JP2000515367A - シグナル増幅法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 分析物の存在又は不存在を試料中で検出するための方法を開示する。さらに本発明の分析方法を行うためのキットも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 シグナル増幅法発明の背景 免疫検定法（例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ））などの生化学検 定法や、検査試料中の核酸配列を検出する方法が公知である。このような検定法 では、その検定で少量の標的分析物を検出できるかどうかには感受性が高いこと が重要である。このような検定法では放射線による方法及び比色法がしばしば用 いられてきた。しかしながら、高い感受性の達成は必ずしも可能ではなく、この ような検査の感受性を向上させる方法が望まれている。 核酸配列及び抗原（又は抗体）を含む分析物を検出するための方法で報告さ れているものの一つ（ヨーロッパ特許公報ＥＰ１２８３３２号）は、分析物と、 検出可能なシグナルを出す「シグナリング成分」との間を架橋する「架橋成分」 を利用する方法である。この架橋成分には、分析物特異領域及びシグナリング成 分特異領域が含まれている。この方法の長所は、標的の分析物に応じて架橋成分 を変更することで、様々な分析物の検出に同じシグナリング成分を利用できると いう点である。しかしながら、この架橋成分の調製にはかなり長時間を要し、ま た非効率的でもある。さらに（例えば長いポリヌクレオチド配列など）大型の架 橋成分では、標的に結合しない大きな部分が存在するために、標的分析物を検出 する上での感受性が低いことがある。加えてこの方法では、分析物特異領域とシ グナリング成分特異領域とがその架橋成分において別々のものである必要がある 。 もう一つの公報（パンディアン氏らの米国特許第５，６２７，０３０号）は、 標的の核酸配列を検出する第一プローブと、この第一プローブに対して相補の第 一領域、及び、複数の標識付プローブに結合させるための繰り返し配列を含んだ 第二領域、という二つの領域を含む核酸配列である「増幅プローブ」とを利用す ることを説いた方法である。この増幅プローブにより、複数の標識付プローブを 各第一プローブに結合させることが可能となり、試料中の標的分子への第一プロ ーブの結合で生じたシグナルを増幅することができる。しかしながら、この増幅 プローブの構築は面倒なことが多い。本発明の概要 本発明は、生化学検定における増幅のための方法及び組成物又はシグナルの増 幅に関するものである。具体的には、本発明は特異結合対の結合に係る生化学検 定における感受性を向上させるために用いることのできる方法及び組成物を提供 するものである。 ある態様では、本発明は、分析物（例えば抗原又は核酸）又は分析物検出成分 （例えば抗体、核酸プローブ、等々）と、検出可能な標識を含む複数のシグナリ ング成分との両方に結合することのできる増幅用実体（ここではポリマー増幅成 分（ＰＡＭ）とも呼ぶ）を提供する。複数のシグナリング成分に結合することで 、このＰＡＭは分析物の存在下で生じたシグナルを増幅し、試料中の分析物の存 在又は不存在を検出する。 別の態様では、本発明は、検定系におけるシグナルを増幅する方法を提供する ものである。本方法は、分析物に特異的に結合する第一部分と、ポリヌクレオチ ド配列を含む第二部分とを有する試薬に試料を接触させて前記分析物と試薬との 錯体を形成させるステップと、前記分析物及び試薬の錯体を、第一ポリヌクレオ チド配列及び第二ポリヌクレオチド配列を有する増幅用実体に接触させるステッ プであって、前記第一ポリヌクレオチド配列が前記試薬の第二部分のポリヌクレ オチド配列に相補であることで、前記分析物、前記試薬及び前記増幅用実体の錯 体が形成される、ステップと、前記分析物、前記試薬、及び前記増幅用実体の錯 体を、複数のシグナリング成分に接触させるステップであって、前記シグナリン グ成分はそれぞれ、検出可能な標識と、前記増幅用実体の第二ポリヌクレオチド 配列に相補のポリヌクレオチド配列とを含むため、前記分析物、前記試薬、前記 増幅ポリヌクレオチド及び前記シグナリング成分の検出可能な錯体が形成される 、ステップと、前記標識を試料中における分析物の存在又は不存在の指標として 検出するステップとを含む。 分析物は核酸配列でもよく、試薬の第一部分は、前記分析物に概ね相補の核酸 配列でもよく、また分析物は抗体又は抗原でもよく、試薬の第一部分は分析物に 特異的に結合する抗体又は抗原でもよく、増幅用実体の第一ポリヌクレオチド配 列及び第二ポリヌクレオチド配列は同じ又は概ね同じ配列を含むものでもよい。 いくつかの実施例では、増幅用実体はホモポリヌクレオチドであるが、このホモ ポリヌクレオチドはpoly(dA)を含んでいてもよく、このpoly(dA)は少なくとも約 ３０００塩基の長さのものでもよく、試薬の第二部分はpoly(dT)を含んでいても よく、シグナリング成分の各々はpoly(dT)を含み、またシグナリング成分の各々 は、抗原、抗体、酵素、放射性同位元素及び蛍光成分のいずれかから選択される 検出可能な標識を含んでいてもよい。いくつかの実施例では、分析物、試薬及び 増幅用実体の錯体を複数のシグナリング成分に接触させるステップの前に、本方 法にはさらに、前記分析物、試薬及び増幅用実体の錯体を洗浄して未結合のポリ ヌクレオチドを除去するステップが含まれる。好適な実施例では、分析物は固定 化された捕獲試薬を用いて固定化される。 別の実施例では、本発明は分析物の存在又は不存在を試料中で検出する方法を 提供するものであるが、この方法は、分析物に特異的に結合する第一部分と、ホ モポリヌクレオチド配列を含む第二部分とを有する試薬に試料を接触させて前記 分析物と試薬との錯体を形成させるステップと、前記分析物及び試薬の錯体を、 前記試薬のホモポリヌクレオチド配列に相補のホモポリヌクレオチド鎖に接触さ せて前記分析物、前記試薬及び前記ホモポリヌクレオチドの錯体を形成させるス テップと、前記分析物、前記試薬及び前記ホモポリヌクレオチドの錯体を複数の シグナリング成分に接触させるステップであって、前記シグナリング成分はそれ ぞれ、検出可能な標識と、ホモポリヌクレオチド鎖に相補のホモポリヌクレオチ ド配列とを含むため、前記分析物、前記試薬、前記ホモポリヌクレオチド鎖及び 前記シグナリング成分の検出可能な錯体が形成される、ステップと、前記標識を 試料中における分析物の存在又は不存在の指標として検出するステップとを含む 。 いくつかの実施例では、このホモポリヌクレオチド鎖はpoly(dA)であり、試薬 の第二部分及びシグナリング成分はpoly(dT)又はpoly(dU)を含むものである。 さらに別の態様では、本発明は分析物の存在又は不存在を試料中で検出する方 法を提供するものであるが、この方法は、分析物に特異的に結合する第一部分と 、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分とを有する第一試薬に試料を接触させて 前記分析物と前記第一試薬との錯体を形成させるステップと、前記分析物及び第 一試薬の錯体を、第一ポリヌクレオチド配列及び第二ポリヌクレオチド配列を有 す る増幅用実体に接触させるステップであって、前記第一ポリヌクレオチド配列が 前記第一試薬の第二部分のポリヌクレオチド配列に相補であるため、前記分析物 、前記第一試薬及び前記増幅用実体の錯体が形成される、ステップと、前記分析 物、第一試薬及び増幅用実体の前記錯体を第二試薬に接触させるステップであっ て、前記第二試薬は、前記増幅成分の第二ポリヌクレオチド配列に相補のポリヌ クレオチド配列を含む第一部分と、第二部分とを有するため、前記分析物、前記 第一試薬、前記増幅用実体及び前記第二試薬の延長可能な錯体が形成される、ス テップと、前記延長可能な錯体を延長用試薬に接触させるステップであって、前 記延長用試薬は、前記増幅用実体の第二部分に特異的に結合することのできる第 一部分と、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分とを含むため、前記延長用試薬 が前記延長可能な錯体に結合して前記分析物、前記第一試薬、前記増幅用実体、 及び前記延長用試薬の錯体が形成される、ステップと、前記分析物、前記第一試 薬、前記増幅用実体及び前記延長用試薬の錯体を複数のシグナリング成分に接触 させるステップであって、前記シグナリング成分の各々は検出可能な標識と、前 記延長用試薬のポリヌクレオチド配列に相補なポリヌクレオチド配列とを含むた め、前記分析物、前記試薬、前記増幅ポリヌクレオチド、前記延長用試薬及前記 シグナリング成分の検出可能な錯体が形成される、ステップと、前記標識を、分 析物の存在又は不存在の指標として前記試料中で検出するステップとを含む。 いくつかの実施例では、延長用試薬の第二部分はホモポリヌクレオチドを含み 、延長用試薬の第二部分はpoly(dC)を含み、シグナリング成分のポリヌクレオチ ド配列はpoly(dG)を含み、検出可能な標識は抗原、抗体、酵素、放射性同位元素 及び蛍光成分のいずれかから選択される。 別の態様では、本発明は分析物の存在又は不存在を試料中で検出するためのキ ットを提供するものである。当該キットには、分析物に特異的に結合する第一部 分と、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分とを有する試薬を含む容器と、第一 ポリヌクレオチド配列及び第二ポリヌクレオチド配列を有する増幅用実体を含む 容器であって、前記第一ポリヌクレオチド配列は前記試薬の第二部分のポリヌク レオチド配列に相補である、容器と、それぞれが検出可能な標識と、前記増幅用 実体の第二ポリヌクレオチド配列に対して相補なポリヌクレオチド配列とを含む 複数のシグナリング成分を含む容器と、分析物の存在又は不存在を試料中で検出 する際の指示書とが含まれる。 好適な実施例では、増幅用実体はホモポリヌクレオチドであるが、このホモポ リヌクレオチドにはpoly(dA)が含まれていてもよく、またこのpoly(dA)は少なく とも約３０００塩基の長さのものでもよく、試薬の第二部分はpoly(dT)を含んで いてもよい。いくつかの実施例では、当該キットにはさらに分析物特異的捕獲試 薬の容器が含まれ、分析物特異的捕獲試薬は固体の担体上に固定化されていても よい。 別の態様では、本発明は、分析物を検出するための検出可能な錯体を提供する ものであり、当該錯体は、分析物に結合した試薬であって分析物に特異的に結合 する第一部分とポリヌクレオチド配列を含む第二部分とを有する試薬と、前記試 薬に結合した増幅用実体であって、第一ポリヌクレオチド配列及び第二ポリヌク レオチド配列を有し、前記第一ポリヌクレオチド配列は前記試薬の第二部分のポ リヌクレオチド配列に相補である、増幅用実体と、前記増幅用実体に結合してい ると共に各々が検出可能な標識と前記増幅用実体の第二ポリヌクレオチド配列に 相補なポリヌクレオチド配列とを含むものである複数のシグナリング成分とを含 む。前記検出可能な錯体にはさらに、固体の担体に結合した分析物特異的捕獲試 薬が含まれていてもよいが、この捕獲試薬はさらに分析物にも結合したものであ る。好適な実施例では、分析物は抗原又は核酸でよい。 さらに別の態様では、本発明は、少なくとも約３０００塩基の長さ、より好ま しくは少なくとも約７０００塩基の長さの分離かつ精製された一本鎖のホモポリ ヌクレオチドを提供する。好適な実施例では、当該ホモポリヌクレオチドはpoly (dA)、poly(dT)、poly(dC)、poly(dG)、及びpoly(dU)のいずれかから選択される 。 本発明による方法及び組成物においては、ＰＡＭは分析物検出成分と複数のシ グナリング成分とに結合することができる。本発明は、少なくとも部分的に、Ｐ ＡＭにおいて分析物検出成分を認識する部分と、シグナリング成分を検出する部 分とが同じであってもよいという発見に基づくものである。この発見により、Ｐ ＡＭの簡略化された合成及び利用が可能となったため、適した検定系を提供する のに必要な時間及び費用を削減することができる。さらに、本発明による簡略化 されたＰＡＭを構築することで、これまで考えられたよりも数多くのシグナリン グ成分の結合を可能にすることができる。図面の簡単な説明 図１は、本発明の方法による分析物検出の概要図である。 図２は、本発明による検出方法のもう一つの実施例の図である。 図３は、第二の増幅子を用いた、本発明による検出方法のまた別の実施例の図 である。 図４は、核酸配列の本発明による検出方法と直接的検出とを比較した棒グラフ である。 図５は、本発明によるシグナル増幅を用いたＥＬＩＳＡの図である。 図６は、本発明によるＨＩＶｐ２４検定の結果をグラフで示した図である。発明の詳細な説明 本発明は、結合検定におけるシグナルを増幅するための方法及び組成物を提供 するものである。 本発明の方法及び組成物は、ある特異結合対の一員である分析物を、その特異 結合対のもう一方の一員の結合により検出する検定法において有用である。特異 結合対は当業において公知であるが、その中には、抗体−抗原、ホルモン−レセ プタ、結合リガンド−基質、レクチン−糖、酵素−阻害物質、等々といった対が ある。ここで用いられる「検出」という術語には、分析物の試料中における存在 又は不存在の判定及び／又は試料中の分析物の量の定量を含めることができる。 本発明による増幅用実体（又はポリマ増幅成分（ＰＡＭ））は、（ｉ）分析物 又は分析物結合成分及び（ｉｉ）複数のシグナリング成分、に結合することがで きれば、いかなる成分であってもよい。例えば、好適な実施例では、ＰＡＭはポ リヌクレオチド、より好ましくはホモポリヌクレオチド、好ましくはpoly(A)、 又はより好ましくはpoly(dA)である。poly(dA)は分析物又は分析物結合成分の相 補配列や、複数のシグナリング成分の相補配列に結合することができる。例えば 、 poly(dA)はpoly(dT)、poly(dU)、を含む配列や、dT及びdUのポリマを含む配列に 結合することができる。別の実施例では、ＰＡＭはポリサッカリド、ポリペプチ ドや、分析物又は分析物結合成分と複数のシグナリング成分とに結合することの できるその他のポリマでもよい。ＰＡＭはまた、例えばたんぱく質−核酸の結合 体、等々の混成分子でもよい。 シグナリング成分は、増幅用実体に結合することができると共に、シグナルを 発生できる部分か、又はシグナルを発生できる成分に結合できる又は相互作用で きる部分を含んだものであれば、いかなる分子的実体でもよい。適したシグナリ ング成分は当業において公知の方法に基づいて調製が可能であり、また予め選択 された増幅用実体に結合するよう調製することができる。シグナリング成分には 検出可能な標識を含めることができる。標識を提供する場合は、この標識は例え ば放射性核種、酵素（例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）又は西洋ワサビペ ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など）、抗体、抗原（例えばＦＩＴＣなど）、特異結 合対の一員（例えばピオチン／ストレプトアビジン）、蛍光成分、染料、等々と することができる。代表的な実施例では、増幅用実体がpoly(dA)であれば、適し たシグナリング成分は標識付けしたpoly(dT)、例えばＦＩＴＣ−ｄＴ₁₅（ＦＩＴ Ｃ＝フルオレセインイソチオシアネート）であろう。この例示した実施例では、 シグナリング成分のpoly(dT)部分は、例えばpoly(dA)などの増幅用実体に結合さ せることができ、一方、シグナリング成分のＦＩＴＣ部分は、例えば抗−ＦＩＴ Ｃ／アルカリホスファターゼ結合体に結合させることができる。この抗−ＦＩＴ Ｃ／アルカリホスファターゼ結合体は、当業において通常の技術にあるように、 その酵素に対する適切な基質との反応により比色シグナルを生じることができる 。 複数のシグナリング成分を各ＰＡＭに結合させるのに用いられるが、このシグ ナリング成分は同じでも、あるいは異なっていてもよい。例えばＰＡＭがpoly(d A)であれば、複数の、例えばＦＩＴＣ−ｄＴ₁₅成分を、poly(dA)の各鎖に結合さ せるのに用いることができ、そのシグナルは、基質と反応して着色生成物を生じ ることのできる抗−ＦＩＴＣ−アルカリホスファターゼ結合体を利用することで 検出することができる。あるいはその代わりに、ＦＩＴＣ−ｄＴ₁₅シグナリング 成分を³²Ｐ−ｄＴ成分と共に用いることができるかも知れない。こうして両方の シ グナリング成分をpoly(dA)の鎖に結合させれば、比色法及び放射性同位元素法の 両方の検出形態をとることができるであろう。 好適なＰＡＭは、少なくとも二つの非重複性核酸配列（それぞれをここでは「 副配列と呼ぶこととする」を含む一本鎖のポリヌクレオチド配列である。少なく とも二つの非重複性核酸配列を有するポリヌクレオチドをここでは「反復ポリヌ クレオチド」（ＲＰ）と呼ぶこととする。副配列それ自体が繰返し単位を含んで いたり、あるいはホモポリヌクレオチド配列であってもよいことは理解されよう 。ＲＰには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡの混合、又は核酸類似体あるい はホスホロチオエート（原語：phosphorothioate）及びペプチド核酸（ＰＮＡ） を含む同種を含めてもよい。ＲＰは二つの核酸配列（副配列）を有していてもよ いが、より好ましくは、少なくとも、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、 １００、２００、３００、５００、７００、１０００、２０００、５０００、又 は１０，０００個の非重複性の副配列が含まれているとよい。好適な実施例では 、ＲＰの全長は、少なくとも約３０塩基の長さであるが、より好ましくは少なく とも約５０塩基、より好ましくは少なくとも約１００塩基、より好ましくは少な くとも約５００塩基、より好ましくは少なくとも約１０００塩基、そして最も好 ましくは少なくとも約５０００塩基の長さであるとよい。いくつかの実施例では 、ＲＰの長さは約１０，０００塩基未満、約５０００塩基未満、約１０００塩基 未満、又は約５００塩基未満である。 相補のポリヌクレオチド配列は、洗浄、検出、等々にまつわる緊縮条件下で安 定的に雑種形成が行われるよう、充分な長さのものでなくてはならず、例えばあ る副配列のその補体への結合は、正常な洗浄等々により、大きく分断されること があってはならない。例えば、試薬第二部分のポリヌクレオチド配列は、洗浄条 件下で増幅用実体の第一ポリヌクレオチド配列に対して安定的に混成するよう充 分な長さのものでなくてはならず、増幅用実体の第二ポリヌクレオチド配列に相 補のシグナリング成分のポリヌクレオチド配列は、増幅用実体の第二ポリヌクレ オチド配列に安定的に混成するよう充分な長さのものでなくてはならない。この ように、好適な実施例では、副配列は少なくとも約６塩基の長さ、より好ましく は少なくとも約１０塩基の長さ、少なくとも約１５塩基の長さ、少なくとも約２ ０塩基の長さ、少なくとも約２５塩基の長さ、少なくとも約３０塩基の長さ、少 なくとも約５０塩基の長さ、又は少なくとも約１００塩基の長さである。好適な 実施例では、増幅用実体は線形の（環状でない）ポリヌクレオチド配列である。 ＲＰには、（二つ以上の副配列が互いに隣接している）「隣接」副配列、（少 なくとも一つの塩基が副配列同士の間に介在している「非隣接」副配列、又は隣 接副配列及び非隣接副配列の組合せが含まれていてもよい。例えば、（少なくと も６つの塩基の長さの）ある副配列をＸで表すとすると、この副配列を含むＲＰ がＸ−Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｚ−Ｘで表され、ただしＹ及びＺは副配列Ｘを含まない塩基 又は配列、とすることができる場合があるかも知れない。この例示的なＲＰには 、（Ｘ−Ｘと表される）隣接副配列と（例えばＸ−Ｚ−Ｘなど、配列部分Ｚが二 つの副配列を分離している）非隣接副配列の両方が含まれている。いくつかの実 施例では隣接副配列が好ましいが、それはなぜなら、関係のない塩基がこのＲＰ ではより少ないからである。特に好適な実施例では、ＲＰが、非隣接副配列又は 非副配列領域を概ねまったく持たずに、隣接副配列を含んでいるとよい。 副配列は、例えばＲＰの調製が容易であること、副配列に対する補体（例えば 標識付けされたシグナリング成分又はプローブ）の調製が容易であること、等々 といった因子に基づいて選択してよい。ＲＰには、好ましくは、例えばループな どの二次的な構造を形成しかねない自己相補性の領域が含まれていないとよいが 、それは、このような二次的な構造の形成が、分析物又はシグナリング成分に混 成しようとするＲＰの能力に干渉するかも知れないからである。ＲＰには、繰り 返される配列が一つ以上含まれていてもよい（即ち一種以上の副配列が含まれて いてもよい）ことは理解されよう。このように、ＲＰは、Ｘ及びＹを異なる核酸 副配列とすると、構造Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙを有するものとなることもあろう 。 ここでの説明から、好適な増幅用実体は、分析物特異的試薬のポリヌクレオチ ド部分に相補の第一ポリヌクレオチド配列と、シグナリング成分のポリヌクレオ チド部分に相補の第二ポリヌクレオチド配列とを含むものであることが理解され よう。特に好適な実施例では、この増幅用実体の第一及び第二ポリヌクレオチド 配列は同じ又は概ね同じ配列を含むものである。ある好適な実施例では、この増 幅用実体の第一及び第二ポリヌクレオチド配列のそれぞれの長さは、少なくとも 約６塩基、より好ましくは少なくとも約１２塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩 基、又は３５塩基である。この結果は、ホモポリヌクレオチドを増幅用実体とし て用いることで達成が可能である。ホモポリヌクレオチドは、両方とも同じホモ ポリヌクレオチド配列を含んだ二つの部分Ｃ及びＤを含むものとして見ることが できるものである。このように、特に好適な増幅用成分はホモポリヌクレオチド 配列、即ち、一個のヌクレオチド塩基から成るヌクレオチド配列をＮとすると、 ｎ個の塩基を有するホモポリヌクレオチド配列はＮ_nで表され、このとき_nは６か ら１０，０００までの整数である。長さ１００のホモポリヌクレオチドは、長さ ５０の副配列を２個、長さ２５の副配列を４個、等々、を含むことは理解されよ う。その他のホモポリヌクレオチド配列も同様にホモポリヌクレオチドの副配列 を含むこととなろう。このように、ホモポリヌクレオチドは、シグナリング成分 又は分析物に結合しない無関係の塩基を伴うことなく、（複数のシグナリング成 分に結合させるのに）複数の副配列を利用できるため、効率的な増幅用実体とな る。 以下に詳述するように、ホモポリヌクレオチドを含む増幅用実体は、市販のも のを入手でき、及び／又は、研究室で容易に調製することができる。好適な増幅 用実体には、ｄＡ_n、ｄＴ_n、ｄＣ_n、ｄＧ_n、ｄＵ_nがあるが、ただしこのｄＡ、 ｄＴ、ｄＣ、ｄＧ、及びｄＵはデオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキ シシトシン、デオキシグアニン、及びデオキシウラシルをそれぞれ表し、ｎは１ ００を越える、好ましくは５００を越える整数、より好ましくは少なくとも約１ ０００、より好ましくは少なくとも約３０００、より好ましくは少なくとも約５ ０００、より好ましくは少なくとも約７０００、そしてさらにより好ましくは９ ０００を越える整数である。 本発明によれば、ＰＡＭ（例えばホモポリヌクレオチドなどの増幅用実体）及 びシグナリング成分の選択は、少なくとも二つのシグナリング成分が、例えば、 ｉ）分析物分子と（直接又は分析物特異的試薬を介して）錯体形成していないＰ ＡＭ、及び／又は、ｉｉ）未結合のシグナリング成分を洗浄除去後に、ＰＡＭの 各鎖に結合できるように、なされる。好適な実施例では、増幅用実体の各鎖に結 合させるシグナリング成分の数は少なくとも約５、より好ましくは少なくとも約 １０、より好ましくは少なくとも約２０、５０、１００、２００、３００、５０ ０、１０００又は２０００である。 理論に縛られることを望むわけではないが、核酸がそれに相補の配列に結合で きる能力は、その核酸の鎖の大きさの影響を受けることがあると考えられる。さ らに、このような影響は、標的の（分析物）配列に対して相補ではない長い区域 を含んだ従来の核酸プローブの感受性を減じかねないと考えられる。このような 非相補性の配列は、あるプローブがその標的に対して感受性高くかつ選択的に結 合する能力を低下させ得ると考えられる。本発明は、分析物結合試薬が分析物に 結合する能力がＰＡＭにより著しく損なわれない増幅系を提供するものである。 このように、本発明の方法は、高い分析物特異性及び感受性を維持しながらも、 発生したシグナルを大きく増幅するものである。Ｉ．方法 ある態様では、本発明は、分析物の存在又は不存在を試料中に検出するための 方法を提供するものである。分析物は、例えば（例えばＤＮＡ配列又はＲＮＡ配 列などの）核酸配列でも、又は抗体／抗原、ホルモン／レセプタ、等々といった 特異結合対の一員でもよい。試料は、とりわけ、例えば組織生検などの生物学的 試料や、血液、尿、精液、唾液、等々などの生物学的流体の試料であってよい。 概略的には、本発明の方法は、分析物に特異的に結合する第一部分と、ポリヌク レオチド配列を含む第二部分とを有する試薬に試料を接触させて前記分析物と試 薬との錯体を形成させるステップと、前記分析物及び試薬の錯体を、第一ポリヌ クレオチド配列及び第二ポリヌクレオチド配列を有する増幅用実体に接触させる ステップであって、前記第一ポリヌクレオチド配列が前記試薬の第二部分のポリ ヌクレオチド配列に相補であることで、前記分析物、前記試薬及び前記増幅用実 体の錯体が形成される、ステップと、前記分析物、前記試薬、及び前記増幅用実 体の錯体を、複数のシグナリング成分に接触させるステップであって、前記シグ ナリング成分はそれぞれ、検出可能な標識と、前記増幅用実体の第二ポリヌクレ オチド配列に相補のポリヌクレオチド配列とを含むため、前記分析物、前記試薬 、前記増幅ポリヌクレオチド及び前記シグナリング成分の検出可能な錯体が形成 さ れる、ステップと、前記標識を試料中における分析物の存在又は不存在の指標と して検出するステップとを含む。この実施例を図１に示す。図１に示すように、 分析物１０（図１では核酸として示すが、これは固体の担体１４に結合させた捕 獲試薬１２（例えば相補のプローブ）で固定化してもよい）を、分析物結合第一 部分２２と、増幅用実体３０の第一ポリヌクレオチド配列に相補のポリヌクレオ チド配列を含む第二部分２４とを含む試薬２０に接触させる。増幅用実体には、 試薬の第二部分のポリヌクレオチド配列に相補の第一ポリヌクレオチド配列と、 第二ポリヌクレオチド配列とが含まれる。複数のシグナリング成分３４（検出可 能な標識部分３６を含む）と、増幅用実体３０の第二ポリヌクレオチド配列に相 補のポリヌクレオチド配列とで、試料中の分析物１０の存在の指標となるシグナ ルを提供する。 試薬は、分析物に選択的に結合することのできる第一部分を有するように選択 される。分析物が核酸である場合は、この選択的な結合部分は、例えば、分析物 の少なくとも一部分に相補の核酸配列や、分析物配列に選択的に結合する核酸結 合たんぱく質や、分析物の核酸配列に選択的に結合する抗体、等々、とすること ができる。分析物が例えば抗原である場合は、試薬の第一部分はその抗原に結合 する抗体とすることができる。分析物が抗体である場合は、試薬の第一部分はそ の抗体が結合する抗原とすることができ、あるいはこの試薬の第一部分を抗−分 析物抗体とすることができる。分析物がホルモンであれば、試薬の第一部分はそ のホルモンのレセプタでよい。試薬の選択的結合部分のその他の例は当業者には 明らかであろう。 試薬の選択的結合第一部分は、増幅用実体のポリヌクレオチド配列に相補のポ リヌクレオチド配列を含む第二部分に共有結合する。この第二部分は、例えば通 常の化学的又は生化学的ヌクレオチド合成法により、増幅用実体に対して相補と なるよう、容易に調製することができる。試薬の第一部分を試薬の第二部分に共 有的に連結する方法もまた、当業者には通常の技術範囲である。例えば、たんぱ く質（例えば抗体）は核酸に対し、二官能性の連結試薬（例えば下記の実施例３ を参照されたい）を利用して連結することができる。同様に、（核酸分析物に相 補の）核酸は、通常の化学的又は生化学的方法により、増幅用実体に相補の核酸 に共有結合させることができる。例えば、分析物特異プローブ（Ａ）をまず合成 し、増幅用実体に相補のポリヌクレオチド配列（Ｂ）を次に合成し、そこでこの Ａ部分をＢ部分に結紮して（例えば化学合成又はリガーゼなどの酵素を用いた結 紮法により）試薬を形成させることができる。あるいはその代わりに、試薬を、 例えば自動化ヌクレオチド合成器を用いるなどして一本鎖として合成してもよい かも知れない。試薬は、増幅用実体に相補の部分を複数有していてもよい（即ち Ａを第一部分、Ｂを増幅用実体に相補のポリヌクレオチド配列、_nを２以上の整 数とするとＡ−（Ｂ）ｎの式で表すことができる）ことは理解されよう。例えば 、下記の実施例３で調製する抗体−核酸結合体試薬は、抗体一部分当り、二つ以 上の核酸の「尾」を有していてもよい。このような試薬は、複数の増幅用実体に 結合することでシグナル成分の結合部位をさらに提供できるため、シグナルをさ らに増強できるものである。 分析物結合試薬は、一般的には、分析物対試薬の錯体の形成が可能であるよう な条件下で分析物に接触させることとなろう。このように、例えば、核酸分析物 の混成を確実に起こさせるためには適した緊縮条件が用いられ、分析物が抗原で ある場合には、抗体を抗原に結合させるのに適した条件が用いられることとなろ う。所望に応じて、分析物対試薬の錯体を洗浄して、例えば不純物や試料のその 他の構成要素や、余分な試薬、等々といった不純物を除去してもよい。洗浄ステ ップを利用する場合、分析物対試薬の錯体が大きく解離しないよう、洗浄の条件 に注意しなければならない。 いくつかの実施例では、洗浄プロセスを容易にするためには分析物を固体の担 体に固定化することが好ましい。このように、例えば核酸分析物はニトロセルロ ースのフィルタ上に固定したり、又は、例えばＰＣＴ公報ＰＣＴ／ＵＳ９６／１ ３５４６号に述べられたようなヘアピン捕獲成分など、固定化した捕獲成分に混 成させることで固定化することができる。ヘアピン捕獲成分は、分析物特異的試 薬を結合させる（試薬第一が標的に対して相補の配列である）標的配列の領域に 隣接する標的核酸配列の一領域に結合する（相補である）よう、選択することが 可能である。この構成の利点は、ヘアピンに結合した標的に試薬を結合させるこ とで、このヘアピンと試薬の第一部分のポリヌクレオチド配列との間で塩基が重 なり合う相互作用が起きることとなるが、これを、不適合を識別するための更な る方法とできる点である。分析物が抗原である場合は、当業において公知の方法 により固定化することができる。例えば、この抗原に結合する、（固体の担体に 結合させた）固定化した抗体を利用してこの抗原を固定化することができる。 分析物対試薬の錯体を形成させた後（そして選択に応じて洗浄して不純物を除 去した後）、この分析物対試薬の錯体を増幅用実体に接触させて、分析物対試薬 対増幅用実体の錯体を形成させる。上述したように、この接触ステップは、分析 物対試薬対増幅用実体の錯体が確実に形成されるような条件下で、かつ充分な時 間、行われねばならないが、これを換言すれば、分析物対試薬の錯体を増幅用実 体に確実に混成させるには、適切な緊縮条件が用いられることになるということ である。分析物対試薬対増幅用実体の錯体が形成されたら、これを洗浄して不純 物、余分な試薬、等々を除去することが、上述したように好ましい。 本方法には、さらに、分析物対試薬対増幅用実体の錯体を、複数の検出可能に 標識付けされたＲＰ相補のシグナリング成分に接触させることで、分析物の存在 又は不存在が試料中で検出されるような検出可能な錯体を形成させるステップを 含む。この「検出可能な錯体」という術語は、分析物、上述した試薬、増幅用実 体、及び検出可能に標識付けされたシグナリング成分の錯体を言う。このシグナ リング成分には、増幅用実体の第二ポリヌクレオチド配列に相補のポリヌクレオ チド配列が含まれる。検出可能に標識付けされた成分は、直接又は間接的のいず れで検出されてもよい。例えば、放射性同位元素は検出可能な標識であるが、こ れは例えばシンチレーション計数又はＸ線フィルム、等々により検出が可能であ る。その他の検出可能な標識には、例えば上述したような標識がある。「複数の 」シグナリング成分には、一個のシグナリング成分が二つ以上含まれていること を含めてもよく、あるいは、複数の異なるシグナリング成分を含めてもよい。例 えば、構造Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ（ただしＸ及びＹは異なる配列）を有する増 幅用実体を、Ｘ_cがＸに相補の配列を表し、＊が検出可能な標識を表すとしたと きの式Ｘ_c＊で表される、複数のシグナリング成分に接触させてもよく、又はＲ Ｐを、Ｙ_cがＹに相補の配列を表し、＊が検出可能な標識を表すとしたときの式 Ｙ_c＊で表される、複数のシグナリング成分に接触させてもよく、あるいはＲＰ を、Ｘ_c＊及 びＹ_c＊の混合を含む複数のシグナリング成分に接触させてもよいかも知れない 。 ここで説明するように、検出可能な錯体（試料中に分析物が存在するためにこ のようなものが形成された場合）は、シグナリング成分上の標識を検出すること で検出が可能である。ある好適な実施例では、検出可能な錯体を洗浄して不純物 、未結合のシグナリング成分、等々を除去して検出プロセスのバックグラウンド ノイズを低減させる。 ある好適な実施例では、増幅用実体はpoly(dA)であり、シグナリング成分の各 々はpoly(dT)又はpoly(dU)、好ましくはｄＴ_m又はｄＵ_mを含み、ただしこのとき の_mは１５から３５までの整数、より好ましくは約２５である。この実施例では 分析物結合試薬の第二部分には好ましくは、poly(dA)増幅用実体が結合できるよ うなpoly(dT)の「尾」が含まれているとよい。 当業者であれば、分析物対試薬対増幅用実体の錯体に結合したシグナリング成 分が複数存在することで、（増幅用実体に複数のシグナリング成分結合部位があ るために）、単一のシグナル成分（又は検出可能な標識）を各分析物分子に結合 させる方法に比較して、シグナルを増幅することができることは理解されよう。 このように、本発明による方法は、数多くの従来の方法に比較して増幅されたシ グナルを提供するものである。好適な実施例では、シグナル、又はシグナル対ノ イズの比は、少なくとも２の因数、より好ましくは少なくとも約５、１０、２０ 、５０、１００、２００、５００、又は１０００の因数で増強される。好適な実 施例では、本発明の方法は、同じ検出可能な標識を用いつつ増幅のない検定法の 少なくとも２、５、１０、５０、１００、５００、１０００又は５０００倍の感 受性を持つ方法を提供するものである。 加えて、シグナリング成分の結合部位をさらに提供することでシグナルをさら に増幅できることは理解されよう。このような結果は、シグナリング成分により 数多くの結合部位を提供する増幅用実体をさらに（第二、第三、等々）用いて（ 第一の）増幅用実体を「延長」することで達成が可能である。例えば、図２に示 すように、分析物対試薬対（第一の）増幅用実体の錯体４０（このとき分析物１ ０は抗原として示され、この抗原は試薬２０の抗体第一部分２２で認識される） を、（第一の）増幅用実体に相補のポリヌクレオチド配列を含む第一部分３２だ けで なく、複数のシグナリング成分が結合可能なポリヌクレオチド部分を含む第二部 分３３を含む延長用試薬３１に接触させることができる。この延長用試薬の第二 部分３３には、増幅用実体の第二部分と同じポリヌクレオチド配列を含めてもよ いが、好ましくは違えてもよい。錯体４０に延長用試薬３１が結合すると、「延 長された」錯体が形成される。この「延長された」錯体を、次に、検出可能な標 識と、延長用試薬３１の第二部分に相補のポリヌクレオチド配列とを含んだ複数 のシグナリング成分３４に接触させて、分析物を検出することができる。poly(d A)の増幅用実体３０への利用に適した試薬３１の一例は、(下記の実施例１で述 べるように調製された)poly(dT)−poly(dC)鎖であるが、このpoly(dT)部分はpol y(dA)鎖に結合し、一方、poly(dC)部分は、例えば(dG)₁₄−ＦＩＴＣなど、複数 のシグナリング成分が結合できる第二のＲＰとして機能する。 シグナリング成分の更なる結合部位は、図３に示すように提供することができ るが、この図において分析物１０は、捕獲試薬１２（例えば結合抗体）により固 体の担体１４上に固定化された抗原として描かれている。分析物を分析物相補性 の試薬に接触させて分析物対試薬の錯体を形成させるステップ、及び、この分析 物対試薬の錯体を第一の増幅用実体に接触させて分析物対試薬対第一の増幅用実 体の錯体を形成させるステップは、例えば上述したように行うことができる。図 ３では、分析物対試薬対第一の増幅用実体４０を二官能性の試薬５０に接触させ ている。二官能性の試薬５０は、第一の増幅用実体の第二ポリヌクレオチド配列 に相補のポリヌクレオチド配列を含む第一部分と、延長用試薬６０により特異的 に認識され、かつ結合される第二部分５２とを含む。第二部分５２の一例は、例 えばここで述べたような特異結合対の一員である。好適な部分５２はビオチンで ある。延長用試薬６０は、二官能性の試薬５０の部分５２に結合することのでき る第一部分６２（例えばストレプトアビジン）と、複数のシグナリング成分が結 合することのできるポリヌクレオチド配列を含む第二部分６４とを含む。複数の シグナリング成分３４はここで説明したようにこの第二部分６４に結合して、試 料中の分析物１０の存在を示すシグナルを生じることができる。 このように、もう一つの実施例では本発明は、分析物の存在又は不存在を試料 中で検出するための方法を提供するものであるが、当該方法は、分析物に特異的 に結合する第一部分と、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分とを有する第一試 薬に試料を接触させて前記分析物と前記第一試薬との錯体を形成させるステップ と、前記分析物及び第一試薬の錯体を、第一ポリヌクレオチド配列及び第二ポリ ヌクレオチド配列を有する増幅用実体に接触させるステップであって、前記第一 ポリヌクレオチド配列が前記第一試薬の第二部分のポリヌクレオチド配列に相補 であるため、前記分析物、前記第一試薬及び前記増幅用実体の錯体が形成される 、ステップと、前記分析物、第一試薬及び増幅用実体の錯体を第二試薬に接触さ せるステップであって、前記第二試薬は、前記増幅用実体の第二ポリヌクレオチ ド配列に相補のポリヌクレオチド配列を含む第一部分と、第二部分とを有するた め、前記分析物、前記第一試薬、前記増幅用実体及び前記第二試薬の延長可能な 錯体が形成される、ステップと、前記延長可能な錯体を延長用試薬に接触させる ステップであって、前記延長用試薬は、前記増幅用実体の第二部分に特異的に結 合することのできる第一部分と、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分とを含む ため、前記延長用試薬が前記延長可能な錯体に結合して前記分析物、前記第一試 薬、前記増幅用実体、及び前記延長用試薬の錯体が形成される、ステップと、前 記分析物、前記第一試薬、前記増幅用実体及び前記延長用試薬の錯体を複数のシ グナリング成分に接触させるステップであって、前記シグナリング成分の各々は 検出可能な標識と、前記延長用試薬のポリヌクレオチド配列に相補なポリヌクレ オチド配列とを含むため、前記分析物、前記試薬、前記増幅ポリヌクレオチド、 前記延長用試薬及前記シグナリング成分の検出可能な錯体が形成される、ステッ プと、前記標識を、分析物の存在又は不存在の指標として前記試料中で検出する ステップとを含む。 ある好適な実施例では、二官能性の試薬の第二部分はビオチンを含み、延長用 試薬の第一部分はストレプトアビジンを含む。いくつかの好適な実施例では、第 一の増幅用実体及び第二の増幅用実体は、非特異的結合を防ぐべく同じ副配列を 含んでいない。このように、第一の増幅用実体がpoly(dA)である実施例では、延 長用試薬の第二部分は好ましくは、異なるホモポリヌクレオチド、好ましくはpo ly(dC)を含む。第二の増幅用実体がpoly(dC)である実施例においては、検出可能 に標識付けされたシグナリング成分の各々は好ましくはpoly(dG)を含む。 二官能性の試薬及び付加的な増幅用実体を適切に選択することで、増幅用実体 の複数の「層」を含む錯体を形成させることができ、ひいては錯体に結合するこ とのできるシグナリング成分の数を倍増させてシグナルを増加させることができ ることは理解されよう。しかしながら、増幅用実体の数を増加させるにつれて、 バックグラウンドの「ノイズ」が増えることが多いことも理解されよう。II ．キット 別の態様では、本発明は分析物を試料中で検出するためのキットを提供するも のである。 ある実施例では、キットには、分析物に特異的に結合する第一部分と、ポリヌ クレオチド配列を含む第二部分とを有する試薬を含む容器と、第一ポリヌクレオ チド配列及び第二ポリヌクレオチド配列を有する増幅用実体を含む容器であって 、前記第一ポリヌクレオチド配列は前記試薬の第二部分のポリヌクレオチド配列 に相補である、容器と、それぞれが検出可能な標識と、前記増幅用実体の第二ポ リヌクレオチド配列に対して相補なポリヌクレオチド配列とを含む複数のシグナ リング成分を含む容器と、分析物の存在又は不存在を試料中で検出する際の指示 書とが含まれる。好適な実施例では、増幅用実体はホモポリヌクレオチド、より 好ましくはpoly(dA)であり、またその長さは少なくとも約３０００塩基、より好 ましくは少なくとも約５０００塩基、より好ましくは少なくとも約７０００塩基 、そしてさらに好ましくは少なくとも約９０００塩基であるとよい。 ある好適な実施例では、当該キットにはさらに分析物特異的捕獲成分の容器が 含まれる。この分析物特異的捕獲成分は、例えば容器表面（例えば分析物特異的 捕獲成分の容器の表面）上に固定化されていてもよいが、この容器は選択に応じ 、９６ウェルプレートなどの反応容器であってもよい。あるいはその代わりに、 分析物特異的捕獲成分を、例えば磁気マイクロビードなど、ビードなどの粒子表 面上に固定化させてもよい。III ．組成物 別の態様では、本発明は、試料中で分析物の存在又は不存在を検出するのに有 用な化合物及び検出可能な錯体を提供するものである。 ある一つの実施例では、本発明は上述した検出可能な錯体を提供するものであ る。ある一つの実施例では、本発明は、分析物と、この分析物に結合した試薬で あって、分析物に特異的に結合する第一部分とポリヌクレオチド配列を含む第二 部分とを有する、試薬と、前記試薬に結合した増幅用実体であって、第一ポリヌ クレオチド配列及び第二ポリヌクレオチド配列を有し、前記第一ポリヌクレオチ ド配列は前記試薬の第二部分のポリヌクレオチド配列に相補である、増幅用実体 と、前記増幅用実体に結合していると共に各々が検出可能な標識と前記増幅用実 体の第二ポリヌクレオチド配列に相補なポリヌクレオチド配列とを含むものであ る複数のシグナリング成分とを含む錯体を提供する。いくつかの実施例では、前 記錯体は少なくとも約５０のシグナリング成分、より好ましくは少なくとも約１ ００のシグナリング成分、少なくとも約２００のシグナリング成分、又は少なく とも約１０００のシグナリング成分を含むものである。 さらに別の態様では、本発明は、増幅用実体として有用なホモポリヌクレオチ ドを提供するものである。ある一つの実施例では、本発明は、少なくとも約３０ ００塩基の長さの分離かつ精製された一本鎖のホモポリヌクレオチドを提供する 。好適な実施例では、当該ホモポリヌクレオチドの長さは少なくとも約７０００ 塩基である。いくつかの実施例では、ホモポリヌクレオチドはpoly(dA)、poly(d T)、poly(dC)、poly(dG)、及びpoly(dU)、のいずれかから選択されるが、最も好 ましくはpoly（dA）である。 以下の実施例は本発明の方法及び組成物を説明するために提供されるものであ り、限定的なものとしては意図されていない。実施例１ 長鎖のpoly(dA)を、公開された手法（Methods in Molecular Biology，Vol．1 6，Ch.7，pp.95-105(1993)）を改良したものにより調製した。末端デオキシリボ ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＤＴ、ＥＣ２．７．７．３１））を用い て、シグマ・ケミカル社（ミズーリ州セントルイス）から購入したpoly(dA)を延 長し た。この文献による手法の改良は、とりわけ、記載を越える量のＴＤＴを加える ことで、反応時間及び／又は延長されたpoly(dA)の収率を向上させたことである 。 poly(dA)を脱イオン水に１２．５Ａ₂₆₀単位／ｍｌの濃度になるまで溶解させ てpoly(dA)溶液を作成した。ｄＡＴＰの脱イオン水溶液（１００ｍＭの濃度）も 調製して、使用時まで冷凍した。 １．５ｍｌのマイクロ遠心分離試験管内に、次の試薬を配合した。 １００μｌのpoly(dA) ２００μｌの５倍緩衝液（５００ｍＭのカコジレート、ｐＨは６．８、５ｍＭ のＣｏＣｌ₂、０．５ｍＭのＤＴＴ） ２０μｌのｄＡＴＰ溶液 ６６０μｌの脱イオン水 ７５０単位のＴＤＴ この反応混合液を一晩、３７℃でインキュベートした。 この反応混合液を緩衝液交換カラムで精製し、脱イオン水で溶出させ、セント リコン１００遠心分離濾過器（マサチューセッツ州ビバリー、アミコン社製）を 用いて限外濾過することで（例えば余分なＡＴＰを取り除くために）さらに精製 した。上述の延長のための手法を繰り返してpoly(dA)をさらに延長してもよいか も知れない。 アガロースゲル分析の結果、延長前のpoly(dA)の平均長は約１６００から１６ ５０塩基であることが判明した。延長を一回行った後では、poly(dA)鎖の平均長 は約５０００塩基であり、二回行った後は約７０００塩基であり、三回行った後 は約９０００塩基であった。これ以上延長を行っても鎖の長さはごく僅かに長く なるに過ぎないように思われた。 同様の手法をpoly(dC)を延長すべく行って、より長いpoly(dC)配列を提供した 。混成試薬を提供するために、poly(dT)鎖をアガロース反応でｄＣ塩基を用いて 成功裡に延長した。実施例２ シグナリング成分に結合するpoly(dA)の能力を、ＦＩＴＣ−Ｔ₂₀及びＦＩＴＣ −Ｔ₄₀結合体を用いてテストした。その他の成分の不存在下でのシグナリング成 分のpoly(dA)に対する結合の分光光度分析（２６０ｎｍ）では、鎖一本当り約１ ６５０塩基の長さの市販のpoly(dA)（シグマ社製）は、室温で、poly(dA)の鎖一 本当り約２８２のＦＩＴＣ−Ｔ₂₀成分又は約９３のＦＩＴＣ−Ｔ₄₀成分に結合し たことが示された。これは、線形でpoly(dA)に結合することのできたシグナリン グ成分の最大数を越える数字であるが、この違いの理由は充分には解明されてい ない。 鎖一本当りの平均長約８０００塩基の延長poly(dA)（実施例１で調製されたも の）試料へのシグナリング成分の結合は上述のように行われた。その結果、室温 で約１１００のＦＩＴＣ−Ｔ₂₀成分又は約４８４のＦＩＴＣ−Ｔ₄₀成分がpoly(d A９の鎖一本当りに結合したことが示された。ここでも、この数字は、シグナリ ング成分が線形でpoly(dA)に結合することのできた最大数を越えるものである。 予測されたように、実施例１で調製された延長poly(dA)により、市販のpoly(d A)が提供するより多くの数のシグナリング成分結合部位が提供されることが分か る。実施例３ ヒトＩｇＧを検出するための分析物特異的試薬を以下に説明するように調製し た。この試薬は、抗ＩｇＧ部分とpoly(dT)の「尾」とを含んでいた。 ５ｍＭのＥＤＴＡ中のヤギ抗ヒトＩｇＧ（ミズーリ州セントルイス、シグマ・ ケミカル社から市販）を、２−メルカプトエチルアミンヒドロクロリド（ＭＥＡ イリノイ州ロックフォード、ピアス社製）を用いて緩衝液Ａ（１００ｍＭのリン 酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨは６．０）中で還元してＦ（ａｂ）フラ グメント同士の間にあるジスルフィドの結合を切断し、遊離したスルフヒドリル 基を生じさせた。反応終了後（インキュベーションは３７℃で９０分間）、混合 液を滅菌済緩衝液Ｂ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨは７．４）で希釈し、バイオ・ラド社のエコノパック１０ ＤＧカラムで、緩衝液Ｂで溶出させながら精製した。留分を採集し、ＢＣＡ検定 法（ピアス社製、ＢＣＡプロテイン・アッセイ・リエージェント・キット）を用 い てたんぱく質について検定したが、その際、還元用試薬による擬陽性を判別する よう注意しながら行った。たんぱく質を含有する留分をプールし、収率を算出し た。遊離スルフヒドリル基を判定する検定（エルマン試薬）の結果、各抗体フラ グメントは複数のスルフヒドリル基を有していることもあることが示された。（ しかしながら、これらの遊離スルフヒドリル基のいくつかは、下記の誘導化ステ ップにおいて、修飾ＤＮＡとは反応しないかもしれない） ３‘端アミン修飾(dT)₃₅をオリゴス社から入手して、無菌ＰＢＳ（２０ｍＭの リン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨは７．２）中でスルホ−スクシ イミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー ト（スルホ−ＳＭＣＣ、ピアス社製、２５モル当量）で処理し、(dT)₃₅アミノ基 を誘導化した。この反応液を、典型的には室温で６０分間又は３７℃で３０分間 、インキュベートした。誘導化された(dT)₃₅を（緩衝液Ｂで溶出させながらバイ オラド社製エコンパックカラムで）精製した。修飾ＤＮＡを含む留分は、２６０ ｎｍでのＵＶ吸収度を計測することで検出された。次に誘導化されたＤＮＡを、 抗ヒトＩｇＧから調製した切断Ｆ（ａｂ）フラグメント（修飾ＤＮＡ対たんぱく 質のモル比は１０：１）に、少なくとも２時間、４℃（又は一晩）でインキュベ ートすることで結合させた。この結合体をセントリコン６０遠心分離濾過器（ア ミコン社製）を用いて精製し、分析物特異的試薬を作成した。 その他のたんぱく質結合物は、この手法にごく些細な変更を加えたのみのもの に基づいて(dT)₃₅の尾で誘導化した。このようにして、分析物特異的試薬を、多 クローン抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧ、及びヒツジ抗ウサギＩ ｇＧ）、単クローン抗体（マウス単クローン抗ＦＩＴＣ、マウス単クローン抗ビ オチン）、及びその他のたんぱく質（ストレプトアビジン及びアルカリホスファ ターゼ（ＡＰ））から調製した。実施例４ 以下のプロトコルをこの実施例に用いた。 １ピコモルの捕獲ヘアピンを適した標的と共に、１ウェル当り１００マイクロ リットルの反応緩衝液（１００ｍＭのTris−ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、０．０８ ％ のトリトン−Ｘ−１００、ｐＨは８）中でインキュベートした。この反応液を９ ５℃まで５分間加熱した後、室温まで冷却した。この反応混合液を高容量のスト レプトアビジンで被膜されたマイクロタイタ・プレート（例えばベーリンガー・ マンハイム社製のものが入手可能）に容れ、４５分間インキュベートした。この ウェルを反応緩衝液で６回洗浄した。 直接的検出のために、次に、下記の「シグナル生成」に述べたプロトコルに従 った。反応を増幅させるために、第二のプローブ分子（標的の配列に相補のＴ₂₀ の尾を付けたポリヌクレオチド）を、反応緩衝液１００マイクロリットル当り１ ００ピコモルの濃度で反応緩衝液中に懸濁させた。標的の混合液をウェルに容れ て４５分間インキュベートした。次にpoly(dA)溶液（２５０ｎｇ／１００マイク ロリットルの反応緩衝液）を各ウェルに加えて（１００マイクロリットル）４５ 分間インキュベートした。このウェルを反応緩衝液で６回洗浄した。 シグナル成分（ＦＩＴＣ−Ｔ₁₅−ＦＩＴＣ）の溶液を反応緩衝液に溶解させた （４ピコモルのシグナル／１００マイクロリットルの緩衝液）。このシグナル溶 液をウェルに容れ、４５分間インキュベートした後、反応緩衝液で６回洗浄して シグナル生成を行わせた。 シグナル生成： 抗ＦＩＴＣ／アルカリホスファターゼ結合体をTris緩衝食塩水（１５０ｍＭの ＮａＣｌ、２０ｍＭのTris、ｐＨは８）で６０００倍に希釈し、１００マイクロ リットルを各ウェルに容れて４５分間インキュベートした。このウェルを１／１ ０の強度の反応緩衝液で６回洗浄した。アルカリホスファターゼの基質を加え、 発色させ、その結果をプレート読み取り器で読み取った。 この実施例では、合成の標的分子を分析物として用いた。標的は、オリゴ・セ ラピューティックス（オレゴン州ウィルソンビル）により、特注で合成され、購 入されたが、以下の配列を持ったものである。 ５‘−ＦＩＴＣ−ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＧＧ ＣＴＡ ＧＧＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＣＡＧ ＴＡＴ ＧＧＡ ＴＣＧ ＧＣＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＣ−３’ ＦＩＴＣ成分が存在することでは、分析物が捕獲ヘアピンプローブ又は検出子 成分に結合する際の妨げとはならなかった。分析物は以下の配列を有する固定化 されたヘアピンプローブにより捕獲された。 ５‘−ＣＴＡＧＴ ＣＧＡＣＧ ＴＧＧＴＣ ＣＴＴＵ_BＴ ＴＧＧＡＣ Ｃ ＡＣＧＴ ＣＧＡＣＴ ＡＧ ＧＧＣＴＣ ＣＴＣＴＧ ＣＣＧＡＴ ＣＣＡＴ Ａ−３ ただし上の式においてＵ_Bはビオチニル化ウラシルを示し、このビオチニル化 ウラシルを介して、ヘアピンはストレプトアビジンで被膜されたプレートに固定 化された。第二のプローブは以下の配列を有していた。 ５‘−ＣＴＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＴＣＣ ＴＡＧ ＣＣＧ ＣＴＴ ＧＴＴ ＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴ−３’ 図４は、直接及び増幅されたＤＮＡ検出の比較を示した図である。図４では、 灰色の棒はＤＮＡの直接検出を表し、黒い棒は本発明の方法による検出を表す。 はめ込み図は直接検出のデータを拡大したものである。垂直軸は、単位時間（秒 ）当りの吸収度（ＯＤ）の変化に相当する単位である。この勾配は、固定された ＯＤ読み取りよりも我々のプレート読み取り器を用いた方がより容易に判定され た。 図４によれば、増幅されたＤＮＡ検出系は直接検出スキームよりも多くのシグ ナルを提供していた（しかしながら、分析物がまったく存在しないとき（「なし 」の欄）に、より大きなシグナルがあることから分かるように、増幅系ではまた ノイズも大きかった）。この増幅系は分析物を１０^-4ピコモルという低いレベル でも検出していた（基線のノイズレベルよりも大きなシグナルが生じた）。対照 的に、直接検出法では、１０^-2ピコモル未満の量の分析物は検出できなかった（ シグナルレベルはバックグラウンドを超えなかった）。実施例５ モデルの抗体を基とした増幅系を調製し、直接検出スキームと比較した。 マイクロタイタ・プレートを１ウェル当り５０ｎｇから５０ｆｇの濃度にヒト ＩｇＧ（シグマ社製）で被膜した。対照ウェル（図５では「なし」と表示）には ＩｇＧは加えなかった。こうしてプレート上のＩｇＧの存在を、抗ＩｇＧ／アル カリホスファターゼ（ＡＰ）結合体（シグマ社製）による比色検出法か、又は、 上述の実施例３で調製した抗ＩｇＧ／poly（dT）結合体による増幅検出法のいず れかを用いて検出した。 結果を図５に示す。テストの棒線（標本＃１、標本＃２及び標本＃３）は、実 施例３で説明した抗ＩｇＧ／poly(dT)試薬の三つの異なる調剤を用いた検定の結 果を表すものである。黒い棒線はシグナル発生のために従来の（シグマ社製）抗 ＩｇＧ／アルカリホスファターゼ（ＡＰ）試薬を用いた検定を表すものである。 はめ込み図に示された抗ＩｇＧ試薬（抗ＩｇＧpoly(dT)又は抗ＩｇＧ／ＡＰのい ずれか）の濃度を用いて別々のパネルを得た。垂直軸は一秒当りの光学密度（Ｏ Ｄ）の変化である。水平線は、対照試料において直接検出法で発生したシグナル レベルに相当する。 図５から、抗ＩｇＧ／poly(dT)試薬の三つの調剤は概ね同じような結果を出し たが、標本＃３の出したシグナルが最も大きかったことが分かる。このモデル系 では、この増幅検出法は、固定化されたＩｇＧの濃度が高いときの直接検出法よ りも大きなシグナルを生じていた。この増幅反応は、直接検出法と同じように、 抗ＩｇＧの濃度が２５ｎｇ／ウェルのときに検出限界があるが、抗ＩｇＧの濃度 が２５０又は２５００ｎｇ／ウェルでは、この増幅検出系は、ＩｇＧを直接検出 する方法と同様又はそれより高い感受性を呈していた。実施例６ 直接検出法の、本発明に基づく二つの増幅法との比較を、ビオチンを試料分析 物として用いて行った。 ナンク・マキシソープ試料プレート（ナンク社製）にＢＳＡ−ビオチン（シグ マ社製）の被膜を施してビオチンでコーティングされた表面を提供した。ＢＳＡ −ビオチンの濃度を１０倍の増分で違えて、異なる量のＢＳＡ−ビオチン分析物 が表面上に固定化されたプレートを作成したが、その際の最も低い量は０．０１ ピコグラムであり、最大では１０００ピコグラムであった。対照プレートの表面 にはビオチン分析物は全く固定化しなかった。 「直接」検出法は、固定化したビオチンに結合させるのにストレプトアビジン 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体（例えばシグマ社から入手可能） を利用して行い、結合したＨＲＰの比色検出を標準的プロトコルに基づいて行っ た。 増幅（図６では「１回増幅」として示されている）は、プレートをストレプト アビジン（０．０５ピコモル）に接触させた後に洗浄し、ビオチン−dT３０結合 体（オリゴズ社から購入）（１ピコモル）を加えて、結合したストレプトアビジ ンに結合させることで行われた。次に、延長されたpoly(dA)（実施例１で作成さ れたもの）を加え（５ｎｇ）、その後ＦＩＴＣ−Ｔ₂₀−ＦＩＴＣシグナリング成 分（オリゴズ社から入手可能を加えた。シグナリング成分の存在を、抗ＦＩＴＣ ／ビオチン結合体（シグマ社製）（０．２５ピコモル）で検出し、続いてストレ プトアビジン−ＨＲＰ結合体によるＨＲＰの比色検出を上述したように行った。 （代替的な検出スキームはビオチン−Ｔ₃₀結合体シグナリング成分を用いてpoly (dA)に混成させ、その後ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体を加えてシグナリン グ成分を検出した。） 延長用試薬を用いた増幅（図６では「２回増幅」と呼ばれている）は、上述し たようにプレートをストレプトアビジン、ビオチン−Ｔ₃₀結合体及びpoly(dA)に 順に接触させることで行われた。次にビオチン−Ｔ₃₀結合体を（poly(dA)に結合 させるための）延長用試薬として加えた。次にこの錯体に、ビオチニル化延長試 薬に結合させるべくストレプトアビジン（０．０５ピコモル）を加え、次にビオ チン−Ｔ３０結合体、次にpoly(dA)（５ｎｇ）を加えて延長した。次にＦＩＴＣ −Ｔ₂₀−ＦＩＴＣシグナリング成分を加えて上述した通りに検出した。 検定結果を図６に示す。「直接」検定法は図６では「対照」と表示されており 、ビオチン分析物のないプレートは「なし」と表示されている。両方の増幅法は 共に、直接検出法よりも大きなシグナル強度を提供したことが窺える。延長増幅 スキームが概して最も大きなシグナルを提供していた。しかしながら、これらの 増幅法では、「なし」（分析物なし）の検定結果の比較に見られるように、直接 検出法よりも大きな「ノイズ」を生じているということはない。ノイズの増加に も関わらず、これら増幅法では低い濃度でも大きなシグナル対ノイズ比を提供し ていた。直接検出法のシグナルは分析物を１００ｐｇ未満加えた場合ではバック グラウンドレベルまで落ちているが、両方の増幅法とも、１ｐｇの分析物でもバ ックグラウンドよりも高いシグナルを提供していた。このように、本増幅法はこ の 系における検出の感受性を１０から１０００倍に増加させると考えられる。 延長用試薬及び第二の増幅用実体の両方として(dT)₂₀−poly(dC)鎖（約５００ から７００ｄＣ塩基の尾がｄＴ₂₀に付けられたもの）、及びシグナリング成分と して（dG）₁₄−ＦＩＴＣを用いた延長増幅法の代替的な形も、概ね同様な結果を もたらすことが判明した。実施例７ ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染は、抗体を基にした反応系により、血中 のＨＩＶのｐ２４抗原の存在に基づいて診断することができる。この実施例では 、「直接」検出系を増幅検出系と比較した。 反応プレートのウェルに、市販の抗ｐ２４抗体（マサチューセッツ州ボストン 、デュポン社から市販のキットで入手可能）の被膜を施した。様々な量のｐ２４ 抗体を含有する試料をこのウェルに加えた後（対照ウェルには抗原はなし）、ビ オチニル化多クローン性抗ｐ２４抗体（マサチューセッツ州ボストンデュポン社 製）を加えた。ｐ２４抗原の「直接」検出法は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ結 合体を加えてＨＲＰ基質（ＯＰＤ、デュポン社のキットと共に提供されている） を用いた比色検出により行われた。増幅検出法は、ストレプトアビジン−Ｔ₃₅結 合体を加え、poly(dA)、次にビオチン−Ｔ₃₀結合体を加え、最後にストレプトア ビジン−ＨＲＰ結合体を加えて上述した比色検出を行うことで行われた。 その結果は、当該増幅検出系は、直接検出系よりも少なくとも１０分の一低い 量のｐ２４の存在を検出できたことを示すものであった。 当業者であれば、ごく通常の実験を行うのみで、ここに説明した具体的な手法 の等価物を数多く認識され、また確認できることであろう。このような等価物は 本発明の範囲内にあるものとして考えられ、また以下の請求の範囲の包含すると ころである。 ここで引用した参考文献及び特許出願の内容をすべて、ここに参考文献として 編入する。 請求の範囲は：

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年７月２０日（１９９８．７．２０） 【補正内容】 請求の範囲 １． 分析物の存在又は不存在を試料中で検出するための方法であって、 分析物に特異的に結合する第一部分と、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分 とを有する試薬に試料を接触させて前記分析物と試薬との錯体を形成させるステ ップと、 前記分析物及び試薬の錯体を、少なくとも約５０００塩基の長さのホモポリヌ クレオチドである、第一ポリヌクレオチド配列及び第二ポリヌクレオチド配列を 有する増幅用実体に接触させるステップであって、前記第一ポリヌクレオチド配 列が前記試薬の第二部分のポリヌクレオチド配列に相補であることで、前記分析 物、前記試薬及び前記増幅用実体の錯体が形成される、ステップと、 前記分析物、前記試薬、及び前記増幅用実体の錯体を、複数のシグナリング成 分に接触させるステップであって、前記シグナリング成分はそれぞれ、検出可能 な標識と、前記増幅用実体の第二ポリヌクレオチド配列に相補の、１５から３５ 塩基の長さのホモポリヌクレオチド配列とを含むため、前記分析物、前記試薬、 前記増幅ポリヌクレオチド及び前記シグナリング成分の検出可能な錯体が形成さ れる、ステップと、 前記標識を試料中における分析物の存在又は不存在の指標として検出するステ ップと を含む、方法。 ２． 前記分析物が核酸配列である、請求項１に記載の方法。 ３． 前記試薬の第一部分が、前記分析物に概ね相補の核酸配列である、請求項 ２に記載の方法。 ４． 前記分析物が抗体又は抗原である、請求項１に記載の方法。 ５．前記試薬の第一部分が前記分析物に特異的に結合する抗体又は抗原である、 請求項４に記載の方法。 ８． 前記ホモポリヌクレオチドがpoly(dA)を含む、請求項７に記載の方法。 １０． 前記試薬の第二部分がpoly(dT)を含む、請求項８に記載の方法。 １１． 前記シグナリング成分の各々がpoly(dT)を含む、請求項８に記載の方法 。 １２． 前記複数のシグナリング成分の各々が抗原、抗体、酵素、放射性同位元 素及び蛍光成分のいずれかから選択される検出可能な標識を含む、請求項１に記 載の方法。 １３． 前記分析物、試薬及び増幅用実体の錯体を複数のシグナリング成分に接 触させるステップの前に、本方法が、前記分析物、試薬及び増幅用実体の前記錯 体を洗浄して未結合のポリヌクレオチドを除去するステップをさらに含む、請求 項１に記載の方法。 １４． 前記分析物が、固定化された捕獲試薬を用いて固定化される、請求項１ に記載の方法。 １５． 前記増幅用実体の第一ポリヌクレオチド配列、及び、前記増幅用実体の 第二ポリヌクレオチド配列が同じ又は概ね同じ配列を含む、請求項１に記載の方 法。 １７． 前記ホモポリヌクレオチド鎖がpoly(dA)であり、前記試薬の第二部分及 び前記シグナリング成分がpoly(dT)又はpoly(dU)を含む、請求項１に記載の方法 。 １８． 分析物の存在又は不存在を試料中で検出するための方法であって、 分析物に特異的に結合する第一部分と、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分 とを有する第一試薬に試料を接触させて前記分析物と前記第一試薬との錯体を形 成させるステップと、 前記分析物及び第一試薬の錯体を、少なくとも約５０００塩基の長さのホモポ リヌクレオチドである、第一ポリヌクレオチド配列及び第二ポリヌクレオチド配 列を有する増幅用実体に接触させるステップであって、前記第一ポリヌクレオチ ド配列が前記第一試薬の第二部分のポリヌクレオチド配列に相補であるため、前 記分析物、前記第一試薬及び前記増幅用実体の錯体が形成される、ステップと、 前記分析物、第一試薬及び増幅用実体の錯体を第二試薬に接触させるステップ であって、前記第二試薬は、前記増幅用実体の第二ポリヌクレオチド配列に相補 のポリヌクレオチド配列を含む第一部分と、第二部分とを有するため、前記分析 物、前記第一試薬、前記増幅用実体及び前記第二試薬の延長可能な錯体が形成さ れる、ステップと、 前記延長可能な錯体を延長用試薬に接触させるステップであって、前記延長用 試薬は、前記増幅用実体の第二部分に特異的に結合することのできる第一部分と 、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分とを含むため、前記延長用試薬が前記延 長可能な錯体に結合することで前記分析物、前記第一試薬、前記増幅用実体、及 び前記延長用試薬の錯体が形成される、ステップと、 前記分析物、前記第一試薬、前記増幅用実体及び前記延長用試薬の錯体を複数 のシグナリング成分に接触させるステップであって、前記シグナリング成分の各 々は検出可能な標識と、前記延長用試薬のポリヌクレオチド配列に相補な、１か ら３５塩基の長さのホモポリヌクレオチド配列とを含むため、前記分析物、前記 試薬、前記増幅ポリヌクレオチド、前記延長用試薬及前記シグナリング成分の検 出可能な錯体が形成される、ステップと、 前記標識を、分析物の存在又は不存在の指標として前記試料中で検出するステ ップと を含む、方法。 １９． 前記延長用試薬の第二部分がホモポリヌクレオチドを含む、請求項１８ に記載の方法。 ２０． 前記延長用試薬の第二部分がpoly(dC)を含み、前記シグナリング成分の ポリヌクレオチド配列がpoly(dG)を含む、請求項１９に記載の方法。 ２１． 前記検出可能な標識が抗原、抗体、酵素、放射性同位元素及び蛍光成分 のいずれかから選択される、請求項２０に記載の方法。 ２２． 分析物の存在又は不存在を試料中で検出するためのキットであって、 分析物に特異的に結合する第一部分と、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分 とを有する試薬を含む容器と、 少なくとも約５０００塩基の長さのホモポリヌクレオチドである、第一ポリヌ クレオチド配列及び第二ポリヌクレオチド配列を有する増幅用実体を含む容器で あって、前記第一ポリヌクレオチド配列は前記試薬の第二部分のポリヌクレオチ ド配列に相補である、容器と、 検出可能な標識と、前記増幅用実体の第二ポリヌクレオチド配列に対して相補 な、１から３５塩基の長さのホモポリヌクレオチド配列とをそれぞれが含む複数 のシグナリング成分を含む容器と、 分析物の存在又は不存在を試料中で検出するための指示書と を含む、キット。 ２４． 前記ホモポリヌクレオチドがpoly(dA)を含む、請求項２３に記載のキッ ト。 ２６． 前記試薬の第二部分がpoly(dT)を含む、請求項２４に記載のキット。 ２７． 分析物特異的捕獲試薬の容器をさらに含む、請求項２２に記載のキット 。 ２８． 前記分析物特異的捕獲試薬が固体の担体上に固定化されている、請求項 ２７に記載のキット。 ２９． 分析物を検出するための検出可能な錯体であって、 分析物と、 前記分析物に結合した試薬であって、分析物に特異的に結合する第一部分とポ リヌクレオチド配列を含む第二部分とを有する、試薬と、 少なくとも約５０００塩基の長さのホモポリヌクレオチドである、前記試薬に 結合した増幅用実体であって、第一ポリヌクレオチド配列及び第二ポリヌクレオ チド配列を有し、前記第一ポリヌクレオチド配列は前記試薬の第二部分のポリヌ クレオチド配列に相補である、増幅用実体と、 前記増幅用実体に結合した複数のシグナリング成分であって、各々が検出可能 な標識と前記増幅用実体の第二ポリヌクレオチド配列に相補な、１から３５塩基 の長さのホモポリヌクレオチド配列とを含む、複数のシグナリング成分と を含む、検出可能な錯体。 ３０． 固体の担体に結合していると共にさらに分析物にも結合した分析物特異 的捕獲試薬をさらに含む、請求項２９に記載の検出可能な錯体。 ３１． 前記分析物が抗原である、請求項３０に記載の検出可能な錯体。 ３２． 前記分析物が核酸である、請求項３０に記載の検出可能な錯体。 ３３． 少なくとも約５０００塩基の長さの分離かつ精製された一本鎖のホモポ リヌクレオチド。 ３４． 前記ホモポリヌクレオチドが少なくとも約７０００塩基の長さである、 請求項３３に記載のホモポリヌクレオチド。 ３５． 前記ホモポリヌクレオチドが、poly(dA)、poly(dT)、poly(dC)、poly(d G)、及びpoly(dU)のいずれかから選択される、請求項４０に記載のホモポリヌク レオチド。 ３６． 前記ホモポリヌクレオチドの長さが少なくとも約７０００塩基である、 請求項１に記載の方法。 ３７． 前記ホモポリヌクレオチドの長さが少なくとも約８０００塩基である、 請求項１に記載の方法。 ３８． 前記ホモポリヌクレオチドの長さが少なくとも約９０００塩基である、 請求項１に記載の方法。 ３９． 前記分析物が核酸配列であり、前記試薬の第一部分がヘアピン捕獲成分 を含む、請求項１に記載の方法。 ４０．前記ホモポリヌクレオチド鎖の長さが少なくとも約７０００塩基である、 請求項１６に記載の方法。 ４１． 前記増幅用実体の長さが少なくとも約７０００塩基である、請求項１８ に記載の方法。 ４２． 前記増幅用実体の長さが少なくとも約８０００塩基である、請求項１８ に記載の方法。 ４３． 前記増幅用実体の長さが少なくとも約９０００塩基である、請求項１８ に記載の方法。 ４４． 前記分析物が核酸配列であり、前記試薬の第一部分がヘアピン捕獲成分 を含む、請求項１８に記載の方法。 ４５． 前記ホモポリヌクレオチドの長さが少なくとも約７０００塩基である、 請求項２２に記載のキット。 ４６． 前記ホモポリヌクレオチドの長さが少なくとも約８０００塩基である、 請求項２２に記載のキット。 ４７． 前記ホモポリヌクレオチドの長さが少なくとも約９０００塩基である、 請求項２２に記載のキット。 ４８． 前記分析物が核酸配列であり、前記試薬の第一部分がヘアピン捕獲成分 を含む、請求項２２に記載のキット。 ４９． 前記ホモポリヌクレオチドの長さが少なくとも約８０００塩基である、 請求項３３に記載のホモポリヌクレオチド。 ５０． 前記ホモポリヌクレオチドの長さが少なくとも約９０００塩基である、 請求項３３に記載のホモポリヌクレオチド。 ５１． 前記第二試薬の前記第二部分及び前記延長用試薬の前記第一部分が特異 結合対を含む、請求項１８に記載の方法。 ５２． 前記特異結合対が、抗体−抗原、ホルモン−レセプタ、結合リガンド− 基質、レクチン−糖、及び酵素−阻害物質のいずれかから選択される、請求項５ １に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ファルダス ブライアン デー. アメリカ合衆国 01754 マサチューセッ ツ州 メイナード、ベルビューテラス ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 分析物の存在又は不存在を試料中で検出するための方法であって、 分析物に特異的に結合する第一部分と、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分 とを有する試薬に試料を接触させて前記分析物と試薬との錯体を形成させるステ ップと、 前記分析物及び試薬の錯体を、第一ポリヌクレオチド配列及び第二ポリヌクレ オチド配列を有する増幅用実体に接触させるステップであって、前記第一ポリヌ クレオチド配列が前記試薬の第二部分のポリヌクレオチド配列に相補であること で、前記分析物、前記試薬及び前記増幅用実体の錯体が形成される、ステップと 、 前記分析物、前記試薬、及び前記増幅用実体の錯体を、複数のシグナリング成 分に接触させるステップであって、前記シグナリング成分はそれぞれ、検出可能 な標識と、前記増幅用実体の第二ポリヌクレオチド配列に相補のポリヌクレオチ ド配列とを含むため、前記分析物、前記試薬、前記増幅ポリヌクレオチド及び前 記シグナリング成分の検出可能な錯体が形成される、ステップと、 前記標識を試料中における分析物の存在又は不存在の指標として検出するステ ップと を含む、方法。 ２． 前記分析物が核酸配列である、請求項１に記載の方法。 ３． 前記試薬の第一部分が、前記分析物に概ね相補の核酸配列である、請求項 ２に記載の方法。 ４． 前記分析物が抗体又は抗原である、請求項１に記載の方法。 ５． 前記試薬の第一部分が前記分析物に特異的に結合する抗体又は抗原である 、請求項４に記載の方法。 ６． 前記増幅用実体の第一ポリヌクレオチド配列及び第二ポリヌクレオチド配 列が概ね同じ配列を含む、請求項１に記載の方法。 ７． 前記増幅用実体がホモポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。 ８． 前記ホモポリヌクレオチドがpoly(dA)を含む、請求項７に記載の方法。 ９． 前記poly(dA)が少なくとも約３０００塩基の長さである、請求項８に記載 の方法。 １０． 前記試薬の第二部分がpoly(dT)を含む、請求項８に記載の方法。 １１． 前記シグナリング成分の各々がpoly(dT)を含む、請求項８に記載の方法 。 １２． 前記複数のシグナリング成分の各々が抗原、抗体、酵素、放射性同位元 素及び蛍光成分のいずれかから選択される検出可能な標識を含む、請求項１に記 載の方法。 １３． 前記分析物、試薬及び増幅用実体の錯体を複数のシグナリング成分に接 触させるステップの前に、本方法が、前記分析物、試薬及び増幅用実体の錯体を 洗浄して未結合のポリヌクレオチドを除去するステップをさらに含む、請求項１ に記載の方法。 １４． 前記分析物が、固定化された捕獲試薬を用いて固定化される、請求項１ に記載の方法。 １５． 前記増幅用実体の第一ポリヌクレオチド配列、及び、前記増幅用実体の 第二ポリヌクレオチド配列が同じ又は概ね同じ配列を含む、請求項１に記載の方 法。 １６． 分析物の存在又は不存在を試料中で検出するための方法であって、 分析物に特異的に結合する第一部分と、ホモポリヌクレオチド配列を含む第二 部分とを有する試薬に試料を接触させて前記分析物と試薬との錯体を形成させる ステップと、 前記分析物及び試薬の錯体を、前記試薬のホモポリヌクレオチド配列に相補の ホモポリヌクレオチド鎖に接触させて前記分析物、前記試薬及び前記ホモポリヌ クレオチドの錯体を形成させるステップと、 前記分析物、前記試薬及び前記ホモポリヌクレオチドの錯体を複数のシグナリ ング成分に接触させるステップであって、前記シグナリング成分はそれぞれ、検 出可能な標識と、ホモポリヌクレオチド鎖に相補のホモポリヌクレオチド配列と を含むため、前記分析物、前記試薬、前記ホモポリヌクレオチド鎖及び前記シグ ナリング成分の検出可能な錯体が形成される、ステップと、 前記標識を試料中における分析物の存在又は不存在の指標として検出するステ ップと を含む、方法。 １７． 前記ホモポリヌクレオチド鎖がpoly(dA)であり、前記試薬の第二部分及 び前記シグナリング成分がpoly(dT)又はpoly(dU)を含む、請求項１６に記載の方 法。 １８． 分析物の存在又は不存在を試料中で検出するための方法であって、 分析物に特異的に結合する第一部分と、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分 とを有する第一試薬に試料を接触させて前記分析物と前記第一試薬との錯体を形 成させるステップと、 前記分析物及び第一試薬の錯体を、第一ポリヌクレオチド配列及び第二ポリヌ クレオチド配列を有する増幅用実体に接触させるステップであって、前記第一ポ リヌクレオチド配列が前記第一試薬の第二部分のポリヌクレオチド配列に相補で あるため、前記分析物、前記第一試薬及び前記増幅用実体の錯体が形成される、 ステップと、 前記分析物、第一試薬及び増幅用実体の錯体を第二試薬に接触させるステップ であって、前記第二試薬は、前記増幅成分の第二ポリヌクレオチド配列に相補の ポリヌクレオチド配列を含む第一部分と、第二部分とを有するため、前記分析物 、前記第一試薬、前記増幅用実体及び前記第二試薬の延長可能な錯体が形成され る、ステップと、 前記延長可能な錯体を延長用試薬に接触させるステップであって、前記延長用 試薬は、前記増幅用実体の第二部分に特異的に結合することのできる第一部分と 、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分とを含むため、前記延長用試薬が前記延 長可能な錯体に結合して前記分析物、前記第一試薬、前記増幅用実体、及び前記 延長用試薬の錯体が形成される、ステップと、 前記分析物、前記第一試薬、前記増幅用実体及び前記延長用試薬の錯体を複数 のシグナリング成分に接触させるステップであって、前記シグナリング成分の各 々は検出可能な標識と、前記延長用試薬のポリヌクレオチド配列に相補なポリヌ クレオチド配列とを含むため、前記分析物、前記試薬、前記増幅ポリヌクレオチ ド、前記延長用試薬及前記シグナリング成分の検出可能な錯体が形成される、ス テップと、 前記標識を、分析物の存在又は不存在の指標として前記試料中で検出するステ ップと を含む、方法。 １９． 前記延長用試薬の第二部分がホモポリヌクレオチドを含む、請求項１８ に記載の方法。 ２０． 前記延長用試薬の第二部分がpoly(dC)を含み、前記シグナリング成分の ポリヌクレオチド配列がpoly(dG)を含む、請求項１９に記載の方法。 ２１． 前記検出可能な標識が抗原、抗体、酵素、放射性同位元素及び蛍光成分 のいずれかから選択される、請求項２０に記載の方法。 ２２． 分析物の存在又は不存在を試料中で検出するためのキットであって、 分析物に特異的に結合する第一部分と、ポリヌクレオチド配列を含む第二部分 とを有する試薬を含む容器と、 第一ポリヌクレオチド配列及び第二ポリヌクレオチド配列を有する増幅用実体 を含む容器であって、前記第一ポリヌクレオチド配列は前記試薬の第二部分のポ リヌクレオチド配列に相補である、容器と、 検出可能な標識と、前記増幅用実体の第二ポリヌクレオチド配列に対して相補 なポリヌクレオチド配列とをそれぞれが含む複数のシグナリング成分を含む容器 と、 分析物の存在又は不存在を試料中で検出するための指示書と を含む、キット。 ２３． 前記増幅用実体がホモポリヌクレオチドである、請求項２２に記載のキ ット。 ２４． 前記ホモポリヌクレオチドがpoly(dA)を含む、請求項２３に記載のキッ ト。 ２５． 前記poly(dA)が少なくとも約３０００塩基の長さである、請求項２４に 記載のキット。 ２６． 前記試薬の第二部分がpoly(dT)を含む、請求項２４に記載のキット。 ２７． 分析物特異的捕獲試薬の容器をさらに含む、請求項２２に記載のキット 。 ２８． 前記分析物特異的捕獲試薬が固体の担体上に固定化されている、請求項 ２７に記載のキット。 ２９． 分析物を検出するための検出可能な錯体であって、 分析物と、 前記分析物に結合した試薬であって、分析物に特異的に結合する第一部分とポ リヌクレオチド配列を含む第二部分とを有する、試薬と、 前記試薬に結合した増幅用実体であって、第一ポリヌクレオチド配列及び第二 ポリヌクレオチド配列を有し、前記第一ポリヌクレオチド配列は前記試薬の第二 部分のポリヌクレオチド配列に相補である、増幅用実体と、 前記増幅用実体に結合した複数のシグナリング成分であって、各々が検出可能 な標識と前記増幅用実体の第二ポリヌクレオチド配列に相補なポリヌクレオチド 配列とを含む、複数のシグナリング成分と を含む、検出可能な錯体。 ３０． 固体の担体に結合すると共にさらに分析物にも結合する分析物特異的捕 獲試薬をさらに含む、請求項２９に記載の検出可能な錯体。 ３１． 前記分析物が抗原である、請求項３０に記載の検出可能な錯体。 ３２． 前記分析物が核酸である、請求項３０に記載の検出可能な錯体。 ３３． 少なくとも約３０００塩基の長さの分離かつ精製された一本鎖のホモポ リヌクレオチド。 ３４． 前記ホモポリヌクレオチドが少なくとも約７０００塩基の長さである、 請求項３３に記載のホモポリヌクレオチド。 ３５． 前記ホモポリヌクレオチドが、poly(dA)、poly(dT)、poly(dC)、poly(d G)、及びpoly(dU)のいずれかから選択される、請求項４０に記載のホモポリヌク レオチド。