃＤＮＡに変換した。これらのｃＤＮＡを、β鎖リーダー特異的プライマー対（ＯＰＲ１３２／ＯＰＲＩ３３）（これらのプライマーの配列は、図面のFIG.８に記載される）又はβ鎖ＴＭ特異的プライマー対（ＯＰＲ１３４／ＯＰＲ１３５）（これらのプライマーの配列は、図面のFIG.８に記載される）を用いて、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。この１１０塩基対βリーダーＰＣＲ産物は、ｐＢＣ１及びｐＢ１６ペプチド−リンカー−β１−β２ベクターへのクローニングのための５’HindII I及びXmaI部位並びに3'AflII部位を含有していた。AflII部位を含めると、Ｉ− Ａ^d β鎖リーダーの最後の２つのアミノ酸が、ＩｇＧリーダーで見い出されるアミノ酸に変化した。βリーダーＰＣＲ産物をHindIII及びXmaIで消化し、ゲル精製して、HindIII／AflII消化ｐＢ１６中に連結して、ｐＤＭ２１を得た。この１８０塩基対のβＴＭＰＣＲ産物は、ｐＤＭ２１へのクローニングのための5'Bst XI部位並びに3'XmaIII及びEcoRI部位を含有していた。βＴＭＰＣＲ産物をBstX I及びEcoRIで消化し、ゲル精製してBstXI／EcoRI消化ｐＤＭ２１中に連結して、ｐＩＡ^dβ／ＯＶＡベクターのｐＶＷ２２９を得た。Ｏｖａペプチドオリゴヌクレオチドを、上の実施例１に記載されたＨＥＬペプチドオリゴヌクレオチドと交換して、ｐＩＡ^dβ／ＨＥＬベクターを作製した。これらのベクターをXmaI及びE coRIで消化して、ＰＥＥ６哺乳動物発現ベクター（Celltech）のＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリ−Ａ部位との間のクローニングのための完全長ペプチド結合 β鎖遺伝子断片を作製した。これらの断片はまた、効率的な翻訳開始のためのKo zakコンセンサス配列を含んでいた（FIG.１８Ｂ）。生じたベクターＰＥＥ−ＩＡ^dβ／ＯＶＡ及びＰＥＥ−ＩＡ^dβ／ＨＥＬをBgIII及びBamHIで消化した。ＣＫＭＢプロモーター／ペプチド−β鎖断片をゲル精製して、BamHI消化ＰＥＥ−ＩＡ^dα中に連結して、最終のＰＥＥ−ＩＡ^d／ＯＶＡ及びＰＥＥ−ＩＡ^d／ＨＥＬ発現ベクターを作製した。どのペプチドオリゴヌクレオチドも含まないベクターのＰＥＥ−ＩＡ^dも構築して、対照として使用した。Ｂ７−１及びＢ７−２遺伝子をクローン化するために、活性化マウス脾臓細胞、又はマウスリンパ腫細胞系から単離した全ＲＮＡから、ｃＤＮＡを作製することができた。これらのｃＤＮＡを、Ｂ７−１又はＢ７−２特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅のテンプレートとした。生成したＰＣＲ産物は、ｐＣＭＶβ哺乳動物発現ベクター（Clonetech）のＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリ−Ａ部位の間のクローニングのための5'及び3'NotI部位を有していた。これらの断片はまた、効率的な翻訳開始のためのKozakコンセンサス配列を有していた。実施例４〜１１アッセイ及び方法一般的説明適切には幾つかのアッセイ系の１つ以上を利用して、Ｔ細胞の活性を調節する可溶性ＭＨＣ融合複合体の能力を試験し、これらの測定系は、以下の実施例に例示した。最初の具体的アッセイでは、マウスＭＨＣクラスII Ｉ−Ａ^d／Ｉｇ融合分子を、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ７４−８６）、チキンオボアルブミン（Ｏｖａ３２３−３３９）又はＯｖａペプチドの２つの単一置換類似体の１つ（ＯｖａＨ３３１Ｒ又はＯｖａＡ３３２Ｙ）からの抗原性ペプチドに結合した。ＨＥＬ７４−８６、Ｏｖａ３２３−３３９及びＯｖａＨ３３１Ｒペプチドは、Ｉ−Ａ^dに結合することが知られているが、一方ＯｖａＡ３３２Ｙ類似体は、非結合性対照となる［S.Buusetal.,Science,235:1353-1358(1987);A.Sette et al. ，Nature，328:395-399(1987)］。His₃₃₁はＭＨＣ結合に重要でないと考えられているが、Ｔ細胞刺激には決定的に重要であり、ＯｖａＨ３３１Ｒ／Ｉ−Ａ^d／Ｉｇ複合体は、Ｔ細胞刺激に対するＴｃＲアンタゴニストとなる。マウスＤ０１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマは、Ｏｖａ３２３−３３９／Ｉ−Ａ^d複合体を特異的に認識し、刺激を受けてＩＬ−２を産生する。以下の実施例４に略述されるアッセイでは、Ｏｖａペプチドで装填されたＡＰＣによるＴ細胞刺激を抑制するために、可溶性Ｏｖａ３２３−３３９／Ｉ−Ａ^d／Ｉｇを使用した。Ｏｖａ特異的Ｔ細胞増殖に及ぼす可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子の更なる作用は、実施例５で試験した。更に、インビボでＴ細胞機能に及ぼす、可溶性Ｏｖａ３２３−３３９／Ｉ−Ａ^d／Ｉｇ及び可溶性ＨＥＬ７４−８６／Ｉ −Ａ^d／Ｉｇの作用は、実施例６及び７に記載されるように試験することができた。マウスに、抗原性ＨＥＬ及びＯｖａペプチド（ＫＬＨ担体に結合している）、並びに可溶性Ｏｖａ３２３−３３９／Ｉ−Ａ^d／Ｉｇ又は可溶性ＨＥＬ７４− ８６／Ｉ−Ａ^d／Ｉｇ分子のいずれかを注射した。インビボのＴ細胞依存性抗体応答、並びにＯｖａ特異的Ｔ細胞及びＨＥＬ特異的Ｔ細胞の増殖の阻害は、実施例６及び７に記載されるように特徴付けした。更に別のモデルは、インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ４０４−４１５）からのペプチドをヒトクラスII ＨＬＡ−ＤＲＩ／Ｉｇ分子に結合するというアッセイにより例示した（実施例５を参照のこと）。可溶性ＮＰ４０４−４１５／ＤＲ１／Ｉｇ分子は、ヒトＴ細胞系のＫ６８−３６のＡＰＣ／ＮＰ４０４−４１５依存性増殖を阻害するその能力に関して解析した。異なるＨＬＡ−ＤＲ１結合ペプチド（ＨＡ３０７−３１９）に結合した可溶性ＤＲＩ／Ｉｇ分子を陰性対照として使用した。追加のモデル系では、自己免疫を抑制する可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子の能力を試験した。多発性硬化症の動物モデルとして、脳炎誘発性タンパク質若しくはペプチドによる免疫化により、又はこれらの抗原に特異的なＴ_H細胞の養子移入により、ＳＪＬマウスを誘導して実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を発症させることができる。以下に記載されるように、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ９１−１０３）及びプロテオリポタンパク質（ＰＬＰ１３９−１５１）の脳炎誘発性領域を、それぞれマウスクラスIIＩ−Ａ^d／Ｉｇ分子に結合した。非結合ＭＢＰ１−１４ペプチドを陰性対照とした。可溶性ペプチド結合Ｉ− Ａ^s／Ｉｇ分子をＥＡＥ誘導マウスに投与した。ＥＡＥの発症率と重篤度を低下させる能力は、以下の実施例８に記載されるように求めた。更に、ＥＡＥ誘導マウスにおける完全長Ｉ−Ａ^s分子に結合したＴｃＲアンタゴニストのＰＬＰ類似体の免疫抑制効果は、この系で試験することができる。ペプチド／ＭＨＣ複合体は、以下の実施例１１に記載されるように、適切な遺伝子構築物を含むＤＮＡの注射により筋肉内で産生される。実施例４オボアルブミン特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ系における可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子の作用本発明による１つのアッセイは、チキン卵白オボアルブミン（Ｏｖａ）に由来する２１アミノ酸ペプチド断片（ａａ３２３−３３９）に特異的なＴ細胞受容体を表面に発現する、マウスＴ細胞ハイブリドーマのＤ０１１．１０［R．Shimo nkevitz et al.，J．Exp．Med.，158:303(1983)］を使用するものであった。このペプチドは、マウスクラスII ＭＨＣ分子Ｉ−Ａ^dを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってのみＤ０１１．１０に提示することができた。ペプチドを適切なＡＰＣにより提示するとき、Ｄ０１１．１０細胞は、ＩＬ−２を産生することにより応答し、これを次にＴ細胞活性化の尺度として測定することができた。抗原を提示するために使用する細胞系は、Ａ２０．１−１１［K．Kim et al.，J ．Immunol.，122:549(1979)］であり、その表面にＩ−Ａ^dを発現した。簡単に述べると、Ａ２０．１−１１細胞を、ペプチド断片の存在下でそのＩ−Ａ^d分子がペプチドで飽和するまで（約３時間）インキュベーションし、次に洗浄して未結合ペプチドを除去した。Ｄ０１１．１０細胞を、可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子と共に、又はそれなしに、３時間（又はそれ以上）インキュベーションし、次に充分に洗浄して未結合タンパク質を除去した。上の実施例１に記載されるように、Ｉ−Ａ^dβ鎖に結合したペプチドは、Ｏｖａ３２３−３３９、Ｏｖａペプチドの２つの単置換類似体の１つ(ＯｖａＨ３３１Ｒ又はＯｖａＡ３３２Ｙ)、又はニワトリ卵白リゾチームからのペプチド(ＨＥＬ７４−８６)を含む。Ｏｖａ３２３−３３９、ＯｖａＨ３３１Ｒ、ＨＥＬ７４−８６ペプチドは、Ｉ −Ａ^dに結合することが知られているが、一方ＯｖａＡ３３２Ｙ類似体は、非結合性対照とした[S.Buus et al.,Science,235:1353-1358(1987);A．Sette et al. ，Nature，328:395-399(1987)］。ＨＥＬ７４−８６ペプチドは、非特異的陰性対照とした。抗原を適用したＡＰＣを次に処理Ｄ０１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマ（２×１０⁵／ウェル）と共に２４時間３７℃で５％ＣＯ₂の雰囲気でインキュベーションした。培養は、完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン及び５×１０^-5M ２−メルカプトエタノールを補足したＲＰＭＩ１６４０）で９６ウェル平底マイクロタイタープレート中で行った。２４時間後、ＩＬ−２依存性マウスＴ細胞系のＣＴＬＬ−２を使用してＩＬ−２の存在に関して培養上清を測定した。平底マイクロタイタープレート中の完全培地で各培養上清の連続２倍希釈液を調製し、各ウェルに１×１０⁴個のＣＴＬＬ−２細胞を加えた。１６〜２０時間後、陰性対照ウェル（培地単独で培養したＣＴＬＬ−２）及び陽性対照ウェル（ｒＩＬ−２を加えて培養したＣＴＬＬ−２細胞）を顕微鏡により検査して、陽性対照細胞はなお活性に増殖しているが、陰性対照細胞の９０％が死滅した時点で、ＭＴＴ（２mg/ml；２５μｌ/ウェル）を加えて、プレートを更に４時間インキュベーターに戻した。この時点で、活性に代謝する細胞中のＭTＴにより形成される青色の結晶は、０．４N ＨＣｌイソプロパノール溶液１５０μｌ/ウェルの添加により溶解した。慎重な混合の後、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ceres-UV 900HI）を使用して５６２nmでＯ．Ｄ．を測定した。実験ウェル中のＩＬ−２の濃度は、ＩＬ−２標準曲線からの外挿により求めることができ、次に組換えタンパク質分子を含有しない培養物からのＩＬ−２を、試験すべき分子を含有する培養物からのＩＬ−２と比較し、阻害指数を算出することができた。Ｄ０１１．１０の活性化に関して、ペプチド抗原及び抗原提示細胞の最大よりもわずかに低い応答を示す、抗原用量及びＡＰＣ数の使用が、組換えタンパク質分子による系の阻害を検出するのに好適であると考えられている。この観点から、好ましくは実験は、少なくとも初期は１００μｇ/ml及び１０μｇ/mlのペプチド抗原適用条件で、そして０．５×１０⁵／ウェル及び０．１×１０⁵／ウェルのＡＰＣ濃度で行った。可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子を、１０^-12〜１０^-6Mの濃度範囲にわたって、この系をブロックするその能力に関して試験した。試験は、適切には可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子と、０．５×１０⁵又は０．１×１０⁵個のＡ２０．１−１１細胞上で発現したＭＨＣクラスIIとの間のモル比約１０：１〜１：１で行った。濃度は、予備実験の結果により、必要に応じて調整した。可溶性Ｏｖａ３２３−３３９／Ｉ−Ａ^d／Ｉｇ又はＯｖａＨ３３１Ｒ／Ｉ−Ａ^d／Ｉｇ分子と共にプレインキュベーションした後のＤ０１１．１０のＩＬ−２産生が、ＯｖＡ３３２Ｙ／Ｉ−Ａ^d／Ｉｇ若しくはＨＥＬ７４−８６／Ｉ−Ａ^d分子と共にプレインキュベーションしたか、又はプレインキュベーションをしていない場合に比較して低下したことは、可溶性ペプチド結合ＭＨＣ分子が、ペプチド特異的な様式で免疫応答を抑制することができることを示している。この同じアッセイは、上で考察したようにＴｃＲアンタゴニスト又は部分アゴニストとして機能するペプチドを同定するために使用することもできた。実施例５抗原刺激したＴ細胞増殖に及ぼす可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子の作用本発明による更に別のアッセイにより、可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子が、（上の実施例４に記載されるＴ細胞ハイブリドーマではなく）マウス又はヒトから単離したＴ細胞において免疫応答を抑制することができるかどうかを試験した。Ｄ０１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマは、部分的に活性化しており、完全な活性化のために同時刺激シグナルを必要としなかった。他方で、免疫化したマウスから単離した非形質転換Ｔ_H細胞は、培養で増殖するために、ペプチド／ＭＨＣシグナル及び同時刺激シグナルの両方を必要とした。この系は、Ｔ_H細胞応答に及ぼす可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子の作用の高感度の尺度として使用した。Ｏｖａで感作したＴ細胞は、尾の基部に皮下投与により、完全フロイントアジュバント中のＯｖａ３２３−３３９−ＫＬＨ５０μｇで免疫化することにより、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＭＨＣクラスII：Ｉ−Ａ^d）から得た。２回の免疫化は７日間隔で行い、２回目の注射の１週間後、マウスを屠殺して、蹊跳及び大動脈傍リンパ節を取り出して単細胞懸濁液にした。ナイロンウール及びセファデックスＧ−１０カラムでのインキュベーションにより、この懸濁液から抗原提示細胞を枯渇させ、生じた精製Ｔ細胞集団をクリック培地（Click's medium）単独と共に、又はクリック培地に溶解した可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子と共にインキュベーションした。Ｔ細胞を可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子（上の実施例４に記載した）と共に３時間培養し、次に洗浄して増殖測定を開始したが、この時間は必要であれば２４時間まで延長することができた。ＢＡＬＢ／ｃマウスからの活性化Ｂ細胞を、増殖アッセイにおいて抗原提示細胞として使用した。Ｂ細胞は、ＬＰＳ５０μｇ/mlと共に４８〜７２時間脾臓細胞を培養することにより調製し、次に活性化細胞を、リンホプレップ（Lymphopr ep）で密度勾配遠心分離により単離した。次に活性化Ｂ細胞にオボアルブミンペプチドを３時間適用し、充分に洗浄して、パラホルムアルデヒドで固定して、Ｂ細胞の増殖を阻害し、精製Ｔ細胞に加えた。増殖アッセイは、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートで３７℃、５％ＣＯ₂で３〜５日間行った。ウェルに³Ｈ−チミジン１μCiを１８時間パルスし、次に培養を終了してスカトロン（Skatron）細胞回収機を使用して回収した。Ｔ細胞増殖の尺度として³Ｈ−チミジンのＤＮＡへの取り込みを、ＬＫＢ液体シンチレーション分光計を使用して測定した。可溶性Ｏｖａ３２３−３３９／Ｉ−Ａd ／Ｉｇ分子とのプレインキュベーション後のＴ細胞増殖が、ＯｖａＡ３３２Ｙ／Ｉ−Ａ^d／Ｉｇ若しくはＨＥＬ７４−８６／Ｉ−Ａ^d／Ｉｇ分子とのプレインキュベーション後又はプレインキュベーションなしの場合に比較して低下したことは、可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子が、ペプチド特異的な様式で免疫応答を抑制することができることを示している。２４及び４８時間目での増殖するＴ細胞を含有するウェルのＩＬ−２濃度の測定は、３〜５日目に増殖のアッセイを行うことの良好な代替法になり得る。最初の実験は、阻害の検出にどちらがより高感度であるかを求めるための、これら２つの系の比較であった。ＩＬ−２の検出は、初期の活性化事象を測定するため、この状況ではより有用であることが判った。可溶性ペプチド結合ＭＨＣ分子の試験に先立って行われる最初の実験では、これらの系の最適なパラメーター、即ち、抗原提示細胞に適用するためのペプチド抗原の最大超、最大及び最大下濃度、ＡＰＣ／ウェルの最適及び最適下量、並びに増殖アッセイ（３〜５日）又はＩＬ−２産生アッセイの最適な長さを決定した。上に考察したように、この系は、Ｔ細胞活性化の最適下レベルで組換えタンパク質による阻害に最も高感度であると考えられたため、好ましくは最初の実験にはこのような条件を選択した。抗原刺激したヒトＴ細胞増殖に及ぼす可溶性ペプチド結合ヒトクラスII ＭＨＣ／Ｉｇ分子の作用も試験した。インフルエンザ核タンパク質のＮＰ４０４−４１５又はインフルエンザ血球凝集素タンパク質のＨＡ３０７−３１８のいずれかに共有結合した可溶性ＨＬＡ−ＤＲ１／Ｉｇ分子は、上の実施例１及び２に記載されたように産生することができた。両ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ１分子に結合することが知られている。ＮＰ４０４−４１５／ＤＲ１特異的ヒトＴ細胞クローンのＫ６８−３６を使用して、上述のように、ＮＰ４０４−４１５を装填されたＡＰＣ（ＢＬＣＬ−Ｋ６８細胞；ＥＢＶで形質転換した同じドナーからのＢ細胞）により刺激された³Ｈ−チミジン取り込みに及ぼす、可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子のプレインキュベーションの作用を試験した。再び、可溶性ＮＰ４０４−４１５／ＤＲ１／Ｉｇ分子とのプレインキュベーション後のＴ細胞増殖が、ＨＡ３０７−３１８／ＤＲ１／Ｉｇ分子とのプレインキュベーション後又はプレインキュベーションなしの場合に比較して低下したことは、可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子が、ペプチド特異的な様式でヒトの免疫応答を抑制できることを示している。これらのアッセイはまた、上述のようにペプチドがＴｃＲのアンタゴニスト又は部分アゴニストとして機能することができるかどうかを決定するために利用することができた。実施例６抗体応答に及ぼす可溶性ペプチド結合ＭＨＣ分子のインビボ作用上で考察したように、ＡＰＣの表面上のペプチド−ＭＨＣ複合体は、ＡＰＣが同時刺激シグナルをも送達するならば、ＭＨＣ結合ペプチドに特異的な反応性Ｔ細胞系のクローンの拡大を誘導するだけであることが証明されている。ＡＰＣが同時刺激シグナルを送達しない場合には、これらの特定の反応性Ｔ_H細胞は、アネルギーの状態まで誘導される。可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子が、インビボでＴ_H細胞アネルギーを誘導できるかどうかを試験するために、Ｔ_H細胞依存性イムノグロブリンのクラススイッチング（即ち、ＩｇＭからＩｇＧへ）及びペプチド特異的Ｔ細胞系（以下の実施例７）のクローンの拡大に及ぼす、このような分子の作用を試験することができた。Ｉｇクラススイッチングを試験するために、３つの試験群を以下のように設定した：（ａ）Ｏｖａ３２３−３３９ペプチドに対する免疫応答を誘導するためＢＡＬＢ／ｃマウス１５匹に、完全フロイントアジュバント中のＯｖａ３２３−３３９ −ＫＬＨ結合体１０〜１００μｇを腹腔内（ＩＰ）注射した。Ｏｖａ−ＫＬＨによる免疫化の前日及び当日に、マウス５匹に、ＰＢＳ中の可溶性Ｏｖａ３２３− ３３９／ＭＨＣＩ−Ａ^d／Ｉｇ１０〜１００μｇをＩＰ注射した。この可溶性Ｏｖａ融合タンパク質は、Ｏｖａ３２３−３３９特異的Ｔ_H細胞上に表示されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合した。同時刺激シグナルが存在しないため、これらのＴ_H細胞は、アネルギーの状態まで誘導された。残りのマウス１０匹は対照とした。これらの内５匹にＰＢＳを投与し、もう５匹にＭＨＣＩ−Ａ^d／Ｉｇを腹腔内投与した。（ｂ）ＨＥＬ−ＫＬＨ結合体及びＨＥＬ７４−８６／ＭＨＣＩ−Ａ^d／Ｉｇにより同一の実験を行った。（ｃ）ＢＡＬＢ／ｃマウス２５匹に、上述のようにＯｖａ−ＫＬＨ及びＨＥＬ −ＫＬＨ結合体の両方を注射した。これらのマウス５匹にＯｖａ３２３−３３９／ＭＨＣＩ−Ａd／Ｉｇを腹腔内注射し、５匹にはＨＥＬ７４−８６／ＭＨＣＩ−Ａ^d／Ｉｇを腹腔内投与した。他のマウスには、対照としてＰＢＳ又はＭＨＣＩ−Ａ^d／Ｉｇのいずれかを投与した。免疫化の１０日後、尾の放血により各マウスから採血した。以下の方法でマウスをメタフェイン（metafane）で麻酔した：メタフェイン２０〜２５滴でコットン又はガーゼを湿らせて、金属又はガラスの蓋のあるガラス容器に入れた。マウスを、湿らせたコットン又はガーゼの上の格子のてっぺんに載せた。呼吸が緩徐になったら、マウスをチャンバーから取り出し、趾をつねって反射をチェックした。一旦マウスを充分に麻酔したら、血流を増加させるために尾を赤外線灯の下で保持した。イソプロピル又はエチルアルコールで尾を消毒後、鋭利なはさみで先端を切り落とした。血液をエッペンドルフチューブに集めた。放血は、尾を「絞り出す」ことにより増強することができた。採血後、ガーゼパッドで尾の先端に圧力をかけた。血液は、約１４，０００Ｇで３〜５分間遠心分離して、血清を回収した。アッセイは、ＯＶＡ−ＫＬＨ又は全オボアルブミンによりTris−ＨＣ１コーティング緩衝液（pH８．５）を使用して１〜５０μｇ/mlでコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート（Maxisorp F8；Nunc，Inc.）で行った。第２セットのプレートは、ＨＥＬ−ＫＬＨ又は全ＨＥＬ１〜５０μｇ/mlでコーティングした。プレートは感圧性フィルム（Falcon,Becton Dickinson,Oxnard,CA ）で覆い、４℃で一晩インキュベーションした。次にプレートを洗浄液（イミダゾール／ＮａＣｌ／０．４％ Tween-20）で洗浄して、３％ＢＳＡ溶液１００μ ｌ/ウェルを加えることによりブロックした。室温で３０分間プレート回転装置でインキュベーション後、プレートを洗浄液で５回洗浄した。マウス血清を試料／結合体希釈液（ＴＢＳ中の、２％ゼラチン＋０．１％ Tween-20）に１：５００希釈して、次に二重反復試験で、プレートで連続希釈した。２つの同一プレートを各コーティングタンパク質について用意し、一方はＩｇＭ力価の測定用、もう一方はＩｇＧ力価の測定用とした。室温で３０分間プレート回転装置でインキュベーション後、プレートを洗浄液で５回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ及びヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体(Boehringer Mannheim,Indianapolis IN,試料／結合体希釈液に１：１００希釈)を適切なプレートに加えた。室温で３０分間プレート回転装置でインキュベーション後、プレートを洗浄液で５回洗浄し、次にＡＢＴＳ発色基質（Kirkgaard & Perry Laboratories,Inc.,Gaithersbu rg,MD）１００μｌ/ウェルと共にプレート回転装置で室温で１０分間インキュベーションした。反応は、クエンチ緩衝液（Kirkgaard & Perry Laboratories,Inc .,Gaithersburg,MD）１００μｌ/ウェルにより停止して、自動マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダー（Ceres UV900HI，Bioteck，Winooski，Vermont）を用いて吸光度値を４０５nmで読んだ。吸光度の読みを試料の希釈のｌｏｇに対してプロットし、中点（吸光度の５０％）の希釈を決定することにより、力価を求めた。次にＩｇＭの力価対ＩｇＧの力価を比較した。この血清では交差反応性についてもチェックした。実施例７可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子で処理したマウスのＴ_H細胞刺激インビボでペプチド特異的Ｔ細胞系のクローンの拡大に及ぼす可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ分子の作用は、適切には以下のアッセイにより試験することができた。処理群（１群マウス４匹）は、上の実施例６に記載されたものと同一とした。免疫化プロトコールは、以下の通りとした：マウスにＰＢＳ中の可溶性Ｏｖａ３２３−３３９／ＭＨＣＩ−Ａ^d／Ｉｇ１０〜１００μｇを腹腔内注射し、２４時間後、尾の基部にＯｖａ３２３−３３９−ＫＬＨ５０ｐｇを皮下注射した。これら２つの注射を６及び７日後に繰り返した。第２セットの注射の終了の７日後、マウスを屠殺した。鼠蹊及び大動脈傍リンパ節を取り出して単細胞懸濁液にした。ナイロンウール及びセファデックスＧ−１０カラムでのインキュベーションにより、この懸濁液から抗原提示細胞を枯渇させ、生じた精製Ｔ細胞集団を、Ｏｖａ３２３−３３９ペプチド又はＨＥＬ７４−８６ペプチドのいずれかを適用したＡＰＣと共にインキュベーションした。ＢＡＬＢ／ｃマウスからの活性化Ｂ細胞を、増殖アッセイにおいて抗原提示細胞として使用した。Ｂ細胞は、牌臓細胞をＬＰＳ５０μｇ/mlと共に４８〜７２時間培養することにより調製し、次いで活性化細胞はリンホプレップ(Lymphopre p)で密度勾配遠心分離により単離した。次に活性化Ｂ細胞にＯｖａ３２３−３３９ペプチド又はＨＥＬ７４−８６ペプチドで３時間適用し、充分に洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定してＢ細胞の増殖を阻害し、各パネルのマウスからの精製Ｔ細胞に加えた。増殖アッセイは、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中で３７℃、５％ＣＯ₂で３〜５日間行った。ウェルに³Ｈ−チミジン１μCiを１８時間適用し、次に培養を終了して、スカトロン（Skatron）細胞回収機を使用して回収した。Ｔ細胞増殖の尺度としてＤＮＡへの³Ｈ−チミジンの取り込みを、ＬＫＢ液体シンチレーション分光計を用いて測定した。ペプチド反応性Ｔ細胞増殖の程度は、免疫化後のマウスに起こったＴ_H細胞応答（即ち、クローンの拡大）を示すものであった。実施例８ＳＪＬマウスにおけるＥＡＥ誘導の可溶性ペプチド結合ＭＨＣ／Ｉｇ介在性阻害実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、マウスにおける自己免疫疾患であり、多発性硬化症の動物モデルとして役立つ。２つのタンパク質の脳炎誘発性領域、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ９１−１０３）及びプロテオリポタンパク質（ＰＬＰ１３９−１５１）は規定されている。感受性ＳＪＬマウス種において、脳炎誘発性ペプチドによる免疫化又はＭＢＰ反応性Ｔ細胞の養子移入により、ＥＡＥの発症を誘導することができた。ＭＢＰ９１−１０３／ＭＨＣＩ−Ａ^s ／Ｉｇ及びＰＬＰ１３９−１５１／ＭＨＣＩ−Ａ^s／Ｉｇ複合体のような可溶性ＭＨＣ融合複合体での処理が、Ｔ細胞活性化後のＥＡＥ発症を防止するかどうかを決定するために、ＳＪＬマウスに、試験したＭＨＣ融合複合体（例えば、ＭＢＰ９１−１０３及びＰＬＰ１３９−１５１）反応性Ｔ細胞芽球をインビボで注射することができた。ＭＢＰ９１−１０３によりＳＪＬマウスにＥＡＥを誘導するために、マウスを背部から完全フロイントアジュバント中のＭＢＰ９１−１０３４００μｇで免疫化した。１０〜１４日後、局所排出リンパ節細胞を上述のように回収して、ＭＢＰを５０μｇ/mlで加えた、ＲＰＭＩ１６４０培地／１０％ウシ胎児血清／１％ペニシリン／ストレプトマイシン１．５ml中で、ウェル当たり６×１０⁶細胞の濃度で２４ウェルプレートで培養した。インビトロ刺激の４日後、ＭＢＰ９１ −１０３反応性Ｔ細胞芽球を、Ficoll／Hypaque密度勾配により回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄して、各マウスに１．３×１０⁷細胞を注射した。脳炎誘発性ＭＢＰ９１−１０３反応性Ｔ細胞の投与を受けたマウスに、次に可溶性ＭＢＰ９１− １０３／Ｉ−Ａ^s／Ｉｇ１００μｇ、ＭＢＰ１−１４／Ｉ−Ａ^s／Ｉｇ（陰性対照）１００μｇ、又は普通の生理食塩水のいずれかを０、３、及び７日目に静脈内投与した（全用量３００μｇ）。ＭＢＰ９１−１０３／Ｉ−Ａ^s／Ｉｇが、これらのマウスのＥＡＥの発症を阻害したことを確認するために、臨床的及び組織学的評価を行った。ＰＬＰペプチド１３９−１５１によりＳＪＬマウスにＥＡＥを誘導するために、ＰＢＳに溶解し、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）Ｈ３７Ｒａを４mg/m lで含有する完全フロイントアジュバントと１：１比で混合したＰＬＰペプチド１３９−１５１でマウスを免疫化した。マウスにペプチドアジュバント混合物１５０μｇを注射した。同日及び４８時間後に、全てのマウスに百日咳毒素４００ngを投与した。次に上述のようにＥＡＥの養子移入を行った。ＰＬＰ１３９−１５１／Ｉ−Ａ^s／Ｉｇは、ＭＢＰ９１−１０３／Ｉ−Ａ^s／ＩｇよりはＥＡＥの発症を防止するのに使用することができた。実施例９ペプチド結合ＭＨＣ発現ベクターによりワクチン接種したマウスの抗体応答以下のアッセイ（ＰＥＥ−ＩＡ^d／ＯＶＡで例示）により、１つ以上の提示ペプチド結合ＭＨＣ発現ベクターの投与（例えば、ＩＭ）によって、本発明で哺乳動物において免疫応答をどのように誘導することができたかを示し、更にＢ７− １（又はＢ７−２）発現ベクターのような同時刺激因子をコードするＤＮＡの同時投与を利用して、上に考察されたように免疫応答を更に増強することができたことを示した。この系は、抗原の取り込み及びプロセシングの複雑さを迂回する免疫応答誘導のユニークな方法（標的疾患に対するワクチン接種法を提供することを含む）を提供した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群５匹）の両方の後肢に、１００μｇの（ａ）ＣＭＶプロモーターの制御下のＯｖａ３２３−３３９／Ｉ−Ａ^dのコード領域を担うＰＥＥ−ＩＡ^d／ＯＶＡ；（ｂ）ＣＭＶプロモーターの制御下のＢ７−１又はＢ７ −２遺伝子のコード領域を含有するｐＣＭＶ／Ｂ７−１又はｐＣＭＶ／Ｂ７−２；（ｃ）ＰＥＥ−ＩＡ^d／ＯＶＡ、及びｐＣＭＶ／Ｂ７−１又はｐＣＭＶ／Ｂ７ −２のいずれか；（ｄ）ＣＭＶプロモーターの制御下のコード領域ＨＥＬ７４− ８６／Ｉ−Ａ^dを有するＰＥＥ−ＩＡ^d／ＨＥＬ；（ｅ）ＰＥＥ−ＩＡ^d／ＨＥＬ、及びｐＣＭＶ／Ｂ７−１又はｐＣＭＶ／Ｂ７−２のいずれか；あるいは（ｆ）ＣＭＶプロモーターの制御下のＩ−Ａ^dのコード領域を含有するＰＥＥ−ＩＡ^dを筋肉内（ＩＭ）注射した。注射は０、３、及び６週間目に行った。最初の注射後０、２、５、及び８週間目に、実施例６に記載されたように、尾の放血により各マウスから採血した。血液を約１４，０００Ｇで３〜５分間遠心分離して、血清を回収した。アッセイは、Tris−ＨＣｌコーティング緩衝液（pH８．５）を用いてＯＶＡ− ＫＬＨ及びＨＥＬ−ＫＬＨ１〜５０μｇ/mlでコーティングした、９６ウェルマイクロタイタープレート（Maxisorp F8，Nunc，Inc.）中で行った。プレートを感圧性フィルム（Falcon，Becton Dickinson，Oxnard，CA）で覆い、４℃で一晩インキュベーションした。次にプレートを洗浄液（イミダゾール／ＮａＣｌ／０．４％ Tween-20）で洗浄して、３％ＢＳＡ溶液１００μｌ/ウェルを加えることによりブロックした。室温で３０分間プレート回転装置でインキュベーション後、プレートを洗浄液で５回洗浄した。マウス血清を試料／結合体希釈液（ＴＢＳ中の、２％ゼラチン＋０．１％ Tween-20）に１：５００希釈して、次に二重反復試験で、プレートで連続希釈した。マウス血清の試料をＯＶＡ−ＫＬＨ及びＨＥＬ−ＫＬＨでコーティングしたプレートの両方に流して、交差反応性について試験した。室温で３０分間プレート回転装置でインキュベーション後、プレートを洗浄液で５回洗浄し、次にヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，試料／結合体希釈液に１：１００希釈）１００ μｌを適切なプレートに加えた。室温で３０分間プレート回転装置でインキュベーション後、プレートを洗浄液で５回洗浄し、次にＡＢＴＳ発色基質（Kirkgaar d & Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD）１００μｌ/ウェルと共にプレート回転装置で室温で１０分間インキュベーションした。反応は、クエンチ緩衝液（Kirkgaard & Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD）１００μ ｌ/ウェルにより停止して、自動マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダー（Ceres UV900HI，Bioteck，Winooski，Vermont）を用いて吸光度値を４０５nm で読んだ。吸光度の読みを試料の希釈のｌｏｇに対してプロットし、中点（吸光度の５０％）の希釈を決定することにより、力価を求めることができた。実施例１０ペプチド結合ＭＨＣ発現ベクターによる免疫応答の誘導後のペプチド特異的Ｔ細胞の検出ＤＮＡの筋肉内注射により、マウスを免疫化してオボアルブミンに対するＴへルパー細胞の応答を起こすのに成功したかどうかを決定するために、オボアルブミン特異的Ｔ細胞増殖アッセイを利用することができた。マウスは、実施例９に記載されたプロトコールにより免疫化して、Ｔ細胞は、２回目の免疫化の７日後に鼠蹊及び大動脈傍リンパ節から調製した。ナイロンウール及びセファデックスＧ−１０カラムでのインキュベーションにより、この懸濁液から抗原提示細胞を枯渇させ、生じた精製Ｔ細胞集団をＯｖａ３２３−３３９ペプチド又はＨＥＬ７４−８６ペプチドのいずれかを適用したＡＰＣと共にインキュベーションした。ＢＡＬＢ／ｃマウスからの活性化Ｂ細胞を、増殖アッセイにおいて抗原提示細胞として使用した。Ｂ細胞は、ＬＰＳ５０ μｇ/mlと共に４８〜７２時間脾臓細胞を培養することにより調製し、次いで活性化細胞を、リンホプレップ（Lymphoprep）で密度勾配遠心分離により単離した。次に活性化Ｂ細胞にＯｖａ３２３−３３９ペプチド又はＨＥＬ７４−８６ペプチドのいずれかで３時間適用し、充分に洗浄して、パラホルムアルデヒドで固定して、Ｂ細胞の増殖を阻害し、精製Ｔ細胞に加えた。増殖アッセイは、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートで３７℃、５％ＣＯ₂で３〜５日間行った。ウェルに³Ｈ−チミジン１μCiを１８時間適用し、次に培養を終了してスカトロン（Skatron）細胞回収機を使用して回収した。Ｔ細胞増殖の尺度として³Ｈ−チミジンのＤＮＡへの取り込みを、ＬＫＢ液体シンチレーション分光計を使用して測定した。ペプチド反応性Ｔ細胞増殖の程度は、免疫化後のマウスに起こったＴ_H細胞応答（即ち、クローンの拡大）を示すものであった。実施例１１ＴｃＲアンタゴニストのペプチド結合ＭＨＣ発現ベクターを注射したマウスにおける自己免疫疾患の抑制上の実施例３及び９〜１０では、ＭＨＣ融合複合体による免疫応答の刺激のために使用される方法論を示した。上で考察したように、ＭＨＣ分子に結合したＴｃＲアンタゴニストのペプチド（即ち、ＭＨＣペプチドに共有結合した提示ペプチドは、ＴｃＲのアンタゴニスト又は部分アゴニストである）を使用することにより免疫応答を阻害するのに、同様の方法を利用することができる。実施例１に記載されたように、ＰＬＰペプチド１３９−１５１は、ＳＪＬマウスにＥＡＥを誘導することができる。このペプチドの類似体は、Ｉ−Ａ^s制限したＰＬＰ１３９−１５１特異的Ｔ細胞クローンのパネルに対するＴｃＲアンタゴニスト活性について特徴付けされている。２つの異なる類似体のＰＬＰ−Ｗ１４４Ｙ（ＨＳＬＧＫＹＬＧＨＰＤＫＦ）（SEQ ID NO:22）及びＰＬＰ− Ｗ１４４Ｌ（ＨＳＬＧＫＬＬＧＨＰＤＫＦ）（SEQ ID NO:23）は、試験したＴ細胞クローンの多くにおいてインビトロでＴ細胞増殖を阻害するのに、特に有用であることが判った［A．Franco et al.，Eur．J．Immunol.，24:940-946(1994)］。モデル系として、ＰＬＰペプチド類似体結合Ｉ−Ａ^sβ鎖及び完全長Ｉ−Ａ^sα 鎖分子を同時発現することができるベクターを構築することができた。ベクター構築は、適切には上の実施例３に略述された方法と同様とした。未変性ＰＬＰ１３９−１５１結合ＭＨＣ構築物を陽性（抗原性）対照とした。これらのベクターＤＮＡ（Ｂ７又はＢ７−２発現ベクターを伴うか又は伴わない）は、ＥＡＥの誘導前及び誘導中に、適切にはＳＪＬマウスにＩＭ注射（注射方法は実施例９を参照のこと）した。ＥＡＥは、上の実施例８に記載された手順によるＰＬＰ１３９ −１５１反応性Ｔ_H細胞の養子移入により誘導することができた。ＰＬＰアンタゴニスト／Ｉ−Ａ^s発現ベクター注射が、マウスにおけるＥＡＥの発症を阻害したことを確認するために、臨床的及び組織学的評価を行った。実施例１２完全長ペプチド結合Ｉ−Ａ^dＭＨＣ発現ベクターの構築完全長Ｉ−Ａ^dα鎖及びペプチド結合Ｉ−Ａ^dβ鎖分子を同時発現することができるベクターは、図面のFIG.１９に略述されるように、及び上の実施例３に開示されたのと同一又は同様の手順により構築した。Ｉ−Ａ^d遺伝子について、全ＲＮＡをマウスＢ細胞リンパ腫Ａ２０細胞系から単離した。簡単に述べると、１× １０⁸個のＡ２０細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ameri can Type Culture Collection）受け入れ番号ＴＩＢ２０８）を氷冷４Mチオシアン酸グアニジニウム、０．１M Tris−ＨＣｌ（pH７．５）６ml中で組織破砕（Ti ssue Tearer）ホモジェナイザーを用いて５分間ホモジェナイズした。ホモジェナイズ後、サルコシルナトリウム（sodium sarcosyl）を加えて０．５％の最終濃度にして、溶液を完全に混合した。ホモジェネートを５０００ｇで１０分間遠心分離して、上清を、４Mチオシアン酸グアニジニウム、０．１M Tris−ＨＣｌ（pH７．５）、０．５％サルコシルナトリウム緩衝液で１０mlにした。上清を、ＳＷ４１透明超遠心管中の５．７M ＣｓＣｌ、０．０１M ＥＤＴＡ（pH７．５）のクッション３．５mlの上に静かに積層した。試料をＳＷ４１ローターで３２，０００rpmで２０℃で２４時間遠心分離した。遠心分離後、上清を慎重に除去して、ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄した。ＲＮＡを３M 酢酸ナトリウム３５０μｌ及びエタノール９７０μｌに溶解した。この手順により、全ＲＮＡ約３７０μｇを得た。ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水で５μｇ/μｌまで再懸濁して、Ｉ−Ａ^d遺伝子のＲＴ−ＰＣＲクローニングに使用した。完全長Ｉ−Ａ^dα鎖を単離するために、製造業者の推奨手順にしたがってＭ− ＭＬＶ逆転写酵素（GIBCO-BRL）及びα鎖ＴＭ特異的プライミングを（オリゴヌクレオチドＯＰＲ１３９）を使用することにより、Ａ２０全ＲＮＡ（５μｇ）をｃＤＮＡに変換した。このｃＤＮＡを、α鎖リーダー特異的プライマー（ＯＰＲ１３６）及びα鎖ＴＭ特異的プライマー（ＯＰＲ１３９）を用いるＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。これらＯＰＲ１３６及びＯＰＲ１３９プライマーの配列が開示されている図面のFIG.２０を参照のこと。典型的なＰＣＲ増幅反応液（１００μｌ）は、テンプレートＤＮＡ、適切なプライマー１０pmol、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位、１００μＭｄＮＴＰ、５０mM ＫＣｌ、１０mM Tris −ＨＣｌ（pH８．３）、１．５mM ＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチンを内容とした。テンプレートは、最初に９６℃で５分間インキュベーションすることにより変性し、その間Ｔａｑポリメラーゼを加えて反応をホットスタート（hot-start）させた。所望の産物は、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間、次に９６℃で１分間を１０温度サイクル、次いで７０℃で１．５分間、次に９６℃で１分間を２０工程サイクルにより増幅した。生じたＰＣＲ産物（〜８００塩基対）は、クローニングのための5'XmaI部位及び3'EcoRI部位を含有していた。更に、この断片は、効率的な翻訳開始のためのKozakコンセンサス配列を有していた(ＰＣＲ産物の配列が開示されている図面のFIG.１８Ａを参照のこと)。ＰＣＲ産物をXmaI及びE coRIで消化し、ゲル精製して、XmaI／EcoRI消化ｐＵＣ１８中に連結して、ベクターｐＪＲＳ１６３−１０を得た。配列の検証後、XmaI／EcoRI断片を切り出し、精製し、ＰＥＥ１３哺乳動物発現ベクター（Celltech）のＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリ−Ａ部位の間にサブクローン化して、ｐＪＲＳ１６４ベクターを得た。完全長ペプチド結合β鎖断片は、上の実施例１に記載されたように、リーダー及びＴＭ配列をＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（ＳＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ）（SEQ ID NO:24）結合β１−β２ベクター（ｐＢ１６）中に挿入することにより構築した。Ａ２０全ＲＮＡ（５μｇ）は、製造業者の推奨手順にしたがってSuperscript-MLV又はＭ−ＭＬＶ Reverse Transcriptase（GIBCO-BRL）及びオリゴｄＴ特異的又はβ鎖ＴＭ特異的プライミング（ＯＰＲ１３５では、その配列はFIG.２０に示す）を使用することにより、ｃＤＮＡに変換した。これらのｃＤＮＡを、１対のβ鎖リーダー特異的プライマー（ＯＰＲ１３２／ＯＰＲ１３３；これらのプライマーの配列は、図面のFIG.２０に開示する）及び１対のβ鎖ＴＭ特異的プライマー（ＯＰＲ１３４／ＯＰＲ１３５；これらのプライマーの配列は、図面のFIG.２０に開示する）のいずれかを用いるＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。ＰＣＲ増幅条件は、この実施例に上述の条件と同様とした。具体的には、リーダー配列を増幅するための温度サイクル条件は、６０℃で１分間、７０℃で１分間、及び９６℃で１分間の１０温度サイクル、次いで７０℃で１分間、及び９６℃で１分間の３０工程サイクルとし、一方ＴＭドメインを増幅するための条件は、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、及び９６℃で１分間の５温度サイクル、次いで７０℃で１分間及び９６℃で１分間の２５工程サイクルとした。１１０塩基対βリーダーＰＣＲ産物は、ｐＢ１６ＯＶＡペプチド−リンカー−β１−β２ベクター中へのクローニングのための、5'HindIII及びXmaI 部位、並びに3'AflII部位を含有していた。AflII部位を含めることで、Ｉ−Ａ^d β鎖リーダーの最後の２つのアミノ酸をＩｇＧリーダーに見い出されるアミノ酸に変えた（図面のFIG.１８Ｂを参照のこと）。βリーダーＰＣＲ産物をHindIII 及びXmaIで消化し、ゲル精製して、HindIII/AflII消化ｐＢ１６中に連結して、ｐＤＭ２１を得た。１８０塩基対βＴＭＰＣＲ産物は、ｐＤＭ２１ベクターへのクローニングのための、5'BstXI部位、並びに3'XmaIII及びEcoRI部位を含有していた。βＴＭＰＣＲ産物をBstXI及びEcoRIで消化し、ゲル精製して、BstXI／Eco RI消化ｐＤＭ２１中に連結して、ｐＶＷ２２９ベクターを得た。このベクターを XmaI及びEcoRIで消化して、ＰＥＥ６哺乳動物発現ベクター（Celltech）のＣＭV プロモーターとＳＶ４０ポリ−Ａ部位の間にクローニングするための、完全長ペプチド結合β鎖遺伝子断片を生成した。これらの断片はまた、効率的な翻訳開始のためのKozakコンセンサス配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧ）（SEQ ID NO:2）を有していた（図面のFIG.１８Ａを参照のこと）。生じたｐVＷ２３１をBglII及びBamHIで消化した。ＣＭＶプロモーター／ペプチド−β鎖断片をゲル精製し、BamHI消化ｐＪＲＳ１６４中に連結して、完全長Ｉ −Ａ^dα及びＯＶＡ結合β鎖遺伝子を含有する最終のｐＪＲＳ１６５．１発現ベクターを生成した。完全長Ｉ−Ａ^dα鎖遺伝子、及び結合ペプチドがないか又はＨＥＬ７４−８６ペプチド（ＮＬＣＮＩＰＳＣＡＬＬＳＳ）（SEQ ID NO:２５）を伴うβ鎖遺伝子を含有する更に別のプラスミドを、図面のFIG.１９のスキームに示されるように構築して、誘導試験における対照とした。それぞれ、リンカー−β１−β２領域及びＨＥＬペプチド−リンカー−β１−β２領域を含有する、ｐＢＣ１及びｐＢ４（上の実施例１に開示された）のAflII／BstXI断片を切り出し、ゲル精製して、AflII／BstXI消化ｐＶＷ２２９中に連結した。生じたベクターのｐＦＢ１２及びｐＦＢＨ３は、XmaI／EcoRI断片に、それぞれ、ペプチドに結合していないか、又はＨＥＬペプチドに結合した、完全長β鎖遺伝子を含有させた。これらの断片を切り出し、ゲル精製して、XmaI／EcoRI消化ＰＥＥ６のＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリ−Ａ部位の間に連結して、ｐＢ１及びｐＢＨ４を生成した。これらのベクターをBglII及びBamHIで消化して、ＣＭＶプロモーター／β鎖断片をゲル精製して、BamHI消化ｐＪＲＳ１６４中に連結し、結合ペプチドのない完全長Ｉ−Ａ^dα及びβ鎖遺伝子を含有する発現ベクターのｐＡＢ５、並びに完全長Ｉ −Ａ^dα及びＨＥＬ結合β鎖遺伝子を含有する発現ベクターのｐＡＢＨ１を作製した。上述のプラスミドｐＪＲＳ１６５．１、ｐＡＢ５及びｐＡＢＨ１の試料（それぞれ、受け入れ番号９７３０１、９７０３２及び９７０３３）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection，Ro ckville，Meryland）に寄託した。Ｂ７遺伝子を含むプラスミドＭＢ７−ＰＣＲ２テンプレート(E.Podack,Univ.o f Miamiから提供）から、マウスＢ７−１遺伝子を増幅した。これらの反応は、Ｂ７特異的プライマーのＢ７−１−２Ｆ及びＢ７−１−２Ｂ（これらのプライマーの配列は、図面のFIG.２０に開示されている）を用いて、製造業者の推奨手順によりアルティマ（Ultima）ポリメラーゼ（Perkin-Elmer）で行った。温度サイクル条件は、６０℃で３０秒間、７２℃で１．５分間、及び９６℃で１分間の２０温度サイクル、次いで７２℃で１．５分間及び９６℃で１分間の１０工程サイクルとした。生成したＰＣＲ産物は、クローニングのための5'及び3'NotI部位を有していた。この断片はまた、効率的な翻訳開始のためのKozakコンセンサス配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧ）（SEQ ID NO:2）を有していた。この産物をNotIで消化し、ゲル精製して、NotI消化ｐＣＭＶβ哺乳動物発現ベクター（Clonetech ）のＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリ−Ａ部位の間に連結した。生じたベクターをｐＵＢ７１９と命名した。実施例１３細胞表面で機能性融合複合体を発現する細胞系の発生以下に更に詳述されるように、マウスＢ細胞腫瘍（ＮＳＯ；Ｈ−２^dバックグラウンド）は、ｐＪＲＳ１６５．１構築物（上の実施例１２に記載されたマウスＩ−Ａ^d／ＯＶＡ３２３−３３９）でトランスフェクションして、細胞表面の流動細胞アッセイにより融合複合体のＭＨＣ部分を発現することを証明した。更に、これらの細胞で発現する融合複合体が、Ｉ−Ａ^d制限のＯＶＡペプチド３２３ −３３９特異的Ｔ細胞ハイブリドーマのＤＯ１１．１０においてＩＬ−２産生を誘導することにより、適切なＴ細胞受容体（ＴｃＲ）の活性を調節することができることを証明した。これらの結果は、特に、（１）共有結合した融合ペプチドを、ＭＨＣのコンホメーションを保持しながらＭＨＣの結合裂溝に装填することができること、（２）ペプチド／ＭＨＣ融合は、ＭＨＣ分子の機能的完全性を保持すること（即ち、ＴｃＲに結合して、ペプチド特異的Ｔ細胞を活性化することができること）、及び（３）ＭＨＣ分子のペプチド装填及び次に抗原提示に関する通常の生理学的機作は、本発明により迂回することができること、を証明した。Ａ．トランスフェクションしたリンパ球の作製少々変更を加えた、セルテック・グルタミンシンセターゼ遺伝子増幅系マニュアル（Celltech Glutamine Synthetase Gene Amplification System Manual）により、ＮＳＯマウスＢ細胞腫瘍系をトランスフェクションした。この方法では、電気穿孔を用いて、グルタミンシンセターゼのコード領域を含有するベクター（ＰＥＥ−１３）により哺乳動物細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は、グルタミンを合成する能力を有するため、外からの供給なしに生存する。形質転換したクローンの選択は、グルタミンを含まない培地で増殖する細胞を単離することにより達成した。簡単に述べると、１×１０⁷個のＮＳＯ細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄して、冷ＰＢＳ７６０μｌに再懸濁した。４０μｇ（１μｇ/μｌで４０μｌ）のＳａｌＩ消化ｐＪＲＳ１６５．１（上の実施例１２を参照のこと）プラスミドＤＮＡを、電気穿孔キュベット中の細胞に加えた（０．４cm）。細胞／ＤＮＡ混合物を氷上に５分間置いて、次に２５０ボルト、９６０μFdの１つのパルスを送達するためにジーンパルサー（Gene Pulse r）（Biorad）を使用して細胞に電気穿孔した。パルスを適用した細胞を氷上に２〜５分間置いて、キュベットから取り出し、非選択培地（ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ、２mM Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン）３0mlに加えた。細胞を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに５０μｌ/ウェル（４プレート、上記の培地３０mlに細胞懸濁；５プレート、細胞懸濁液を１：４希釈；５プレート、細胞懸濁液を１：２０希釈）で入れて、次に５％ＣＯ₂、３７℃でインキュベーションした。陰性対照として、ＤＮＡを割愛した他は、電気穿孔及び平板培養を同じ手順で行った。翌日、選択培地［ＩＭＤＭ、１０％透析ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ヌクレオシド（６μｇ/ml Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ；２μｇ/ml Ｔ）、６０μｇ/mlグルタミン酸及びアスパラギン］１５０μｌを各ウェルに加えた。使用した培地１００μｌ/ウェルを除去し、新鮮培地１００μｌ/ウェルを加えることにより、週毎にプレートに選択培地を供給して、細胞が培地から残り全てのグルタミンを徐々に奪うことができるようにした。形質転換した細胞のみが生き残り、１４〜２１日でコロニーが明らかとなった。コロニー、又はクローンを拡大増殖して、コンホメーションが正しい表面ＭＨＣクラスII融合複合体の発現に関して、以下に詳述されるようにスクリーニングした。Ｂ．ＭＨＣ／ペプチド融合構築物のコンホメーション上記トランスフェクションで生成したクローンは、親細胞のＮＳＯよりも顕著に高いレベルのクラスII ＭＨＣ融合複合体の発現について分析した。ＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡクローン（１×１０⁵個）又は対照細胞のＮＳＯ又はＡ２０．１− １１［K．Kim et al.，J．Immunol.，122:549(1979)］は、染色緩衝液（ＰＢＳ／１％ＦＢＳ）中のＦＩＴＣ結合抗ＩＡ^d抗体（Pharmingen，１：１００希釈）と共に暗所で４℃で４５分間インキュベーションした。染色緩衝液で３回洗浄後、Beckton Dickinson FACScan流動細胞測定機で蛍光を測定した。アイソタイプが適合した無関係の抗体（ＦＩＴＣ結合抗ＩＡ^k、Pharmingen，１：１００）を陰性対照として使用した。ＩＡ^d蛍光強度は、比蛍光を求めるためにＩＡ^kの発現と比較した（以下の表１に記載される結果を参照のこと）。この表において、データは、蛍光強度の尺度であるピークチャネル緑色蛍光として、したがって細胞表面上に発現したＩＡ^d分子の密度として記録した。陰性対照細胞系（ＮＳＯ）はチャネル６７にピークがあり、そして陽性対照（Ａ２０．１−１１）はチャネル１３２２にピークがあった。チャネル１００より大きいピーク蛍光を示すクローンを、融合タンパク質の機能の更なる分析のために選択した。表１に列挙したクローンをバルクで増殖させ、凍結して今後の使用のために保存した。抗体はＭＨＣ分子のコンホメーションを認識するため、抗体を用いて細胞表面上のＭＨＣ融合複合体を検出するこの能力は、ＭＨＣクラスIIのコンホメーションが、組換え融合複合体において保存されていることの証明となった。表１ＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡクローンにおけるＩＡ^d発現（ピークチャネル蛍光）クローンＩＡ^d ＩＡ^k Ａ２０．１（＋対照） 1322 5 ＮＳＯ（−対照） 67 5 ＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡ．Ｂ２ 528 14 ＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡ．Ｂ５ 209 10 ＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡ．Ｂ４ 271 11 ＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡ．Ａ４ 153 34 Ｃ．ＭＨＣ融合複合体の機能的活性の証明これらの組換えタンパク質分子の生物学的に相当する活性を確認するために、適切なＴ細胞受容体とインビトロで抗原特異的な様式で相互作用し、かつＴ細胞の活性化を引き起こす分子の能力を評価した。チキン卵白オボアルブミン（ＯＶＡ）由来の２１アミノ酸のペプチド断片（ａａ３２３〜３３９）に特異的なＴ細胞受容体をその表面に発現する、マウスＴ細胞ハイブリドーマのＤＯ１１．１０［Shimonkevitz,R.et al．(1983)J.Exp. Med．158:303］を利用した。このペプチドは、マウスクラスII ＭＨＣ分子Ｉ− Ａ^dを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってのみＤＯ１１．１０に提示することができる。適切なＡＰＣによりこのペプチドが提示されると、ＤＯ１１．１０細胞は、ＩＬ−２を産生することにより応答し、このＩＬ−２はＴ細胞活性化の尺度として測定することができる。陽性対照とした細胞系は、Ａ２０．１−１１であったが、この細胞は、その表面上にＩ−Ａ^dを発現する。簡単に述べると、Ａ２０．１−１１細胞（１×１０⁵個／ウェル）を、ペプチド(１μｇ/ウェル) 及びＤＯ１１．１０細胞(２×１０⁵個／ウェル)と共に、３７℃で５％ＣＯ₂の雰囲気で２４時間インキュベーションした。ＮＳＯ細胞（陰性対照として）及びＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡクローン（１×１０⁵個）を、ペプチドの非存在下でＤＯ１１．１０細胞と共にインキュベーションした。培養は、９６ウェル平底マイクロタイタープレート中で完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミン及び５×１０^-5M ２−メルカプトエタノール）で行った。２４時間後、後述のように、ＩＬ−２依存性マウスＴ細胞系ＣＴＬＬ−２を使用して、ＤＯ１１．１０由来ＩＬ−２の存在に関して培養上清を測定した。簡単に述べると、平底マイクロタイタープレート中で完全培地で各培養上清の連続２倍希釈液を調製して、各ウェルに１×１０⁴個のＣＴＬＬ−２細胞を加えた。１６〜２０時間後、陰性対照ウェル（培地単独で培養したＣＴＬＬ−２）及び陽性対照ウェル（ｒＩＬ−２と共に培養したＣＴＬＬ−２細胞）を顕微鏡で検査して、陰性対照細胞の約９０％が死滅し、他方陽性対照細胞がなお活性に増殖している時点で、ＭＴＴ（ＰＢＳ中２mg/ml；２５μｌ/ウェル）を加えて、更に４時間プレートをインキュベーターに戻した。このとき、活性に代謝する細胞で生成したホルマザン（formazan）の青色結晶を、０．４N ＨＣｌイソプロパノール溶液１５０μｌ/ウェルの添加により溶解した。慎重な混合の後、Ceres-UV900 HIプレートリーダーを用いて５６２nmのＯ．Ｄ．を測定した。適切な陰性(ＮＳＯ)対照と共に上で考察した４つのクローンの機能的活性を示すデータは、図面のFIG.２１に示し、またＴ細胞活性化の尺度としてＤＯ１１．１０培養上清の最初の４つの希釈液のＯ．Ｄ．値を表示するグラフで表した。これらの結果により、これらのトランスフェクションした細胞で発現したＭＨＣ／ペプチド複合体は、ＤＯ１１．１０上のＴｃＲをふさぎ、かつＩＬ−２の産生を引き起こすことができるため、生物学的に機能性であることを確立した。これらの結果は、このようなユニークなＭＨＣ／ペプチド構築物を同時刺激シグナルの非存在下で発現する改変細胞が、アレルギー又はある種の自己免疫疾患におけるような、あるペプチドに対する不適切な免疫応答が宿主の病因となる症状において臨床的に重要であることを示した。この方法はまた、改変細胞の更なる操作により、免疫化のための陽性シグナルを送達するためのベクターとして役立つ可能性をも有する。実施例１４ＭＨＣ融合複合体を発現する細胞による免疫誘導又は抑制のアッセイ以下のアッセイを利用して、本発明のＭＨＣ融合複合体細胞系（即ち、ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡを導入された細胞）の、その細胞を投与した宿主において免疫応答を誘導又は抑制する能力を評価することができた。本アッセイの以下の例示では、オボアルブミンペプチド３２３−３３９による免疫化の動物モデル、及び上の実施例１３に記載された改変融合複合体発現細胞を使用するこのペプチドに対する応答の操作を利用した。本実施例の方法論は、哺乳動物における免疫応答を調節（即ち、抑制又は誘導）することができ、そして上に開示されたような可撓性リンカーなどによりＭＨＣ分子に結合することができる提示ペプチドを含有する広範なＭＨＣ融合複合体に適用することができる。本アッセイにおいて利用することができる細胞（ＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡ．Ｂ２、ＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡ．Ｂ４、ＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡ．Ｂ５及びＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡ．Ａ４）は、ＭＨＣ／ＯＶＡ３２３−３３９融合複合体ＤＮＡのｐＪＲＳ１６５．１（上の実施例１２及び１３を参照のこと）によりトランスフェクションした。これらの細胞は、同時刺激分子を低いレベル（即ち、Ｔ細胞増殖に無効な量）でしか発現せず、そのためペプチドに対する免疫の誘導の最初の感作事象を開始することができない（当該分野で知られているように、Ｂ細胞は記憶Ｔ細胞を活性化することができるが、「専門のＡＰＣ」とは異なり免疫の誘導に必要なシグナルを送達することはできない）。組織適合性宿主へのこれらの細胞の注射により、同時刺激分子の非存在下でＴ細胞との相互作用が起こり、そのため抗原特異的応答性低下又はＴ細胞寛容の誘導が起きた。本アッセイは具体的には以下のように行うことができた。ＢＡＬＢ／ｃ（ＩＡ^d ）マウス（１群３〜４匹）に、以下の表２に列挙した細胞又は試薬を、尾から静脈内注射又は尾の基部から皮下注射した。細胞はＰＢＳで洗浄し、１×１０⁸ 個/mlまでＰＢＳに再懸濁して、尾静脈に注射した（０．１ml；１×１０⁷細胞／マウス）。オボアルブミンペプチド（ＰＢＳ中２mg/ml）を、結核菌（Mycobacte rium tuberculosis）Ｈ３７Ｒａを含有する完全フロイントアジュバントと１：１のv/v比で混合した。５０μｌを尾の基部の各側に皮下注射した。最後の注射の７日後、リンパ節（鼠蹊、大動脈傍、頸部、腋窩、上腕）を取り出し、ホモジェナイズして単細胞懸濁液を得た。群内の個々のマウスからのリンパ節は別々に処理した。Ｔ細胞は、リンパ節集団から、Ｇ−１０及びナイロンウールに細胞懸濁液を通して補助細胞を除去することにより精製した。抗原提示細胞は、未変性ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から、脾臓をホモジェナイズして単細胞懸濁液を得て、ゲイ溶液（Gey's solution）を用いて赤血球を分解し、マイトマイシンＣで処理（ＲＰＭＩ１６４０／１％ＦＢＳ中１００μｇｌml、３７℃で１時間）してＡＰＣ増殖を阻害し、そして３回洗浄して残ったマイトマイシンＣを除去することにより調製した。Ｔ細胞応答の誘導のアッセイは、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートで行った。２〜４×１０⁵個のＴ細胞を２〜４×１０⁵個のＡＰＣと混合した。各Ｔ細胞／ＡＰＣの組合せを、三重反復試験でＯＶＡペプチド(１０〜２００ng/ウェルの範囲)を加えるか又は加えずに３〜５日間インキュベーションした。培養終了の約１８時間前に、³Ｈ−チミジン０．４uCiを各ウェルに加えた。ウェルは、スカトロン（Skatron）細胞回収機を使用して回収し、³Ｈ−チミジン取り込み（ＤＮＡ合成、したがってＴ細胞増殖の尺度）をＬＫＢ液体シンチレーション分光計を用いて測定した。ペプチドを含有するウェルがペプチドなしのウェルよりも著しく多くのＤＮＡを取り込むならば、陽性の応答は明白である。典型的には、ペプチドに応答しての増殖（平均cpm）が、ペプチドなしのバックグラウンド増殖よりも約３標準偏差以上大きい場合にマウスを陽性と考えた。各群について、平均ペプチド特異的増殖は、マウス各３匹の値を平均することにより計算した。典型的には、実験群の平均が、陽性の対照群の平均よりも約３標準偏差以上小さいときに、免疫化の抑制が起こったと考えた。以下の表２に関して、群１（注射なし）及び４（ＮＳＯ単独の注射）は、陰性対照としたが、これらは、ペプチドによるインビトロ抗原投与には応答しないはずである。群２には、典型的な免疫化プロトコールであるペプチドの２回注射を行ったが、これらは、インビトロのペプチド提示に対して最適に応答するはずである。群３には、ペプチドの１回注射を行ったが、これらは、インビトロで最適を下回る応答が期待できた。群５には、最初にＮＳＯ細胞を投与し、次に１週間後にペプチドを投与した。ＮＳＯ細胞の注射は、ペプチドによる感作を妨害しないため、この群からの結果は、群３と同様になるはずであり、寛容誘導の陰性対照とした（群７）。群６には、融合複合体を発現する細胞を投与した。未変性Ｔ細胞の刺激に必要な同時刺激分子の発現を欠いているため、この群は、群７の陰性対照とした。この群からの無応答は、「無応答」又は「特異的応答性低下」のいずれかを意味する可能性がある。ＮＳＯ／ＩＡ^d／ＯＶＡ細胞の初回注射及び次にペプチドの注射を投与した群７では、これら２つの結果は区別された。この群からの、ペプチドによるインビトロ抗原投与に対する応答の欠如は、特異的応答性低下、又は寛容の誘導を証明するものであった。表２実施例１５ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡ単独又は同時刺激分子をコードするＤＮＡとの組合せの筋肉内（ｉ．ｍ．）注射後のＴ細胞活性化骨格筋は、免疫学的微環境としての役割を果たし得る。以前の研究で、外来遺伝子は、筋肉細胞で発現することができ［J．Wolff et al.，Science，247:1465 (1990)］、そして免疫応答がこれらの抗原に対して誘導される［J．Ulmer et al .，Science，259:1745(1993)］ことが証明されている。また、培養ヒト筋肉細胞（筋芽細胞）のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−ｙ）による刺激が、これらの細胞上のＭＨＣクラスII複合体の発現をもたらすことが報告されている［N．Goebe ls et al.，J．Immunol.，149:661-667(1992)］。マウス筋肉細胞に、特異的なマウスＯＶＡ３２３−３３９／ＩＡ^dＭＨＣII融合複合体をコードするＤＮＡ(ｐＪＲＳ１６５．１)及び同時刺激シグナルＢ７− １（ｐＵＢ７１９）を注入して、オボアルブミンペプチド３２３−３３９を含有する融合複合体を発現する局所の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を生成した。これらのＡＰＣは、結局Ｔ細胞を活性化する。以下に詳述されるように、ＭＨＣ融合複合体及び同時刺激分子をコードするＤＮＡを、このＤＮＡ（例えば、ｐＪＲＳ１６５．１及びｐＵＢ７１９）にコードされるペプチドに応答して特異的Ｔ細胞の増殖を誘導するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射（ｉ．ｍ．）した。３群のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群マウス３匹）に、プラスミドの１）ＣＭＶプロモーターの制御下にマウスＯＶＡ３２３−３３９／Ｉ−Ａ^dＭＨＣIIのコード領域を含むｐＪＲＳ１６５．１単独、又は２）ＣＭＶプロモーターの制御下にマウスＢ７−１遺伝子のコード領域を含有する、ｐＪＲＳ１６５．１及びｐＵＢ７１９、又は３）ｐＵＢ７１９単独を含有する、無菌ＰＢＳ５０μｌを両方の後肢の四頭筋に筋肉内注射した。マウスは、上の実施例６に開示された方たチャンバー中で前もって麻酔した。各群内で、マウス３匹に、ＰＢＳ１００μＬ中のＤＮＡ１００μｇを０週目に注射し、同じＤＮＡのブースター注射を３週目に行った。最後の注射の１０日後、鼠蹊及び大動脈傍リンパ節を取り出した。リンパ節細胞を単離して以下のようにＯＶＡ特異的Ｔ細胞増殖アッセイに付した。細胞を完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ、２mM Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び５×１０^-5２−メルカプトエタノール）で３回洗浄し、５×１０⁶細胞／mLで再懸濁した。細胞懸濁液１００μＬを９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに加えた。０．８μｇ/mL〜１０μｇ/mLの範囲のＯＶＡ(３２３ −３３９)ペプチドの希釈液を調製し、１００μＬ/ウェルを三重反復試験で細胞に加えた。バックグラウンドの増殖は、ペプチドを割愛することにより測定した。プレートを５％ＣＯ₂で３７℃で３〜５日間インキュベーションした。ウェルに、³Ｈ−チミジン０．４μCiを１８時間適用して、次に培養を終了して、スカトロン（Skatron）細胞回収機を使用して回収した。Ｔ細胞増殖の尺度としてＤＮＡへの³Ｈ−チミジンの取り込みを、ＬＫＢ液体シンチレーション分光計を用いて測定した。ペプチド反応性Ｔ細胞増殖の程度は、免疫化後のマウスに起こったＴ_h細胞応答（即ち、クローンの拡大）を示すものであった。増殖アッセイの結果は、図面のFIG.２２に示した。具体的には、ＤＮＡ１００ μｇの注射では、ｐＪＲＳ１６５．１注射の場合にも、ｐＵＢ７１９を同時に注射した場合にも、著しいＯＶＡ特異的Ｔ細胞増殖は見られなかった。これらの結果は、この場合にＯＶＡ３２３−３３９／ＭＨＣII融合複合体をコードするＤＮＡ単独、又は同時刺激分子ＤＮＡと組合せての筋肉内投与が、ＯＶＡペプチドに対する免疫応答を誘導しないことを示した。ｐＪＲＳ１６５．１ＤＮＡの高用量注射（即ち、１００μｇ）で観察された限定的な増殖応答は、注射による皮内の樹枝状細胞（dendritic cells）（皮内ＡＰＣ）の形質転換の結果であろう（以下の実施例１６を参照のこと）。実施例１６ＭＨＣ融合複合体をコードするＤＮＡの皮内（ｉ．ｄ．）注射後のインビボＴ細胞活性化樹枝状細胞は、専門の皮内抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。これらの細胞（本実施例に例示）又は他の細胞（上の実施例１３に例示したような）の、特異的ＭＨＣクラスII融合複合体による形質転換は、ペプチド特異的なＴ細胞応答を誘導し得る。これらのＡＰＣは、Ｔ細胞に第２の活性化シグナルを提供する同時刺激分子（即ち、Ｂ７−１）を既に有している。２群のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群マウス９匹）に、１０μｇの１）ＣＭＶプロモーターの制御下にマウスＯＶＡ３２３−３３９／Ｉ−Ａ^dＭＨＣクラスII融合遺伝子のコード領域を含むｐＪＲＳ１６５．１、又は２）対照群としてＣＭＶプロモーターの制御下にマウスＨＥＬ７４−８６／Ｉ−Ａ^dＭＨＣII融合複合体のコード領域を含むｐＡＢＨｌ、を含有するＰＢＳ１００μｌを剃毛した背中にｉ．ｄ．注射した。注射の４、７、及び１４日後、鼠蹊及び大動脈傍リンパ節を取り出した。リンパ節細胞を単離して以下のようにＯＶＡ特異的Ｔ細胞増殖アッセイに付した。細胞を完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ、２mM Ｌ −グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び５×１０^-5M ２−メルカプトエタノール）で３回洗浄し、５×１０⁶細胞／mLで再懸濁した。細胞懸濁液１００μＬを９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに加えた。０．０８μｇ/mL〜１０μｇ/mLの範囲のＯＶＡ（３２３−３３９）ペプチドの希釈液を調製し、１００μＬ/ウェルを三重反復試験で細胞に加えた。バックグラウンドの増殖は、ペプチドを割愛して測定した。プレートを５％ＣＯ₂で３７℃で３〜５日間インキュベーションした。ウェルに、³Ｈ−チミジン０．４μCiを１８時間適用し、次に培養を終了して、スカトロン（Skatron）細胞回収機を使用して回収した。Ｔ細胞増殖の尺度としてＤＮＡへの³Ｈ−チミジンの取り込みを、ＬＫＢ液体シンチレーション分光計を用いて測定した。ペプチド反応性Ｔ細胞増殖の程度は、免疫化後のマウスに起こったＴ_H細胞応答（即ち、クローンの拡大）を示すものであった。増殖アッセイの結果は、図面のFIG.２３に示した。ｐＪＲＳ１６５．１注射マウスでもｐＡＢＨ１注射マウスでも注射の４日後に著しい特異的Ｔ細胞増殖は検出されなかった（約２，５００cpm）。注射の７日後、ｐＪＲＳ１６５．１注射マウスからのリンパ節細胞は、０．３１μｇ/mLの刺激ペプチド濃度で４日目に比較して１２倍高い増殖を示した。ペプチド濃度を高くすると、増殖応答は約１５，０００cpmまで低下した。しかしｐＡＢＨ１注射マウスからの細胞は、３つ全ての時点で増殖の著しい増加を示さなかった(約７，０００cpm)。注射の１４日後の特異的（ＯＶＡ）増殖応答は、７日目よりも３倍低く、このことは、最大刺激時間が経過してしまったことを示している。これらの結果は、皮内ＡＰＣが、機能性ＯＶＡ３２３−３３９／ＭＨＣII融合複合体により形質転換したこと、及びＯＶＡ特異的Ｔ細胞が、感作されて拡大増殖したことを示した。刺激物質（ＨＥＬペプチド）が存在しないため、ＨＥＬ特異的Ｔ細胞（ｐＡＢＨ１で形質転換したＡＰＣにより活性化した）は本試験では増殖しなかった。どのＴ細胞活性化の前にも４日の遅延期間を観察した。実施例１７特異的提示ペプチドを伴う可溶性及び膜結合性一本鎖ＭＨＣクラス II分子を発現するためのベクターの構築これらの構築物に使用されるＭＨＣクラスII遺伝子は、上の実施例（特に上の実施例１を参照のこと）に記載されたように、適切なＡＰＣから生成したｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により当初は単離した。Ｉ−Ａ^dα及びβ鎖遺伝子の断片は、テンプレートＤＮＡとしてクローン化した遺伝子を用いてＰＣＲ増幅により生成し、図面のFIG.２５に示されるクローニングスキームで組み立てることにより、一本鎖Ｉ−Ａ^d分子に結合した、抗原性ペプチドＯＶＡ３２３−３３９をコードするキメラ遺伝子を得た。簡単に述べると、３９ＡＤ２中にクローン化したα１−α２遺伝子断片は、プライマーＪＬＡ００７及びＪＬＡＯ１０（クローニングに使用される全てのオリゴヌクレオチドは、図面のFIG.２６に列挙した）を使用するＰＣＲ増幅にテンプレートとして用いることにより、5'XhoI及び3'Xm aI制限部位を付加した。α１−α２ＰＣＲ産物をXhoI及びXmaIで消化し、ゲル精製してｐＬＬ１０１ベクター中にサブクローン化して、ｐＪＡα９構築物を得た。このベクターには、タンパク質精製を助けるために、α１−α２タンパク質の末端に６×Hisタグをコードする配列を付加した。Ｉ−Ａ^dβ１−β２遺伝子断片を単離し、リンカー配列を付加するための方策は、上の実施例に記載した。ｐＢＣ１中の１０ａａのリンカー−β１−β２遺伝子断片は、ＪＬＡ００５及びＪＬＡ００９プライマーを用いるＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いて、続くクローニングに必要なNcoI及びSpeI制限部位を付加した。ＰＣＲ産物をNcoI／SpeI消化ｐＪＡα９に連結し、ｐＪＡα９β２０構築物を得た。一本鎖クラスII分子を作製するために、ＨＬＡ−ＤＲ１結晶構造のコンピューターモデル化により、可撓性リンカーを、β２ドメインのカルボキシル末端とα１ドメインのアミノ末端との間に挿入できることを決定した。これらの残基間の距離が４７Åであることに基づき、主として４回反復した(ＧＧＧＧＳ) モチーフよりなる２４アミノ酸リンカーをモデル化して使用した。この可撓性ペプチドをコードする配列を、クローン化したβ鎖とα鎖遺伝子断片の間に挿入するために、オリゴヌクレオチドＪＡ３０１及びＪＡ３０２をアニーリングして、 SpeI／XhoI消化ｐＪＡα９β２０中に連結した。生じた構築物をｐＪＡＬＮＫと命名した。ｐＪＡＬＮＫをNheI及びEcoRIで消化して、β１β２−α１α２一本鎖遺伝子断片をゲル精製した。この断片を、上の実施例に記載されたように、β 鎖リーダー配列及びＯＶＡ３２３−３３９ペプチドをコードする領域を有するｐＶＷ２２９ベクター中に挿入した。生じた構築物ＳＳＣｌは、βリーダー／ＯＶＡペプチド／１０ａａリンカー／β１−β２／２０ａａリンカー／α１−α２／６×Hisタグをコードするキメラ遺伝子を含有していた。この遺伝子の配列は、図面のFIG.２７に示した。昆虫細胞発現系での可溶性一本鎖（ｓｃ）クラスII分子の発現用のベクターを構築するために、NcoI及びEcoRIでの消化によりこのキメラ遺伝子をＳＳＣ１から取り出して、ゲル精製した。この断片をNcoI／EcoRI消化ｐ２Ｂａｃベクター（In Vitrogen，パート番号Ｖ１９８０−１０）中に連結して、ｐＭＢＳＣ１．２を作製した。哺乳動物細胞で膜結合ｓｃクラスII分子を発現することができるベクターを作製するために、α鎖の膜貫通（ＴＭ）ドメインをコードするｐＪＲＳ１６３−１０のBcII−EcoRI断片をBclI−EcoRI消化ＳＳＣ１ベクター中にサブクローン化した。生じたベクターのＳＣＴＭ１をXmaI及びEcoRIで消化し、一本鎖Ｉ−Ａ^d−ＯＶＡカセットをＰＥＥ１３哺乳動物発現ベクター中に挿入して、ＳＣＴ１構築物を得た。このキメラ遺伝子の配列は、図面のFIG.２８に示した。哺乳動物細胞で可溶性ｓｃ−ＭＨＣ分子を発現することができるベクターを作製するために、α鎖のテンプレートＤＮＡを、プライマーＪＳ３０５及びＯＰＲ１４２を使用してｐＪＲＳ１６３−１０からＰＣＲにより増幅し、それによってこの遺伝子断片の３’末端にＥＥ抗体タグをコードする配列を付加した。ＰＣＲ産物をBclI及びEcoRIで消化し、消化ＳＳＣＩベクター中にクローン化した。生じたベクターＳＣＥＥ１をBclI-EcoRIで消化し、一本鎖Ｉ−Ａ^d−ＯＶＡカセットをＰＥＥ１３哺乳動物発現ベクター中に挿入して、ＳＣＥ１構築物を得た。このキメラ遺伝子の配列は、図面のFIG.２９に示した。上の一本鎖プラスミドｐＭＢＳＣ１．２、ＳＣＴ１及びＳＣＥ１の試料はアメリカン・タイプ・カルチャー．コレクション（American Type Culture Collection，Rockville，Mary land）に寄託した。実施例１８可溶性一本鎖ＭＨＣ分子の産生（昆虫細胞中のＭＨＣ II（Ｉ−Ａ^d ））精製ｐＭＢＳＣ１．２プラスミドを同時トランスフェクションに使用して、組換えウイルスを野生型ＡｃＭＮＰＶから限界希釈法により濃縮した（D.R.O'Reil ly et al.，Baculovirus Expression Vectors:ALaboratory Manual.，WHFreeman & Co.，New York(1992)を参照のこと）。終始ＳＦ９細胞を使用した。ウェルからの上清は、組換え産物（ｓｃＩ−Ａ^d−ＯＶＡ）を産生するウイルスを同定するために、ＥＬＩＳＡにより試験した。ＥＬＩＳＡアッセイでは、０．１Ｍ炭酸緩衝液（pH８．２）５０μｌ中で９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルにＭ５／１１４（ＡＴＣＣＴＩＢ１２０）抗ＩＡ^d １００ngをコーティングする。ブロッキングは、ＰＢＳ１０％ＦＢＳ（Biowhittaker，パート番号１４−９０１Ｆからのウシ胎児血清）２００μｌにより少なくとも１時間行い、プレートを洗浄緩衝液（Tween 20 ０．５ml/lを含むＰＢＳ）２００μｌで３回洗浄した。試料を１００μｌ/ウェルで加えて、３７℃で１５分間インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液２００μｌで４回洗浄した。ビオチン化ＡＭＳ−３２．１抗ＩＡ^d（Pharmingen）からのパート番号０６０３２Ｄ）をＰＢＳ１０％ＦＢＳ１００μｌ中に１００ng/ウェルで加えた。３７℃で１５分間のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。アビジンペノレオキシダーゼ（Sigma）をＰＢＳ１０％ＦＢＳ１００μｌ/ウェル中に２５０ng/ウェルで加え、３７℃で１５分間インキュベーションした。次にプレートを洗浄緩衝液２００μｌで８回洗浄し、ＡＢＴＳ基質（Kirkegaard and Perry，パート番号５０６０−００又は５０−６０−０１）１００μｌをウェル毎に加えた。吸光度を４０５nmで測定した。同時トランスフェクション混合上清は、上のＥＬＩＳＡによりＩ−Ａ^d反応性に関して試験した。二重反復試験ウェルの平均吸光度は、以下の表３に示した。観察されたシグナルの特異性は、ＳＦ９細胞による培養上清へのｓｃＩ−Ａ^d −ＯＶＡの分泌によることが判った。限界希釈サブクローニングは、同時トランスフェクション混合物で、完全培地（１０％ＦＢＳを補足した、JRH BiosciencesからのＴＮＭＦＨパート番号５１９４２）にウイルスを希釈し、ウイルス希釈液を２×１０⁴個のＳＦ９細胞／ウェルと共に９６ウェルプレート中でインキュベーションすることにより行った。感染の可視的徴候を示すが多角体は示さないウェルからの上清をＩＡ^dＥＬＩＳＡで試験した。クローンＣ６（１．５５７）、及びＦ８（１．４４６）は非常に強く陽性であった。Ｃ１２は、明らかに陰性であった（０．１２４）。陽性クローンＣ６５００μｌを、ＳＦ９細胞を１×１０⁶細胞／mlで含有する３つの１Ｌフラスコ各々に加えた。感染上清約２２００mlを、以下の実施例１９に記載するようにｓｃＩ−Ａ^d−ＯＶＡの精製に使用した。こうして精製した一本鎖ＭＨＣ II 複合体を、以下の実施例２０に記載するように、Ｄ０１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマの活性を調節する能力に関して測定した。表３同時トランスフェクションからの昆虫細胞培養上清のＩ−Ａ^dＥＬＩＳＡ試料希釈吸光度未希釈 0.857 １：２ 0.524 １：４ 0.305 １：８ 0.165 試料希釈液を含む陰性対照（０．０６４）、及びＳＦ９細胞内のニューロン特異エノラーゼ（Neuron Specific Enolase）（ＮＳＥ）の遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスにより行った感染からの上清は、無視できるほどの結合しか示さなかった（０．０９８）。実施例１９一本鎖ＭＨＣ分子（昆虫細胞で発現したＭＨＣ II（Ｉ−Ａｄ））の精製昆虫細胞培養上清からの可溶性一本鎖Ｉ−Ａ^d−ＯＶＡの調製において以下の工程を行った。硫酸アンモニウム分画：０〜４℃で、試料を撹拌しながら、昆虫細胞培地（２２００ml）中に固体硫酸アンモニウム（０．４３６g/ml）をゆっくり加えた。硫酸アンモニウムの添加後、試料の撹拌を３０分間続けた。次に混合物を２６０００ｇ及び４℃で３０分間遠心分離し、上清を廃棄し、そしてペレットをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）１００mlに再懸濁した。再懸濁試料をＰＢＳ４０００mlに対して４℃で約２０時間（最初の４．５〜５時間の透析後に新しいＰＢＳに一度交換した）透析した。透析した試料の容量を測定して、固体ＮａＣｌ及び２０％(v/v)Tween 20を０．５ＮａＯＨに加えて、次に０．８ミクロンフィルターにより濾過した。金属キレート親和性及び免疫親和性クロマトグラフィー：全ての下記工程は室温で行った。Ｎｉ−ＩＤＡセファロース：上の分画工程により得られた試料を、ＰＢＳ、０．５ＭＮａＣｌ、０．２％(v/v)Tween 20（pH８．０）少なくとも５床容量で平衡化したＮｉ−ＩＤＡセファロースファストフローカラム（Ni-IDA Sepharose Fast Flow column）（２．６×７．２cm、３８．０ml）に充填した。充填試料の流速は、３ml/分とした。次にカラムを、上の平衡化緩衝液少なくとも７〜８床容量で洗浄し、続いて２０mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄（pH７．０）、０．２M ＮａＣｌ２．５〜３床容量で洗浄した。洗浄のための流速は、５ml/分とした。Ｉ−Ａ^d タンパク質は、ＦＰＬＣコントローラーでプログラムされた、緩衝液Ａ（２０mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄（pH７．０）、０．２M ＮａＣｌ）と緩衝液Ｂ（２０mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄（pH３．０）、０．２M ＮａＣｌ）との異なる割合の混合により段階的にp Hを低下させながら溶出した。抗Ｉ−Ａ^dモノクローナル抗体（Ｉ−Ａｄ分子のエピトープのコンホメーションを認識する）を使用するＥＬＩＳＡアッセイにより、Ｉ−Ａｄは、９０％及び１００％緩衝液Ｂにより溶出した画分に存在することが判った。これら９０％及び１００％緩衝液Ｂにより溶出したＡ_280nmピークをプールし、直ぐに1M TrisでpH７．０に調整した。試料を濃縮して、限外濾過により２０mM Tris−ＨＣｌ（pH８．０）に緩衝液交換した。免疫親和性クロマトグラフィー：上の工程からの試料を最初にプロテインＡセファロースファストフローカラム（Protein A Sepharose Fast Flow column）（１．６×５cm、１０ml）に通し、次にＭＫＤ６（抗Ｉ−Ａ^dモノクローナル抗体）と架橋したプロテインＡセファロースファストフローのカラム(１．６×３．４cm、６．８ml)にかけた。２つのカラムは、前もって２０mM Tris−ＨＣｌ(pH ８．０)で平衡化しておいた。試料の適用後、免疫親和性カラムを２０mM Tris− ＨＣｌ（pH８．０）でＡ_280nm基線に到達するまで洗浄した。次に抗体カラムを、1M ＮａＣｌを含有する上と同じ緩衝液で洗浄して、非特異結合タンパク質を除去した。次にＩ−Ａ^dタンパク質を５０mMグリシン−ＮａＯＨ（pH１１．０）で溶出した。抗体カラムからの溶出タンパク質ピーク（Ａ_280nmでモニターした）は、直ぐに２Mグリシン（pH２．０）でpH８．０に調整し、濃縮して、限外濾過により２０mM Tris−ＨＣｌ（pH８．０）に緩衝液交換した。精製試料を４〜８℃で保存した。Ｉ−Ａ^d試料の純度及び機能性を、それぞれ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＴ細胞活性化アッセイ(下記を参照のこと)により試験した。この調製物からの精製一本鎖Ｉ−Ａ^d −ＯＶＡは、クーマシー染色したポリアクリルアミドゲルでは混入物のバンドは見られず、全タンパク質は、全タンパク質アッセイにより１２５μｇ/mlであった。実施例２０一本鎖ＭＨＣ複合体の活性ＩＬ−２及びＩＬ−４産生により測定されるように、精製一本鎖Ｉ−Ａ^d／ＯＶＡＭHＣ複合体が、ＯＶＡ特異的ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマを活性化できるかどうかを決定した。この方法では、ＰＢＳ中で一本鎖Ｉ−ａ^d／ＯＶＡをIMMULON IIプレート（Dynatech）に一晩４℃でコーティングする。ウェルを空にし、ＰＢＳで1回洗浄して、１×１０⁵個のＤＯ１１．１０細胞を１ウェル当たりＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ２００μｌ中に加えた。１０％ＣＯ₂を含む加湿インキュベーターで３７℃で一晩インキュベーション後、培養上清を回収し、細胞を遠心分離により取り出し、ＩＬ−２及びＩＬ−４レベルを以下のようにＥＬＩＳＡにより測定した。ラット抗マウスＩＬ−２ＥＬＩＳＡ捕捉抗体（Pharmingen，パート番号１８１６１Ｄ）を、０．1M炭酸（pH８．２）５０μｌ中１００ng/ウェルでコーティングした。ブロッキングは、ＰＢＳ１０％ＦＢＳ２００μｌで少なくとも１時間行い、プレートを洗浄緩衝液（Tween 20 ０．５ml/lを含むＰＢＳ）２００μ ｌで３回洗浄した。試料を１００μｌ/ウェルで加えて、室温で４時間又は４℃ で一晩インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液２００μｌで４回洗浄し、ビオチン化ラット抗マウスＩＬ−２（Pharmingen）を、ＰＢＳ１０％ＦＢＳ１００μｌ中１００ng/ウェルで加えた。室温で４５分間インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。アビジンペルオキシダーゼ（Sigma ，パート番号Ａ−３１５１）をＰＢＳ１０％ＦＢＳ１００μｌ/ウェル中２５０ng/ウェルで加え、室温で３０分間インキュベーションした。次にプレートを洗浄緩衝液２００μｌで８回洗浄して、ＡＢＴＳ基質(Kirkegaard and Perry，パート番号５０６０−００又は５０−６６−０１）１００μｌをウェル毎に加えた。吸光度を４０５nmで測定した。ＩＬ−４ＥＬＩＳＡプロトコールは、ＩＬ−４特異的捕捉及びプローブ抗体（Pharmingen）を使用することを除いて、同一とした。１つの活性化アッセイの結果を以下の表４に示した。ＤＯ１１．１０細胞単独でもＤＯ１１．１０＋Ａ２０（Ｉ−Ａ^d陽性）細胞でも、ＩＬ−２やＩＬ−４を分泌しなかった。ｓｃＩ−Ａ^d−ＯＶＡでは、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマによりＩＬ−２及びＩＬ−４の分泌が起こった。低用量の固定化ｓｃＩ−Ａ^d−ＯＶＡにより第２の活性化を行った。以下の表５に示されるように、滴定されるＩＬ−２及びＩＬ−４の分泌レベルは両方ともゼロまで落ちた。両方の実験において、ＩＬ−２及びＩＬ−４は、固定化ｓｃＩ−Ａ^d−ＯＶＡへの曝露に対して用量依存的にＤＯ１１．１０細胞により分泌された。表４固定化精製ｓｃＩ−Ａ^d−ＯＶＡを用いるＤＯ１１．１０活性化アッセイｓｃＩＡ^d−ＯＶＡＤＯ１１上清中のＤＯ１１上清中の（ng/ウェル）ＩＬ−２濃度（U/ml）ＩＬ−４濃度（U/ml） 2500 143 23 1250 126 20 625 116 15 312 109 16 156 100 10 78 45 7 0（ＤＯ１１．１０のみ） 0 0 表５固定化精製ｓｃＩ−Ａ^d−ＯＶＡ高希釈液を用いるＤＯ１１．１０活性化アッセイｓｃＩＡ^d−ＯＶＡＤＯ１１上清中のＤＯ１１上清中の（ng/ウェル）ＩＬ−２濃度（U/ml）ＩＬ−４濃度（U/ml） 625 38 2.0 312 35 1.5 156 24 0.9 78 17 0.8 39 0 0 0（ＤＯ１１．１０のみ） 0 0 実施例２１哺乳動物細胞における一本鎖ＭＨＣ分子（クラスII）の産生哺乳動物細胞系のトランスフェクション及び選択は、以下のように行った：ＮＳＯ細胞１×１０⁷個を氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、冷ＰＢＳ７６０μｌに再懸濁して、ＳａｌＩ線状化プラスミドＳＣＥ１又はＳＣＴ１ＤＮＡ４０μｇ（１μｇ/μｌ）と混合した。氷上で５分間のインキュベーション後、２５０ボルト、９６０μFdの１つのパルスを送達するためにGene Pusler（Biorad）を使用して細胞に電気穿孔した。パルスを適用した細胞を氷上に２〜５分間置いて、非選択培地（ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ、２mM グルタミン、５０００単位/mlペニシリン、５０００μｇ/mlストレプトマイシン）３０mlに加えた。細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに入れて、２４時間後、選択培地（ＩＭＤＭ、１０％透析ＦＢＳ、５０００単位/mlペニシリン、５０００μｇ/mlストレプトマイシン、１×ヌクレオシド、１×グルタミン酸＋アスパラギン）１５Ｏμｌを各ウェルに加えた。使用した培地１００μｌ/ウェルを除去し、新鮮な選択培地１００μ ｌ/ウェルを加えることにより、週毎にプレートに選択培地を供給し、細胞が培地から残り全てのグルタミンを徐々に奪うことができるようにした。ＳＣＥ１及びＳＣＴ１プラスミドに含まれるグルタミンシンセターゼ遺伝子により、グルタミンを含まない培地中でのトランスフェクション細胞の選択的増殖が可能になった。１４〜２１日後、プラスミドでトランスフェクションした細胞のコロニーが明らかになった。ＳＣＴ１ベクター（即ち、ｓｃＩ−Ａ^d−ＯＶＡ分子の膜結合型）を有するトランスフェクション体を拡大増殖させ、以下に記載されるように流動細胞アッセイによりＭＨＣ分子の発現についてスクリーニングした。トランスフェクション／選択プロトコールから生成したクローンを、親細胞系よりも顕著に高いレベルのクラスII ＭＨＣ分子の表面発現に関して分析した。細胞を、ＦＩＴＣ結合抗Ｉ−Ａ^d抗体ＡＭＳ３２．１（PharMingen，１：１００希釈）と共に冷染色緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ）中で、暗所で４５分間インキュベーションした。染色緩衝液で３回洗浄後、FACScan流動細胞測定機（Beckton Dickinson）で蛍光を測定した。アイソタイプが適合したＦＩＴＣ結合抗Ｉ−Ａ^k 抗体１０−３．６（PharMingen，１：１００希釈）を陰性対照として使用した。３つ別個のＳＣＴ１でトランスフェクションした細胞系について以下の表６に示される、このようなアッセイの結果は、トランスフェクションした細胞が、その細胞表面上でｓｃＩ−Ａ^d−ＯＶＡを発現することを示した。ＳＣＥＩベクター（即ち、ｓｃＩ−Ａ^dＯＶＡ分子の可溶性型）を有するトランスフェクション体を拡大増殖させ、上の実施例１８に記載されたＩ−Ａｄ特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＭＨＣ分子の発現及び分泌に関してスクリーニングした。ＳＣＥ１でトランスフェクションした２つの細胞系からの培養上清のこのようなアッセイの結果を、以下の表７に示した。これらの結果は、トランスフェクションした細胞が、ｓｃＩ−Ａ^d−ＯＶＡ分子を産生して分泌することを示した。この系を使用して、大量の可溶性ペプチド結合一本鎖ＭＨＣ分子を作製することができた。表６トランスフェクションした細胞系のＩ−Ａ^d分子の表面発現平均蛍光細胞系Ｉ−Ａ^d特異的Ｉ−Ａ^d特異的ＮＳＯ（親） 280.4 32.1 Ｔ２（ＳＣＴ１トランスフェクション体） 612.8 22.0 Ｔ６（ＳＣＴ１トランスフェクション体） 417.9 45.1 Ｔ１２（ＳＣＴ１トランスフェクション体） 911.1 45.9 表７ＳＣＥ１トランスフェクション体の細胞培養上清のＩ−Ａ^dＥＬＩＳＡアッセイ培養上清（未希釈）吸光度ＮＳＯ（親細胞系） 0.444 Ｅ１０（ＳＣＥ１トランスフェクション体） 0.781 Ｅ１１（ＳＣＥ１トランスフェクション体） 0.960 昆虫細胞培養物からのｓｃＩ−Ａ^d−ＯＶＡ（陽性対照） 2.44実施例２２哺乳動物細胞上で発現した一本鎖Ｉ−Ａ^d分子の活性ＯＶＡ３２３−３３９特異的Ｉ−Ａ^d制限ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマからのＩＬ−２放出の促進を、上の実施例２０に記載したように行った。簡単に述べると、１×１０⁵個のＳＣＴ１トランスフェクション体の細胞又はＡ２０．１１を（種々の量の）ＯＶＡペプチド及びＤＯ１１．１０細胞２×１０⁵個／ウェルと共に３７℃で５％ＣＯ₂の雰囲気でインキュベーションした。培養は、９６ウェル平底マイクロタイタープレート中で完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン及び５０μＭ２−メルカプトエタノールを補足したＲＰＭＩ１６４０）で行った。２４時間後、培養上清を、上の実施例２０に記載したＩＬ−２ＥＬＩＳＡアッセイを用いるか、又はＩＬ−２依存性マウスＴ細胞系ＣＴＬＬ−２の増殖を測定することにより、ＤＯ１１．１０由来ＩＬ−２の存在について測定した。後者の試験では、各培養上清の連続２倍希釈液は、平底マイクロタイタープレート中で完全培地で調製して、各ウェルにＣＴＬＬ−２細胞１×１０⁴個を加えた。ｒＩＬ−２（量）の標準曲線作成を平行して行った。１６〜２０時間後、ＭＴＴ（２mg/ml、ン２７μｌ/ ウェル）を加えて、プレートを４時間インキュベーションした。このとき、活性に代謝している細胞においてＭＴＴにより生成した青色結晶は、０．４N ＨＣｌイソプロパノール溶液１５０μｌの添加により溶解した。混合後、５６２でのＯ．Ｄ．を、Ceres-UV900HIプレートリーダーを使用して測定した。吸光度は、培地中のＩＬ−２により支持されるＣＴＬＬ細胞の増殖のレベルに対応する。２つのこのような活性化アッセイの結果を、以下の表８及び９に示した。ＣＴＬＬアッセイを使用して同様な結果を得た。表８ＳＣＴ１でトランスフェクションした細胞系によるＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマの活性化アッセイした抗原提示細胞ＩＬ−２ＥＬＩＳＡ結果（吸光度）ＮＳＯ（親細胞系） 0.047 Ｔ２（ＳＣＴ１トランスフェクション体） 0.758 Ｔ６（ＳＣＴ１トランスフェクション体） 0.307 Ａ２０＋ＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（陽性対照） 1.33 表９ＳＣＴ１でトランスフェクションしたＴ１２細胞によるＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマの活性化アッセイした抗原提示細胞ＩＬ−２ＥＬＩＳＡ結果（吸光度）ＮＳＯ（親細胞系） 0.078 Ｔ１２（ＳＣＴ１トランスフェクション体） 1.03 Ａ２０＋ＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（陽性対照） 1.45実施例２３可溶性ペプチド結合一本鎖ＭＨＣクラスII分子を使用する免疫抑制方法可溶性ペプチド結合一本鎖クラスII分子が、動物モデル系においてＴ_H細胞アネルギーを誘導できるかどうかを試験するために、Ｔ_H細胞依存性のイムノグロブリンのクラススイッチング（即ち、ＩｇＭからＩｇＧへ）、及びペプチド特異的Ｔ細胞系のクローンの拡大に及ぼすこの分子の作用を試験することができる。Ｉｇクラススイッチングを試験するために、以下のように２つの試験群を設定した：（ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹に、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに対する免疫応答を誘導するため、完全フロイントアジュバントＨ３７Ｒａ中のＯＶＡ３２３−３３９１００μｇを尾の基部に注射して、７日後再度ブースター注射した。ＯＶＡによる各免疫化の前日に、マウス５匹にＰＢＳ中の可溶性一本鎖Ｉ−Ａ^dＯＶＡ１０〜１００μｇをＩＶ注射した。この可溶性融合タンパク質は、ＯＶＡ３２３−３３９特異的ＴＨＥ細胞上に表示されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合した。同時刺激シグナルが存在しないため、これらのＴ_H細胞は、アネルギーの状態に誘導された。イムノグロブリンのクラススイッチングはＴ_H細胞依存性過程であるため、抗ＯＶＡ３２３−３３９ＩｇＧ抗体の誘導は、一本鎖Ｉ−Ａ^d−ＯＶＡ処理マウスでは低下していることが予想された。残りのマウス５匹は対照としてＰＢＳを投与した。２回目の免疫化の１０日後、尾の放血により各マウスから採血した。血液を約１４，０００Ｇで３〜５分間遠心分離して、血清を回収した。アッセイは、Tris −ＨＣｌコーティング緩衝液（pH８．５）を使用してオボアルブミンで１〜５０μｇ/mlにコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート（Maxisor pF8，Nunc，Inc.）中で行った。プレートを感圧性フィルム（Falcon，Becton Di ckinson，Oxnard，CA）で覆い、４℃で一晩インキュベーションした。次にプレートを洗浄液（Wash solution）（イミダゾール／ＮａＣｌ／０．４％Tween-20 ）で洗浄して、３％ＢＳＡ溶液１００μｌ/ウェルを加えることによりブロックした。室温で３０分間プレート回転装置でインキュベーション後、プレートを洗浄液で５回洗浄した。マウス血清を試料／結合体希釈液(ＴＢＳ中の、２％ゼラチン＋０．１％ Tween-20)に１：５００希釈して、次に二重反復試験で、プレートで連続希釈した。２つの同一プレートを各コーティングタンパク質用に設定し、一方はＩｇＭ力価の測定用、そしてもう一方はＩｇＧ用とした。室温で３０分間インキュベーション後、プレートを洗浄液で５回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ及びヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体(Boehringer Mannheim，Indi anapolis，IN，試料／結合体希釈液に１：１００希釈)を適切なプレートに加えた。室温で３０分間インキュベーション後、プレートを洗浄液で５回洗浄し、次にＡＢＴＳ発色基質（Kirkgaard & Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg， MD）１００μｌ/ウェルと共に室温で１０分間インキュベーションした。反応は、クエンチ緩衝液（Quench buffer）（Kirkgaard & Perry Laboratories，Tnc. ，Gaithersburg，MD）１００μｌ/ウェルにより停止して、自動マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダー（Ceres UV900HI，Bioteck，Winooski，Vermont ）を用いて吸光度値を４０５nmで読んだ。吸光度の読みを試料の希釈のｌｏｇに対してプロットすることにより、力価を求めた。次にＩｇＭの力価を比較した。上に詳述したように、可溶性ペプチド結合一本鎖ＭＨＣクラスII分子は、対応するペプチド反応性Ｔ_H細胞において誘導されるアネルギーのため、ペプチド特異的にＩｇＧクラススイッチングを阻害することが予想された。インビボでペプチド特異的Ｔ細胞系のクローンの拡大に及ぼす可溶性ペプチド結合一本鎖ＭＨＣ分子の作用は、以下のように試験することができた。処理群（１群マウス４匹）は、適切には上述のものと同一とした。免疫化プロトコールは、適切には以下の通りとした：ＰＢＳ中の可溶性一本鎖Ｉ−Ａ^d−ＯＶＡ融合タンパク質１０〜１００μｇをマウスにＩＶ注射し、２４時間後、尾の基部に完全フロイントアジュバントＨ３７Ｒａ中のＯＶＡ３２３−３３９５０μｇを皮下注射した。これら２回の注射は、６及び７日後に繰り返した。第２セットの注射の終了の７日後、マウスを屠殺した。鼠蹊及び大動脈傍リンパ節を取り出して、単細胞懸濁液にした。ナイロンウール及びセファデックスＧ−１０カラムでのインキュベーションにより、この懸濁液から抗原提示細胞を枯渇させ、生じた精製Ｔ細胞集団をＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを適用したＡＰＣと共にインキュベーションした。脾臓Ｂ細胞を抗原提示細胞とした。これらの細胞をマイトマイシンＣ（脾臓細胞４× １０⁶個／mlの懸濁液中５０〜１００μｇ/ml）で固定して、Ｂ細胞の増殖を阻害し、充分に洗浄して、種々の濃度のＯＶＡ３２３−３３９ペプチドと共に精製Ｔ細胞に加えた。増殖アッセイは、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中で、３７℃、５％ＣＯ₂で３〜５日間行った。ウェルに³Ｈ−チミジン１μＣｉを適用して、１８時間後に培養を終了し、スカトロン（Skatron）細胞回収機を使用して回収した。Ｔ細胞増殖の尺度としてのＤＮＡへの³Ｈ−チミジンの取り込みは、ＬＫＢ液体シンチレーション分光計を使用して求めた。ペプチド反応性Ｔ細胞増殖の程度は、免疫化後のマウスに起こったＴ_H細胞応答（即ち、クローンの拡大）を示すものであった。実施例２４ペプチド結合一本鎖ＭＨＣ分子を発現するベクターを伴うＤＮＡ接種による免疫抑制アプローチＤＮＡ接種アプローチ（特に筋肉内又は皮内）の作用を試験するモデル系の一例を以下に略述した。ＢＡＬＢ／ｃマウス３群に両方の後肢に１００μｇの（ａ）ＳＣＥ１、（ｂ）ＳＣＴ１、又は（ｃ）生理食塩水を筋肉内（ＩＭ）注射した。注射は０、２、及び４週目に行った。最初のＤＮＡ注射後４及び５週目に、ＯＶＡペプチド３２３−３３９（完全フロイントＨ３７Ｒａアジュバント中１００ μｇ/マウス）を尾の基部に皮下注射した。２週間後（８週目）、尾の放血により各マウスから採血し、約１４，０００Ｇで３〜５分間の遠心分離により血清を得た。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の力価は、上述のように測定した。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体の程度は、Ｔ_H細胞が、ペプチドによる免疫化後のマウスに起こったイムノグロブリンクラススイッチングを指令したことを示すものであった。したがって、ペプチド結合一本鎖ＭＨＣ発現ベクターによるＤＮＡの接種は、ＩｇＭ抗体レベルに影響することなく、ペプチド特異的ＩｇＧ抗体のレベルの低下を引き起こし得る。代替アッセイとしては、ＯＶＡ特異的Ｔ_H細胞のクローンの拡大又は増殖を測定することがある。簡単に述べると、２回目のＯＶＡ免疫化の７日後に、鼠蹊及び大動脈傍リンパ節から細胞懸濁液を調製した。ナイロンウール及びセファデックスＧ−１０カラムでのインキュベーションにより、この懸濁液から抗原提示細胞を枯渇させ、生じた精製Ｔ細胞集団を、Ｏｖａ３２３−３３９ペプチドを適用したＡＰＣと共にインキュベーションした。脾臓Ｂ細胞を抗原提示細胞とした。これらの細胞をマイトマイシンＣ（脾臓細胞４×１０⁶個／mlの懸濁液中５０〜１００μｇ/ml）で固定して、Ｂ細胞の増殖を阻害し、充分に洗浄して、種々の濃度のＯＶＡ３２３−３３９ペプチドと共に精製Ｔ細胞に加えた。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞増殖アッセイは、上述のように行った。ペプチド反応性Ｔ細胞増殖の程度は、ペプチドによる免疫化後のマウスに起こったＴ_H細胞応答（即ち、クローンの拡大）を示すものであった。したがって、ペプチド結合一本鎖ＭＨＣ発現ベクターによるＤＮＡの接種は、ペプチド特異的Ｔ_H細胞増殖のレベルの低下を引き起こし得る。実施例２５１つのＴＭドメインを有する一本鎖クラスIIＭＨＣ分子の構築及び細胞表面発現（ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ）上述の方法にしたがい、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ融合分子（FIG.３０）を以下の方法により作製した：Ａ２０−１．１１細胞から単離した全ＲＮＡからのＩＡ^dα及びβ鎖遺伝子断片を増幅するために、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)を行った［K．Kim et al.，J．Immunol.，122:546(1979)］。クローニングを促進するために、ＰＣＲにより遺伝子断片の各末端に、適切な制限酵素部位を導入した。ＰＣＲにより、１０アミノ酸ペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列をβ１− β２遺伝子断片の５’末端に導入し、そしてKozakコンセンサス配列をβシグナル配列の５’末端に導入した。２４アミノ酸リンカー及びＯＶＡ抗原性ペプチドをコードする領域は、アニーリングしたオリゴヌクレオチドから作製した。ＰＣＲ断片とpBlueScript-IIベクター（Stratagene）中の二本鎖オリゴヌクレオチドの組み立てにより、ｓｃ−ＩＡ^d融合遺伝子を作製した（FIG.３０を参照のこと）。哺乳動物での発現に関して、ｓｃ／ＩＡ^dＯＶＡ遺伝子（α鎖ＴＭ及び細胞質領域を含む）をｐＥＥ１３(Cell Tech)のＣＭＶプロモーターの下流にサブクローニングすることにより、ｐＳＣＴ１ベクターを作製した。ｐＥＥ１３ベクターはまた、選択可能なグルタミン酸シンセターゼ遺伝子を含む。可溶性ＳＣ−ＩＡ^d分子を作製するために、α鎖ＴＭ及び細胞質領域（即ち、アミノ酸１８３〜２３３まで）を、６個の連続ヒスチジンをコードするアミノ酸配列で置換することにより、端を切ったｓｃ−ＩＡ^d構築物を作製した。これらの構築物を、pBluebacIII（Invitrogen）のバキュロウイルス多角体プロモーターの下流にサブクローン化した。線状化野生型ＡｃＭＮ−ＰＶ（Invitrogen）によるＳＦ９昆虫細胞のリポソーム介在同時トランスフェクションにより、融合遺伝子をバキュロウイルス中に組換えた。クローニング後、標準法により精製組換えウイルスのストックを調製した。他の抗原性ペプチドも共有結合した提示ペプチドとして使用できることは容易に明らかである。例えば、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドコード配列を、以下のｇＤペプチドコード配列で置換することによりｓｃ−ＩＡ^d／ｇＤ融合分子を作製するために、ＨＳＶ−１ｇＤペプチドを使用した。好ましくは、提示ペプチドは、約６〜３０個までの（末端を含む）アミノ酸を含有する。共有結合した提示ペプチドを含む任意の一本鎖ＭＨＣ融合複合体について、本明細書に記載されるＴ細胞活性化アッセイを使用して、提示ペプチドが適切に折り畳まれて、複合体のペプチド結合溝又は裂溝に入るかどうかを決定することができる。以下の方法により、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ融合分子を細胞表面発現について試験した：ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ融合遺伝子を有する発現ベクターでトランスフェクションしたプラズマ細胞腫ＮＳ−Ｏ細胞を選択して、クラスII分子の表面発現を流動細胞アッセイにより試験した。ＮＳ−Ｏ細胞を、電気穿孔により、ｓｃ− ＩＡ^d／ＯＶＡ融合遺伝子を有する線状化ｐＳＣＴ１ＤＮＡでトランスフェクションした。グルタミンを含まない培地中での増殖により細胞を選択した。トランスフェクション体（即ち、Ｔ１２細胞）は１４〜２１日後には明らかとなり、クラスIIＭＨＣ分子の表面発現について分析した。細胞をＦＩＴＣ結合抗ＩＡ^dｍＡｂ（ＡＭＳ−３２．１、PharMingen）で染色して、流動細胞アッセイにより蛍光を測定した。アイソタイプが適合したＦＩＴＣ結合抗Ｉ−Ａ^kｍＡｂ（１０−３．６；PharMingen）を陰性対照として使用した。 FIG.３１Ａに、機能性一本鎖融合分子の細胞表面発現を示した。安定なトランスフェクション体を、抗ＩＡ^d及び抗ＩＡ^kｍＡｂを使用する流動細胞アッセイにより分析した。Ｔ１２トランスフェクション体について示される結果は、他の３つの独立なトランスフェクション体で示された結果と同様であった（ｍ．ｆ．ｉ．＝平均蛍光強度）。結果により、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ発現ベクターでトランスフェクションした細胞の表面上のｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ発現の増加が証明された。クラスII分子の細胞表面発現には完全なβ ＴＭドメインは必要ではなかった；β及びα鎖をつなぐ可撓性リンカーは、β ＴＭドメインの機能に取って代わることができる。最後に、本結果はまた、提示ペプチドの一本鎖ＭＨＣクラス II分子への共有結合が、ＭＨＣ分子の安定な組み立て及び表面発現を促進することを証明した。提示ペプチドのβ鎖への結合はまた、一本鎖ＭＨＣ融合分子の安定な組み立て及び細胞表面発現も可能にした。実施例２６細胞表面ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ融合複合体は、インビトロでＴ細胞応答を誘導する。ＯＶＡペプチドが適正にｓｃ−ＩＡ^d融合複合体内に折り畳まれたかどうかをチェックするために、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡでトランスフェクションした細胞を、Ｔ細胞を刺激するその能力について測定した。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ（ＤＯ１１．１０）を使用した。ＴＣＲは、ＩＡ^dとの関係においてＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを認識する。これらの細胞のＴＣＲがＡＰＣ（ここでは、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡトランスフェクション体）と相互作用するとき、ＤＯ１１．１０細胞はインターロイキン−２（ＩＬ−２）を分泌する。ＤＯ１１．１０細胞（２×１０⁵個／ウェル）を、Ｔ１２トランスフェクション体のＮＳ−Ｏ細胞（１×１０⁵個／ウェル）の存在下で２４時間培養し、培地中に放出されたＩＬ−２を、ＩＬ−２特異的ＥＬＩＳＡ(PharMingen) により測定した。マウスＩＡ^d含有Ｂ細胞リンパ腫のＡ２０−１．１１（１×１０⁵個／ウェル）にＯＶＡ３２３−３３９２０mMを適用して、抗原提示の陽性対照とした［K．Kim et al.，J．Inlmunol.，122:549(1979)］。Ｔ１２細胞単独の培地ではＩＬ−２は検出されなかった。結果は、他の２つのｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡトランスフェクション体で観察されたのと同様であった。 FIG.３１Ｂに示されるように、ＮＳ−Ｏ細胞(トランスフェクションしていない) はＤＯ１１．１０細胞を刺激できなかったが、一方ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ融合遺伝子でトランスフェクションした細胞は、ＤＯ１１．１０細胞からのＩＬ−２の放出を強力に促進した。ＩＬ−２分泌の程度は、ＯＶＡペプチドを適用したＩＡ^d 含有ＡＰＣで見られたものに匹敵した。本結果により、ＯＶＡペプチドが、ｓｃ−ＩＡ^d融合複合体内に適正に折り畳まれ、そして折り畳まれたＯＶＡペプチドがＩＡ^dとの関係により、ＤＯ１１．１０細胞の表面上のＴＣＲに認識されたことを証明した。実施例２７可溶性ｓｃ−ＩＡ^d／ペプチド融合分子は、インビトロでＴ細胞応答を誘導する。可溶性ＩＡ^dヘテロ二量体は、不安定であることが報告されている（Kozono,H ．et al.，Nature 369，151(1994)）。以下の結果は、ＩＡ^d分子が、二量体を合わせて一本鎖にすることにより安定化することを示した。他のＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣクラスＩ、ＩＥ、ＤＱ、ＤＰ又はＤＲ分子）の安定化も、二量体又はその断片を合わせて一本鎖分子にすることにより達成することができる。一本鎖ＩＡ^dＭＨＣ分子の安定性を証明するために、及びＯＶＡペプチドを他のペプチドで置換可能であることを示すために、バキュロウイルス−昆虫細胞系を使用して可溶性ｓｃ−ＩＡ^d／ペプチド分子を産生した。作製したキメラ遺伝子は、提示ペプチドを除いて一般にFIG.３０と同一であった。例えば、キメラ遺伝子は、共有結合したＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（ｓｃ−ＩＶＡ^d／ＯＶＡ）、ＨＳＶ−１糖タンパクＤからのペプチド（ｇＤ２４６−２６１）［ＡＰＹＳＴＬＬＰＰＥＬＳＥＴＰ］（SEQ ID NO:124）［S．Grammer et al.，J．Immunol .，145:2249(1990)］（ｓｃ−ＩＡ^d／ｇＤ）、又はペプチドなし（ｓｃ−ＩＡ^d ／ブランク）のいずれかを含んでいた。各場合に、α鎖遺伝子のＴＭ及び細胞質ドメインをヒスチジンテール（６×His）をコードする配列で置換して、可溶性発現を可能にした。ｓｃ−ＩＡ^d融合遺伝子を有する組換えバキュロウイルスは、標準的な手順により作製し、次いでこれを使用してＳＦ９昆虫細胞を感染させた。感染細胞は、可溶性ｓｃ−ＩＡ^d融合分子を分泌した；これらは、ＩＡ^d特異的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により培地中で検出できた。次にｓｃ−ＩＡ^d融合分子を免疫親和性クロマトグラフィーにより精製した。昆虫細胞をトランスフェクションし、かつｓｃ−ＩＡ^d融合分子を精製するために使用したプロトコールは、以下の通りであった:ヒンク(Hink's)のＴＭＮ− ＦＨ昆虫培地＋１０％ウシ胎児血清中のＳＦ９細胞（１×１０⁶細胞／ml）を感染多重度１０でｓｃ−ＩＡ^d遺伝子を有するバキュロウイルスで感染させた。５日後、培養上清を回収し、1MTrisでpH８．０に調整し、プロテインＡセファロースカラムを通した。次に未結合物質をＭＫ−Ｄ６ｍＡｂプロテインＡセファロースカラムに適用した。カラムを２０mM Tris−ＨＣｌ（pH８．０）及び1M ＮａＣｌ、２０mM Tris−ＨＣｌ（pH８．０）で洗浄した。ｓｃ−ＩＡ^d融合タンパク質を、５０mMグリシン−ＨＣｌ（pH１１．０）で溶出して、直ちにpH８．０まで中和した。溶出タンパク質を濃縮して、セントリコン３０(Centricon 30)を用いて２０mM Tris−ＨＣｌ（pH８．０）に交換した。捕捉ｍＡｂとしてＭ５／１１４及びプローブｍＡｂとしてビオチン結合ＡＭＳ−３２．１（PharMingen）を使用する、高感度ＩＡ^dコンホメーション特異的ＥＬＩＳＡにより、ｓｃ−ＩＡ^d分子を検出した。ｓｃ−ＩＡ^dタンパク質をプロービングするために使用した他のｍＡｂ（３４−５−４、３９−１０−８）は、PharMingenから入手した。完全フロイントアジュバントＨ３７Ｒａ中のＯＶＡ３２３−３３９１００μｇを２回注射したマウスからのポリクローナル抗血清を使用して、共有結合ＯＶＡペプチドを検出した。ポリクローナル抗血清の調製法に関する詳細なプロトコールについては、Ausbel，前出を参照のこと。一般に、精製操作により、培地１リットル当たりｓｃ−ＩＡ^d／ペプチド２００〜３００μｇを得た。 FIG.３２では、昆虫細胞が可溶性一本鎖ＭＨＣクラスII分子を産生したことを示した。親和性カラム溶出液のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、約５0kDaの１本の主要なバンドが示された（FIG. ３２、レーン２及び３）。可溶性ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ（レーン３、５）及びｓｃ−ＩＡ^d／ブランク（レーン２及び４）タンパク質は、バキュロウイルス感染ＳＦ９細胞により発現し、固定化抗ＩＡ^dＭＫ−Ｄ６ｍＡｂを使用する免疫親和性クロマトグラフィーにより精製した。試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで解析して、クーマシーブルーで染色した（レーン１〜３）。分子量標準（レーン１）を示した。ｓｃ−ＩＡ^dタンパク質はまた、ナイロン膜に移行させて、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに特異的なマウス抗血清でプロービングした（ウェスタンブロット、レーン４及び５）。共有結合ＯＶＡペプチドは、完全フロイントアジュバントＨ３７Ｒａ中のＯＶＡ３２３−３３９を注射したマウスからのポリクローナル抗血清を使用して検出した。ｓｃ／ＩＡ^dをグリコシル化して、結合ペプチドによる質量の差を示した。ウェスタンブロット分析により、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ試料中のＯＶＡ３２３−３３９ペプチドの存在を確認した（FIG.３２、レーン５）。また、精製ｓｃ−ＩＡ^d ／ＯＶＡ及びｓｃ−ＩＡ^d／ブランクタンパク質の両方とも、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)（ＭＫ−Ｄ６、Ｍ５／１１４、ＡＭ５−３２．１、３９−１０−８、及び３４−５−４）により認識された。これらのｍＡｂは、未変性ＩＡ^dのエピトープを認識する。 FIG.３３では、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ分子が、Ｄ１１．１０細胞からのＩＬ− ２の用量依存的放出を誘導したことを示しており、これによりバキュロウイルス産生分子の機能性が確認できた。Ｄ１１．１０細胞はまた、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ分子により刺激されるとＩＬ−４を産生する。FIG.３３ではまた、ＤＯ１１．１０細胞が、ｓｃ−ＩＡ^d／ブランク分子には応答しなかったことを示した。一本鎖ＭＨＣ融合分子が、ＯＶＡ３２３−３３９以外の共有結合提示ペプチドを含んでよいことは明らかである。融合分子内のペプチドの適正な折り畳みをチェックするために使用する細胞の選択は、使用される特定の提示ペプチドにより左右される。例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞系のＧＤ１２は、ＩＡ^d分子との関係においてｇＤ２４６−２６1ペプチドを認識する[例えば、S.Grammer et al.，J．Immunol．145:2249(1990)］。一例として、ＧＤ１２細胞を使用して、ｇＤペプチドがｓｃ−ＩＡ^d融合複合体中に適正に折り畳まれたこと、及びｓｃ−ＩＡ^d／ｇＤ分子がＴ細胞を活性化したことを証明した。Ｔ細胞ハイブリドーマＧＤ１２は、固定化ｓｃ−ＩＡ^d／ｇＤにはよく応答したが、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡには応答しなかった（FIG.３４Ａ）。逆に、ＤＯ１１．１０細胞系は、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡペプチドにはよく応答したが、ｓｃ−ＩＡ^d／ｇＤにはしなかった（FIG.３４Ｂ）。これらの実験において、ＧＤ１２（ｇＤ２４６−２６１及びＩＡ^dに特異的）又はＤＯ１１．１０細胞は、ｓｃ−ＩＡ^d／ｇＤ又はｓｃ／ＩＡ^d／ＯＶＡでコーティングしたウェルに、それぞれ個別に１×１０⁵個ずつ加えた。プレートは一晩インキュベーションして、上清ＩＬ−２の量をＥＬＩＳＡにより測定した。実施例２８空のｓｃ−ＩＡ^d融合複合体の構築及び使用ｓｃ−ＩＡ^d／ブランク分子は、ＯＶＡ３２３−３３９提示ペプチドで装填することができることが判った。FIG.３４Ｃに示されるように、装填された融合分子は予想外に、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ融合分子よりも大きくＤＯ１１．１０細胞を活性化した。FIG.３４Ｃは以下のように説明される： FIG.３４Ｃ。固定化ｓｃ−ＩＡ^d／ブランクタンパク質（５００ng/ウェル）を、クエン酸緩衝液（pH５．０）中で５０モル過剰のＯＶＡ３２３−３３９ペプチドの非存在下(左側の棒)又は存在下(中央の棒)で３７℃で２０時間インキュベーションした。固定化ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡタンパク質（５００ng/ウェル）は、抗原提示に及ぼす結合条件の影響を測定するために、ペプチドを加えることなくインキュベーションした（右側の棒）。未結合ペプチドの除去後、全てのｓｃ−ＩＡ^d分子を、ＤＯ１１．１０細胞を活性化するその能力について試験した。本発明の他の可溶性の空の一本鎖ＭＨＣクラスII複合体が、免疫系応答、例えば、Ｔ細胞誘導及びサイトカイン放出を有効に調節することができることは明らかである。例えば、可溶性ＭＨＣ／Ｉｇ分子をコードするＤＮＡ（実施例４）は、標準法により、対応する空のＭＨＣ／Ｉｇ分子をコードするＤＮＡを産生するため結合ＯＶＡペプチドなしに作製することができた。空の分子は、適切には発現してから提示ペプチド（例えば、本明細書に記載されるＯＶＡペプチド）で装填することができた。Ｔ細胞を誘導する装填された可溶性ＭＨＣ／Ｉｇ分子の能力は、本明細書に記載されるＴ細胞活性化アッセイで観察することができた。実施例２９可溶性ｓｃ−ＩＡ^d／ペプチド融合複合体は、Ｔ細胞を活性化し、アポトーシスを誘導する。ＤＯ１１．１０細胞を使用して、Ｔ細胞アポトーシスを誘導する可溶性ｓｃ− ＩＡ^d融合分子の能力を試験した。上述の可溶性ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ分子と共に一晩インキュベーション後、ＤＯ１１．１０細胞は、核縮合、アポトーシス体の出現及びオリゴヌクレオソームのバンドへのＤＮＡの分解を含む、細胞形態の著しい変化を示した（FIG.３５、レーン４）。これらの変化は、アポトーシスに特徴的である［P．Walker et al.，BioTechniques，15:1032(1993)］。同様な作用は、抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ３ｍＡｂと共にインキュベーションした細胞において観察されたが、一方固定化ｓｃ−ＩＡ^d／ブランクと共にインキュベーションした細胞では細胞形態又はＤＮＡ分解に何も変化がなかった（FIG.３５のレーン３及び５を比較されたい）。 FIG.３５は、以下のように説明される：ＤＯ１１．１０細胞を未処理ウェル中、又は抗ＴＣＲｍＡｂ（Ｈ５７−５９７、PharMingen）１００ng/ウェル、若しくはｓｃ−ＩＡ^d分子２５０ng/ウェルでコーティングしたウェル中でインキュベーションした。２４時間後、細胞（１．２×１０⁶個／試料）を回収して、Trint on X-100可溶性／ＤＮＡを単離した［P．Walker et al.，Bio Techniques，15:1 032(1993)］。試料を２％アガロースゲル電気泳動により解析して、臭化エチジウムで染色し、はしご状の染色体ＤＮＡを検出した。レーン２は、未処理ＤＯ１１．１０細胞に由来した。レーン１及び６には、ＤＮＡ分子量マーカーを示した。実施例３０可溶性ｓｃ−ＩＡ^dＭＨＣ融合分子は、インビボでＴ細胞の拡大を抑制する。Ｔ細胞の活性化（例えば、Ｔ細胞の増殖におけるような）には少なくとも２つのシグナルが必要である。ＴＣＲを介してＴ細胞に送達される単一のシグナル及びＭＨＣクラスII／ペプチド融合複合体は、Ｔ細胞を殺すか又はアネルギー化する。可溶性ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ融合分子は、インビボで加える同時刺激シグナルの非存在下では、選択的に抗原特異的Ｔ細胞を殺すことが判った。これらの結果は、一本鎖ＭＨＣ分子、特に一本鎖ＭＨＣクラスII分子が、インビボで免疫系機能を抑制するのに充分に適していることを示した。また本結果は、一本鎖ＭＨＣ分子が、同時刺激シグナルと共に細胞中で同時発現されると、又は一本鎖ＭＨＣ分子が、適切な同時刺激シグナルが既に存在している細胞で発現されると、免疫系機能を誘導できることを示した。Ｔ細胞のクローンの拡大をインビボで抑制するために、本発明者らは、標準法によりｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ融合遺伝子を含むように改変できる、哺乳動物発現ベクターｐＥＥ３を使用した。ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ遺伝子の転写は、発現ベクターのＣＭＶプロモーターにより駆動した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、プラスミドＤＮＡ（ＰＢＳ中１mg/ml）１００μｇを後肢に筋肉内（ＩＭ）注射した。注射は更に２回、１４及び２８日後に繰り返した。対照群には、０週目に生理食塩水、そして２及び４週目にｓｃ−ＩＡ^d／ブランクをコードするプラスミド１００ μｇをＩＭ注射した。次に両方の群で、最終ＤＮＡ接種の２３及び３０日後にＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（完全フロイントＨ３７Ｒａアジュバント中１００μｇ/マウス）を尾の基部に皮下注射した。１週間後、マウスを屠殺して、鼠蹊及び大動脈傍リンパ節を回収した。リンパ節細胞懸濁液を調製して、ナイロンウール及びセファデックスＧ−１０カラムでのインキュベーションにより抗原提示細胞を枯渇させて、生じた精製Ｔ細胞集団を、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを適用したＡＰＣと共にインキュベーションした。ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓Ｂ細胞をＡＰＣとした。これらの細胞をマイトマイシンＣ（４×１０⁶脾細胞/mlの懸濁液中５Ｏ〜１００μｇ/ml）で固定して、Ｂ細胞の増殖を阻害し、充分に洗浄して、２×１０⁵ 細胞／ウェルで、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（０〜５０μｇ/ウェル）と共に精製Ｔ細胞（２×１０⁵細胞／ウェル）に加えた。細胞を９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中で３７℃、５％ＣＯ₂で４日間増殖させた。次にウェルにＭＴＳ（４０μｌ/ウェル）（Promega）を４〜６時間適用し、次いで培養を終了した。ＭＴＳの取り込みを、４９０での吸光度を測定することにより求めたが、これはＴ細胞増殖の尺度である。 FIG.３６Ａ及びFIG.３６Ｂには、注射したマウス及び対照マウスからの細胞を使用するＴ細胞増殖アッセイの結果を示した。FIG.３６Ａにおいて、Ｔ細胞は、ｓｃ−ＩＡ^d／ブランクプラスミド（及び生理食塩水）のＩＭ注射したマウスから単離した。FIG.３６Ｂでは、マウスにｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡプラスミドのＩＭ注射を行った。マウスにＯＶＡペプチドで２回抗原投与して、１週間後リンパ節からＴ細胞を単離した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞増殖アッセイは、上述のように行った。ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡプラスミドを注射したマウスから単離したＴ細胞は、ｓｃ−ＩＡ^d／ブランクプラスミドを注射した対照群から単離したものと比較して、ＯＶＡ特異的増殖の量が著しく低下した。これらの結果は、可溶性ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ分子の発現が、抗原特異的なＴ細胞のクローンの拡大をインビボで抑制することを示すものであった。可溶性一本鎖ＭＨＣ分子（例えば、可溶性ｓｃ−ＭＨＣクラスIIペプチド融合複合体又は可溶性の装填されたｓｃ−ＭＨＣクラスII複合体）又はこれらの分子をコードするＤＮＡ発現ベクターの投与は、哺乳動物、特にヒトにおける、抗原特異的Ｔ細胞の望ましくない存在又は拡大に関わる免疫疾患を緩和する。例えば、可溶性一本鎖ＭＨＣ分子（例えば、可溶性ｓｃ−ＭＨＣクラスIIペプチド融合複合体）又はこれらの分子をコードするＤＮＡ発現ベクターを、薬学的に受容可能な担体物質（例えば、生理食塩水）と混合して、抗原特異的Ｔ細胞の望ましくない存在又は拡大に関わる免疫疾患に罹患しているか又は罹患しやすい哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することができる。他の薬学的に受容可能な担体の例はよく知られている（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，MackPub． Co.，Easton，PA，1980を参照のこと）。投与の１つの特定の様式は、筋肉内投与であるが、他の様式を使用することもでき（例えば、経口、鼻内、静脈内、非経口、又は経皮投与）、その様式は、その動物の治療すべき症状及び全般的な健康状態に依存し、そして当業者には明らかであろう。可溶性一本鎖ＭＨＣ融合分子の用量もまた、免疫疾患のタイプ及び重篤度のような要因に依存して変化するが、一般的には抗原特異的Ｔ細胞のような免疫細胞のインビボの拡大を抑制するのに充分な用量である。典型的な用量範囲は、体重１kg当たり可溶性ＭＨＣクラスII分子１ng〜１０mgであろう。治療は、考えられる必要に応じて繰り返すことができる（例えば、毎日）。また、本発明の全て又はほとんどのＭＨＣ分子を有する細胞は、Ｔ細胞を抑制又は誘導するのに充分な用量で哺乳動物に投与することができることが理解されるであろう。Ｔ細胞活性は、本明細書に記載されたアッセイにより検出することができる。他の可溶性の装填された一本鎖ＭＨＣ分子を使用して、抗原特異的Ｔ細胞の望ましくない存在又は拡大をインビボで処置できることは明らかである。例えば、約６〜３０個までのアミノ酸の提示ペプチドは、少なくとも等モル比で適切な可溶性の空の一本鎖ＭＨＣ分子と混合して、対応する装填された分子を形成することができる。次に装填された分子を薬学的に受容可能な担体と混合して、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、上述のような免疫系疾患を処置することができる。実施例３１一本鎖ＭＨＣ複合体を有するトランスジェニックマウスの作成及び用途本発明の任意の一本鎖ＭＨＣ分子をコードする１つ以上の遺伝子を有するトランスジェニックマウスを作成することができた。好適な一本鎖ＭＨＣ分子の例として、α又はβ鎖（又はその一部）に単一の膜貫通ドメインを有する一本鎖ＭＨＣクラスＴ１ペプチド融合分子、可溶性一本鎖ＭＨＣクラスIIペプチド融合分子、及び溶解度を上昇させるために１つ以上の親水性アミノ酸（例えば、上記６× Hisタグ，前出）を有する一本鎖ＭＨＣクラスII分子をそれぞれ使用して、トランスジェニックマウス種を作成することができた。このようなマウス種は、例えば、抗原特異的Ｔ細胞の抑制又は拡大のための有用なインビボモデルとして役立つ。更に、このようなトランスジェニック動物に由来する細胞を使用して、インビボで無限に増殖しながら、その分化した特徴の少なくとも幾つかを保持する、不死細胞系を確立することができた。可溶性一本鎖ＭＨＣクラスIIペプチド融合分子を有するトランスジェニックマウスを作製することができた。例えば、上記の可溶性ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ又はｓｃ−ＩＡ^d／ｇＤ分子をコードするＤＮＡ構築物は、選択された細胞又は組織に特異的なプロモーター及び／又はエンハンサーに結合して、生じたハイブリッド遺伝子を標準法により(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Leder et al.，米国特許第4,736,866号、Wagner et al.，米国特許第4,873,191号、及びOhashi，The Immunologist，2，87-92に記載されているように)、初期発生段階（例えば、受精した卵母細胞段階）で動物胚に導入して、選択された細胞又は組織（例えば、Ｔ細胞又は神経外胚葉、内皮又は血管由来組織）中で上昇したレベルの目的の活性を発現するトランスジェニック動物を作製することができた。導入遺伝子(transgene)陽性動物（創始者(founder)動物）を非トランスジェニック動物と交配して、導入遺伝子ＤＮＡの伝播に関して子孫（ｆ１動物）をスクリーニングする。ｆ１導入遺伝子陽性動物は、導入遺伝子ＤＮＡに関してヘミ接合であり、ホモ接合のトランスジェニック動物は、適切な同胞交配により作製することができる。各創始者動物及びそのトランスジェニックな子孫は、同じ導入遺伝子で確立した他のトランスジェニックマウスに比較してユニークである。マウスゲノムＤＮＡへの導入遺伝子ＤＮＡの組み込みは、ランダムであり、組み込みの部位は、導入遺伝子の発現のレベル、及び組織と発生のパターンに大いに影響し得る。したがって、多くのトランスジェニックマウス系を確立して、最も適切な発現パターンの動物の選択についてスクリーニングする。トランスジェニック系は、導入遺伝子発現のレベル及び本明細書に記載されたＴ細胞アッセイにより評価した。ＲＮＡレベルの発現は、初めに発現陽性動物を同定して定量するために測定した。導入遺伝子ＲＮＡテンプレートのみを増幅するように設計されたオリゴヌクレオシドプライマーを用いるＰＣＲ増幅アッセイ、及び導入遺伝子特異的プローブを用いる溶液ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、Ausbel et al.，前出を参照のこと）を含む、ＲＮＡ解析の標準法を利用した。次にＲＮＡ陽性動物は、例えば、ＩＡ^d又はＯＶＡ特異的抗体を使用するウェスタン免疫ブロットにより、タンパク質発現に関して解析した（例えば、Ausubel et al.，前出を参照のこと）。更に、それぞれ、導入遺伝子特異的ヌクレオチドプローブ及び抗体を用いるインサイチューハイブリダイゼーション及び免疫組織化学を適切には利用して、トランスジェニック組織内の発現の部位の位置を特定することができた。本明細書に記載された方法により、選択されたトランスジェニックマウス種においてＯＶＡ又はｇＤ特異的Ｔ細胞の活性を低下させることが可能である。使用されるＤＮＡの形態は、使用される動物種と類似したＭＨＣ分子をコードするＤＮＡであってもよく、又は異なる種（例えば、ヒト）の相同体をコードしてもよい。トランスジェニック動物におけるＴ細胞のレベルは、本明細書に記載されたＴ細胞アッセイにより評価することができた。「導入遺伝子（trans gene）」とは、そのトランスジェニックマウスには完全に異種（即ち、外来）であり、かつマウスゲノム中に挿入されるＤＮＡを意味するものと理解されたい。また、「プロモーター」とは、転写酵素複合体が結合して、次に遺伝子の転写を開始させる、ＤＮＡのセグメントを意味するものと理解されたい。トランスジェニックマウスの作成には、好適なプロモーターは、ＩＡ^dプロモーター及びラットのインスリンプロモーター（Ohashi et al.，Cell 65，305-317(1991)により報告された）を含む。本発明は、その好適な実施態様を参照して記載されている。しかし、当業者であれば、本開示を考察することにより、本発明の精神と範囲内で修飾及び改善を加えることができる。

【手続補正書】【提出日】平成１０年１０月１９日（１９９８．１０．１９）【補正内容】Ｉ．特許請求の範囲の欄別紙のとおり補正する。 II．明細書の欄（１）明細書第３３頁第９行の「リウマチなど」を「リウマチ、重症筋無力症、慢性アレルギーなど」と補正する。（２）同第３５頁第１２から１３行の「アレルギー、並びに多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病及び慢性関節リウマチのような自己免疫疾患」を、「多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、慢性アレルギーのようなアレルギーおよび自己免疫疾患」と補正する。（３）同第３７頁下から７〜６行目の「(例えば、経口又は経皮投与)」を「(例えば、経口、経皮、または鼻内投与)」と補正する。（４）同第３８頁最下行〜３９頁第１行の「トランスジェニックマウス」を「トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウス」と補正する。（別紙）請求の範囲１．ペプチド結合溝を有する一本鎖ＭＨＣ分子を含む、空のＭＨＣ複合体。２．ＭＨＣ複合体がクラスIIであり、かつ分子のα及びβ鎖が共有結合している、請求項１記載のＭＨＣ複合体。３．複合体が、連続して共有結合した、１）クラスIIβ鎖、２）一本鎖リンカー配列、及び３）クラスIIα鎖を含む、請求項２記載のＭＨＣ複合体。４．複合体が可溶性である、請求項１記載のＭＨＣ複合体。５．複合体が、装填された一本鎖ＭＨＣ複合体を形成する条件下で、提示ペプチドにより接触している、請求項１〜４のいずれか１項記載のＭＨＣ複合体。６．膜貫通ドメインを含む装填されたＭＨＣ複合体であって、ペプチド結合溝を含む空のＭＨＣ分子、及びペプチド結合溝に非共有的に結合して装填されたＭＨＣ複合体を形成する提示ペプチドを含み、ここで、装填されたＭＨＣ複合体はＴ細胞の活性を調節することができる、装填されたＭＨＣ複合体。７．請求項１〜６のいずれか１項記載の２つ以上の結合ＭＨＣ複合体を含む、多価ＭＨＣ複合体。８．Ｔ細胞の活性を調節することができる提示ペプチドの同定方法であって、宿主細胞中に、請求項２記載のＭＨＣ複合体をコードするＤＮＡ構築物をそれぞれ含有するクローニングベクターを導入すること、宿主細胞を、ＭＨＣ複合体の発現に適切な条件下で培養すること、ＭＨＣ複合体を発現する宿主細胞からＭＨＣ複合体を精製すること、そしてＭＨＣ複合体を、装填されたＭＨＣ複合体を形成するのに充分に提示ペプチドと接触させること、Ｔ細胞活性を調節するために、Ｔ細胞を、装填されたＭＨＣ複合体と接触させること；及びＴ細胞の活性を調節し、それによってペプチドを同定すること、を含む方法。９．請求項１〜７のいずれか１項記載のＭＨＣ複合体をコードするＤＮＡ構築物。１０．有効量の請求項５記載の装填されたＭＨＣ複合体を含む、哺乳動物における免疫応答の抑制のための組成物。１１．Ｔ細胞を、有効量の請求項１〜５のいずれか１項記載のＭＨＣ複合体と接触させることを含む、Ｔ細胞にアポトーシスを誘導する方法。１２．ＭＨＣクラスII−ペプチド融合複合体であって、ＭＨＣクラスII分子のα及びβ鎖が共有結合している、一本鎖ＭＨＣクラスII 分子；及びＭＨＣクラスII分子のペプチド結合溝に共有結合している提示ペプチド、を含み、ここで、融合複合体は、Ｔ細胞の活性を調節することができる、ＭＨＣクラスII−ペプチド融合複合体。１３．請求項１３記載の融合複合体をコードするＤＮＡ構築物。１４．請求項１４記載のＤＮＡ構築物を含むＤＮＡ配列の、哺乳動物における免疫応答の抑制剤の調製における使用。１５．請求項１３記載のＭＨＣクラス−IIペプチド融合複合体であって、細胞膜に結合している複合体をコードするＤＮＡ構築物の、哺乳動物における免疫応答の誘導剤の調製における使用。１６．請求項１３記載の融合複合体を発現する宿主細胞の選択方法であって、宿主細胞中に、請求項１３記載の融合複合体をコードするＤＮＡ構築物をそれぞれ含有するクローニングベクターを導入すること、宿主細胞を、ＭＨＣ複合体の発現に適切な条件下で培養すること；及び融合複合体を発現する宿主細胞を精製すること、を含む方法。１７．Ｔ細胞同時刺激因子及び請求項１３記載の融合複合体を発現する宿主細胞の選択方法であって：宿主細胞中に、クローニングベクターであって、そのベクターがそれぞれＴ細胞同時刺激因子及び請求項１３記載の融合複合体を独立に又は一緒にコードするＤＮＡ構築物を含有するクローニングベクターを導入すること、宿主細胞を、Ｔ細胞同時刺激因子と融合複合体の両方を発現する条件下で培養すること；そしてＴ細胞同時刺激因子と融合複合体の両方を発現する宿主細胞を精製すること、を含む方法。１８．請求項１７で得ることができる細胞の、哺乳動物における免疫応答の抑制剤の調製における使用。１９．請求項１８で得ることができる細胞の、哺乳動物における免疫応答の誘導剤の調製における使用。２０．請求項１〜７又は１３のいずれか１項記載のＭＨＣクラスII複合体をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、ここで、導入遺伝子が哺乳動物遺伝子プロモーターの転写制御下にあるトランスジェニック非ヒト動物。２１．Ｔ細胞を請求項６記載のＭＨＣ複合体と接触させることを含む、Ｔ細胞の誘導方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 21/04 21/04 25/28 25/28 29/00 29/00 37/06 37/06 37/08 37/08 43/00 43/00 Ｃ０７Ｋ 14/74 Ｃ０７Ｋ 14/74 19/00 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジァオ，ジン―アンアメリカ合衆国、フロリダ 33326、フォート・ローダーデール、ウェスト・ベイ・ブリッジ・ドライブ 121 (72)発明者バークハート，マーチンアメリカ合衆国、フロリダ 33138、マイアミ、エヌ・イー・75ティーエイチ・ストリート 950 (72)発明者ウォン，ヒン・シーアメリカ合衆国、フロリダ 33332、フォート・ローダーデール、ウェントワース 2966

Claims

【特許請求の範囲】１．ペプチド結合溝を有する一本鎖ＭＨＣ分子を含む、空のＭＨＣ複合体。２．ＭＨＣ複合体が、クラスIIであり、かつ分子のα及びβ鎖が、共有結合している、請求項１記載のＭＨＣ複合体。３．複合体が、連続して共有結合した、１）クラスIIβ鎖、２）一本鎖リンカー配列、及び３）クラスIIα鎖を含む、請求項２記載のＭＨＣ複合体。４．１）又は３）の鎖が、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、又はその一部を欠いている、請求項３記載のＭＨＣ複合体。５．１）及び３）の鎖が、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、又はその一部を欠いている、請求項３記載のＭＨＣ複合体。６．一本鎖リンカー配列が、約１５〜４０個のアミノ酸を含有する、請求項３記載のＭＨＣ複合体。７．複合体が、装填された一本鎖ＭＨＣ複合体を形成する条件下で、提示ペプチドに接触している、請求項３記載のＭＨＣ複合体。８．膜貫通ドメインを含む装填されたＭＨＣ複合体であって、ペプチド結合溝を含む空のＭＨＣ分子、及びペプチド結合溝に非共有結合して、装填されたＭＨＣ複合体を形成する提示ペプチドを含み、ここで、装填されたＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞の活性を調節することができる装填されたＭＨＣ複合体。９．提示ペプチドが、約６〜３０個のアミノ酸を含有する、請求項７記載のＭＨＣ複合体。１０．リンカー配列が、ＭＨＣ複合体のＮ末端に共有結合している、請求項３記載のＭＨＣ複合体。１１．リンカー配列が、切断部位を含み、かつ約８〜１２個のアミノ酸を含有する、請求項３記載のＭＨＣ複合体。１２．複合体が、更に複合体のＮ−又はＣ末端に付加される１つ以上のアミノ酸を含む、請求項４記載のＭＨＣ複合体。１３．アミノ酸が、親水性であるか、又は膜アンカーをコードする、請求項１２記載のＭＨＣ複合体。１４．請求項１記載の２つ以上の結合ＭＨＣ複合体を含む、多価ＭＨＣ複合体。１５． β及びα鎖が、それぞれ、ＩＥ、ＩＡ、ＤＲ、ＤＱ及びＤＰタンパク質よりなる群から選択される、請求項３記載のＭＨＣ複合体。１６．Ｔ細胞の活性を調節することができる提示ペプチドの同定方法であって、宿主細胞中に、請求項２記載のＭＨＣ複合体をコードするＤＮＡ構築物をそれぞれ含有するクローニングベクターを導入すること、宿主細胞を、ＭＨＣ複合体の発現に適切な条件下で培養すること、ＭＨＣ複合体を発現する宿主細胞からＭＨＣ複合体を精製すること、そしてＭＨＣ複合体を、装填されたＭＨＣ複合体を形成するのに充分に提示ペプチドと接触させること、Ｔ細胞活性を調節するために、Ｔ細胞を、装填されたＭＨＣ複合体と接触させること；及びＴ細胞の活性を調節すること、それによって提示ペプチドを同定すること、を含む方法。１７．更に、それぞれ空のＭＨＣ複合体をコードする複数のＤＮＡ配列を連結し、それによってＤＮＡ構築物を与えることを含む、請求項１６記載の方法。１８．装填されるとＴ細胞受容体に拮抗することができる空のＭＨＣ複合体を発現する宿主細胞が選択される、請求項１６記載の方法。１９．請求項３、４又は５記載のＭＨＣ複合体をコードするＤＮＡ構築物。２０．更に、Kozakコンセンサス配列に対応する翻訳開始配列を含む、請求項１９記載のＤＮＡ構築物。２１．ＭＨＣ複合体をコードする遺伝子が、哺乳動物ウイルス遺伝子プロモーターの転写制御下にある、請求項２０記載のＤＮＡ構築物。２２．有効量の請求項７記載の装填されたＭＨＣ複合体を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫応答の抑制方法。２３．哺乳動物が、自己免疫疾患に罹患しているか、又は罹患しやすい、請求項２２記載の方法。２４．自己免疫疾患が、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、重症筋無力症又は慢性アレルギーのいずれかである、請求項２３記載の方法。２５．Ｔ細胞を、有効量の請求項３又は７記載のＭＨＣ複合体と接触させることを含む、Ｔ細胞にアポトーシスを誘導する方法。２６．ＭＨＣクラスII−ペプチド融合複合体であって、ＭＨＣクラスII分子のα及びβ鎖が、共有結合している、一本鎖ＭＨＣクラス II分子；及びＭＨＣクラスII分子のペプチド結合溝に共有結合している提示ペプチド、を含み、ここで、融合複合体は、Ｔ細胞の活性を調節することができるＭＨＣクラス II−ペプチド融合複合体。２７．複合体が可溶性である、請求項２６記載の融合複合体。２８．請求項２７記載の融合複合体をコードするＤＮＡ構築物。２９．請求項２８記載のＤＮＡ構築物を含む有効量のＤＮＡ配列を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫応答の抑制方法。３０．ＤＮＡ配列が筋肉内投与される、請求項２９記載の方法。３１．ＤＮＡ配列が、皮内、経皮、経口又は鼻内投与される、請求項２９記載の方法。３２．複合体が細胞膜に結合している、請求項２６記載の融合複合体。３３．複合体がα又はβ鎖に単一の膜貫通ドメインを含む、請求項３２記載の融合複合体。３４．請求項３２又は３３記載の融合複合体をコードするＤＮＡ構築物。３５．請求項３４記載のＤＮＡ構築物を含む有効量のＤＮＡ配列を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫応答の誘導方法。３６．ＤＮＡ配列が皮内投与される、請求項３５記載の方法。３７．ＤＮＡ配列が、筋肉内、経皮、経口又は鼻内投与される、請求項３５記載の方法。３８．請求項３３記載の融合複合体を発現する宿主細胞の選択方法であって、宿主細胞中に、請求項３３記載の融合複合体をコードするＤＮＡ構築物をそれぞれ含有するクローニングベクターを導入すること、宿主細胞を、ＭＨＣ複合体の発現に適切な条件下で培養すること；及び融合複合体を発現する宿主細胞を精製すること、を含む方法。３９．宿主細胞が、細胞表面上の１つ以上のＴ細胞同時刺激因子を欠いている、請求項３８記載の方法。４０．Ｔ細胞同時刺激因子及び請求項３３記載の融合複合体を発現する宿主細胞の選択方法であって：宿主細胞中に、クローニングベクターであって、そのベクターがそれぞれＴ細胞同時刺激因子及び請求項３３記載の融合複合体を独立に又は一緒にコードするＤＮＡ構築物を含有するクローニングベクターを導入すること、宿主細胞を、Ｔ細胞同時刺激因子と融合複合体の両方を発現する条件下で培養すること；そしてＴ細胞同時刺激因子と融合複合体の両方を発現する宿主細胞を精製すること、を含む方法。４１．請求項３８又は３９記載の方法により産生される宿主細胞。４２．請求項４０記載の方法により産生される宿主細胞。４３．有効量の請求項４１記載の宿主細胞を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫応答の抑制方法。４４．有効量の請求項４２記載の細胞を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫応答の誘導方法。４５．哺乳動物が、自己免疫疾患又は慢性アレルギーに罹患しているか、又は罹患しやすい、請求項２９又は４３記載の方法。４６．自己免疫疾患が、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、インスリン依存性糖尿病のいずれかである、請求項４５記載の方法。４７．哺乳動物が、免疫無防備状態であるか、又はそうなりやすい、請求項４４記載の方法。４８．免疫無防備状態の哺乳動物が、ウイルス感染又は化学療法に曝露されてきている、請求項４７記載の方法。４９．請求項３又は２６記載のＭＨＣクラスII複合体をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、ここで、導入遺伝子が哺乳動物遺伝子プロモーターの転写制御下にあるトランスジェニック非ヒト動物。５０．動物における導入遺伝子の発現がＴ細胞の活性を調節する、請求項４９記載の動物。５１．Ｔ細胞がヘルパーＴ細胞である、請求項４９記載の動物。５２．Ｔ細胞を請求項７記載のＭＨＣ複合体と接触させることを含む、Ｔ細胞の誘導方法。